KR100698449B1

KR100698449B1 - 안구 혈관신생 질환 치료용 스타우로스포린 유도체의 용도

Info

Publication number: KR100698449B1
Application number: KR1020017006415A
Authority: KR
Inventors: 로물러스 킴브로 브랫쩰; 지네뜨 마요리 우드; 피터 안토니 캄포치아로; 프란시스 엘리자베쓰 칸
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 1998-11-23
Filing date: 1999-11-22
Publication date: 2007-03-23
Also published as: ES2211197T3; DK1131073T3; NZ511559A; BR9915569A; EP1131073B1; PT1131073E; ATE252387T1; CA2348890C; CA2348890A1; NO328085B1; DE69912304D1; JP2002530342A; WO2000030651A1; NO20012490D0; KR20010078398A; IL142757A0; CN1172673C; EP1131073A1; AU1506600A; NO20012490L

Abstract

본 발명은 안구 혈관 신생을 치료 또는 예방용 방법을 제공한다. 이 방법은 스타우로스포린 유도체를 유효량 투여하여 망막 또는 맥락막 혈관신생을 치료 또는 예방한다.

Description

안구 혈관신생 질환 치료용 스타우로스포린 유도체의 용도 {Use of Staurosporine Derivatives for Treating Ocular Neovascular Diseases}

본 발명은 안구 혈관신생 질환, 예를 들어 망막 혈관신생 및 맥락막 혈관신생을 치료하는 의약의 제조에서 특히 스타우로스포린 유도체의 용도에 관한 것이다.

눈의 망막은 두개의 혈관상으로부터 혈관 공급을 받는데, 망막 혈관은 망막의 내부의 2/3에, 맥락막 혈관은 외부의 1/3에 공급한다. 망막 모세혈관의 차단을 초래하는 망막 혈관 손상은 당뇨병성 망막증, 미숙아의 망막증, 망막정맥분지폐쇄증 및 망막중심정맥폐쇄증을 포함하는 여러가지 질환 진행에서 일어나고; 그들은 허혈성 망막증으로서 집합적으로 취급된다. 망막 허혈은 혈관신생을 자극하는 하나 이상의 맥관형성 인자를 방출시킨다. 새로운 혈관은 망막의 내부 표면을 따라 정렬되어 있고, 유리체의 외부 표면을 따라 성장하는 내경계막 (Internal Limiting Membrane, ILM)을 관통한다. 이들은 다른 많은 세포들을 모으고, 망막을 끌어당기는 혈관, 세포 및 외세포 매트릭스의 시트를 생성하는데, 이는 종종 망막을 탈리시키고, 심한 시력 상실을 가져온다.

맥락막 혈관신생은 다수의 질환이 진행되는 중에 일어나는데, 이들 중 가장 흔한 것은 노후관련 황반 변성이다. 이 상태에서, 특히 정확하고 세밀한 시력을 위해 조절되는 황반은 광수용체 및 RPE 세포의 점차적인 사멸로 손상된다. 이것은 점차적인 중심시의 상실을 가져오는 질병의 변성 부분을 구성한다. 세포 사멸의 원인은 공지되어 있지 않으며, 현재 치료법이 전혀 없다. 변성이 일어날 때, 새로운 혈관이 맥락막으로부터 성장하여 서브-RPE 및 망막하 공간으로 침범해가는 경향이 있다. 이러한 진행을 맥락막 혈관신생 (CNV)이라고 하고, 이것은 종종 출혈 및 반흔화로부터의 빠르고 심각한 시력 상실을 초래한다. CNV가 윤곽이 잘 잡혀있고 와(窩)의 중심 아래에 있지 않는 경우 (소수 환자에만 해당), 레이저 치료가 때로는 도움이 될 수 있다. 초기에 레이저가 성공적일 때조차도, 재발성 CNV와 시력 상실이 높은 비율로 나타난다. 혈관 성장 자극에 직접적인 치료법이 필요하며, 망막 또는 맥락막 혈관신생 환자에게 이로울 것이다.

본 발명에 따라 망막 혈관신생 및 맥락막 혈관신생을 포함하는 안구 혈관신생 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 이 방법에는 유효량의 스타우로스포린 유도체 또는 그의 염을 투여하는 단계가 있다.

본 발명의 스타우로스포린 치료는 제한된 효능을 갖는 선행 기술의 레이저 치료와는 달리 안구 혈관신생을 억제하고 예방하는데 매우 효과적이다. 또한, 스타우로스포린 치료는 선행 기술의 치료 방법, 예를 들어 침해적이고 복잡한 장치가 요구되는 레이저 치료와는 달리 투여가 간단하다.

본 발명은 안구 혈관신생 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 스타우로스포린 유도체를 함유하는 의약을 사용한다. 이제, 놀랍게도 본 발명자들은 화학식 I의 화합물이 망막 혈관신생 및 맥락막 혈관신행을 포함하여 안구 혈관신생을 치료하는데 매우 유용하다는 것을 밝혀내었다.

따라서, 본 발명은 안구 혈관신생 질환의 치료 및(또는) 예방용 의약의 제조에서 화학식 I의 화합물의 용도에 관한 것이다.

<화학식 I>

식 중, R은 히드로카르빌 라디칼 R°또는 아실 라디칼 Ac이다.

적합한 히드로카르빌 라디칼로는 최대 총 탄소 원자수가 바람직하게는 30, 특히 18인 아시클릭, 카르보시클릭 및 카르보시클릭-아시클릭 히드로카르빌 라디칼이 있다.

더욱 적합한 히드로카르빌 라디칼은 헤테로시클릭 라디칼 및 헤테로시클릭-아시클릭 라디칼이다. 히드로카르빌 라디칼 (R°)은 포화 또는 불포화될 수 있으며, 치환되거나 또는 비치환될 수 있다. 적합한 아실 라디칼로는 임의로 관능적으로 변형된 카르복실산 및 유기 술폰산, 및 임의로 에스테르화된 인산, 예를 들어 피로- 또는 오르토-인산이 있다.

바람직한 아시클릭 히드로카르빌 라디칼로는 C₁-C₂₀-알킬 라디칼; 히드록시기가 1-위치 이외의 임의의 위치에 있는 C₂-C₂₀ 히드록시알킬 라디칼; 시아노-[C₁-C₂₀]-알킬 라디칼; 카르복시-[C₁-C₂₀]-알킬 라디칼; 및 유리 원자가가 이중 결합이 있는 탄소 원자에 있지 않은 C₃-C₂₀-알케닐 라디칼이 있다. 전형적인 아시클릭 히드로카르빌 라디칼은 저급 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 및 헵틸; 저급 알케닐, 예를 들어 프로페닐, 2- 또는 3-메탈릴 및 2- 또는 3-부테닐; 저급 알카디에닐, 예를 들어 1-펜타-2,4-디닐; 및 저급 알키닐, 예를 들어 프로파르길 또는 2-부티닐의 라디칼이다. 바람직한 카르보시클릭 히드로카르빌 라디칼은 모노-, 비- 또는 폴리시클릭 시클로알킬, 예를 들어 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 비시클로[2,2,2]옥틸, 2-비시클로[2,2,1]헵틸 및 아다만틸; 시클로알케닐; 시클로알칸디에닐; 및 상응하는 아릴의 라디칼이다. 아릴 라디칼로는 페닐, 나프틸 (예를 들어, 1- 또는 2-나프틸), 비페닐릴 (예를 들어, 4-비페닐릴), 안트릴, 플루오레닐, 아줄레닐의 라디칼 및 그의 하나 이상의 포화 고리를 갖는 방향족 동족체가 있다. 바람직한 카르보시클릭-아시클릭 라디칼은 하나 이상의 카르보시클릭 라디칼을 갖는 아시클릭 라디칼이다. 헤테로시클릭 라디칼 및 헤테로시클릭-아시클릭 라디칼로는 방향족 특성의 모노시클릭, 비시클릭, 폴리시클릭, 아자-, 티아-, 옥사-, 티아자-, 옥사자-, 디아자-, 트리아자- 및 테트라자-시클릭 라디칼이 있다.

임의로 관능적으로 변형된 카르복실산 (Ac¹)으로부터 유래된 아실 라디칼의 예는 화학식 Z-C(=W)- (식 중, W는 산소, 황 또는 이미노이고, Z는 수소, 히드로카르빌 R°, 히드로카르빌옥시 R°O, 또는 아미노임)이다. 바람직하게는 W는 산소 또는 황이고, Z는 C₁-C₇ 알킬, 특히 할로겐, 카르복시 또는 C₁-C₄ 알콕시카르보닐로 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬이다. 추가로 바람직한 Z는 페닐, 피리딜, 푸릴, 티에닐, 이미다졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 벤조푸라닐 또는 벤즈이미다졸릴이며, 이들 각각은 치환되지 않거나 또는 C₁-C₄ 알킬, C₁-C₄ 알콕시, 할로겐, 니트로, 트리플루오로메틸, 카르복시, C₁-C₄ 알콕시카르보닐, 메틸렌디옥시, 시아노 및(또는) 그의 염으로 치환된다. 바람직한 Ac¹아실 라디칼은 화학식 R_b°-CO- (식 중, R_b°는 수소, 벤조일, 또는 히드로카르빌 라디칼, 예를 들어 카르복시기, 시아노기, 에스테르기, 아미노기 또는 할로겐으로 임의로 치환된 C₁-C₁₉ 알킬 라디칼임)이다. 바람직한 Ac ¹아실 라디칼의 또다른 기는 화학식 R°-O-CO-이다. 그러나, 바람직한 Ac¹아실 라디칼의 또다른 기는 하기의 화학식과 같다.

식 중, R₁ 및 R₂는 수소 및 비치환된 아시클릭 C₁-C₇ 히드로카르빌, 바람직하게는 C₁-C₄ 알킬 및 C₃-C₇ 알케닐로부터 독립적으로 선택된다. R ₁ 및 R₂는 독립적으로 최대 탄소 원자수 10의 모노시클릭 아릴, 아르알킬 또는 아르알케닐일 수 있으며, 이들 각각은 임의로는 C₁-C₄ 알킬, C₁-C₄ 알콕시, 할로겐 및(또는) 니트로로 임의로 치환된다. 이들 기의 특히 바람직한 라디칼은 R₁의 경우 수소이고, R₂의 경우 임의로 치환된 C₁-C₄ 알킬, C₃-C₇ 알케닐, 페닐, 피리딜, 피리미딜, 푸릴, 티에닐, 이미다졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 벤조푸라닐 또는 벤즈이미다졸릴이다.

유기 술폰산 (Ac²)로부터 유래된 아실 라디칼의 예는 화학식 R°-SO₂- (식 중, R°은 히드로카르빌 라디칼임)이다. 바람직하게는, 술폰산 아실 라디칼의 R°는 C₁-C₇ 알킬, 페닐, 피리딜, 피리미딜, 푸릴, 티에닐, 이미다졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 벤조푸라닐 또는 벤즈이미다졸릴이며, 이들 각각은 치환되지 않거나 또는 C₁-C₄ 알킬, C₁-C₄ 알콕시, 할로겐, 니트로, 트리플루오로메틸, 카르복시, C₁-C₄ 알콕시카르보닐, 메틸렌디옥시, 시아노 및(또는) 그의 염으로 치환된다.

임의로 에스테르화된 인산 (Ac³)으로부터 유래된 아실 라디칼의 예는 하기의 화학식과 같다.

식 중, R₁ 및 R₂는 독립적으로 수소, 비치환된 아시클릭 C₁-C₇ 히드로카르빌, 바람직하게는 C₁-C₄ 알킬 및 C₃-C₇ 알케닐로부터 선택된다. R₁ 및 R₂는 독립적으로 최대 탄소 원자수 10의 모노시클릭 아릴, 아르알킬 또는 아르알케닐일 수 있으며, 이들 각각은 C₁-C₄ 알킬, C₁-C₄ 알콕시, 할로겐 및(또는) 니트로로 임의로 치환된다.

더욱 적합한 스타우로스포린 유도체로는 화학식 I의 스타우로스포린 (식 중, R은 글리신, 페닐글리신, 알라닌, 페닐알라닌, 프롤린, 루이신, 세린, 발린, 티로신, 아르기닌, 히스티딘 및 아스파라긴으로부터 선택되는 α-아미노산으로부터 유래됨) 또는 그의 염이 있다. 본 발명의 적합한 스타우로스포린 유도체는 카라바티 (Caravatti) 등의 미국 특허 제 5,093,330호에 더욱 상세히 개시되어 있다. 이 특허 발명의 스타우로스포린 유도체의 설명은 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명의 특히 바람직한 화학식 I의 스타우로스포린 유도체로는, N-(3-카르복시프로피오닐)-스타우로스포린, N-벤조일-스타우로스포린, N-트리플루오로아세틸-스타우로스포린, N-메틸아미노티오카르보닐-스타우로스포린, N-페닐카르바모일-스타우로스포린, N-(3-니트로벤조일)-스타우로스포린, N-(3-플루오로벤조일)-스타우로스포린, N-tert-부톡시카르보닐-스타우로스포린, N-(4-카르복시벤조일)-스타우로스포린, N-(3,5-디니트로벤조일)-스타우로스포린, N-알라닐-스타우로스포린, N-에틸-스타우로스포린, N-카르복시메틸-스타우로스포린, N-[(tert-부톡시카르보닐아미노)-아세틸]-스타우로스포린, N-(2-아미노아세틸)-스타우로스포린 및 이들의 제약학적으로 허용되는 염이 있다.

화학식 I의 화합물을 활성 성분으로서 함유하는 본 발명의 제약 조성물은 포유동물, 특히 사람의 안구 혈관신생을 치료하기 위해 장, 비강, 협측, 직장내, 국소, 경구, 및 비경구 투여, 예를 들어 정맥내, 근육내, 유리체내, 결막하 또는 피하 투여할 수 있다. 이 조성물은 활성 성분을 단독으로, 또는 바람직하게는 활성 성분과 제약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 활성 성분의 유효 투여량은 표적 질환의 유형 뿐만아니라, 환자의 종, 연령, 체중 및 신체 상태, 약동학적 데이타, 및 투여 방식에 좌우된다.

화학식 I의 화합물은 포유동물, 예를 들어 사람의 병리 상태에 대해 유효량으로 투여한다. 약 70 kg의 체중을 갖는 사람에게 투여되는 일일 전신 투여량은 활성 성분 약 0.1 g 내지 약 20 g, 바람직하게는 약 0.5 g 내지 약 5 g이고, 적합한 제약 조성물은 활성 성분을 약 1% 내지 약 95% 함유할 수 있다. 적합한 단위 투여 형태로는 코팅 및 코팅되지 않은 정제, 앰플, 바이알, 좌약, 캡슐제가 있다. 다른 적합한 투여 형태는 주사, 안내 기구, 유리체내 장치, 연고, 크림, 페이스트, 발포제, 팅크제, 립스틱, 점안제, 정경구제, 분무제, 분산액 등이 있다. 본 발명의 제약 조성물은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 통상의 혼합, 과립화, 코팅, 용해 또는 동결건조 방식으로 제조한다.

활성 성분의 용액, 및 또한 현탁액 또는 분산액, 특히 등장 수용액, 분산액 또는 현탁액을 사용하는 것이 바람직하다. 활성 성분을 함유하는 적합한 제약 조성물은 담체, 예를 들어 만니톨 및 전분, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 가용화제, 삼투압 조절용 염, 완충액 등을 함유할 수 있다. 조성물은 당업계에 공지된 방식, 예를 들어 통상의 용해 및 동결건조 방식으로 제조한다. 조성물의 용액 또는 현탁액 형태는 점도-증가제, 예를 들어 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈 및 젤라틴; 및 가용화제, 예를 들어 트윈 (Tween) 80 [폴리옥시에틸렌(20)소르비탄 모노-올레이트; 미국 소재 ICI 아메리카스, 인크 (Americas, Inc.)의 상표명]을 함유할 수 있다.

적합한 담체로는 충전제, 예를 들어 설탕, 예를 들어 락토오스, 사카로오스, 만니톨 또는 소르비톨; 셀룰로오스 제제; 인산 칼슘, 예를 들어 인산삼칼슘 및 인산수소칼슘; 결합제, 예를 들어 전분, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈; 및 목적한다면, 붕해제, 예를 들어 전분, 가교결합된 폴리비닐피롤리돈, 알긴산 또는 그의 염이 있다. 더욱 적합한 부형제는 유동 조절제 및 윤활제, 예를 들어 규산, 활석, 스테아르산 및 그의 염, 예를 들어 스테아르산 마그네슘 또는 칼슘, 폴리에틸렌 글리콜 및 그의 유도체이다.

본 발명의 활성 성분, 즉, 스타우로스포린 유도체는 완전히 또는 실질적으로 완전히 안구 혈관신생, 특히 망막 혈관신생 및 맥락막 혈관신생을 억제한다. 또한, 본 발명의 화합물을 개인에게 투여시 예방 효능이 관찰된다. 각 경우, 완전히 또는 거의 완전히 억제하는 병적 혈관에 대한 효과는 극적이고 충분하지만, 성숙한 망막 혈관에 대한 확인될만한 독성 효과는 없다.

본 발명을 하기의 실시예로 더 예시한다. 그러나, 이것은 본 발명을 한정하려는 의도는 아니다.

실시예 1

허혈성 망막증을 스미스 (Smith) 등의 문헌 (Oxygen-induced Retinopathy in the Mouse, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35, 101-111 (1994))에 기술된 방식으로 C57/BL6J 마우스에 생기게 하였다. 생후 7일된 마우스와 그의 어미를 밀폐된 인큐베이터에 놓고 5일간 75 ±3% 산소 분위기에 노출시켰다. 인큐베이터 온도를 23 ±2 ℃로 유지하고, 산소를 산소 분석기로 8시간마다 측정하였다. 5일 후, 마우스를 인큐베이터로부터 꺼내어, 실내 공기하에 놓고, 약물 치료하였다. N-벤조일-스타우로스포린 (NBS)를 디메틸 술폭시드 (DMSO)에 용해시키고, 물을 사용하여 최종 농도로 희석하였다; DMSO의 최대 농도는 1%였다. 비히클 (1% DMSO) 또는 비히클을 함유하는 다양한 농도의 약물 (부피 = 체중의 단위 그램당 10 ㎕)은 가바즈 (gavage)로 위에 넣었다. 다른 마우스에는 체중의 단위 kg당 NBS 60, 300 또는 600 mg을 투여하였다. 마우스 대조군에는 NBS 무함유 비히클을 투여하였다.

처치 5일 후, 마우스를 희생시키고, 눈을 빨리 제거하고, 최적 컷팅 온도로 임베딩시키는 화합물 (Optimum cutting temperature embedding compound (OCT); 미국 인디애나주 엘크하르트 소재 마일스 디아그노스틱사 (Miles Diagnostics)) 중에서 동결시키거나, 또는 10% 인산염-완충된 포르말린 중에 고정시켜 파라핀에 임베딩시켰다. 성숙 C57BL6J 마우스를 또한 약물 또는 비히클로 가바즈 처치하고, 5일 후에 희생시켜서 눈을 동결 또는 파라핀 절편 처리하였다.

약물-처치된 마우스와 대조 마우스로부터의 눈의 동결 절편 (10 ㎛)을 내피 세포에 선택적으로 결합하는 바이오틴화된 그리포니아 심플리시폴리아 렉틴 (griffonia simplicifolia lectin) B4 (미국 캘리포니아 벌링검 소재의 벡터 래보러토리스사 (Vector Laboratories))로 조직화학적으로 염색하였다. 슬라이드를 메탄올/H₂O₂ 중에 4 ℃에서 10분간 인큐베이션하고, pH 7.6 (TBS)의 0.05 M 트리스-완충 염수로 세척하고, 30분간 10% 정상 돼지 혈청에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 바이오틴화된 렉틴과 함께 실온에서 2시간 인큐베이션하고, 0.05 M TBS로 헹군 후, 퍼옥시다제 (벡터 래보러토리스사)에 커플링된 아비딘과 함께 45분간 실온에서 인큐베이션하였다. 10분간 0.05 M의 TBS로 세척한 후, 슬라이드를 디아미노벤지딘과 함께 인큐베이션하여 갈색 반응 생성물을 얻었다. 몇몇 슬라이드는 헤마톡실린으로 대비염색하고, 모든 슬라이드를 시토실 (Cytoseal)로 마운팅하였다.

정량 분석을 위해, 10 ㎛의 연속 절편을 각각의 눈의 절반에 걸쳐 자르고, 약 50 내지 60 ㎛ 떨어진 절편을 렉틴으로 염색하여 분석용으로 하나의 눈 당 13 절편을 얻었다. 렉틴-염색한 절편을 악시오스콥 (Axioskop) 현미경 (미국 뉴욕 토른우드 소재 제이스사 (Zeiss))로 검사하고, 영상을 3 CCD 컬러 비디오 카메라 (IK-TU40A, 일본 동경 소재 도시바사 (Toshiba)) 및 프레임 그래버 (frame grabber)를 사용하여 디지탈화하였다. 영상-프로 플러스 소프트웨어 (미국 메사추세스주 실버 스프링 소재의 미디아 사이버네틱스사 (Media Cybernetics))를 사용하여 망막 표면 상의 렉틴-염색된 세포를 도해하고, 그 면적을 측정하였다. 각각의 눈으로부터의 13개의 측정 방법은 단일 실험값으로서 사용되었다.

NBS 무함유 비히클로 처치된 허혈성 망막증이 있는 마우스는 몇몇의 연결 혈관의 표층 (superficial) 및 심층 (deep)의 모세혈관상에서 정상 혈관을 보이는 비허혈성 마우스와 비교할 때 망막 표면 상에 커다란 세포 응집체를 갖는 망막에 내피 세포 염색 영역이 현저히 증가된 것을 보여 주었다. 5일동안 하루에 일회 NBS 600 mg/kg을 투여한 허혈성 마우스는 비히클-처치된 마우스와 비교할 때, 망막 표면 상 및 망막내에서 내피 세포 염색이 극적으로 감소하였다. 사실, NBS-처치된 허혈성 마우스의 망막내 내피 세포 염색은 비허혈성 마우스에 비해 적었다. 고배율로 관찰하면 망막 표면상에서 내피 세포를 확인할 수 없는데, 이것은 혈관신생이 완전히 억제되었음을 가리키는 것이다. 또한, 심층 모세혈관상이 정상적으로 위치하는 곳에서 내핵층 및 외망상층에서 내피 세포 염색의 현저한 부재가 있었다.

하루 2회 NBS 300 mg/kg 또는 60 mg/kg을 가바즈로 투여한 허혈성 망막증이 있는 마우스는 비히클-처치된 대조 마우스의 망막에서의 응집보다 망막 표면상에서의 혈관 신생의 몇몇 응집이 덜함을 나타내었다. NBS-처치된 마우스의 망막은 또한 망막내 내피 염색에 있어서 약간 감소함을 보였다. 영상 분석 결과, 하루 1회 600 또는 60 mg/kg으로 처치한 마우스의 망막 위와 내부의 내피 세포 염색은 비히클-처치한 마우스에서보다 현저히 적었으며, 하루 2회 처치한 마우스와 비교할 때 투여량-의존 효과를 나타내었다. 이 결과는 스타우로스포린 유도체가 망막 혈관신생을 억제한다는 것을 명백하게 증명한다.

실시예 2

성숙 C57BL6J 마우스는 가바즈로 하루 1회 비히클 또는 NBS 600 mg/kg을 투여하고, 5일 후 희생시켜 그들의 눈을 실시예 1과 같이 처리하였다.

영상 분석 결과 NBS-처치한 마우스의 망막 내 내피 염색의 총 면적 또는 망막 혈관의 양상이 비히클-처치한 마우스와 비교하여 차이가 없음을 보여준다. 분석은 또한 NBS- 및 비히클-처치한 마우스 사이의 망막 내피 세포 염색의 양에 차이가 없음을 보여준다. 이것은 스타우로스포린 유도체가 성숙 혈관의 내피 세포에 독성이 없음을 증명한다.

실시예 3

신생아 C57/BL6J 마우스 (신생아 마우스)의 무리를 약물 또는 비히클 100 mg/kg 각각을 매일 피하 주사하는 처치군과 대조군으로 나누었다. 생후 7일 또는 10일이 되면, 에테르로 마취시키고, 토브 (Tobe) 등의 문헌 (Evolution of Neovascularizaion in Mice with Overexpression of VEGF in Photoreceptors, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998))에 기술된 것과 같이 플루오레세인-표지된 덱스트란 (평균 분자량 2 X 10⁶, 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마사 (Sigma)) 50 mg/㎖을 함유하는 인산염-완충 염수 1 ㎖로 관류시켰다. 눈을 제거하고, 1시간동안 10% 인산염-완충 포르말린에 고정하였다. 각막 및 렌즈를 제거하고, 망막 전체를 주의하여 냉안배로부터 절개하였다. 망막연부로부터 적도 방향으로 방사성으로 균일하게 4분구로 절단하고, 망막을 광수용체로 상부에 면하도록 아쿠아마운트 (Aquamount) 중에 편평하게 올렸다. 편평한 표본을 형광 현미경으로 검사하고, 영상을 3 CCD 컬러 비디오 카메라 및 프래임 그래버 (frame grabber)로 디지탈화하였다. Image-Pro (상표) Plus를 각각의 4분구 중 시신경의 중심부로부터 성장하고 있는 망막 혈관의 선행부 (leadign front)까지의 거리를 측정하는데 사용하고, 평균값을 단일 실험값으로서 사용하였다.

생후 7일에, 비히클-처치한 마우스의 망막 혈관은 망막의 주변연부에 거의 도달하지만, NBS-처치한 마우스의 망막 혈관은 단지 주변의 약간 반 이상으로 신장되기만 하였다. 생후 10일에, 표층 모세혈관상은 망막의 주변연부로 모든 방향으로 완전히 신장되었고, 심층 모세혈관상은 부분 성장하였다. 그러나, NBS-처치한 마우스에서, 표층 모세혈관상은 망막연부까지 도달하지는 않았다. 시신경으로부터 혈관 전방부까지의 거리는 영상 분석으로 계산하였는데, 생후 7일 및 10일된 처치 마우스과 대조 마우스간의 차이는 통계학적으로 유의하였다. 이것은 스타우로스포린 유도체가 망막 혈관 성장을 억제한다는 것을 나타낸다.

실시예 4

C57BL/6J 마우스를 동물 치료를 위한 시력 및 안과학 연구협회 (Association for Research in Vision and Ophthalmology, ARVO) 해결법에 따라 치료하였다. 맥락막 혈관신생을 상기 기술된 기술 (토브 (Tobe) 등의 문헌: Targeted disruption of the FGF2 gene dose not prevent choroidal neovascularization in a murine model, Amer. J Path, in press)의 변형법으로 생성시켰다. 간단히, 생후 4 내지 5주된 수컷 C57BL/6J 마우스를 케타민 히드로클로라이드 (100 mg/kg 체중)로 마취시키고, 동공을 1% 트로피카미드로 확장시켰다. 크립톤 레이저 광응고법의 3개의 열상 (Burn) (100 ㎛의 반점 크기, 0.1초간 지속, 150 mW)을 코헤런트 모델 (Coherent Model) 920 광응고기 및 콘택트 렌즈로서 핸드 헬드 커버 슬라이드 (hand held cover slide)의 슬릿 램프 전달 시스템을 이용하여 각각의 망막으로 전달시켰다. 열상을 망막 후극의 9, 12 및 3시 방향으로 수행하였다. 브루크막 파열을 나타내는 레이저 시간대에서의 버블의 생성은 CNV를 얻는 중요한 인자여서, 단지 버블이 모든 3개의 열상으로 생성되는 마우스만을 포함시켰다. 10마리의 마우스를 랜덤하게 비히클 단독 처치하도록 하고, 10마리 마우스를 가바즈에 의해 NBS 400 mg/kg/일을 함유하는 비히클로 경구 투여하도록 하였다. 14일 후, 마우스를 과량의 펜토바르비탈 소듐으로 희생시키고, 빨리 눈을 제거하고, 최적 컷팅 온도로 임베딩시키는 화합물 (OCT) 중에서 동결시켰다. 동결 연속 절편 (10 ㎛)을 각각의 열상 전체 부위를 통해 절단하고 내피 세포에 선택적으로 결합하는 바이오틴화된 그리포니아 심플리시폴리아 렉틴 B4 (미국 캘리포니아 벌링검 소재의 벡터 래보러토리스사)로 조직화학적으로 염색하였다. 슬라이드를 메탄올/H₂O₂ 중에 30분간 4 ℃에서 인큐베이션하고, pH 7.4의 0.05 M 트리스-완충 염수 (TBS)로 세척하고, 30분간 10% 정상 돼지 혈청 중에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 0.05 M TBS로 헹군 후, 37 ℃에서 바이오틴화된 렉틴과 함께 2시간동안 인큐베이션하였다. 0.05 M의 TBS로 헹군 후, 슬라이드를 스트렙타비딘 (streptavidin)-포스파타제 (미국 메릴랜드주 케빈 존 소재 키르케가르드 및 페리 래보러토리스사 (Kirkegaard and Perry Laboratories))와 함께 30분간 실온에서 인큐베이션하였다. pH 7.6의 0.05 M 트리스 완충액 중에서 10분간 인큐베이션한 후, 슬라이드를 히스토마크 레드 (Histomark Red) (키르케가르드 및 페리 래보러토리스사)로 현상하여 적색의 반응 생성물을 얻고, 시토실 (미국 뉴저지주 리버대일 소재 스테펜스 사이언티픽사 (Stephens Scientific))로 마운팅하였다. 몇몇 슬라이드를 콘트래스트 블루 (키르케가르드 및 페리 래보러토리스사)로 대조염색하였다.

정량 평가를 수행하기 위해, 렉틴-염색한 절편을 악시오스콥 현미경 (미국 뉴욕 토른우드 소재 제이스사)으로 검사하고, 영상을 3 CCD 컬러 비디오 카메라 (IK-TU40A, 일본 동경 소재 도시바사) 및 프레임 그래버를 사용하여 디지탈화하였다. 영상-프로 플러스 소프트웨어 (미국 메사추세스주 실버 스프링 소재의 미디아 사이버네틱스사)를 사용하여 망막 하부 공간의 렉틴-염색된 혈관을 도해하고, 그 면적을 측정하였다. 각각의 병변에 대해 몇몇의 병변이 나타난 모든 절편의 면적을 측정하고, 함께 합산하여 적분 면적 측정값을 얻었다. 값을 평균화하여 마우스 당 하나의 실험값을 얻었다. 동등하지 않은 분산에 대한 2개의 시료 t-시험법은 처치 마우스와 대조 마우스간의 로그 평균 적분 면적을 비교하여 수행하였다.

레이저 처치 2주 후, 양쪽 군의 마우스 모두에서 모든 병변은 망막 상층에 대해 거의 동등한 손상이 있는 브루크막에서 불연속성을 나타냈다. 비히클만으로 처치된 모든 마우스는 각각의 레이저 유도된 브루크막의 파열 부위에 넓은 면적의 맥락막 혈관신생을 보였다. 새로운 혈관의 가장자리를 따라 망막의 염색된 내피 세포가 증식되었다. 렉틴으로 염색된 망막 혈관은 망막 상층부에서 보였다. 대조적으로, NBS 400 mg/kg/일 처치한 모든 마우스에는 각각의 레이저-유도된 브루크막의 파열 부위에서 맥락막 혈관신생이 거의 나타나지 않았다. 대부분의 사례에서, 열상 전체를 통해 렉틴-염색된 혈관신생 조직을 전혀 확인할 수 없었으나, 몇몇의 열상은 렉틴-염색된 조직의 얇은 디스크 (disc)가 있는 부분을 함유하였다. RPE 세포의 온건한 증식이 있었다. 처치된 마우스 눈의 맥락막 혈관신생이 현저하게 감소하였음에도 불구하고, 망막 상층부 혈관은 정상을 나타내었다. 이것은 대조염색 없는 부위에서 가장 잘 보였다.

병변당 렉틴 염색의 적분 면적량은 비히클로만 처치된 마우스에서의 병변 (0.0695621 ± 0.0073960 ㎟)과 비교할 때, NBS 처치된 마우스에서 극적인 감소 (0.0090182 ±0.0017540 ㎟)를 나타내었다. 이러한 차이는 통계학적으로 매우 유의하다 (p=0.004). 이러한 결과는 스타우로스포린 유도체가 맥락막 혈관신생을 극적으로 억제한다는 것을 명백하게 증명한다.

상기의 실시예는 활성 성분의 효능을 예시하는 것이다. 본 발명의 스타우로스포린 유도체는 망막 및 맥락막 혈관신생을 완전히 또는 실질적으로 완전히 억제하는데 매우 효과적이고, 활성 성분은 통상적이고(거나) 실제적인 약물 처치에 의해 환자에게 투여될 수 있다.

Claims

활성 성분으로서의 화학식 I의 화합물 또는 그의 염, 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는, 노후관련 황반 변성, 당뇨병성 망막증, 미숙아의 망막증, 망막정맥분지폐쇄증 및 망막중심정맥폐쇄증으로부터 선택된 안구 혈관신생 질환의 치료 및(또는) 예방용 제약 조성물.

<화학식 I>

식 중, R은 히드로카르빌 라디칼 R°또는 아실 라디칼 Ac이고;

상기 히드로카르빌 라디칼은 아시클릭 또는 카르보시클릭 히드로카르빌 라디칼, 또는 아릴이고, 상기 아시클릭 히드로카르빌 라디칼은 C₁-C₂₀-알킬 라디칼; 히드록시기가 1-위치 이외의 위치에 있는 C₂-C₂₀ 히드록시알킬 라디칼; 시아노-[C₁-C₂₀]-알킬 라디칼; 카르복시-[C₁-C₂₀]-알킬 라디칼; 또는 유리 원자가가 이중 결합이 있는 탄소 원자에 있지 않은 C₃-C₂₀-알케닐 라디칼이고, 상기 카르보시클릭 히드로카르빌 라디칼은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 비시클로[2,2,2]옥틸, 2-비시클로[2,2,1]헵틸 또는 아다만틸이고, 상기 아릴 라디칼은 페닐, 나프틸, 비페닐릴, 안트릴, 플루오레닐, 아줄레닐 라디칼, 또는 하나 이상의 포화 고리를 갖는 그의 방향족 동족체이고;

상기 아실 라디칼은 화학식 Z-C(=W)- (식 중, W는 산소 또는 황이고, Z는 C₁-C₇ 알킬, 특히 할로겐, 카르복시 또는 C₁-C₇ 알콕시카르보닐에 의해 치환되거나 비치환된 C₁-C₄ 알킬이거나, 페닐, 피리딜, 푸릴, 티에닐, 이미다졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 벤조푸라닐 또는 벤즈이미다졸릴이며, 이들 각각은 C₁-C₄ 알킬, C₁-C₄ 알콕시, 할로겐, 니트로, 트리플루오로메틸, 카르복시, C₁-C₄ 알콕시카르보닐, 메틸렌디옥시, 시아노 및(또는) 그의 염으로 치환되거나 비치환됨)의 라디칼이거나,

상기 아실 라디칼은 화학식 R_b°-CO- (식 중, R_b°는 수소, 벤조일, 또는 카르복시기, 시아노기, 에스테르기, 아미노기 또는 할로겐에 의해 치환되거나 비치환된 C₁-C₁₉ 알킬 라디칼임)의 라디칼이거나,

상기 아실 라디칼은 화학식 R°-O-CO- (식 중, R°는 히드로카르빌 라디칼임)의 라디칼이거나,

상기 아실 라디칼은 하기 화학식의 라디칼이거나,

(식 중, R₁ 및 R₂는 수소 및 비치환된 아시클릭 C₁-C₇ 히드로카르빌, 최대 탄소 원자수 10의 모노시클릭 아릴, 아르알킬 또는 아르알케닐로부터 독립적으로 선택되고, 이들 각각은 C₁-C₄ 알킬, C₁-C₄ 알콕시, 할로겐 및(또는) 니트로에 의해 치환 또는 비치환되거나, 또는 R₁의 경우에는 수소이고, R₂의 경우에는 비치환되거나 치환된 C₁-C₄ 알킬, C₃-C₇ 알케닐, 페닐, 피리딜, 피리미딜, 푸릴, 티에닐, 이미다졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 벤조푸라닐 또는 벤즈이미다졸릴임),

상기 아실 라디칼은 화학식 R°-SO₂- (식 중, R°는 히드로카르빌 라디칼임)의 라디칼이거나, 또는

상기 아실 라디칼은 하기 화학식의 라디칼이다.

(식 중, R₁ 및 R₂는 수소, 비치환된 아시클릭 C₁-C₇ 히드로카르빌로부터 독립적으로 선택됨)
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제1항에 있어서, 상기 활성 성분이 N-(3-카르복시프로피오닐)-스타우로스포린, N-벤조일-스타우로스포린, N-트리플루오로아세틸-스타우로스포린, N-메틸아미노티오카르보닐-스타우로스포린, N-페닐카르바모일-스타우로스포린, N-(3-니트로벤조일)-스타우로스포린, N-(3-플루오로벤조일)-스타우로스포린, N-tert-부톡시카르보닐-스타우로스포린, N-(4-카르복시벤조일)-스타우로스포린, N-(3,5-디니트로벤조일)-스타우로스포린, N-알라닐-스타우로스포린, N-에틸-스타우로스포린, N-카르복시메틸-스타우로스포린, N-[(tert-부톡시카르보닐아미노)-아세틸]-스타우로스포린, N-(2-아미노아세틸)-스타우로스포린 및 이들의 염으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
제13항에 있어서, 상기 활성 성분이 N-벤조일-스타우로스포린 또는 그의 염인 제약 조성물.
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