CN113687076B - 一种可用于肺腺癌早期诊断的联合检测血清标志物及其应用 - Google Patents

一种可用于肺腺癌早期诊断的联合检测血清标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可用于肺腺癌早期诊断的联合检测血清标志物，包括TSHR、ERBB2、Survivin、PIK3CA和JAK2的IgM自身抗体，应用所述的联合检测血清标志物所对应的特异性蛋白制备ELISA血清检测试剂盒，所述的联合检测血清标志物在提高肺腺癌早期诊断的灵敏度、特异度和准确性方面发挥重要作用，同时应用该联合检测血清标志物联合CEA血清标志物构建诊断模型，提供了一种灵敏度高、特异性强、成本低且可辅助肺腺癌临床诊断的血清学检测方法。

Description

一种可用于肺腺癌早期诊断的联合检测血清标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种可用于肺腺癌早期诊断的联合检测血清标志物及其应用。
背景技术
2020年，据统计肺癌有220万新发病例，180万死亡病例，分别占全部癌症的11.4％和18.0％，是全球发病率第二、死亡率第一的癌症。肺腺癌作为非小细胞肺癌中最常见的组织学亚型，约占肺恶性肿瘤的40％，多发生于女性及不抽烟者。大量研究表明，原位腺癌(Adenocarcinoma in Situ，AIS)和微浸润腺癌(Minimally Invasive Adenocarcinoma，MIA)患者若接受根治性手术，其5年无病生存率可接近100％。由此可见，对肺腺癌患者进行早期诊断并及时有效治疗对肺癌防治有重大意义。目前，临床主要通过低剂量螺旋CT(LDCT)和病理组织活检对肺癌患者进行筛查和诊断，但前者假阳性率较高而后者创伤性较大使患者承受较大负担。近年来，操作简便，创伤性小，易被患者所接受的血清学标志物受到广泛关注。临床上，癌胚抗原(CEA)作为传统血清肿瘤标志物在肺癌辅助诊断中应用较为广泛，但是单项检测仍有灵敏度及特异度均不高等缺点。IgM自身抗体作为体液免疫应答过程中产生的第一类抗体，有很大潜能可作为肺癌的早期诊断指标，目前却尚未有相关研究。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种可用于肺腺癌早期诊断的联合检测血清标志物，该联合检测血清标志物在提高肺腺癌早期诊断的灵敏度、特异度和准确性方面发挥重要作用，同时应用该联合检测血清标志物联合CEA血清标志物构建诊断模型，提供了一种灵敏度高、特异性强、成本低且可辅助肺腺癌临床诊断的血清学检测方法。
本发明提供了一种可用于肺腺癌早期诊断的联合检测血清标志物，所述血清标志物为五种IgM自身抗体，包括TSHR、ERBB2、Survivin、PIK3CA和JAK2的自身抗体；
一种可用于肺腺癌早期诊断的联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固相载体和包被于固相载体上所述的联合检测血清标志物所对应的特异性蛋白。
优选地，所述的固相载体为96孔酶标板。
进一步地，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、显色液、终止液、封闭液和洗涤液。
优选地，所述第二抗体带有可检测的标记物；
优选地，所述的标记物为辣根过氧化物酶；
优选地，所述的第二抗体为羊抗人IgM抗体；
所述的联合检测ELISA试剂盒检测肺腺癌血清样本的方法，具体为：
a)包被：用包被液分别将联合检测血清标志物蛋白浓度稀释为0.125μg/ml，按50μl/孔包被于96孔板内，置于4℃冰箱内过夜；
b)封闭：弃去孔中蛋白稀释液，于96孔板内加入封闭液，100μl/孔，置于4℃冰箱内过夜封闭；
c)洗涤：弃去孔中封闭液，将酶标板置于自动洗板机内，按照300μl洗液/孔，10秒/次，重复洗涤3次，最后拍干。
d)一抗孵育：在96孔板内相应位置加入稀释后的血清和空白对照，50μl/孔，37℃水浴锅内孵育1小时，其中，稀释后的血清是将血清用抗体稀释液按1:100比例进行稀释；空白对照为抗体稀释液；
e)洗涤：弃去孔中血清溶液，将酶标板置于自动洗板机内，按照300μl洗液/孔，10秒/次，重复洗涤5次，最后拍干；
f)二抗孵育：将HRP标记的羊抗人IgM与抗体稀释液按照1:2000比例稀释，后加入96孔酶标板，50μl/孔，37℃水浴锅内孵育1小时；
g)洗涤：弃去孔中二抗溶液，将酶标板置于自动洗板机内，按照300μl洗液/孔，10秒/次，重复洗涤5次，最后拍干。
h)显色：分别向每孔加入50μl显色液，酶标板下需垫上白纸，置于室温避光显色20min。
i)终止：分别向孔中以25μl/孔加终止液。
j)测吸光度：使用酶标仪分别测定450nm和620nm波长所对应的吸光度值，以OD450-OD620为相对OD值，然后扣去空白对照。
本发明还提供了一种可用于肺腺癌早期诊断的联合诊断模型的构建方法，具体包括以下步骤：
(1)蛋白芯片技术筛选IgM自身抗体：通过蛋白质芯片技术对肺腺癌患者和正常对照血清样本进行血清学分析，筛选潜在的可用于肺腺癌诊断的五种IgM自身抗体；
(2)通过ELISA实验对挑选出的候选IgM自身抗体指标在肺腺癌患者和正常对照的血清样本中进行验证，获得可用于肺腺癌早期诊断的联合检测血清标志物，包括TSHR、ERBB2、Survivin、PIK3CA和JAK2的自身抗体；
(3)用Logistic回归将可用于肺腺癌早期诊断的联合检测血清标志物与传统肿瘤标志物CEA联合，进而构建肺腺癌诊断模型P＝1/(1+Exp(-(1.655*ODERBB2+7.862*ODJAK2-10.285*ODTSHR+17.135*ODPIK3CA-11.294*ODSurvivin+0.299*CEA-1.899)))；式中ODERBB2、ODJAK2、ODTSHR、ODPIK3CA、ODSurvivin分别为各个IgM自身抗体指标的相对OD值减去空白对照后的吸光度值；CEA为临床运用电化学发光法检测所得的患者血清内CEA含量，单位是ng/mL。
附图说明
图1为实验例中蛋白芯片筛选出的5种IgM自身抗体血清标志物的SNR散点图以及诊断肺腺癌的ROC曲线图。
图2为实验例中ELISA验证结果的5种IgM自身抗体血清标志物的OD散点图以及诊断肺腺癌ROC曲线图。
图3为实验例中ELISA验证5种IgM自身抗体血清标志物、CEA血清标志物和二者联合诊断肺腺癌的ROC曲线图。
有益效果
本发明的可用于肺腺癌早期诊断的五种联合检测血清标志物，用于83例肺腺癌和83例正常对照的血清样本检测，结果显示，五种联合检测血清标志物联合后AUC为0.698，而传统的肿瘤标志物CEA的AUC为0.692，同时，将本发明的五种联合检测血清标志物与CEA联合后AUC可达0.827。
本发明的可用于肺腺癌早期诊断的五种联合检测血清标志物，对于肺腺癌表现出一定的诊断效果，将其与临床已有的肿瘤标志物CEA联合，构建诊断模型后，可为临床提供一种简单可行，无创伤性，成本低且诊断效能更高的诊断方法。且该模型可有效的区分肺腺癌患者和正常对照，且在不同肺腺癌患者分层中均具有较好的诊断价值。此外，该模型在不同分组中(早期及晚期肺腺癌患者；发生及未发生***转移的肺腺癌患者；发生及未发生远端转移的肺腺癌患者)的差异均具有统计学意义。该模型对肺腺癌患者的诊断及分层有一定的临床辅助功能。
具体实施方式
下面将结合附图及具体实验例对本发明的技术方案作详细描述，但需要强调的是，本发明并不受限于所述的具体实施方式。
实验例
1、血清标本收集和制备
1.1血清样本的收集
本研究共纳入研究对象430例，分为发现组和验证组，发现组用于筛选对肺腺癌诊断价值较高的IgM自身抗体指标。验证组用于对候选IgM自身抗体指标进行验证，并结合CEA构建诊断模型。
所有受试者血清标本均是2016-2019年期间于河南省某三甲医院收集，所有受试者的基本信息、病理分期及血清CEA水平等信息都在病人同意以及机构审查委员会和医院伦理委员会批准情况下，通过该医院内部***进行汇总整理。其中，血清CEA检测结果由该医院检验科提供，是采用瑞士罗氏公司生产的MODULARE70型全自动分析仪和配套试剂盒检测而得，其原理是电化学发光法。实验操作均由专业技术人员进行，结果在有经验的检验科医师查验后发布。CEA临界值为5.0ng/mL。具体受试者信息如表1所示。
表1 本发明血清样本发现组和验证组受试者临床信息
P*＜0.05
1.2血清样本的制备
所有标本均是用红头采血管采集研究对象全血5-10mL，在室温放置2小时后，1000g离心15分钟，将上清分装为500μL/管，贴好标签后于-80℃保存，避免反复冻融。
2、用于筛选肺腺癌早期诊断的联合检测血清蛋白标志物的蛋白质芯片的制备
蛋白质芯片委托于广州博翀生物科技有限公司进行定制，该芯片包含154种重组蛋白或蛋白片段，其中有11种(CIP2A/p90，c-Myc，CyclinB1，IMP1，IMP2，IMP3，RalA，RBM39，YWHAZ和两个Survivin片段)是在本实验室之前的研究(Establishment and validationof an immunodiagnostic model for prediction of breast cancer.Oncoimmunology 9(1)(2020)1682382.和Using recursive partitioning approach to select tumor-associated antigens in immunodiagnosis of gastric adenocarcinoma,Cancer Sci110(6)(2019)1829-1841.)中发现具有潜在诊断价值的基因编码蛋白质或蛋白质片段，其他143种是基于138个癌症驱动基因编码的蛋白质(Cancer genome landscapes,Science(New York,N.Y.)339(6127)(2013)1546-58.)。
3、基于蛋白芯片技术筛选实验
通过蛋白质芯片技术对发现组68例肺腺癌患者和68例正常对照进行血清学分析，筛选潜在的可用于肺腺癌诊断的联合检测血清标志物。
3.1实验所需试剂
封闭液：10％BSA与1×PBS溶液按照3:7比例混匀，置于冰上。
血清孵育液：10％BSA与1×PBST溶液按照1:9比例混匀，置于冰上。
清洗液：1×PBST，4℃保存。
二抗孵育液：包括荧光标记抗人IgM二抗(cy5标记，呈现红色)。
3.2实验具体操作步骤
a)复温：将芯片从-80℃冰箱取出，于4℃冰箱复温半小时，然后于室温复温15min。
b)封闭：复温后的芯片，14blocks围栏固定，向每个block中加入封闭液，并放置在侧摆摇床上，室温封闭3小时。
c)血清样本孵育：封闭完成后，倒尽封闭液体，然后迅速加入预先准备好的血清孵育液，每张芯片孵育14个样本(样本先放在4℃层析柜冻融，将样本用血清孵育液以1:50比例稀释，每个血清样本的上样体积为200μL，侧摆摇床20rpm，4℃过夜孵育。
d)清洗：将芯片及芯片夹一同取出，吸去样本，然后迅速加入等体积的1×PBST溶液，如此循环数次，保证在拆除芯片夹时血清样本间无交叉污染。拆除芯片夹后，将芯片置于加有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温80rpm，清洗3次，每次10min。
e)二抗孵育：将芯片转移到加入了3mL二抗孵育液的孵育盒中，侧摆摇床40rpm，避光，室温60min。
f)清洗：将芯片取出(注意不能触及或划破芯片的上表面)，置于加入有清洗液的芯片清洗盒，至于水平摇床上，80rpm清洗3次，每次10min。完成后用ddH2O清洗2次，每次10min。
g)干燥：将芯片置于芯片干燥机离心干燥。
h)扫描：按照扫描仪的操作规范和使用说明操作。
i)数据提取：将芯片图像和结果每个阵列整体对齐，按下自动对齐按钮，提取数据并保存。
j)数据处理分析：对数据进行统计分析，首先根据AUC>0.5且P<0.05的筛选出31个有潜在诊断效能的IgM自身抗体，最终挑选AUC排名前五的5种IgM自身抗体作为可用于肺腺癌早期诊断的联合检测血清标志物，分别为TSHR、ERBB2、Survivin、PIK3CA和JAK2自身抗体。基于蛋白芯片结果筛选出的5种IgM自身抗体联合检测血清标志物的SNR散点图以及诊断肺腺癌的ROC曲线图如图1所示。
所采用的数据统计分析方法具体如下：
本发明使用Mann-WhitneyU检验方法分析肺腺癌组和正常组两组间自身抗体水平的差异，使用SPSS26.0软件进行ROC分析，以特异性大于90％时约登指数最大所对应的OD值为截断值，来计算指标及模型的AUC(95％CI)、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比和准确度，进而判断指标及模型对肺腺癌的诊断能力。散点图是使用GraphPadPrism8制作完成。所有统计分析使用SPSS26.0软件进行，P<0.05为统计判断标准。
4、运用ELISA法对5种IgM自身抗体联合检测血清标志物进行验证
运用ELISA检测方法，对验证组中147例肺腺癌患者和147例正常对照血清进行TSHR、ERBB2、Survivin、PIK3CA和JAK2五种IgM自身抗体水平的检测；
4.1实验所需试剂
包被液(1L)：将1.5gNa2CO3和2.9gNaHCO3溶于800ml去离子水中，混匀，最后加水定容至1L，于4℃保存。
10×PBST洗液(1L)：将81.8gNaCl，28.8gNa2HPO4·12H2O和3.1gNaH2PO4·2H2O溶于800ml去离子水中，再加入5ml吐温20，混匀，最后加水定容至1L，于室温保存。
1×PBST洗液(1L)：取100ml10×PBST洗液至容器内，加水定容至1L并混匀，于室温保存。
封闭液(2％BSA，100ml)：取2gBSA(BIOSHARP公司)，溶于100ml1×PBST溶液中，混匀，于4℃保存。
抗体稀释液(1％BSA，100ml)：取1gBSA(BIOSHARP公司)，溶于100ml1×PBST溶液中，混匀，于4℃保存。
终止液(200ml)：取100ml去离子水于容器内，将20ml浓硫酸沿玻璃棒缓慢注入容器内，边加边搅拌，最后加水定容至200ml，于室温保存。
底物液A(100ml)：将20mgTMB溶于100ml去离子水中，混匀，于4℃避光保存。
0.75％H2O2溶液(10ml)：取75mg过氧化氢脲素溶于10ml去离子水中，混匀，于4℃避光保存。
底物液B(100ml)：将3.7gNa2HPO4·12H2O和0.92g柠檬酸溶于80ml去离子水内，再加入800μl0.75％H2O2溶液，后加水定容至100ml，于4℃避光保存。
显色液：将底物液A与底物液B按1:1比例混合，于4℃避光保存。现用现配。
4.2实验具体操作步骤
a)包被：用包被液将蛋白(武汉云克隆)浓度稀释为0.125μg/ml，按50μl/孔包被于96孔板内，置于4℃冰箱内过夜；
b)封闭：弃去孔中蛋白稀释液，于96孔板内加入封闭液，100μl/孔，置于4℃冰箱内过夜封闭。
c)洗涤：弃去孔中封闭液，将酶标板置于自动洗板机内，按照所设定的程序(300μl洗液/孔，10秒/次，重复3次)洗涤，最后拍干。
d)一抗孵育：在96孔板内相应位置加入稀释后的血清和空白对照(抗体稀释液)，50μl/孔，37℃水浴锅内孵育1小时，其中稀释后的血清是将血清用抗体稀释液(1×PBST溶液)按1:100比例进行稀释。
e)洗涤：弃去孔中血清溶液，将酶标板置于自动洗板机内，按照所设定的程序(300μl洗液/孔，10秒/次，重复5次)洗涤，最后拍干。
f)二抗孵育：将HRP标记的羊抗人IgM(SIGMA)与抗体稀释液按照1:2000比例稀释，后加入96孔酶标板，50μl/孔，37℃水浴锅内孵育1小时。
g)洗涤：弃去孔中二抗溶液，将酶标板置于自动洗板机内，按照所设定的程序(300μl洗液/孔，10秒/次，重复5次)洗涤，最后拍干。
h)显色：分别向每孔加入50μl显色液(现用现配)，酶标板下需垫上白纸，使颜色变化易于察觉，置于室温避光显色20min。
i)终止：加终止液，25μl/孔。
j)测吸光度：使用酶标仪分别测定450nm和620nm波长所对应的吸光度值，以OD450-OD620为相对OD值，然后扣去空白对照。
K)数据处理分析：五种IgM自身抗体在肺腺癌与正常对照血清中的表达水平有显著差异(P<0.05)(图2所示)，揭示了ELISA检测结果与蛋白芯片结果的一致性。但是，与以往很多类似的标志物研究相同，单个指标显示出较低的诊断价值，在特异性大于90％的条件下选择最大约登指数所对应OD值为截断值，分析得单个IgM自身抗体灵敏度范围为9.52％至17.01％，其诊断准确性也仅在51.70％到54.76％之间(表2)。
表2 实验例中5种IgM自身抗体血清检测标志物在ELISA验证中的诊断效能
*在特异性大于90％条件下，将约登指数最大时所对应的OD值定义为截断值。
5、可用于肺腺癌早期诊断的联合检测血清标志物与CEA联合诊断模型的构建
从验证组所有受试者中匹配出有血清CEA检测结果的83例肺腺癌患者和83例正常对照，基于五种IgM自身抗体的ELISA结果和临床CEA检测信息，运用Logistic回归分析将指标联合分析，应用Logistic回归将候选IgM自身抗体指标与传统肿瘤标志物CEA联合进而构建肺腺癌诊断模型P＝1/(1+Exp(-(1.655*ODERBB2+7.862*ODJAK2-10.285*ODTSHR+17.135*ODPIK3CA-11.294*ODSurvivin+0.299*CEA-1.899)))；式中ODERBB2、ODJAK2、ODTSHR、ODPIK3CA、ODSurvivin分别为各个IgM自身抗体指标的相对OD值减去空白对照后的吸光度值；CEA为临床运用电化学发光法检测所得的患者血清内CEA含量，单位是ng/mL。
诊断结果如图3所示，单个CEA的AUC仅为0.692，五种IgM自身抗体联合后AUC为0.698，将五种IgM自身抗体与CEA联合后AUC可达0.827；结果表明，将两种不同类型的生物标志物联合构建诊断模型可有效提高在肺腺癌中的诊断效能。
6、可用于肺腺癌早期诊断的联合检测血清标志物与CEA联合诊断模型在肺腺癌诊断中的应用
1)诊断模型在肺腺癌和正常对照中的诊断效能
本发明通过Logistic回归将5个候选IgM自身抗体指标与传统肿瘤标志物CEA联合，构建肺腺癌诊断模型。该模型在83例肺腺癌和83例正常对照的样本中，其AUC(95％CI)达0.827(0.765-0.890)，灵敏度和特异度为56.63％，93.98％(图3和表3)。结果显示，此模型对肺腺癌患者具有良好的诊断能力。
2)诊断模型在早期及晚期肺腺癌患者中的诊断效能
根据肺腺癌患者的TNM分期将其分为23例早期肺腺癌患者，55例晚期肺腺癌患者和5例分期不明的肺腺癌患者。该诊断模型在不同分期中的ROC结果显示，23例早期肺腺癌对83例正常对照的AUC(95％CI)，灵敏度，特异度和准确度分别为0.744(0.625-0.864)，39.13％，95.18％，83.02％；此外，对于55例晚期肺腺癌对83例正常对照的AUC(95％CI)，灵敏度，特异度和准确度分别为0.861(0.793-0.928)，65.45％，92.77％，81.88％(表3)。结果表明此模型对于早期肺腺癌诊断具有较高的准确性。
3)诊断模型在不同***转移情况的肺腺癌患者中的诊断效能
根据肺腺癌患者的***转移情况将其分为32例未发生***转移的肺腺癌患者，47例存在***转移的肺腺癌患者和4例情况不明的肺腺癌患者。该诊断模型在不同***转移情况的肺腺癌患者中的ROC结果显示，对于32例未发生***转移的肺腺癌患者和83例正常对照中，该模型的AUC(95％CI)，灵敏度，特异度和准确度分别为0.805(0.713-0.897)，43.75％，92.77％，79.13％，而在区分47例存在***转移的肺腺癌患者和83例正常对照时，该模型的AUC(95％CI)，灵敏度，特异度和准确度分别为0.843(0.764-0.921)，63.83％，96.39％，84.62％(表3)。并且，该诊断模型在发生和未发生***转移的肺腺癌患者之间的差异也具有统计学意义(P<0.05)。因此，本发明结果提示，该模型可以用于不同***转移情况下的肺腺癌患者的诊断，尤其对于存在***转移的患者具有更高的诊断价值。
4)诊断模型在不同远端转移情况的肺腺癌患者中的诊断效能
根据肺腺癌患者的远端转移情况将其分为43例未发生远端转移的肺腺癌患者，34例存在远端转移的肺腺癌患者和6例远端转移情况不明的肺腺癌患者。该模型在不同远端转移情况的肺腺癌患者中的分析结果显示，当患者未发生远端转移时，其AUC(95％CI)，灵敏度，特异度和准确度分别为0.769(0.679-0.859)，44.19％，93.98％，76.98％；在患者存在远端转移时，其AUC(95％CI)，灵敏度，特异度和准确度分别为0.892(0.817-0.967)，67.65％，96.39％，88.03％(表3)。另外，该模型在发生和未发生远端转移的肺腺癌患者之间也有显著性差异(P<0.05)。本发明结果提示，该模型可以用于不同远端转移情况下的肺腺癌患者的诊断，尤其对于存在远端转移的患者具有更高的诊断价值。
表3 实验例中5种IgM自身抗体血清检测标志物和CEA构建的诊断模型在不同肺腺癌患者分层中的诊断效能
P值表示早期和晚期、***转移(-)和***转移(+)、远端转移(-)和远端转移(+)之间的差异。
以上实验例仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种可用于肺腺癌早期诊断的联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固相载体和包被于固相载体上的联合检测血清标志物所对应的特异性蛋白；所述血清标志物为五种IgM自身抗体，包括TSHR、ERBB2、Survivin、PIK3CA和JAK2的自身抗体。
2.如权利要求1所述的可用于肺腺癌早期诊断的联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述的固相载体为96孔酶标板。
3.如权利要求1所述的可用于肺腺癌早期诊断的联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、显色液、终止液、封闭液和洗涤液。
4.如权利要求3所述的可用于肺腺癌早期诊断的联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述第二抗体带有可检测的标记物。
5.如权利要求4所述的可用于肺腺癌早期诊断的联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述的标记物为辣根过氧化物酶。
6.如权利要求5所述的可用于肺腺癌早期诊断的联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述的第二抗体为羊抗人IgM抗体。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的联合检测ELISA试剂盒用于非疾病的诊断和治疗目的的检测肺腺癌血清样本的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
a)包被：用包被液分别将联合检测血清标志物蛋白浓度稀释为0.125μg/ml，按50μl/孔包被于96孔板内，置于4℃冰箱内过夜；
b)封闭：弃去孔中蛋白稀释液，于96孔板内加入封闭液，100μl/孔，置于4℃冰箱内过夜封闭；
c)洗涤：弃去孔中封闭液，将酶标板置于自动洗板机内，按照300μl洗液/孔，10秒/次，重复洗涤3次，最后拍干；
d)一抗孵育：在96孔板内相应位置加入稀释后的血清和空白对照，50μl/孔，37℃水浴锅内孵育1小时，其中，稀释后的血清是将血清用抗体稀释液按1:100比例进行稀释；空白对照为抗体稀释液；
e)洗涤：弃去孔中血清溶液，将酶标板置于自动洗板机内，按照300μl洗液/孔，10秒/次，重复洗涤5次，最后拍干；
f)二抗孵育：将HRP标记的羊抗人IgM与抗体稀释液按照1:2000比例稀释，后加入96孔酶标板，50μl/孔，37℃水浴锅内孵育1小时；
g)洗涤：弃去孔中二抗溶液，将酶标板置于自动洗板机内，按照300μl洗液/孔，10秒/次，重复洗涤5次，最后拍干；
h)显色：分别向每孔加入50μl显色液，酶标板下需垫上白纸，置于室温避光显色20min；
i)终止：分别向孔中以25μl/孔加终止液；
j)测吸光度：使用酶标仪分别测定450nm和620nm波长所对应的吸光度值，以OD450-OD620为相对OD值，然后扣去空白对照。
8.一种可用于肺腺癌早期诊断的联合诊断模型的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)蛋白芯片技术筛选IgM自身抗体：通过蛋白质芯片技术对肺腺癌患者和正常对照血清样本进行血清学分析，筛选潜在的可用于肺腺癌诊断的五种IgM自身抗体；
(2)通过ELISA实验对挑选出的候选IgM自身抗体指标在肺腺癌患者和正常对照的血清样本中进行验证，获得可用于肺腺癌早期诊断的联合检测血清标志物，包括TSHR、ERBB2、Survivin、PIK3CA和JAK2的自身抗体；
(3)用Logistic回归将可用于肺腺癌早期诊断的联合检测血清标志物与传统肿瘤标志物CEA联合，进而构建肺腺癌诊断模型P＝1/(1+Exp(-(1.655*ODERBB2+7.862*ODJAK2-10.285*ODTSHR+17.135*ODPIK3CA-11.294*ODSurvivin+0.299*CEA-1.899)))；式中ODERBB2、ODJAK2、ODTSHR、ODPIK3CA、ODSurvivin分别为各个IgM自身抗体指标的相对OD值减去空白对照后的吸光度值；CEA为临床运用电化学发光法检测所得的患者血清内CEA含量，单位是ng/mL。
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