JP3747412B2

JP3747412B2 - Use of collagen from aquatic animals to produce carriers designed for tissue engineering and the carriers and biomaterials obtained thereby

Info

Publication number: JP3747412B2
Application number: JP2002500933A
Authority: JP
Inventors: アンドレヴァレリー; アブドュルマラクナビル; ウックアラン
Original assignee: Coletica SA; BASF Beauty Care Solutions France SAS
Current assignee: BASF Beauty Care Solutions France SAS
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2001-05-25
Publication date: 2006-02-22
Anticipated expiration: 2021-05-25
Also published as: JP2003534858A; DE10196235B4; WO2001092322A1; DE10196235T1

Description

【０００１】
本発明は、本質的には、組織工学用担体を製造するための水生動物起源のコラーゲンの使用、並びに、それにより得られる担体及び生体材料に関する。
【０００２】
コラーゲンは、細胞の成長に特に好ましい基質である。これは、このタンパク質が、生きた細胞を含有する再生組織を生産するために、いくつかの形態（すなわち、マトリックス、ゲル又はフィルム）で非常に広く使用されているからである。
【０００３】
すばらしい未来があることを期待させる技術である組織工学の分野では、コラーゲンは、特に人工皮膚又は人工軟骨の生産をもたらしている。満足できる結果を達成するためには、コラーゲンは、物理的若しくは化学的な架橋プロセスによって、又は、このタンパク質と強く相互作用する天然高分子を存在させることによって、又は、最終的に両方のシステムの組合せによって、細胞の代謝による酵素分解から保護されなければならない。
【０００４】
従来、このような組織工学への適用の場合、細胞を受容するために担体で使用されているコラーゲンは、哺乳動物から、最も頻繁にはウシの皮膚から抽出されていた。抽出後に得られるタンパク質の良好な機械的性質、酵素分解に対するその抵抗性、そして最後に、ヒトコラーゲンのアミノ酸組成と非常に類似しているそのアミノ酸組成によってこの供給源は選択されていた。これらのすべての理由から、このコラーゲンがヒト細胞の培養に適した唯一のものであると考えることは妥当であった。
【０００５】
ＦａｃｅｂＪｏｕｒｎａｌ（第１４巻第４号、２０００年３月１５日）におけるＹｅｈらの論文（「組織工学用の新規な天然マトリックス：細胞−マトリックス相互作用の分析」）により、生体適合性を研究するために、ヒト皮膚のケラチノサイト及び繊維芽細胞とのその相互作用の研究にジンベイザメの無細胞コラーゲンのマトリックスの使用が誘起された。
【０００６】
ＤｅｒｗｅｎｔアブストラクトＸＰ００２１６１５９８は、培養材料として魚類由来のコラーゲンを使用する方法を記載する特願平０７−０７５５６６（マリノフォーラム、１９９５年３月２０日公開）を参照している。
しかし、この培養は魚類細胞を取り扱っている。
【０００７】
欧州特許ＥＰ−０７５３３１３Ａ１には、海洋生物を使用して、軟体動物又はイカから抽出したキチンの層又はシートを含む積層体の皮膚代用物が記載されている。この場合、キチン溶液が冷凍乾燥（凍結乾燥）されたとき、不溶性の非生分解性海綿状体を構成するキチン構造体が得られることから、キチンの使用は不可欠である。これは、キチンが、ヒト皮膚に存在する酵素によって分解されないからである。魚類皮膚のコラーゲンゲルはキチンの層又はシートの上に注ぐことができ、そして両者は約１週間にわたって冷蔵庫において乾燥される。実際、このコラーゲン層は緻密であり、多孔性ではない。このコラーゲン層には、生きた細胞を植え付けることができない。ここに記載した積層体は不活性な積層体であり、従って、下記の本発明とは対照的に、生きた細胞を植え付けることができず、そしてこれらの細胞の生存性を保つことができないと予想される。
【０００８】
今回、本発明者らは、予想もしなかったことに、ヒト細胞が、魚類コラーゲン（好ましくは、架橋された魚類コラーゲン）からなるいくつかの担体の表面又はその内部で非常によく成長することに注目した。この海産コラーゲンは、好ましくは硬骨魚類の皮膚に由来し、より具体的には無着色の皮膚領域を有する魚類に由来し、より詳細にはカレイ目の魚類に由来し、特に、例えば、シタビラメ（ｓｏｌｅ）、マコガレイ（ｄａｂ）、ターボット（ｔｕｒｂｏｔ）、ブリル（ｂｒｉｌｌ）などのような産業的に漁獲されている魚類に由来する。それらの切り身（ｆｉｌｅｔ：フィレ）調製物は切り分けたものを含意する。より好ましいカレイ目の魚類は、無着食の腹側部分を容易に薄く切ることができるシタビラメである。
【０００９】
さらに、本発明者らは、このような生体材料で培養されたヒト細胞が正常な代謝を保持していることを明らかにすることができた。硬骨魚類の皮膚から抽出されたコラーゲンを用いて生きた細胞の保存及び増殖能を可能にする生体適合性と共に、さらにコラーゲンが架橋され、特筆すべきことに化学的に架橋されていることも、当業者には特に自明ではなかった。これは、一般に、コラーゲンを架橋することにより、架橋されたコラーゲンは、生きた細胞に対して、特にヒトの生きた細胞に対して、生体適合性を有しなくなり、毒性を有するからである。
【００１０】
これらの生体材料は、フィルム、又は圧縮された海綿状体、又は多孔性マトリックスのいずれにもすることができる。これらは、下記に示される実施例においてその調製方法と一緒に記載される。
【００１１】
本発明の１つの目的は、新規な生体材料を形成させるために好適な組織工学用の新規な担体、すなわち、上記担体で培養される正常な生きた細胞又は遺伝子操作されている生きた細胞又は悪性の生きた細胞の良好な増殖、及び、インビトロ又はインビボでのその後の増殖のために上記生きた細胞を含有するこれらの新規な生体材料の枠内で使用されるべき上記細胞類の良好な増殖を可能にするために好適な、組織工学用の新規な担体を提供することにある、新しい技術的問題を解決することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、製造コストが低く、そしてまた汚染の危険性が低い組織工学用の新規な担体を提供すること、従って、新規な生体材料を提供するために特に好適なそのような担体を生産することにある、新しい技術的問題を解決することである。
【００１３】
本発明のさらなる主要な目的は、正常な生きた細胞又は遺伝子操作されている生きた細胞又は悪性の生きた細胞のインビトロ又はインビボでの増殖を可能にするために特に好適な組織工学用の新規な担体を提供することにある新しい技術的問題を解決することである。この場合、その構造は、哺乳動物、特に動物又は好ましくはヒトにおけるインビボでの使用に関して十分な適合性を有しているが、一方で同時に、動物又は好ましくはヒトなどの上記哺乳動物の組織の構造と異なり、その結果、上記動物（好ましくはヒト）の新しく合成された組織と古い組織との間のその後の識別が可能になっている。
【００１４】
本発明は、低コストで、汚染の危険性が低く又は汚染を伴うことなく、同時に、新しく合成された組織を同定することを容易に可能にするという、これらの技術的問題のすべてを満足できる様式で初めて解決する。このことは、当業者には特に自明ではなく、かつ予想できることでもない。
【００１５】
従って、第１の特徴によれば、本発明は、組織工学用担体を製造するための水生動物起源のコラーゲンの使用に関する。
【００１６】
「水生動物起源のコラーゲン」という表現は、水生動物起源の生物のコラーゲン含有組織に由来するコラーゲンを意味するとして理解される。このような生物は当業者には十分公知であり、これらには、限定されるわけではないが、例えば、水生哺乳動物（特に海洋哺乳動物）、クラゲ及び海水又は淡水の魚類が含まれる。当業者にとってはさらに、これらの生物の皮膚が本質的にコラーゲンを含有することは公知である。好ましくは、「水生動物起源のコラーゲン」は、硬骨魚科の魚類から、より具体的には、無着色の領域を有する魚類から、より具体的にはカレイ目の魚類から、特に上記に示した魚類から抽出される。最も好ましいカレイ目の魚類はシタビラメである。
【００１７】
１つの好適な実施形態において、コラーゲンは、魚類の皮膚から、好ましくはその天然体で得られる。
【００１８】
本発明の別の好適な実施形態において、コラーゲンの機械的強度又は酵素分解に対するコラーゲンの抵抗性が、化学的及び／又は物理的な架橋、又は、コラーゲンと強く相互作用する天然高分子の付加、又は、両方のプロセスの組合せのいずれかによって増大する。
【００１９】
本発明のさらに別の好適な実施形態において、コラーゲンは、凍結乾燥工程を好ましくは受けたコラーゲンゲルから調製される多孔性マトリックスの形で使用される。
【００２０】
さらに別の好適な変形形態において、上記の多孔性マトリックスは、物理的方法によって、好ましくは熱脱水又はＴＤＨによって架橋される。
【００２１】
さらに別の好適な変形形態において、上記の多孔性マトリックスは、化学的方法によって、好ましくは、ジフェニルホスホリルアジド若しくはＤＰＰＡを用いた化学的方法によって、又は、カルボジイミド及び／又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いた化学的方法によって、又は、グルタルアルデヒドを用いた化学的方法によって架橋される。
【００２２】
ある好適な実施形態において、上記のコラーゲンは、キトサン及び必要に応じて少なくとも１つのグリコサミノグリカン（好ましくはコンドロイチン硫酸）と混合された海産コラーゲン（好ましくは天然型）から調製された多孔性マトリックスの形態を取ることできる。
【００２３】
本発明のさらに別の好適な実施形態において、上記のコラーゲンは、コラーゲンゲルから調製された多孔性マトリックスの形態を取ることでき、上記多孔性マトリックスは、少なくとも１つの面が（好ましくは空気中又はガス流体中で）コラーゲンゲルを乾燥することによって調製されたコラーゲンフィルム、又は、非常に大きく圧縮されたコラーゲン海綿状体のいずれかからなる本質的に目の詰まったコラーゲン膜で覆われる。
【００２４】
別の好適な変形形態において、非常に大きく圧縮されたコラーゲン海綿状体の上記の圧縮が、少なくとも約５０ｂａｒ（約５０×１０^５パスカル（Ｐａ））の圧力で、好ましくは５０ｂａｒ（５０×１０^５Ｐａ）〜２００ｂａｒ（２００×１０^５Ｐａ）の間の圧力で行われる。この場合、この圧縮は、必要に応じて２０℃〜８０℃の温度で、好ましくは４０℃〜６０℃の温度で行われる。
【００２５】
本発明のさらに別の好適な特徴によれば、２つの層（すなわち、多孔性の層及び本質的に目の詰まった膜）の少なくとも１つは、特に若年の個体又は中高年の個体に由来する、正常な生きた細胞又は遺伝子操作されている生きた細胞又は悪性の生きた細胞を含む。
【００２６】
１つの好適な実施形態において、生きた細胞は、繊維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、血液に由来するランゲルハンス細胞、血液に由来する内皮細胞、血液細胞（特に、マクロファージ又はリンパ球）、脂肪細胞、皮脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、及び、血液に由来するメルケル細胞からなる群から選択される。この場合、上記細胞は正常であるか、又は、遺伝子操作されているか、又は、悪性である。
【００２７】
１つの特に好適な実施形態において、多孔性の層は、正常又は遺伝子操作型又は悪性の繊維芽細胞を含有し、且つ、本質的には目の詰まった膜は、ケラチノサイト、メラノサイト、血液に由来するメルケル細胞、血液に由来するランゲルハンス細胞、皮脂細胞、血液に由来する細胞、及び、神経細胞から特に選択される正常又は遺伝子操作型又は悪性の生きた細胞を含有する。
【００２８】
本発明のさらに別の好適な実施形態により、本発明は、若年の個体から採取された細胞を使用する「若い」再生皮膚、又は中高年の個体から採取された細胞から得られる「老化している」再生皮膚のいずれかを調製するために特に有益であると考えられる。これらのモデルにより、皮膚の老化プロセスの我々の知識を改善させ、かつ、このプロセスに対する活性な薬剤の影響を研究することが可能になる。
【００２９】
別の特に好適な実施形態において、上記の本質的に目の詰まった膜は、コラーゲン海綿状体を含むことが好ましい多孔性の層との組合せに先立って、具体的には、膜を調製して、それをコラーゲンゲルの上に置き、その後、全体を凍結及び凍結乾燥することによって調製される。
【００３０】
第２の特徴によれば、本発明はまた、上記に規定されるような水生動物起源のコラーゲン又はその全体を通して理解され、且つ、その一般性において本発明の不可欠な部分を形成する実施例を含む下記の説明から得られるような水生動物起源のコラーゲンを含む組織工学用の担体を包含する。従って、この特徴は、いずれかの技術と比較することにより新規性があると考えられるあらゆる特徴に関して、実施例の内容にかかわらず、その機能及びその一般性が理解される。
【００３１】
第３の特徴によれば、本発明はまた、生体材料、例えば再生結合組織又は再生皮膚の形をとる生体材料を包含する。このような生体材料は、上記の第２の特徴の担体に関して、特徴のすべてが上記に規定され、さらにまた下記の説明から得られるような水生動物起源のコラーゲンから調製されている。
【００３２】
本説明及び請求項の枠内において、「組織工学用の担体」という表現は、正常な生きた細胞又は遺伝子操作されている生きた細胞又は悪性の生きた細胞の培養及び増殖を、それがインビトロであってもインビボであっても行なうために使用される担体を意味する。この増殖は、動物及び好ましくはヒトを含む哺乳動物にインビボで適用されることが好ましい。本発明は、（例えば、再生結合組織又は再生皮膚の形をとる）生体材料を製造するための組織工学の枠内において、特に好ましい用途を有することが理解される。この枠内において、最初の工程は、一般には、上記生きた細胞を有する担体をインビトロで培養して、（例えば、再生結合組織又は再生皮膚の形をとる）生体材料を得ることであり、そして、次に二番目の工程は、損傷したか、若しくは、手術によって除去された結合組織を再生するために、又は、同様に皮膚を再生して、医学的理由が何であれ、損傷したか、又は手術によって除去された領域を再置換するために、哺乳動物において、例えば、動物又は好ましくはヒトにおいて、この生体材料を、再生結合組織又は再生皮膚としてインビボで使用することであろう。
【００３３】
好適なことに、このような組織工学用担体、又は、好ましくは（例えば再生結合組織又は再生皮膚の形をとる）生体材料は、具体的には、組織の老化プロセス及び特に皮膚の老化プロセスを研究するために、並びに、必要な場合には、このプロセスにおける活性な成分又は主成分の効力を試験するために、実質的に若年の個体のみから得られる細胞又は実質的に中高年の個体のみから得られる細胞のいずれかを含む。
【００３４】
従って、本発明は、特に簡便な方法で、低コストで、汚染の危険性が低く、そして水生動物コラーゲンと、インビボでの使用の過程で新しく合成された哺乳動物コラーゲン又は好ましくはヒトコラーゲンとを識別できる、上記の新しい技術的課題に対する一般的な解決策を提供していることが理解される。
【００３５】
実際、生きている人工組織を製造する際の魚類コラーゲンの使用は、哺乳動物源と比較して、３つの本質的な利点を有している。
・原材料として一般に使用される魚類皮膚は、非常に清浄な条件のもとで豊富に得ることができる。
・感染性汚染の危険が非常に低い。特に、プリオンタイプの伝染性病原体の危険性が全く知られてない。
・最後に、魚類コラーゲンのアミノ酸組成はヒトコラーゲンのアミノ酸組成とは比較的似ていないので、この２つのタンパク質は、特異的な抗体によって比較的容易に識別することができる。この方法論は、特に「インビトロ」試験又は「インビボ」治癒研究において非常に有益であろう。
【００３６】
さらに、海産コラーゲンを使用すれば、免疫標識が非常に効果的に行なえ、そして海産コラーゲンと新しく合成されたコラーゲンとの識別が可能になるであろう。
【００３７】
魚類コラーゲンは、プロテアーゼによる酵素分解からそれ自体を保護し、かつその機械的性質に主に関わる天然構造を有している。従って、抽出操作及び精製工程のときに使用される処理によってタンパク質構造ができる限り分解されないことは非常に重要であろう。これは、らせん構造並びに分子間及び分子内の架橋ができる限り保持されなければならないことを意味している。本発明者らは、より詳細には、１９９４年７月１９日に付与された米国特許第５３３１０９２号に記載される方法を実施することによってこれを達成した。それにもかかわらず、特定の適用のためには、部分的に架橋が開裂したコラーゲン、例えば、アテロコラーゲン（すなわち、そのテロペプチドの部分を失っているコラーゲン）の使用を想定することは可能であろう。
【００３８】
その場合、組織工学の適用例の大部分にとっては、コラーゲンの機械的性質が高められ、そして酵素消化に対する抵抗性が、化学的及び／又は物理的な架橋技術によって、又は、このタンパク質と強く相互作用する天然高分子の付加によって、又は、最終的には両方のプロセスの組合せによって、そのいずれでも大きくなるであろう。
【００３９】
魚類コラーゲンの保護は、その天然の安定性が哺乳動物コラーゲンの安定性よりも低いためにますます重要である。魚類コラーゲンの天然の安定性が低いという特徴は、ヒドロキシプロリン含有量がより低いことによるものである。
【００４０】
上記に記載の生体材料には、「インビトロ」試験の分野又は損傷組織を修復するための薬学的分野のいずれでも使用され得る生きた人工組織を作製するために、生きた細胞を植え付けることができる。
【００４１】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、組織工学用担体の製造のための本発明の枠内並びに担体及び生体材料を構成する本発明の枠内で使用することができる水生動物起源のコラーゲンの様々な形態を調製する実施例を参照にしてなされた、下記の説明のための記載から明瞭に明らかになるであろう。この場合、実施例は、例示として単に示されているだけであり、従って本発明の範囲を決して限定するものではない。
【００４２】
実施例では、別途示されない限り、温度は℃の単位で示され、圧力は大気圧であり、百分率は重量％で示される。
【００４３】
実施例１〜１３は、当然のことではあるが、本発明による組織工学用担体として使用され得るコラーゲンを調製する実施例である。
【００４４】
実施例１４〜１６は、注目すべきことには、組織工学用担体の製造する観点から実施例１〜１３のうちの中でいくつかで調製された形態の本発明の水生動物起源のコラーゲンを使用するという観点からの比較試験である。
【００４５】
実施例１
水生動物の天然コラーゲンからなる多孔性マトリックスの調製
【００４６】
このコラーゲンは、１９９４年７月１９日に付与された米国特許第５３３１０９２号の技術によって得られる。
【００４７】
Ａ．水生動物の天然コラーゲンの調製
コラーゲンゲルをシタビラメの腹側皮膚から調製する。皮膚を磨砕して、次いで下記の組成：０．７８ｇ／ｌのリン酸二水素カリウム及び２１．７ｇ／ｌのリン酸一水素二ナトリウムを有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）で洗浄する。洗浄は、磨砕した材料１ｋｇあたり５ｌの緩衝液の割合で、撹拌しながら１時間行われる。その後、磨砕した材料１ｋｇあたり５ｌの水の割合で、軟水を用いて２回連続して洗浄を行い、その後引き続いて４０００ｒｐｍで連続遠心分離（Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ遠心分離）を行なってリン酸緩衝液を除去する。その後、０．２５Ｍの酢酸溶液を用いて、１０ｌの溶液に対して磨砕した材料１ｋｇの割合で、磨砕した材料を酸性化する。その後、ゲルを４０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。使用されるゲルは、コラーゲン濃度が０．５％〜２％の間にある得られた上清からなる。
【００４８】
Ｂ．上記で得られたコラーゲンゲルからの多孔性マトリックスの調製
このゲルを凍結乾燥皿に２０ｇ／ｃｍ^２の割合で注ぐ。その後、ゲルは、−３０℃で凍結し、そして＋３２℃で加熱した後、凍結乾燥される。総凍結乾燥時間は４００マイクロバールの圧力で１６時間である。その後、得られたマトリックスを加熱脱水（ＴＤＨ）によって架橋する。加熱脱水は、４００マイクロバールの真空度で１６時間にわたって１１０℃のオーブンで加熱することからなる。
【００４９】
実施例２
欧州特許第４６６８２９号（１９９６年７月２４日）に記載される技術によってジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）で架橋された多孔性マトリックスの調製
実施例１のコラーゲンマトリックスを、１００ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に５μｌ〜２５０μｌのＤＰＰＡ／ｇコラーゲンを含有する溶液中で２４時間インキュベーションする。その後、コラーゲンを１００ｍｌのＤＭＦで洗浄して、ＤＰＰＡを除く。次いで、ＤＭＦを、ｐＨ８．９のホウ酸塩緩衝液溶液（０．０４Ｍ四ホウ酸ナトリウム、０．０４Ｍホウ酸）の１００ｍｌで洗浄することによって除去する。
最後に、コラーゲンを同じホウ酸緩衝液中で一晩インキュベーションし、その後、６時間にわたって軟水で連続的に洗浄することによってホウ酸緩衝液を除去する。
【００５０】
実施例３
カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドで架橋された多孔性マトリックスの調製
実施例１の水生動物コラーゲンマトリックスを、ＥＤＣ（エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド）をコラーゲン１ｇあたり０．２３ｇ〜０．６９ｇの濃度で、そしてＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を０．４２ｇ／ｇコラーゲンの濃度で架橋する。
軟水で洗浄した後、コラーゲンを再び凍結乾燥する。
【００５１】
実施例４
グルタルアルデヒドで架橋された多孔性マトリックスの調製
実施例１の水生動物コラーゲンの多孔性マトリックスを、０．６％〜１％のＧＴＡを含有する溶液中で、２０℃で２４時間〜９６時間にわたって架橋する。
軟水で洗浄した後、コラーゲンを再び凍結乾燥する。
【００５２】
実施例５
欧州特許第２９６０７８号（１９９１年５月２９日）に記載されるような、キトサン及びグリコサミノグリカンと組み合わせて実施例１の水生動物天然コラーゲンを用いて調製される多孔性マトリックス
３５６ｍｌの水に２．５ｇのキトサンを含む溶液及び１．９ｍｌの酢酸、次いで４００ｍｌの軟水に１ｇのコンドロイチン４−硫酸を含む溶液を６００ｇの１．５％コラーゲンゲルに加える。続いて、約４．０のｐＨを有するこの混合物を撹拌して、凍結乾燥する。得られた海綿状体をＴＤＨによって架橋する。
【００５３】
実施例６
コラーゲンフィルムで被覆された実施例１に記載される多孔性マトリックス
Ａ．フィルムの調製
固体含有量が０．３％〜０．８％であるコラーゲンゲルを３０℃のオーブンで乾燥するか、又は０．５ｇゲル／ｃｍ^２皿の割合でフード下で乾燥する。１０％〜４０％のグリセロールをコラーゲンゲルに添加することができる。
これらの条件のもとで乾燥したコラーゲンを透明なフィルムにする。
【００５４】
Ｂ．フィルムと上記に記載される多孔性マトリックスとの結合
固体含有量が０．５％〜２％である水生動物の天然コラーゲンゲルを凍結乾燥皿に０．５ｇ／ｃｍ^２の割合で置き、その後、コラーゲンフィルムをこのゲルの上に置き、全体を凍結乾燥する。
得られた凍結乾燥物をＴＤＨによって架橋する。
【００５５】
実施例７
酸可溶性コラーゲンゲルを用いて調製され、コラーゲンフィルムで被覆された多孔性マトリックス
方法は、実施例６に示される方法であるが、唯一の違いは、フィルムに注がれたゲルの性質にある。このゲルは、当業者に十分に公知の技術によって調製される酸可溶性コラーゲンからなる。
【００５６】
実施例８
アテロコラーゲンゲルを用いて調製され、コラーゲンフィルムで被覆された多孔性マトリックス
方法は、実施例６に示される方法であるが、唯一の違いは、フィルムに注がれたゲルの性質にある。このゲルは、当業者に十分に知られている技術によって調製されるアテロコラーゲン（すなわち、テロペプチド非含有コラーゲン）からなる。
【００５７】
実施例９
キトサン及びグリコサミノグリカンと組み合わせたコラーゲンからなり、コラーゲンフィルムで被覆された多孔性マトリックス
方法は、この場合には、コラーゲンフィルムに注がれたゲルが、コラーゲン、キトサン及びグリコサミノグリカンからなることを除いて、実施例６に示される方法である。このゲルの調製は実施例５に記載される。
【００５８】
実施例１０
上記の多孔性マトリックスはすべて、コラーゲンフィルムで被覆されており、実施例２、３及び４に記載される技術によって架橋することができる。
【００５９】
実施例１１
圧縮されたコラーゲン海綿状体で被覆された、実施例１に記載したコラーゲンのみの多孔性マトリックス
Ａ．圧縮された海綿状体の調製
固体含有量が０．３％〜１．５％である、実施例１のように調製されたコラーゲンゲルを凍結乾燥して、重量が０．５ｇ／ｃｍ^２〜２ｇ／ｃｍ^２である海綿状体を得る。
この凍結乾燥物を２０℃〜６０℃の温度及び５０ｂａｒ〜２００ｂａｒ（５０〜２００×１０^５Ｐａ）の圧力で５秒間〜６０秒間圧縮する。
【００６０】
Ｂ．圧縮された海綿状体と多孔性マトリックスとの結合
実施例１に記載されるコラーゲンゲルを凍結乾燥皿に０．５ｇ／ｃｍ^２の割合で置く。次いで、圧縮された海綿状体をこのゲルの上に置き、全体を凍結乾燥して、圧縮されたコラーゲン海綿状体で被覆された多孔性コラーゲン海綿状体を得る。全体を、実施例１に記載されるようにＴＤＨによって架橋する。
【００６１】
実施例１２
実施例５に記載するように、コラーゲン、キトサン及びグリコサミノグリカンからなり、圧縮された海綿状体で被覆された多孔性マトリックス
実施例５のプロセスによって調製された、コラーゲン、キトサン及びグリコサミノグリカンからなるゲルを凍結乾燥皿に０．５ｇ／ｃｍ^２の割合で置き、次いで、圧縮された海綿状体をこのゲルの上に置き、全体を凍結乾燥する。その後、凍結乾燥物を、実施例１に記載されるようにＴＤＨによって架橋する。
【００６２】
実施例１３
上記の多孔性マトリックスはすべて、圧縮されたコラーゲン海綿状体で被覆されており、実施例２、３及び４に記載される技術によって架橋することができる。
【００６３】
実施例１４〜１６：ウシ及び水生動物のコラーゲンマトリックスの細胞代謝を比較するための試験

【００６４】
実施例１４：繊維芽細胞の細胞生存性に対する試験
Ｉ−真皮等価物の調製
この比較試験のために、実施例２に従ってＤＰＰＡ架橋された水生動物多孔性マトリックスが最初に調製される。
【００６５】
比較として、ウシマトリックスと呼ばれる比較用の多孔性マトリックスが、これもまたＤＰＰＡで架橋されるが、実施例２の条件と同じ条件のもとでウシ起源のコラーゲンを用いて調製される。
【００６６】
若年ドナープールから採取され、７代目の継代で使用される正常なヒト繊維芽細胞を、増殖及びタンパク質合成の研究の場合には２５０，０００細胞／ｃｍ^２の割合で、そして組織化学的研究を目的とする水生動物及びウシのマトリックスの場合には３００，０００細胞／ｃｍ^２の割合で、水生動物及びウシのマトリックスのそれぞれに播種する。
【００６７】
これらの水生動物マトリックス及びウシマトリックスは、１０％のウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ及び５０μｇ／ｍｌのビタミンＣが補充された、５０／５０（ｖ／ｖ）の比のＤＭＥＭ／ＨＡＭＦ１２からなる培地で培養される。
この培養は１ヶ月間行われ、培養培地が１週間に３回交換される。
【００６８】
ＩＩ−行われた分析
１）ＭＴＴとの反応による細胞生存性の測定
１重量％のＭＴＴ（すなわち、３−（４−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）を培養培地に加える。
インキュベーションを３７℃で２．５時間行なう。
このインキュベーション期間の後、変換生成物（ホルマザンブルー）をＤＭＳＯに可溶化して、その光学密度を５５０ｎｍにおいて読み取る。
得られた光学密度は、明黄色のテトラゾリウム塩、ＭＴＴをホルマザンの青色結晶に変換することができるコハク酸デヒドロゲナーゼの活性に比例している。
細胞生存性が、培養の１日後、５日後、７日後及び２２日後並びに１ヶ月後に測定された。
平均値を求めるために、６つのサンプルがそれぞれのマトリックスについて調製された。
【００６９】
【表１】

【００７０】
これらの結果はまた、添付の図１の曲線のために使用される。
ひし形の点の曲線が水生動物マトリックスで得られた曲線であり、四角の点の曲線がウシマトリックスで得られた曲線であることが認められる。
【００７１】
これらの結果は、全く驚くべきことに、水生動物マトリックスが、正常なヒト繊維芽細胞の生存だけでなく、これらの正常なヒト繊維芽細胞の増殖をも可能にしている担体を構成し、その一方で同時に、最初の３週間の間、はるかにより良好な培養担体を構成していることを示している。
従って、驚くべきことに、水生動物コラーゲンは、組織工学用担体を製造するために、特に、生きた細胞、特に、そして好ましくはヒトの生きた細胞を含有する生体材料を形成させるためのインビトロでの適用に、そしてとりわけインビボでの適用さえも特に好適であると、これらの試験から結論することができる。
【００７２】
２）タンパク質合成の測定
ウシ胎児血清を含まない培養培地に３日間わたって分泌されたタンパク質の合成を、真皮等価物の調製において上記に報告された条件のもとで１ヶ月の培養を行った後で得られるような真皮等価物の成熟化の１ヶ月後に評価した。
分析をＰｉｅｒｃｅのミクロＢＣＡ法により行なう。
細胞密度が、上記の条件下でのＭＴＴ試験で同時に評価された。
相対タンパク質含有量は、光学密度又はＯＤとして表される細胞密度の１ユニットあたりのタンパク質含有量に対応するので、問題としている細胞濃度は等しい。得られた結果を下記の表ＩＩに示す。
【００７３】
【表２】

【００７４】
表Ｉのように、平均値は６つのサンプルに基づく。
【００７５】
３）組織化学
水生動物及びウシのコラーゲンマトリックスの２１日間の培養の後に得られた真皮等価物を２％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、その後、四酸化オスミウム溶液で後固定し、脱水して、Ｅｐｏｎに封入し、切片化して、ＣＭＥＡＧＢ（Ｌｙｏｎ、フランス）において透過電子顕微鏡検査（Ｊｅｏｌ１２００）によって観察した。
【００７６】
結論
これらの結果は、マトリックスが水生動物又はウシであるかにかかわらず、三次元マトリックスの非常に良好なコロニー形成を示している。３週間の培養後、細胞密度は両タイプのマトリックスにおいて等しい。しかし、水生動物マトリックスは、第１週の培養における増殖研究によって示されるように、実験の初期におけるより良好な細胞接着、従って、短い培養期間のより良好なコロニー形成を可能にしているようである。
【００７７】
タンパク質合成に関する限り、繊維芽細胞の合成能力（相対タンパク質含有量）もまた１ヶ月の培養後において等しい。
【００７８】
これらの結果は、開発された水生動物コラーゲンマトリックスが、良好な性質を有する真皮等価物の調製を可能にしたことを示しており、そしてこれらのマトリックスを用いて得られる結果は、ウシのコラーゲンマトリックスを用いて得られた結果と匹敵し得る。
【００７９】
透過電子顕微鏡検査では、繊維芽細胞をウシ起源及び水生動物起源のマトリックスにおいて認めることができる。両タイプのマトリックスにおいて、多量の新しく合成された細胞外マトリックスの存在が認められる。新しく合成された細胞外マトリックスは、最初の海綿状体の三次元マトリックスを形成するコラーゲンクラスターと比較して、堆積したコラーゲン繊維の周期的な細い縞によって区別することができる。
【００８０】
実施例１５
細胞生存性に対する水生動物コラーゲンマトリックスの異なるタイプの架橋の影響
下記の試験が、細胞生存性に対する水生動物コラーゲンマトリックスの異なるタイプの架橋の影響を調べるために行われる。
【００８１】
Ｉ）真皮等価物の調製
ａ）使用される担体又はマトリックス
様々なコラーゲン担体又はマトリックスが、下記のように、多孔性の層又はマトリックスを製造するためのコラーゲンゲルにおいて異なる割合のコラーゲンを使用して、そして必要な場合には異なる架橋剤を使用して調製される。
【００８２】
１）試験１
この試験のために、多孔性海綿状体の形をとる多孔性マトリックスが、１．３重量％の水生動物コラーゲンから調製された水生動物コラーゲンゲルから製造される。これは、−８０℃で凍結され、実施例２による標準的な凍結乾燥に供され、その後、乾燥状態の海綿状体１ｇあたり２５０μｌの割合でＤＰＰＡを用いて架橋される。
【００８３】
２）試験２
この試験に、水生動物性海綿状体の形をとる多孔性マトリックスが、０．７重量％の水生動物コラーゲンを含む水生動物コラーゲンゲルから調製される。これは、試験１のように、−８０℃で凍結され、その後、標準的な凍結乾燥に供され、乾燥海綿状体１ｇあたり２５０μｌの割合でＤＰＰＡを用いて架橋される。
【００８４】
３）試験３
この試験について、手順は、架橋が、乾燥海綿状体１ｇあたり０．４６ｇの割合で実施例３に従ってＥＤＣを用いて行われることを除いて、試験１の通りである。
【００８５】
４）試験４
１．１重量％の水生動物コラーゲンを含む水生動物コラーゲンゲルから得られる水生動物コラーゲンの海綿状体を含む多孔性担体が調製される。これは、試験２のように、−８０℃で凍結され、その後、標準的な凍結乾燥に供され、乾燥海綿状体１ｇあたり２５０μｌの割合でＤＰＰＡを用いて架橋されるが、その違いは、水生動物コラーゲンの割合が１．１重量％であることにある。
【００８６】
これらの試験のすべてにおいて、水生動物コラーゲンは、実施例２のようにシタビラメの腹側皮膚に由来する。
【００８７】
ｂ）これらのマトリックスにおける繊維芽細胞の培養
正常なヒト繊維芽細胞が実施例１４のように使用されるが、繊維芽細胞は８代目の継代から採取される。
播種が２７５，０００細胞／ｃｍ^２の割合で行われる。
培養培地は、１０重量％のウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ及び５０μｇ／ｍｌのビタミンＣが補充された５０／５０（ｖ／ｖ）のＤＭＥＭ／ＨＡＭＦ１２からなる。
培養は１ヶ月間行われ、培地が１週間に３回交換される。
４つのマトリックスが、試験のそれぞれのタイプについて平均値が得られ、平均標準偏差が評価されるように、それぞれの試験について使用される。
【００８８】
ＩＩ）行われた分析
アラマーブルー（レドックスマーカー）との反応による細胞生存性の測定
培養培地から採取されるサンプルについて細胞生存性を測定することが所望されるときには、アラマーブルーが、使用された培養培地の２重量％の割合で添加される。
３７℃で２時間２０分にわたってインキュベーションした後、蛍光を、５３０ｎｍでの励起光及び５９０ｎｍでの放出光に基づいて読み取る。
得られる蛍光強度は細胞の代謝活性に比例している。
細胞生存性が、培養の１日後、４日後、６日後、１１日後及び１７日後に１０個のサンプルについて測定される。
結果は下記の表ＩＩＩに表される。
結果は、時間の関数として蛍光の国際単位（ＩＵ）で示されている。
【００８９】
【表３】

【００９０】
表３の結果もまた、添付の図２のために使用される。
結果は、真皮等価物における繊維芽細胞の増殖曲線を示している。
黒ひし形の点を伴う曲線は試験１に対応し、黒四角の点を伴う曲線は試験２に対応し、三角の点を伴う曲線は試験３に対応し、十字の点を伴う曲線は試験４に対応する。
時間が横軸に日数で表され、蛍光が、１５，０００から始まり、１０，０００単位で５５，０００まで増大するスケールを用いてＩＵで表されている。
結果から、下記の結論を引き出すことができる。
【００９１】
結論
結果は、調製された種々のマトリックスが、１７日の培養後において繊維芽細胞の良好な増殖を可能にし得ることを示している。水生動物コラーゲンマトリックスの調製に関係なく、繊維芽細胞は、それらの三次元担体に良好に接着し、非常に迅速に***して、マトリックスにおいてコロニー形成する。
【００９２】
増殖プロフィールはマトリックスのタイプ毎に非常にわずかに変化しているが、繊維芽細胞の密度は、調製方法にかかわらず、１７日の培養後において匹敵し得る。
【００９３】
ＤＰＰＡ又はＥＤＣのいずれかを用いて行われた種々のタイプの架橋は細胞の再生に影響を及ぼしていないようである。実際には３週間の培養後において、マトリックスの安定性は優れており、ほとんど消化されず、そしてほとんど収縮していない。
【００９４】
実施例１６
新しく合成されたヒトコラーゲンの同定及びアッセイについて水生動物コラーゲンの利点を明らかにする試験
この試験は、組織化学が免疫標識とともに行われることを除いて、実施例１４の試験に類似している。
試験は下記のように行われる。
【００９５】
１）真皮等価物の調製
これらは実施例１４の真皮等価物であり、培養が実施例１４の条件のもとで行われる。
従って、この培養は、実施例１４に示されるように、正常なヒト繊維芽細胞が３００，０００細胞／ｃｍ^２の割合で播種され、培地を１週間に３回交換しながら３週間にわたって行われる。
【００９６】
２）組織化学
ａ）従来的な組織化学
固定が、４重量％の濃度のパラホルムアルデヒドを用いて行われ、その後、材料は脱水され、パラフィンに封入される。
この後、７μｍの切片が調製され、そしてパラフィンの除去及び再水和の後にマロリー・ハイデンハイン染色が行われる。
ｂ）免疫標識
固定が、４重量％のパラホルムアルデヒドを用いて再び行われ、材料はＴｉｓｓｕｅＴｅｋＯＣＴコンパウンド、すなわち、Ｍｉｌｅｓ（Ｅｌｋｈａｒｔ、Ｉｎｄｉａｎａ、米国）により供給される封入液に封入され、７μｍの切片が低温で調製される。
免疫標識は下記を用いて行われる：
ｉ．一次のウサギ抗ヒトＩ型コラーゲン抗体（希釈、１／４０）及び
ｉｉ．二次のＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）結合抗ウサギ抗体（希釈、１／１６０）。
ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジラクテート）が対比染色として使用される。
【００９７】
３）結果
水生動物マトリックス及びウシマトリックスからなる担体は、繊維芽細胞が接着する多少なりとも詰まっていない細孔を形成していることが見出される。
より大きい割合の繊維芽細胞が表面に認められ、再生皮膚を製造するために真皮等価体を覆う好適な被覆を形成している。繊維芽細胞の分布は水生動物の海綿状体及びウシの海綿状体において均質である。
免疫標識では、ウシコラーゲンから形成されたマトリックスが抗ヒトＩ型コラーゲン抗体によって標識されることが見出される（交差）。
一方、水生動物起源のマトリックスは抗ヒトコラーゲン抗体によって非常に弱く標識されるだけである。
従って、水生動物コラーゲンから構成される海綿状体は、新しく合成された細胞外マトリックスの同定には好都合である。
これらの結果は、下記の表ＩＶ又はＨａｒｔｍａｎｎの表に示される免疫標識後の光学密度測定値によって決定される、種々の抗体に対する種々の抗原の反応に関するＨａｒｔｍａｎｎ教授の研究によって説明される。
【００９８】
【表４】

【００９９】
結果は、ＯＤ×１０^３（λ＝４５０ｎｍにおける光学密度）で表されている。
記号：２０１１１（２２５）：抗ヒトＩ型コラーゲン
５０１２１（０３）：抗ウシＩ型コラーゲン
５０１７１（０１）：抗魚類（シタビラメ）Ｉ型コラーゲン
【０１００】
この表の結果は、免疫標識における抗体（抗ヒトＩ型コラーゲン、抗ウシＩ型コラーゲン、抗シタビラメＩ型コラーゲン）にかかわらず、ヒトコラーゲンとシタビラメコラーゲンとの差が、ヒトコラーゲンとウシコラーゲンとの差よりも大きいことを示している。従って、魚類コラーゲンマトリックスでは、ヒト繊維芽細胞によって合成されたコラーゲンをはるかに容易に同定することができる。このことは、魚類コラーゲンマトリックス中で合成されたコラーゲンを抗ヒトＩ型コラーゲン抗体で免疫標識することによって得られた上記の結果を確かなものにしており、従って、本発明の特に予想外で、好適な結果を構成している。
【図面の簡単な説明】
【図１】真皮等価物における正常なヒト繊維芽細胞の増殖を示す。日数で表される時間が横軸にプロットされ、そして光学密度×１０００が縦軸にプロットされ、１００単位ごとに目盛りを付してある。ひし形の点を伴う曲線は、使用された担体が水生動物コラーゲン（この場合には魚類コラーゲン）の多孔性マトリックスであるときに得られた曲線である。四角の点を伴う曲線は、ウシコラーゲンで得られた曲線である。
【図２】真皮等価物における正常なヒト繊維芽細胞の増殖に対する類似の曲線を示す。日数で表される時間が横軸にプロットされ、国際単位（ＩＵ）で表される蛍光が縦軸にプロットされ、１５，０００から始まり、１０，０００単位ごとに目盛りを付してある。黒ひし形の点を伴う曲線は、試験１で得られた蛍光を表し、四角の点を伴う曲線は、試験２で得られた曲線を表し、白三角の点を伴う曲線は、試験３で得られた曲線を表し、そして最後に、十字の点を伴う曲線は、試験４で得られた曲線を表す。[0001]
The present invention relates essentially to the use of collagen from aquatic animals to produce tissue engineering carriers, and the carriers and biomaterials obtained thereby.
[0002]
Collagen is a particularly preferred substrate for cell growth. This is because this protein is very widely used in several forms (ie, matrix, gel or film) to produce regenerative tissue containing living cells.
[0003]
In the field of tissue engineering, a technology that is expected to have a great future, collagen has led to the production of artificial skin or cartilage, in particular. In order to achieve satisfactory results, collagen is produced by a physical or chemical cross-linking process, or by the presence of a natural polymer that interacts strongly with this protein, or ultimately in both systems. The combination must protect against enzymatic degradation due to cellular metabolism.
[0004]
Traditionally, for such tissue engineering applications, collagen used in carriers to receive cells has been extracted from mammals, most often from bovine skin. This source was selected because of the good mechanical properties of the protein obtained after extraction, its resistance to enzymatic degradation, and finally its amino acid composition very similar to that of human collagen. For all these reasons, it was reasonable to consider that this collagen was the only one suitable for human cell culture.
[0005]
Study biocompatibility according to the paper by Yeh et al. ("A new natural matrix for tissue engineering: analysis of cell-matrix interactions") in Faceb Journal (Vol. 14, No. 4, March 15, 2000). Therefore, the use of whale shark's cell-free collagen matrix was induced to study its interaction with human skin keratinocytes and fibroblasts.
[0006]
Derwent abstract XP002161598 refers to Japanese Patent Application No. 07-0775566 (Marino Forum, published March 20, 1995) which describes a method of using fish-derived collagen as a culture material.
However, this culture deals with fish cells.
[0007]
European Patent EP-0753313 A1 describes a laminate skin substitute comprising a layer or sheet of chitin extracted from molluscs or squid using marine organisms. In this case, when the chitin solution is freeze-dried (freeze-dried), a chitin structure constituting an insoluble non-biodegradable spongy body is obtained, so that use of chitin is indispensable. This is because chitin is not degraded by enzymes present in human skin. Fish skin collagen gel can be poured onto a chitin layer or sheet, and both are dried in a refrigerator for about a week. In fact, this collagen layer is dense and not porous. Living cells cannot be planted in this collagen layer. The laminates described here are inactive laminates, and therefore, in contrast to the present invention described below, it is not possible to plant living cells and maintain the viability of these cells. is expected.
[0008]
This time we have unexpectedly found that human cells grow very well on or within the surface of several carriers of fish collagen (preferably cross-linked fish collagen). noticed. This marine collagen is preferably derived from the skin of teleost fish, more specifically from fish having an uncolored skin area, more particularly from fish in the order of flatfish, in particular, for example, derived from industrially fished fish such as sole, flounder (dab), turbot, brill and the like. Those fillet preparations imply cut pieces. A more preferred flounder fish is a spotted jelly that can easily slice the ventral portion of non-eaten.
[0009]
Furthermore, the present inventors have been able to clarify that human cells cultured with such a biomaterial retain normal metabolism. Along with biocompatibility that allows for the preservation and growth of living cells using collagen extracted from the skin of teleost fish, the collagen is also cross-linked and, notably, chemically cross-linked, It was not particularly obvious to those skilled in the art. This is because, generally, by cross-linking collagen, the cross-linked collagen is not biocompatible and toxic to living cells, particularly human living cells.
[0010]
These biomaterials can be either films, compressed sponges, or porous matrices. These are described along with their methods of preparation in the examples shown below.
[0011]
One object of the present invention is to provide a novel tissue engineering carrier suitable for forming a new biomaterial, ie, a normal living cell or a genetically engineered living cell cultured on the carrier or Good growth of the malignant living cells and of the cells to be used within the framework of these novel biomaterials containing the living cells for subsequent growth in vitro or in vivo. The solution is to solve a new technical problem in providing a new tissue engineering carrier suitable for enabling growth.
[0012]
It is a further object of the present invention to provide a novel carrier for tissue engineering that is low in production cost and also has a low risk of contamination, and is therefore particularly suitable for providing a novel biomaterial. Is to solve new technical problems that are in production.
[0013]
A further main object of the present invention is a novel tissue engineering novel which is particularly suitable for allowing the growth of normal living cells or living cells that are genetically engineered or malignant living cells in vitro or in vivo. It is to solve a new technical problem in providing a simple carrier. In this case, the structure is sufficiently compatible for in vivo use in mammals, in particular animals or preferably humans, while at the same time, the structure of the mammalian tissue such as animals or preferably humans. Unlike structure, the result allows subsequent discrimination between newly synthesized and old tissue of the animal (preferably human).
[0014]
The present invention can satisfy all of these technical problems at low cost, with low risk of contamination or without contamination, and at the same time making it easy to identify newly synthesized tissues. Solve for the first time in style. This is not particularly obvious and predictable to those skilled in the art.
[0015]
Thus, according to a first aspect, the invention relates to the use of aquatic animal-derived collagen for the manufacture of tissue engineering carriers.
[0016]
The expression “collagen from aquatic animals” is understood to mean collagen derived from collagen-containing tissues of organisms of aquatic animal origin. Such organisms are well known to those skilled in the art and include, but are not limited to, aquatic mammals (especially marine mammals), jellyfish and seawater or freshwater fish. It is further known to the person skilled in the art that the skin of these organisms essentially contains collagen. Preferably, “collagen of aquatic origin” is from the teleost fish, more specifically from fish with uncolored areas, more specifically from flounder fish, especially as indicated above Extracted from fish. The most preferred flounder fish is winglet.
[0017]
In one preferred embodiment, the collagen is obtained from fish skin, preferably in its natural form.
[0018]
In another preferred embodiment of the invention, the mechanical strength of the collagen or the resistance of the collagen to enzymatic degradation is chemically and / or physically cross-linked or the addition of a natural polymer that interacts strongly with the collagen, Or increased by either combination of both processes.
[0019]
In yet another preferred embodiment of the invention, the collagen is used in the form of a porous matrix prepared from a collagen gel that preferably has undergone a lyophilization process.
[0020]
In yet another preferred variant, the porous matrix is crosslinked by physical methods, preferably by thermal dehydration or TDH.
[0021]
In yet another preferred variant, the porous matrix is made by chemical methods, preferably by chemical methods with diphenylphosphoryl azide or DPPA, or with carbodiimide and / or N-hydroxysuccinimide. Crosslinking is performed by a chemical method or by a chemical method using glutaraldehyde.
[0022]
In a preferred embodiment, the collagen is a porous matrix prepared from marine collagen (preferably native) mixed with chitosan and optionally at least one glycosaminoglycan (preferably chondroitin sulfate). Can take the form of
[0023]
In yet another preferred embodiment of the invention, the collagen can take the form of a porous matrix prepared from a collagen gel, the porous matrix having at least one side (preferably in air or It is covered with an essentially clogged collagen membrane consisting of either a collagen film prepared by drying the collagen gel (in a gas fluid) or a very large compressed collagen sponge.
[0024]
In another preferred variation, the above compression of a very large compressed collagen sponge is at least about 50 bar (about 50 × 10⁵At a pressure of Pascal (Pa), preferably 50 bar (50 × 10⁵Pa) to 200 bar (200 × 10⁵Pa). In this case, this compression is carried out at a temperature of 20 ° C. to 80 ° C., preferably at a temperature of 40 ° C. to 60 ° C., if necessary.
[0025]
According to yet another preferred feature of the invention, at least one of the two layers (ie the porous layer and the essentially clogged membrane) is derived from a particularly young or middle-aged individual. Normal living cells or genetically engineered living cells or malignant living cells.
[0026]
In one preferred embodiment, living cells are fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells derived from blood, endothelial cells derived from blood, blood cells (particularly macrophages or lymphocytes), adipocytes, sebum Selected from the group consisting of cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, and Merkel cells derived from blood. In this case, the cells are normal, genetically engineered, or malignant.
[0027]
In one particularly preferred embodiment, the porous layer contains normal or genetically engineered or malignant fibroblasts and the essentially clogged membrane is derived from keratinocytes, melanocytes, blood Merkel cells, Langerhans cells derived from blood, sebum cells, cells derived from blood, and normal or genetically engineered or malignant living cells specifically selected from nerve cells.
[0028]
According to yet another preferred embodiment of the present invention, the present invention relates to “young” regenerative skin using cells taken from young individuals, or “aged” obtained from cells taken from middle-aged individuals. It is considered to be particularly beneficial for preparing any of the regenerated skin. These models allow us to improve our knowledge of the skin aging process and to study the effects of active drugs on this process.
[0029]
In another particularly preferred embodiment, the essentially plugged membrane is specifically prepared prior to combination with a porous layer that preferably comprises collagen sponges. It is prepared by placing it on a collagen gel and then freezing and lyophilizing the whole.
[0030]
According to a second aspect, the present invention is also an embodiment which is understood throughout the aquatic collagen as defined above or throughout and which forms an integral part of the present invention in its generality. Including a tissue engineering carrier comprising aquatic origin collagen as obtained from the following description. Thus, this feature is understood in terms of its function and generality, regardless of the content of the embodiment, for any feature that appears to be novel by comparison with any technology.
[0031]
According to a third aspect, the invention also encompasses a biomaterial, for example in the form of regenerative connective tissue or regenerated skin. Such biomaterials are prepared from aquatic origin collagen as defined above, and also from the description below, with respect to the carrier of the second feature described above.
[0032]
Within the context of this description and claims, the expression “tissue engineering carrier” refers to the culture and proliferation of normal living cells or living cells that have been genetically engineered or malignant living cells, in vitro. Means a carrier used to carry out either in vivo or in vivo. This propagation is preferably applied in vivo to animals and preferably mammals including humans. It is understood that the present invention has a particularly preferred application within the framework of tissue engineering for producing biomaterials (eg in the form of regenerative connective tissue or regenerated skin). Within this framework, the first step is generally to culture the carrier with the living cells in vitro to obtain a biomaterial (eg in the form of regenerative connective tissue or regenerated skin) and The second step is then to regenerate damaged connective tissue that has been removed by surgery, or to regenerate skin as well, whatever the medical reason, or The biomaterial will be used in vivo as regenerative connective tissue or regenerated skin in mammals, for example in animals or preferably humans, to re-replace areas removed by surgery.
[0033]
Suitably, such a tissue engineering carrier, or preferably a biomaterial (for example in the form of regenerative connective tissue or regenerated skin), specifically comprises a tissue aging process and in particular a skin aging process. To study, and if necessary, to test the efficacy of the active ingredient or main component in this process, from cells obtained only from substantially younger individuals or substantially from only older individuals Including any of the resulting cells.
[0034]
Thus, the present invention provides a particularly simple method, low cost, low risk of contamination, and aquatic animal collagen and newly synthesized mammalian collagen or preferably human collagen in the course of in vivo use. It is understood that it provides a general solution to the above new technical problem that can be identified.
[0035]
In fact, the use of fish collagen in producing living artificial tissue has three essential advantages compared to mammalian sources.
-Fish skin that is commonly used as a raw material can be obtained abundantly under very clean conditions.
・ The risk of infectious contamination is very low. In particular, the danger of prion-type infectious pathogens is not known at all.
Finally, since the amino acid composition of fish collagen is relatively similar to that of human collagen, the two proteins can be distinguished relatively easily by specific antibodies. This methodology would be very beneficial especially in “in vitro” testing or “in vivo” healing studies.
[0036]
Furthermore, the use of marine collagen will make immunolabeling very effective and allow discrimination between marine collagen and newly synthesized collagen.
[0037]
Fish collagen has a natural structure that protects itself from enzymatic degradation by proteases and is primarily responsible for its mechanical properties. It will therefore be very important that the protein structure is not degraded as much as possible by the treatment used during the extraction operation and the purification process. This means that the helical structure and intermolecular and intramolecular crosslinks must be preserved as much as possible. The inventors have achieved this in more detail by carrying out the method described in US Pat. No. 5,313,092 issued on July 19, 1994. Nevertheless, for certain applications, it would be possible to envisage the use of partially cross-linked cleaved collagen, such as atelocollagen (ie, collagen that has lost its portion of the telopeptide). .
[0038]
In that case, for the majority of tissue engineering applications, the mechanical properties of collagen are enhanced, and resistance to enzymatic digestion is strongly interacted with this protein by chemical and / or physical cross-linking techniques. Either will be increased by the addition of a working natural polymer, or ultimately by a combination of both processes.
[0039]
The protection of fish collagen is increasingly important because its natural stability is lower than that of mammalian collagen. The low natural stability of fish collagen is due to the lower hydroxyproline content.
[0040]
The biomaterials described above can be implanted with living cells to create living artificial tissue that can be used either in the field of “in vitro” testing or in the pharmaceutical field to repair damaged tissue. .
[0041]
Other objects, features and advantages of the present invention are collagens of aquatic origin that can be used within the framework of the present invention for the manufacture of tissue engineering carriers and within the framework of the present invention comprising the carriers and biomaterials. It will be clearly apparent from the following illustrative description made with reference to examples of preparing various forms of In this case, the examples are merely given as examples and thus do not in any way limit the scope of the invention.
[0042]
In the examples, unless otherwise indicated, temperature is given in units of ° C., pressure is atmospheric pressure, and percentages are given in weight percent.
[0043]
Examples 1-13 are, of course, examples of preparing collagen that can be used as a tissue engineering carrier according to the present invention.
[0044]
Examples 14-16 are notable for the collagen of the aquatic animal origin of the present invention in the form prepared in some of Examples 1-13 from the point of view of manufacturing a tissue engineering carrier. This is a comparative test from the viewpoint of use.
[0045]
Example 1
Preparation of porous matrix composed of natural aquatic animal collagen
[0046]
This collagen is obtained by the technique of US Pat. No. 5,313,092 issued on Jul. 19, 1994.
[0047]
A. Preparation of natural collagen from aquatic animals
Collagen gel is prepared from ventral skin of winglet. The skin is ground and then washed with a phosphate buffer (pH 7.8) having the following composition: 0.78 g / l potassium dihydrogen phosphate and 21.7 g / l disodium monohydrogen phosphate. . Washing is carried out for 1 hour with stirring at a rate of 5 l of buffer per kg of ground material. After that, it is washed twice with soft water at a rate of 5 liters of water per 1 kg of ground material, and then continuously centrifuged at 4000 rpm (Rouseselt centrifuge) to remove the phosphate buffer. To do. The ground material is then acidified using a 0.25 M acetic acid solution at a rate of 1 kg of ground material for 10 l of solution. The gel is then centrifuged at 4000 rpm for 5 minutes. The gel used consists of the resulting supernatant with a collagen concentration between 0.5% and 2%.
[0048]
B. Preparation of porous matrix from collagen gel obtained above
This gel is placed in a freeze-dried dish at 20 g / cm²Pour in proportions. The gel is then frozen at -30 ° C and lyophilized after heating at + 32 ° C. The total lyophilization time is 16 hours at a pressure of 400 microbars. Thereafter, the resulting matrix is crosslinked by heat dehydration (TDH). Heat dehydration consists of heating in an oven at 110 ° C. for 16 hours at a vacuum of 400 microbars.
[0049]
Example 2
Preparation of porous matrix crosslinked with diphenylphosphoryl azide (DPPA) by the technique described in EP 466829 (July 24, 1996)
The collagen matrix of Example 1 is incubated for 24 hours in a solution containing 5 μl to 250 μl DPPA / g collagen in 100 ml dimethylformamide (DMF). The collagen is then washed with 100 ml DMF to remove DPPA. The DMF is then removed by washing with 100 ml of a pH 8.9 borate buffer solution (0.04 M sodium tetraborate, 0.04 M boric acid).
Finally, the borate buffer is removed by incubating the collagen overnight in the same borate buffer, followed by continuous washing with soft water for 6 hours.
[0050]
Example 3
Preparation of porous matrix crosslinked with carbodiimide and N-hydroxysuccinimide
The aquatic animal collagen matrix of Example 1 was prepared by adding EDC (ethyldimethylaminopropylcarbodiimide) at a concentration of 0.23 to 0.69 g / g of collagen and NHS (N-hydroxysuccinimide) at a concentration of 0.42 g / g collagen. Crosslink with
After washing with soft water, the collagen is lyophilized again.
[0051]
Example 4
Preparation of porous matrix cross-linked with glutaraldehyde
The porous matrix of aquatic animal collagen of Example 1 is crosslinked in a solution containing 0.6% to 1% GTA at 20 ° C. for 24 to 96 hours.
After washing with soft water, the collagen is lyophilized again.
[0052]
Example 5
Porous matrix prepared using the aquatic animal natural collagen of Example 1 in combination with chitosan and glycosaminoglycan as described in EP 296078 (May 29, 1991)
A solution containing 2.5 g chitosan in 356 ml water and 1.9 ml acetic acid followed by 1 g chondroitin 4-sulfate in 400 ml soft water is added to 600 g 1.5% collagen gel. Subsequently, the mixture having a pH of about 4.0 is stirred and lyophilized. The resulting sponge is crosslinked by TDH.
[0053]
Example 6
Porous matrix described in Example 1 coated with a collagen film
A. Film preparation
A collagen gel with a solid content of 0.3% to 0.8% is dried in an oven at 30 ° C. or 0.5 g gel / cm²Dry under a hood in the proportion of a dish. 10% to 40% glycerol can be added to the collagen gel.
Collagen dried under these conditions is made into a transparent film.
[0054]
B. Bonding the film to the porous matrix described above
Aquatic animal natural collagen gel with a solid content of 0.5% to 2% is placed in a freeze-dried dish at 0.5 g / cm²The collagen film is then placed on the gel and the whole is lyophilized.
The resulting lyophilizate is crosslinked by TDH.
[0055]
Example 7
Porous matrix prepared using acid-soluble collagen gel and coated with collagen film
The method is that shown in Example 6 with the only difference being the nature of the gel poured into the film. This gel consists of acid-soluble collagen prepared by techniques well known to those skilled in the art.
[0056]
Example 8
Porous matrix prepared with atelocollagen gel and covered with collagen film
The method is that shown in Example 6 with the only difference being the nature of the gel poured into the film. This gel consists of atelocollagen (ie, telopeptide-free collagen) prepared by techniques well known to those skilled in the art.
[0057]
Example 9
Porous matrix consisting of collagen combined with chitosan and glycosaminoglycan and covered with collagen film
The method is the method shown in Example 6 except that in this case the gel poured into the collagen film consists of collagen, chitosan and glycosaminoglycan. The preparation of this gel is described in Example 5.
[0058]
Example 10
All of the porous matrices described above are coated with a collagen film and can be crosslinked by the techniques described in Examples 2, 3 and 4.
[0059]
Example 11
A collagen-only porous matrix as described in Example 1 coated with a compressed collagen sponge
A. Preparation of compressed spongy bodies
The collagen gel prepared as in Example 1 having a solid content of 0.3% to 1.5% is lyophilized to a weight of 0.5 g / cm²~ 2g / cm²To obtain a spongy body.
This lyophilizate is subjected to a temperature between 20 ° C. and 60 ° C.⁵Compress for 5 to 60 seconds at a pressure of Pa).
[0060]
B. Bonding of a compressed spongy body with a porous matrix
0.5 g / cm of the collagen gel described in Example 1 in a lyophilized dish²Put in proportions. The compressed sponge is then placed on the gel and the whole is lyophilized to obtain a porous collagen sponge coated with the compressed collagen sponge. The whole is crosslinked by TDH as described in Example 1.
[0061]
Example 12
A porous matrix consisting of collagen, chitosan and glycosaminoglycan and coated with a compressed sponge as described in Example 5
A gel prepared by the process of Example 5 consisting of collagen, chitosan and glycosaminoglycan was placed in a lyophilized dish at 0.5 g / cm.²Then the compressed sponge is placed on the gel and the whole is lyophilized. The lyophilizate is then crosslinked with TDH as described in Example 1.
[0062]
Example 13
All of the porous matrices described above are coated with a compressed collagen sponge and can be crosslinked by the techniques described in Examples 2, 3 and 4.
[0063]
Examples 14-16: Tests to compare cellular metabolism of bovine and aquatic collagen matrices

[0064]
Example 14: Test for cell viability of fibroblasts
I-Preparation of dermal equivalent
For this comparative test, a DPPA cross-linked aquatic porous matrix is first prepared according to Example 2.
[0065]
For comparison, a comparative porous matrix called bovine matrix, which is also crosslinked with DPPA, is prepared using bovine-origin collagen under the same conditions as in Example 2.
[0066]
Normal human fibroblasts taken from a young donor pool and used in the seventh passage were used for growth and protein synthesis studies at 250,000 cells / cm.²And 300,000 cells / cm for aquatic and bovine matrices for histochemical studies²Of each of the aquatic animals and the bovine matrix.
[0067]
These aquatic and bovine matrices are supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 IU / ml penicillin, 25 μg / ml gentamicin, 1 μg / ml amphotericin B and 50 μg / ml vitamin C, 50/50 Incubate in medium consisting of DMEM / HAM F12 in the ratio of (v / v).
This culture is performed for one month, and the culture medium is changed three times a week.
[0068]
II-Analysis performed
1) Measurement of cell viability by reaction with MTT
1% by weight of MTT (ie 3- (4-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) is added to the culture medium.
Incubation is carried out at 37 ° C. for 2.5 hours.
After this incubation period, the conversion product (formazan blue) is solubilized in DMSO and its optical density is read at 550 nm.
The optical density obtained is proportional to the activity of succinate dehydrogenase, which can convert the light yellow tetrazolium salt, MTT, into blue crystals of formazan.
Cell viability was measured after 1 day, 5 days, 7 days and 22 days and 1 month after culture.
Six samples were prepared for each matrix to determine the average value.
[0069]
[Table 1]

[0070]
These results are also used for the curves of FIG. 1 attached.
It can be seen that the diamond point curve is the curve obtained with the aquatic animal matrix and the square point curve is the curve obtained with the bovine matrix.
[0071]
These results are quite surprisingly because the aquatic animal matrix constitutes a carrier that allows not only the survival of normal human fibroblasts but also the growth of these normal human fibroblasts. At the same time, it shows that it constitutes a much better culture carrier for the first 3 weeks.
Surprisingly, therefore, aquatic animal collagen is used in vitro to produce tissue engineering carriers, in particular to form biomaterials containing living cells, in particular and preferably human living cells. It can be concluded from these tests that it is particularly suitable for application, and in particular even in vivo application.
[0072]
2)Measuring protein synthesis
The synthesis of the protein secreted over 3 days in culture medium without fetal calf serum, as obtained after 1 month of culture under the conditions reported above in the preparation of the dermal equivalent Evaluation was made 1 month after maturation of the dermal equivalent.
Analysis is performed by the Pierce micro-BCA method.
Cell density was assessed simultaneously in the MTT test under the conditions described above.
Since the relative protein content corresponds to the protein content per unit of cell density expressed as optical density or OD, the cell concentration in question is equal. The results obtained are shown in Table II below.
[0073]
[Table 2]

[0074]
As in Table I, the average value is based on 6 samples.
[0075]
3) Histochemistry
The dermal equivalent obtained after 21 days of culture of aquatic and bovine collagen matrices is fixed with 2% paraformaldehyde solution, then postfixed with osmium tetroxide solution, dehydrated, encapsulated in Epon, Sectioned and observed by transmission electron microscopy (Jeol 1200) in CMEAGB (Lyon, France).
[0076]
Conclusion
These results indicate very good colonization of the three-dimensional matrix, regardless of whether the matrix is an aquatic animal or a cow. After 3 weeks of culture, the cell density is equal in both types of matrix. However, the aquatic animal matrix appears to allow better cell adhesion early in the experiment and thus better colonization in short culture periods, as shown by growth studies in the first week of culture. .
[0077]
As far as protein synthesis is concerned, fibroblast synthesis capacity (relative protein content) is also equal after one month of culture.
[0078]
These results show that the developed aquatic animal collagen matrices have made it possible to prepare dermal equivalents with good properties, and the results obtained with these matrices are that of bovine collagen matrices The results obtained using can be comparable.
[0079]
In transmission electron microscopy, fibroblasts can be seen in matrices of bovine and aquatic origin. In both types of matrix, the presence of large amounts of newly synthesized extracellular matrix is observed. The newly synthesized extracellular matrix can be distinguished by periodic fine stripes of deposited collagen fibers compared to the collagen clusters that form the original three-dimensional matrix of the cavernous body.
[0080]
Example 15
Influence of different types of cross-linking of aquatic collagen matrix on cell viability
The following tests are conducted to investigate the effect of different types of cross-linking of the aquatic collagen matrix on cell viability.
[0081]
I)Preparation of dermal equivalent
a)Carrier or matrix used
Various collagen carriers or matrices are prepared using different proportions of collagen in the collagen gel to produce the porous layer or matrix, and using different crosslinkers if necessary, as described below Is done.
[0082]
1)Test 1
For this test, a porous matrix in the form of a porous spongy body is produced from an aquatic animal collagen gel prepared from 1.3% by weight aquatic animal collagen. This is frozen at −80 ° C., subjected to standard lyophilization according to Example 2, and then crosslinked with DPPA at a rate of 250 μl per gram of dry sponge.
[0083]
2)Test 2
For this test, a porous matrix in the form of an aquatic sponge is prepared from an aquatic collagen gel containing 0.7% by weight aquatic collagen. This is frozen at −80 ° C. as in Test 1 and then subjected to standard lyophilization and crosslinked with DPPA at a rate of 250 μl per gram of dry sponge.
[0084]
3)Test 3
For this test, the procedure is to crosslink at a rate of 0.46 g / g dry sponge.Example 3According to test 1, except that the test is performed using EDC.
[0085]
4)Test 4
A porous carrier comprising an aquatic animal collagen spongy body obtained from an aquatic animal collagen gel containing 1.1 wt% aquatic animal collagen is prepared. This was frozen at −80 ° C. as in Test 2 and then subjected to standard lyophilization and crosslinked with DPPA at a rate of 250 μl per gram of dry sponge, The proportion of aquatic animal collagen is 1.1% by weight.
[0086]
In all of these studies, the aquatic animal collagen is derived from the ventral skin of the flyfly as in Example 2.
[0087]
b)Fibroblast culture in these matrices
Normal human fibroblasts are used as in Example 14, but fibroblasts are taken from the 8th passage.
Seeding is 275,000 cells / cm²Done at a rate of
The culture medium is 50/50 (v / v) supplemented with 10% by weight fetal calf serum, 100 IU / ml penicillin, 25 μg / ml gentamicin, 1 μg / ml amphotericin B and 50 μg / ml vitamin C. It consists of DMEM / HAM F12.
The culture is performed for one month, and the medium is changed three times a week.
Four matrices are used for each test so that an average value is obtained for each type of test and the average standard deviation is evaluated.
[0088]
II)Analysis performed
Measurement of cell viability by reaction with Alamar Blue (redox marker)
When it is desired to measure cell viability for a sample taken from the culture medium, Alamar Blue is added at a rate of 2% by weight of the culture medium used.
After incubation for 2 hours and 20 minutes at 37 ° C., fluorescence is read based on excitation light at 530 nm and emission light at 590 nm.
The fluorescence intensity obtained is proportional to the metabolic activity of the cells.
Cell viability is measured on 10 samples after 1 day, 4 days, 6 days, 11 days and 17 days of culture.
The results are shown in Table III below.
Results are shown in international units of fluorescence (IU) as a function of time.
[0089]
[Table 3]

[0090]
The results in Table 3 are also used for the attached FIG.
The results show a fibroblast proliferation curve in the dermal equivalent.
The curve with black diamond points corresponds to test 1, the curve with black square points corresponds to test 2, the curve with triangular points corresponds to test 3, and the curve with cross points is test 4 Corresponding to
Time is expressed in days on the horizontal axis, and fluorescence is expressed in IU using a scale that starts at 15,000 and increases to 55,000 in 10,000 units.
The following conclusions can be drawn from the results.
[0091]
Conclusion
The results show that the various matrices prepared can allow good growth of fibroblasts after 17 days of culture. Regardless of the preparation of the aquatic collagen matrix, fibroblasts adhere well to their three-dimensional carrier, divide very quickly and colonize in the matrix.
[0092]
Although the growth profile varies very slightly with each type of matrix, the fibroblast density can be comparable after 17 days of culture, regardless of the method of preparation.
[0093]
Various types of cross-linking performed with either DPPA or EDC do not appear to affect cell regeneration. In fact, after 3 weeks of culture, the stability of the matrix is excellent, hardly digested and hardly contracted.
[0094]
Example 16
Testing to identify the benefits of aquatic animal collagen for identification and assay of newly synthesized human collagen
This test is similar to the test of Example 14, except that histochemistry is performed with immunolabeling.
The test is performed as follows.
[0095]
1)Preparation of dermal equivalent
These are the dermis equivalents of Example 14, and the culture is performed under the conditions of Example 14.
Therefore, this culture was performed at 300,000 cells / cm normal human fibroblasts as shown in Example 14.²And is carried out for 3 weeks, changing the medium 3 times a week.
[0096]
2)Histochemistry
a)Traditional histochemistry
Fixing is performed with paraformaldehyde at a concentration of 4% by weight, after which the material is dehydrated and encapsulated in paraffin.
After this, 7 μm sections are prepared and after removal and rehydration of paraffin, Mallory-Heidenhain staining is performed.
b)Immunolabeling
Fixation was performed again with 4 wt% paraformaldehyde and the material was encapsulated in Tissue Tek OCT compound, ie, an encapsulating solution supplied by Miles (Elkhart, Indiana, USA), and 7 μm sections prepared at low temperature. Is done.
Immunolabeling is performed using:
i. Primary rabbit anti-human type I collagen antibody (diluted, 1/40) and
ii. Secondary FITC (fluorescein isothiocyanate) -conjugated anti-rabbit antibody (diluted, 1/160).
DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dilactate) is used as a counterstain.
[0097]
3)result
Carriers consisting of aquatic animal matrix and bovine matrix are found to form pores that are more or less plugged to which fibroblasts adhere.
A larger proportion of fibroblasts is found on the surface, forming a suitable coating over the dermal equivalent to produce regenerated skin. The distribution of fibroblasts is homogeneous in aquatic and bovine sponges.
With immunolabeling, it is found that the matrix formed from bovine collagen is labeled with anti-human type I collagen antibody (crossing).
On the other hand, matrices of aquatic origin are only very weakly labeled with anti-human collagen antibodies.
Accordingly, spongiform bodies composed of aquatic animal collagen are advantageous for identification of newly synthesized extracellular matrix.
These results are explained by Professor Hartmann's work on the response of different antigens to different antibodies, as determined by optical density measurements after immunolabeling shown in Table IV below or the Hartmann table.
[0098]
[Table 4]

[0099]
The result is OD × 10³(Optical density at λ = 450 nm).
Symbol: 20111 (225): Anti-human type I collagen
50121 (03): Anti-bovine type I collagen
50171 (01): Anti-fish (pterus) type I collagen
[0100]
The results in this table show that the difference between human and bovine collagen is the difference between human and bovine collagen, regardless of the antibodies in the immunolabeling (anti-human type I collagen, anti-bovine type I collagen, anti-spotter type I collagen). It is larger than the difference. Therefore, in a collagen collagen fish, collagen synthesized by human fibroblasts can be identified much more easily. This confirms the above results obtained by immunolabeling collagen synthesized in a fish collagen matrix with anti-human type I collagen antibody, and thus, particularly unexpected of the present invention, It constitutes a favorable result.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows normal human fibroblast proliferation in the dermal equivalent. The time expressed in days is plotted on the horizontal axis, and the optical density × 1000 is plotted on the vertical axis, with a scale every 100 units. The curve with diamond points is the curve obtained when the carrier used is a porous matrix of aquatic animal collagen (in this case fish collagen). The curve with square points is the curve obtained with bovine collagen.
FIG. 2 shows a similar curve for normal human fibroblast proliferation in the dermal equivalent. Time in days is plotted on the horizontal axis, and fluorescence in international units (IU) is plotted on the vertical axis, starting at 15,000 and graduated every 10,000 units. The curve with black diamond points represents the fluorescence obtained in Test 1, the curve with square points represents the curve obtained in Test 2, and the curve with white triangle points was obtained in Test 3. And, finally, the curve with a cross point represents the curve obtained in test 4.

Claims

凍結乾燥工程を受けた水生動物起源コラーゲンゲルから調製される多孔性マトリックスからなる組織工学用担体であって、
前記多孔性マトリックスは、ジフェニルホスホリルアジドすなわちＤＰＰＡ、及び、カルボジイミドから選択される化学的架橋剤を用いた化学的方法によって架橋されたものであり、かつ、生きた繊維芽細胞を含むものである組織工学用担体。A tissue engineering carrier comprising a porous matrix prepared from an aquatic animal-derived collagen gel that has undergone a lyophilization process,
The porous matrix, diphenylphosphoryl azide That DPPA, and state, and are not cross-linked by chemical method using chemical cross-linking agent selected from carbodiimide, and living is intended to include fibroblast tissue engineering Carrier.

生きた繊維芽細胞が、正常、遺伝子操作型又は悪性の繊維芽細胞から選択されるものである請求項１に記載の組織工学用担体。The tissue engineering carrier according to claim 1, wherein the living fibroblasts are selected from normal, genetically engineered or malignant fibroblasts .

水生動物起源コラーゲンが、硬骨魚類の皮膚に由来するものである請求項１又は２に記載の組織工学用担体。 The tissue engineering carrier according to claim 1 or 2, wherein the aquatic animal-derived collagen is derived from the skin of teleost fish.

水生動物起源コラーゲンが、カレイ目の魚類の皮膚に由来するものである請求項１〜３のいずれかに記載の組織工学用担体。 The tissue engineering carrier according to any one of claims 1 to 3, wherein the aquatic animal-derived collagen is derived from the skin of a fish of the orderfish.

水生動物起源コラーゲンが、シタビラメ（ｓｏｌｅ）、マコガレイ（ｄａｂ）、ターボット（ｔｕｒｂｏｔ）及びブリル（ｂｒｉｌｌ）から選択される産業的に漁獲されている魚類の皮膚に由来するものである請求項１〜４のいずれかに記載の組織工学用担体。 The aquatic origin collagen is derived from the skin of an industrially fished fish selected from sole, sole, dab, turbot and brill. The tissue engineering carrier according to any one of the above.

多孔性マトリックスが、キトサン及び必要に応じて少なくとも１つのグリコサミノグリカンと混合された水生動物コラーゲンからなるものである請求項１〜５のいずれかに記載の組織工学用担体。 The tissue engineering carrier according to any one of claims 1 to 5, wherein the porous matrix is composed of aquatic animal collagen mixed with chitosan and optionally at least one glycosaminoglycan.

多孔性マトリックスは、少なくとも１つの面が、空気中又はガス流体中でコラーゲンゲルを乾燥することによって調製されたコラーゲンフィルム、及び、圧縮されたコラーゲン海綿状体から選択される本質的には目の詰まったコラーゲン膜で覆われたものである請求項１〜６のいずれかに記載の組織工学用担体。 The porous matrix essentially consists of a collagen film prepared by drying a collagen gel in air or gas fluid and at least one surface selected from a compressed collagen sponge. The tissue engineering carrier according to any one of claims 1 to 6, which is covered with a packed collagen membrane.

多孔性マトリックスが、正常な生きた細胞、遺伝子操作された生きた細胞、及び、悪性の生きた細胞からなる群から選択される、繊維芽細胞以外の生きた細胞をさらに含む請求項１〜７のいずれかに記載の組織工学用担体。The porous matrix further comprises living cells other than fibroblasts selected from the group consisting of normal living cells, genetically engineered living cells, and malignant living cells. The tissue engineering carrier according to any one of the above.

繊維芽細胞以外の生きた細胞が、ケラチノサイト、メラノサイト、血液に由来するランゲルハンス細胞、血液に由来する内皮細胞、血液細胞、マクロファージ、リンパ球、脂肪細胞、皮脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、及び、血液に由来するメルケル細胞からなる群から選択されるものである請求項８に記載の組織工学用担体。 Fibroblasts other living cells, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells from blood, endothelial cells from blood, blood cells, macrophages, lymphocytes, adipocytes, sebocytes (sebocyte), chondrocytes, osteocytes The tissue engineering carrier according to claim 8, wherein the tissue engineering carrier is selected from the group consisting of, osteoblasts, and Merkel cells derived from blood.

本質的には目の詰まったコラーゲン膜が、ケラチノサイト、メラノサイト、血液に由来するメルケル細胞、血液に由来するランゲルハンス細胞、皮脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、血液に由来する細胞、及び、神経細胞から選択される正常、遺伝子操作型又は悪性の生きた細胞を含有する請求項７、８又は９に記載の組織工学用担体。Essentially clogged collagen membrane is selected from keratinocytes, melanocytes, blood-derived Merkel cells, blood-derived Langerhans cells, sebocytes, blood-derived cells, and nerve cells 10. The tissue engineering carrier according to claim 7, 8 or 9 , comprising normal, genetically engineered or malignant living cells.

生きた細胞が、ヒトに由来するものである請求項１〜１０のいずれかに記載の組織工学用担体。The tissue engineering carrier according to any one of claims 1 to 10 , wherein the living cells are derived from a human.

生きた細胞が、若年の個体に由来するものである請求項１〜１１のいずれかに記載の組織工学用担体。The tissue engineering carrier according to any one of claims 1 to 11 , wherein the living cells are derived from a young individual.

生きた細胞が、中高年の個体に由来するものである請求項１〜１１のいずれかに記載の組織工学用担体。The tissue engineering carrier according to any one of claims 1 to 11 , wherein the living cells are derived from a middle-aged individual.

圧縮されたコラーゲン海綿状体の圧縮が、少なくとも５０ｂａｒ（５０×１０５Ｐａ）の圧力で、２０℃〜８０℃の温度で行われる請求項７〜１３のいずれかに記載の組織工学用担体。The tissue engineering carrier according to any one of claims 7 to 13 , wherein the compression of the compressed collagen sponge is performed at a pressure of at least 50 bar (50 x 105 Pa) and a temperature of 20 ° C to 80 ° C.

本質的には目の詰まったコラーゲン膜が、多孔性マトリックスとの組合せに先立って、目の詰まったコラーゲン膜を調製して、それを水生動物起源コラーゲンゲルの上に置き、その後、目の詰まったコラーゲン膜とコラーゲンゲルとを組み合わせたものを凍結及び凍結乾燥することによって調製される請求項７〜１４のいずれかに記載の組織工学用担体。Essentially a clogged collagen membrane prepares a clogged collagen membrane prior to combination with a porous matrix and places it on an aquatic origin collagen gel which is then clogged. The tissue engineering carrier according to any one of claims 7 to 14 , which is prepared by freezing and freeze-drying a combination of a collagen membrane and a collagen gel.

生体材料、再生用結合組織又は再生皮膚の形をとる請求項７〜１５のいずれかに記載の組織工学用担体。 16. The tissue engineering carrier according to any one of claims 7 to 15 , which takes the form of a biomaterial, a regenerating connective tissue or a regenerated skin.

実質的に若年の個体のみに由来する細胞又は実質的に中高年の個体のみに由来する細胞のいずれかを含み、皮膚の老化プロセスを研究し、皮膚の老化プロセスにおける活性な成分の効力を試験するための、請求項７〜１６のいずれかに記載の組織工学用担体。Investigate the skin aging process and test the efficacy of active ingredients in the skin aging process, including cells derived from substantially only young individuals or cells derived from substantially only middle-aged individuals The tissue engineering carrier according to any one of claims 7 to 16 , for use.