ES2355556T3 - PRUEBA ANALÍTICA SÁNDWICH PARA DETERMINAR NT-proBNP. - Google Patents

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Abstract

Elemento de ensayo en forma de una tira de ensayo inmunográfica que funciona según el principio sándwich, caracterizado porque el elemento de ensayo comprende como mínimo dos anticuerpos contra NT-proBNP, de los cuales al menos uno es un MAC, y los anticuerpos se hallan en las siguientes combinaciones: MAC 18.4.34 (27-31) con PAC (39-50) o PAC (38-42) o PAC (44-50); o MAC 18.4.34 (27-31) con MAC (38-42); o MAC 18.9.8 (27-31) con MAC (38-42), y uno de los anticuerpos está conjugado con un marcador particulado.

Description

Prueba analítica sándwich para determinar NT-proBNP.
La presente invención se refiere a una prueba analítica de tipo sándwich, en concreto a un elemento analítico, sobre todo en forma de una tira de ensayo inmunocromatográfica que trabaja según el principio sándwich, para determinar el péptido natriurético cerebral N-terminal (NT-proBNP).
El NT-proBNP es un marcador muy prometedor para diagnosticar y controlar la insuficiencia cardíaca. Un resumen sobre la insuficiencia cardíaca y la importancia del NT-proBNP como sustancia marcadora se encuentra, por ejemplo, en la patente WO 00/45176 páginas 1 a 4. Además los documentos WO 00/35951, US 5,786,163, US 6,461,828, US 6,117,644, EP 1 151 304, WO 02/083913 y la solicitud de patente europea nº 03 010 591.0 de 12.5.2003 (Klemt y otros), publicada como WO 2004/099252 y WO 2004/099253, tratan del NT-proBNP, de anticuerpos para el mismo y de métodos para determinarlo.
Actualmente el único ensayo diagnóstico in vitro del NT-proBNP disponible en el mercado es el Elecsys® NT-proBNP-Test totalmente automatizado de Roche Diagnostics, que funciona en base a una reacción tipo sándwich con detección por electroquimioluminiscencia. Este ensayo está concebido para ser utilizado en grandes laboratorios centrales y su realización requiere, además de reactivos líquidos con dosificación exacta, un aparato relativamente complejo para dosificar los líquidos y detectar la señal luminiscente. Hoy en día no existe en el mercado un ensayo rápido de NT-proBNP que sea fácil de manejar para casos de emergencia y que dé una indicación visual, sin necesidad de un dispositivo de evaluación.
Los ensayos rápidos de sustancias inmunológicamente detectables son conocidos desde hace mucho tiempo para una serie de diversos parámetros, por ejemplo a través de las patentes WO 97/06439, EP 0 291 194, US 5,591,645, US 4,861,711, US 5,141,850, US 6,506,612, US 5,458,852, US 5,073,484. Para ello, en la mayoría de los casos, los reactivos de detección inmunológica (básicamente anticuerpos o antígenos marcados o no) se preparan en forma seca sobre un soporte al cual pueda aplicarse una muestra líquida (especialmente líquidos corporales como sangre, suero, plasma, orina, saliva, etc.). Es preferible que el soporte tenga actividad capilar, por ejemplo que sea una membrana o un soporte de plástico con canales capilares. En el mundo científico se habla a menudo de tiras o dispositivos de ensayo inmunocromatográficos.
En pacientes con disnea aguda es conveniente hacer lo más rápidamente posible una determinación de NT-proBNP, para excluir o diagnosticar una insuficiencia cardíaca como causa de la disnea e iniciar el tratamiento adecuado. Como el ensayo Elecsys® NT-proBNP solo puede realizarse en un laboratorio central, es muy difícil hacer una determinación rápida de NT-proBNP fuera de los horarios habituales. Por tanto sería ventajoso disponer de un ensayo rápido, justo para situaciones urgentes, que pudiera realizarse prontamente en tales casos, fuera de los horarios habituales. Este ensayo rápido debería garantizar los mismos márgenes y límites de referencia que el correspondiente método del laboratorio central (Elecsys® NT-proBNP), para que los resultados fueran compatibles - con independencia del tipo de ensayo realmente efectuado.
Los anticuerpos policlonales (PAC) usados en el ensayo Elecsys® NT-proBNP reconocen una fracción muy concreta del NT-proBNP (NT-proBNP "nativo"; véase solicitud de patente EP nº 03 010 591.0 del 12.5.2003 de Klemt y otros; así se reconocen los epítopos del NT-proBNP con los aminoácidos 1-21 (AS 1-21) y 39-50 (AS 39-50)). No obstante, se ha demostrado que estos anticuerpos policlonales son inapropiados para ensayos rápidos de NT-proBNP con marcadores particulados, como p.ej. oro coloidal, porque, debido a interacciones físico-químicas con los componentes del ensayo rápido (como p.ej. materiales soporte, matrices, etc.), dan desfavorablemente una señal muy variable, lo cual produce visibles oscilaciones cualitativas del ensayo entre una y otra carga.
Por consiguiente el objeto de la presente invención era resolver los inconvenientes del estado técnico, en concreto, proporcionando un ensayo rápido para la determinación del NT-proBNP, que pudiera elaborarse de modo reproducible y tuviera una buena correlación con el método de laboratorio.
Este objetivo se resuelve mediante el objeto de la presente invención.
La presente invención tiene por objeto un ensayo inmunológico, sobre todo en forma de ensayo rápido, como p.ej. un elemento analítico del tipo descrito en las reivindicaciones independientes de la patente. En las reivindicaciones dependientes se describen formas de ejecución preferidas.
Según la presente invención, la solución para elaborar un ensayo inmunológico en formato sándwich que tenga buena correlación con el método Elecsys® de referencia prevé el uso de una combinación especial de anticuerpos, incluyendo al menos dos anticuerpos contra NT-proBNP, de los cuales al menos uno es un anticuerpo monoclonal (MAC; en inglés: monoclonal antibody o MAB). Otro anticuerpo del ensayo sándwich según la presente invención puede ser también un MAC o un anticuerpo policlonal (PAC; en inglés: polyclonal antibody o PAB).
Se prefiere una combinación de anticuerpos que comprenda al menos un anticuerpo policlonal (PAC; en inglés: polyclonal antibody o PAB) y un anticuerpo monoclonal (MAC; en inglés: monoclonal antibody o MAB) (la llamada combinación PAC/MAC) contra NT-proBNP.
En los términos de esta solicitud de patente PAC (X-Y) significa un anticuerpo policlonal dirigido contra el epítopo del NT-proBNP con los aminoácidos X hasta Y. MAC (X-Y) es un respectivo anticuerpo monoclonal. AC (X-Y) designa en general un anticuerpo (p.ej. PAC o MAC) dirigido contra el epítopo del NT-proBNP con los aminoácidos X hasta Y.
El MAC a.b.c. (X-Y) es un anticuerpo monoclonal obtenido de la línea celular depositada a.b.c., que va dirigido contra el epítopo del NT-proBNP con los aminoácidos X hasta Y.
Para garantizar que la calidad del conjugado anticuerpo-marcador sea reproducible, el MAC se inmoviliza preferiblemente sobre el marcador particulado, concretamente sobre un marcador de oro. Otros marcadores particulados adecuados son, por ejemplo, látex teñidos, otros marcadores de sol metálico, marcadores poliméricos o nanocristales semiconductores (los llamados puntos cuánticos). El conjugado MAC-marcador se dispone preferiblemente sobre el dispositivo de ensayo rápido de modo pueda separarse de éste mediante la muestra líquida, por ejemplo impregnando materiales soporte adecuados como vellos, membranas, etc. Sin embargo el conjugado MAC-marcador también puede añadirse al ensayo rápido en forma disuelta.
El PAC, que se obtiene preferentemente por inmunización de mamíferos, en especial ovejas, cabras o conejos, se ofrece preferiblemente como derivado de biotina en el ensayo rápido y puede estar unido a una tira de detección de avidina o de estreptavidina. Sin embargo el PAC también se puede inmovilizar directamente en el dispositivo de ensayo, por ejemplo en forma de una capa de detección sobre una membrana cromatográfica adecuada.
El MAC usado según la presente invención no debe identificar forzosamente el epítopo (AS 1-21) reconocido en el sistema de referencia (Elecsys® Test) para garantizar una buena correlación con el ensayo de referencia: las combinaciones de anticuerpos mencionadas en la reivindicación 1, sobre todo la combinación MAC/PAC MAC 18.4.34(27-31)/PAC (39-50), muestran buena correlación con el sistema de referencia Elecsys®, en el cual se usan anticuerpos policlonales contra los epítopos AS 1-21 y AS 39-50 del NT-proBNP (PAC (1-21) y PAC (39-50)).
Los anticuerpos policlonales, por ejemplo PAC (39-50), se pueden obtener, caracterizar e identificar por métodos ya conocidos del especialista, especialmente por analogía con el ejemplo 2 de la patente WO 00/45176.
Los anticuerpos monoclonales, por ejemplo MAC (38-42) y MAC (44-50), se pueden obtener, caracterizar e identificar por métodos ya conocidos del especialista, especialmente por analogía con el ejemplo 3 de la patente WO 00/45176 o con el ejemplo 3 de la solicitud de patente EP nº 03 010 591.0, de 12.5.2003 (Klemt y otros).
La marcación de los anticuerpos, por ejemplo con oro u otros marcadores, biotina, etc., se realiza según los métodos ya conocidos del especialista (véase también a tal efecto el ejemplo 2 de la patente WO 00/45176 y el ejemplo 2 de la solicitud de patente EP nº 03 010 591.0, de 12.5.2003 (Klemt y otros). La marcación con oro está descrita con detalle, por ejemplo, en la patente EP-A 0 898 170.
En concreto, los anticuerpos monoclonales preferidos MAC 16.1.39 (38-42), MAC 18.29.23 (64-67) y MAC 18.4.34 (27-31) deben obtenerse según el ejemplo 3 de la solicitud de patente EP nº 03 010 591.0 de 12.5.2003, de Klemt y otros. Las líneas celulares correspondientes están depositadas en la "Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSZM)" [banco alemán de microorganismos y cultivos celulares] (nº de registro y fecha de consignación: DSM ACC2590 (7 de mayo de 2003) para MAC 16.1.39 (38-42); DSM ACC2593 (7 de mayo de 2003) para MAC 18.29.23 (64-67); y DSM ACC2592 (7 de mayo de 2003) para MAC 18.4.34 (27-31).
La combinación MAC 18.4.34 (27-31)/PAC (39-50) produce una buena correlación con el ensayo de referencia, comparable con la combinación MAC 17.3.1 (13-16)/PAC (39-50) que no es parte de la invención reivindicada (ver también ejemplo 2).
La combinación MAC 18.4.34 (27-31)/PAC (39-50) también resultó especialmente ventajosa para el ensayo de la presente invención: con ella se pudo ajustar una curva de funcionamiento especialmente adecuada para ensayos rápidos (véase el ejemplo 3). En cambio la combinación MAC 17.3.1 (13-16)/PAC (39-50), ajena a la presente invención, dio una peor sensibilidad del ensayo.
La presente invención se explica más detalladamente por medio de los ejemplos y figuras siguientes.
En la figura 1 se representa esquemáticamente una forma de ejecución preferida para un dispositivo de ensayo rápido, según la presente invención, configurado como tira de ensayo inmunocromatográfica.
La figura 2 muestra la correlación de la combinación de anticuerpos MAC 17.3.1 (13-16)/PAC (39-50) en el formato de ensayo húmedo Elecsys ® con el método de referencia Elecsys® PAC (1-21)/PAC (39-50).
La figura 3 muestra la correlación de la combinación de anticuerpos MAC 18.4.34 (27-31)/PAC (39-50) en el formato de ensayo húmedo Elecsys ® con el método de referencia Elecsys® PAC (1-21)/PAC (39-50).
La figura 4 muestra curvas de funcionamiento de tiras de ensayo de NT-proBNP según el ejemplo 1, con diferentes combinaciones de anticuerpos.
La figura 5 muestra la correlación de una tira de ensayo de NT-proBNP, que contiene la combinación de anticuerpos Au-MAC 18.4.34 (27-31)/Bi-PAC (39-50), con el kit de ensayo Elecsys® NT-proBNP.
Las cifras de las figuras significan:
1
Zona de aplicación de la muestra
2
Zona de separación de eritrocitos
3
Zona de detección
4
Zona de absorción
5
Material soporte
6
Matriz de aplicación de la muestra ("vello de biotina" y "vello de oro")
7
Matriz de separación de eritrocitos
8
Matriz de detección
9
Zona de inmovilización en forma de capa
10
Matriz de absorción
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos 1) Preparación de un dispositivo de ensayo para determinar NT-proBNP en sangre entera (ver figura 1)
El dispositivo de ensayo (fig. 1) consta de un material soporte (5) sobre el cual se ha dispuesto una zona de aplicación de la muestra (1), una zona de separación de eritrocitos (2), una zona de detección (3) y una zona de absorción (4). En la zona de aplicación de la muestra (1) hay una matriz de aplicación de la muestra (6) parcialmente solapada con una matriz de separación de eritrocitos (7) que a su vez solapa un poco la matriz de detección (8) (zona de detección), sobre la cual se ha aplicado una capa (9) de una sustancia inmovilizada. La matriz de absorción (10) solapa un poco la matriz de detección (8). La matriz de aplicación de la muestra (6) lleva incorporados todos los reactivos necesarios para formar un complejo con el analito objeto de la determinación. En el caso presente la zona de aplicación de la muestra consta de dos vellos superpuestos, el primero ("vello de oro") impregnado con un anticuerpo contra NT-proBNP marcado con oro (MAC 18.4.34 (27-31)) y el segundo ("vello de biotina") contiene un anticuerpo biotinilado contra NT-proBNP (PAC (39-50)). En la zona de detección hay una capa (9) de estreptavidina.
Como capa soporte 5 se usa una lámina de poliéster de 350 \mum de espesor (de la firma Pütz). Como "vello de oro" o "vello de biotina" de la matriz de aplicación de la muestra 6 se utiliza un vello de poliéster de 360 \mum de espesor (Roche Diagnostics). Como matriz de separación de eritrocitos 7 se usa un vello de fibra de vidrio de 1,8 mm de espesor (Roche Diagnostics). Como matriz de detección 8 sirve una membrana de nitrocelulosa de 140 \mum de grosor (Sartorius). Como matriz de absorción 10 sirve un vello de fibra de vidrio de 1,8 mm de espesor (Roche Diagnostics). Los diferentes componentes (6, 7, 8, 10) representados en la fig. 1 se pegan ligeramente solapados sobre la capa soporte 5 mediante un adhesivo termofusible.
La receta de impregnación del "vello de oro y del vello de biotina" es:
"Vello de biotina":
Hepes 100 mM pH 7,4, Tween® 0,1%, 20 \mug/ml de PAC (39-50) biotinilado
"Vello de oro":
Hepes 100 mM pH 7,4, OD 4 MAC 18.4.34 (27-31)-conjugado de oro
\vskip1.000000\baselineskip
2) Correlación entre las combinaciones epítopo/anticuerpo MAC 17.3.1 (13-16)/PAC (39-50) y MAC 18.4.34 (27-31)/PAC (39-50) en el formato Elecsys® y el kit de ensayo Elecsys® NT-proBNP (ver fig. 2 y 3)
Se estudió la correlación de las combinaciones MAC/PAC MAC 17.3.1 (13-16)/PAC (39-50) y MAC 18.4.34 (27-31)/PAC (39-50) con el kit de ensayo Elecsys® (PAC (1-21)/PAC (30-50)) en un ensayo de electroquimioluminiscencia realizado en un analizador Elecsys® 2010 (Roche Diagnostics), utilizando el PAC (39-50) como reactivo de captación y fragmentos F(ab')_{2} rutenizados de los MACs como reactivo de detección. Se incubaron durante 9 minutos a 37ºC 20 \mul de muestra o material estándar con 75 \mul de ambos reactivos de anticuerpos, respectivamente. Después se añadieron 35 \mul de partículas magnéticas de poli-estireno recubiertas de estreptavidina y se incubó 9 minutos más a temperatura ambiente. La señal electroluminiscente de un alícuota de la solución incubada se midió normalmente en un analizador Elecsys® 2010 y se transformó en una señal de concentración mediante una curva estándar.
Después se midieron muestras clínicas de pacientes de insuficiencia cardíaca con ambas variantes de ensayo MAC/PAC y el kit Elecsys®. Los resultados se representan en las figuras 2 y 3. Con ambas variantes MAC/PAC se obtiene una correlación muy buena con el kit Elecsys® (r = 0,978 y r = 0,957).
3) Curva de funcionamiento de una tira de ensayo de NT-proBNP con dos combinaciones MAC/PAC distintas
Se elaboró una tira de ensayo de NT-proBNP según el ejemplo 1, empleando la siguiente receta de impregnación para los vellos de reactivo:
"Vello de biotina":
Hepes 100 mM pH 7,4, Tween® 0,1%, 20 \mug/ml de PAC (39-50) biotinilado
"Vello de oro":
Hepes 100 mM pH 7,4, OD 4 MAC 18.4.34 (27-31)- o MAC 17.3.1 (13-16)-conjugado de oro
\vskip1.000000\baselineskip
Se completaron y alicuotaron muestras de sangre heparinizada de donantes sanos con sueros de pacientes de insuficiencia cardíaca que contenían NT-proBNP. Se pipetearon 150 \mul de estas muestras de sangre sobre la tira de ensayo y se llevó a cabo la medición en un aparato CARDIAC Reader® (Roche Diagnostics). El tiempo de reacción tras el reconocimiento de las muestras fue de 12 minutos. Para determinar la concentración de NT-proBNP de las muestras se centrifugó el plasma de un alícuota y se midió con un kit Elecsys ® NT-proBNP (Roche Diagnostics). Las curvas de funcionamiento obtenidas de ambas variantes de la tira de ensayo MAC 17.3.1 (13-16)/PAC (39-50) y MAC 18.4.34 (27-31)/PAC (39-50) están representadas en la figura 4. Con la variante MAC 18.4.34 (27-31)/PAC (39-50) se obtiene una curva estándar de pendiente claramente mayor y, por tanto, un ensayo más sensible.
4) Correlación de una tira de ensayo de NT-proBNP con la combinación de AC: Au-MAC 18.4.34 (27-31)/Bi-PAC (39-50) respecto al kit de ensayo Elecsys® NT-proBNP
Se completaron y alicuotaron muestras de sangre heparinizada de donantes sanos con sueros de pacientes de insuficiencia cardíaca que contenían NT-proBNP. Se pipetearon 150 \mul de estas muestras de sangre sobre la tira de ensayo y se llevó a cabo la medición en un aparato CARDIAC Reader® (Roche Diagnostics) según el método estándar. Se centrifugó plasma de la misma muestra y se midió con el kit Elecsys® NT-proBNP en un sistema analítico Elecsys® 1010 (Roche Diagnostics). De este modo se prepararon 60 muestras y se midieron con ambos sistemas. La figura 5 presenta los valores para ambos sistemas. La correlación es muy buena (r = 0,95).

Claims (5)

1. Elemento de ensayo en forma de una tira de ensayo inmunográfica que funciona según el principio sándwich, caracterizado porque el elemento de ensayo comprende como mínimo dos anticuerpos contra NT-proBNP, de los cuales al menos uno es un MAC, y los anticuerpos se hallan en las siguientes combinaciones:
MAC 18.4.34 (27-31) con PAC (39-50) o PAC (38-42) o PAC (44-50); o
MAC 18.4.34 (27-31) con MAC (38-42); o MAC 18.9.8 (27-31) con MAC (38-42), y
uno de los anticuerpos está conjugado con un marcador particulado.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Elemento de ensayo según la reivindicación 1, caracterizado porque el MAC (38-42) es el MAC 16.1.39 (38-42).
3. Elemento de ensayo según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque uno de los anticuerpos está en forma de conjugado con oro.
4. Elemento de ensayo según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque uno de los anticuerpos está en forma de conjugado con una partícula de látex teñida.
5. Método para detectar NT-proBNP, caracterizado porque se emplea un elemento de ensayo según una de las reivindicaciones 1 a 4.
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