KR100620297B1 - ＮＴ―ｐｒｏＢＮＰ 측정용 분석 샌드위치 테스트 - Google Patents

ＮＴ―ｐｒｏＢＮＰ 측정용 분석 샌드위치 테스트 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 특별한 항체의 조합을 사용한, NT-proBNP 측정용 면역학적 신속한 테스트에 관계된 것이다. 본 발명의 신속한 테스트는, 면역크로마토그래피 테스트 스트립으로써 유리하게 존재 가능하다.

Description

ＮＴ―ｐｒｏＢＮＰ 측정용 분석 샌드위치 테스트{ANALYTICAL SANDWICH TEST FOR DETERMINING NT-proBNP}
도 1은, 면역크로마토그래피 테스트 스트립 형태의, 본 발명에 따른 신속한 테스트 장치의 바람직한 구현 모식도이다.
도 2는, Elecsys
Figure 112004054883343-pat00001
습윤 테스트 포맷 하의 MAB 17.3.1 (13-15) / PAB (39-50) 항체 조합과, Elecsys
Figure 112004054883343-pat00002
참조 방법 PAB (1-21) / PAB (39-50)과의 상관도를 나타낸다.
도 3은, Elecsys
Figure 112004054883343-pat00003
습윤 테스트 포맷 하의 MAB 18.4.34 (27-31) / PAB (39-50) 항체 조합과, Elecsys
Figure 112004054883343-pat00004
참조 방법 PAB (1-21) / PAB (39-50)과의 상관도를 나타낸다.
도 4는, 실시예 1에 따른 NT-proBNP 테스트 스트립의 상이한 항체 조합에 따른 작용 곡선을 나타낸다.
도 5는, 항체 조합과 NT-proBNP 테스트 스트립의 상관도를 나타낸다 (Elecsys
Figure 112004054883343-pat00005
NT-proBNP 테스트 키트에 대한 Au-MAB 18.4.34 (27-31) / Bi-PAB (39-50)).
도면에서의 번호는 다음을 나타낸다:
1 샘플 첨가 영역
2 적혈구 분리 영역
3 측정 영역
4 흡입 영역
5 지지체 물질
6 샘플 적용 매트릭스 ('비오틴 플리스' 및 '금 플리스')
7 적혈구 분리 매트릭스
8 측정 매트릭스
9 직선 모양의 고정화 영역
10 흡입 매트릭스.
본 발명은, 분석 샌드위치 테스트, 특히 테스트 요소 및 특히 N-말단 프로브레인 (pro-brain) 나트륨배설증가 펩티드 (NT-proBNP) 측정을 위한 샌드위치 원리를 이용한 면역크로마토그래피 테스트 스트립의 형태에 관한 것이다.
NT-proBNP는, 심장 이상의 진단 및 조절에 있어 매우 유용한 마커이다. 심장 이상 및 이를 위한 마커 물질로서의 NT-proBNP의 중요성에 관한 리뷰는 일례로 WO 00/45176의 1-4면에 기재된 것으로, 이는 여기에서 전적으로 참고가 된다. 또한 문헌 (US 5,786,163, US 6,461,828, US 6,117,644, EP 1 151 304, WO 02/083913 및 EP 특허 출원 03 010 591.0 [12.5.2003일자, Klemt 등])은, NT-proBNP, 이에 대한 항체 및 측정법에 관련된 것이다.
현재 생체외 진단 시장에서 가능한 유일한 NT-proBNP 테스트는, Roche Diagnostics사의 완전 자동 Elecsys
Figure 112004054883343-pat00006
NT-proBNP 테스트로, 이는, 전기화학발광 측정을 사용한 샌드위치 반응에 기초한 것이다. 이 테스트는, 대규모 중앙 연구소에서의 사용을 위해 디자인된 것으로, 또한 정확한 투여량을 요구하는 액체 시약은, 액체 투여 및 테스트 실시를 위해 발광 시그날 측정을 위한 상대적으로 복잡한 기기를 필요로 한다. 사용이 간편하고, 필요시 평가 기기 없이도 시각적으로 평가 가능한 NT-proBNP의 신속한 테스트는 현재 시판되고 있지 않다.
면역상 검출 가능한 물질의 신속한 테스트는 각종 상이한 인자에 대해 장기간 동안 알려져 왔다 (일례로, WO 97/06439, EP 0 291 194, US 5,591,645, US 4,861,711, US 5,141,850, US 6,506,612, US 5,458,852, US 5,073,484). 이들의 경우, 면역 검출 시약 (반드시 레벨링 또는 레벨링되지 않은 항체 또는 항원)이 지지체 상의 보통 건조한 형태로 제공되어, 이는 지지체 상 또는 지지체 내에서 샘플 액체 (특히 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액 등의 체액)의 전달을 가능하게 한다. 이러한 목적을 위해, 지지체는 바람직하게 모세관 활성으로 일례로, 모세관 채널을 가진 막 또는 플라스틱 지지체이다. 전문가들 사이에서는, 이들은 종종 면역크로마토그래피 테스트 스트립 또는 테스트 장치로 불린다.
급성 호흡 장애를 가진 환자에서는 NT-proBNP 측정을 가능한 신속히 실시하여, 호흡 곤란의 원인으로써의 심장 이상을 방지 또는 진단하고 적절한 치료를 개 시하도록 하는 것이 유리하다. Elecsys
Figure 112004054883343-pat00007
NT-proBNP 테스트는 중앙 실험실에서만 실시 가능하므로, 일반적 시간외에서 NT-proBNP를 신속히 측정하는 것을 곤란하다. 따라서, 일반적 시간 이외에 비상 병동에서 바로 신속한 테스트가 실시 가능하다면, 이는 특히 비상 병동에서 유용할 것이다. 그러나 이러한 신속한 테스트는, 실제 행하여지는 테스트 타입과 무관한, 결과의 양호한 동등성을 보장하기 위해, 중앙 실험실에서의 참조 방법 (Elecsys
Figure 112004054883343-pat00008
NT-proBNP)과 동일한 참조 영역 및 컷어프를 가져야만 한다.
Elecsys
Figure 112004054883343-pat00009
NT-proBNP 테스트에서 사용되는 폴리클로날 항체 (PAB)는, NT-proBNP의 매우 특별한 분획 ('천연' NT-proBNP; EP 특허 출원 03 010 591.0 참조, 12.5.2003, Klemt 등; 문헌에 따르면 상기 테스트는, 아미노산 1-21 (AA 1-21) 및39-50 (AA 39-50)을 함유한 NT-proBNP의 에피토프를 인식한다)을 인식할 수 있다. 그러나, 이들 폴리클로날 항체는, 레벨로 콜로이드성 금과 같은 특정 레벨을 사용하는 신속한 NT-proBNP 테스트에는 부적절한 것으로 판명되었는데, 이는 이들 특정 레벨이, 신속한 테스트의 성분 (지지체 물질, 매트릭스 등과 같은 것)과 물리화학적 반응에 의해 시그날 생성에서 원치 않는 높은 가변성을 나타내는 때문이다. 이러한 결과는, 배치간의 테스트의 질을 현격히 변화시킨다.
따라서 본 발명의 목적은, 선행 기술의 문제점을 해결하는 것이다. 특히 본 발명의 목적은, 재현성 있게 제조되며, 실험실 방법과 양호한 상관도를 가지는, NT-proBNP 측정용 신속한 테스트를 제공하는 것이다.
본 목적은, 본 발명의 주제에 의해 달성된다.
본 발명은, 특허의 독립 청구항에 특정된 바와 같은, 분석 테스트 요소와 같은, 특히 신속한 테스트 형태의 면역 테스트에 관한 것이다. 바람직한 구현은 종속항에 기재된다.
Elecsys
Figure 112004054883343-pat00010
참조 방법과 우수한 상관도를 가지는 샌드위치 포맷의 면역 테스트, 특히 신속한 테스트의 제조를 위한 본 발명의 해답은, NT-proBNP 에 대한 항체 2 개 이상을 포함하는 항체의 특별 조합을 사용하는 것으로, 여기에서 하나 이상의 항체는 모노클로날 항체 (MAB)이다. 본 발명의 샌드위치 테스트의 다른 항체는, 또한 MAB 이거나 또는 폴리클로날 항체 (PAB)이다. 여기에서, 이들 항체 (AB로 약칭) 중의 하나는, 최소한 아미노산 38-50을 함유하는 NT-proBNP 의 에피토프 부분에 대한 것이다 (이는 하기에서, 또한, AB (38-50) 또는 MAB (38-50) 또는 PAB (38-50)로 약칭됨). 추가로 하나 이상의 항체는, 최소한 아미노산 1-37 또는 43-76을 함유하는 NT-proBNP 의 에피토프 부분에 대한 것이다 (이는 하기에서, AB (1-37) 또는 AB (43-76) 또는 MAB (1-37) 또는 MAB (43-76) 또는 PAB (1-37) 또는 PAB (43-76)로 약칭됨). 이들 항체에 의해 인식되는 에피토프는, 바람직하게는 5개 미만의 아미노산, 특히 바람직하게는 2개 미만의 아미노산이 약간 중복되는 것이다.
항체의 조합이 바람직한데, 이는, NT-proBNP에 대한 하나 이상의 폴리클로날 항체 (PAB) 및 하나의 모노클로날 항체 (MAB)를 포함하는 것이다 (이른바 PAB/MAB 조합).
PAB (X-Y)라는 용어는 본 특허 출원에서 아미노산 X 내지 Y를 함유하는 NT-proBNP의 에피토프에 대한 폴리클로날 항체를 의미한다. MAB (X-Y)는, 해당 모노클로날 항체이다. AB (X-Y)는 일반적으로 아미노산 X 내지 Y를 함유하는 NT-proBNP의 에피토프에 대한 항체 (일례로 PAB 또는 MAB)를 나타낸다.
MAB a.b.c. (X-Y)는, 기탁된 세포주 a.b.c.를 이용하여 수득한 아미노산 X 내지 Y를 함유한 NT-proBNP의 에피토프에 대한 모노클로날 항체이다.
항체-레벨 컨쥬게이트의 재현성 품질 보장을 위해, MAB는 특정 레벨, 특히 금 레벨상에 바람직하게 고정화된다. 다른 적절한 특정 레벨은 일례로 착색 래티스, 다른 금속 졸 레벨, 중합체 레벨 또는 반도체 나노결정 (소위 양자 점)이다. MAB-레벨 컨쥬게이트는, 일례로, 플리스, 막과 같은 적절한 지지체 물질을 함침함에 의해 샘플 액체에 의해 분리될 수 있는 방식으로 신속한 테스트 장치 상에 바람직하게 제공된다. 그러나 또한, 신속한 테스트 내로 용액으로서 MAB-레벨 컨쥬게이트를 가할 수 있다.
특히 양, 염소 또는 토끼와 같은 포유류를 면역화하여 바람직하게 수득하는 PAB는, 비오틴 유도체로 신속한 테스트 내에 공급되며, 이는, 아비딘 또는 스트렙타비딘 측정선에 결합 가능하다. 그러나, 일례로, 적절한 크로마토그래피 막 상의 측정선 형태로, 신속한 테스트 장치에 있어서 PAB를 직접 고정화 가능하다.
본 발명에서는, 또한 가능하지만 덜 바람직하게, 레벨링된 AB, 특히 레벨링 된 MAB 및 제 2 항체, 특히 신속한 테스트를 위한 용액 또는 용액들 중의 제 2 MAB 또는 PAB를 사용할 수 있다. 적절하게 레벨링된 AB를 포획 가능한 결합 파트너는 이후 측정 장치의 측정 영역에 위치하게 되어, 제 1 항체, 분석물 및 제 2 항체를 함유한 샌드위치 복합체를 신속한 테스트의 고체 상에 결합하게 한다.
본 발명에서 사용한 MAB는, 참조 테스트와의 양호한 상관도 유지를 위해 참조 시스템 (Elecsys
Figure 112004054883343-pat00011
test)에서 측정되는 에피토프 (AA 1-21)을 반드시 인식할 필요는 없다. 청구항 제 1 항에 언급된 항체 조합들 및 특히 MAB/PAB 조합인 MAB 17.3.1 (13-16)/PAB (39-50) 및 MAB 18.4.34 (27-31)/PAB (39-50)는, NT-proBNP 의 AA 1-21 및 AA 39-50 에피토프에 대한 폴리클로날 항체 (PAB (1-21) 및 PAB (39-50))를 사용하는 Elecsys
Figure 112004054883343-pat00012
참조 시스템과 양호한 상관도를 가진다.
PAB (1-21) 및 PAB (39-50)와 같은 폴리클로날 항체는 특히 WO 00/45176의 실시예 2와 유사하게 당업자에 공지인 방법으로 수득, 특정화 및 동정 가능하다.
MAB (38-42) 및 MAB (44-50)와 같은 모노클로날 항체는, 특히 WO 00/45176의 실시예 3 또는 유럽 특허 출원 03 010 591.0 [12.5.2003,Klemt 등]의 실시예 3과 유사하게 당업자에 공지인 방법으로 수득, 특정화 및 동정 가능하다.
항체는, 당업자에 공지인 방법으로 일례로 금 또는 기타 레벨, 비오틴 등으로 레벨링 가능하다 (WO 00/45176의 실시예 2 또는 유럽 특허 출원 03 010 591.0 [12.5.2003,Klemt 등]의 실시예 2를 또한 참조). 금으로의 레벨링은 일례로 EP-A 0 898 170에 상술되어 있다.
특히, 바람직한 모노클로날 항체인 MAB 17.3.1 (13-16), MAB 16.1.39 (38- 42), MAB 18.29.23 (64-67) 및 MAB 18.4.34 (27-31)는, 유럽 특허 출원 03 010 591.0 [12.5.2003,Klemt 등]의 실시예 3에 따라 수득 가능하다. 해당 세포주는 기탁된 바 있다 [Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSZM); 수탁번호 및 수탁일: MAB 17.3.1 (13-16)은, DSM ACC2591 (2003.5.7); MAB 16.1.39 (38-42)은 DSM ACC2590 (2003.5.7); MAB 18.29.23 (64-67)은 DSM ACC2593 (2003.5.7); 및 MAB 18.4.34 (27-31)은 DSM ACC2592 (2003.5.7)].
MAB 18.4.34 (27-31) / PAB (39-50)의 조합은, MAB 17.3.1 (13-16) / PAB (39-50)의 조합과 마찬가지로, 참조 테스트와 상대적으로 양호한 상관도를 나타낸다 (실시예 2를 또한 참조).
MAB 18.4.34 (27-31) / PAB (39-50)의 조합은, 본 발명의 테스트에 있어 특히 바람직한 것으로 밝혀졌다. 이러한 조합은, 신속한 테스트에 특히 적당하게 작용 곡선이 적응되도록 한다 (실시예 3 참조). 이에 반해, MAB 17.3.1 (13-16) / PAB (39-50)의 조합은 테스트 민감성이 열악하다.
본 발명은 하기 실시예 및 도면에 의해 추가로 개시된다.
실시예
1) 전체 혈액으로부터의 NT-proBNP를 측정하기 위한 테스트 장치의 제조 (도 1 참조)
도 1의 테스트 장치는, 샘플 첨가 영역 (1), 적혈구 분리 영역 (2), 측정 영역 (3) 및 흡입 영역 (4)이 부가된 지지체 물질 (5)로 구성된다. 적혈구 분리 영역 (7)과 일부 겹쳐진 샘플 첨가 매트릭스 (6)은 샘플 첨가 영역 (1) 내에 위치 한다. 적혈구 분리 매트릭스 (7)은 그 결과, 직선 형태 (9)로 고정화 물질이 적용된 측정 매트릭스 (8) (측정 영역)과 일부 겹쳐진다. 흡입 매트릭스 (10)은 측정 매트릭스 (10)과 일부 겹쳐진다. 측정하고자하는 분석물과 복합체를 형성하기 위해 필요한 모든 시약은, 샘플 첨가 매트릭스 (6)에 수용된다. 본 경우에서, 샘플 첨가 영역은 서로 겹쳐진 2개의 플리스로 구성되며 제 1 플리스 (금 플리스)는 NT-proBNP (MAB 18.4.34 (27-31))에 대한 금으로 레벨링된 항체로 함침된 것이며, 제 2 플리스 (비오틴 플리스)는, NT-proBNP (PAB (39-50))에 대한 비오틴화 항체를 포함한다. 스트렙타비딘으로 만들어진 직선 (9)는 측정 영역 내에 적용된다.
350㎛ 두께의 폴리에스터 호일 (Putz)을, 지지체 층 (5)로 사용한다. 360㎛ 두께의 폴리에스터 플리스 (Roche Diagnostics)를, 샘플 첨가 매트릭스 (6)의 '금 플리스'또는 '비오틴 플리스'로 사용한다. 1.8mm 두께의 유리 섬유 플리스 (Roche Diagnostics)를 적혈구 분리 매트릭스(7)로 사용한다. 140㎛ 두께의 니트로셀룰로스 막 (Sartorius)을 측정 매트릭스 (8)로 사용한다. 1.8mm 두께의 유리 섬유 플리스 (Roche Diagnostics)를 흡입 매트릭스 (10)으로 사용한다. 각 성분 (6, 7, 8, 10)들은, 도 1에서와 같이 고온 용융 접착물에 의해 지지체 층 (5)에 일부 겹쳐져 부착된다.
'금 및 비오틴 플리스'의 함침 제제는 다음과 같다:
비오틴 플리스: 100 mM Hepes pH 7.4, 0.1 % Tween
Figure 112004054883343-pat00013
, 20 ㎍/ml 비오틴화 PAB (39-50)
금 플리스: 100 mM Hepes pH 7.4, OD 4 MAB 18.4.34 (27-31) 금 컨쥬게이트.
2) Elecsys
Figure 112004054883343-pat00014
NT-proBNP 테스트 키트에 대한, Elecsys
Figure 112004054883343-pat00015
포맷의 에피토프/항체 조합 MAB 17.3.1 (13-16) / PAB (39-50) 및 MAB 18.4.34 (27-31) / PAB (39-50)의 상관도 (도 2 및 도 3 참조)
Elecsys
Figure 112004054883343-pat00016
테스트 키트 (PAB (1-21)/PAB (30-50))에 대한 MAB/PAB 조합 MAB 17.3.1 (13-16) / PAB (39-50) 및 MAB 18.4.34 (27-31) / PAB (39-50)의 상관도를 Elecsys
Figure 112004054883343-pat00017
2010 (Roche Diagnostics) 상의 전기화학발광 면역어세이에 의해 측정하였다. 이를 위해, PAB (39-50)를 비오틴화 포획 시약으로, 그리고 MAB의 루테닐화 F(ab')2 단편을 측정 시약으로 사용하였다. 각 경우, 20㎕의 샘플 또는 표준 물질을 2개의 항체 시약 75㎕와 9분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이후, 35㎕의 스트렙타비딘 코팅된 자기 폴리스티렌 입자를 가하고, 실온에서 추가로 9분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 용액 일부의 전기발광 시그날을 Elecsys
Figure 112004054883343-pat00018
2010 상에서 간단히 측정하고, 표준 곡선에 의해 농도 시그날로 환산하였다.
심장 이상을 가진 환자의 임상 샘플을, 2개의 MAB/PAB 테스트 변이물 및 Elecsys
Figure 112004054883343-pat00019
키트를 사용하여 이제 측정하였다. 결과를 도 2 및 도 3에 도시하였다. MAB/PAB 변이물 모두에 대하여 매우 양호한 Elecsys
Figure 112004054883343-pat00020
키트와의 상관도 (r=0.978 및 r=0.957)가 수득되었다.
3) 2개의 상이한 MAB/PAB 조합과 NT-proBNP 테스트 스트립의 작용 곡선
실시예 1에 따라 NT-proBNP 테스트 스트립을 제조하였다. 사용한 시약 플리스에 대한 함침 제제는 다음과 같다:
비오틴 플리스: 100 mM Hepes pH 7.4, 0.1 % Tween
Figure 112004054883343-pat00021
, 20 ㎍/ml 비오틴화 PAB (39-50)
금 플리스: 100 mM Hepes pH 7.4, OD 4 MAB 18.4.34 (27-31) 또는 MAB 17.3.1 (13-16) 금 컨쥬게이트
건강한 공여자의 헤파린화 혈액 샘플에 심장 이상 환자의 NT-proBNP를 함유한 혈청을 가해 분액하였다. 상기 첨가 혈액 샘플 150 ㎕을 테스트 스트립 상에 피펫팅하고, CARDIAC Reader
Figure 112004054883343-pat00022
(Roche Diagnostics)로 측정하였다. 샘플 측정 이후 반응 시간은 12분이었다. 샘플 내의 NT-proBNP 농도 측정을 위해, 한 분액으로부터 혈장을 원심분리하여, Elecsys
Figure 112004054883343-pat00023
NT-proBNP 키트(Roche Diagnostics)로 측정하였다. 상기 방식으로 수득한, 2개의 테스트 스트립 변이물 MAB 17.3.1 (13-16) / PAB (39-50) 및 MAB 18.4.34 (27-31) / PAB (39-50)에 대한 작용 곡선은 도 4에 개시하였다. 변이물 MAB 18.4.34 (27-31) / PAB (39-50)은 현격하게 경사진 표준 곡선을 가졌으며 따라서 보다 민감한 테스트이다.
4) Elecsys
Figure 112004054883343-pat00024
NT-proBNP 테스트 키트에 대한, AB 조합 Au-MAB 18.4.34 (27-31) / Bi-PAB (39-50)을 이용한 NT-proBNP 테스트 스트립의 상관도
건강한 공여자의 헤파린화 혈액 샘플에 심장 이상 환자의 NT-proBNP를 함유 한 혈청을 가해 분액하였다. 이들 상기 첨가 혈액 샘플 150㎕을 테스트 스트립 상에 피펫팅하고, 표준 방법에 따라 CARDIAC Reader
Figure 112004054883343-pat00025
(Roche Diagnostics)로 측정하였다. 동일한 샘플로부터 혈장을 원심분리하여, Elecsys
Figure 112004054883343-pat00026
1010 분석 시스템 상의 Elecsys
Figure 112004054883343-pat00027
NT-proBNP 키트(Roche Diagnostics)로 측정하였다. 이러한 방식으로 60 개의 샘플을 제조하여 양 시스템 모두에 대해 측정하였다. 도 5는 양 시스템에 대한 측정치를 나타낸다 상관도는 r=0.95로 매우 높았다.
본 발명은, 분석 샌드위치 테스트, 특히 테스트 요소 및 특히 N-말단 프로브레인 (pro-brain) 나트륨배설증가 펩티드 (NT-proBNP) 측정을 위한 샌드위치 원리를 이용한 면역크로마토그래피 테스트 스트립의 형태로써 유용한 것이다.

Claims (10)

  1. 하기의 항체 조합을 사용함을 특징으로 하는, NT-proBNP 측정용 면역 샌드위치 테스트 장치:
    PAB (39-50) 또는 PAB (38-42) 또는 PAB (44-50) 또는 MAB (38-42) 와, MAB 18.4.34 (27-31), 또는,
    PAB (39-50) 또는 PAB (38-42) 또는 PAB (44-50)와, MAB 17.3.1 (13-16).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서, MAB (38-42)가 MAB 16.1.39 (38-42)임을 특징으로 하는 면역 테스트 장치.
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서, 항체 중 하나가 항체-금 컨쥬게이트로 존재함을 특징으로하는 면역 테스트 장치.
  9. 제 1 항에 있어서, 항체 중 하나가 비오틴화 항체로 존재함을 특징으로 하는 면역 테스트 장치.
  10. 제 1 항의 면역 테스트 장치를 사용함을 특징으로 하는, NT-proBNP 측정 방법.
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