KR100646046B1 - Use of collagen of aquatic origin for the production of supports for tissue engineering, and supports and biomaterials obtained - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인공조직용 지지체의 생산을 위한 수산물 유래 콜라겐의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to the use of aquatic product-derived collagen for the production of scaffolds for artificial tissues.

콜라겐은 어류 피부 바람직하게는 천연의 형태로 편리하게 얻어진다.Collagen is conveniently obtained in fish skin, preferably in its natural form.

본 발명은 오염 위험이 적으며 신규한 인공조직용 지지체를 생산할 수 있다.The present invention has a low risk of contamination and can produce a novel support for artificial tissue.

콜라겐, 지지체, 생체 재료, 어류, 인공조직, 인조피부, 피부, 진피, 진피 대체물, 각질형성세포, 배양, 이식, 피부대체물, 기질, 겔, 가교결합Collagen, scaffolds, biomaterials, fish, artificial tissues, artificial skin, skin, dermis, dermal substitutes, keratinocytes, culture, transplantation, skin substitutes, substrates, gels, crosslinks

Description

인공조직용 지지체의 생산을 위한 수산물 유래 콜라겐의 용도, 그 지지체 및 생체 재료{Use of collagen of aquatic origin for the producing of support designed for tissue engineering, and resulting supports and biomaterials}Use of collagen of aquatic origin for the producing of support designed for tissue engineering, and resulting supports and biomaterials}

본 발명은 본질적으로 인공조직용 지지체의 생산을 위한 수산물 유래 콜라겐의 용도, 그 지지체 및 생체 재료에 관한 것이다.The present invention essentially relates to the use of aquatic product-derived collagen for the production of scaffolds for artificial tissues, scaffolds and biomaterials.

콜라겐은 세포의 성장에 특별히 적합한 기질이며 이 때문에 생체 세포(living cells)를 포함하는 재건된 조직의 생산을 위한 몇몇의 형태들 예를 들어, 기질(matrices), 겔 또는 피막에서 매우 광범위하게 사용되어진다.Collagen is a substrate that is particularly suitable for cell growth and because of this it has been used extensively in several forms for the production of reconstructed tissue, including living cells, for example matrices, gels or coatings. Lose.

대단히 장래가 유망한 기술인, 인공조직 분야에서 콜라겐은 특별히 인조 피부나 연골을 생산해낸다. 만족할 만한 결과를 위해서, 콜라겐은 물리적 또는 화학적 가교결합이나, 단백질과 강하게 상호작용하는 천연의 거대분자의 존재, 또는 이 둘 간의 조합에 의한 세포 대사에 기인하는 효소적 분해(enzymatic degradation)으로부터 보호되어져야만 한다.In the field of artificial tissue, a very promising technology, collagen produces especially artificial skin or cartilage. For satisfactory results, collagen is protected from enzymatic degradation due to physical or chemical crosslinking, the presence of natural macromolecules that interact strongly with proteins, or cellular metabolism by a combination of the two. You must lose.

지금까지는 이러한 인공조직 적용을 위하여, 수용 세포를 위한 지지체 내에서 사용되어지는 콜라겐은 포유동물로부터 추출되어졌으며 가장 흔하게는 소의 피부로부터 추출되어졌다. 이러한 추출원(source)의 선택은 추출 후에 얻어지는 단백 질의 좋은 기계적 성질, 효소적 분해에 대한 저항성 및 인간 콜라겐과 매우 유사한 아미노산 조성물에 기인하였다. 이러한 모든 이유들 때문에, 이 콜라겐이 인간 세포의 배양에 적당한 유일한 단 하나로 인정되어졌다.To date, for this artificial tissue application, the collagen used in the support for recipient cells has been extracted from mammals and most often from cow skin. The choice of this source was due to the good mechanical properties of the protein obtained after extraction, resistance to enzymatic degradation and amino acid compositions very similar to human collagen. For all these reasons, this collagen has been recognized as the only one suitable for the culture of human cells.

2000년 3월 15일자 파세브 저널 제 14권의 제 4번(Faceb Journal vol. 14, N° 4)에서 Yeh 등(Yeh et al.)의 논문, "신규한 인공조직용 천연 기질 세포-기질 상호작용의 분석{A novel native matrix for tissue engineering. Analysis of cell-matrix interaction.}"은 생체적합성(biocompatibility)를 연구하기 위하여 인간 피부의 각질형성세포(keratinocytes) 및 섬유아세포(fibroblasts)와의 상호작용을 연구하기 위한 상어, 고래의 무세포적 콜라겐 기질의 용도를 환기시킨다.Yeh et al., Paper in Faced Journal Vol. 14, No. 4, March 15, 2000, entitled “Natural Stromal Cell-Substrates for New Artificial Tissues. A novel native matrix for tissue engineering. Analysis of cell-matrix interaction. "Interacts with keratinocytes and fibroblasts in human skin to study biocompatibility. Recall the use of acellular collagen substrates of sharks and whales to study them.

더웬트(Derwent) 요약서 XP 002161598은 배양 물질로서 어류 유래의 콜라겐을 사용하는 방법을 묘사하는 1995년 3월 20일자로 공개된 마리노 포럼(Marino Forum)의 일본 특허출원 제 JP 07/075566호를 언급하고 있다.Derwent Summary XP 002161598 refers to Japanese Patent Application No. JP 07/075566 of the Marino Forum, published March 20, 1995, which describes how to use collagen derived from fish as a culture material. Doing.

그러나, 이 배양은 어류 세포를 가지고 처리한다.However, this culture is treated with fish cells.

유럽 특허 EP 0,753,313 A1은 해양 생물을 이용하는 연체 동물 또는 오징어로부터 추출한 키틴의 층(layer)이나 시트(sheet)를 포함하는 라미네이트(laminate)의 피부 대체물을 묘사한다. 여기에서, 키틴의 사용은 매우 중요하다. 왜냐하면 키틴 용액이 동결건조되어 졌을 때, 불용성의 생분해될 수 없는 해면(sponge)을 구성하는 키틴 구조가 얻어지며, 이 키틴은 인간 피부에 존재하는 효소에 의해 분해되지 않는다. 어류 피부의 콜라겐 겔은 키틴 층이나 시트 위에 부어질 수 있으며 이 둘은 약 일주일동안 냉장고 안에서 건조되어진다. 이러한 콜 라겐 층은 밀도가 높으며 다공질이 아니다. 생체 세포가 파종될 수 없다. 이 문헌에서 묘사된 라미네이트는 자력으로 행동할 수 없는 라미네이트이며 이 후로 묘사되어지는 발명이 제공하는 것과는 대조적으로 생체 세포를 파종하여 이러한 세포의 생체 특성(character)을 유지하는 것을 기대하지 못한다.European patent EP 0,753,313 A1 describes a skin substitute of a laminate comprising a layer or sheet of chitin extracted from mollusk or squid using marine life. Here, the use of chitin is very important. Because when the chitin solution is lyophilized, a chitin structure is obtained that constitutes an insoluble, biodegradable sponge, which is not degraded by enzymes present in human skin. Collagen gels from fish skin can be poured over a layer of chitin or sheets, which are dried in the refrigerator for about a week. This collagen layer is dense and not porous. Living cells cannot be seeded. The laminates described in this document are laminates that cannot act on their own and do not expect to maintain the biocharacteristics of these cells by seeding the living cells as opposed to the invention described later.

이제, 본 발명자들은 기대치 않게 인간 세포가 어류 콜라겐, 바람직하게는 가교결합된 어류 콜라겐으로 구성된 특정 지지체 상부 또는 내부에서 매우 잘 발육되어지는 것을 발견하였다. 이러한 해양성 콜라겐은 바람직하게 경골 어류의 피부로부터 얻어지며 더욱 바람직하게는 무색소의 피부 부분을 가지는 어류로부터, 더욱 바람직하게는 가자미류로부터, 특별히 서대(sole), 문치가자미(dab), 터보트(turbot), 브릴(brill)과 같은 산업적인 어류 중 하나이며 상기 어류는 토막으로 썰어 사용한다. 더욱 바람직한 가자미류는 무색소의 복부 피부 부분이 잘 잘라지는 서대이다.Now we have unexpectedly found that human cells develop very well on or inside certain supports composed of fish collagen, preferably crosslinked fish collagen. Such marine collagen is preferably obtained from the skin of tibial fish and more preferably from fish with a skin-free skin portion, more preferably from flounder, in particular from soles, dabs and turbots. , One of the industrial fishes such as brill, which is cut into pieces and used. More preferred flounder is a stand where the colorless abdominal skin is cut off well.

더 나아가, 본 발명자들은 이러한 생체 재료 내에서 배양된 인간 세포들이 정상적인 대사를 유지한다는 것을 주장할 수 있었다. 경골 어류 피부로부터 추출된 콜라겐을 가지는 생체 세포의 보존과 증식(proliferation)을 가능하게 하는 생체 적합성은 콜라겐이 가교결합, 특히 화학적으로 가교결합됨에 따라 특별히 당업자에게 명백하지 않았다. 이는 일반적으로 콜라겐의 가교결합은 가교결합된 콜라겐이 생체 세포 특별히 인간의 생체 세포에 대하여 생체 적합적이지 못하며 유독하다.Furthermore, we could argue that human cells cultured in these biomaterials maintain normal metabolism. Biocompatibility that allows the preservation and proliferation of living cells with collagen extracted from tibial fish skin is not particularly apparent to those skilled in the art as the collagen is crosslinked, especially chemically crosslinked. This generally indicates that the crosslinking of collagen is toxic and the crosslinked collagen is not biocompatible to living cells, especially human living cells.

이러한 생체 재료는 피막, 압축 스폰지(compressed sponges) 또는 다공질 기질 중의 어느 하나일 수 있으며 이들은 하기 실시예에서 기재하는 제조방법과 함께 설명될 것이다.Such biomaterials may be any of coatings, compressed sponges or porous substrates, which will be described in conjunction with the production methods described in the Examples below.

본 발명의 목적은 신규한 생체 재료 즉, 지지체 위에서 배양되어지기 위한 그리고 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성 생체 세포를 포함하고 있는 신규한 생체 재료의 테두리 안에서 사용되어지기 위한 상기 생체 세포의 훌륭한 증식 그리고 그 이후 시험관 내 또는 생체 내 분열증식에 적합한 신규한 생체 재료를 형성하기에 적합한 인공조직용 지지체를 제공하는 것으로 구성되는 신규한 기술적 문제를 해결하는 것이다.It is an object of the present invention to provide good proliferation of novel biomaterials, i.e., living cells, to be cultured on a support and to be used within the border of novel biomaterials containing normal, genetically modified or malignant living cells. And thereafter, to solve the novel technical problem consisting of providing a support for artificial tissue suitable for forming a novel biomaterial suitable for in vitro or in vivo fission proliferation.

본 발명의 다른 목적은 저가의 제조비용으로 낮은 오염 위험을 가지고 신규한 인공조직용 지지체를 제공하고 이를 신규한 생체 재료를 공급하는데 특별히 적합하도록 만드는 것으로 구성되는 신규한 기술적 문제를 해결하는 것이다.Another object of the present invention is to solve the novel technical problem which consists of providing a support for a novel artificial tissue with a low contamination risk and making it particularly suitable for supplying a new biomaterial.

본 발명의 또 다른 주요 목적은 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성의 생체 세포를 시험관 내 또는 생체 내에서 증식시키는데 특별히 적합하고, 그 것의 구조가 포유동물 특별히 동물 또는 바람직하게 인간의 생체내 사용에 충분히 적합하면서 동시에 상기 포유동물 바람직하게는 인간의 새롭게 합성된 조직과 기존의 조직 간의 구별이 가능하도록 동물 또는 바람직하게는 인간과 같은 상기 포유동물의 조직구조와 다른 신규한 인공조직용 지지체를 제공하는 것으로 구성되는 신규한 기술적 문제를 해결하는 것이다.Another main object of the present invention is particularly suitable for propagating normal, genetically modified or malignant living cells in vitro or in vivo, the structure of which is suitable for in vivo use in mammals, in particular animals or preferably humans. Providing a support for a new artificial tissue that is different from the tissue structure of the mammal, such as an animal or preferably a human, so as to be able to distinguish between the newly synthesized tissue of the mammal preferably human, and the existing tissue. It is to solve a new technical problem consisting of.

본 발명은 처음으로 모든 이러한 기술적 문제들을 만족할만한 방식, 저비용, 낮은 오염 위험 또는 오염 위험 없이 해결하는 동시에 당업자에게 특별히 명백하지 않으며 기대치 못했던 새롭게 합성된 조직을 쉽게 구별할 수 있도록 하였다.The present invention solves for the first time all of these technical problems without satisfactory mode, low cost, low contamination risk or contamination risk, and at the same time makes it possible to easily distinguish newly synthesized tissue which is not particularly obvious and unexpected to those skilled in the art.

따라서, 첫 번째 주안점으로 본 발명은 인공조직용 지지체의 생산을 위한 수산물 유래의 콜라겐의 용도에 관한 것이다.Therefore, as a first point, the present invention relates to the use of aquatic-derived collagen for the production of scaffolds for artificial tissues.

본 발명에서 "수산물 유래의 콜라겐"은 수산물 유래 생물의 콜라겐을 포함하는 조직으로부터 유래된 콜라겐을 의미하는 것으로 이해된다; 이러한 생물은 당업자에게 잘 알려져 있으며 예를 들어, 모든 수생 포유동물, 특히 해양 포유동물, 해파리 및 바닷물고기 또는 민물고기를 포함한다. 더 나아가 당업자에게 이러한 생물의 피부가 필수적으로 콜라겐을 포함한다는 점은 알려져 있다. 바람직하게, 본 발명에서 "수산물 유래의 콜라겐"은 경골어류과 어류로부터, 더 특별하게는 무색소 부분을 가지는 어류로부터, 더욱 특별하게는 가자미류 및 특별히 상기에서 언급되어졌던 어류, 그리고 가장 바람직하게는 가자미류인 서대(sole)로부터 추출되어진다.In the present invention, "collagen derived from aquatic products" is understood to mean collagen derived from tissues containing collagen of aquatic product-derived organisms; Such organisms are well known to those skilled in the art and include, for example, all aquatic mammals, in particular marine mammals, jellyfish and saltwater or freshwater fish. It is further known to those skilled in the art that the skin of such organisms essentially contains collagen. Preferably, the "collagen derived from aquatic products" in the present invention is from tibia fish and fish, more particularly from fish having a colorless portion, more particularly from flounder and especially the fish mentioned above, and most preferably from flounder It is extracted from the sole.

한 가지 유익한 실시예에서, 콜라겐은 어류 피부, 바람직하게는 그 것의 천연 형태로부터 얻어진다.In one advantageous embodiment, the collagen is obtained from fish skin, preferably from its natural form.

본 발명의 다른 유익한 실시예에서, 콜라겐의 기계적 강도 또는 효소적 소화(digestion)에 대한 저항성은 화학적 또는 물리적 가교결합에 의하여, 또는 콜라겐과 강하게 상호작용하는 천연의 거대분자의 첨가에 의하여, 또는 이들 두 과정의 조합에 의하여 증가되어진다.In another advantageous embodiment of the present invention, the mechanical strength or resistance to enzymatic digestion of collagen is determined by chemical or physical crosslinking, or by the addition of natural macromolecules that strongly interact with collagen, or It is increased by the combination of the two processes.

본 발명의 또 다른 유익한 실시예에서, 콜라겐은 바람직하게 동결건조 단계 를 거친 콜라겐 겔로부터 제조되어진 다공질 기질의 형태로 사용되어진다.In another advantageous embodiment of the invention, the collagen is preferably used in the form of a porous substrate prepared from a collagen gel that has undergone a lyophilization step.

다른 유익한 변형예에서, 상기에서 언급한 다공질 기질은 물리적 방법, 바람직하게는 열 건조(thermal dehydration; TDH)에 의해 가교결합되어진다.In another advantageous variant, the above-mentioned porous substrate is crosslinked by a physical method, preferably thermal dehydration (TDH).

또 다른 유익한 변형예에서, 상기에서 언급된 다공질 기질은 화학적 방법, 바람직하게는 디페닐포스포릴라자이드(diphenylphosphorylazide; DPPA), 카보디이미드(carbodiimide), N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide) 또는 글루타알데히드(glutaraldehyde)를 이용한 화학적 방법에 의하여 가교결합되어진다.In another advantageous variant, the above-mentioned porous substrate is chemically treated, preferably diphenylphosphorylazide (DPPA), carbodiimide, N-hydroxysuccinimide Or by a chemical method using glutaraldehyde.

본 발명의 유익한 실시예에서, 상기에서 언급한 콜라겐은 키토산과, 선택적으로 적어도 하나의 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan), 바람직하게는 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate)가 혼합된 해양성 콜라겐(바람직하게는 천연 콜라겐)으로부터 제조되어진 다공질 기질의 형태로 얻어질 수 있다.In an advantageous embodiment of the invention, the above-mentioned collagen is a marine collagen (preferably natural) mixed with chitosan and optionally at least one glycosaminoglycan, preferably chondroitin sulfate. Collagen), which can be obtained in the form of a porous substrate.

본 발명의 다른 유익한 실시예에서, 상기에서 언급한 콜라겐은 콜라겐 겔로부터 제조되어진 다공질 기질의 형태로 제조되어질 수 있다. 상기 다공질 기질은 콜라겐 겔을 바람직하게는 공기 중에서 또는 가스성 유체에서 건조함으로써 제조되어진 콜라겐 피막 또는 고압축 콜라겐 스폰지 중의 하나로 구성되는 본질적으로 치밀한 콜라겐 막으로 적어도 한 면이 덮여져 있다.In another advantageous embodiment of the invention, the aforementioned collagen may be prepared in the form of a porous substrate prepared from collagen gels. The porous substrate is covered on at least one side with an essentially dense collagen membrane consisting of either a collagen film or a high compression collagen sponge, which is prepared by drying the collagen gel, preferably in air or in a gaseous fluid.

본 발명의 다른 유익한 변형예에서, 상기에서 언급한 고압축 콜라겐 스폰지의 압축은 적어도 대략 50 바{대략 50×105 파스칼(Pascal; Pa)}의 압력, 바람직하게는 50 바(50×105 Pa) 내지 200 바(200×105 Pa)의 압력에서 수행되어지며, 이러한 압축은 선택적으로 20℃ 내지 80℃의 온도, 바람직하게는 40℃ 내지 60℃의 온도에서 수행되어진다.In another advantageous variant of the invention, the compression of the above-mentioned high compression collagen sponge is carried out at a pressure of at least approximately 50 bar (approximately 50 × 10 5 Pascal; Pa), preferably 50 bar (50 × 10 5 Pa). ) To 200 bar (200 × 10 5 Pa), and this compression is optionally performed at a temperature of 20 ° C. to 80 ° C., preferably at a temperature of 40 ° C. to 60 ° C.

본 발명의 다른 유익한 특징에 따라, 두 층 즉, 다공질 층과 본질적으로 치밀한 막 중 적어도 하나는 특별히 청년 또는 중장년층 피실험자로부터 얻은 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성의 생체 세포를 포함한다.According to another advantageous feature of the invention, at least one of the two layers, the porous layer and the essentially dense membrane, comprises normal, genetically modified or malignant living cells, especially obtained from young or middle aged subjects.

본 발명의 한 가지 유익한 실시예에서, 생체 세포는 섬유아세포(fibroblasts), 각질형성세포(keratonocytes), 멜라닌세포(melanocytes), 혈액으로부터 유래된 랑게르한스 세포(Langerhans's cells), 혈액으로부터 유래된 내피세포(endothelial cells), 혈액 세포, 특별히 대식세포(macrophages) 또는 림프구(lymphocytes), 지방세포(adipocytes), 피지선세포(sebocytes), 연골세포(chondrocytes), 골세포(osteocytes), 골아세포(osteoblasts) 및 혈액으로부터 유래된 상피성촉각세포(Merkel's cells)로 구성되는 그룹으로부터 선택되어지며 상기 세포들은 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성의 세포들이다.In one advantageous embodiment of the invention, the living cells are fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans's cells derived from blood, endothelial cells derived from blood ( endothelial cells, blood cells, in particular macrophages or lymphocytes, adipocytes, sebocytes, chondrocytes, osteoblasts, osteoblasts and blood It is selected from the group consisting of Merkel's cells derived from the cells are normal, genetically modified or malignant cells.

본 발명의 한 가지 특별히 유익한 실시예에서, 다공질 층은 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성의 섬유아세포를 포함하고 본질적으로 치밀한 막은 특별히 각질형성세포(keratonocytes), 멜라닌세포(melanocytes), 혈액으로부터 유래된 상피성촉각세포(Merkel's cells), 혈액으로부터 유래된 랑게르한스 세포(Langerhans's cells), 피지선세포(sebocytes), 혈액 및 신경 세포로부터 유래된 세포들로부터 선택된 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성의 생체 세포를 포함 한다.In one particularly advantageous embodiment of the invention, the porous layer comprises normal, genetically modified or malignant fibroblasts and the essentially dense membrane is specifically derived from keratinocytes, melanocytes, blood Normal, genetically modified or malignant living cells selected from isolated epidermal tactile cells (Merkel's cells), blood-derived Langerhans's cells, sebocytes, cells and blood-derived cells Includes.

본 발명의 다른 유익한 실시예에서, 청년 피실험자로부터 얻은 세포를 이용하여 재건된 "어린(young)" 피부 또는 중장년층 피실험자로부터 얻은 세포로부터 얻은 재건된 "성숙(aged)" 피부 중 하나를 제조할 수 있다. 이러한 모델들은 피부 노화 과정에 대한 우리의 지식과 이러한 과정에 활성이 있는 작용제의 효과에 대한 연구를 증진시킬 수 있게 한다.In another advantageous embodiment of the present invention, cells obtained from a young subject may be used to prepare either reconstructed “young” skin or rebuilt “aged” skin obtained from cells obtained from a middle aged subject. . These models can enhance our knowledge of the skin aging process and the study of the effects of active agents on these processes.

본 발명의 다른 특별히 유익한 실시예에서, 상기에서 언급한 본질적으로 치밀한 막은 특별히 그 전체가 냉동되어 동결건조되기 전에 막이 준비되어 콜라겐 겔상에 침적되어짐으로써 바람직하게는 콜라겐 스폰지를 포함하는 다공질 층과 조합되기 전에 제조되어진다.In another particularly advantageous embodiment of the invention, the essentially dense membrane mentioned above is combined with a porous layer, preferably comprising a collagen sponge, by which the membrane is prepared and deposited on the collagen gel, especially before the whole is frozen and lyophilized. Is manufactured before.

두 번째 주안점으로, 본 발명은 또한 상기에서 정의되어진 또는 하기 상세한 설명과 실시예에서 온전히 그대로 얻어지는 수산물 유래의 콜라겐을 포함하는 인공조직용 지지체를 포함한다. 이는 일반적으로 본 발명의 필수적인 부분을 형성하고 당해 기술분야의 정세와 비교함으로써 신규한 것으로 나타나는 특징에 관한 것으로, 이러한 특징들은 그 것들의 기능과 그 것들의 보편성, 독립적으로 실시예의 문맥에서 얻어진다.In a second aspect, the present invention also includes a support for artificial tissue comprising collagen derived from aquatic products as defined above or obtained intact in the following detailed description and examples. This generally relates to features that appear novel by forming an essential part of the present invention and in comparison with the state of the art, which features are obtained from their function and their universality, independently from the context of the examples.

세 번째 주안점으로, 본 발명은 또한 생체 재료를 포함한다. 상기 생체 재료는 재건하는 접합적인 조직 또는 재건된 피부의 형태이고 상기에서 정의되고 또한 하기 상세한 설명으로부터 얻어지는 수산물 유래의 콜라겐으로부터 제조되어지며 상기 두 번째 주안점의 지지체를 위한 것이다.As a third point, the present invention also includes biomaterials. The biomaterial is in the form of connective tissue to be reconstructed or reconstructed skin and is made from collagen derived from aquatic products, as defined above and also obtained from the following description and for the support of the second point.

본 발명의 상세한 설명과 청구항의 관점에서, "인공조직용 지지체" 표현은 시험관 내 또는 생체 내에서 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성의 생체 세포를 배양하고 분열증식시키는데 사용되는 지지체를 의미한다. 이러한 분열증식은 바람직하게는 동물을 포함하는 포유동물 바람직하게는 인간의 생체 내에 응용되어진다. 본 발명은 예를 들어 재건된 연결 조직(reconstituted connective tissues) 또는 재건된 피부(reconstitued skin)의 형태인 생체 재료의 제조를 위한 인공조직의 범주 내에서 특별하게 바람직한 용도를 가지는 것으로 이해되어진다. 이러한 범주 내에서, 첫 번째 단계는 일반적으로 재건된 연결 조직(reconstituted connective tissues) 또는 재건된 피부(reconstitued skin)의 형태와 같은 생체 재료를 주기 위하여 시험관 내에서 상기 생체 세포들을 가지고 지지체를 배양하는 것이며 그 다음 두 번째 단계는 재건된 연결 조직(reconstituted connective tissues) 또는 재건된 피부(reconstitued skin)의 형태와 같은 이러한 생체 재료를 예를 들어 동물 또는 바람직하게는 인간과 같은 포유 동물의 생체 내에서 외과적으로 손상되었거나 제거된 접합적인 조직을 재건하기 위하여, 또는 모든 의학적 동기를 위하여 외과적으로 손상되었거나 제거된 영역을 대체하기 위하여 피부를 제건하기 위하여 사용하는 것이다.In the context of the present description and claims, the expression "support for artificial tissue" refers to a support used for culturing and proliferating normal, genetically modified or malignant living cells in vitro or in vivo. Such fission proliferation is preferably applied in vivo to mammals, preferably to animals, including humans. It is understood that the present invention has a particularly desirable use within the scope of artificial tissue for the manufacture of biomaterials, for example in the form of reconstituted connective tissues or reconstituted skin. Within this category, the first step is to incubate the support with the living cells in vitro to give a biomaterial, usually in the form of reconstituted connective tissues or reconstituted skin. The second step is then surgically applied to such biomaterials, such as in the form of reconstituted connective tissues or reconstituted skin, in vivo, for example in animals or mammals such as humans. It is used to rebuild the skin in order to reconstruct the connective tissue that has been damaged or removed, or to replace the surgically damaged or removed area for all medical motives.

이롭게는, 인공조직용 지지체 또는 바람직하게는 재건된 연결 조직(reconstituted connective tissues) 또는 재건된 피부(reconstitued skin)의 형태와 같은 생체 재료는 특별히 조직의 노화 과정을 연구하기 위한 그리고 각별히 피부 노화 과정과 선택적으로 이러한 과정에 활성이 있는 원료 또는 성분의 효능을 테스트하기 위한 청년 피실험자로부터 전적으로 얻었거나 또는 중장년 피실험자로부터 전적으로 얻은 세포들을 포함한다.Advantageously, biomaterials, such as in the form of scaffolds for artificial tissues or preferably in the form of reconstituted connective tissues or reconstituted skin, are particularly useful for studying the aging process of tissues and in particular for skin aging processes. Optionally cells that have been obtained entirely from young subjects or who have obtained solely from middle aged subjects for testing the efficacy of active ingredients or ingredients active in this process.

그러므로, 본 발명은 상기에서 언급한 새로운 기술적 문제에 대한 일반적인 해법을 제공하는 것이며 이 해법은 특별히 단순한 방식이고, 저가의 비용이 들며, 적은 오염 위험을 가질뿐만 아니라, 수산 콜라겐과 포유류의 콜라겐 또는 바람직하게는 생체 내 사용 과정에서 새롭게 합성되어진 인간 콜라겐 사이를 구별지을 수 있는 능력을 가진다.Therefore, the present invention provides a general solution to the above mentioned new technical problem, which solution is particularly simple, inexpensive and has a low risk of contamination, but also collagen or mammalian collagen or preferred Preferably it has the ability to distinguish between newly synthesized human collagen in vivo use.

사실상, 생체 인조 조직의 생산에서의 어류 콜라겐의 사용은 포유류 소스(source)와 비교되는 세 가지 주요 이점을 가진다:In fact, the use of fish collagen in the production of artificial tissue has three major advantages compared to mammalian sources:

·원료로써 일반적으로 사용되어지는 어류 껍질을 매우 청결한 조건 하에서 다량으로 얻을 수 있다.Fish shells commonly used as raw materials can be obtained in large quantities under very clean conditions.

·전염으로 인한 오염 위험이 매우 낮다. 특별히, 프리온(prion) 타입의 전염성 병원체의 알려진 위험이 없다.Very low risk of contamination due to transmission In particular, there is no known risk of prion type infectious pathogens.

·마지막으로, 어류 콜라겐의 아미노산 조성이 인간 콜라겐의 조성과 상대적으로 비슷하지 않음으로써, 두 단백질이 특별한 항체에 의하여 상대적으로 쉽게 구별되어질 수 있다. 이러한 계통적 분류법(methodology)은 특별히 "시험관 내" 테스트 또는 "생체 내" 치료 연구에 매우 가치가 있을 것이다.Finally, since the amino acid composition of fish collagen is not relatively similar to that of human collagen, the two proteins can be relatively easily distinguished by particular antibodies. This systematic methodology will be particularly valuable for "in vitro" testing or "in vivo" therapeutic studies.

게다가, 해양성 콜라겐의 용도는 매우 효과적으로 면역적 표지를 가능하게 할 것이며 해양성 콜라겐과 새롭게 합성된 콜라겐 사이를 구별할 수 있게 할 것이다.In addition, the use of marine collagen will enable very effective immunological labeling and will be able to distinguish between marine collagen and newly synthesized collagen.

어류 콜라겐은 프로테아제(proteases)에 의한 효소적 분해로부터 그 것을 보호하는 천연의 구조를 가지며 이 구조는 그 것의 기계적 특성에 대한 주요한 원인이 된다. 그러므로 추출 및 정제 실시 중 사용되는 처리들(treatment)이 가능한 한 적게 단백질 구조를 붕괴시킨다는 점은 매우 중요할 것이다. 이 것은 나선형의 구조와 분자간 및 분자내의 가교결합이 가능한 한 보호되어져야만 한다는 것을 의미한다. 본 발명자들은 이 것을 1994년 7월 19일자로 등록된 미국 특허 제 5331092호에서 묘사한 과정을 이행함으로써 좀 더 특별히 성취하였다. 그럼에도 불구하고, 특별한 적용을 위하여, 부분적으로 탈가교결합된(decrosslinked) 콜라겐, 예를 들어 아텔로콜라겐(atelocollagen) 즉, 텔로펩티드(telopeptide)가 없는 콜라겐의 사용을 상상해 보는 것이 가능하다.Fish collagen has a natural structure that protects it from enzymatic degradation by proteases, which is a major cause for its mechanical properties. Therefore, it will be very important that the treatments used during extraction and purification disrupt the protein structure as little as possible. This means that the helical structure and intermolecular and intramolecular crosslinking should be protected as much as possible. The inventors have accomplished this more particularly by implementing the procedure described in US Pat. No. 53,31092, registered July 19, 1994. Nevertheless, for particular applications it is possible to imagine the use of partially decrosslinked collagen, for example collagen without atelocollagen, ie telopeptide.

그 다음, 대다수의 인공조직 적용을 위하여, 콜라겐의 기계적 특성이 강화되어질 것이며 효소적 소화에 대한 그 것의 저항성이 화학적 또는 물리적 가교결합 기술에 의하여 또는 단밸질과 강하게 상호작용하는 천연 거대분자의 첨가에 의하여 또는 마지막으로 두 과정의 조합 중 어느 하나에 의하여 증가되어질 것이다.Then, for the majority of artificial tissue applications, the mechanical properties of collagen will be strengthened and its resistance to enzymatic digestion by chemical or physical crosslinking techniques or by the addition of natural macromolecules that interact strongly with protein. Or finally by any combination of the two processes.

어류 콜라겐의 보호는 그 것의 천연 안정성이 포유류의 콜라겐의 그 것보다 더 낮기 때문에 더욱 중요하며 후자의 특성은 낮은 히드록시프롤린(hydroxyproline) 함유량에 기인한다.The protection of fish collagen is even more important because its natural stability is lower than that of mammalian collagen, and the latter property is due to the low hydroxyproline content.

상기에서 묘사한 생체 재료들은 생체 인조 조직을 생성하기 위하여 생체 세포와 함께 배양되어진다. 상기 인조 조직들은 "시험관 내" 테스트 분야 또는 상처 입은 조직을 치료하기 위한 약학 분야에서 사용되어진다.The biomaterials depicted above are incubated with living cells to produce biosynthetic tissue. The artificial tissues are used in the field of "in vitro" testing or in the field of pharmacy for treating wounded tissue.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 인공조직용 지지체의 생산을 위한 본 발명의 범주 내에서 사용되어질 수 있는, 그러한 지지체뿐만 아니라 생체 재료를 구성하는 하기 수산물 유래 콜라겐의 형태들을 제조하는 것에 대한 실시예들에서 언급하는 상세한 설명으로부터 명백하여 질 것이며 이는 단순히 실례로서 주어지는 것일뿐이므로 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.Another object, feature and advantage of the present invention is to practice the preparation of the following aquatic-derived collagen forms that make up such a support as well as a biomaterial that can be used within the scope of the invention for the production of a support for an artificial tissue. It will be apparent from the detailed description referred to in the examples that are given by way of example only and do not limit the scope of the invention.

실시예에서, 다른 표시가 없는 한, 온도는 섭씨 온도로서, 압력은 대기압으로서, 퍼센트는 중량 퍼센트로서 주어진다.In the examples, unless otherwise indicated, temperature is given in degrees Celsius, pressure is at atmospheric pressure, and percentages are given as weight percentages.

실시예 1 내지 13은 콜라겐의 제조에 대한 실시예들이며 상기 콜라겐은 본 발명에 따라 인공조직용 지지체로서 사용되어질 수 있다.Examples 1 to 13 are examples for the preparation of collagen and the collagen may be used as a support for artificial tissue according to the present invention.

실시예 14 내지 16은 명백히 수산물 유래 콜라겐 용도의 범주내에서 실시예 1 내지 13에서 제조되어진 형태들에 대한 비교 테스트들이며 이는 인공조직용 지지체의 생산 범주 내이다.Examples 14-16 are comparative tests of the forms prepared in Examples 1-13, clearly within the scope of aquatic product-derived collagen use, which are within the production range of scaffolds for artificial tissues.

도 1은 진피 등가물 내에서의 정상의 인간 섬유아세포의 분열증식을 보여준다. 가로축은 시간(일)로 나타내며, 세로축은 흡광도 ×1000으로 나타내며 100 단위로 증가하였다. 다이아몬드 점을 가진 곡선은 사용되어진 지지체가 수산 콜라겐, 이 경우에는 어류 콜라겐인 경우의 다공질 기질일 때 얻어진 결과이며 정사각형 점을 가진 곡선은 소의 콜라겐을 가지고 얻은 결과이다.1 shows the proliferation of normal human fibroblasts in dermal equivalents. The horizontal axis represents time (days) and the vertical axis represents absorbance × 1000 and increases by 100 units. Curves with diamond dots are obtained when the substrate used is a porous substrate in the case of collagen oxalate, in this case fish collagen, and a curve with square dots is obtained with bovine collagen.

도 2는 진피 등가물에서의 섬유아세포의 분열증식을 위한 유사한 곡선을 보 여준다. 가로축은 시간(일)로 나타내며, 세로축은 국제 단위로 표현되어진 형광 강도를 나타내며 이는 15,000에서 시작하고 10,000 단위로 증가한다. 닫힌 다이아몬드 점을 가진 곡선은 테스트 1에서 얻어진 형광을 나타내고 닫힌 정사각형 점을 가진 곡선은 테스트 2에서 얻어진 결과이고 열린 삼각형을 가진 곡선은 테스트 3에서 얻은 결과이며 십자 표시를 가진 곡선은 테스트 4에서 얻어진 결과이다.2 shows similar curves for fibroblast proliferation in dermal equivalents. The horizontal axis represents time (days) and the vertical axis represents fluorescence intensity expressed in international units, starting at 15,000 and increasing to 10,000 units. Curves with closed diamond points represent the fluorescence obtained in Test 1, curves with closed square points are results from Test 2, curves with open triangles are from Test 3, and curves with cross marks are from Test 4. to be.

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실시예 1: 천연 수산 콜라겐의 다공질 기질 제조
콜라겐은 1994년 7월 19일 등록된 미국 특허 제 5331092호의 기술에 의해 얻어진다. Example 1 Preparation of Porous Substrates of Natural Collagen Hydroxide
Collagen is obtained by the technique of US Pat. No. 5331092, registered July 19, 1994.

A. 천연 수산 콜라겐의 제조A. Preparation of Natural Fish Collagen

서대(sole) 복부 껍질을 마쇄한 후 0.78 g/L 포타슘 디하이드로겐포스페이트 및 21.7 g/L 디소듐 모노하이드로겐포스페이트를 포함하는 pH 7.8의 인산 완충용액으로 세척하여 콜라겐 겔을 제조하였다. 세척은 마쇄 물질(ground materials) kg 당 5L의 완충액의 비율로 한 시간동안 교반하면서 수행되어졌다. 인산 완충액은 마쇄 물질 kg 당 물 5L의 비율로 연수로 두 번 계속적으로 세척한 뒤 연속적으로 4000 rpm(로우셀렛 원심분리기; Rousselet centrifuge)에서 원심분리함으로써 제거되어졌다.The collagen gel was prepared by crushing the sole abdominal shell and washing it with a pH 7.8 buffer solution containing 0.78 g / L potassium dihydrogenphosphate and 21.7 g / L disodium monohydrogen phosphate. Washing was performed with stirring for one hour at a rate of 5 L buffer per kg ground materials. Phosphate buffer was removed by continual washing twice with soft water at a rate of 5 L of water per kilogram of ground material followed by continuous centrifugation at 4000 rpm (Rosselet centrifuge).

그 다음 마쇄 물질을 용액 10L에 마쇄 물질 1kg의 비율로 0.25 M 아세트산 용액을 이용하여 산성화하였다. 그 후 겔(gel)을 5분 동안 4000 rpm에서 원심분리 하였다.The grinding material was then acidified using a 0.25 M acetic acid solution at a rate of 10 kg of solution to 1 kg of grinding material. The gel was then centrifuged at 4000 rpm for 5 minutes.

사용되어지기 위한 겔은 0.5 내지 2%의 콜라겐 농도를 가진 상기에서 수득한 상청액으로 구성된다.The gel to be used consists of the supernatant obtained above having a collagen concentration of 0.5 to 2%.

B. 상기에서 수득한 콜라겐 겔로부터 다공질 기질의 제조B. Preparation of Porous Substrate from Collagen Gels Obtained Above

상기에서 얻은 겔을 20 g/cm2의 비율로 동결 건조 트레이(lyophilization tray)안으로 부어 넣었다. 그 후 -30℃에서 냉동하고 32℃ 이상에서 가열한 후 동결건조되었다. 총 동결건조 시간은 400 마이크로바(microbar)의 압력 하에서 16 시간이었다. 수득된 기질은 그 후 열 건조(thermal dehydration; TDH)에 의해 가교결합되어졌다. 열 건조는 16 시간동안 400 마이크로바의 진공하에서 110℃ 오븐에서 가열함으로써 수행되어졌다.
The gel obtained above was poured into a lyophilization tray at a rate of 20 g / cm 2 . It was then frozen at −30 ° C., heated at 32 ° C. or higher, and lyophilized. Total lyophilization time was 16 hours under pressure of 400 microbar. The substrate obtained was then crosslinked by thermal dehydration (TDH). Thermal drying was performed by heating in an oven at 110 ° C. under vacuum of 400 microbar for 16 hours.

실시예 2: 1996년 7월 24일자 유럽 특허 제 466 829호에 개시된 기술에 의한 디페닐포스포릴라자이드(diphenylphosphorylazide; DPPA)를 이용하여 가교결합된 다공질 기질의 제조Example 2 Preparation of Crosslinked Porous Substrates Using Diphenylphosphorylazide (DPPA) by the Technique Published in European Patent No. 466 829 of 24 July 1996

실시예 1의 콜라겐 기질을 100 mL 디메틸포름아마이드(dimethylformamide; DMF)에 5 내지 250㎕ DPPA/g 콜라겐을 포함하는 용액 내에서 24 시간동안 배양하였다. 그 후 콜라겐을 DPPA를 제거하기 위하여 100 mL DMF로 헹구었다. DMF는 그 다음 pH 8.9의 붕산 완충용액(0.04 M 소듐 테트라보레이트, 0.04 M 붕산) 100mL로 헹굼으로써 제거되어졌다. 콜라겐은 최종적으로 동일한 붕산 완충용액안에서 하룻밤 동안 배양되졌으며 붕산 완충용액은 그 후 6 시간동안 연수로 계속적으로 헹굼으로써 제거되어졌다.
The collagen substrate of Example 1 was incubated in 100 mL dimethylformamide (DMF) for 24 hours in a solution containing 5-250 μl DPPA / g collagen. The collagen was then rinsed with 100 mL DMF to remove DPPA. DMF was then removed by rinsing with 100 mL of boric acid buffer (0.04 M sodium tetraborate, 0.04 M boric acid) at pH 8.9. Collagen was finally incubated overnight in the same boric acid buffer and the boric acid buffer was then removed by continuous rinsing with soft water for 6 hours.

실시예 3: 카보디이미드 및 N-히드록시숙신이미드를 이용하여 가교결합된 다공질 기질의 제조Example 3: Preparation of Crosslinked Porous Substrates Using Carbodiimide and N-hydroxysuccinimide

실시예 1의 수산 콜라겐 기질을 0.23 내지 0.69 g/g 콜라겐 농도의 EDC(에틸디메틸아미노프로필카보디이미드; ethyldimethylaminopropylcarbodiimide)와 0.42 g/g 콜라겐 농도의 NHS(N-히드록시숙신이미드; N-hydroxysuccinimide)를 이용하여 가교결합시켰다.EDC (ethyldimethylaminopropylcarbodiimide) and NHS (N-hydroxysuccinimide; N-hydroxysuccinimide) at 0.42 g / g collagen concentration of 0.23 to 0.69 g / g collagen concentration ) To crosslink.

연수로 헹군 후, 콜라겐을 다시 동결건조하였다.
After rinsing with soft water, the collagen was lyophilized again.

실시예 4: 글라타알데히드를 이용하여 가교결합된 다공질 기질의 제조Example 4 Preparation of Crosslinked Porous Substrates Using Glataaldehyde

실시예 1의 수산 콜라겐의 다공질 기질을 20℃에서 0.6 내지 1%의 GTA를 포함하는 용액 내에서 24 내지 96 시간동안 가교결합시켰다.The porous substrate of collagen oxalate of Example 1 was crosslinked at 20 ° C. for 24 to 96 hours in a solution containing 0.6 to 1% of GTA.

연수로 헹군 후, 콜라겐을 다시 동결건조하였다.
After rinsing with soft water, the collagen was lyophilized again.

실시예 5: 1991년 5월 29일자 유럽 특허 제 296078호에 개시된 키토산 및 글리코사미노글리칸과 함께 실시예 1의 천연 수산 콜라겐을 이용하여 제조된 다공질 기질Example 5: Porous substrate prepared using the natural collagen of Example 1 with chitosan and glycosaminoglycans disclosed in European Patent No. 296078, filed May 29, 1991

2.5g의 키토산을 포함하는 356 mL의 물과 1.9 mL의 아세트산 용액; 및 400 mL의 연수에 1g의 콘드로이틴 4-설페이트(chondroitin 4-sulfate)를 포함하는 용액을 600g의 1.5% 콜라겐 겔에 첨가하였다. pH가 대략 4.0인 혼합물을 그 후 교반하고 동결건조시켰다. 수득된 스폰지를 열 건조로 가교결합시켰다.
356 mL of water and 1.9 mL of acetic acid solution containing 2.5 g of chitosan; And a solution comprising 1 g of chondroitin 4-sulfate in 400 mL of soft water was added to 600 g of 1.5% collagen gel. The mixture with a pH of approximately 4.0 was then stirred and lyophilized. The sponge obtained was crosslinked by heat drying.

실시예 6: 콜라겐 피막으로 덮여진 실시예 1에서 묘사한 다공질 기질Example 6: Porous Substrate Described in Example 1 Covered with Collagen Film

A. 피막의 제조A. Preparation of Film

고형분 함량이 0.3 내지 0.8%인 콜라겐 겔을 30℃ 오븐 또는 후드(hood) 아래에서 0.5g 겔/cm2 트레이의 속도로 건조시켰다.Collagen gels with a solids content of 0.3-0.8% were dried at a rate of 0.5 g gel / cm 2 trays under a 30 ° C. oven or hood.

10 내지 40%의 글리세롤을 상기 콜라겐 겔에 첨가하였다.10-40% glycerol was added to the collagen gel.

상기 조건들 하에서 건조된 콜라겐은 투명한 피막을 형성하였다.Collagen dried under the above conditions formed a transparent coating.

B. 상기에서 묘사한 다공질 기질과 피막의 조합B. Combination of Porous Substrate and Film as Described Above

0.5% 내지 2%의 고체상 내용물을 가지는 수산 천연 콜라겐 겔을 cm2당 0.5g의 비율로 동결건조 트레이 안에서 침적시켰다. 콜라겐 피막이 상기 겔 위에 침적되어졌으며 그 후 그 전체를 동결건조시켰다. 수득된 동결건조물을 열 건조에 의해 가교결합시켰다.
Fishery natural collagen gel with a solid content of 0.5% to 2% was deposited in a lyophilized tray at a rate of 0.5 g per cm 2 . Collagen coatings were deposited on the gel and the whole was lyophilized. The lyophilisate obtained was crosslinked by thermal drying.

실시예 7: 산-용해성 콜라겐 겔을 이용하여 제조되어지고 콜라겐 피막으로 덮여진 다공질 기질Example 7: Porous Substrate Prepared Using Acid-Soluble Collagen Gel and Covered with Collagen Film

본 과정은 피막 위로 겔을 붓는 것을 제외하고 실시예 6과 같다. 상기 피막 은 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 제조되어진 산-용해성의 콜라겐으로 이루어져 있다.
The procedure is the same as in Example 6 except that the gel is poured over the coating. The coating consists of acid-soluble collagen prepared by techniques well known to those skilled in the art.

실시예 8: 아텔로콜라겐 겔을 이용하여 제조되어지고 콜라겐 피막으로 덮여진 다공질 기질Example 8: Porous Substrate Prepared Using Atelocollagen Gel and Covered with Collagen Film

본 과정은 피막 위로 겔을 붓는 것과 같은 차이점을 제외하고 실시예 6과 같다. 상기 피막은 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 제조되어진 아텔로콜라겐(atelocollagen), 즉 텔로펩타이드가 없는 콜라겐(telopeptide-free collagen)으로 이루어져 있다.
The procedure is the same as in Example 6 except for differences such as pouring the gel over the coating. The coating is composed of atelocollagen, that is, telopeptide-free collagen, prepared by techniques well known to those skilled in the art.

실시예 9: 키토산 및 글리코사미노글리칸과 함께 콜라겐으로 이루어지고 콜라겐 피막으로 덮여진 다공질 기질Example 9 Porous Substrates Consisting of Collagen and Covered with Collagen Film with Chitosan and Glycosaminoglycans

본 과정은 콜라겐, 키토산 및 글리코사미노글리칸으로 이루어진 콜라겐 피막 위에 겔을 붓는 것을 제외하고 실시예 6과 같다. 상기 겔의 제조는 실시예 5에서 기술되어졌다.
The procedure is the same as in Example 6 except that the gel is poured onto the collagen coating consisting of collagen, chitosan and glycosaminoglycans. Preparation of the gel was described in Example 5.

실시예 10Example 10

콜라겐 피막으로 덮여진 상기에서 묘사한 모든 다공질 기질은 실시예 2, 3 및 4에서 묘사한 기술에 의해 가교결합되어질 수 있다.
All porous substrates described above covered with collagen coatings can be crosslinked by the techniques described in Examples 2, 3 and 4.

실시예 11: 압축된 콜라겐 스폰지로 덮여진 실시예 1에서 묘사한 콜라겐만으로 된 다공질 기질Example 11: Porous Substrate with Collagen Only Described in Example 1 Covered with Compressed Collagen Sponge

A. 압축 스폰지의 제조A. Preparation of Compression Sponge

실시예 1에서와 같이 제조되어진, 고형분 함량이 0.3 내지 1.5%인 콜라겐 겔을 0.5 내지 2 g/cm2 무게의 스폰지를 얻기 위하여 동결건조시켰다.A collagen gel with a solid content of 0.3-1.5%, prepared as in Example 1, was lyophilized to obtain a sponge weighing 0.5-2 g / cm 2 .

동결건조물은 20 내지 60℃의 온도 범위와 50 내지 200 바(50 내지 200×105 Pa)의 압력 범위에서 5 내지 60 초 동안 압축되어졌다.The lyophilisate was compressed for 5 to 60 seconds at a temperature range of 20 to 60 ° C. and a pressure range of 50 to 200 bar (50 to 200 × 10 5 Pa).

B. 압축된 스폰지의 다공질 기질과의 조합B. Combination of Compressed Sponges with Porous Substrates

실시예 1에서 묘사된 콜라겐 겔이 cm2당 0.5g의 비율로 동결건조 트레이에서 침적되어졌다. 압축된 스폰지가 그 후 상기 겔 위에 침적되어졌으며 그 전체가 압축된 콜라겐 스폰지로 덮여진 다공질 콜라겐 스폰지를 얻기 위하여 동결건조되어졌다. 그 전체는 실시예 1에서 묘사된 대로 열 건조에 의해 가교결합되어졌다.
The collagen gels depicted in Example 1 were deposited in lyophilized trays at a rate of 0.5 g per cm 2 . A compressed sponge was then deposited on the gel and lyophilized to obtain a porous collagen sponge covered in its entirety with the compressed collagen sponge. The whole was crosslinked by thermal drying as described in Example 1.

실시예 12: 압축된 스폰지로 덮여진 실시예 5에서 묘사된 콜라겐, 키토산 및 글리코사미노글리칸으로 이루어진 다공질 기질Example 12 A porous substrate consisting of collagen, chitosan and glycosaminoglycans depicted in Example 5 covered with a compressed sponge

실시예 5의 과정에 의해 제조되어진 콜라겐, 키토산 및 글리코사미노글리칸 겔을 cm2당 0.5g의 비율로 동결건조 트레이 안에서 침적시켰다. 그 후 압축된 스폰지가 상기 겔 위에 침적되어졌으며 그 전체가 동결건조되어졌다. 동결건조물은 그 후 실시예 1에서 묘사되어진 바와 같이 열 건조에 의해 가교결합되어졌다.
Collagen, chitosan and glycosaminoglycan gels prepared by the procedure of Example 5 were deposited in a lyophilized tray at a rate of 0.5 g per cm 2 . A compressed sponge was then deposited on the gel and the whole was lyophilized. The lyophilisate was then crosslinked by thermal drying as depicted in Example 1.

실시예 13Example 13

압축된 콜라겐 스폰지로 덮여진 상기에서 묘사된 모든 다공질 기질들은 실시예 2, 3 및 4에서 묘사되어진 기술에 의해 가교결합되어질 수 있다.
All porous substrates depicted above covered with a compressed collagen sponge can be crosslinked by the technique depicted in Examples 2, 3 and 4.

실시예 14 내지 16: 소 및 수산물 유래의 콜라겐 기질의 세포 대사를 비교하기 위한 테스트Examples 14--16 Tests to Compare Cell Metabolism of Collagen Substrates from Bovine and Aquatic Products

실시예 14: 섬유아세포의 세포 생존능(cell viability) 테스트Example 14 Cell Viability Test of Fibroblasts

I. 진피 등가물(dermis equivalents)의 제조I. Preparation of dermis equivalents

본 비교 실험을 위하여, 우선 실시예 2에 따른 DPPA-가교결합된 수산 다공질 기질을 제조하였다.For this comparative experiment, first a DPPA-crosslinked hydroxyl porous substrate according to Example 2 was prepared.

비교 방법에 의해, 소 유래의 기질(bovine matrix)이라 불리는, DPPA로 가교결합되어진 비교 다공질 기질이 실시예 2와 같은 조건 하에서 소 유래의 콜라겐을 가지고 제조되어졌다.By a comparative method, a comparative porous substrate crosslinked with DPPA, called a bovine matrix, was prepared with bovine derived collagen under the same conditions as in Example 2.

7회 계대배양한 젊은 기증자군으로부터 채취한 정상 인간의 섬유아세포를 수산 및 소 유래의 기질 각각에 분열증식과 단백질 합성 연구의 경우에는 cm2당 250,000 세포의 비율로, 조직학 연구를 위한 수산 및 소 유래의 기질의 경우에는 cm2당 300,000 세포의 비율로 배양시켰다.Normal human fibroblasts from seven donor populations were subcultured to fish and bovine-derived substrates at a rate of 250,000 cells per cm 2 for fission proliferation and protein synthesis studies, respectively. In the case of the substrate was cultured at a rate of 300,000 cells per cm 2 .

상기 수산 및 소 유래의 기질들을 10% 우태반혈청, 100 IU/mL 페니실린(penicillin), 25㎍/mL 젠타마이신(gentamycin), 1㎍/mL 암포테리신 B(amphotericin B) 및 50㎍/mL 비타민 C를 50/50 (v/v) 비율로 첨가한 DMEM/HAM F12로 구성된 배지(medium) 안에서 배양시켰다.The fish and bovine-derived substrates were treated with 10% fetal placental serum, 100 IU / mL penicillin, 25 μg / mL gentamycin, 1 μg / mL amphotericin B and 50 μg / mL. Vitamin C was incubated in medium consisting of DMEM / HAM F12 added at a 50/50 (v / v) ratio.

상기 배양은 1 달동안 수행되어졌으며 배지는 일 주일에 3번 교환하여 주었다.The culture was performed for 1 month and the medium was exchanged 3 times a week.

II. 수행되어진 분석들II. Analyzes performed

1) MTT와의 반응에 의한 세포 생존능의 측정1) Measurement of Cell Viability by Reaction with MTT

1 중량%의 MTT(즉, 3-(4-(dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)를 배양액에 첨가하여 37℃에서 2.5 시간동안 배양하였다.1 wt% of MTT (ie, 3- (4- (dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) was added to the culture and incubated at 37 ° C. for 2.5 hours.

상기 배양 기간 이후에, 변환된 생성물(conversion product)(포마잔 블루; formazan blue)를 DMSO에 용해시켜서 그것의 흡광도(optical density)를 550nm에서 측정하였다.After the incubation period, the conversion product (formazan blue) was dissolved in DMSO and its optical density was measured at 550 nm.

얻어진 흡광도는 숙신산염 탈수소 효소의 활성에 비례하였다. 이는 밝은 황색 테트라졸리움염(bright yellow tetrazolium salt) 즉, MTT를 포마잔의 청색 결정으로 변환시킬 수 있다.The absorbance obtained was proportional to the activity of the succinate dehydrogenase. This can convert bright yellow tetrazolium salt, MTT, into blue crystals of formazan.

세포 생존능은 배양 후 1, 5, 7 및 22일과 한 달에 측정되어졌다.Cell viability was measured 1, 5, 7 and 22 days and one month after culture.

측정 값을 결정하기 위하여, 각 기질에서 6개의 시료를 준비하였다. To determine the measured values, six samples from each substrate were prepared.

일(days)Days 수산 기질Fishery substrate 평균 표준편차Mean standard deviation 소 유래의 기질Substrate derived from cattle 평균 표준편차Mean standard deviation 1One 487487 2424 403403 4040 55 604604 1919 393393 5959 77 520520 5656 398398 6464 2222 608608 3030 680680 4040

상기 결과들은 또한 도 1에 덧붙여진 곡선을 위하여 사용되어졌다.The results were also used for the curve added to FIG. 1.

다이아몬드 점을 가진 곡선은 수산물 유래의 기질로부터 얻은 결과이며 정사각형 점을 가진 곡선은 소 유래의 기질로부터 얻은 결과이다.Curves with diamond points are results from substrates derived from aquatic products, and curves with square points are results from substrates derived from cows.

상기 결과는 전체적으로 놀랍게도 수산물 유래의 기질이 정상 인간의 섬유아세포의 생존뿐만 아니라 이러한 정상의 인간 섬유아세포의 분열증식을 가능하게 하는 지지체를 만들어 냈으며 동시에 처음 3주 동안 훨씬 더 좋은 배양 지지체를 만들어 내었음을 보여준다.Overall, the results showed that the aquatic-derived substrate produced a support that allows not only the survival of normal human fibroblasts but also the division and proliferation of these normal human fibroblasts, while at the same time producing much better culture supports. Shows.

따라서, 놀랍게도 상기 결과로부터 수산물 유래의 콜라겐이 특별히 생체 세포, 특별하게 바람직하게는 인간의 생체 세포를 포함하는 생체 재료를 형성하기 위한 시험관 내 그리고 심지어 생체 내에서의 적용을 위한, 특별히 인공조직용 지지체의 생산에 적합함을 결론지을 수 있었다.Surprisingly, therefore, from these results, collagen derived from aquatic products can be used in particular for artificial tissues, especially for in vitro and even in vivo applications for forming biomaterials comprising biological cells, particularly preferably human cells. It can be concluded that it is suitable for the production of.

2) 단백질 합성의 측정2) Measurement of Protein Synthesis

진피 등가물의 준비에 대하여 상기에서 보고한 조건들 하에서 한 달 동안 배양한 후 얻은 진피 등가물을 한 달동안 성숙 분열시킨 후, 우태반혈청이 없는 배양액에서의 3일에 걸친 단백질 합성을 평가하였다. For the preparation of dermal equivalents, the dermal equivalents obtained after culturing for one month under the conditions reported above were maturely cleaved for one month, followed by evaluation of protein synthesis over three days in a culture without bovine placental serum.

분석은 피어스(Pierde)의 microBCA 방법에 의해 수행되어졌다.Analysis was performed by Pierde's microBCA method.

세포 밀도는 상기에서 묘사한 조건 하에서 MTT 테스트에 의해 병행하여 평가되어졌다.Cell density was assessed in parallel by the MTT test under the conditions described above.

상대 단백질 함량은 흡광도(optical density) 또는 OD로서 표현되어진 세포 밀도의 단위(unit) 당 단백질 함량에 해당되며, 그래서 해당 세포 농도는 등가이다. 수득된 결과를 하기 표 2에 나타내었다.Relative protein content corresponds to protein content per unit of cell density expressed as optical density or OD, so that cell concentration is equivalent. The results obtained are shown in Table 2 below.

지지체의 콜라겐Collagen of Support 수산 기질Fishery substrate 소 유래의 기질Substrate derived from cattle 평균Average ** 평균Average ** 세포 밀도(OD)Cell density (OD) 2.122.12 0.090.09 1.911.91 0.130.13 단백질(㎍/mL)Protein (μg / mL) 494494 4848 499499 3232 상대 단백질 함량Relative protein content 233233 1818 262262 2323

*: 평균 표준 편차
*: Mean standard deviation

표 I에서와 같이, 평균은 6개의 시료들로부터 구하였다.As in Table I, the mean was obtained from six samples.

3) 조직학3) Histology

21일 동안 수산 및 소 유래의 콜라겐 기질을 배양한 후 얻은 진피 등가물을 2% 파라포름알데하이드 용액(paraformaldehyde solution)으로 고정시킨 후 오스뮴 테트록사이드 용액(osmium tetroxide solution)에서 후고정(post-fixed)시킨 뒤, 건조시키고, 에폰(Epon)에 넣어, 박편을 만든 다음 CMEAGB(프랑스, 라이온; Lyon, France)에서 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy)(Jeol 1200)에 의하여 관찰하였다. The dermal equivalents obtained after incubating the collagen matrix derived from fish and bovine for 21 days were fixed with 2% paraformaldehyde solution and then post-fixed in osmium tetroxide solution. After drying, drying, and placed in Epon, flakes were made and observed by transmission electron microscopy (Jeol 1200) in CMEAGB (Lion, Lyon, France).

결론conclusion

상기 결과는 기질이 수산 또는 소의 것인지 그 여부와 관계없이 3차원적 기질의 매우 훌륭한 군체 형성을 나타내었다. 3주 동안 배양한 후, 세포 밀도는 기질 양쪽 모두 동등하였다. 그러나, 수산물 유래의 기질은 배양 첫 주 분열증식 연구에 의해 나타난 바와 같이 실험 초기에 더 좋은 세포 유착이 가능한 것으로 보였으며 따라서 짧은 배양 시간동안 더 좋은 군체 형성이 가능하다.The results showed very good colonization of the three-dimensional substrate, whether the substrate was fish or cow. After incubation for 3 weeks, the cell density was equal for both substrates. However, the aquatic-derived substrate appeared to be capable of better cell adhesion early in the experiment, as indicated by the first week of proliferation studies, thus allowing for better colonization over short incubation times.

단백질 합성에 관한 한, 섬유아세포 합성 능력(상대적인 단백질 함량)은 또한 배양 한달 이후 동일하였다.As far as protein synthesis is concerned, fibroblast synthesis capacity (relative protein content) was also the same after one month of culture.

이러한 결과는 발육되어진 수산 콜라겐 기질이 훌륭한 품질의 진피 등가물을 제조하는 것을 가능하게 함을 나타내 주며 이러한 기질을 가지고 얻은 결과가 소 유래의 콜라겐 기질을 가지고 얻은 결과와 유사하였다.These results indicate that the developed collagen oxalate substrate makes it possible to produce dermal equivalents of good quality, and the results obtained with these substrates are similar to those obtained with collagen substrates derived from cows.

투과 전자 현미경에서, 섬유아세포는 소 및 수산 유래의 기질에서 관찰되어질 수 있었다. 양쪽 기질에서, 풍부한 새롭게 합성된(neosynthesized) 세포외(extracellular) 기질의 존재가 감지되어졌다. 새롭게 합성된 세포외 기질은 침적된 콜라겐의 섬유 조직의 주기적인 줄무늬의 덕분으로 초기 스폰지의 3차원적 기질을 형성하는 콜라겐 다발(clusters)와 비교하여 구별되어질 수 있었다.
In transmission electron microscopy, fibroblasts could be observed on substrates derived from bovine and fishery. In both substrates, the presence of abundant neosynthesized extracellular matrix was detected. The newly synthesized extracellular matrix could be distinguished in comparison to collagen clusters forming the three-dimensional matrix of the initial sponge, thanks to the periodic streaks of the fibrous tissue of the deposited collagen.

실시예 15: 세포 생존능에 대한 수산 콜라겐 기질의 가교결합의 다른 타입이 주는 영향Example 15 Effect of Different Types of Crosslinking of the Collagen Hydroxide Substrate on Cell Viability

하기 테스트들은 세포 생존력에 대하여 수산 콜라겐 기질의 가교결합의 다른 타입이 주는 영향을 연구하기 위하여 수행되어졌다.The following tests were conducted to study the effect of different types of crosslinking of the collagen hydroxy substrate on cell viability.

I) 진피 등가물의 제조I) Preparation of Dermal Equivalents

a) 사용된 지지체 또는 기질a) the support or substrate used

다른 비율의 콜라겐을 포함하는 다공질 층 또는 기질을 생산하기 위한 콜라겐 겔 내에서 다른 가교결합제(crosslinking agent)를 선택적으로 사용하여 다양한 콜라겐 지지체 또는 기질을 제조하였다:Various collagen supports or substrates were prepared by optionally using other crosslinking agents in the collagen gel to produce a porous layer or substrate comprising different proportions of collagen:

1) 테스트 11) Test 1

본 테스트를 위하여, 다공질 스폰지의 형태인 다공질 기질을 1.3 중량% 수산 콜라겐으로부터 제조된 수산 콜라겐 겔로부터 생산하였다. 상기 다공질 기질은 -80℃에서 냉동되어졌으며 실시예 2에 따라 표준의 동결건조를 수행한 후 건조 상태에서 스폰지 g당 250㎕의 비율로 DPPA로 가교결합되어졌다.For this test, a porous substrate in the form of a porous sponge was produced from a collagen hydroxide gel prepared from 1.3 wt% collagen hydroxide. The porous substrate was frozen at −80 ° C. and subjected to standard lyophilization according to Example 2 and then crosslinked with DPPA at a rate of 250 μl / g sponge in dry state.

2) 테스트 22) test 2

본 테스트를 위하여, 수산 스폰지의 형태인 다공질 지지체를 0.7 중량%의 수산 콜라겐을 포함하는 수산 콜라겐 겔로부터 제조하였다. 상기 다공질 지지체는 -80℃에서 냉동되어진 후 표준 동결건조를 수행하였으며 테스트 1에서와 같이 건조 스폰지 g당 250㎕의 비율로 DPPA로 가교결합되어졌다.For this test, a porous support in the form of a hydroxyl sponge was prepared from a hydroxyl collagen gel comprising 0.7 wt% collagen hydroxide. The porous support was frozen at −80 ° C. and then subjected to standard lyophilization and crosslinked with DPPA at a rate of 250 μl per g dry sponge as in Test 1.

3) 테스트 33) test 3

본 테스트를 위하여, 건조 스폰지 g당 0.46g의 비율로 실시예 2에 따라 EDC를 이용하여 가교결합을 수행한 점 이외에는 테스트 1과 같은 과정을 수행하였다.For this test, the same procedure as Test 1 was performed except that crosslinking was performed using EDC according to Example 2 at a rate of 0.46 g per g dry sponge.

4) 테스트 4 4) test 4

1.1 중량%의 수산 콜라겐을 포함하는 수산 콜라겐 겔로부터 얻은 수산 콜라겐 스폰지를 포함하는 다공질 지지체를 제조하였다. 상기 지지체를 -80℃에서 냉동시킨 후 표준 동결건조를 수행하였으며, 수산 콜라겐 1.1 중량%의 비율인 점을 제외하고 테스트 2에서와 같이 건조 스폰지 g당 250㎕의 비율로 DPPA로 가교결합시켰다.A porous support comprising a collagen hydroxide sponge obtained from a collagen hydroxide gel comprising 1.1 wt% collagen hydroxide was prepared. The support was frozen at −80 ° C. and then subjected to standard lyophilization and crosslinked with DPPA at a rate of 250 μl per g dry sponge as in test 2, except that it was 1.1% by weight of collagen hydroxide.

상기 모든 테스트들에서, 수산 콜라겐은 실시예 2에서와 같이 서대의 복부 껍질로부터 얻었다.In all the above tests, collagen oxalate was obtained from the abdominal shell of the sap as in Example 2.

b) 상기 기질상에서의 섬유아세포의 배양b) culture of fibroblasts on the substrate

정상의 인간 섬유아세포를 실시예 14에서와 같이 사용하였다. 다만, 상기 세포들은 8회 계대배양한 것을 취하였다.Normal human fibroblasts were used as in Example 14. However, the cells were taken subcultured 8 times.

접종을 cm2당 275,000 세포의 비율로 수행하였다.Inoculation was performed at a rate of 275,000 cells per cm 2 .

배양액은 10 중량%의 우태반혈청, 100 IU/mL 페니실린, 25 ㎍/mL 젠타마이신, 1㎍/mL 암포테리신 B 및 50㎍/mL 비타민 C를 50/50(v/v)의 비율로 첨가한 DMEM/HAM F12로 구성된다.The cultures contained 10 wt% fetal placental serum, 100 IU / mL penicillin, 25 μg / mL gentamicin, 1 μg / mL amphotericin B and 50 μg / mL vitamin C at a ratio of 50/50 (v / v). It consists of added DMEM / HAM F12.

배양은 1달 동안 수행되어졌으며 배양액은 일 주일에 3번 교환되어졌다.The culture was carried out for one month and the culture was exchanged three times a week.

4개의 기질을 테스트의 각 타입에 대한 값을 얻기 위하여 각 테스트를 위하여 사용하였으며 평균 표준편차를 측정하였다.Four substrates were used for each test to obtain values for each type of test and the mean standard deviation was measured.

II) 수행되어진 분석II) Analysis performed

알라마 블루(산화 환원 반응 마커)와의 반응에 의한 세포 생존능 측정Cell viability measurement by reaction with Alamar Blue (redox marker)

배양액으로부터 취한 시료의 세포 생존능을 측정하고자 하는 순간 사용되어진 배양액에 대하여 2중량%의 비율로 알라마 블루(alamar blue)를 첨가하였다.Alamar blue was added at a rate of 2% by weight relative to the culture medium used to measure the cell viability of the sample taken from the culture medium.

37℃에서 2시간 30분동안 배양(incubation)한 후, 530nm 여기파장(excitation) 및 590nm 방출파장(emission)에 따라 형광 강도를 측정하였다. 얻은 형광 강도는 세포의 대사 활성에 비례하였다.After incubation at 37 ° C. for 2 hours 30 minutes, the fluorescence intensity was measured according to 530 nm excitation wavelength and 590 nm emission wavelength. The fluorescence intensity obtained was proportional to the metabolic activity of the cells.

세포 생존능을 배양 후 1, 4, 6, 11 및 17일에 10개의 시료에 대하여 측정하였다.Cell viability was measured on 10 samples at 1, 4, 6, 11 and 17 days after culture.

결과를 하기 표 3에 나타내었다.The results are shown in Table 3 below.

결과는 시간 함수(function of time)로서 형광의 국제 단위로 표시하였다.The results are expressed in international units of fluorescence as a function of time.

시간(일) 테스트 1 테스트 2 테스트 3 테스트 4 평균 SD* 평균 SD* 평균 SD* 평균 SD* 1 21,734 1184 30,535 1888 25,528 6820 28,461 3805 4 31,611 920 35,623 3544 36,404 3570 45,126 2930 6 43,144 2500 35,244 2095 37,819 4170 41,254 3396 11 42,808 1481 38,532 2537 42,442 3112 44,508 2329 17 45,484 2426 45,094 1470 43,963 8285 43,939 4521 순서 1 2 3 4
*: 표준편차 Hours Test 1 Test 2 Test 3 Test 4 Average SD * Average SD * Average SD * Average SD * One 21,734 1184 30,535 1888 25,528 6820 28,461 3805 4 31,611 920 35,623 3544 36,404 3570 45,126 2930 6 43,144 2500 35,244 2095 37,819 4170 41,254 3396 11 42,808 1481 38,532 2537 42,442 3112 44,508 2329 17 45,484 2426 45,094 1470 43,963 8285 43,939 4521 order One 2 3 4
*: Standard Deviation

삭제delete

표 3의 결과는 덧붙여진 도 2에서 또한 사용되어졌다.The results in Table 3 were also used in the accompanying Figure 2.

도 2는 진피 등가물의 섬유아세포 분열증식의 곡선을 보여준다.2 shows the curve of fibroblast proliferation of dermal equivalents.

닫힌 다이아몬드 점을 가진 곡선은 테스트 1에 해당되고, 닫힌 정사각형 점을 가진 곡선은 테스트 2에 해당되며, 삼각형을 가진 곡선은 테스트 3에 해당되고, 십자 표시를 가진 곡선은 테스트 4에 해당된다.Curves with closed diamond points correspond to test 1, curves with closed square points correspond to test 2, curves with triangles correspond to test 3, and curves with cross marks correspond to test 4.

가로축은 시간(일)로 표시되었으며, 세로축은 형광 강도를 나타내었으며 형광 강도는 15,000을 시작으로 55,000까지 10,000의 단위 눈금을 가지도록 하였고 IU로 표시하였다.The horizontal axis represents time (days), the vertical axis represents fluorescence intensity, and the fluorescence intensity has a unit scale of 10,000 up to 55,000 starting from 15,000 and expressed in IU.

상기 결과들은 하기 결론을 보여준다.The results show the following conclusion.

결론conclusion

상기 결과는 제조된 다른 기질들이 배양 17일 이후 섬유아세포의 훌륭한 성장을 가능케 하였음을 나타내었다. 수산 콜라겐 기질의 제조와 관계없이, 섬유아세포는 그들의 3차원적 지지체에 잘 부착되었으며 기질을 이식하기 위하여 매우 급속하게 분화되었다.The results indicated that the other substrates produced allowed for excellent growth of fibroblasts after 17 days of culture. Regardless of the preparation of the hydroxyl collagen matrix, fibroblasts adhered well to their three-dimensional supports and differentiated very rapidly to implant the substrate.

분열증식 윤곽(profile)은 하나의 기질에서 다른 기질까지 매우 약간만 변경되었다. 다만 섬유아세포 밀도는 준비과정과 관계없이 배양 17일 이후 비슷하였다.The proliferative profile changed only slightly from one substrate to another. Fibroblast density was similar after 17 days regardless of preparation.

DPPA 또는 EDC 중 어느 하나를 이용하여 수행한 다른 가교결합의 타입은 세포의 재생에 영향을 주지 않는 것으로 보인다. 실질적으로 배양 3주 이후, 기질의 안정성(stability)이 뛰어났으며 소화와 위축(contraction)은 거의 일어나지 않았다.
Other types of crosslinking performed using either DPPA or EDC do not appear to affect cell regeneration. Substantially after 3 weeks of culture, the substrates had excellent stability and very little digestion and contraction occurred.

실시예 16: 새롭게 합성된 인간 콜라겐의 동정 및 분석을 위한 수산 콜라겐의 이점을 증명하는 테스트Example 16: Test demonstrating the benefits of hydroxycollagen for identification and analysis of newly synthesized human collagen

본 테스트는 조직학이 면역적 표지를 이용하여 수행된 점을 제외하고 실시예 14와 유사하다.This test is similar to Example 14 except that histology was performed using immunological labels.

테스트는 하기와 같이 수행되어졌다:The test was performed as follows:

1) 진피 등가물의 제조1) Preparation of dermal equivalents

실시예 14의 조건들 하에서 배양을 수행하여 실시예 14의 진피 등가물을 얻었다.Cultures were performed under the conditions of Example 14 to obtain dermal equivalents of Example 14.

그러므로 상기 배양은 3 주동안 수행되어졌으며 배양액은 일 주일에 3번 교환되어졌다. 정상의 인간 섬유아세포가 실시예 14에서 나타낸 바와 같이 cm2당 300,000 세포의 비율로 접종되어졌다.Therefore, the incubation was carried out for three weeks and the culture was exchanged three times a week. Normal human fibroblasts were seeded at a rate of 300,000 cells per cm 2 as shown in Example 14.

2) 조직학적 연구2) Histological Study

a) 종래 조직학적 연구a) conventional histological studies

고정은 4 중량%의 농도에서 파라포름알데하이드로 이루어졌으며 그 후 얻은 물질을 건조하여 파라핀에 넣었다. 그 다음 파라핀을 제거하고 재수화(rehydration)시킨 후 7㎛ 절편(sections)을 준비하고 말로리 하이든하인(Mallory Haidenhain)으로 착색(stain)시켰다.Fixation consisted of paraformaldehyde at a concentration of 4% by weight and the material obtained was then dried and placed in paraffin. The paraffin was then removed, rehydrated, 7 μm sections were prepared and stained with Mallory Haidenhain.

b) 면역적 표지(Immunolabeling)b) immunolabeling

4 중량%의 파라포름알데하이드로 다시 고정하였다. 얻어진 물질을 티슈 텍 오시티 화합물(Tissue Tek OCT compound) 즉, 미국 인디아나주 엘크하트 마일스사(Miles, Elkhart, Indiana, USA)로부터 얻은 봉입액(inclusion liquid)에 넣었고, 7㎛ 절편을 냉장고에 준비하여 두었다. Fixed again with 4% by weight of paraformaldehyde. The obtained material was placed in a Tissue Tek OCT compound, that is, an inclusion liquid obtained from Miles, Elkhart, Indiana, USA, and 7 μm sections were prepared in a refrigerator. I put it.

면역적 표지가 하기를 이용하여 수행되어졌다:Immune labeling was performed using the following:

i. 일차 항체(토끼 유래의 항-인간 콜라겐 타입 I 항체)(1/40 희석), 및 i. Primary antibody (anti-human collagen type I antibody from rabbit) (1/40 dilution), and

ii.이차 항체{FITC(Fluorescein IsoThioCyanate)가 결합된 항-토끼 항체}(1/160 희석).ii.Secondary antibody {anti-rabbit antibody with Fluorescein IsoThioCyanate) (1/160 dilution).

DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole dilactate)가 대비염색제(counterstain)로서 사용되어졌다.DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dilactate) was used as counterstain.

3) 결과3) results

수산물 유래의 기질과 소 유래의 기질로 이루어진 지지체들이 섬유아세포가 부착되는 더 많은 또는 덜 헐거운 구멍을 형성하였음을 발견하였다.It was found that scaffolds consisting of aquatic-derived and bovine-derived substrates formed more or less loose holes to which fibroblasts were attached.

섬유아세포가 재건된 피부의 생산을 위한 진피 등가물을 순조롭게 덮는 표면에서 더 큰 비율로 발견되어졌다. 섬유아세포의 분포는 수산 및 소 유래의 스폰지에서 모두 균일하였다.Fibroblasts were found in larger proportions on the surface that gently covered the dermal equivalents for the production of reconstructed skin. The distribution of fibroblasts was uniform in both sponges derived from fish and bovine.

면역적 표지에서, 소 유래의 콜라겐으로 형성된 기질이 항-인간 콜라겐 타입 I 항체(교차; crossing)에 의해 표지된 점을 발견하였다.In immunolabelling, it was found that substrates formed from bovine-derived collagen were labeled by anti-human collagen type I antibodies (crossing).

다른 한편으로, 수산물 유래의 기질이 항-인간 콜라겐 항체에 의해 단지 매우 약하게 표지되었다.On the other hand, substrates derived from aquatic products were only very weakly labeled by anti-human collagen antibodies.

그러므로, 수산 콜라겐으로 구성된 스폰지의 용도는 새롭게 합성된 세포외 기질의 동정에 유리하다.Therefore, the use of sponges composed of collagen hydroxide is advantageous for the identification of newly synthesized extracellular matrix.

상기 결과들은 다른 항체에 대한 다른 항원의 반응에 대한 하트만 교수의 연구(Professor Hartmann's studies)에 의하여 설명되어진다. 이는 하기 표 4 또는 하트만 테이블(Hartmann's table)에 주어진 면역적 표지 후 흡광도 측정에 의하여 결정되어진다.The results are explained by Prof. Hartmann's studies on the response of different antigens to other antibodies. This is determined by measuring the absorbance after immunolabelling given in Table 4 below or Hartmann's table.

항원antigen 서대 타입 I 콜라겐Seodae Type I Collagen 인간 타입 I 콜라겐Human Type I Collagen 소의 I 타입 콜라겐Bovine I type collagen 항체Antibodies 20111(225)20111 (225) 1/251/25 190190 >> 815815 1/501/50 210210 >> 548548 1/1001/100 7373 12331233 234234 1/2001/200 4343 605605 136136 1/4001/400 5656 326326 165165 50121(03)50121 (03) 1/251/25 180180 15501550 >> 1/501/50 130130 10941094 >> 1/1001/100 158158 536536 >> 1/2001/200 9696 305305 967967 1/4001/400 109109 215215 728728 50171(01)50171 (01) 1/251/25 18801880 6464 7373 1/501/50 10431043 193193 3232 1/1001/100 571571 5151 3333 1/2001/200 523523 5151 8787

(>: 2000 보다 더 큰 흡광도)(>: Absorbance greater than 2000)

상기 결과들을 OD ×103(λ= 450nm에서의 흡광도)로 표시하였다.The results are expressed as OD × 10 3 (absorbance at λ = 450 nm).

기호 해석: 20111 (225): 항-인간 콜라겐 타입 I Symbol interpretation: 20111 (225): anti-human collagen type I

50121 (03): 항-소 콜라겐 타입 I 50121 (03): Anti-Bovine Collagen Type I

50171(01): 항-어류 (서대) 콜라겐 타입 I
50171 (01): Anti-Fish (Western) Collagen Type I

상기 결과를 나타내는 표는 면역적 표지에서 항체(항-인간 타입 I 콜라겐, 항-소 타입 I 콜라겐, 항-서대 타입 I 콜라겐)와 관계없이, 인간 콜라겐과 서대 콜 라겐 사이의 차이가 인간 콜라겐과 소의 콜라겐 사이 보다 훨씬 더 크다는 점을 보여준다. 결과적으로, 어류 콜라겐 기질에서, 인간 섬유아세포에 의하여 합성되어진 콜라겐이 훨씬 더 쉽게 동정되어질 수 있다. 이로써 어류 콜라겐 기질안에서 합성되어진 콜라겐을 항-인간 타입 I 콜라겐 항체로 면역적 표지를 수행함으로써 얻어지는 상기에서 묘사한 결과가 본 발명의 특별히 기대치 못한 유익한 결과를 구성함을 확인할 수 있었다.
The results show that the difference between human collagen and western colloidal collagen differs from that of human collagen, regardless of antibodies (anti-human type I collagen, anti-small type I collagen, anti-western type I collagen) in immunological labeling. It is much larger than bovine collagen. As a result, in fish collagen matrices, collagen synthesized by human fibroblasts can be identified much more easily. Thus, the above-described results obtained by performing an immunological labeling of collagen synthesized in a fish collagen matrix with an anti-human type I collagen antibody constituted a particularly unexpected beneficial result of the present invention.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 인공조직용 지지체의 생산을 위한 수산물 유래 콜라겐의 용도, 그 지지체 및 생체 재료에 관한 것으로 생체 세포를 시험관 내 또는 생체 내에서 증식시키는데 특별히 적합하고 포유동물 바람직하게 인간의 생체내 사용에 충분히 적합하면서 동시에 상기 포유동물 바람직하게는 인간의 새롭게 합성된 조직과 기존의 조직을 쉽게 구별할 수 있도록 포유동물 바람직하게는 인간의 조직구조와 다른 신규한 인공조직용 지지체를 제공함으로써 피부인공조직산업 및 생체재료산업상 유용한 발명인 것이다.As described in detail above, the present invention relates to the use of the aquatic product-derived collagen for the production of a support for artificial tissue, the support and the biomaterial, which is particularly suitable for propagating living cells in vitro or in vivo, and preferably for mammals. A mammalian preferably human tissue structure and other novel artificial scaffolds are provided so that they can be readily distinguished from the newly synthesized tissues of the mammal, preferably humans, and the existing tissues. By providing it is a useful invention in the skin artificial tissue industry and biomaterials industry.

Claims (19)

동결건조 단계를 거친 수산물 콜라겐으로 부터 제조된 다공질 기질을 포함하고, 상기 다공질 기질은 화학적 방법에 의해 가교결합된 것임을 특징으로 하는 인공조직용 지지체.A support for artificial tissue, characterized in that it comprises a porous substrate prepared from aquatic product collagen subjected to a lyophilization step, wherein the porous substrate is crosslinked by a chemical method. 제 1항에 있어서, 상기에서 사용된 가교결합제는 디페닐포스포릴아자이드(DPPA, Diphenylphosphorylazide), 카보디이미드, N-하이드록시석신이미드 및 글루타알데히드에서 선택된 것임을 특징으로 하는 인공조직용 지지체.The support for artificial tissue according to claim 1, wherein the crosslinking agent used is selected from diphenylphosphoryl azide (DPPA, Diphenylphosphorylazide), carbodiimide, N-hydroxysuccinimide and glutaaldehyde. . 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 수산 콜라겐이 경골어류 피부에서 유래된 것임을 특징으로 하는 인공조직용 지지체.The support for artificial tissue according to claim 1 or 2, wherein the hydroxyl collagen is derived from the tibia fish skin. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 수산 콜라겐이 가자미류 피부에서 유래된 것임을 특징으로 하는 인공조직용 지지체. The scaffold for artificial tissue according to claim 1 or 2, wherein the hydroxyl collagen is derived from flounder skin. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 수산 콜라겐이 서대(sole), 문치가자미(dab), 터보트(turbot), 브릴(brill)에서 선택된 산업적으로 가공된 어류의 피부에서 유래된 것임을 특징으로 하는 인공조직용 지지체.The method according to claim 1 or 2, characterized in that the collagen is derived from the skin of industrially processed fish selected from sole, dal, turbot, and brill. Support for artificial tissue. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 다공질 기질이 키토산과 혼합된 수산 콜라겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 인공조직용 지지체.The support for artificial tissue according to claim 1 or 2, wherein the porous substrate comprises collagen hydroxide mixed with chitosan. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 다공질 기질이 공기 중에서 또는 가스성 유체에서 콜라겐 겔을 건조함으로써 제조되어진 콜라겐 피막 또는 압축된 콜라겐 스폰지로부터 선택된 본질적으로 치밀한 콜라겐 막으로 적어도 한 면이 덮여져 있음을 특징으로 하는 인공조직용 지지체.3. The porous substrate of claim 1 or 2, wherein the porous substrate is covered with at least one side with an essentially dense collagen membrane selected from a collagen coating or a compressed collagen sponge prepared by drying the collagen gel in air or in a gaseous fluid. Support for artificial tissue, characterized in that. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 다공질 기질이 생체에서 분리된 정상 생체 세포, 유전적으로 변형된 생체 세포 및 악성의 생체 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 생체 세포를 포함함을 특징으로 하는 인공조직용 지지체.The artificial tissue according to claim 1 or 2, wherein the porous substrate comprises a living cell selected from the group consisting of normal living cells isolated from the living body, genetically modified living cells and malignant living cells. Support for. 제 8항에 있어서, 상기 생체 세포가 섬유아세포(fibroblasts), 각질형성세포(keratonocytes), 멜라닌세포(melanocytes), 혈액으로부터 유래된 랑게르한스 세포(Langerhans's cells), 혈액으로부터 유래된 내피세포(endothelial cells), 혈액 세포, 대식세포(macrophages), 림프구(lymphocytes), 지방세포(adipocytes), 피지선세포(sebocytes), 연골세포(chondrocytes), 골세포(osteocytes), 골아세포(osteoblasts) 및 혈액으로부터 유래된 상피성촉각세포(Merkel's cells)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 인공조직용 지지체.The method of claim 8, wherein the living cells are fibroblasts (keratonocytes), melanocytes (melanocytes), Langerhans' cells derived from blood, endothelial cells (endothelial cells) derived from blood , Blood cells, macrophages, lymphocytes, adipocytes, sebocytes, chondrocytes, osteoblasts, osteoblasts and blood-derived epithelium The scaffold for artificial tissue, characterized in that selected from the group consisting of Merkel's cells. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 다공질 기질이 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성의 섬유아세포로부터 선택된 생체 섬유아세포를 포함함을 특징으로 하는 인공조직용 지지체.3. The scaffold for artificial tissue according to claim 1 or 2, wherein the porous substrate comprises living fibroblasts selected from normal, genetically modified or malignant fibroblasts. 제 10항에 있어서, 본질적으로 치밀한 막은 각질형성세포(keratonocytes), 멜라닌세포(melanocytes), 혈액으로부터 유래된 상피성촉각세포(Merkel's cells), 혈액으로부터 유래된 랑게르한스 세포(Langerhans's cells), 피지선세포(sebocytes), 혈액세포 및 신경세포로부터 유래된 세포들 중에서 선택된 정상의, 유전적으로 변형된 또는 악성의 생체 세포를 포함함을 특징으로 하는 인공조직용 지지체.The method of claim 10 wherein the essentially dense membrane comprises keratinocytes, melanocytes, epidermal tactile cells derived from blood, Langerhans's cells derived from blood, sebaceous gland cells ( and a normal, genetically modified or malignant living cell selected from cells derived from sebocytes, blood cells and neurons. 제 8항에 있어서, 상기 생체 세포는 인체에서 유래된 것임을 특징으로 하는 인공조직용 지지체.The support for artificial tissue according to claim 8, wherein the living cell is derived from a human body. 삭제delete 삭제delete 제 7항에 있어서, 압축된 콜라겐 스폰지의 압축은 적어도 50 바(50×105 Pa)의 압력하에서, 20℃ 내지 80℃의 온도 범위에서 수행되어짐을 특징으로 하는 인공조직용 지지체.8. The scaffold of claim 7, wherein the compressed collagen sponge is compressed at a temperature in the range of 20 ° C to 80 ° C, under a pressure of at least 50 bar (50 x 105 Pa). 제 7항에 있어서, 상기 본질적으로 치밀한 막은 콜라겐 스폰지와 콜라겐 겔의 조합물이 냉동되어 동결건조되기 전에 치밀한 콜라겐 막이 준비되어 상기 수산 콜라겐 겔상에 침적되어짐으로써 다공질 층과 조합되기 전에 제조되어짐을 특징으로 하는 인공조직용 지지체.8. The intrinsically dense membrane is characterized in that a dense collagen membrane is prepared before being combined with the porous layer by being deposited on the collagen hydroxide gel before the combination of collagen sponge and collagen gel is frozen and lyophilized. Support for artificial tissue. 생체물질, 재건 연결 조직(reconstructing conjunctive tissue) 또는 재건된 피부의 형태인 청구항 7항의 인공조직용 지지체.The scaffold for artificial tissue of claim 7, which is in the form of a biomaterial, reconstructing conjunctive tissue or reconstructed skin. 피부의 노화와 관련된 활성 성분의 효능을 시험하기 위한, 피부 노화 연구용 세포를 포함하는 청구항 7항의 인공조직용 지지체.The scaffold for artificial tissue according to claim 7, comprising cells for skin aging research for testing the efficacy of the active ingredient associated with aging of the skin. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 다공질 기질이 키토산 및 하나 이상의 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)과 혼합된 수산 콜라겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 인공조직용 지지체.The scaffold of claim 1, wherein the porous substrate comprises collagen hydroxide mixed with chitosan and one or more glycosaminoglycans.
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