KR100546009B1

KR100546009B1 - 무세포 단백질 합성용 세포추출물 함유제제 및 무세포단백질 합성수단

Info

Publication number: KR100546009B1
Application number: KR1020017014336A
Authority: KR
Inventors: 야에타엔도; 쉬게미치니쉬카와
Original assignee: 셀프리 사이언스 코 엘티디
Priority date: 1999-05-11
Filing date: 1999-07-29
Publication date: 2006-01-25
Also published as: US6905843B1; AU4930199A; EP1176210B1; EA006162B1; EP1176210A4; WO2000068412A1; EP1176210A1; DE69940525D1; EA200101189A1; AU765632B2; KR20010112953A; CA2373057A1; US7235382B2; ATE424467T1; US20050186655A1

Abstract

생물체로부터 자기의 단백질합성반응의 억제에 관여하는 시스템을 배제함으로써 조제한 세포추출물을 함유한 무세포 단백질 합성용 세포추출물 함유제제와, 무세포 단백질 합성용의 반응조를 구비한 무세포 단백질합성반응장치와, 그들에 이용하는 키트가 개시되어 있다. 이 제제는 실온보존가능하고 또한 그 세포추출물의 생물학적기능을 유지한 상태의 제제로서 조제된다. 또한, 자기의 단백질합성반응의 억제물질이 실질적으로 배제된 세포추출물로 이루어지는 무세포 단백질 합성수단에 있어서, 적어도 합성반응의 극형이 되는 mRNA, 에너지재생계효소, 기질, 에너지원 중에서 선택된 요소에 대하여 추가·보존·교환·배출 중에서 선택되는 처치를 도입하는 연속 무세포 단백질 합성수단이 개시되어 있다.

Description

무세포 단백질 합성용 세포추출물 함유제제 및 무세포 단백질 합성수단{Preparation containing cell extracts for cell-free protein synthesis and means for synthesizing cell-free protein}

본 발명은 무세포 단백질합성계에 사용하는 세포·조직으로부터 조제한 무세포 단백질 합성용 세포추출물 함유제제, 이 제제를 안정화하여 실온보존·실온수송을 가능하게 한 제제, 및 이들 제제를 이용한 무세포 단백질 합성수단·장치의 제공에 관한 것이다.

세포내에서 행해지고 있는 단백질의 합성반응은 먼저 유전정보를 가진 DNA로부터 그 정보가 mRNA에 전사된 후 리보솜이 mRNA의 정보를 번역하여 단백질을 합성하는 공정으로 진행되고 있다. 현재, 이 세포내에 있어서의 단백질합성을 시험관 등의 생체외에서 행하는 방법으로서는 예를 들면 리보솜을 생물체로부터 추출하여 이들을 사용하여 시험관내에서 단백질합성을 행하는 무세포 단백질합성법의 연구가 많이 행해지고 있다(특개평 6-98790, 특개평 6-225783, 특개평 7-194, 특개평 9-291, 특개평 7-147992). 이 방법에는 리보솜의 원료로서 대장균, 배아, 집토끼망상적혈구 등이 사용되어 왔다.

이들 무세포 단백질합성시스템에 사용하는 무세포 단백질 합성용 세포추출물이나 번역주형을 제외한 다른 합성기질이나 에너지원 및 각종이온 등 번역반응에 불가결 또는 동반응 효율을 높이는 화학물질을 함유한 무세포 단백질합성반응액은 상온에서는 불안정하고, -80℃이하의 초저온에서만 안정적인 보존이 가능하였다.

무세포 단백질합성시스템은 중합체 합성반응속도와 번역반응의 정확성에 있어서 소의 세포에 필적하는 고성능을 유지하며 또한 목적으로 하는 단백질을 복잡한 정제공정을 실시하지 않고도 얻을 수 있는 유용한 방법이다. 그 때문에 그 합성시스템을 보다 유용하게 산업상에 적용하기 위하여 합성효율의 향상에 관한 몇가지 발명이 개시되어 왔다. 그러나 산업상의 유용성 향상을 위해서는 합성효율뿐만 아니라 합성시스템에 사용하는 각종의 물질을 안정적으로 고품질을 유지하여 공급하는 것이 필요하다.

본 발명의 목적은 무세포 단백질합성시스템에 필요한 무세포 단백질 합성용 세포추출물, 번역주형을 제외한 다른 합성기질, 에너지원 및 각종이온 등 번역반응에 불가결 또는 동반응효율을 높이는 화학물질을 함유한 무세포 단백질 합성용 세포추출물 함유제제를 상온하에서도 안정적이며 그 제제의 생물학적 기능을 유지가능하게 하는 수단을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 무세포 단백질 합성용 세포추출물 함유제제를 함유한 키트를 안정적으로 보존·공급함으로써 무세포 단백질합성의 작업공정을 간편화하는 수단을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 무세포 단백질 합성용 세포추출물 함유제제를 사용한 생산성·생산량·간편성을 개선한 무세포 단백질 합성수단을 제공하는 것이다.

발명의 개시

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 검토한 결과, 그 수단의 하나로서 원료인 무세포 단백질 합성용 세포의 자기 단백질합성반응의 억제에 관여하는 시스템을 배제함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 또한 본 발명의 다른 수단의 하나는 조제한 무세포 단백질 합성용 세포추출물 또는 무세포 단백질 합성용 세포추출물과 무세포 단백질합성반응시스템에 관여하는 물질에 대하여 동결건조 등의 처리를 도입하여 건조제제로 함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 또한, 본 발명의 또다른 수단의 하나는 상기수단에 의하여 획득한 무세포 단백질합성시스템을 사용한 무세포 단백질합성방법으로서 분자체의 원리를 응용한 무세포 단백질 합성수단을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 무세포 단백질 합성수단은 투석막을 이용한 연속 무세포 단백질 합성수단으로서 선택된 요소를 추가 도입하는 것 및 그를 위한 장치에 관한 것이다.

도면의 간단한 설명

제 1도는 동결건조한 밀배아 추출물을 -80℃로 2개월간 보존한 것과 동결건조하지 않은 밀배아추출물을 액체질소중에서 2개월간 보존한 것과의 단백질합성활성을 비교한 도면이다. 도면중 각 부호는 액체질소중에 종래법으로 2개월간 보존한 추출물(--), 동결건조 후 동기간 보존한 것(■--■)을 표시한 것이고, 세로축은 단백질에 취입된 방사활성(DPM/5㎕당의 반응액)을, 가로축은 26℃에 있어서의 반응시간을 표시한 것이다.

제2도는 동결건조추출물의 보존온도의 단백질합성활성에 주는 영향을 도시한 것이다. 도면중 각 부호는 실온에서 1개월간(--), 4℃로 동기간(■--■), -80℃로 동기간 (●--●) 보존한 것을 표시한 것이다.

제3도는 동결건조한 밀 무세포 단백질 합성용액의 뱃치반응시스템에 있어서의 단백질합성활성을 도시한 것이다. 도면중 각 부호는 액체질소중에 종래법으로 2개월간 보존한 추출물(■--■), 동결건조후 동기간 보존한 것(--)을 표시한 것이다.

제 4A도는 오픈컬럼(open column)을 이용한 무세포 단백질합성의 결과를 나타낸 사진도이다. 레인 1(lane 1)은 주형이 없는 경우 레인 3은 컬럼법으로 12시간 합성한 결과이고 레인 2는 비교예로서 종래의 투석법을 사용하는 연속식 무세포 단백질합성법으로 동시간 합성한 결과를 나타낸 것이다. 제 4A도의 최좌측 레인은 분자량마커(marker)이며, 위에서부터 94kDa, 67kDa, 43kDa, 30kDa, 20.1kDa를 나타낸다. 화살표는 합성된 디히드로엽산 환원효소를 가리킨다.

제 4B도는 시판되고 있는 액체크로마토그래피를 이용한 무세포 단백질합성의 결과를 나타낸 사진도이다. 레인 1은 비교예인 종래의 투석법을 사용하는 연속식 무세포 단백질합성법으로 12시간 합성한 결과이다. 레인 2는 액체크로마토그래피를 이용한 무세포 단백질합성법으로 동시간 합성한 결과이다. 화살표는 합성된 디히드로엽산 환원효소를 가리킨다.

제5도는 카트릿지장치의 사시도이다.

제6도는 카트릿지장치의 중앙단면도이다.

제5도 및 제6도의 각 부호의 의미는 다음과 같다.

1: 함침조

2: 덮개부

3: 투석외액

4: 투석외액의 액면

5: 기질 및/또는 에너지원 등의 공급용의 도입구

6: 기질 및/또는 에너지원 등의 공급용의 함침조내 출구

7: 유로

8: 투석외액배출용의 함침조내 도입구

9: 투석외액배출용의 외부배출구

9a: 투석외액배출용의 외부배출구

10: 유로

11: mRNA 및/또는 에너지재생계 효소공급용의 도입구

12: 투석막기능을 가진 매체

13: 도입구(11)의 도입부

14: 막류구(膜留具)

15: 막단부(膜端部)

16: 마그네틱 스탤러

17: 도입구(5)의 도입부

18: 함침조내의 출구(6)의 도입부

19: 합침조내의 도입구(8)의 도입부

20: 외부배출구(9)의 도입부

20a: 외부배출구(9a)의 도입부

제7도는 mRNA 및 크레아틴키나제의 추가첨가에 의한 단백질의 합성효과의 유지를 도시한 것이다. 도면중 ○--○ 은 CAP부착의 디히드로엽산 환원효소를 코딩하는 mRNA와 크레아틴키나제를 추가첨가,△--△은 mRNA만을 추가첨가, ▽--▽ 은 크레아틴키나제만을 추가첨가, --은 추가첨가하지 않은 것, 화살표는 추가첨가시를 표시한 것이다.

제8도는 투석외액의 교환에 의한 단백질의 합성효과의 유지를 도시한 것이고, ○--○ 은 투석외액의 교환을 한 것, △--△ 은 교환하지 않은 것, 화살표는 교환시를 표시한 것이다.

제9도는 자동화장치에 의한 단백질의 합성효과의 유지를 도시한 것이다. 도면중 ○--○은 CAP부착의 디히드로엽산 환원효소를 코딩하는 mRNA와 크레아틴키나제를 추가첨가, △--△ 은 mRNA를 추가첨가하지 않은 것을 표시한 것이며, 흰 화살표는 합성산물인 디히드로엽산 환원효소, 또한, ★표는 추가한 크레아틴키나제의 염색밴드를 표시한 것이다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

1) 무세포 단백질 합성용 세포에 있어서의 자기단백질 합성반응의 억제 에 관여하는 시스템의 배제

본 발명의 한 수단인 원료인 무세포 단백질 합성용 세포의 자기 단백질 합성반응의 억제에 관여하는 시스템을 배제하는 것이라 함은 원료세포 자신이 함유하는 또는 유지하는 자기 단백질의 합성을 제어하는 수단을 제외하는 것을 의미한다. 특히 본 발명자가 알아낸 이 관여하는 시스템을 배제한다는 것은 리보솜, 번역단백질인자, mRNA, tRNA에 작용하여 그 기능을 억제하는 물질의 배제를 의미한다.

원료세포 자신이 함유하는 또는 유지하는 단백질합성기능을 억제하는 물질이란, 예를 들면 종자의 배유에 대량으로 존재하는 것으로 알려져 있는 리보솜의 기능을 억제하는 트리틴(Massiah, A.J., and Hartely, M.R.(1995) Planta, 197, 633-640), 티오닌이라고 불리는 시스틴을 많이 함유한 단백질(Brummer, J., Thole, H. and Kloppstech, K.(1994) Eur., J. Biochem, 219, 425-433), 리보뉴클레아제(Matsushita S., Mem. Res. Inst. Food Sci. kyoto Univ., No. 19, 1~) 등이 있다.

배아의 단리단계에서 혼입하는 배유국재성의 배아 무세포 단백질합성억제단백질의 1군, 예를 들면 트리틴, 티오닌, 리보누클레아제 등을 완전히 배아시료로부터 배제함으로써 단백질합성의 불활성화반응을 배제할 수 있다. 즉, 본 발명 수단의 하나는 무세포 단백질 합성용의 세포조직으로부터 추출물을 조제함에 있어서 생체조직이나 세포의 손상시에 발동하는 자기단백질 합성반응 억제기구, 즉, 생리적으로 구비된 대병원자기방어기구로서의 자기단백질 합성반응 파괴기구를 제거하는 기술, 파쇄에 따라 유기되는 단백질합성반응억제활성을 중화시키거나 또는 제거하는 기술에 의하여 달성된다.

본 발명의 원료세포는 무세포 단백질 합성시스템에 널리 사용되고 있는 배아, 대장균 및 망상적혈구나 암세포등 외에 다른 생물에서 유래하는 무세포 단백질 합성용세포도 기본적으로 사용가능하다. 바람직한 태양으로서는 배아이고, 밀, 보리, 벼, 옥수수, 시금치, 메밀 등에서 유래하는 것이 예시된다.

이들 원료세포로부터의 본발명의 무세포 단백질 합성용 세포추출물의 조제는 이미 알려진 각종의 방법(Johnston, F.B. et a1.(1957) Nature, 179, 160-161)과 조합하여 행할 수 있다. 본 발명의 수단의 하나인 자기단백질의 합성을 제어하는 수단을 제외하기 위한 유용한 수단은 계면활성제, 특히 비이온성의 계면활성제를 사용하여 원료세포를 처리하는 것이다. 비이온성의 계면활성제인 경우에는 널리 이용할 수 있으나, 적절한 것으로서는 폴리옥시에틸렌유도체인 브릿지(Brij), 트리톤(Triton), 노니뎃(Nonidet) P-40, 트윈(Tween)등이 예시된다. 그 중에서도 노니뎃 P-40이 가장 적합하다. 이들 비이온성 계면활성제는 예를 들면 0.5%의 농도로 사용된다.

처리는 원료세포로서 예를 들면 밀배아를 사용한 경우, 이미 알려진 수단으로 밀, 부선, 체로 치기의 공정에 의하여 배아추출물을 회수한다. 이 배아추출물에 대하여 혼입되어 있는 배유부분을 배제하기 위하여 계면활성제에 의한 세정을 수회 행하고 세정액이 백탁하지 않게 될 때까지 세정한다. 이 처리는 초음파처리를 겸하는 것이 더 좋으며 더욱 완전한 효과를 얻을 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 배아추출물은 트리틴 등의 내인성의 특이적 억제 물질을 함유한 배유가 거의 완전히 제거되어 배아는 실질적으로 순화되어 있었다. 항트리틴항체를 사용한 이뮤노플로트법으로 트리틴을 지표로 하여 초음파 세정 전후의 배유단백질의 혼입도를 검정하였으나 초음파 세정에 의하여 트리틴함량이 검출한도 이하로 되어 있는 것이 확인되었다. 이 때문에 그 배아추출물에는 배유단백질의 혼입이 거의 없고, 배유에 존재하는 다른 단백질합성 불활성화 인자인 티오닌이나 리보뉴클레아제도 배아추출물로부터 제거되어 있는 것이 확인되었다. 또 얻어진 배아추출물은 리보솜이 실질적으로 탈아데닌화되지 않을 정도로 순화되어 있고 리보솜의 탈아데닌화율이 7%미만, 바람직하기는 1% 이하로 되어 있었다.

2) 제제 안정화 수단

본 발명의 다른 수단은 이렇게 하여 조제한 무세포 단백질 합성용 세포추출물의 제제적 안정화 수단을 도입하는 것이다. 종래의 무세포 단백질 합성용 세포추출물의 보존방법은 상기와 같이 -80 ~ -196℃ 근처였으나, 그 수단의 도입에 의하여 무세포 단백질 합성용 세포추출물을 함유하는 제제는 실온에서 안정적으로 보존할 수 있다. 본 발명제제가 실온보존이 가능한 기술을 달성한 것은 산업상 유용하다.

무세포 단백질 합성용 세포추출물의 안정화의 수단은 제제를 건조제제, 특히 동결건조수단에 의하여 제제화하는 것이다. 동결건조는 자체공지의 방법을 이용할 수 있는데, 예를 들면 액체질소에 의하여 급속히 무세포 단백질 합성용 세포추출물을 동결시킨다. 건조는 예를 들면, 보통의 동결건조기를 이용하여 3시간 건조시킨다. 수분제거가 완성되어 얻어진 분말상 제제는 진공 또는 질소가스하에 봉관되어 제제화가 이루어진다.

상기제제는 물론 상기 본 발명의 수단이 실시된 무세포 단백질 합성용 세포추출물 단독으로 제제화되어도 좋으나 희망에 따라 무세포 단백질 합성시스템에 불가결한 물질, 예를 들면 합성기질, 아미노산, 에너지원 등을 선택하여 첨가 후 제제화하여도 좋다.

제제는 또한 희망에 따라 무세포 단백질합성시스템의 반응효율을 높이는 물질, 예를 들면 각종 이온화합물, 바람직하기는 칼륨이온화합물, 마그네슘이온화합물 등을 첨가할 수 있다.

제제는 또한 용해성을 높이는 물질 예를 들면 계면활성제, 상기 리보솜의 탈아데닌화를 방어하는 물질 등을 희망에 따라 첨가할 수 있다.

제제는 더욱 바람직하게는 무세포 단백질합성에 있어서 단순히 물을 첨가하는 것만으로 반응의 최적정화를 달성할 수 있는 조성으로 조정되어 있는 것이지만, 이것은 예를 들면 제품을 키트(kit)화 함으로써 필요시에 혼합하여 사용하여도 좋다. 물론 키트화에 있어서는 무세포 단백질 합성용 세포추출물 단독, 무세포 단백질합성시스템에 불가결한 물질, 무세포 단백질합성시스템의 반응효율을 높이는 물질, 그리고 반응의 최적정화에 적합한 수용액 등을 선택하여 키트화할 수 있다.

3) 무세포 단백질 합성수단 : 분자체 담체의 이용

또 다른 본 발명은 무세포 단백질합성시스템에 사용하는 반응조가 분자체 가능한 담체에 의하여 조제될 수 있다. 이 담체로서는 분획분자량이 10.000이하의 것에 적합한 것이면 특별히 한정되지 않는다. 담체 재료는 예를 들면 다공성 겔(gel)여과입자이고 구체적으로는 세파덱스 G1~G25 등이 예시된다. 담체는 물로 조제하여도 좋으나 보다 바람직하게는 완충액에 의하여 평형화하여 사용하는 것이 좋다. 담체는 미리 반응조내에 충전하여 조제하여도 좋고 필요시에 조제할 수 있도록 반응조와 따로따로 키트화하여 조제하여도 좋다.

반응조는 크로마토그래피 바람직하기는 컬럼크로마토그래피가 좋다. 컬럼직경, 컬럼길이, 담체볼륨은 반응시간과 전개속도와의 조합에 의하여 적절히 조정할 수 있다. 반응조의 볼륨은 목적단백질의 합성량에 따라 적절히 선택가능하다. 반응조는 담체를 사전에 충전하고 희망에 따라 무세포 단백질합성시스템에 관여하는 재료물질을 담체 중에 분산시킨 것을 조제하기 위해서는 필요시에 개방가능한 적어도 2개의 개구를 담지한 것이 적당하다.

반응조에 담체를 충전하는 것은 필요시에 또는 사전에 가능하나, 무세포 단백질합성시스템에 관여하는 재료물질, 특히 합성기질 예를 들면 아미노산이나 에너지원 예를 들면 ATP, GTP, 크레아틴인산, 희망에 따라 첨가하는 무세포 단백질합성반응 효율을 높이는 이온성분은 충전담체중에 균일하게, 보다 바람직하게는 이들 물질의 담체의 이동상에서의 전개와 별도로 충전되는 무세포 단백질 합성용 세포추출물 및/또는 번역주형물질의 전개속도와의 연계를 고려한 반응효율을 계산하여 최적의 분산상태, 특히 국재적 균일분산을 행하는 것이 좋다.

여기서 희망에 따라 담체는 분자체담체만으로 구성하고 별도로 무세포 단백질 합성용 세포추출물, 합성기질, 에너지원, 희망에 따라 무세포 단백질합성반응효율을 높이는 이온성분을 적절히 선택하여 사전 조제한 제제를 필요시에 담체에 충전하고 번역주형물질을 충전하고 전개하여 무세포 단백질합성을 하는 것도 가능하다.

분자체 가능한 담체에 있어서의 이동상의 전개속도는 컬럼의 사이즈나 합성효율에 의하여 결정되나 일반적으로는 1시간당 컬럼내용량의 1/10~1/30 이다. 전개에 이용하는 용액은 합성기질 예를 들면 아미노산이나 에너지원 예를 들면 ATP, GTP, 크레아틴인산, 희망에 따라 첨가하는 무세포 단백질합성반응효율을 높이는 이온성분을 함유한 용액이지만 반드시 한정되지는 않는다. 또한, 전개는 바람직하게는 자동제어된 것이 좋으나 반드시 한정되지는 않는다.

합성반응은 담체를 충전한 반응조내에서 행하는 것이 좋다. 그러나, 충전조건을 고려하면 담체상등 중에서 또는 뱃치에 의하여 반응을 일으키고 그 후 다시 담체전개중에 합성반응을 일으키는 것도 가능하다.

본 발명의 합성반응은 리보솜과 같은 무세포 단백질 합성용 세포추출물이 이동상으로 이동하여 합성반응에 의하여 정제하는 부산물이 분별적으로 전개됨으로써 분리제거됨과 동시에 최적농도의 합성기질이나 에너지원 및 각종이온 등 번역반응에 불가결한 또는 동반응 효율을 높이는 화학물질의 공급하에 최대반응속도로 합성이 진행되는 것이 특징이다.

본 발명의 수단은 무세포 단백질합성시스템에 관여하는 재료물질의 충전·전개 그리고 합성단백질의 회수를 자동제어화하여 실시 가능하다. 자동화는 희망에 따라 공정단위마다 제어할 수 있으나 더욱 바람직하게는 이동상의 액 전개 속도가 자동제어되어 있는 것이 좋다.

본 발명의 수단은 각종의 이온 교환 컬럼(ion-exchange column)이나 어피니티 컬럼(affinity column) 등 목적으로 하는 단백질에 따라 자체 공지의 정제 수단을 연결함으로써 대량의 단백질을 고순도로 연속적으로 회수할 수 있다.

이렇게 하여 상기에 설명된 본 발명의 수단을 사용하면 목적하는 단백질을 효율적으로 제조하는 방법을 제공할 수 있다.

또한, 상기에 설명된 본 발명의 수단을 사용하면 목적하는 무세포 단백질 합성용의 장치를 제공할 수 있다.

또한, 추가로 상기의 설명된 본 발명의 수단을 사용하면 목적하는 무세포 단백질 합성에 적합한 세트로 된 키트를 제공할 수 있다.

4) 연속 무세포 단백질 합성수단(각 요소의 추가 첨가)

또한, 다른 본 발명은 무세포 단백질 합성시스템에 사용하는 각 요소를 추가 첨가함으로써 달성된다.

본 발명에 있어서는 반응 개시 후 필요시에 또는 계속적으로 합성 반응 주형이 되는 mRNA를 원료로서 첨가한 mRNA의 주형활성이 저하 경향을 나타내는 전후에 추가한다. 첨가는 희망에 따라 극소량을 계속적으로 첨가하여도 좋고 일정기간 마다 첨가하여도 좋다. 첨가량은 원료 mRNA량의 10분의 1부터 동량정도까지이다. 본 발명의 특징은 추가 첨가의 효과를 처음으로 확인한 것에 있고 첨가량과 첨가시기에 대해서는 합성효과의 확인을 가지고 당업자가 쉽게 변경·특징 가능하다. 그리고 다른 요소에 대해서도 마찬가지이고 이하의 기재에서 특히 기술되어 있지 않더라도 똑같은 의미이다.

본 발명에 있어서는 반응 개시 후 필요시 또는 계속적으로 에너지 재생시스템 효소를 원료로서 첨가한 에너지 재생시스템 효소 활성이 저하 경향을 나타내는 전후에 추가한다. 첨가는 희망에 따라 극소량을 계속적으로 첨가하여도 좋고 일정기간 마다 첨가하여도 좋다. 첨가량은 원료에너지 재생시스템 효소의 10분의 1부터 동량정도까지이다. 에너지 재생시스템 효소로서는 크레아틴키나제가 적당하다. 물론 본 화합물과 똑같은 기능을 가진 물질은 똑같이 에너지 재생시스템 효소로서 첨가할 수 있다. 그 첨가량과 방법은 합성량을 마커로 하여 필요시에 변경 가능하다.

mRNA의 추가 첨가와 에너지 재생시스템 효소의 추가 첨가는 따로 따로 행하여도 좋으나 바람직하기는 병용하는 것이 좋다. 첨가 방법도 계속적으로 또는 단속적으로 행하여도 좋다. 그 첨가량과 첨가방법은 합성량을 지표로 하여 필요시에 변경 가능하다.

본 발명은 상기 mRNA의 추가 첨가 및/ 또는 에너지 재생시스템 효소의 추가 첨가에 더하여 희망에 따라 기질 및/ 또는 에너지원이 고갈되는 것을 방지하는 공정 및/ 또는 부생성물을 배출하는 공정을 도입하는 것이 가능하다. 기질, 에너지로서는 각종 아미노산, ATP, GTP 등이 연속적으로 또는 단속적으로 추가 공급되는 것이 바람직하다. 그 첨가량으로서는 합성개시시의 각 물질의 농도 또는 거의 그것에 가까운 농도가 유지되는 것이 바람직하다. 그러나 이 첨가량도 또한 합성 효과를 지표로 하여 필요시에 추가·변경이 가능하다.

부생성물을 배출한다는 것은 AMP나 GMP등의 대사산물 및 인산이나 피로린산 등의 반응물을 배출하는 것이고 이러한 화합물은 계속적으로 또는 단속적으로 반응시스템로부터 배출되는 것이 좋다.

기질 및/또는 에너지원이 고갈되는 것을 방지하는 공정 및/또는 부생성물을 배출하는 공정으로서는 반응시스템의 반응매체를 계속적으로 또는 단속적으로 갱신해 가는 것이 좋다. 본 발명에서는 예를 들면 투석막을 사용하는 방법을 예시하고 있으나 그 경우에 예를 들면 투석외액을 계속적으로 또는 단속적으로 갱신 또는 교환해 간다.

이상과 같은 각요소의 추가·보존·교환·배출은 바람직하기는 자동화하여 처리하는 것이 좋다. 자동화의 수단은 자체공지의 컴퓨터시스템의 제어하에 있는 장치를 준비하여 각 요소의 추가·보존·교환·배출을 일체화하여 행한다. 이들에 사용하는 각 요소로서의 시약류는 키트화하여 조제되어 있는 것이 좋다.

5) 자동연속 무세포 단백질 합성장치

자동연속 무세포 단백질 합성장치는 자체공지의 컴퓨터 시스템의 제어하에 있고 각 요소의 추가·보존·교환·배출을 일체화하여 행하는 기능에 더하여 단백질합성에 가장 적합한 환경을 설정할 수 있는 기능을 아울러 갖는다.

즉, 복수의 투석용기를 예를 들면 15~37℃까지 온도 가변가능한 각각 독립된 복수의 전자냉각장치와 히터로 이루어지는 챔버(chamber)에 넣음으로써 희망하는 온도에 설정할 수 있고 목적하는 단백질의 합성에 가장 적합한 온도를 유지할 수 있다.

또, 투석용기의 투석외액을 계속적 또는 단속적으로 갱신 또는 교환해가는 방법으로서 예를 들면 연속가변 또는 단속적으로 폐리스터펌프 또는 실린지펌프 등의 분주장치를 사용하여 투석외액의 갱신 또는 교환의 속도를 예를 들면 0.1~1㎖/시간 동안 가변으로 함으로써 목적하는 단백질의 합성에 가장 적합한 조건을 선정할 수 있다.

또한, 주형 mRNA 및 에너지재생계 효소인 크레아틴키나제 등의 단백질합성에 필요한 물질을 복수의 투석용기안에 설치되는 단백질합성반응시스템 부분에 희망하는 시간마다 예를 들면 6~15시간동안의 간격을 두고 희망량을 추가 첨가할 수 있다.

상기 장치에 있어서 주형 mRNA, 에너지재생계 효소기질, 에너지원, 투석외액 등의 각 요소는 개별적으로 또는 혼합되어 투석용기에 접속된 저장용기에 보존되며 저장용기와 단백질합성반응시스템 부분 또는 투석용기와를 연결하는 유로를 통하여 공급된다. 이 저장용기는 바람직하기는 4℃로 유지되는 것이 좋다.

6) 연속 무세포 단백질 합성장치의 구성

본 발명의 구체화를 위한 연속 무세포 단백질합성시스템에 사용하는 장치의 일례로서 카트릿지장치를 설명한다. 단, 본 발명의 장치는 반드시 카트릿지식일 필요는 없다.

카트릿지장치는 일반적으로 유저 중공체인 함침조와 이것에 밀봉가능하게 장착되는 덮개부를 포함한 구성으로 이루어지는 연속 무세포 단백질합성장치이다. 이 장치는 기질 및/또는 에너지원의 도입수단인 입구와 투석외액의 함침조내의 액실에 연결되는 출구를 가진 유로, 투석외액 중의 대사산물 등의 배출수단인 함침조내의 액실에 존재하는 입구와 외부로 연결되는 출구를 가진 유로, mRNA 및/또는 에너지재생계효소의 도입수단인 입구와 투석외액의 함침조내의 액실에 존재하는 투석막의 기능을 가진 매체를 담지한다. 이하, 도면을 참조하면서 본 발명의 카트릿지장치를 상세히 설명하나 도시한 장치는 실시의 1 태양이고 이것에 한정되는 것은 아니다.

카트릿지장치는 일반적으로 유저중공체인 함침조(1)와 이것에 밀봉가능하게 장착되는 덮개부(2)를 포함하며, 함침조(1)내에는 투석외액(3)이 액면(4)까지 채워진다. 더욱 상세히 말하면, 에너지원 등의 도입수단인 입구(5)와 투석외액(3)의 함침조(1)내의 액실에 연결되는 출구(6)를 가진 유로(7), 투석외액(3)중의 대사산물등의 배출수단인 함침조(1)내의 액실에 존재하는 입구(8)와 외부로 연결되는 출구(9 및/또는 9a)를 가진 유로(10) 및 합성시스템물질의 도입수단인 입구(11)와 투석외액(3)의 함침조(1)내의 액실에 존재하는 투석막의 기능을 가진 매체(12)를 기본적인 구성으로하여 담지한다. 실시예의 1 태양으로서, 제 5도 및 제 6도에는 함침조가 원통체인 카트릿지장치를 도시하였으나 함침조의 형태는 원통체에 한정되지 않는다.

여기에서, 출구(6)는 투석외액(3)과 액중에서 연결되고 있으며 출구(6)의 단부는 함침조(1)의 상반부분에 위치하고 적어도 액면(4)보다는 하부에 위치한다. 입구(8)는 투석외액(3)과 액중에서 연결되어 있으며 입구(8)의 단부는 함침조(1)의 하반부분에 위치한다. 출구(6)의 단부의 위치와 입구(8)의 단부의 위치는 상하가 역전되어 있어도 좋다.

출구(9a)와 도입부(20a)는 액면(4)과 같은 부위에 접하고 또한 액면(4)보다 상부에 위치한다. 출구(9a)와 도입부(20a)에 의하여 배출은 자연유출이 가능하게 된다. 그리고 투석외액(3)중의 대사산물 등의 배출을 출구(9)와 그 도입부(20)를 통하여 행하는 경우에는 출구(9a)와 그 도입부(20a)를 폐쇄하거나 또는 성형시에 출구(9a)와 그 도입부(20a)를 부가하지 않고 성형한 것을 사용할 수도 있다. 또한, 투석외액(3)중의 대사산물 등의 배출을 출구(9a)와 그 도입부(20a)를 통하여 자연배출하는 경우에는 출구(9)와 그 도입부(20)를 폐쇄하거나 또는 성형시에 출구(9)와 그 도입부(20)를 부가하지 않고 성형한 것을 사용할 수도 있다. 또한 이 경우 도시하지는 않았으나 출구(9a)의 도입부(20a)와 입구(8)의 도입부(19)가 접속 가능하게 되도록 도입부(19) 및 도입부(20a)를 성형하여 사용할 수도 있다. 이 성형시에 입구(8)의 도입부(19)는 출구(9)쪽의 단부를 덮개부에 접속하지 않고 출구(9a)의 도입부(20a)에 접속하도록 성형하여도 좋다.

투석막기능을 가진 매체(12)는 입구(11)의 도입부(13)와 일체로 성형되어 있어도 좋으나, 예시한 바와 같이 고정구(14)에 의하여 고정되어 있어도 좋다. 매체(12)는 적어도 투석외액(3)중에 침지되도록 함침조(1)내에 위치되게 설치된다. 매체(12)의 입구(11)에 연결되는 방향과는 역방향의 단부는 적어도 투석외액(3)중에 침지되도록 함침조(1)내에 위치되게 설치되며 적어도 폐쇄되어 있으면 충분하고 한 구체적 예로서는 막단부(15)와 같이 덮개형상의 것에 의하여 폐쇄하거나 또는 매체(12)를 입구부분이 한 개의 포대형상의 것으로서 사용하여도 좋다.

카트릿지장치에는 바람직하게는 투석외액(3)의 교반을 하는 수단을 도입하여도 좋다. 한 구체적 예로서는 마그네틱스탤러(16)와 같은 회전 매체를 함침조(1)내에 두어도 좋다.

함침조(1)는 항온화하는 것이 합성효율을 위해서는 좋고 희망하는 항온화 수단과의 병용이 가능하다. 예를 들면, 항온조에 설치가능 하도록 함침조(1)는 조정할 수 있다. 카트릿지장치는 통상은 투석외액(3) 및 합성시스템물질이 침지되지 않은 상태로 사용자에게 제공되고 사용자가 희망에 따라 수시 입구(11), 입구(5)로부터 각각 유입시킴으로써 침지된다.

입구(5), 출구(9), 입구(11)는 그 유출입에 대하여 자동화 제어하는 수단이 도입되는 것이 바람직하다. 단, 보다 간단한 자동화 수단으로서는 입구(5)로부터 출구(6), 그리고 입구(8)로부터 출구(9)의 유출입시스템가 액면(4)을 일정하게 유지하도록 자동제어 되어 있는 것이 좋다. 이 경우, 입구(11)로부터의 물질의 추가첨가는 수동제어에 의하여 행하여도 좋다. 또, 출구(9a) 및 도입부(20a)가 액면(4)보다 상부이고 또한 액면에 접한 부위에 설치된 경우에는 자연유출이 가능하다.

본 카트릿지장치는 사전조립장치라도 좋고 필요시 조립장치라도 좋다. 필요시에 조립하는 경우에는 함침조(1), 함침조(1)의 덮개부(2), 입구(11)의 도입부(13), 입구(5)의 도입부(17), 출구(6)의 도입부(18), 입구(8)의 도입부(19), 출구(9)의 도입부(20), 매체(10)(도입부(13)은 사전에 성형하여도 좋다.)를 개별적으로 준비하고, 각각의 접속은 예를 들면 테이퍼수단에 의하여 행한다. 카트릿지장치의 재질은 널리 공지된 플라스틱재료를 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 밀배아를 사용한 무세포 단백질 합성용 세포추출물 함유제제에 대한 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하나, 하기의 실시예는 본 발명에 대한 구체적 인식을 얻는 일조로 보아야 할 것이고, 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 하등 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 밀배아 추출물의 조제

밀, 부선, 체를 사용하는 종자로부터의 무상배아(발아기능을 가진)의 단리방법은 Johnston들의 방법(Johnston,F.B.et a1.(1957) Nature, 179, 160-161)을 개량하여 사용하였다. 북해도산의 티호크밀종자(미소독)을 1분간에 100g의 비율로 밀(Fritsch사 제품 Rotor Speed Mill pulverisette 14형)에 첨가하여 회전수 8,000rpm으로 종자를 온화하게 파쇄하였다. 이것을 다시 6,000rpm으로 파쇄하여 체로 조배아획분(메쉬사이즈 0.71~1.00mm)를 얻은 후, 4염화탄소와 시클로헥산혼액(사염화탄소:시클로헥산 = 2.5:1)을 사용한 부선에 의하여 발아능을 가진 배아를 부상획분으로부터 회수하고, 실온건조에 의하여 유기용매를 제거하였다. 이 배아획분에 혼재하는 종피 등의 불순물을 폴리에틸렌판자 등의 정전기 대전체를 사용하여 흡착제거하였다.

또한 배아입자를 체와 정전기 대전체를 사용하여 소입자(0.71 ~ 0.85mm), 중입자(0.85 ~ 1mm), 경입자(0.85 ~ 1mm이고 경량)의 3획분으로 분별하고, 최후에 눈에 의한 분별을 행하였다. 소입자획분이 가장 높은 단백질합성활성을 나타내었다. 경입자는 종자 파해시에 배아에 생긴 상처배아가 부선조작 중에 파괴가 진행된 것이라고 추측된다. 다음에 이 시료로부터 밀배유성분을 완전히 제거하기 위하여 가제에 밀배아를 넣고 냉각시키면서 냉증류수(DDW)로 세정하여 비이온성 계면활성제인 NP-40의 5% 용액에 현탁하고, 초음파세정기를 사용하여 세정액이 백탁하지 않게 될 때까지 세정을 반복하였다. 증류수의 존재하에 다시 1회의 초음파 세정 후, 흡인여과에 의하여 밀배아를 취하여 그것을 냉증류수(DDW)로 몇번 세정하여 밀배아를 순화시켰다.

밀배아 추출물의 조제는 상법(Erickson, A.H. et a1.(1996) Methods in Enzymo1. 96, 38-50)에 준하였다. 이하의 조작은 4℃로 행한다. 액체질소로 동결한 순화 밀배아를 유발중에서 분쇄하여 얻은 분말체 1g당 1㎖의 Patterson들의 방법을 일부 개변한 추출용액(80mM HEPES-KOH, pH 7.8, 200mM 아세트산칼륨, 2mM 아세트산마그네슘, 4mM 염화칼슘, 8mM 디티오슬레이톨, 각 0.6mM L형 아미노산 20종류, 각 1μM의 단백질 분해효소억제제인 FUT, E-64, PMSF를 포함)을 가하여 거품이 발생하지 않도록 주의하면서 교반하였다,

30,000g, 15분간의 원심에 의하여 얻어지는 상층액을 배아추출물로서 회수하고, 미리용액(40mM HEPES-KOH, pH 7.8, 100mM 아세트산칼륨, 5mM 아세트산마그네슘, 4mM 디티오슬레이톨)로 평형화해둔 세파덱스 G-25컬럼(Coarse)으로 겔여과를 행하였다. 시료의 농도를 170~250A 260nm(A260/A280=1.5)으로 조정하였다.

이렇게 하여 조제된 제제의 탈아데닌화율은 복수회의 실시에서 모두 1% 이하이고, 0.01~0.3%의 결과가 얻어졌다(탈아데닌화율의 측정은 산성하의 아닐린처리에 의한 탈리법을 사용하여 행하였다. : Endo, Y.et a1, (1987) J. Bio1. chem., 262, 5908 - 5912, Yoshinari, S. et a1,(1996) Eur. J. Biochem., 242, 585-591). 또한, 트리틴의 협잡물량을 항트리틴항체를 사용한 이뮤노플로트법으로 검정하였으나, 검출한도 이하였다.

실시예 2 : 투석법에 의한 연속식 밀배아 무세포 단백질합성

연속식 밀배아 무세포 단백질합성의 방법은 이미 보고된 (Endo, Y. et a1.(1992) J. Biotech., 25, 221-230) 상기 실시예 1의 반응용액을 디스포다이어라이저(Spectra/Por ^ⓡCE, MWCO : 25k, volume : 0.5㎖)에 넣고, 반응액의 10배용량의 투석외액(20mM HEPES-KOH, pH 7.6, 95mM 아세트산칼륨, 2.65mM 아세트산마그네슘, 4mM 디티오슬레이톨, 1.2mM ATP. 0.25mM GTP, 16mM 클레아틴인산, 0.38mM 스펠미딘, L형아미노산 20종류(각 0.3nM), 0.005% NaN₃, 0.05% NP-40, E-64, PMSF 각 1mM)에 대한 투석시스템에서 반응은 20℃로 행하였다.

이상의 방법으로 얻은 조건하에 밀배아 연속식 무세포 단백질합성을 시도하였던 바, 분자량 5,000~130,000의 여러 가지 단백질을 효율적으로 합성할 수 있었고, 합성효율은 반응용량 1㎖당 0.3~1.8㎎ 이었다.

표 1 : 밀배아 무세포시스템(투석시스템)으로 합성한 단백질종의 합성량과 성질

① DHFR(20kDA) 1.8㎎/㎖ (활성있음)

② 사람의 미트콘드리아 Met-tRNA synthetase(84kDa)

1.3㎎/㎖ (활성없음. 항체작성용항원)

③ 루시퍼레이즈(Luciferase)(60kDa)

0.7㎎/㎖ (활성있음)

④ 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein)(27kDa)

0.4㎎/㎖ (활성있음)

⑤ 사람의 RNA 헬리케이즈 A(he1icase A)(130kDa)

0.3㎎/㎖ (활성없음. 항체작성용 항원)

⑥ 프로테아솜 활성 단백질(Proteasome Activator protein α,β,γ(각 28, 28, 31kDa)) 각 0.5㎎/㎖ (활성없음. 항체작성용 항원)

그리고, 상기 실시예에 있어서, 단백질 합성활성의 분석방법은 Endo 들의 이미 보고된 기재에 따라 행하였다. 또 ¹⁴C-루신의 단백질로의 취입측정법, SDS-포리아크릴아미드겔 전기영동에 의한 합성단백질의 분리와 쿠마실브릴리안트불루에 의한 염색법, 및, 서당밀도경사 원심법에 의한 폴리리보솜패턴 분석법은 Endo들의 논문(Endo, Y, et a1. (1992) J. Biotech., 25, 221-230, Endo, Y. et a1. (1975) Biochim. Biophys. Acta, 383, 305-315)의 기재에 따라 행하였다.

실시예 3 : 밀배아 추출물의 제제화

실시예 1에 기재한 방법으로 얻은 밀배아 추출물을 액체질소로 동결 후, 통상의 동결건조기(Labconc Freeze Dry System Freezone 4.5)를 사용하여 3시간의 운전으로 수분을 제거하였다. 조제한 분말상의 시료는 그 성분이 화학변화하지 않도록 3종의 방법, 진공 및 질소가스 충전하에 봉관하여 보존하였다.

실시예 4 : 단백질 합성효과의 확인

상기 실시예 3의 방법으로 동결건조시켜 제제화한 본 발명으로 이루어지는 밀배아추출물 함유제제를 -80℃로 2개월간 보존한 것과, 동결건조시키지 않은 밀배아 추출물을 액체질소중(-196℃)에서 2개월간 보존한 것과의 단백질합성활성의 비교를 행하였다.

각 밀배아 추출물에 Erickson 들의 방벙에 준한 성분조성인 30mM HEPES-KOH, pH7.6, 95mM 아세트산 칼륨, 2.65mM 아세트산 마크네슘, 2.85mM 디티오슬레이톨, 0.5mg/ml 크레아틴키나제, 1.2mM ATP, 0.25mM GTP, 16mM 크레아틴인산, 0.380mM 스펠미딘, 20종류의 L형 아미노산(각 0.3mM)을 가하였다. 또한, 1,000 units/ml 리보뉴클레아제 억제제(RNasin)와 NP-40(최종농도 0.05%)을 첨가한 후, 이미 발명자가 문헌으로 보고한 방법(Endo, Y.et a1.,(1992)J.Biotech., 25,221-230)으로 조제한 CAP 부착 디히드로 엽산 환원효소(dihydrofolate reductase) mRNA(80㎍/ml 반응용량)과 50 μCi(ml반응용량당)의 [U-¹⁴C]-루신(leucine)(166mCi/mmol)을 첨가하고, 단백질 합성활성을 [U-¹⁴C]-루신의 단백질로의 취입을 지표로 측정하였다. 반응은 20~30℃로 행하였다.

제 1도에 도시한 바와 같이, 동결건조시킨 밀추출물 함유제제(■--■)를 실온 -80℃로 2개월간 보존한 후에도 종래의 액체질소 보존(□--□)과 동등한 단백질 합성활성을 유지하고 있었다. 또한, 동결건조후에 있어서의 보존온도에 대하여 검토하였던 바, 보존기간 1개월후에 있어서의 단백질 합성활성으로 비교한 경우, -80℃(●--●)가 가장 안정적이었으나, 4℃(■--■) 또는 실온(□--□)에서의 보존이라도 단백질 합성활성을 충분히 유지되고 있었다(도 2도).

즉, 본 발명의 수단을 적용하여 무세포 단백질 합성용 세포추출물을 종래의 보존온도보다 높은 온도인 -80℃ ~ 실온에서 고품질을 유지하면서 보존 및 공급하는 것이 가능하다.

실시예 5 : 무세포 단백질합성 밀배아 추출물 함유제제의 조제

반응액은 용량의 20~60%의 실시예 1에 기재된 방법으로 조제한 밀배아 추출물을 함유하고, 상기 Erickson들의 방법에 준한 이하의 성분조성인 30mM HEPES-KOH, pH7.6, 6.95mM 아세트산칼륨, 2.65mM 아세트산 마그네슘, 2.85mM 디티오슬레이톨, 0.5mg/ml 크레아틴키나제, 1.2mM ATP, 0.25mM GTP, 16mM 크레아틴인산, 0.380mM 스펠미딘, 20종류의 L형 아미노산 (각 0.3mM)을 첨가한 후, 액체질소로 동결시키고, 통상의 동결건조기로 수분을 제거하였다. 조제한 분말상의 시료는 그 성분이 화학변화하지 않도록 진공 또는 질소가스 충전하에 봉관하여 보존하였다.

실시예 6 : 단백질 합성활성의 측정

본 발명으로 이루어지는 실시예 5의 방법으로 조제한 무세포 단백질 합성 밀배아추출물 함유제제를 -80℃로 2개월간 보존한 결과, 동기간 액체질소중(-196℃)에 보존한 기존법으로 조제한 밀배아추출물에 실시예5에 기재된 Erickson 등의 방법에 준한 성분 조성의 물질을 첨가한 무세포 단백질합성 밀배아추출물과의 단백질 합성활성을 비교하였다. 각 용액에 다시 1,000 units/ml 리보뉴클레아제 억제제(RNasin)과 NP-40 (최종농도 0.05%)을 첨가한 후, 단백질 합성활성의 측정을 실시예4에 기재한 방법으로 행하였다. 도 3에 도시한 바와같이, 본 발명의 동결건조시킨 무세포 단백질합성 밀배아추출물 함유제제(□--□)는 종래법으로 조제하여 액체질소보존(■--■)한 것과 동등한 단백질 합성활성을 유지하고 있었다. 즉, 본 발명의 수단을 적용함으로써 무세포 단백질 합성용 세포추출물을 함유한 제제를 종래의 보존온도보다 높은 온도인 -80℃ ~ 실온에서 고품질을 유지하면서 안정적으로 보존·공급할 수 있고, 또한 무세포 단백질 합성시스템의 작업공정을 간편화 하는 방법을 제공하는 것이 가능하다.

실시예 7 : 겔여과 컬럼 크로마토를 반응조로 하는 밀배아 연속식 무세포 단 백질 합성: 수동 오픈 컬럼법

겔여과 담체로서 파마시아사제품 세파덱스 G-25(fine)를 팽윤시킨 후, 하기의 성분조성인 완충액(20mM HEPES-KOH,pH 7.6, 95mM 아세트산칼륨, 2.65mM 아세트산 마그네슘, 4mM 디티오슬레이톨, 1.2mM ATP, 0.25mM GTP, 16mM크레아틴인산, 0.380mM 스펠미딘, 20종류의 L형 아미소산(각 0.3mM),0.005% NaN3,0.05% NP-40, E-64, PMSF (각 1mM)로 컬럼을 평형화하여 컬럼(내경 10mm, 길이 100mm)에 채웠다.

이 컬럼에 실시예 1에 기재한 방벙으로 조제한 무세포 단백질 합성반응용액 0.1ml(번역주형으로서 5'CAP 부착의 디히드로엽산환원효소 mRNA를 반응액 1ml 당 80㎍ 함유)을 중층하고, 23℃로 1시간보온 후, 아미노산, 에너지원 등 합성에 필요한 성분을 페리스터펌프를 사용하여 1시간당 0.5ml의 유속으로 연속적으로 공급하였다. 반응 12시간후의 시료 1㎕을 12.5% SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에 부하여 단백질을 분리한 후, 쿠마실브릴리안트불루로 염색하고, 다시 합성된 단백질의 정량을 덴시트미터에 의하여 행하였다. (Endo,Y.et a1.,(1992) J.Biotech., 25, 221-230, Endo, Y.et a1.,(1975) Biochim Biophys. Acta, 383, 305-315).

결과는 제 4A도에 도시하였다. 레인 1은 주형이 없는 경우, 레인 3은 컬럼법으로 12시간 합성한 결과이다. 왼쪽의 레인은 분자량 마커이고, 위에서부터 94kDa, 67kDa, 43kDa, 30kDa, 20.1kDa을 나타낸다. 화살표는 합성된 디히드로엽산 환원 효소를 표시한 것이다.

실시예 8 : 겔여과 컬럼 크로마토를 반응조로 하는 밀배아 연속식 무세포단백질합성:액체크로마토 장치

파마시아사제품 세파덱스G-25(fine)를 겔여과담체로 하는 컬럼(HR10/30,내경 10mm, 길이 300mm)을 사용하여 파마시아바이오테크 SMART ^ⓡsystem 액체크로마토그래피를 이용하여 반응용량을 0.3ml로 한 것 이외는 반응액조성, 반응방법, 분석방법 모두 실시예 1과 똑같이 행하였다. 결과는 제 4B도의 레인 2에 표시하였다.

비교예로서 투석법을 사용하는 연속식 밀배아 무세포 단백질합성을 검토하였다. 실시예 1에 기재한 방법으로 조제한 무세포 단백질 합성용 반응액을 디스포다이어라이저(spectra/por ^ⓡCE, MWCO:25k,volume:0.5ml)에 넣고, 반응액의 10배용량의 투석외액(20mM HEPES-KOH, pH7.6, 95mM 아세트산칼륨, 2.65mM 아세트산마그네슘, 4mM 디티오슬레이톨, 1.2mM ATP, 0.25mM GTP, 16mM크레아틴인산, 0.380mM 스펠미딘, 20종류의 L형아미노산 (각 0.3mM), 0.005% NaN3, 0.05% NP-40, E-64, PMSF 각 1mM)에 대한 투석시스템에서, 반응은 23~30℃로 12시간 행하였다. 결과는 제 4A도의 레인 2 및 제 4B도의 레인 1에 표시하였다.

제 4도에 도시한 바와같이, 컬럼법에 의하여 모델로서 사용한 디히드로엽산 환원 효소를 투석법과 똑같은 합성 수량(0.25mg/ml 반응용량)으로 생산할 수 있는 것이 수동 오픈컬럼법과 액체크로마토그래피를 사용하는 양방법으로 실험적으로 확인되었다. 컬럼사이즈를 증대시킴으로써 단백질의 대량생산이 가능하다.

실시예 9 : mRNA 및 크레아틴키나제의 추가에 의한 반응유지 시간의 연장에 의한 합성의 효율화

모델로서 디히드로 엽산 환원효소를 코딩하는 mRNA을 사용하여 24시간 합성반응을 행하였다. 반응용액은 용량의 48%의 실시예1에서 얻은 밀배아추출물을 함유하고, 상기 Erickson 등의 방법에 준한 이하의 성분 조성인 1,000units/ml 리보뉴클레아제 억제제(RNAasin), 30mM HEPES-KOH, pH7.6, 95mM 아세트산 칼륨, 2.65mM 아세트산 마그네슘, 2.85mM 디티오슬레이톨, 0.5mg/ml 크레아틴키나제, 1.2mM ATP, 0.25mM GTP, 16mM 크레아틴 인산, 0.380mM 스펠미딘, 20종류의 L형 아미노산(각 0.3mM), 0.05% NP-40외에 이미 보고된 방법(Endo,Y.et a1.(1992)J.Biotech., 25, 221-230)으로 조제한 CPa 부착 디히드로엽산 환원효소(dihydrofolate reductase)를 코딩하는 mRNA(80㎍/ml반응용량)를 포함한다.

반응용액을 그 20배 용량의 투석외액(20mM HEPES-KOH pH7.6, 95mM 아세트산 칼륨, 2.65mM 아세트산 마그네슘, 4mM 디티오슬레이톨, 1.2mM ATP, 0.25mM GTP, 16mM 크레아틴인산, 0.380mM 스펠미딘, 20종류의 L형아미노산(각 0.3mM), 0.005% NaN3, 0.05% NP-40, E-64, PMSF 각 1mM)에 대한 투석시스템을 사용하여 23℃로 반응시겼다.

반응개시 12시간후에 1ml의 반응용량당 CAP부착 디히드로엽산 환원효소를 코딩하는 mRNA와, 1㎖의 반응용량당 20A㎍의 크레아틴키나제를 추가첨가, 또는 1ml의 반응용량당 20㎍의 CAP 부착 디히드로엽산환원효소를 코딩하는 mRNA만을 추가첨가, 혹은 1ml의 반응용량당 200㎍의 크레아틴키나제만을 추가첨가 하였다. 비교대조효소로서 양물질 모두 추가 첨가하지 않고 반응을 행하였다. 조작은 수동으로 행하고, 투석 외액의 교환은 하지 않았다. 합성단백질의 양은 SDS-폴리 아크릴아미드 겔 전기 영동 후에 단백질을 쿠마시불루 염색하고, 덴시트미터를 사용하여 그 염색밴드강도와 표준품과의 비로써 구하였다(Endo,Y.et a1.(1992)J.Biotech,25,221-230,Endo,Y.et a1.(1975)Biochim.Biophys. Acta,383, 305-315).

제 7도에 도시한 바와 같이, 반응개시 12시간후(화살표)에 있어서의 mRNA 및 크레아틴키나제의 추가첨가(○--○)에 의하여 합성반응이 거의 직선적으로 지속되는 것을 알 수 있다. 어느 한쪽만의 추가첨가(△-△)(▽-▽)에서는 추가첨가하지 않은 것(□--□)과 똑같이 반응이 정지 되었다. 즉, 상기에서 표시한 가능성(mRNA의 주형활성의 저하와, 크레아틴 키나제활성의 저하에 의한 에너지원의 고갈에 기인하는 단백질 합성반응의 정지)이 여기서 실험적으로 확인되어 그 해결방법도 완성되었다.

실시예 10 : 투석외액이 경시적 교환에 의한 반응유지시간의 연장에 의한 합성의 효율화

모델로서 디히드로엽산 환원효소를 코딩하는 mRNA를 사용하여 반응액조성, 온도 등의 조건은 실시예 9와 똑같이 하여 반응개시후 24시간 및 45시간에 투석외액을 교환하여 60시간 단백질 합성을 행하였다.

비교대조로서 투석외액을 교환하지 않고 단백질합성을 행하였다. 어느 반응시스템에도 1ml의 반응용량당 20㎍의 CAP 부착 디히드로 엽산환원효소를 코딩하는 mRNA와, 1ml의 반응용량당 200㎍의 클레아틴 키나제를 추가첨가 하였다. 합성단백질의 양은 실시예 9에 기재한 방법에 의하여 측정하였다.

제8도에 도시한 바와 같이, 투석외액 교환 없음(△-△)에서는 24시간까지 거의 직선적으로 합성이 진해되지만, 30시간정도로 반응속도가 극단적으로 저하한다. 그러나, 24시간마다 (화살표) 투석외액을 교환함으로써( -- ), 단백질합성이 적어도 60시간까지 지속되었다. 즉, 상기에서 표시한 가능성(단백질 합성에 필수적인 원료의 고갈과 부생성물의 축적에 의한 단백질 합성 반응의 정지)이 여기에서 실험적으로 확인되어 그 해결방벙도 완성되었다.

실시예 11 : 자동 연속 무세포 단백질 합성 장치를 사용한 mRNA 및 크레아틴키나제의 자동추가 및 투석외액의 자동교환에 의한 반응유지시간의 연장과 합성의 효율화

모델로서 디히드로엽산 환원효소를 코딩하는 mRNA를 사용하여 반응액조성, 온도 등의 조건은 실시예 9와 똑같이 하여 자동 연속 무세포 단백질 합성장치를 사용하여 단백질 합성을 60시간 행하였다. 반응개시후 12시간마다 따로따로 4℃에서 보존해둔 1ml 반응용량당 20㎍의 CAP 부착 디히드로엽산환원효소를 코딩하는 mRNA 및 1ml 반응용량당 200㎍의 크레아틴키나제를 각각 5ml씩 추가첨가하여 반응시켰다. 투석외액은 4℃로 유지한 저장용기로부터 투석용기에 연속적으로 공급(0.3ml/시간)하고, 같은 속도로 투석용기로부터 배출시켰다. 개시반응용액량(0.5ml)에 대하여 1㎍상당량의 반응용액을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동 후에 단백질을 쿠마시불루 염색하였다(제9A도). 비교대조로서 CAP 부착 디히드로엽산 환원효소를 코딩하는 mRNA를 추가첨가하지 않고 크레아틴키나제만을 추가첨가하여 상기한 바와 똑같은 방법으로 단백질의 합성을 행하였다(제 9B도). 또한, 반응 0시간의 시료 1㎍에 디히드로엽산환원효소 표품 1㎍를 첨가하여 똑같이 영동·염색하였다(제 9A도 오른쪽 레인). 합성단백질의 양은 실시예 9에 기재한 방법으로 측정하였다(제9C도).

제 9도에 도시한 바와 같이, CAP 부착 디히드로엽산 환원효소를 코딩하는 mRNA를 추가첨가하지 않고 크레아틴키나제만을 추가첨가한(△-△) 경우, 반응이 15시간 정도로 정지되었다. 도시하고 있지 않으나, 크레아틴키나제를 추가하지 않고 CAP 부착 디히드로엽산 환원효소를 코딩하는 mRNA만을 추가첨가한 경우에도 똑같이 반응의 정지가 관찰되었다. 한편, 12시간마다 CAP 부착 디히드로엽산 환원효소를 코딩하는 mRNA 및 크레아틴키나제의 자동추가와 24시간째의 투석외액의 자동교환( -- )에 의하여 무세포 단백질합성이 자동적으로 효율좋게 진행되었다. 즉, 본 장치가 유효히 기능하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 제제는 (1) 무세포 단백질 합성용 세포추출물의 보존에 초저온조나 드라이 아이스 등을 사용하는 저온수송의 필요없이 장기에 걸쳐 고품질관리가 가능하게 된다. (2) 무세포 단백질 합성용 세포추출물과 아미노산이나 ATP 등의 합성기질 및 각종이온 등, 번역반응에 불가결 또는 동 반응효율을 높이는 화학물질을 미리 혼합하여 조제한 본 발명의 무세포 단백질 합성용 세포추출물 함유제제를 그대로 동결건조시킴으로써, 단백질 합성의 고활성을 가진 채로의 형태로 쉽게 보존·수송이 가능하다.

본 발명의 무세포 단백질 합성용 세포추출물 함유제제는 생체 외에서의 단백질 합성에 있어서 반응혼액의 조제를 필요로 하지 않고, 기본적으로는 물과 목적하는 번역주형(mRNA)을 첨가하는 것만으로 유전자 산물의 동정이나 그 다량합성이나 그 번역기구의 해석을 손쉽게 할 수 있는 수단을 제공하는 것이다.

본 발명에 의하여 무세포 단백질 합성시스템에 필요한 무세포 단백질 합성용 세포추출물, 번역주형을 제외한 다른 합성기질이나 에너지원 및 각종이온 등의 번역반응에 불가결 또는 동반응효율을 높이는 화학물질을 함유한 무세포 단백질 합성반응시스템에 관여하는 물질과 같이 상온에서는 불안정한 물질을 안정적으로 보존 및 공급하는 것이 가능하게 되며, 이들 물질을 장기간에 걸쳐 고품질 관리하는 것이 가능하게 되었다. 또한, 본 발명의 동결건조시킨 무세포 단백질 합성용 세포추출물을 함유한 제제를 제공함으로써 무세포 단백질 합성시스템의 취급이 종래보다 쉬워지고, 또한, 반응액을 조제할 필요가 없으므로 작업공정이 단축되어, 그 무세포 단백질합성시스템의 산업상의 유용성이 향상된다.

본 발명의 또 다른 수단은 무세포 단백질 합성용 반응조의 담체로서 분자체의 원리를 응용함으로써 종래의 막을 사용한 연속식 무세포 단백질 합성법으로는 어려웠던 대용량의 무세포 단백질합성이 가능하게 되었다.

또한, 또다른 본 발명의 수단은 투석식의 자동연속 단백질의 합성장치가 발명되어 단백질의 합성이 간편화되었다.

Claims

자기의 단백질 합성반응의 억제에 관여하는 시스템을 실질적으로 배제하여 조제한 무세포 단백질 합성용 식물세포 추출물 함유제제에 있어서, 배아(embryo) 추출물로부터 그 배아추출물에 혼입하는 배유(endosperm)를 완전히 제거하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성용 식물세포 추출물 함유제제.
제 1항에 있어서, 자기의 단백질합성반응의 억제에 관여하는 시스템을 배제하는 방법은 비이온성 계면활성제를 사용하여 배아추출물을 처리하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성용 식물세포 추출물 함유제제.
제 2항에 있어서, 비이온성 계면활성제를 사용하여 배아추출물을 처리하는 방법은 초음파 처리에 의하여 세정액이 백탁하지 않게 될 때까지 행하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성용 식물세포 추출물 함유제제.
제 1항에 있어서, 자기의 단백질합성반응의 억제에 관여하는 시스템을 배제하는 것은 리보솜의 탈아데닌화를 제어하는 것임을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성용 식물세포 추출물 함유제제.
제 1항에 있어서, 자기의 단백질합성반응의 억제에 관여하는 시스템을 배제하기 위하여 리보솜의 탈아데닌화를 억제하는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성용 식물세포 추출물 함유제제.
제 1항에 있어서, 비이온성 계면활성제와 리보솜의 탈아데닌화를 제어하는 물질을 첨가하여 배아에 처리하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성용 식물세포 추출물 함유제제.
제 1항에 있어서, 상기 무세포 단백질 합성용 세포추출물을 함유한 제제는 실온보존가능하고 상기 세포추출물의 생물학적 기능을 유지한 상태의 제제로 조제하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성용 식물세포 추출물 함유제제.
제 1항에 있어서, 상기 제제는 건조제인 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성용 식물세포 추출물 함유제제.
제 8항에 있어서, 제제화는 동결건조처리에 의하여 행하여지는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성용 식물세포 추출물 함유제제.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 기재된 무세포 단백질 합성용 세포추출물 함유제제를 사용하는 무세포 단백질합성시스템에 있어서, 상기 합성시스템에 사용되는 반응조는 분자체 가능한 담체에 의하여 제조되고, 무세포 단백질 합성시스템에 관여하는 재료물질은 그 담체를 이동상으로 하여 전개되며, 전개시 무세포 단백질 합성반응이 일어나고, 그 결과 합성단백질을 얻음을 특징으로 하는 합성단백질을 회수할 수 있는 시스템에서 무세포 단백질 합성수단.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 기재된 무세포 단백질 합성용 세포추출물 함유제제를 사용하는 무세포 단백질합성시스템에 있어서, 상기 합성시스템에 사용하는 반응조는 투석수단에 의하여 제조되고, 무세포 단백질 합성시스템에 관여하는 재료물질과 무세포 단백질 합성반응산물은 투석막을 통해 분리되어, 그 결과 합성단백질을 얻음을 특징으로 하는 합성단백질을 회수할 수 있는 시스템에서 무세포 단백질 합성수단.
제 10항에 있어서, 상기 무세포 단백질 합성방법에 있어서, 합성반응의 주형이 되는 mRNA, 에너지재생계효소, 기질 및 에너지원 중 적어도 어느 하나로부터 선택되는 요소에 대하여 추가, 보존, 교환 또는 배출 중에서 선택되는 처리를 도입하는 것을 특징으로 하는 연속 무세포 단백질 합성수단.
밀배아로부터 배유성분의 협잡물을 완전히 제거하기 위하여 밀배아를 비이온성 계면활성제로 세정하는 공정을 포함한 처리로 얻은 밀배아 추출물을 함유하는 무세포 단백질 합성용 세포추출물 함유제제에 있어서, 상기 밀배아추출물의 탈아데닌화율은 1% 이하이고, 상기 밀배아추출물의 건조제제는 실온보존도가 좋은 안정성을 유지하고, 상기 밀배아추출물을 사용하는 단백질합성기질 등을 추가하는 것을 포함하는 연속 무세포 단백질합성에 있어서, 적어도 합성개시후 24시간째에도 정상적인 합성능을 가지며, 또한 24시간째에 적어도 1mg/mL 이상의 합성량을 가진 무세포 단백질 합성용 세포추출물 함유제제.
함침조와 이것에 밀봉가능하게 장착되는 덮개부를 포함한 구성으로 이루어지는 제 11항에 기재된 무세포 단백질 합성수단을 사용하는 연속 무세포 단백질합성장치로서, 상기 장치는 기질 및/또는 에너지원의 도입수단인 입구와 투석외액의 함침조내의 액실에 연결되는 출구를 가진 유로, 투석외액 중 대사산물 등의 배출수단인 함침조내의 액실에 존재하는 입구와 외부로 연결되는 출구를 가진 유로, mRNA 및/또는 에너지재생계효소의 도입수단인 입구와 투석외액의 함침조내의 액실에 존재하는 투석막의 기능을 가진 매체를 담지하는 장치를 사용하여 합성반응의 주형이 되는 mRNA, 에너지재생계효소, 기질 및 에너지원 중 적어도 어느 하나로부터 선택되는 요소에 대하여 추가, 보존, 교환 또는 배출 중에서 선택되는 처리를 도입하는 것을 특징으로 하는 연속 무세포 단백질 합성수단.
제 1항 내지 제 9항 및 제 13항 중 어느 한 항에 기재된 제제를 이용한 단백질의 합성방법.
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