KR100606500B1

KR100606500B1 - 단백질분해효소 처리에 의한 불가사리 유래의 항균성 추출물

Info

Publication number: KR100606500B1
Application number: KR1020030053442A
Authority: KR
Inventors: 차용준; 조우진
Original assignee: 경상남도; 창원대학교 산학협력단
Priority date: 2003-08-01
Filing date: 2003-08-01
Publication date: 2006-08-02
Also published as: KR20050014996A

Abstract

본 발명은 서브틸리신 A(Subtilisin A) 성분이 함유된 단백질분해효소 처리에 의한 불가사리 유래의 항균성 추출물에 관한 것으로, 본 발명은 불가사리에 단백질분해효소를 처리하여 항균활성이 있는 불가사리 추출물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

아므르 불가사리, 별 불가사리, 단백질분해효소, 항균활성

Description

단백질분해효소 처리에 의한 불가사리 유래의 항균성 추출물{Antimicrobial materials isolated from starfishes by protease treatment}

도 1은 본 발명 아므르 불가사리에 단백질분해효소를 처리한 후 효소 무처리군과의 아미노질소 함량을 비교한 그래프이다.

도 2는 본 발명 별 불가사리에 단백질분해효소를 처리한 후 효소 무처리군과의 아미노질소 함량을 비교한 그래프이다.

도 3은 본 발명 불가사리의 용매순차추출 공정도를 도시한 것이다.

도 4는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용한 본 발명 불가사리 유래의 생리활성물질을 추출하기 위한 공정도를 도시한 것이다.

본 발명은 서브틸리신 A(Subtilisin A) 성분이 함유된 단백질분해효소 처리에 의한 불가사리 유래의 항균성 추출물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 불가사리를 용매순차추출 후, 항균 활성이 검정된 활성물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 분리·정제하여 얻는 항균활성이 있는 불가사리 추출물에 관한 것이다.

불가사리는 몸은 편평한 별모양으로 연안에서 우리가 가장 흔하게 접할 수 있는 해양동물 중의 하나로서, 전국 연안에 30여종의 불가사리가 서식하고 있으며, 번식률은 대단히 높아서 마리당 200만~300만개를 산란하며, 극피동물문의 바다나리강, 불가사리아강, 거미불가사리아강, 성게강, 해삼강에 포함되는 해산 무척추동물이다. 우리나라에는 불가사리류 47종이 보고되어 있으며 남쪽에 비해 북방계의 종이 풍부하다. 이들은 북태평양에 널리 분포하는 종으로서 일본의 북부와 북미쪽에 공통해 있는 종이다. 이들을 보면 빗살판불가사리류(Ctenodiscus), 작은불가사리류(Leptychaster), 검은띠불가사리류(Luidia), 헛불가사리류(Pseudarchaster), 애기불가사리류(Henricia), 햇님불가사리류(Solaster), 입방불가사리류(Pteraster), 문어불가사리류(Plazaster), 일본불가리류(Distolasterias), 아팰불가사리류(Aphelasterias), 그리고 우리나라 남해안일대에 광범위하게 서식하고 있으며 양식장에 피해를 주고 있다고 알려져 있는 아므르불가사리류(Asterias),등이다.

불가사리류는 육식성의 적게 먹는 동물로서 먹이에 대해 아주 민감하게 반응한다. 그래서 이미패류와 고동, 굴 등의 연체동물, 작은 갑각류, 다모류, 성게, 거미불가사리 등의 극피동물이 먹이가 된다. 자망에 걸린 어류도 먹으며 굴, 홍합, 조개 양식장에는 많은 불가사리가 습격하여 피해를 주는 수가 있다. 먹이습성상 잡식성이지만 특히 조개류를 좋아하기 때문에 패류양식장에서는 이를 해적생물로 간주하여 매년 퇴치작업을 벌이고 있다. 그러나 불가사리는 이동하는 것은 포식하지 못할 뿐만 아니라 아주 느리게 움직이는 소라고동도 건강한 개체는 불가사리에 희생되지 않으며 이동이 불가능하게 되었거나 죽은 개체, 그리고 정착성 조개류가 주 먹이이다. 급격히 줄어드는 수중자원 만큼 불가사리 숫자도 자연 감소하고 있다. 불가사리는 수중생태계의 한 고리로서 다른 자원이 줄어들면 따라서 자연히 숫자가 감소된다는 것을 알 수 있으며 인간이 불가사리를 백해무익한 해적생물로 규정하고 인위적으로 그 숫자를 조절할 필요는 없다고 본다. 불가사리의 효용가치는 지금으로서는 전무하다고 볼 수 있다. 채포한 불가사리를 비료대용으로 사용하려는 시도가 있었지만 그 효과는 아직까지는 인정받지 못하고 있으며 불가사리의 식품으로서의 이용가치를 알아보기 위하여 불가사리를 조리해 보았으나 식용으로서는 불가하였다. 최근에 불가사리에 다량 함유된 아연성분을 추출하여 건강 식품으로 소개된 바가 있다. 또한, 불가사리를 활용한 항암물질과 기능성 가축사료를 만드는 연구가 활발하게 이뤄지고 있다.

본 발명자는 이러한 점에 착안하여 우리 나라 패류 양식어장에 크게 피해를 주는 것으로 알려진 아므르 불가사리와 별 불가사리의 효용가치를 높이는 일환으로생리적 활성을 갖는 물질을 분리해냄으로써 해양신물질을 기능성 소재화하고 상기 물질을 대량생산하고자 본 발명을 실시하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 불가사리에 서브틸리신 A(Subtilisin A) 성분이 함유된 단백질분해효소를 처리하여 항균활성이 있는 항균성 추출물을 제공하고자 한다.

본 발명의 상기 목적은 불가사리에 서브틸리신 A(Subtilisin A) 성분이 함유된 단백질분해효소를 처리한 후 용매순차추출하고, 상기로부터 얻은 용매추출물의 항균활성을 검정하고, 상기 활성이 검정된 분획은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 상기 분획의 항균활성을 검색함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 불가사리 시료의 용매순차추출단계; 용매추출물의 항균활성 검정단계; 항균활성이 검정된 분획의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 실시단계; 정제된 물질의 항균활성 조사단계로 구성된다.

본 발명에서 사용된 불가사리는 우리 나라 패류 양식어장에 크게 피해를 주는 것으로 알려진 별 불가사리(Asterina pectinifera) 및 아므르 불가사리(Asterias amurensis) 2종을 시료로 하였으며, 표면의 수분을 제거하여 균질기 (Waring blender Co., USA)로 갈아서 분석용 시료로 하였다.

본 발명 불가사리 유래의 항균성 추출물은 불가사리에 3배(v/w)의 증류수를 첨가하고 단백질분해효소를 첨가하여 50℃에서 3∼5시간 동안 교반한 후 원심분리하여 상등액과 잔사를 분리함으로써 상등액을 회수하여 얻음을 특징으로 한다.

한편, 바람직스럽게는 상기 불가사리 유래의 항균성 추출물은 증류수를 첨가하여 교반한 후 원심분리함으로써 분리된 잔사에 3배(v/w)의 메탄올을 첨가하여 4℃에서 5∼6시간 동안 교반한 후, 진공여과하여 여액과 잔사를 분리함으로써 여액을 회수하여 얻음을 특징으로 한다.

한편, 바람직스럽게는 상기 불가사리 유래의 항균성 추출물은 상기 메탄올을 첨가하여 교반한 후 진공여과하여 분리한 잔사에 3배(v/w)의 아세톤을 첨가하여 4℃에서 5∼6시간 동안 교반한 후, 진공여과하여 여액과 잔사를 분리함으로써 여액을 회수하여 얻음을 특징으로 한다.

본 발명 불가사리 유래의 항균성 추출물은 상기 용매순차추출에서 얻은 여액을 5:5 또는 7:3의 비율로 혼합된 CH₃Cl₃: MeOH 용매계로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(200 메쉬)를 수행하여 얻은 분획물임을 특징으로 한다.

본 발명 불가사리의 성분분석을 위해, 일반성분은 AOAC법에 준하여 수분은 상압가열건조법, 조단백질은 semi micro Kjeldahl법, 지방은 Soxhlet법, 회분은 건식회화법에 따라 측정하였고, 아미노질소는 Formol법으로 정량하였다. 카노티노이드는 전처리 후 445 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였고, 구성아미노산 분석은 아미노산 자동분석기(Pharmacia Biochrom 20, 미국 파마시아 LKB 바이오테크)로 분석하였다.

본 발명 불가사리 추출물의 항균활성을 검정하기 위해 사용된 실험균주로는 식품부패, 병원성 및 식중독 유발균류 중 그람 양성균으로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 그람 음성균으로는 이 콜라이(E. coli), 살모넬라 티피무리움(Salmonnella typhimurium), 엔테로박터 아에로제네스(Enterobacter aerogenes) 7종, 피부염에 관련된 진균류 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 2종, 피부 백선균류 에피더모파이톤 플로코숨(Epidermophyton floccosum), 마이크로스프럼 아우도우이니(Microsproum audouinii), 트리코파이톤 페루지넘(Trichophyton ferrugineum), 트리코파이톤 멘타그로파이테스(Trichophyton mentagrophytes), 트리코파이톤 러브럼(Trichophyton rubrum) 5종 및 혐기성 여드름균 프로피오니박테리움 애크네스(Propionibacterium acnes) 1종 등, 총 15종을 사용하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 불가사리 시료의 성분분석

경남 마산시 진전면 일대 해안으로부터 수심 5∼10 m 범위의 해역에서 각 월별(5월∼7월)로 채집한 아므르 불가사리 (Asterias amurensis)와 별 불가사리 (Asterina pectinifera)를 냉동용기(ice chest)에 담아 실험실로 한시간 이내에 운반하여 시료 표면의 이물질을 제거하고 깨끗이 수세한 후 신문지로 표면의 수분을 일부 제거한 다음 균질기 (Waring blender Co., USA)로 갈아서 분석용 시료로 하였다.

일반성분은 AOAC법에 준하여 수분은 상압가열건조법, 조단백질은 semi micro Kjeldahl법, 지방은 Soxhlet법, 회분은 건식회화법에 따라 측정하였고, 아미노질소는 Formol법으로 정량하였다.

카노티노이드는 전처리 후 445 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였고, 구성아미노산 분석은 아미노산 자동분석기(Pharmacia Biochrom 20, 미국 파마시아 LKB 바이오테크)로 분석하였다.

종	채취 기간	수분(%)	조 단백질(%)	조 지질(%)	회분(%)
아므르 불가사리 (Asterias amurensis)	5월	72.35±0.32	10.32±0.07	1.77±0.13	13.39±0.18
아므르 불가사리 (Asterias amurensis)	7월	72.80±0.09	12.09±0.04	2.55±0.19	9.31±0.30
별 불가사리 (Asterina pectinifera)	5월	65.18±0.02	8.71±0.11	0.44±0.03	22.54±0.25
별 불가사리 (Asterina pectinifera)	7월	64.75±0.03	10.03±0.05	1.18±0.16	22.37±0.16

¹⁾평균±S.D (n=3).

표 1에 나타난 바와 같이, 아므르 불가사리와 별 불가사리의 일반성분 조성은 일반 어패류에 비하여 수분 함량이 적고, 회분 함량이 높은 것이 특징이었다. 아므르 불가사리의 경우 전체 고형물 함량에 대한 회분의 함량이 약 50%, 별 불가사리의 경우에는 60% 이상을 차지하고 있었다. 이는 일반 어패류의 회분이 1∼3%인 것에 비하여 매우 높다는 것을 알 수 있었다. 그리고 별 불가사리가 아므르 불가사리보다 수분과 단백질 함량이 낮은 반면 회분 함량이 높았는데, 이는 불가사리의 종류에 따라 일반성분의 조성도 약간 다름을 알 수 있었다. 한편 수분 및 회분을 제외하고는 2종 모두 단백질 함량이 가장 많았다.

상기의 결과에 따라, 아므르 불가사리와 별 불가사리에 대한 구성 아미노산을 분석하였다.

성분	함량(mg%)
성분	아므르 불가사리 (Asterias amurensis)	별 불가사리 (Asterina pectinifera)
O-phospho-L-serine	9.39 (0.15)²⁾	72.73 (0.85)
Taurine	19.10 (0.18)	296.87 (3.49)
O-phosphoethanolamine	79.50 (0.74)	N/D
Urea	25.13 (0.23)	75.92 (0.89)
Aspartic acid1	298.23 ( 2.76)	508.48 (5.97)
Hydroxy-L-proline	221.11 (2.05)	134.21 (1.58)
L-Threonine	20.03 (0.19)	540.21 (6.35)
Serine	N/D¹⁾	409.19 (4.81)
Asparagine	N/D	N/D
Glutamic acid	2552.45 (23.65)	991.09 (11.64)
Sarcosine	35.59 (0.33)	10.79 (0.13)
α-Amino adipic acid	8.58 (0.08)	5.54 (0.07)
Proline	3528.21 (32.71)	301.93 (3.55)
Glycine	78.09 (0.72)	1025.11 (12.04)
L-Alanine	N/D	594.79 (6.99)
L-Citrulline	33.92 (0.31)	73.79 (0.87)
L-α-Amino-n-butyric acid	7.38 (0.07)	7.04 (0.08)
L-Valine	23.47 (0.22)	389.32 (4.57)
L-Cystine	54.11 (0.50)	66.79 (0.78)
L-Methionine	12.16 (0.11)	8.29 (0.10)
Cystathionine	934.82 (8.67)	12.88 (0.15)
L-Isoleucine	3.96 (0.04)	300.53 (3.53)
L-Leucine	11.99 (0.11)	482.43 (5.67)
L-Tyrosine	22.28 ( 0.21)	220.76 (2.59)
β-Alanine	766.83 (7.11)	8.73 (0.10)
L-Phenylalanine	N/D	302.99 (3.57)
D,L-β-Aminoisobutyric acid	69.26 (0.64)	12.29 (0.14)
L-Homocystine	65.50 (0.61)	1.77 (0.02)
γ-Amino-n-butyric acid	196.52 (1.82)	0.49 (0.01)
Ethanolamine	46.47 (0.43)	58.79 (0.69)
Aminonium chloride	292.10 (2.71)	268.26 (3.16)
δ-Hydroxylysine	70.99 (0.66)	95.21 (1.12)
L-Ornithine	30.46 (0.28)	31.20 (0.37)
L-Lysine	494.96 (4.59)	464.03 (5.45)
1-Methyl-L-histidine	42.17 (0.39)	3.83 (0.04)
L-Histidine	152.82 (1.42)	147.19 (1.73)
3-Methyl-L-histidine	0.88 (0.01)	6.06 (0.07)
L-Anserine	24.91 (0.23)	8.49 (0.10)
L-Carnosine	4.26 (0.04)	1.81 (0.02)
L-Arginine	542.15 (5.03)	571.20 (6.71)
Total	10786.98 (100)	8511.33 (100)

¹⁾N/D : 미검출 ²⁾% 총 아미노산 함량

표 2에 나타난 바와 같이, 전체적인 함량은 아므르 불가사리가 10,786.95 mg%로서 별 불가사리의 8,511.33 mg%보다 많은 함량이였다. 아므르 불가사리의 경우 프롤린이 전체 구성 아미노산의 32.71%인 3,528.21 mg%로 가장 많았고, 글루탐 산은 2,552.45 mg% (23.65%)로서 다음으로 많은 함량이였다. 그외 시스타티오닌(cystathionine)이 8.37%, β-알라닌이 7.11%, L-아르기닌이 5.03% 및 L-리신이 4.59% 순이었다. 한편 별 불가사리의 경우 글리신이 1,025.11 mg%로서 전체 구성 아미노산의 12.04%를 차지하였다. 다음으로 글루탐산 (11.64%), L- 아르기닌 (6.71%), L-트레오닌 (6.35%), 아스파르트산 (5.97%) 및 L-루신 (5.67%) 순이었다. 이상의 결과로 볼 때 불가사리의 종류에 따라 구성하고 있는 아미노산의 종류도 약간 다름을 알 수 있었다. 특히 콜라겐의 구성성분인 아미노산류가 많이 존재하고 있어 기능성소재로서의 가치가 있었다.

한편, 카로티노이드는 광선에 의해서 유발되는 광감광 산화반응에 있어서 활성화 산소에 대해 강력한 소거제로 작용한다. 또한 광감광 산화반응시 형성되는 활성화된 일중항 산소와 반응하여 전체적인 반응의 진행을 억제하고, 자유 라디칼 반응의 억제 기작에 의해 발생되는 활성산소로부터 세포와 조직을 보호하는 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 뿐만 아니라 암발생을 억제하고 강력한 항산화력으로 동물의 번식 촉진, 성장률 개선, 질병발생 억제, 어육의 색상개선 등 유용한 기능성을 나타내는 것으로 알려지고 있다. 따라서 이러한 물질의 함량을 분석하는 것은 추후 기능성 물질분석의 기초자료로 이용하기 위하여 가치 있을 것으로 생각되어 분석을 하였으며 그 결과는 표 3에 나타내었다.

	아므르 불가사리	별 불가사리
총 카로티노이드	0.62 mg%	5.88 mg%

표 3에 나타난 바와 같이, 아므르 불가사리에는 총 카로티노이드 함량은 0.62 mg%로 적은 반면, 별 불가사리에는 5.88 mg%로 상당히 많이 함유되어 있었다. 이것은 진주담치 수컷 (male) 이 1.1 mg%, 암컷 (female) 이 3.2 mg%인 것에 비해 별 불가사리에 더 많은 양이 함유되어 있음을 알 수 있었다. 따라서, 안정성만 확보된다면 의약용제, 사료첨가물, 건강식품 등에 이용가치가 클 것으로 기대된다.

실시예 2: 본 발명 불가사리의 용매순차추출

상기로부터 알 수 있는 바와 같이, 불가사리는 수분과 회분을 제외하면 단백질 함량이 가장 많았다. 따라서, 서브틸리신 A(Subtilisin A) 성분이 함유된 단백질가수분해효소를 처리할 경우 생리활성물질의 추출효율을 높일 수 있으리라 사료되어 효소분해 처리조건 및 수율을 비교 분석하였다. 단백질분해효소에 의한 추출시간에 따른 아므르 및 별 불가사리의 가수분해율은 아미노질소의 함량을 측정함으로써 조사하였고, 단백질분해효소로써 알칼라아제 0.6L^TM (Alcalase 0.6L^TM, 노보엔자임 社, 덴마크)와 프로타멕스^TM (Protamex^TM, 노보엔자임 社, 덴마크)를 사용하였다.
알칼라아제 0.6L^TM는 Bacillus licheniformis 균으로 부터 추출된 효소로서, 효소의 주성분은 서브틸리신 A(Subtilisin A)이며, 효소분해의 특성은 엔도프로티아제(endoprotease)이며, 최적활성적온은 55-77℃ 범위이며, 최적 pH는 6.5-8.5 범위입니다. 효소의 평균분자량은 27,300 이며, 기질에 반응하는 촉매의 활성부위는 serine 아미노산 부위이다.
프로타멕스^TM 는 Bacillus licheniformis, Bacillus amylosiqufaciens 균으로 부터 추출된 식품가수분해를 위해 사용하는 Bacillus protease complex이며, 최적온도는 35-60℃, 최적 pH는 5.5-7.5 범위이다.

도 1과 2에 나타난 바와 같이, 단백질분해효소를 처리한 경우 대조군보다 가수분해율이 더 높았는데, 특히 알칼라아제 0.6L^TM 보다 프로타멕스^TM를 사용한 처리군의 가수분해율이 더 높았다. 그리고 반응 5시간까지 분해율이 계속 증가하다가 6시간째 감소하는 경향을 보였다. 그러나 효소를 첨가하지 않은 대조군의 경우는 추출 6시간동안 가수분해율이 낮아 자가소화효소에 의한 가수분해는 거의 없는 것으로 판단되었다. 또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 50℃ 에서 단백질분해효소를 처리 하지 않은 대조군에서는 반응 1시간 후에 60.2 mg% 까지 아미노질소 함량이 증가하였으며, 그 후 반응 5시간까지는 거의 일정수준의 범위에 있었다. 알칼라아제 0.6L^TM을 처리한 경우와 비교해 보면 반응초기에는 불가사리의 자가소화효소의 효과가 있음을 알 수 있었다. 그리고 4℃ 에서 효소 무처리군은 자가소화효소의 효과는 거의 볼 수 없었다.

도 3에는 불가사리로부터 용매순차추출을 통한 생리활성물질의 추출 공정도를 도시하였다. 도 3의 공정도에 따라, 단백질분해효소를 5시간 처리한 후 용매별로 추출을 실시하고 각 용매 분획별 수율과 추출효율을 비교하고, 추출 구간별 수율은 표 4에 나타내었다.

용매	아므르 불가사리 (Asterias amurensis)			별 불가사리 (Asterina pectinifera)
	대조군¹⁾	단백질분해효소		대조군	단백질분해효소
	대조군¹⁾	알칼라아제 0.6L^TM	프로타멕스^TM	대조군	알칼라아제 0.6L^TM	프로타멕스^TM
물	15.31	17.42	17.71	18.19	19.94	20.78
메탄올	9.27	11.13	12.16	5.50	7.70	7.93
아세톤	1.44	1.68	1.66	0.21	0.36	0.34
에틸 에테르	0.12	0.18	0.19	0.04	0.06	0.06
에틸 아세테이트	0.05	0.09	0.09	0.02	0.05	0.04
총	26.19	30.50	31.81	23.94	28.66	29.11
잔여물	73.81	69.50	68.19	76.94	71.34	70.89

¹⁾단백질분해효소의 무처리 ; 단위 : w/w%

표 4에 나타난 바와 같이, 각 용매별 추출물을 살펴보면, 두 종 모두 물 추출물에서 15.31∼20.78%로 가장 높은 수율을 보였고, 다음으로 메탄올, 아세톤 추 출물 순이었고, 에틸 에테르, 에틸 아세테이트 추출물은 수율이 매우 낮았다. 그리고 효소 무처리군에 비해 효소를 첨가한 경우 효소가 단백질을 분해하거나 색소등을 분리하여 추출물의 색깔이 확실히 짙었고, 수율도 높게 나왔는데, 알칼라아제 0.6L^TM 보다 프로타멕스^TM를 처리했을 때 더 높은 수율을 나타내어 프로타멕스^TM에 의한 추출 효과가 우수함을 알 수 있었다.

실시예 3: 본 발명 불가사리 용매추출물의 항균활성 검정

상기 실시예 2에서 서브틸리신 A(Subtilisin A) 성분이 함유된 단백질분해효소를 처리하여 추출한 불가사리 용매추출물의 항균력을 페이퍼 디스크(paper disk) 법에 따라 검색하였다. 실험균주로서 식품부패, 병원성 및 식중독 유발균류 중 그람 양성균으로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스타필로커커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 그람 음성균으로는 이 콜라이(E. coli), 살모넬라 티피무리움(Salmonnella typhimurium), 엔테로박터 아에로제네스(Enterobacter aerogenes) 7종, 피부염에 관련된 진균류 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 2종 등 총 9종을 사용하였다. 그 결과를 표 5와 6에 나타내었다.

아므르 불가사리의 용매 추출물의 단백질분해효소처리 후 항균활성 검정

용매	㎍/ disk	프로타멕스^TM처리
		투명환 (mm)
		그람 양성균				그람 음성균			곰팡이
		B.subtilis	B.cereus	S.aureus	L.monocytogenes	E.aerogenes	E.coli	S.typhimurium	A.flavus	A.niger
물	500	-¹⁾	-	-	-	-	-	-	-	-
	1000	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	1500	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	2000	-	-	-	-	-	-	-	-	-
메탄올	500	9	9	8.5	8.5	8.5	8.5	8.5	8.5	9
	1000	11	10	10	9	10	11	9.5	9	9
	1500	14	12	13	12	12	13	10	10	10
	2000	15	15	16	13	13	15	13	12	12
아세톤	500	8.5	8.5	-	8.5	-	-	9	-	-
	1000	10	9	9	9	8.5	9	9	9	9
	1500	12	9.5	10	10	10	11	10	9	9
	2000	13	10	11	12	11	12	11	11	10
에틸 에테르	500	8.5	-	-	-	-	8.5	-	-	8.5
	1000	10	9	9	8.5	9	10	9	9	9
	1500	10	11	10	10	9	10	10	10	9
	2000	11	12	11	11	9	12	10	11	11
에틸 아세테이트	500	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	1000	10	9	-	9	-	10	-	-	-
	1500	11	10	9	10	-	11	-	-	9
	2000	12	10	9	10	-	11	9	-	10

¹⁾- : 미검출

별 불가사리의 용매 추출물의 단백질분해효소처리 후 항균활성 검정

용매	㎍/ disk	프로타멕스^TM처리
		투명환 (mm)
		그람 양성균				그람 음성균			곰팡이
		B.subtilis	B.cereus	S.aureus	L.monocytogenes	E.aerogenes	E.coli	S.typhimurium	A.flavus	A.niger
물	500	-¹⁾	-	-	-	-	-	-	-	-
	1000	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	1500	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	2000	-	-	-	-	-	-	-	-	-
메탄올	500	9	9	9	9	9	8.5	8.5	8.5	8.5
	1000	11.5	11	10	10	10	11	10	9	9
	1500	14	13	14	13	12	13	12	11	12
	2000	16	15	17	14	13	16	14	14	14
아세톤	500	8.5	9	10	9	8.5	8.5	8.5	-	-
	1000	10	10	11	9.5	9	9	9	-	10
	1500	13	11	12	10	10	10	10	9	11
	2000	14	13	13	12	11	12	10	11	12
에틸 에테르	500	8.5	8.5	8.5	8.5	-	8.5	-	-	-
	1000	9	9	10	9	-	9	8.5	-	9
	1500	10	10	11	10	9	10	9	-	10
	2000	12	11	12	11	10	10	10	10	11
에틸 아세테이트	500	-	8.5	-	-	-	-	-	-	-
	1000	9	9	8.5	9	-	-	-	-	9
	1500	10	10	9	9	-	9	-	-	9
	2000	11	11	10	10	-	10	-	-	10

¹⁾- : 미검출

표 5와 6에 나타난 바와 같이, 아므르 불가사리보다 별 불가사리에서 항균성이 더 강하였다. 추출 용매별로 살펴보면 메탄올, 아세톤이 가장 우수하였고, 다음으로 에틸 에테르, 에틸 아세테이트 순이었고, 물 추출물은 항균성이 전혀 나타나지 않았다.

실시예 4: 본 발명 불가사리 용매추출물의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 를 통한 분리 및 정제

상기 실시예 3에서 생리활성이 검정된 본 발명 불가사리 용매추출물로부터 생리활성물질을 분리하기 위해 도 4의 단계 1에 따라 단백질분해효소(프로타멕스^TM)를 처리한 효소군으로부터 메탄올 및 아세톤 순서로 용매순차추출 후 CH₃Cl₃: MeOH (10:0, 9:1, 7:3, 5:5, 3:7, 1:9, 0:10) 용매계로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography I(200 mesh))를 이용하여 각 분획별로 50 mL씩 취하여 총 7개의 분획으로 분리 및 정제하였다. 그 후, 상기 분획의 항균력을 검색하기 위해 표 7에 기재된 균주에 대해 항균활성을 페이퍼 디스크법에 따라 1000 ㎍/disk의 농도에서 측정하였으며, 그 결과는 표 8∼11에 나타내었다.

항균 활성 검정에 사용된 실험균주¹⁾

균주	기탁번호	배양배지	비고
그람 양성균
Bacillus subtilis	KCTC 1021	Muller-Hinton agar	37℃
Listeria monocytogenes	KCTC 3710	∥	∥
Propionibacterium acnes	KCTC 3314	GAM Semisolid	∥
그람 음성균
Escherichia coli	KCTC 1924	∥	37℃
Salmonella typhimurium	KCTC 2515	∥	∥
곰팡이
Epidermophyton floccosum	KCTC 6586	Sabouraud Dextrose agar	28℃
Microsporum audouinii	KCTC 6346	∥	∥
Trichophyton ferrugineum	KCTC 6351	∥	∥
Trichophyton mentagrophytes	KCTC 6316	∥	∥
Trichophyton rubrum	KCTC 6345	∥	∥

¹⁾Korean Collection of Type Culture(KCTC).

별 불가사리의 메탄올 추출물의 분획별 항균활성

분획번호	투명환 (mm)¹⁾
	그람 양성균			그람 음성균		곰팡이
	B.subtilis	L.monocytogenes	P.acnes	E.coli	S.typhimurium	E.floccosum	M.audouinii	T.ferrugineum	T.mentagrophytes	T.rubrum
1	-²⁾	-	11	-	9	-	-	-	-	-
2	-	-	11	9.5	9	-	-	-	9	-
3	10.5	13	14	11.5	10	16.5	10	11	10	12.5
4	10	10	12	11	9	16.5	12.5	11.5	10	9.5
5	-	-	11	-	-	10	-	-	-	-
6	-	-	10	-	-	-	-	-	-	-
7	-	-	10	-	-	-	-	-	-	-

¹⁾페이퍼디스크법에 따라 검출됨. ²⁾- : 미검출.

별 불가사리의 아세톤 추출물의 분획별 항균활성

분획번호	투명환 (mm)¹⁾
	그람 양성균			그람 음성균		곰팡이
	B.subtilis	L.monocytogenes	P.acnes	E.coli	S.typhimurium	E.floccosum	M.audouinii	T.ferrugineum	T.mentagrophytes	T.rubrum
1	-²⁾	-	10	-	-	-	-	-	-	-
2	-	-	11	10	-	-	-	-	-	-
3	9	11	12	11	9	13	9.5	9.5	9.5	9
4	11	11	12	9.5	9	15	11	10.5	9.5	11.5
5	-	-	12	11	-	9	-	11.5	-	9
6	-	-	11	-	-	-	-	-	-	-
7	-	-	9	-	-	-	-	-	-	-

¹⁾페이퍼디스크법에 따라 검출됨. ²⁾- : 미검출.

아므르 불가사리의 메탄올 추출물의 분획별 항균활성

분획 번호	투명환 (mm)¹⁾
	그람 양성균			그람 음성균		곰팡이
	B.subtilis	L.monocytogenes	P.acnes	E.coli	S.typhimurium	E.floccosum	M.audouinii	T.ferrugineum	T.mentagrophytes	T.rubrum
1	-²⁾	-	10	-	-	-	-	-	-	-
2	-	-	10	-	-	-	-	-	-	-
3	10.5	12.5	12	10.5	9	12.5	9	9	10	11
4	-	11	12	9	9	16.5	12	10.5	10	12
5	-	-	-	-	-	12.5	9	-	-	9
6	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
7	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

¹⁾페이퍼디스크법에 따라 검출됨. ²⁾- : 미검출.

아므르 불가사리의 아세톤 추출물의 분획별 항균활성

분획번호	투명환 (mm)¹⁾
	그람 양성균			그람 음성균		곰팡이
	B.subtilis	L.monocytogenes	P.acnes	E.coli	S.typhimurium	E.floccosum	M.audouinii	T.ferrugineum	T.mentagrophytes	T.rubrum
1	-²⁾	-	10	-	-	-	-	-	-	-
2	-	-	10	-	-	-	-	-	-	-
3	9.5	11	12	11	10	12	9	10	9.5	9.5
4	-	-	11	9	-	13	10	9	9	9
5	-	-	10	-	-	9	-	-	-	9
6	-	-	10	-	-	-	-	-	-	-
7	-	-	10	-	-	-	-	-	-	-

¹⁾페이퍼디스크법에 따라 검출됨. ²⁾- : 미검출.

표 8∼11에 나타난 바와 같이, 별 불가사리 및 아므르 불가사리의 모든 추출물의 3번과 4번 분획에서 대부분 높은 항균효과가 나타났다. 여드름균인 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes) 는 별 불가사리의 메탄올 추출물에서 항균효과가 가장 높게 나타났고, 특히 백선균인 에피더모파이톤 플로코숨(Epidermophyton floccosum) 에 대해서 메탄올이나 아세톤 추출물 모두 3번과 4번 분획에서 가장 높은 항균효과를 나타내어 전체적으로 3번과 4번 분획이 가장 우수한 항균성 추출물임을 알 수 있었다.

상기 실시예 및 실험예를 통하여 살펴본 바와 같이, 본 발명은 서브틸리신 A(Subtilisin A) 성분이 함유된 단백질분해효소 처리에 의한 불가사리 유래의 항균성 추출물에 관한 것으로, 불가사리에 단백질분해효소를 처리하여 항균활성이 있는 신규한 생리활성물질을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 불가사리 유래의 항균활성물질을 유효성분으로 하는 항균제품을 제조할 수 있어 기능성제품제조산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

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아므르 불가사리(Asterias amurensis) 또는 별 불가사리(Asterina pectinifera)에 증류수를 첨가하고 서브틸리신 A(Subtilisin A) 성분이 함유된 단백질분해효소를 첨가하여 50℃에서 3-5시간 동안 교반한 후 원심분리하여 분리된 잔사에 3배(v/w)의 메탄올 또는 아세톤을 첨가하여 4℃에서 5-6시간 동안 교반한 후, 진공여과하여 얻은 여액을 5:5 또는 7:3의 비율로 혼합된 CH₃Cl₃:MeOH 용매계로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(200 메쉬)를 수행하여 얻은 분획물을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 항균제용 조성물.
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