KR100545619B1 - Ｍｉｔｅ-유사 인자 및 전사 활성화 인자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 당근-유래의 MITE-유사 인자 (전이 인자)를 제공한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 전이 인자, 특히 상기 MITE-유사 인자를 하나 이상 포함하는 전사 활성화 인자를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 서열 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 그에 대한 기능적 등가물, 및(또는) 서열 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 그에 대한 기능적 등가물을 갖는 전사 활성화 인자를 제공한다. 본 발명의 전사 활성화 인자는 트랜스제닉 기술에 의해 도입된 외래 유전자의 발현을 증가시키거나 활성화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 전사 활성화 인자는 식물 게놈에 도입된 외래 유전자의 안정한 발현에 기여하며, 유전자 변형 식물을 안정하게 생성하는데 유용하다.

미니어처 역위 반복 전이 인자, 전사 활성화 인자, 발현 카세트, 트랜스제닉 식물

Description

ＭＩＴＥ-유사 인자 및 전사 활성화 인자{MITEs-Like Element and Transcriptional Activation Element}

본 발명은 신규 식물-유래 전이 인자, 더욱 구체적으로는 MITE (미니어처 역위-반복 전이 인자, miniature inverted-repeat transposable element)-유사 서열에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 당근 (다우쿠스 카로타 ( Daucus carota ))으로부터 단리된 신규 전이 인자에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 전이 인자를 함유하는 신규 전사 활성화 인자에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은, 유전자에 삽입시 삽입된 부위의 주변 또는 근방에 위치한 유전자의 전사를 촉진하거나 삽입된 유전자의 전사 불활성화를 억제할 수 있는 전사 활성화 인자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 전사 활성화 인자를 함유하는 트랜스제닉 식물에 관한 것이다.

전이 인자는 원핵생물과 진핵생물 또는 동물과 식물 사이의 차이없이 거의 모든 생물체의 게놈에서 발견된다. 이들 전이 인자는 한 게놈 유전자로부터 다른 유전자로 이동하여, 전이 인자가 삽입된 서열의 상류 또는 하류의 게놈 유전자를 불활성화시킬 수 있다. 추가로, 전이 인자는 그러한 작용 이외에 다양한 유형의 게놈 재구성 (결실, 역위, 중복 등)을 유발하는 것으로 밝혀졌으며, 이런 사실은 생물체의 진화에 중요한 게놈 가소성 (genomic plasticity)을 유발하고, 특히 전이 인자는 생물체가 게놈 스트레스에 반응하여 환경에 적응하는 진화에 중요한 역할을 한다고 보고되었다 (문헌 [McClintock, Science 26: 792-801 (1984)], 문헌 [Arber et al., FEMS Micorb. Ecol., 15: 5-14 (1994)] 참조).

전이 인자는 크게 3가지 유형으로 분류된다: DNA형 (트랜스포손 및 삽입 서열), RNA 형 (레트로트랜스포손; 문헌 [Berg et al. (ed.), Mobile DNA (1989)] 참조), 및 상기 두 가지 유형 중 어디에도 속하지 않는 미니어처 역위-반복 전이 인자 (MITE) (문헌 [Wessler et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 914-821 (1995)] 참조).

이들 중 DNA형 및 RNA형 전이 인자에 대해서는 게놈에서 이들의 실제 전이 메카니즘이 확립된 반면, MITE에 대해서는 MITE가 DNA형과 유사함에도 불구하고 지금까지 게놈에서의 전이에 관한 증거가 보고되지 않았다.

대부분의 MITE는, 현재 진행 중인 게놈 프로젝트에 의해 밝혀진 다양한 생물체의 게놈 유전자 뉴클레오티드 서열의 데이타베이스로부터 컴퓨터 검색을 통해 알려졌다. 최초로 발견된 것은 뷰러우 (Bureau) 등에 의한 투어리스트 (Tourist) 족이다 (문헌 [Bureau et al., Plant Cell 4: 1283-1294 (1992)] 참조). 그 후, 식물 게놈과 곤충 및 동물 게놈에서 다양한 MITE가 발견되었다.

일반적으로, MITE는 (1) 5'- 및 3'-말단 영역에 각각 완전 또는 불완전 역위 반복 서열을 갖고 (이는 DNA형 전이 인자와 유사함), (2) DNA형 전이 인자가 게놈 DNA로 삽입될 때 형성되는 것과 유사한, 2개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 표적 중복-유사 서열이 역위 반복 서열의 양쪽 말단 모두에 나타나며, (3) 일반적으로 2 kb 미만의 크기를 갖는다는 특징이 있다 (문헌 [Wessler et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 914-821 (1995)] 참조).

DNA형 전이 인자와 유사하게 양쪽 말단 역위 반복 서열들 사이에 트랜스포자제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 갖는 MITE의 경우에는, MITE 중 IS630-Tc1/마리너 (Mariner) 족만이 곰팡이류 및 동물에서 발견되었다 (문헌 [Kachroo et al., Mol. Gen. Genet. 245: 339-348 (1994)], 문헌 [Smit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1443-1448 (1996)] 참조). 그러나, 식물 유래의 MITE에 관한 한, 이와 같이 트랜스포자제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임이 발견되지 않았다. 따라서, 식물 MITE의 전이 메카니즘 및 그 작용에 관해서는 많은 점들이 해명되지 않은 채로 남아있다.

한편, 지금까지 고등 생물체에서의 유전자 조작으로 이루어진 유전자 전달 실험은 주로 핵 게놈 삽입형이었다. 이는, 원핵생물에서의 플라스미드와 동등한 기능을 하는 벡터가 고등 생물체에는 없기 때문이다.

핵 게놈으로의 삽입에 의한 유전자 전달을 위해, 고등 생물체의 핵 게놈으로 삽입을 원하는 유전자와 결합된 벡터를 파티클 건 (particle gun) 기술, 리포펙션 (lipofection) 기술 또는 전기천공 (electroporation) 기술에 의해 도입하는 것을 비롯한 물리적 방법, 및 원하는 유전자를 함유하는 상기 벡터를 일단 바이러스 또는 미생물에 도입한 후에, 이를 상기 바이러스 또는 미생물이 가진 DNA 전달/삽입 시스템을 이용하여 고등 생물체의 핵 게놈으로 도입하는 생물학적 방법을 이용할 수 있다.

그러나, 이들 물리적 및 생물학적 방법은 고등 생물체에 도입된 유전자의 발현 활성이 개체마다 달라서 일정하게 이루어지지 않다는 문제가 있다. 많은 경우, 이는 위치 효과 (position effect; 문헌 [Peach et al., Plant Mol. Biol. 17: 46-60 (1991)] 참조)로 인한 유전자 침묵 (silencing)에서 기인한다. 그러한 위치 효과는 효모 및 기타 다수의 진핵생물에서 발견되는 현상이며, 삽입된 유전자 자체의 뉴클레오티드 변화는 없지만 염색체 상의 상기 유전자 삽입 부위에 따라 그 발현 활성이 현저히 달라지고, 특정 경우에는 유전자의 발현이 완전히 불활성화 (유전자 침묵)되는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Molecular Biology of the Cell, 3rd edition, 434-435 (1995)] 참조).

그러한 유전자 침묵 현상에 대해서는, 고등 생물체의 핵 게놈에 존재하는 모든 유전자가 균일하게 전사되지 않는다는 사실과, 유전자가 활성적으로 전사되는 활성 부위 및 유전자의 전사가 완전히 침묵되는 불활성 (cryptic) 부위가 핵 게놈에 혼재한다는 사실을 그 원인으로 생각할 수 있다. 불활성 부위에 삽입된 유전자는, 전사에 필수적인 단백질이 이 유전자에 전혀 접근하지 못하거나, 또는 이 부위에서 게놈 DNA의 메틸화로 인해 뉴클레오좀의 구조가 변하거나 이질염색질화 (heterochromatinization)되기 때문에 전혀 전사될 수 없고, 그 결과 유전자 발현이 불활성화 (유전자 침묵)된다고 알려져 있다 (문헌 [Ng et al., Curr. Opin. Genet. Dev., 9: 158-163 (1999)], 문헌 [Matzke et al., Curr. Opin. Plant Biol. 1: 142-148 (1999)] 참조).

또한, 동일한 생물체에서도 유전자 침묵은, 포유류의 X 염색체에서 나타나는 바와 같이 세포 분화의 상태에 따라 달라진다. 추가로, 일단 유전자 침묵이 현재 알려지지 않은 메카니즘에 의해 유발된다면, 이는 교배로 생성된 다음 세대 자손에게 유전되는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Molecular Biology of the Cell, 3rd edition, 434-453 (1995)] 참조).

한편, 유전자 조작시 (유전자 넉아웃 (knockout)에 사용되는 상동성 재조합법보다는) 물리적 또는 생물학적 방법에 의해 목적 유전자 (외래 유전자)가 고등 동물 세포에 도입될 때, 세포 핵 게놈에서 유전자가 삽입되는 부위는 세포마다 다르며, 이를 인공적으로 제어하는 것은 실질적으로 불가능하다. 따라서, 고등 생물체 세포로 외래 유전자를 도입하면, 핵 게놈의 활성 부위에 외래 유전자를 함유하는 세포 및 게놈의 불활성 부위에 외래 유전자를 함유하는 세포가 불특정한 방식으로 형성된다.

식물의 경우, 외래 유전자가 일단 불활성 부위에 도입되면 이는 불활성 부위의 영향을 받아 외래 유전자의 발현이 현저하게 감소하거나 무효 (null)가 되는 것으로 알려져 있으며, 또한 외래 유전자가 활성 부위에 도입되더라도, 세포 분열의 반복에 의한 성장 진행으로서의 유전자 침묵으로 인해 이 유전자의 발현이 불안정해지거나 감소되는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Peach et al., Plant Mol. Biol. 17: 46-60 (1991)] 참조).

외래 유전자의 발현 불활성화에 대해 예상할 수 있는 주요 원인으로는 염색체 중 핵 DNA의 구조를 들 수 있다. 핵 DNA의 구조에 관여하는 인자는 MAR (매트 릭스 부착 영역 (matrix attachment region); 또한, SAR (스캐폴드 (scaffold) 부착 영역)이라고도 불리움) 서열이다. MAR 서열은 핵 게놈 DNA를 핵 매트릭스에 고정시키는 서열이다. 동물에서, MAR을 함유하는 닭의 A 인자를 삽입한 후 전달될 외래 유전자에 연결시켰을 때, 삽입된 유전자의 발현이 증가하였다 (문헌 [Stief et al., Nature 341; 343-345 (1989)] 참조). 그러나, 이후 연구에서는 MAR이 발현 효율의 증가에는 기여하지만, 단독으로 위치 효과를 방해할 수는 없음이 밝혀졌다 (문헌 [Bonifer et al., Nucleic Acids Res. 22: 4202-4210 (1994)], 문헌 [Poljak et al., Nucleic Acids Res. 22: 4386-4394 (1994)] 참조). 또한, 식물에서 형질전환체를 이용하여 MAR의 효과를 조사하기 위한 연구가 이루어졌다. 그러나, 아직까지는 재현 가능한 어떤 결과도 얻지 못하였다. MAR 단독으로 위치 효과를 방해할 수 있다고는 생각되지 않는다 (문헌 [Meshi: Shokubutsu no Genome Science (Genome Science of Plants), 153-160 (1996), Shujunsha 발행]).

현재 유전자 변형된 식품으로서 유전자 변형 식물이 개발되어 있다. 그러나, 이들을 개발함에 있어서 해결해야할 가장 중요한 문제점은, 상기 언급한 바와 같이 외래 유전자의 발현을 불활성화시키는 유전자 침묵 현상이다. 유전자 변형 식물을 개발함에 있어서, 유전자 침묵 현상을 피하기 위해 매우 많은 식물 개체 중에서 유전자 침묵이 가능한 발생하지 않는 위치에 외래 유전자가 삽입되고 수년동안 여러 세대가 지난 후에도 유전자 침묵이 발생하지 않을 식물 개체를 선별하는 것은 필수적이다. 그러한 선별을 위해서는 다수의 식물 개체를 육종하고 이를 여러 세대 동안 반복해야 하기 때문에 많은 노동력과 시간이 요구될 뿐만 아니라, 큰 면적의 경작지가 요구되므로 토양 면적 문제가 발생한다.

따라서, 유전자 침묵을 피하는 또다른 전략으로 식물의 유전자를 조작함에 있어서, 급박하고 가장 중요한 문제점은 위치 효과에서 기인하는 유전자 침묵 또는 삽입된 유전자의 불활성화를 억제하는 방법을 개발하는 것이며, 더욱 구체적으로는 이들 효과 중 어느 하나를 나타내는 소위 "전사 활성화 인자"를 개발하는 것이다.

<발명의 개요>

상기 언급한 바와 같이, 식물 MITE가 어떤 기능을 갖는지에 대해 많은 점들이 밝혀지지 않은 채로 남아있다. MITE의 기능으로서, MITE가 다양한 유전자들의 프로모터 상류에서 주로 발견된다는 현재까지 얻어진 연구 결과를 기초로, 유전자 발현의 활성화에 기여할 가능성을 예상할 수 있다 (문헌 [Wessler et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 914-821 (1995)] 참조). 또한, 다수의 MITE가 매트릭스 부착 영역 (MAR) 부근에서 발견되기 때문에 (문헌 [Avramova et al., Nucleic Acids Res. 26: 761-767 (1998)] 참조), 이들은 게놈의 구조와 중요한 관련성을 가질 수 있을 것으로 예상할 수도 있다.

따라서, MITE는 게놈 구조와 유전자 발현 사이의 관계를 밝혀내는 과학적 관점에서 매우 흥미있는 전이 인자 (삽입 인자)이며, 이는 아직 완전히 조사되지 않았다. MITE의 가능성 면에서, 게놈 유전자 사이로의 전이 이후에 게놈 구조에 혼입될 때, 게놈 구조의 변화 및 그에 따른 유전자 발현의 제어를 기대할 수 있고, 또한 외래 유전자의 도입에 따른 유전자 발현 활성의 안정화 인자 또는 불활성 억제 인자로서 이들의 유용성을 기대할 수 있다.

따라서, 본 발명의 첫 번째 측면에서 본 발명의 목적은 상기 언급한 바와 같이 과학적 및 산업적 유용성을 갖는 신규한 식물-유래 MITE-유사 인자를 제공하는 것이다.

구체적으로, 본 발명은 무엇보다도 하기 1 내지 5에 언급하는 신규 MITE-유사 인자 (이하에 그러한 MITE-유사 인자는 편의상 "IS2 인자"라고도 불리움)에 관한 것이다:

1. 표적 서열인 (A)nG(A)n [n은 1 이상의 정수임]의 중복을 야기할 수 있는 MITE-유사 인자;

2. 5' 및 3' 말단 영역 각각에 완전 또는 불완전 말단 역위 반복 서열을 갖는, 상기 1에 정의된 바와 같은 MITE-유사 인자;

3. 화학식 (1) 또는 화학식 (2)로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 다수 반복되게 포함하는, 상기 1 또는 2에 정의된 바와 같은 MITE-유사 인자

XttgcaaY

(X는 g 또는 t를 나타내고, Y는 a 또는 c를 나타냄)

Zatgcaa

(Z는 t 또는 a를 나타냄);

4. 말단 역위 반복 서열로서, 5' 말단 영역에는 서열 10으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖고 3' 말단 영역에는 서열 11로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는, 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같은 MITE-유사 인자; 및

5. 서열 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 MITE-유사 인자.

또한, 본 발명은 하기 6 및 7에 언급하는 신규 MITE-유사 인자 (이하에 그러한 MITE-유사 인자는 편의상 "IS1 인자"라고도 불리움)에 관한 것이다:

6. 말단 역위 반복 서열로서, 5' 말단 영역에는 서열 12로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖고 3' 말단 영역에는 서열 13으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 가지며, 표적 서열인 TA의 중복을 야기할 수 있는 MITE-유사 인자; 및

7. 서열 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 MITE-유사 인자.

본 발명의 두 번째 측면에서, 본 발명의 목적은 위치 효과에서 기인하며 유전자 침묵이라 불리우는 유전자 불활성화 현상을 억제하거나 그의 근방 또는 주변에 위치한 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있는 소위 "전사 활성화 인자"를 제공하는 것이다.

구체적으로, 본 발명은 하기 8 내지 12에 언급하는 전사 활성화 인자에 관한 것이다:

8. 하나 이상의 전이 인자를 포함하는 전사 활성화 인자;

9. 전이 인자가 MITE-유사 인자인, 상기 8에 정의된 바와 같은 전사 활성화 인자;

10. 전이 인자가

(a) 서열 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 또는

(b) 엄격한 조건하에서 상기 뉴클레오티드 서열 (a)를 갖는 DNA에 혼성화될 수 있고, 삽입 부위에서 (A)nG(A)n [n은 1 이상의 정수임]의 중복을 야기할 수 있는 MITE-유사 인자를 코딩하는 DNA를 포함하는 MITE-유사 인자, 및(또는)

(c) 서열 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA,

(d) 엄격한 조건하에서 상기 뉴클레오티드 서열 (c)를 갖는 DNA에 혼성화될 수 있고, 삽입 부위에서 TA의 중복을 야기할 수 있는 MITE-유사 인자를 코딩하는 DNA를 포함하는 MITE-유사 인자

를 포함하는, 상기 9에 정의된 바와 같은 전사 활성화 인자;

11. 전이 인자가

(a) 서열 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 또는

(b) 엄격한 조건하에서 상기 뉴클레오티드 서열 (a)를 갖는 DNA에 혼성화될 수 있고, 삽입 부위에서 (A)nG(A)n [n은 1 이상의 정수임]의 중복을 야기할 수 있는 MITE-유사 인자를 코딩할 수 있는 DNA를 포함하는 MITE-유사 인자, 및

(c) 서열 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA,

(d) 엄격한 조건하에서 상기 뉴클레오티드 서열 (c)를 갖는 DNA에 혼성화될 수 있고, 삽입 부위에서 TA의 중복을 야기할 수 있는 MITE-유사 인자를 코딩하는 DNA를 포함하는 MITE-유사 인자

의 탠덤(tandem) 결합체인, 상기 9에 정의된 바와 같은 전사 활성화 인자; 및

12. 서열 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 포함하는 전사 활성화 인자.

또한, 본 발명은 상기 언급한 전사 활성화 인자를 포함하는, 도입된 유전자 의 발현을 위한 카세트에 관한 것이다. 구체적으로, 하기 13 내지 15에 언급하는 카세트가 있을 수 있다:

13. 상기 8 내지 12 중 어느 하나에 정의된 전사 활성화 인자와, 상기 인자에 작동 가능하게 결합된 DNA 서열을 포함하는, 식물에 도입된 유전자의 발현을 위한 카세트;

14. 전사 활성화 인자에 작동 가능하게 결합된 DNA 서열이 프로모터 및(또는) 터미네이터 (terminator)를 포함하는, 상기 13에 정의된 바와 같은 도입 유전자 발현 카세트; 및

15. 전사 활성화 인자에 작동 가능하게 결합된 DNA 서열로서, 발현될 바람직한 도입 유전자를 추가로 포함하는, 상기 14에 정의된 바와 같은 도입 유전자 발현 카세트.

또한, 본 발명은 상기 언급한 전사 활성화 인자를 포함하는 플라스미드 (예를 들면, 도입 유전자 발현 카세트), 및 그러한 플라스미드를 이용하여 도입된 전사 활성화 인자를 함유하는 트랜스제닉 식물에 관한 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 MITE-유사 인자인 IS2 인자의 구조를 나타내는 도면이다.

도 2는 본 발명에 따른 MITE-유사 인자인 IS1 인자, 및 그의 말단 역위 반복 서열과 삽입된 중복 서열 (밑줄 그어진 부분의 TA)의 구조를 나타내는 도면이다.

도 3은 gDCPAL3-pro/SK의 제작 방법을 나타내는 모식도이다.

도 4는 당근의 PAL 유전자인 gDCPAL3과 gDCPAL4의 구조를 비교하는 도면이다.

도 5는 본 발명 MITE-유사 인자 (IS1 인자)의 뉴클레오티드 서열과 지금까지 알려진 스토우어웨이 (Stowaway) 족 (문헌 [Bureau and Wessler, Plant Cell, 6: 907-917 (1994)])의 뉴클레오티드 서열을 비교한 결과를 나타내는 도면이다. 흑색 배경에 백색 문자로 표시된 서열은 상동성을 나타내는 말단 역위 반복 서열이다.

도 6은 본 발명의 MITE-유사 인자인 IS2 인자의 말단에서 발견되는 불완전 역위 반복 서열 및 표적 중복 서열 (밑줄 그어진 부분의 AAAAGAAAA)을 나타내는 도면이다.

도 7은 IS1-35S/SK의 제작 방법을 나타내는 모식도이다.

도 8은 IS2-35S/SK의 제작 방법을 나타내는 모식도이다.

도 9는 IS12-35S/SK의 제작 방법을 나타내는 모식도이다.

도 10은 MU3-35S/SK의 제작 방법을 나타내는 모식도이다.

도 11은 pIS1-35S/AB35S, pIS2-35S/AB35S, pIS12-35S/AB35S 및 pMU3-35S/AB35S의 제작 방법을 나타내는 모식도이다.

도 12는 작제물 pIS1-35S/AB35S (IS1), pIS2-35S/AB35S (IS2), pIS12-35S/AB35S (IS12) 및 pAB35S (35S) (대조군)의 도입에 의해 형질전환되어 배양된 담배 BY-2 세포로부터, 카나마이신을 함유하는 선별 배지 상에서 재생된 다수의 캘러스 (callus)들을 비교한, 실시예 3 (1)의 결과를 나타내는 도면이다. 이 도면에서, 상단 및 하단의 그래프는 각각 100 ㎍/ml 및 300 ㎍/ml의 카나마이신을 함유하 는 선별 배지를 이용하여 얻은 결과를 나타낸다.

도 13은 pAB35S (35S)의 도입에 의해 생성된 담배 캘러스 (대조군)의 GUS 활성 (좌측 그래프), 및 pIS12-35S/AB35S (IS12)의 도입에 의해 생성된 담배 캘러스의 GUS 활성 (우측 그래프)을 비교한, 실시예 3 (2)의 결과를 나타내는 도면이다.

Ⅰ. 신규 MITE-유사 인자

지금까지 발견된 공지의 MITE로는 상기 언급한 투어리스트 및 스토우어웨이 족 뿐만 아니라, 캐스트어웨이 (Castaway), 크래클 (Crackle), 에미그란트 (Emigrant), 익스플로러 (Explorer), 디토 (Ditto), 가이진 (Gaijin), 크리스피 (Krispie), 팝 (Pop), 스냅 (Snap), 완더러 (Wanderer), 우진 (Wujin), 우콩 (Wukong), 우넹 (Wuneng) 및 엑스비알 (Xbr) 족도 포함된다. 이들 MITE는 모두 말단 영역에 완전 또는 불완전 역위 반복 서열을 갖는다고 구조적으로 특성화되어 있지만, 역위 반복 서열들은 MITE의 종류에 따라 뉴클레오티드 서열 및 길이가 서로 매우 다르다. 또한, MITE의 표적 중복 서열은, 투어리스트 족의 경우 TAA이고, 스토우어웨이 족의 경우 TA이며, 캐스트어웨이 족의 경우 TAA이고, 크래클 족의 경우 GTTGATAT이며, 디토 족의 경우 TTA이고, 에미그란트 족의 경우 TA이며, 가이진 족의 경우 ATT, TAG, TGA, GGT, GTT 또는 GAA이고, 크리스피 족의 경우 TTGAAC이며, 팝 족의 경우 AAAACAAA 또는 AAAAAAAA이고, 스냅 족의 경우 TTTTTTT이며, 완더러 족의 경우 TTA 또는 TAA이고, 우진 족의 경우 TA 또는 CATA이며, 우콩 족의 경우 TATA 또는 TACA이고, 우넹 족의 경우 TTAA 또는 TTAT이며, 엑스비알 족의 경우 TTAA이다 (익스플로러 족의 경우에는 어떤 한정된 표적 중복 서열도 발견되지 않음) (문헌 [Bureau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8524-8529 (1996)], 문헌 [Casacuberta et al., Plant J., 16: 79-85 (1998)], 문헌 [Song et al., Mol. Gen. Genet., 258: 449-456 (1998)], 문헌 [Tu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 7475-7480 (1997)], 문헌 [Unsal and Morgan, J. Mol. Biol., 248: 812-823 (1995)] 참조).

한편, 본 발명의 상기 신규 MITE-유사 인자의 한 실시양태인 IS2 인자는 표적 중복 서열로서 (A)nG(A)n [n은 1 이상의 정수임]을 가지며, 이는 지금까지 알려진 MITE들 (삽입 인자) 중 어느 것에서도 발견되지 않는다. 이점에 있어서, IS2 인자는 지금까지 알려진 삽입 인자의 족들 중 어느 것과도 다른 신규한 족에 속한다고 말할 수 있다.

본 발명의 신규 MITE-유사 인자의 한 실시양태인 IS1 인자는 표적 중복 서열로서 TA를 가지기 때문에 공지된 스토우어웨이 족에 속하는 신규 MITE-유사 인자라고 말할 수 있다 (문헌 [Bureau, T. E. and Wessler, S. R., Stowaway: a new family of inverted repeat elements associated with the genes of both monocotyledonous and dicotyledonous plants. Plant Cell, 6: 907-16 (1994)] 참조).

이들 IS2 및 IS1 인자에 대해 하기에 설명한다.

1. IS2 인자

IS2 인자는 게놈 유전자의 삽입 부위에서 (A)nG(A)n의 표적 중복을 야기하는 특징이 있다. 숫자 n은 1 이상의 어떠한 정수일 수도 있다. 특별히 한정되지는 않지만, 구체적으로 예를 들면 2 내지 6, 바람직하게는 3 내지 5, 더욱 바람직하게는 4이다.

더욱 구체적으로, 본 발명의 MITE-유사 인자는 크기가 약 2 kb 이하, 바람직하게는 약 0.2 내지 2 kb인 DNA이며, 5' 및 3' 말단 영역에 서로에 대해 반대 방향인 반복 서열 (말단 역위 반복 서열)을 갖는다.

그러한 관점에서, 본 발명의 IS2 인자는 상기 언급한 MITE의 3가지 특성에 관한 요구조건을 충족한다 (문헌 [Wessler et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 914-821 (1995)] 참조). 여기서, 3가지 특성이란 (1) 5' 및 3' 말단에 각각 완전 또는 불완전 역위 반복 서열을 갖고, (2) 유전자 삽입 부위의 역위 반복 서열의 양쪽 모두에 2개 이상의 염기쌍을 함유하는 반복 서열이 동일한 방향으로 표적 중복 서열로서 나타나며, (3) 그 크기가 2 kb 이하인 것을 의미하며, 그러므로 MITE-유사 서열을 갖는 전이 인자 (삽입 인자, MITE-유사 인자)로서 확인될 수 있다.

본 발명의 IS2 인자는 그 뉴클레오티드 서열이 화학식 (1) 또는 화학식 (2)로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을, 연속적 또는 불연속적으로 반복되는 방식으로 함유한다는 구조적 특징이 있다.

<화학식 1>

XttgcaaY

(X는 g 또는 t를 나타내고, Y는 a 또는 c를 나타냄; 서열 4 내지 7)

<화학식 2>

Zatgcaa

(Z는 t 또는 a를 나타냄; 서열 8 내지 9)

그러한 반복 서열의 위치 및 수가 특별히 한정되지는 않지만, IS2 인자의 양쪽 말단 영역에 나타나는 말단 역위 반복 서열에 포함되거나, 또는 상기 말단 역위 반복 서열들 사이에 나타나는 중간 영역에 포함될 수 있다.

본 발명의 IS2 인자로는, 도 1에 도시되는 바와 같이 말단 역위 반복 서열들 사이에 상기 화학식 (1) 및 (2)로 표시되는 다수의 반복 서열을 함유하고 말단 역위 반복 서열에 화학식 (1)로 표시되는 다수의 반복 서열을 함유하는 것들이 포함된다.

본 발명의 IS2 인자를 갖는 말단 역위 반복 서열이 서로 엄격하게 상보적일 필요는 없지만, 5' 및 3' 말단 영역이 엄격한 조건하에서 서로 혼성화될 수는 있어야 하며, 그 결과 IS2 인자가 도 1에 도시되는 바와 같은 스템 (stem) 구조를 가질 수 있어야 한다. 이 관점에서, 본 발명의 IS2 인자는 말단 역위 반복 서열로서 완전 역위 반복 서열 뿐만 아니라, 말단 역위 반복 서열로서 불완전 역위 반복 서열도 포함한다.

본 발명의 IS2 인자에 대한 구체적인 예로는, 말단 역위 반복 서열로서, 5' 말단 영역에는 서열 10으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖고 3' 말단 영역에는 서열 11로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 인자들을 언급할 수 있다. 더욱 구체적인 IS2 인자의 예로는 서열 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 인자를 언급할 수 있다. IS2 인자는, 결과의 변이체가 실질적으로 IS2 인자 자체의 기능 또는 활성을 갖는 기능적 등가물로 남아있다면, 말단 역위 반복 서열에서 또는 상기 반복 서열들 사이에 나타나는 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 치환, 부가 또는 결실될 수 있다. 본 발명의 MITE-유사 인자에는 그러한 기능적 등가물도 포함된다.

바람직한 기능적 등가물로는, 서열 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 IS2 인자의 실질적인 기능 또는 활성을 갖고, 삽입 부위에서 (A)nG(A)n [n은 1 이상의 정수임]의 표적 중복을 야기하며, 엄격한 조건하에서 상기 IS2 인자와 혼성화될 수 있는 것들을 언급할 수 있다. "엄격한 조건"이란 용어는 1×SSC 및 0.1 중량/중량％의 SDS 중에서 50℃ 이상의 온도로 1 시간 넘게 반응시키는 조건을 의미한다. 더욱 구체적인 기능적 등가물로는, 뉴클레오티드가 서열 1로 표시되는 IS2 인자와 70％ 이상, 바람직하게는 85％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 더 바람직하게는 95％ 이상의 상동성을 나타내는 것들을 언급할 수 있다.

2. IS1 인자

본 발명의 IS1 인자는 게놈 유전자 삽입 부위에서 TA의 표적 중복을 야기하며, 말단 역위 반복 서열로서 5' 말단 영역에는 서열 12로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖고 3' 말단 영역에는 서열 13으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 특징이 있다. 본 발명의 IS1 인자는 구체적으로 크기가 약 1 kb 이하, 바람직하게는 약 100 bp 내지 500 bp인 DNA이다. 이러한 사실들에 기초하여, 본 발명의 IS1 인자는 상기 언급한 IS2 인자와 유사하게 MITE-유사 인자로서 정의될 수 있다.

본 발명의 IS1 인자로서 구체적으로 언급할 수 있는 것으로는, 도 2에 도시된 구조를 갖는 것이 있다. 더욱 구체적으로는 서열 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 언급할 수 있다. 그러한 뉴클레오티드 서열을 갖는 MITE-유사 인자는, 결과의 변이체가 실질적으로 MITE-유사 인자 자체의 기능 또는 활성을 갖는 기능적 등가물로 남아있다면, 말단 역위 반복 서열에서 또는 이들 5' 및 3' 말단 영역의 서열들 사이에 나타나는 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 치환, 부가 또는 결실될 수 있다. 본 발명의 MITE-유사 인자에는 그러한 기능적 등가물도 포함된다.

기능적 등가물로서 바람직한 것은, 서열 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 MITE-유사 인자 (IS1 인자)의 실질적인 기능 또는 활성을 가지며, 뉴클레오티드 서열이 상기 IS1 인자와 85％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 95％ 이상의 상동성을 나타내는 것이다.

본원의 상기에 기재된 MITE-유사 인자 (IS2 및 IS1 인자)는 모두 당근의 게놈, 더욱 구체적으로는 본원의 하기에 언급되는 당근의 페닐알라닌 암모니아-분해효소 유전자에서 발견되었으며, 이는 본원 하기의 실시예 단락에 기재되는 바와 같이 단리 및 회수될 수 있다. 본 발명의 MITE-유사 인자가 상기 언급한 구조 및 특성을 갖는다면, 그 기원이 제한되지는 않는다.

일반적으로, 전이 인자는 식물 게놈 자체의 자가 변이 메카니즘으로서 관련 생물체의 진화 및 환경 적응에 현저하게 기여할 수 있을 것으로 지적되고 있다.

본 발명의 MITE-유사 인자와 관련하여, 식물 게놈의 자가 변이 메카니즘과 관련된 기능을 하는 메카니즘이 공지되어 있다. 그러나, 레트로트랜스포손의 경우 와는 달리 (문헌 [McDonald, BioScience 40: 183-191 (1990)] 참조), 인핸서 요소를 내부에 가지고 있다는 사실과, 유전자 프로모터가 상기 인핸서 요소의 전이 결과로서의 삽입에 의해 활성화된다는 사실이 발견되지 않는다.

따라서, 본 발명의 MITE-유사 인자가 식물 게놈으로 삽입되면 게놈 구조의 변화를 유발할 가능성이 높은 것으로 여겨지며, 이에 의해 지금까지 알려진 인핸서 요소의 메카니즘과는 매우 다른 메카니즘을 통해 게놈 DNA의 풀리는 정도 (unwindability) 변화 또는 뉴클레오좀의 구조 변화 등, 게놈 구조가 역동적으로 변화하는데 기여할 수 있을 것으로 생각된다.

본 발명의 MITE-유사 인자를 적절히 이용하면, 지금까지 알려진 것과는 다른 기술에 의해 상기 인자의 근방에 위치한 유전자의 발현을 제어할 수 있다. 일반적으로, 외래 유전자가 게놈 DNA의 불활성 부위에 삽입되는 경우에는 그 유전자의 발현이 억제 또는 불활성화된다고 지적하고 있다. 따라서, 본 발명의 MITE-유사 인자를 상기 특성에 기초하여 이용하면, 트랜스제닉 기술에 의해 도입된 외래 유전자의 감소 또는 억제된 발현 능력을 증진시키거나 활성화시킬 수 있으리라 생각된다. 따라서, 본 발명의 MITE-유사 인자는 유전자 조작된 식물을 안정하게 생성하기 위한 트랜스진 (transgene) 발현 카세트 및 상기 카세트를 포함하는 플라스미드를 제작하는데 유용하며, 또한 상기 카세트 및 플라스미드를 이용하여 트랜스진을 발현시킬 수 있는 유전자 조작 생물체를 안정하게 생성하는데 유용하다.

Ⅱ. 전사 활성화 인자

추가로, 본 발명은 전사 활성화 인자에 관한 것이다.

본원에서 전사 활성화 인자로 불리우는 것에는, 상기 인자의 근방 또는 주변에 위치한 일군의 유전자의 전사를 촉진할 수 있는 인자 뿐만 아니라, 위치 효과에 기인한 유전자 침묵에 의해 게놈 DNA 등에 도입된 원하는 외래 유전자가 억제되는 것을 저해할 수 있는 인자가 포함된다. 전사 활성화를 담당하는 것으로 지금까지 알려진 인자들은 각각, 인핸서로서 특정 유전자의 프로모터에 인접하여 나타나 상기 프로모터에 직접 시스로 작용하여 (cis-acting) 상기 유전자의 전사를 활성화시킨다. 이와는 반대로, 본 발명의 전사 활성화 인자는 프로모터에 대한 위치와 무관하게 자신의 근방 또는 주변에 위치하는 단일 유전자 또는 일군의 다수 유전자의 전사를 촉진하며, 추가로 고유의 전사 불활성화 현상을 억제함으로써 실질적으로 전사를 촉진하는 인자들을 포함하기 때문에, 개념적으로는 선행 기술의 전사 활성화 인자에 대한 개념보다 더 넓은 범위의 인자들을 포함한다.

본 발명의 전사 활성화 인자는 하나 이상의 전이 인자를 포함하는 특징이 있다.

본원에서 전이 인자로 불리우는 것은 상기 언급한 DNA형과 RNA형의 인자 및 MITE 모두를 포함한다. 따라서, 본 발명의 전사 활성화 인자에는 동일한 종에서 유래하든 상이한 종에서 유래하든 무관하게 전이 인자로서 이들 중 하나 이상을 포함하는 인자들이 포함된다.

바람직한 전사 활성화 인자는 전이 인자로서 MITE를 포함한다.

MITE는 상기 언급한 바와 같이 (1) 5' 및 3' 말단 영역에 각각 완전 또는 불완전 역위 반복 서열을 갖고 (이는 DNA형 전이 인자와 유사함), (2) DNA형 전이 인 자가 게놈 DNA로 삽입될 때 형성되는 것과 유사하게, 동일한 방향으로 배열되는 반복 서열을 포함하고 2개 염기쌍 이상을 함유하는 표적 중복-유사 서열이 역위 반복 서열의 양쪽 말단 모두에 나타나며, (3) 일반적으로 2 kb 미만의 크기를 갖는다 (문헌 [Wessler et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 914-821 (1995)] 참조)는 특징이 있는 것으로 정의되며, 그러한 정의의 카테고리에 속하는 임의의 MITE는 본 발명을 수행함에 있어서 전이 인자로 사용할 수 있다. 특히 적합한 MITE로서, 무엇보다도 상기 언급한 본 발명의 신규 MITE-유사 인자, 즉 "IS2 인자", "IS1 인자" 및 그에 대한 기능적 등가물을 언급할 수 있다.

따라서, 본 발명의 전사 활성화 인자는 바람직하게는 상기 IS2 인자, IS1 인자 및 그에 대한 기능적 등가물들 사이에서 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 전사 활성화 인자는 무엇보다도 (1) IS1 인자 또는 그의 기능적 등가물의 뉴클레오티드 서열을 갖는 인자, (2) IS2인자 또는 그의 기능적 등가물의 뉴클레오티드 서열을 갖는 인자, (3) IS1 인자 또는 그의 기능적 등가물의 뉴클레오티드 서열과, IS2인자 또는 그의 기능적 등가물의 뉴클레오티드 서열이 탠덤으로 결합된 뉴클레오티드 서열을 갖는 인자 (IS1 인자와 IS2 인자의 순서는 바뀔수 있음) 및 (4) IS1 인자 (또는 IS2 인자) 또는 그에 대한 기능적 등가물과, IS2 인자 (또는 IS1 인자) 또는 그에 대한 기능적 등가물이 임의의 뉴클레오티드 서열을 통해 결합된 뉴클레오티드를 갖는 인자를 포함한다. 전사 활성화 인자의 바람직한 예로는 (i) IS2 인자 또는 그에 대한 기능적 등가물 및 (ii) IS1 인자 (또는 IS2 인자) 또는 그에 대한 기능적 등가물과, IS2 인자 (또는 IS1 인자) 또는 그에 대한 기능적 등가물이 탠덤으로 결합된 생성물을 언급할 수 있다. 후자인 (ii)에 대한 구체적인 예로는 서열 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 언급할 수 있다.

상기 (4)에 언급한 전사 활성화 인자에 있어서, IS1 인자와 IS2 인자 (순서는 바뀔수 있음) 사이에 개재되는 뉴클레오티드 서열이 특별히 한정되지는 않지만, 본 발명의 효과에 반하지 않는다면 어떠한 뉴클레오티드 서열이어도 무방하다. 구체적으로 예를 들면, 당근의 PAL 프로모터 서열로부터 유래한 서열을 언급할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, 그러한 뉴클레오티드 서열의 크기는 5 내지 1,000 bp, 바람직하게는 300 내지 500 bp이다. 그러한 실시양태의 전사 활성화 인자로는 구체적으로 서열 14로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 인자를 언급할 수 있다.

본 발명의 전사 활성화 인자는 식물체에 도입될 원하는 유전자 서열 (외래 유전자 서열을 포함하는 트랜스진 서열)에 작동 가능하게 결합될 수 있으며, 또한 상기 트랜스진 서열에 결합된 전사 활성화 인자는 식물에서 기능하는 프로모터 및(또는) 식물에서 기능하는 터미네이터와 같은 기능성 DNA 서열 또는 서열들에 작동 가능하게 결합될 수 있다.

본원에 사용된 "작동 가능하게 결합된"이란 표현은, 전사 활성화 인자가 상기 언급한 트랜스진 서열 또는 다양한 기능성 DNA 서열에 충분히 가깝게 위치하여 삽입 부위 및 방향에 무관하게 이들 서열에 영향을 미치는 것을 의미한다.

본 발명을 수행하는데 사용되는 트랜스진에는, 특정 식물에 대해 동종성이든 이종성이든 상기 식물에서 발현되기를 바라는 DNA가 포함된다. 그러한 트랜스진에는 β-글루쿠로니다제를 코딩하는 유전자; 항생제 내성 유전자; 살충성 및 살균성 단백질 독소를 코딩하는 유전자; 항-병원성 화합물에 대한 유전자; 퍼옥시다제, 글루카나제, 키티나제 및 파이토알렉신과 같은 과민성 화합물을 합성하는 유전자; 농약, 제초제 및 살미생물제 내성 유전자; 식물 효소를 합성하는 유전자 (예를 들어, 단백질, 전분, 당류 및 지질의 함량 및 질과 관련된 효소) 및 이들의 조절 인자에 대한 유전자; 프로테아제 억제제 및 아밀라아제 억제제와 같은 식물 효소 억제제와 관련된 유전자; 식물 호르몬 합성에 관여하는 유전자; 곤충 호르몬 및 페로몬 합성에 관여하는 유전자; β-카로틴 및 비타민과 같은 의약 화합물 및 영양성 화합물의 합성에 관여하는 유전자; 및 식물에 나타나는 뉴클레오티드 서열을 방해하는 안티센스 전사물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다 (문헌 [Transgenic Plant, vol. 1, Academic Press, 1993] 참조).

또한, 본 발명은 식물에 사용하기 적합한 유전자 발현 카세트에 관한 것이며, 이는 상기 전사 활성화 인자와 여기에 작동 가능하게 결합된 DNA 서열 또는 서열들을 포함한다. 본원에서 "유전자 발현 카세트"라 불리우는 것은 식물에 도입하는데 사용될 플라스미드 및 그의 하위 단편을 의미한다.

전사 활성화 인자에 작동가능하게 결합된 DNA 서열로는 프로모터 및 터미네이터와 같은 기능성 DNA 서열들을 언급할 수 있다. 상기 DNA 서열은 상기 언급한 어떤 트랜스진 서열도 포함할 수 있다.

본원에서 프로모터라 불리는 것은, 원하는 단백질에 대한 구성 유전자가 상기 프로모터의 하류에 결합된 경우에 식물 세포에서 전사 및 그 이후의 번역을 통해 상기 단백질의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미하며, 여기에는 식물에서 기능을 나타내고 관련 분야에서 식물의 형질전환을 위해 사용되는 모든 프로모터가 포함된다. 식물의 형질전환에 있어서, 아그로박테리움 투메파시엔스 ( Agrobacterium tumefaciens )로부터 단리된 프로모터, 즉 옥토핀 신타아제 (ocs) 프로모터 (문헌 [L. Comai et al., 1985], 문헌 [C. Waldron et al., 1985] 참조), 만노핀 신타아제 (mas) 프로모터 및 나팔린 신타아제 (nos) 프로모터를 비롯한 다수의 프로모터가 지금까지 사용되어 왔다. 형질전환에 통상적으로 사용되는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터도 본 발명을 수행하는데 적절하게 사용될 수 있다. 35S 프로모터의 변이체, 예를 들어 2개의 병렬 35S 프로모터 (문헌 [R. Kay et al., 1987]) 및 mas-35S 프로모터 (문헌 [L. Comai et al., 1990])도 사용될 수 있다. 또한, 꽃양배추 모자이크 바이러스 19S 프로모터 (문헌 [J. Paszkowski et al., 1984]) 및 현삼 (scrophularia) 모자이크 바이러스 유래의 34S 프로모터 (문헌 [M. Sanger et al., 1990])도 포함될 수 있다. 추가의 예로는, 식물 유래의 프로모터인 액틴 프로모터 및 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제의 작은 서브유닛 (rbcS) 프로모터 등을 언급할 수 있다.

터미네이터에는 식물에서 원하는 구성 유전자의 전사를 효율적으로 종결시킬 수 있는 DNA 서열들이 포함되며, 여기에는 관련 분야에서 형질전환에 사용된 식물에서 기능을 나타내는 모든 터미네이터들이 포함된다. 구체적으로는, 예를 들어 노팔린 신타아제 (nos) 터미네이터를 전형적인 예로서 언급할 수 있다.

본 발명의 전사 활성화 인자 또는 상기 인자를 포함하는 트랜스진 발현 카세트는 식물에서 도입된 유전자의 발현을 유도 또는 조절하는데 사용될 수 있으며, 이는 통상적으로 식물에서 널리 사용되는 것이다.

식물이 특별히 제한되지는 않지만, 여기에는 무엇보다도, 외떡잎 식물이든 쌍떡잎 식물이든 무관하게 농업상 유용한 식물이 포함된다. 외떡잎 식물의 예로는 옥수수, 벼, 밀, 보리, 아프리카 또는 인도 수수, 귀리, 호밀, 기장 및 기타 곡식용 작물 뿐만 아니라, 백합, 난초, 붓꽃, 야자, 튜울립, 사초 및 기타 다양한 장식용 식물들이 포함된다. 쌍떡잎 식물에는 국화, 금어초, 카네이션, 목련, 양귀비, 양배추, 장미, 완두, 포인세티아, 목화, 선인장, 당근, 월귤나무, 박하, 해바라기, 토마토, 느릅나무, 참나무, 단풍나무, 포플라, 대두, 메론, 사탕무, 평지, 감자, 상추 및 카리카 파파야 등이 포함된다.

또한, 본 발명은 본 발명의 전사 활성화 인자, 또는 상기 인자를 포함하는 본 발명의 트랜스진 발현 카세트를 함유하는 트랜스제닉 식물을 제공하며, 여기서 상기 트랜스제닉 식물은 도입된 외래 유전자의 위치 효과에서 기인한 유전자 침묵 (불활성화) 현상이 억제되거나 상기 외래 유전자의 전사가 활성화되어 있다. 상기 트랜스제닉 식물에는 그의 후손도 포함된다.

본원에서 사용되는 "식물"이란 용어에는 완전한 식물체 뿐만 아니라, 잎, 종자, 구근 또는 자른 가지와 같은 식물체의 일부도 포함된다. 또한, 식물에는 원형질체 (protoplast), 식물 캘러스, 메리클론 (mericlone) 및 식물-유사 세포도 포함 된다.

그러한 트랜스제닉 식물을 생성하는 방법이 특별히 한정되지는 않지만, 관련 분야에서 통상적으로 사용되는 DNA 도입 기술이면 어떤 것이라도 무방하다. 구체적으로, 상기 방법은 본 발명의 전사 활성화 인자를 포함하는 발현 플라스미드 또는 상기 인자를 포함하는 트랜스진 발현 카세트를 이용하여 식물 세포에 DNA를 도입하는 것이며, 여기에는 무엇보다도 아그로박테리움 방법, 전기적 방법 (전기천공법) 및 파티클 건 (particle gun) 방법과 같은 공지된 방법이 포함된다.

이와 같이 얻은, 본 발명의 전사 활성화 인자, 상기 인자를 포함하는 트랜스진 발현 카세트 또는 발현 플라스미드를 함유하는 식물 세포는, 예를 들어 문헌 [S. B. Gelvin, R. A. Schilperoot and D. P. S. Verma: Plant Molecular Biology Manual (1991), Kluwer Academic Publishers] 또는 [Valvekens et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 5536-5540 (1998)]에 기재된 식물 조직 배양 기술에 사용되는 통상적인 방법 중 하나에 의해 재생될 수 있으며, 이에 의해 식물체 또는 상기 식물 세포로부터 유래한 그의 일부를 얻을 수 있다.

본 발명의 발현 플라스미드는, 이 플라스미드가 전사 활성화 인자 및 기능성 DNA 서열 (예를 들어, 프로모터 및 터미네이터)과 함께 도입될 목적 DNA 서열 (트랜스진)을 함유한다면 어느 것이어도 무방하다. 그러나, 이들 DNA 서열은 서로 작동가능하게 결합된 것이 바람직하다. "작동가능하게 결합된"이란 어구는 플라스미드가 의도된 목적에 부합하여 기능하는 것을 의미한다. 구체적으로는, 해당 플라스미드가 식물 세포에 도입되는 경우에 원하는 트랜스진 (구성 유전자)이 전사 활 성화 인자의 조절하에 발현되고, 상기 플라스미드에 포함된 프로모터를 불활성화시키지 않으면서 터미네이터에 의해 발현이 효율적으로 종결되는 것을 의미한다.

추가로, 본 발명은 식물에서 트랜스진을 발현시키는 방법을 포함한다. 이 방법은 적어도, 상기 언급한 바와 같이 트랜스진이 통합된 상태로 트랜스진 발현 카세트를 식물에 도입하는 단계 및 상기 식물에서 상기 트랜스진을 발현시키는 단계를 포함하여 수행될 수 있다. 식물에 트랜스진 발현 카세트 (DNA)를 도입하는 것과 상기 트랜스진을 발현시키는 것은 모두 그 자체로 당업계에 공지된 기술 (문헌 [Plant Molecular Biology Manual, 1991, Kluwer Academic Publishers] 참조)에 의해 수행될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 좀 더 자세하게 설명하고 있다. 그러나, 이는 결코 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다. 본 발명의 실시에서 사용된 유전 공학 기술 및 분자 생물학의 실험 방법 (제한 효소 처리 조건, 리게이션 반응 조건, 에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli) 내로의 형질전환 등)은 특히 예를 들어, 문헌 [J. Sambrook, E.F. Frisch, T. Maniatis: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 및 문헌 [D.M. Glover: DNA Cloning, IRL Press, 1985]에 기술된 바와 같이 일반적으로 수행되고 널리 사용될 수 있다.

실시예 1

1) 표적 식물, 표적 유전자

MITE-유사 인자를 찾기 위해, 당근 (Daucus carota L. cv. Kurodagosun)을 표적 식물로서, 그리고 상기 당근의 페닐알라닌 암모니아-분해효소 (PAL)를 표적 유전자로서 사용하였다.

2) 당근 PAL 유전자 gDCPAL3 및 gDCPAL4의 클로닝

당근 게놈 DNA 라이브러리로부터 당근 게놈 서열을 클로닝하였다. 상기 당근 게놈 DNA 라이브러리는 본 발명자가 이전에 기술한 것처럼 (문헌 [Ozeki, Y., Davies, E. and Takeda, J.: Structure and expression of chalcone synthase gene in carrot suspension cultured cells regulated by 2,4-D. Plant Cell Physiol., 34:1029-1037 (1993)] 참조) 배양된 당근 세포 (문헌 [Ozaki, Y. and Komamine, A.: Induction of anthocyanin synthesis in relation to embryogenesis in a carrot suspension culture; Correlation of metabolic differentiation with morphological differentiation. Physiol. Plantarum, 53:570-577 (1981)] 참조)로부터 λEMBL3 벡터 (토요보 (Toyobo) 제품)를 사용하여 제작되었다.

구체적으로, 당근 게놈 DNA는 동결-건조된 당근으로부터 머레이 (Murray)와 톰슨 (Thompson)의 방법 (1980) (문헌 [Murray, M.G. and Thompson, W.F.; Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucl. Acids Res. 8:4321-4325 (1980)] 참조)에 따른 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB) 용액을 사용하여 제조하였다. 얻어진 게놈 DNA를 Sau 3AI으로 부분적으로 분해시키고, 수크로스 밀도 구배법에 의해 분해된 DNA를 크기에 따라 분류하였다. 15 내지 20 kbp 내의 DNA 단편을 수득하고 Bam HI으로 절단된 λEMBL3 벡터에 리게이션시킨 후, 이어서 파지 입자 내에 팩키징 (packaging)시켜 당근 핵 라이브러리를 제작하였다.

그후, 오제키 (Ozeki) 등의 방법 (문헌 [Ozeki, Y., Matsui, K., Sakuta, M., Matsuoka, M., Ohashi, Y., Kano-Murakami, Y., Yamamoto, N, and Tanaka, Y.: Differential regulation of phenylalanine ammonia-lyase genes during anthocyanin synthesis and by transfer effect in carrot cell suspension cultures. Physiol. Plantarum, 80:379-387 (1990)] 참조)에 의해 클로닝된 PAL cDNA (ANT-PAL cDNA)를 프로브로 사용하여 당근 게놈 라이브러리를 당근 PAL 게놈 클론에 대해 스크리닝하였다 (문헌 [Sambrook et al., 1989] 참조). 당근 게놈 라이브러리의 스크리닝을 위해 6 x SSC, 60 mM 인산 나트륨 (pH 6.8), 10 mM EDTA, 1％ SDS, 0.02％ 폴리비닐피롤리돈, 0.02 ％ Ficoll 400 및 변성된 연어 정자 DNA 100 ㎍/㎖을 함유하는 용액을 68℃에서 밤새 처리하여 혼성화하였다. 막 세척은 실온에서 0.5％ SDS를 함유하는 2 x SSC 용액으로 2회 (15 분 x 2), 실온에서 0.1％ SDS를 함유하는 0.1 x SSC 용액 또는 1 x SSC 용액으로 2회 (10 분 x 2), 그리고 최종적으로 68℃에서 0.1 x SSC 용액으로 2회 (30분 x 2) 수행하였다.

결과, 양성 클론 8개를 얻었다. 그러한 클론에 대해 제한 효소 맵핑을 수행하여, 그 맵에 따라, 상기 클론을 각각 gDCPAL3 및 gDCPAL4로 명명된 두개의 유전자로 분류할 수 있었다.

gDCPAL3을 가지고, 문헌 [Sambrook et al. (1989)]에 기술된 방법에 따라 양성 클론의 λ파지를 배양하고, λDNA를 추출하고, Bam HI로 절단하고, 나일론 막에 서던 (Southern) 전달되도록 하였다. 이를 통해, 상기 언급한 ANT-PAL cDNA를 EcoRI으로 절단하고 그의 DNA 단편 (984 bp)을 5' 말단에서 [³²P]로 라벨링하여 제조한 프로브를 사용하여 서던 분석을 수행하였고, 상기 프로브와 혼성화된 2.77 kbp DNA 단편을 얻었다. 이 DNA 단편을 Bam HI으로 절단하고 송아지 장 알칼라인 포스파타제 (CIP)를 처리한 pBluescript SK 플라스미드 내에 서브클로닝하여 gDCPAL3-pro/SK (도 3 참조)를 얻었다. 그후, 얻어진 gDCPAL3-pro/SK 플라스미드를 제한 효소인 Sal I 및 Apa I으로 절단하고, 문헌 [Sambrook et al. (1989)]에 기술된 방법에 따라 엑소뉴클레아제 III 및 완두 뉴클레아제를 사용하여 일련의 결실 DNA 단편군을 생성하였고, 이들을 사용하여 gDCPAL3 DNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 전사 개시 부위 (+1)는 오제키 및 타케다 (Takeda) (1994) (문헌 [Regulation of phenylalanine ammonia-lyase genes in carrot suspension cultured cells. Plant Cell. Tissue and Organ Culture, 38:221-225 (1994)] 참조)에 의해 기술된 바와 같이 당근으로부터 추출한 mRNA를 사용하여 프라이머 확장법에 의해 발견된 띠의 위치에 의거하여 결정하였다.

gDCPAL4로 gDCPAL4-pro/SK 플라스미드를 제작하고, 상기 DNA에 대응하는 gDCPAL4 DNA의 뉴클레오티드 서열을 유사한 방식으로 결정하였다. 구체적으로, 양성 gDCPAL4 클론의 λ파지로부터 얻은 λDNA를 Hind III 및 Bam HI로 절단하고, 상기 언급한 프로브와 동일한 프로브를 사용하여 서던 분석을 수행하고, 그 프로브와 혼성화되는 1.63 kbp DNA 단편을 Hind III 및 Bam HI으로 절단하고, CIP를 처리한 pBluescript SK 플라스미드 내에 서브클로닝하여 gDCPAL4-pro/SK 플라스미드를 얻 었다. 그후, 상기에서처럼 얻어진 gDCPAL4-pro/SK 플라스미드를 제한 효소인 Xba I 및 Bst XI으로 절단하고, 문헌 [Sambrook et al. (1989)]에 기술된 방법에 따라 엑소뉴클레아제 III 및 완두 뉴클레아제를 사용하여 일련의 결실 DNA 단편군을 생성하였고, 이들을 사용하여 gDCPAL4 DNA의 뉴클레오티드를 결정하였다.

3) 결과

gDCPAL3 및 gDCPAL4의 뉴클레오티드 서열 비교시 gDCPAL3의 프로모터 영역은 gDCPAL4에서는 발견되지 않는 불완전 역위 반복 서열이 있는 미니어처 역위-반복 전이 인자 (MITE)를 가지고 있으며, 이는 -1897 내지 -1599 (길이 299 bp) 및 -1157 내지 -389 (길이 769 bp)로 불리우는 두 부위에서 존재하고 있는 것으로 나타났다 (도 4). 이들 서열은 각각 IS1 및 IS2로 명명되었다.

이들 서열 및 삽입 부위 주위의 뉴클레오티드 서열을 오토시퀀서 (autosequencer) (라이커 (LICOR) 모델 4000L 제품)를 사용하여 시퀀싱하였다. IS1의 뉴클레오티드 서열은 서열 2로 표시되며, IS2의 뉴클레오티드 서열은 서열 1로 표시된다.

이들 IS1 및 IS2의 특성은 하기와 같다.

(1) IS1

서열 2로 표시된 뉴클레오티드 서열을 가지며 (총 길이: 299 bp), 5' 및 3' 말단 영역에서 서로에 대해 불완전한 역위 반복 서열이 있고 (32 bp), 표적 유전자로서 작용하는 게놈으로의 삽입 부위에 표적 중복 서열인 TA가 있다. 이러한 사실에 근거하여 기존에 알려진 스토우어웨이 (Stowaway)족 (문헌 [Bureau, T.E. and Wessler, S.R. Stowaway: a new family of inverted repeat elements associated with the genes of both monocotyledonous and dicotyledonous plants. Plant Cell, 6:907-16 (1994)] 참조)에 속하는 신규 MITE 인자의 유전자 서열일 것으로 예상하였다. IS1 인자의 스템 구조 및 말단의 역위 반복 서열 영역의 구조와 삽입 부위 영역의 구조가 도 2에 도시되어 있다.

얻어진 뉴클레오티드 서열 정보에 근거하여, 상용 데이타베이스 (예, GENE TYX-MAC/CD1995)를 이용해서 뉴클레오티드 서열의 상동성 분석을 수행하였고, 이를 통해 말단 역위 반복 서열 내에서 스토우어웨이족에 속하는 MITE 인자의 유전자 서열과 70 내지 90％의 상동성이 발견되었다. 따라서, 상기 인자가 스토우어웨이족에 속하는 전이 인자임을 확증하였다 (도 5).

(2) IS2

서열 1로 표시된 뉴클레오티드 서열을 가지며 (총 길이: 769 bp), 5' 및 3' 말단 영역에서 서로에 대해 불완전한 역위 반복 서열이 있고 (158 bp), 표적 유전자로서 작용하는 게놈으로의 삽입 부위에 표적 중복 서열인 AAAAGAAAA가 있다. 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 상동성을 비교하였지만, 공지된 전이 인자와는 상동성이 관측되지 않았다. 따라서, 이는 기존에 공지된 어떠한 전이 인자족에도 속하지 않는 신규 족을 이루는 전이 인자, 특히 MITE-유사 인자임을 발견하였다. IS2 인자의 전반적인 구조 (스템 구조)는 도 1에 도시되어 있고, 그의 말단 역위 반복 서열 영역 및 삽입 부위의 구조 (뉴클레오티드 서열)은 도 6에 도시되어 있다.

실시예 2

(1) IS1, IS2, IS12 및 MU3의 클로닝

(i) IS1의 클로닝 (도 7)

실시예 1에서 뉴클레오티드 서열 결정에 사용하였던 것과 같은 gDCPAL3 프로모터 영역의 3' 말단으로부터 유래된 결실 DNA 단편이 있는 플라스미드 중에서 -1581까지 결실된 플라스미드 (gDCPAL3-IS1/SK)를 선별하여, Kpn I로 플라스미드를 절단하고, T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 블런트-말단을 만들고, Sca I로 절단하고, 이어서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 321 bp DNA 단편을 절개해 내었다. Hinc II로 절단하고 CIP를 처리한 pBluescript SK 플라스미드 내에 이를 서브클로닝하였다. 상기 서브클로닝에 의해 얻은 다수의 독립적인 클론을 보유하는 에셰리키아 콜라이의 콜로니로부터 플라스미드를 추출하고, 그의 뉴클레오티드 서열을 결정하여 삽입된 각 DNA 단편의 방향을 확인하였다. 이러한 방식으로, IS1의 5' 말단 측면이 pBluescript SK 플라스미드의 다중 클로닝 부위에서 Kpn I의 측면에 삽입된 플라스미드를 선별하고, 이를 IS1/SK로 명명하였다. 나아가, pBI221 (Clontech Inc.)를 Hind III 및 Sma I으로 절단하여 얻은 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (35S) 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 수득하고, Hind III 및 Sma I으로 절단하고 CIP를 처리한 pBluescript SK 플라스미드 내에 서브클로닝하여 35S/SK로 명명한 플라스미드를 얻었다. IS1/SK를 Kpn I 및 Hind III로 절단하고, 이어서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 삽입 DNA 단편을 절개해 내고, 이를 Kpn I 및 Hind III로 절단하고 CIP를 처리한 35S/SK 플라스미드 내로 서브클로닝하여 35S 프로모터 영역의 상류 영역에 IS1 영역이 있는 IS1-35S/SK를 얻었다.

(ii) IS2의 클로닝 (도 8)

실시예 1에서 뉴클레오티드 서열 결정에 사용하였던 것과 같은 gDCPAL3 프로모터 영역의 3' 말단으로부터 유래된 결실 DNA 단편이 있는 플라스미드 중에서 -389까지 결실된 플라스미드 (gDCPAL3-IS12/SK)를 선별하여, Kpn I로 플라스미드를 절단하고, T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 블런트-말단을 만들고, Dde I로 절단하고, 이어서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 797 bp DNA 단편을 절개해 내었다. Hinc II로 절단하고 CIP를 처리한 pBluescript SK 플라스미드 내에 이를 서브클로닝하였다. 상기 서브클로닝에 의해 얻은 다수의 독립적인 클론을 보유하는 이. 콜라이의 콜로니로부터 플라스미드를 추출하고, 그의 뉴클레오티드 서열을 결정하여 삽입된 각 DNA 단편의 방향을 확인하였다. 이러한 방식으로, IS2의 5' 말단이 pBluescript SK 플라스미드의 다중 클로닝 부위에서 Kpn I의 측면에 삽입된 플라스미드를 선별하고, 이를 IS2/SK-1로 명명하였다. IS2의 3' 말단이 Kpn I의 측면에 삽입된, 즉 반대 방향으로 삽입된 것을 선별하고, 이를 IS2/SK-2 (반)으로 명명하였다.

IS2/SK-1을 KpnI 및 Hind III로 절단하고, 인서트 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 수득하고, 이를 Kpn I 및 Hind III으로 절단하고 CIP로 처리한 35S/SK 플라스미드 내에 서브클로닝하여 IS2 영역 (양성 가닥)이 35S 프로모터 영역의 상류 영역에 있는 IS2-35S/SK를 얻었다.

(iii) IS12의 클로닝 (IS1-IS2 탠덤 커플링 (tandem coupling) 산물) (도 9)

(ii)에 기술된 바에 따라 얻은 IS2/SK-2 (반)을 Kpn I로 절단하고, T4 DNA 폴 리머라제를 사용하여 블런트-말단을 만들고, 그후 Hind III으로 절단하여 아가로스 겔 전기영동에 의해 인서트 DNA 단편을 수득하였다. 이를 Pst I로 절단하고, T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 블런트-말단을 만들고, 그후 Hind III로 절단하고 CIP로 처리한 IS1-35S/SK 플라스미드 내에 서브클로닝하여 IS1 영역 및 IS2 영역이 35S 프로모터 영역의 상류 영역 내에서 탠덤 방식으로 있는 IS12-35S/SK를 얻었다.

(iv) MU3의 클로닝 (도 10)

MU3을 위해, gDCPAL3-IS12/SK를 Kpn I으로 절단하고, 그후 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 블런트-말단을 만들고, Sca I로 절단하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 1,514 bp DNA 단편을 수득하였다. Hinc II로 절단하고 CIP로 처리한 pBluescript SK 플라스미드 내에 이를 서브클로닝 하였다. 상기 서브클로닝에 의해 얻은 각각의 독립적인 클론을 보유한 다수의 이. 콜라이 콜로니로부터 플라스미드를 추출하여 그의 뉴클레오티드 서열을 결정함으로써 DNA 단편의 삽입 방향을 검사하였다. IS1의 5' 말단 측면이 pBluescript SK 플라스미드의 다중 클로닝 부위에서 Kpn I의 측면에 삽입된 플라스미드를 선별하고, 이를 MU3/SK로 명명하였다. MU3/SK를 Kpn I 및 Hind III으로 절단하고, 이어서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 인서트 DNA 단편을 절개해 내었다. 이를 Kpn I 및 Hind III으로 절단하고 CIP로 처리한 35S/SK 플라스미드 내에 서브클로닝하여 IS1 영역 및 IS2 영역이 gDCPAL3-유래 영역 서열 (441 bp)을 경유하여 35S 프로모터 영역의 상류 영역에 있는 MU3-35S/SK를 얻었다.

(2) 식물 유전자 발현 벡터 내에 IS1, IS2, IS12 및 MU3의 삽입 (도 11)

pABN-Hm1 (문헌 [Mita, S., Suzuki-Fujii, K. and Nakamura, K. Sugar-inducible expression of a gene for β-amylase in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol., 107:895-904 (1995)] 참조; 나고야 대학의 나카무라 켄조 박사 (Kenzo Nakamura)가 제공함)을 Hind III으로 절단함으로써, β-아밀라제 프로모터 (1.7 kb)를 절제해 내고, T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 블런트-말단을 만들고, 그후 Xba I로 절단하고, CIP를 처리한 후 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 Ti 플라스미드 영역 뿐만 아니라 카나마이신 내성 유전자 [nos 프로모터/네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II 유전자 (npt II)의 코딩 영역/nos 터미네이터], 코딩 영역 (GUS)/β-글루쿠로니다제 유전자의 nos 터미네이터 및 하이그로마이신 내성 유전자 [35S 프로모터/하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 코딩 영역 (HPT)/nos 터미네이터]를 함유하는 10 kbp DNA 단편을 단리하였다. 여기에 35S/SK를 Hind III로 절단하고, T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 블런트-말단을 만들고, Xba I로 절단함으로써 얻은 35S 단편을 서브클로닝하여 pAB35S를 제작하였다.

이를 Xho I 및 Xba I으로 절단하고 CIP로 처리하고, 그후 아가로스 겔 전기영동에 의해 35S DNA 단편을 절제하여 벡터를 얻었다. 별도로, 상기 언급한대로 제조한 IS1-35S/SK, IS2-35S/SK, IS12-35S/SK 및 MU3-35S/SK 각각을 Xho I 및 Xba I로 절단하고, 삽입을 위한 DNA 단편 (트랜스진 발현 카세트)을 아가로스 겔 전기영동에 의해 수득하였다. 그러한 DNA 단편을 상기 언급한 벡터에 리게이션시키고 이. 콜라이 DH5α를 형질전환하는데 사용하였다. 카나마이신 25 ㎍/ℓ를 함유하는 LB 아가 배지 (1％ 박토-트립톤 (Bacto-Trypton), 0.5％ 효모 추출물, 1％ 염화 나트륨, 1.5％ 박테리아 배양 배지용 아가 분말)에 상기 얻어진 이. 콜라이 형질전환체 각각을 접종하고, 고속 플라스미드 DNA 추출법에 의해 콜로니로부터 플라스미드를 추출하여 얻어진 플라스미드의 제한 효소 맵을 검사함으로써 도 11에 도시된 것과 같이 pIS1-35S/AB35S, pIS2-35S/AB35S, pIS12-35S/AB35S 및 pMU3-35S/AB35S의 형성, 즉 카나마이신 내성에 필요한 nptII 유전자 및 구성 유전자인 GUS 유전자 사이에 삽입된 상기 트랜스진 발현 카세트가 있는 작제물을 확증하였다.

(3) 아그로박테리움 투메파시엔스 ( Agrobacterium tumefaciens )의 콤피텐트 세포 제조

글리세롤 원액으로부터 취한 에이. 투메파시엔스 (A. tumefaciens) EHA 101 세포 백금이량을 YEP 고체 배지 (1％ 효모 추출물, 1％ 박토헵톤 (Bactoheptone) 및 0.5％ 내지 1.5％ 농도의 염화 나트륨을 함유하는 YEP 배지에 박테리아 배양 배지용 아가 분말을 첨가하고, 이어서 고압 증기 멸균 및 고체화에 의해 제조; 이후 동일한 방법을 적용함)에 도말하고, 상기 세포를 28℃의 암실에서 2일동안 배양하였다. 에이. 투메파시엔스가 생장한 단일 콜로니 각각을 이쑤시개로 수득하고 YEP 배지 1.5 ㎖에 접종하고 밤새 28℃에서 진탕배양하였다. 80 ㎖ YEP 배지를 500 ㎖ 플라스크에 넣고, 상기 에이. 투메파시엔스 배양액 0.8 ㎖를 첨가하고, 28℃에서 OD₆₀₀ = 0.4가 될 때까지 진탕배양을 수행하였다. 이를 얼음으로 냉각시키고, 미리 얼음으로 냉각시킨 원심분리 튜브에 옮기고, 4℃에서 6000 rpm으로 5분동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 10％ 글리세롤 20 ㎖를 첨가하여 침전물을 현탁시켰 다. 이 과정을 3회 반복하고, 배지를 완전히 제거하여 에이. 투메파시엔스의 콤피텐트 세포를 얻었다. 원액 제조를 위해, 상기 세포를 10％ 글리세롤 400 ㎕ 중에 현탁시키고, 그 현탁액을 튜브에 40 ㎕씩 분배하고, 이어서 액체 질소 중에서 급속 냉동시켰다.

(4) 에이. 투메파시엔스 내로의 플라스미드 DNA 도입

상기 (2)에서 기술된 바와 같이 얻은 작제물 (pIS1-35S/AB35S, pIS2-35S/AB35S, pIS12-35S/AB35S 및 pMU3-35S/AB35S 플라스미드) 각각을 전기천공법 (Shimadzu GTE-10 사용)에 의해 에이. 투메파시엔스의 콤피텐트 세포 내로 도입하였다. 구체적으로, 상기 (2)에서 기술된 바와 같이 제조한 각각의 플라스미드, 즉 pIS1-35S/AB35S (IS1), pIS2-35S/AB35S (IS2), pIS12-35S/AB35S (IS12) 및 pMU3-35S/AB35S (MU3)와 전사 활성화 인자(들) (IS1 및(또는) IS2)가 삽입되지 않은 대조구용 플라스미드인 pAB35S (35S) 각 100 ng을 상기 (3)에서 기술된 바와 같이 제조한 콤피텐트 세포 40 ㎕와 혼합하고, 각각의 혼합물을 전기천공기 셀 (cell)에 옮겨담았다. 전기 펄스 (1.2 kV, 35 ㎌, 550 Ω)를 가하고, YEP 배지 1 ㎖을 즉시 첨가하고, 28℃에서 1시간동안 인큐베이션을 수행하였다. 약 50 ㎕를 취하여 하이그로마이신 50 ㎍/ℓ를 함유하는 YEP 고체 배지 상에 도말하고, 28℃의 암실에서 2일동안 인큐베이션을 수행하였다. 생장한 단일 콜로니를 하이그로마이신 50 ㎍/ℓ가 함유된 또다른 YEP 고체 배지 상에 백금 루프를 사용하여 엷게 도말하고 28℃에서 24시간동안 인큐베이션시켰다. 세포 일부를 취하여 하이그로마이신 50 ㎍/ℓ를 함유하는 YEP 배지 5 mL에 접종하고 밤새 28℃에서 진탕 배양하였다.

실시예 3

(1) 배양된 담배 세포 내로의 전사 활성화 인자-함유 작제물의 도입

실시예 2에서 제조된 작제물을 갖는 에이. 투메파시엔스, 즉 pIS1-35S/AB35S (IS1), pIS2-35S/AB35S (IS2) 또는 pIS12-35S/AB35S (IS12)가 도입된 에이. 투메파시엔스 (이후 "형질전환된 에이. 투메파시엔스"로 지칭함)를 사용하여, IS1, IS2 및 IS12를 각각 배양된 담배 세포 내로 도입하였다. 대조구로서 pAB35S (35S)가 그 안에 도입된 에이. 투메파시엔스를 사용하여 동일한 과정을 수행하였다.

우선, YEP 액체 배지 5 ㎖ 중에서 배양시킨 상기 형질전환된 에이. 투메파시엔스를 50 ㎖ 원심분리 튜브에 옮겨담고 3,000 rpm으로 10분동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 린스마이어 앤드 스쿠그 배지 (Linsmaier ＆ Skoog) (문헌 [Linsmaier, E.M. and Skoog, F.; Physiol. Plantarum 18, 100-127 (1965); 이후 본원에서 "린스 배지 (Lins medium)"로 지칭함)를 침전물에 첨가하고, 재현탁시킨 후 다시 원심분리를 3,000 rpm으로 상온에서 10분동안 수행하고, 상청액을 버렸다. 이 과정을 4회 반복하였다. 에이. 투메파시엔스 세포를 수획하고, OD₆₀₀ = 0.2가 되는 양으로 린스 배지를 첨가하여 현탁시키고, 여기에 아세토시링곤 (acetosyringone)을 10 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고, 이어서 재현탁시켰다.

별도로, 각 작제물을 도입하는데 사용되는 배양된 담배 세포 BY-2 (동경 대학의 나가타 토시유키 박사 (Toshiyuki Nagata)가 제공)를 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)을 함유한 린스 배지 45 ㎖ 중에 미리 배양하고, 세포를 함유한 현탁 배양액 1 ㎖을 1주일 간격으로 새 린스 배지에 옮기고, 옮긴 후 약 100시간이 지난 뒤 생장 곡선이 로그기에 들어선 세포를 사용하였다.

멸균된 90 mm 디쉬에 상기 배양된 담배 세포 BY-2 (4 ㎖)을 접종하고, 상기 과정에서 세척시킨 형질전환된 에이. 투메파시엔스 세포 100 ㎕를 배양된 담배 세포 상에 고르게 첨가하였다. 약하게 섞은 후, 22℃의 암실에서 3일동안 동시-배양을 수행하였다.

그 후, 린스 배지 12 ㎖을 세포 배양액에 첨가하여 현탁시키고, 그 현탁액을 50 ㎖ 원심분리 튜브에 옮겨담고 1,000 rpm으로 1분동안 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 이 과정을 4회 반복하였다. 그후, 클라포란 (claforan) 250 ㎍/㎖을 함유한 린스 배지 12 ㎖을 첨가하고, 상기와 동일한 과정을 1회 더 반복하였다. 상청액을 버린 후, 린스 배지 약 25 ㎖을 침전된 세포에 첨가하여 이를 현탁시키고, 혈구계를 사용하여 상기 배지 0.25 ㎕ 내에 있는 세포수를 구하였다. 상기 세포를 카나마이신 100 ㎍/㎖ 또는 300 ㎍/㎖가 함유된 (추가로 클라포란 250 ㎍/㎖이 함유된) 린스 고체 선별 배지 상의 일부에 고르게 접종하되, 플레이트 당 세포의 수가 4 x 10⁵, 6 x 10⁵, 8 x 10⁵, 10 x 10⁵ 또는 15 x 10⁵ 의 양이 되도록 하였다. 이를 28℃ 암실에서 배양하였다. 배양 1개월 후, 각 플레이트에 형성되어 있는 배양된 트랜스제닉 담배 세포의 수 (형질전환 캘러스) 및 형질전환 비율 또는 수율을 결정하였다. 그에 따라 얻어진 결과를 표 1 및 도 12에 도시하였다.

카나마이신-함유 배지에서 배양된 담배 세포 BY-2로부터 형성된 형질전환 캘러스의 수 및 형질전환 캘러스 형성 비율

카나마이신 100 ㎍/㎖
세포수 (x105)	4	6	8	10
IS1	4 ±0 (0.10)	20 ±4 (0.33)	43 ±3 (0.54)	99 ±10 (0.99)
IS2	10 ±7 (0.25)	72 ±13 (1.20)	84 ±4 (1.05)	137 ±12 (1.37)
IS12	16 ±3 (0.40)	70 ±6 (1.67)	124 ±16 (1.55)	220 ±4 (2.20)
35S (대조구)	3 ±2 (0.08)	40 ±8 (0.67)	47 ±2 (0.59)	83 ±13 (0.83)
카나마이신 300 ㎍/㎖
세포수 (x105)	4	6	8	10
IS1	0 (0.00)	3 ±0 (0.05)	10 ±3 (0.13)	20 ±5 (0.20)
IS2	0 (0.00)	4 ±2 (0.07)	36 ±4 (0.45)	72 ±11 (0.72)
IS12	2 ±1 (0.05)	15 ±1 (0.25)	41 ±2 (0.51)	89 ±5 (0.89)
35S (대조구)	0 (0.00)	0 (0.00)	3 ±2 (0.04)	37 ±16 (0.37)
위: 형성된 캘러스의 수 아래: 수율 (x 10-2％)

상기 결과로부터, 배양된 담배 세포 내로 IS2 또는 IS12 작제물이 삽입되면 카나마이신-함유 배지 내에서 형질전환 캘러스의 수율이 증가하며 그 수율은 그러한 인자가 삽입되지 않은 배양된 담배 세포 (35S)로부터의 형질전환 캘러스 수율보다 높다는 것을 발견하였다. 구체적으로, IS2 또는 IS12 작제물이 도입된 형질전환 캘러스의 수율은 그러한 인자가 도입되지 않은 대조구 (35S)보다 1.6 내지 2.6 배 더 높았다.

특히 배지 내의 카나마이신 농도가 300 ㎍/㎖인 경우, IS2 또는 IS12 작제물이 도입됨으로써 형질전환 캘러스의 수율이 대조구 (35S)보다 10배 이상 높은 수준으로 증가하였음을 관찰하였다. 이는 IS2 또는 IS12 작제물의 삽입이, 카나마이신 내성을 나타내도록 하며 상기 작제물의 근처 또는 주변에 있는 ntpII 유전자의 발현 수준을 증가시켰음을 시사하고 있다.

(2) 형질전환 담배 캘러스에서의 GUS 활성 측정

상기 결과를 기반으로, 상기 pIS12-35S/AB35S (IS12) 작제물을 사용하여 리포터 유전자인 GUS 유전자의 발현을 검사함으로써 상기 삽입된 작제물이 구성 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는지 검사하였다.

GUS 유전자의 발현은 우선 다수의 형질전환 캘러스로부터 독립적인 캘러스를 무작위로 선택하고, 각 캘러스로부터 핵 DNA를 추출하고, 서던 분석에 의해 유전자의 도입을 확증한 후, 캘러스로부터 단백질을 추출하고 GUS 활성을 측정하여 관찰하였다. 구체적으로, 형질전환된 담배 캘러스 0.75 g을 취하여 GUS-Light (Tropix, Inc.)를 사용하여 단백질을 추출하였다. Bio-Rad의 단백질 분석 키트를 사용하여 상기 단백질 농도를 결정하고, 그후 GUS-Light (Tropix)와 루미노미터 (Luminometer) Lumat LB905 (Bertold Japan)을 사용하여 5초동안 GUS 활성을 측정하였다. 그렇게 얻어진 결과가 도 13에 도시되어 있다. 상기 도면에서, GUS 활성 (세로 좌표)는 루미노미터로부터 얻은 발광값을 단백질 중량으로 나누기하여 계산한 단백질 단위 중량 당 발광값의 식으로 나타내었다.

도 13에서 명백하게 나타나듯, IS12 작제물의 삽입으로 생성된 형질전환 담배 캘러스는 평균적으로 무(無)-인자 pAB35S의 삽입으로 생성된 대조구 (35S)에 비해 약 2.6배 더 높은 GUS 활성을 보였다. 이로부터, GUS 유전자의 발현이 IS12 작제물의 삽입에 의해 현저하게 증가하였음을 발견하였다.

이는 상기 작제물 내에 함유된 각 인자 (IS1 인자, IS2 인자 및 그의 커플링 산물 (예, IS12 인자))가 전사 활성화 인자임을 나타내고 있다.

실시예 4 전사 활성화 인자-함유 작제물의 담배 식물로의 도입 (잎 디스크 방법)

실시예 2에서 제조된 작제물을 갖는 에이. 투메파시엔스, 즉 pIS1-35S/AB35S (IS1), pIS2-35S/AB35S (IS2) 또는 pIS12-35S/AB35S (IS12)가 그 안에 도입된 에이. 투메파시엔스 (이후 본원에서 "형질전환된 에이. 투메파시엔스"로 지칭함)를 사용하여, IS1, IS2 및 IS12 작제물을 각각 잎 디스크 방법에 의해 담배 잎 내로 도입하였다. 대조구에서는, 작제물이 없는 pAB35S가 도입된 에이. 투메파시엔스를 사용하였고 동일한 과정을 수행하였다.

구체적으로, 각 담배 (SR 1) 잎을 10％ 차아염소산에 담그고, 교반기로 온화하게 교반시키면서 약숟가락을 사용하여 2분에 걸쳐 공기 방울을 제거하고, 용액을 새것으로 바꾸어 동일한 과정을 추가로 5분동안 반복하였다. 상기 잎을 건져내고 멸균수에 담그고, 이어서 온화하게 교반하였다. 차아염소산 용액을 새것으로 바꾸는 동안, 동일한 과정을 모두 3회 반복하였다. 멸균 종이 수건을 사용하여 수분을 제거한 후, 상기 잎을 코르크 천공기로 펀칭하여 잎 디스크 (잎맥은 제거됨)를 얻었다. 이를 멸균수 10 ㎖에 담그었다. 그렇게 제조된 잎 디스크를 YEP 배지 5 ㎖ 중에서 배양시킨 상기 형질전환된 에이. 투메파시엔스 (멸균수로 OD₆₀₀ = 0.25가 되도록 맞춤)에 담그었다. 그 후, 상기 박테리아 현탁액 및 잎 디스크를 함께 멸균 종이 수건 위에 옮기고 다른 멸균 종이 수건으로 수분을 제거하였다.

MS 배지에 아세토시링곤 40 mg/ℓ및 0.2％ 겔란 검을 부가하여 제조한 MS 감염 배지 (문헌 [Murashige, T. and Skoog, F.; Physiol. Plantarum 15, 473-497 (1962)) 상에서 상기 잎을 뒤집어 놓고 25℃ 암실에서 2일동안 배양하였다. 그 후, 각각의 잎 디스크에서 MS 분화 배지 (α-나프탈렌아세트산 0.1 mg/ℓ, 벤질아데닌 1 mg/ℓ, 카나마이신 150 mg/ℓ, 클라포란 500 mg/ℓ 및 0.2％ 겔란 검을 부가한 MS 배지)를 닦아내는 방식으로 박테리아 세포를 제거하고, 그후 다른 MS 분화 배지 상에서 상기 잎을 뒤집어 놓고 25℃에서 배양하였다. 상기 배지를 2주일 간격으로 새로운 MS 분화 배지로 갈아주고, 1개월이 지난 후, 재생된 줄기의 수를 세었다. 그렇게 얻어진 결과를 표 2에 도시하였다.

담배 잎 디스크 상에서 재생된 줄기의 개수 비교

디스크 당 줄기수	35S	IS1	IS2	IS12
0	73	49	56	50
1	26	21	20	23
2	13	17	11	14
3	10	14	8	5
4	3	6	9	8
5	2	1	2	1
6	1	3	3	2
7	0	1	2	5
8	1	0	0	3
9	0	0	0	1
10	0	0	2	1
11	0	0	0	1
12	0	0	0	1
13	0	0	0	0
14	0	0	0	2
총 디스크수	129	112	113	117
총 줄기수	118	151	164	244
디스크 당 줄기의 평균개수	0.91	1.35	1.45	2.09

상기 결과로부터 명백하게 나타난 것처럼, 줄기 재생 효율은 IS1 또는 IS2 작제물을 함유한 담배 식물의 경우가 무-인자 대조구 (35S)에 비해서 약 1.4배 높으며, 특히 IS1 및 IS2 둘 모두가 탠덤 방식으로 함유된 경우 (IS12)는 대조구에 비해서 줄기수가 약 두 배 정도 많았다. 이로부터, 본 발명의 인자 (IS1 인자, IS2 인자 및 그로부터 얻은 커플링 산물 (IS12 등))가 담배 식물 내에서 상기 인자의 근처 또는 주변 영역에 나타나는 카나마이신 유전자 (ntpII 유전자)의 활성을 증가시킬 수 있음이 명백하다. 이 결과는 본 발명의 인자가 전사 활성화 인자라고 하는 실시예 3으로부터의 견해를 지지하고 있다.

실시예 5 전사 활성화 인자-함유 작제물의 당근 체세포 배아로의 도입

실시예 2에서 제조한 작제물을 갖는 에이. 투메파시엔스, 즉 pIS1-35S/AB35S (IS1), pIS2-35S/AB35S (IS2), pIS12-35S/AB35S (IS12) 또는 pMU3-35S/AB35S (MU3)이 그 안에 도입된 에이. 투메파시엔스 (이후 본원에서 "형질전환된 에이. 투메파 시엔스"로 지칭함)를 사용하여, IS1, IS2, IS12 및 MU3 작제물을 각각 당근 체세포 배아 내에 도입하였다. 대조구로서 pAB35S (35S)가 그 안에 도입된 에이. 투메파시엔스를 사용하여 동일한 과정을 수행하였다.

구체적으로는, 우선 멸균 조건 하에서 발아한 당근 배축을 약 1 cm 길이로 절단하고, 그후 4.5 x 10^-6 M 2,4-D (2,4-디클로로페녹시아세트산)이 함유된 MS 배지 중에 두어 암실에서 24시간동안 배양하고, 그후 2,4-D가 없는 MS 배지 중에 두어 암실에서 3일동안 배양하였다. 상기 배지를 새것으로 교환하고, 같은 방식으로 7일동안 배양을 수행하여 배축에서 당근 체세포 배아가 발아하였다.

별도로, YEP 배지 5 ㎖에서 배양한 상기 에이. 투메파시엔스 배양액을 3,000 rpm으로 10분동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, MS 배지 약 30 ㎖를 첨가하여 세포를 현탁시켰다. 이 과정을 2회 반복하여 YEP 배지를 완전히 제거하였다. 그후, 3,000 rpm으로 10분동안 원심분리를 수행하여, 상청액을 제거하고, 아세토시링곤 10 mg/ℓ가 함유된 MS 배지를 침전물에 첨가함으로써 OD₆₀₀ = 약 0.3이 되도록 맞추었다.

여기에 그물을 이용하여 수득한 상기 당근 배축을 첨가하고, 그 혼합물을 온화하게 5분동안 진탕하였다. 상기 배축을 멸균 종이 수건으로 닦아 수분을 제거하고 아세토시링곤 10 mg/ℓ가 함유된 MS 배지에 담그고 22℃ 암실에서 3일동안 배양하였다. 상기 배축을 멸균 종이 수건으로 닦아 수분을 제거하고 카르베니실린 500 ㎍/ℓ가 함유된 MS 배지에 담그고, 온화하게 진탕하여 상기 배지로 세척하였다. 같은 방식으로 수분을 제거한 후, 상기 배축을 카르베니실린 500 ㎍/ℓ 및 카나마이신 10 ㎍/ℓ가 함유된 MS 아가 배지 (0.8％ 아가 함유) 중에서 암실에서 배양하였다. 1.5 내지 3개월 후, 각각 캘러스를 재생한 배축의 수를 세었다. 그렇게 얻은 결과를 표 3에 도시하였다.

캘러스-재생 배축 개수의 비교

		35S	IS1	IS2	IS12	MU3
+ 2,4-D	캘러스-재생 배축 개수	5	6	10	9	8
	총 배축 개수	78	56	60	61	63
	재생 백분율 (％)	6.4	11	17	15	13
- 2,4-D	캘러스-재생 배축 개수	3	9	12	6	4
	총 배축 개수	77	62	62	64	58
	재생 백분율 (％)	3.9	13	19	9.4	6.9

표 3에 명백히 나타난 것처럼, 당근 체세포 배아에서도 담배 캘러스의 경우와 마찬가지로, 2,4-D-함유 배지 (+ 2,4-D) 중에서 배양하는 분화 생장 조건 하에서뿐만 아니라 2,4-D가 없는 배지 (- 2,4-D) 중에서 배양하는 분화 생장 조건 하에서도 IS1, IS2, IS12 및 MU3 작제물의 삽입에 의해 재생 효율이 개선되는 것이 발견되었다. 재생 효율이 가장 크게 개선된 것은 IS2 작제물이 삽입된 경우에서 관찰되었다.

실시예 6 전사 활성화 인자-함유 작제물의 쌀 내로의 도입

실시예 2에서 제조한 작제물을 갖는 에이. 투메파시엔스, 즉 pIS1-35S/AB35S (IS1), pIS2-35S/AB35S (IS2), pIS12-35S/AB35S (IS12) 또는 pMU3-35S/AB35S (MU3)이 그 안에 도입된 에이. 투메파시엔스 (이후 본원에서 "형질전환된 에이. 투메파시엔스"로 지칭함)를 사용하여, IS1, IS2, IS12 및 MU3 작제물을 각각 벼 종자 내에 도입하였다. 대조구로서 pAB35S (35S)가 그 안에 도입된 에이. 투메파시엔스를 사용하여 동일한 과정을 수행하였다.

구체적으로, 완전히 익은 벼 종자 (Nihonbare)로부터 형태 및 색이 정상적인 개체들을 우선 선별하고 막자 사발에서 가볍게 마쇄하여 껍질을 제거하였다. 껍질을 벗긴 종자를 50 ㎖ 팰콘 (Falcon) 튜브에 넣고, 2.5％ 차아염소산 나트륨을 첨가하고, 그 혼합물을 100 내지 120 rpm으로 20분동안 진탕시켰다. 그후, 상청액을 제거하고, 멸균수를 첨가하고, 그 혼합물을 온화하게 진탕시켰다. 이 과정을 3회 반복한 후, 상기 종자를 캘러스 유도 배지 상에 두고 28℃ 암실에서 배양하였다.

3 내지 4주일 후, 배반(胚盤)으로부터 생성되어 생장하는 황색 가지가 있는 캘러스 중에서 오직 직경 2 내지 3 mm이고 수종의 군 중에서 흩어진 것처럼 보이는 개체만을 새 캘러스 유도 배지 상에 놓고 28℃ 암실에서 7일동안 배양하였다.

별도로, 상기 형질전환된 에이. 투메파시엔스를 YEP 고체 배지에 접종하고 28℃ 암실에서 3일동안 배양하였다. 에이. 투메파시엔스 세포를 약숟가락으로 긁어내어 아세토시링곤이 부가된 AAI 배지 (문헌 [Toriyama, K. and Hirata, K.; Plant Science 41,179-183 (1985)] 참조)에 첨가하고, OD₆₀₀이 0.18 내지 0.2가 되도록 맞추었다. 이를 25℃ 암실에서 1시간동안 진탕-배양하였다.

상기 방식으로 배양된 쌀 캘러스를 멸균시킨 차 여과기에 두고, 상기 배양된 에이. 투메파시엔스를 현탁액의 형태로 첨가하였다. 차 여과기를 3분동안 간헐적으로 흔들어 전체 캘러스가 확실히 잠기도록 하여 진탕시키고, 그 후 상기 여과기 와 내용물을 함께 종이 수건에 놓고, 과량의 박테리아 배양액을 제거하였다. 상기 캘러스를 동시-배양 배지 상에 두고 25℃ 암실에서 3일동안 배양하였다.

그 후, 동시-배양 캘러스를 차 여과기 내로 수득하고, 클라포란 500 mg/ℓ가 부가된 멸균수에 담그고, 차 여과기를 진탕하여 에이. 투메파시엔스를 세척해 내고, 그 후 상기 차 여과기와 그 내용물을 함께 멸균된 종이 수건 상에 놓고, 물을 제거하였다. 같은 과정을 모두 4회 반복하였다. 상기 캘러스를 선별 배지 상에 두고 28℃ 암실에서 배양하였다. 3 내지 4 주일 후, 다량의 캘러스 중에서 캘러스를 무작위로 선택하여 각 캘러스의 일부를 취하고 GUS 염색 용액 (0.75 mM X-Gluc (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루쿠론산), 0.5 mM 페리시안화 칼륨, 0.5 mM 페로시안화 칼륨, 0.3％ 트리톤 (Triton) X-100, 20％ 메탄올, 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0))중에 두고, 밤새 37℃에서 반응이 일어나도록 하여 GUS 활성을 검출하였다. 청색으로 염색되어 GUS 활성을 나타낸 캘러스는 트랜스제닉, 형질전환된 쌀 캘러스이었다. 그렇게 얻어진 결과를 표 4에 도시하였다.

GUS에 의해 염색한 쌀 캘러스 결과

	35S	IS1	IS2
염색된 캘러스	27	38	44
캘러스 총수	275	244	228
형질전환된 캘러스 백분율 (％)	9.8	15.6	19.3

표 4에 도시된 결과에서 명백하게 나타난 것처럼, 형질전환 효율이 IS1 및 IS2 작제물의 도입에 의해 대조구 (35S)에 비해서 각각 약 1.5 배 및 약 2배 증가하였음을 발견하였다.

상기 실시예 1 내지 6의 결과에서 재생 효율 (형질전환 효율)이 본 발명의 전사 활성화 인자 (IS1, IS2, IS12, MU3)를 사용함으로써 증가하였음을 증명하였다. 그 이유로는 하기의

(1) 식물 세포 내로 Ti 플라스미드가 도입되는 효율이 증가했을 가능성,

(2) IS1 및(또는) IS2 인자에 의한 nos 프로모터 활성의 증가 및 그에 따른 nptII 유전자의 전사 촉진에 의해 상기 유전자 산물의 생산량이 증가하고, 따라서 선별용 카나마이신-함유 배지 상에서 생장 가능한 세포수의 증가로 인해 세포로부터의 재생 효율이 증가했을 가능성, 그리고

(3) IS1 및(또는) IS2 인자가 그의 근처 또는 주변 영역의 유전자 영역을 활성화하거나 상기 유전자 영역의 불활성화를 방지하였을 가능성

을 고려할 수 있다.

Ti 플라스미드에 의해 유전자를 도입하면 식물 염색체 상의 결정된 부위로 삽입되는 것이 아니며, 그 삽입 부위는 일정하지 않다. 따라서, 목적 유전자가 염색체 구조에 의해 결정된 활성화 부위 내로 삽입되었는지 또는 게놈 DNA의 메틸화 메카니즘이나 기타 다른 원인에 의해 유전자가 불활성화되는 데 인접한 불활성 부위 내로 삽입되었는지는 우연성에 좌우되는 것이다. 트랜스진이 불활성 부위 내로 도입되는 경우, 염색체의 "장 (場, field)"에 의해 영향을 받아 상기 트랜스진 역시 불활성화되는 것으로 여겨진다.

상기 실시예에서 사용된 작제물에서, 전사 활성화 인자 (IS1 및(또는) IS2)는 nptII 유전자 (카나마이신 내성 유전자)의 터미네이터 측면 상에, 즉 카나마이 신 내성 유전자 프로모터의 반대 면에 삽입되는 것을 발견하였다. 따라서, 이들 인자가 카나마이신 내성 유전자 프로모터에 시스로 작용을 하는 것은 불가능하다.

그러나, 상기 실시예를 통해 본 발명의 전사 활성화 인자가 nos 프로모터에 직접적으로 작용하지 못하는 위치에 삽입된 환경 하에서도 배양된 담배 세포에서 카나마이신 내성 세포 (형질전환 담배 캘러스)의 수는 증가하였고, 특히 배지 내의 카나마이신 농도가 300 mM 만큼 존재하는 경우에서도 카나마이신 내성 캘러스의 수는 증가하였으며 (실시예 3 (1)), 나아가 상기 작제물을 다양한 식물 종의 식물 세포 내에 도입함으로써 카나마이신 내성 식물의 재생 효율이 증가 (실시예 4 내지 6)하였음을 증명하는 결과를 얻었다. 이들 결과는 IS1 및(또는) IS2 인자가 그 근처에 있는 카나마이신 내성 유전자에 대해 작용하되 직접적인 방식으로 nos 프로모터의 시스 활성화를 일으키지는 않았으며, 그 결과 상기 카나마이신 내성 유전자의 활성이 유지된 (활성화된 것 및 불활성화가 방지된 것의 두 가지 의미를 모두 포함) 세포수에 영향을 준 것으로 나타났다. 따라서, 이는 통상적인 전사 활성화 인자 (팩터 (factor))가 특이적인 유전자의 프로모터 근처에서 인헨서 (enhancer)로서 나타나며 상기 프로모터에 대해 시스로 작용을 함으로써 전사를 활성화시키는 것과 달리, 본 발명의 전사 활성화 인자는 게놈 유전자로 삽입된 경우 그 삽입 부위의 근처 또는 주변 영역에 있는 단일 유전자군 또는 다수의 유전자군을 활성화시키고, 그렇게 함으로써 전사 활성화 촉진, 즉 (3)에서 언급한 메카니즘에 의한 작용을 할 가능성을 나타내었다.

상기 실시예에서 사용된 작제물에서, IS1 및(또는) IS2 인자는 GUS 유전자의 35S 프로모터 측면에 삽입되었다. 상기 작제물의 삽입으로 인해 얻은 배양된 담배 세포는 실시예 3(2)에서 GUS 활성이 증가된 것으로 나타났으며, 이는 본 발명의 전사 활성화 인자가 그의 하류에 인접하여 나타나는 35S 프로모터에 대해서도 작용하여 GUS 유전자의 전사 활성을 증가시켰음을 명백하게 보여주었다. 이 결과는 상기 언급한 견해를 지지하는 것이며 본 발명의 전사 활성화 인자가 상기 (3)에서 언급한 작용, 즉 "IS1 및(또는) IS2 인자가 그를 포함한 인근 유전자 영역을 활성화하거나, 또는 상기 유전자 영역의 불활성화를 방지하는 것"을 나타내었다.

상기 실시예에서는, 본 발명의 전사 활성화 인자를 사용함으로써 배양된 세포 (실시예 3) 뿐만 아니라 식물 조직 세포로도, 담배 잎 디스크 실험에서 담배 식물 줄기의 재생 효율이 확실히 증가하였고 (실시예 4), 당근 배축으로부터의 식물 재생에 근간이 되는 배형성 캘러스의 형성 효율이 증가하였고 (실시예 5), 쌀 식물 재생에 근간이 되는 캘러스의 형성 효율이 증가하였음 (실시예 6)을 또한 보여주고 있다. 이들 결과는 해당 식물의 게놈 내에 도입된 외래 유전자로 인한 식물 재생 또는 캘러스 형성이 위치 효과에 의해 유전자 침묵 (불활성화)되지 못하도록 본 발명의 전사 활성화 인자가 상기 식물들에 대해서 작용함으로써 식물 재생 또는 형성 효율이 증가한 것처럼 나타났고, 결국 매우 실용적임을 나타내었다.

MAR와 마찬가지로 MITE가 핵 매트릭스에 결합한다는 최근의 발견 (문헌 [Tikhonov et al., Plant Cell 12:249-264 (2000)] 참조)에 비추어 볼 때, MITE는 핵 내에서 MAR와 유사한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 이에 근거하여, 본 발명의 전사 활성화 인자, 즉 MITE가 단일하게 또는 MAR와 같은 인자들과의 조합으로 유전자 변형 식물의 생산에 사용되어 식물 재생 또는 형성 효율을 보다 증가시키는 효과를 기대할 수 있다.

유전자 변형 식물의 생산에 있어서 극복해야할 가장 중요한 과제는 외부 유전자의 발현 불활성화를 일으키는 유전자 침묵 현상이다. 유전자 변형 식물의 개발에서 유전자 침묵 현상을 피하기 위해서는 유전자 침묵을 최소화하는 부위로 해당 외래 유전자가 삽입된 다수의 식물 개체를 선별하는 것이 필요하다.

본 발명은 신규 식물-유래 MITE-유사 인자를 제공하며, 상기 MITE-유사 인자가 식물 게놈 내로 삽입되는 경우 게놈 구조 상의 변화를 야기하여, 그에 의해 게놈 구조의 동역학적 변화, 예를 들어 게놈 DNA의 풀림 (unwinding)을 촉진하거나 통상적인 인핸서 인자의 작용 메카니즘과는 매우 다른 메카니즘에 의해 뉴클레오좀 상의 변화를 야기하도록 기여할 가능성이 매우 높다.

따라서, 본 발명의 MITE-유사 인자의 이러한 특성을 이용함으로써 기존의 기술과는 다른 방법을 통해서 그 근방에 나타나는 유전자의 발현을 조절하는 것이 가능하게 된다. 즉, 상기 특성을 가진 본 발명의 MITE-유사 인자를 통해, 트랜스제닉 기술에 의해 도입된 외래 유전자의 감소된 발현 능력을 증가시키거나 활성화시킬 수 있다. 이러한 면에서, 본 발명의 MITE-유사 인자는 유전적으로 변형된 생명체의 생산에 있어서 트랜스진 발현 카세트 및 상기 카세트를 함유하는 플라스미드 제작에 유용하며, 나아가 트랜스진 발현이 가능한 유전자 변형 생물체의 안정적인 생산에 유용하다.

상기 언급한 MITE-유사 인자 중 하나 (바람직하게는 IS1 및(또는) IS2)와 같은 전이 인자를 함유하는 본 발명의 전사 활성화 인자는 식물의 유전자 전달에서 위치 효과로 인한 유전자 발현의 불활성화 현상 (유전자 침묵 현상)을 억제 및 무력화시키는 활성을 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 전사 활성화 인자를 단일하게 또는 핵 DNA 구조 형성에 참여하는 다른 인자와 조합하여 사용함으로써, 유전자를 안정적으로 발현시키고, 그에 의해 유전자 전달 후 일반적으로 수행되는 스크리닝 과정의 수와 접종 및 배양되는 재조합 식물의 수를 상당히 감소시킬 것으로 기대된다.

백합, 국화 및 밀과 같이 게놈 크기가 큰 식물은 게놈 내에 방대한 불활성 부위를 가지고 있어서, 도입되는 외래 유전자는 대부분 불활성 부위 내로 삽입된다. 그러한 식물에 대해서는, 기존의 기술로 재조합 식물을 생산하는 것이 매우 어렵고 실질적으로 불가능하다. 반면, 본 발명의 전사 활성화 인자를 통해 식물 게놈 상에 도입된 외래 유전자가 유전자 침묵을 일으키는 것을 상당히 저해할 수 있고, 따라서 유전자 재조합이 어려운 것으로 여겨져 왔던 상기 식물종들에 외래 유전자를 효율적으로 도입시켜 재조합 식물을 생산하는 것이 가능할 것으로 기대되다.

또한 본 발명의 전사 활성화 인자는 삽입된 것으로 발견된 유전자 영역의 근방 또는 주변에 위치한 유전자를 활성화 (전사 활성화 포함)시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명의 전사 활성 인자는 거대 게놈 크기로 인해 유전자 침묵이 빈번하게 일어나서 유전자 변형 식물체를 생산하기 어려운 상기 식물들에서도 실질적으로 트랜스제닉 기술을 사용 가능하게 할 뿐만 아니라, 유용한 특성의 유전자의 프로모터 상류 부위 또는 그의 인접 부위에 상기 전사 활성화 인자를 삽입시켜 사용함으로써 대두, 옥수수, 감자 및 토마토와 같이 이미 실용화된 식물종의 유전 공학에서도 유전자 전달의 효율을 증가시키고, 그와 동시에 제초제 내성 유전자 및 살충 단백질 유전자와 같은 유용한 특성의 유전자에 대한 전사 활성을 증가시킬 것으로 기대된다. 나아가, 상기 전사 활성화 인자는 기존의 방법으로 생산한 유전자 변형 식물에 비해 높은 생산성 및 고품질의 유전자 변형 식물을 생산하는 것이 가능하도록 할 수 있을 것으로 기대된다.

SEQUENCE LISTING <110> OZEKI, Yoshihiro <110> SAN-EI GEN F.F.I.,INC., <120> NOVEL MINIATURE INVERTED-REPEAT TRANSPOSABLE ELEMENTS (MITEs)-LIKE ELEMENT AND TRANSCRIPTIONAL ACTIVATION ELEMENT <130> P00-14 <150> JP 1999/206316 <151> 1999-07-21 <150> JP 1999/206320 <151> 1999-07-21 <150> JP 2000/175825 <151> 2000-06-12 <160> 14 <210> 1 <211> 769 <212> DNA <213> Carrot (Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 1 gggatctttt taaaaatacc catctgtaaa attatttttt taaaaatact accatctttt 60 tcattgtttt taaaaatacc ttttcataaa tttttttttt caaaaatacg atttgcaact 120 tttgcaacct catttgcaac cttgggcggc gcagccgtaa aagttgccag tgaggttgca 180 aaagttgcaa atgagtttgt aaaagttgca aatgaggttg caaaagttgc aaataaaaat 240 ggaaagttgc aacagttgca actgcaattg caactagttc aactgaaaac tgtaagttgc 300 aaaagttgca aatgaggttg caactaaatg caactgaaaa ctgtaagtaa caacagatgt 360 atggtgtgcc cctggcgggg ccgttagatt acaatagaat caactgaatg caatcatatg 420 caactgaata caactatatg caatcatata tgcaattaca aatcctgatt tcaagttcca 480 gttttcgaat gtcattttcg aaatcgatat atatatatat atatatatat cgatttcgaa 540 aatgacattc gaaaactgga acttgaaatc aggaattcag ctgcatatga agttgcaaaa 600 gaggttgcaa cacggctggc gccgcctgta gttgcaaatg aggttgcaaa agttgcaaac 660 agtatttttg aaaaaaagat tttatgaaaa ggtattttta aaaataattc tggaaggtag 720 tatttttgaa aacaataaaa gaaaaggtag gtagttttgt agatttccc 769 <210> 2 <211> 299 <212> DNA <213> Carrot (Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 2 ctccctacgt cccattttat gtgacctcat tttctttttg ggacgtctca aaaaaaataa 60 cctagaatac ttactatttt ttaacactat ttttcactat tacacccacc aactctatat 120 tttatactat tttattatta aataaacact attacaccca ctacttttct ccactatctc 180 aaatctatta ttaaatattg ataggtccac cactttaccc acttttcaac tacatttact 240 acatttttct taatctccgt gaaagtcaaa ctcattcaca taaaatggga cagagggag 299 <210> 3 <211> 1192 <212> DNA <213> Carrot (Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 3 ggtaccgggc cccccctcga ggtcactccc tacgtcccat tttatgtgac ctcattttct 60 ttttgggacg tctcaaaaaa aataacctag aatacttact attttttaac actatttttc 120 actattacac ccaccaactc tatattttat actattttat tattaaataa acactattac 180 acccactact tttctccact atctcaaatc tattattaaa tattgatagg tccaccactt 240 tacccacttt tcaactacat ttactacatt tttcttaatc tccgtgaaag tcaaactcat 300 tcacataaaa tgggacagag ggagtaatta ttaattttaa tagacggtat cgataagctt 360 atcgataccg tctcagattc gcaaacataa aaagaaaagg gatcttttta aaaataccca 420 tctgtaaaat tattttttta aaaatactac catctttttc attgttttta aaaatacctt 480 ttcataaatt ttttttttca aaaatacgat ttgcaacttt tgcaacctca tttgcaacct 540 tgggcggcgc agccgtaaaa gttgccagtg aggttgcaaa agttgcaaat gagtttgtaa 600 aagttgcaaa tgaggttgca aaagttgcaa ataaaaatgg aaagttgcaa cagttgcaac 660 tgcaattgca actagttcaa ctgaaaactg taagttgcaa aagttgcaaa tgaggttgca 720 actaaatgca actgaaaact gtaagtaaca acagatgtat ggtgtgcccc tggcggggcc 780 gttagattac aatagaatca actgaatgca atcatatgca actgaataca actatatgca 840 atcatatatg caattacaaa tcctgatttc aagttccagt tttcgaatgt cattttcgaa 900 atcgatatat atatatatat atatatatcg atttcgaaaa tgacattcga aaactggaac 960 ttgaaatcag gaattcagct gcatatgaag ttgcaaaaga ggttgcaaca cggctggcgc 1020 cgcctgtagt tgcaaatgag gttgcaaaag ttgcaaacag tatttttgaa aaaaagattt 1080 tatgaaaagg tatttttaaa aataattctg gaaggtagta tttttgaaaa caataaaaga 1140 aaaggtaggt agttttgtag atttcccaga cctcgagggg gggcccggta cc 1192 <210> 4 <211> 8 <212> DNA <213> Carrot (Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 4 gttgcaaa 8 <210> 5 <211> 8 <212> DNA <213> Carrot (Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 5 gttgcaac 8 <210> 6 <211> 8 <212> DNA <213> Carrot (Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 6 tttgcaaa 8 <210> 7 <211> 8 <212> DNA <213> Carrot (Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 7 tttgcaac 8 <210> 8 <211> 7 <212> DNA <213> Carrot (Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 8 tatgcaa 7 <210> 9 <211> 7 <212> DNA <213> Carrot (Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 9 aatgcaa 7 <210> 10 <211> 158 <212> DNA <213> Carrot (Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 10 gggatctttt taaaaatacc catctgtaaa attatttttt taaaaatact accatctttt 60 tcattgtttt taaaaatacc ttttcataaa tttttttttt caaaaatacg atttgcaact 120 tttgcaacct catttgcaac cttgggcggc gcagccgt 158 <210> 11 <211> 158 <212> DNA <213> Carrot (Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 11 acggctggcg ccgcctgtag ttgcaaatga ggttgcaaaa gttgcaaaca gtatttttga 60 aaaaaagatt ttatgaaaag gtatttttaa aaataattct ggaaggtagt atttttgaaa 120 acaataaaag aaaaggtagg tagttttgta gatttccc 158 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Carrot (Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 12 ctccctacgt cccattttat gtgacctcat tt 32 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Carrot (Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 13 aaactcattc acataaaatg ggacagaggg ag 32 <210> 14 <211> 1553 <212> DNA <213> Carrot (Daucus carota L.cv.Kurodagosun) <400> 14 ggtaccgggc cccccctcga ggtcactccc tacgtcccat tttatgtgac ctcattttct 60 ttttgggacg tctcaaaaaa aataacctag aatacttact attttttaac actatttttc 120 actattacac ccaccaactc tatattttat actattttat tattaaataa acactattac 180 acccactact tttctccact atctcaaatc tattattaaa tattgatagg tccaccactt 240 tacccacttt tcaactacat ttactacatt tttcttaatc tccgtgaaag tcaaactcat 300 tcacataaaa tgggacagag ggagtaatta ttaattttaa taaattatat gtgattttga 360 ttatgtgtgg attcttgata aaatatcaca gagttgatat aaattctaaa gatttaacca 420 caatgtttca aaatctcata gattttagta ggattcaaaa aatttaaaat acgttcaaaa 480 atctcataaa attcatcatt ttattaaatc caaaaaaatc cagtaatatt tgacaatcag 540 attttaatga attttaaatt gaacaatctc agttgaatac catgagattt taaaatataa 600 tttaaaattc taattgaata ccaccagatt ttgtaaaata atttaaaatt ttaattgaat 660 attcaagatt ttaatatatt ttaaataatc tcgatctgaa ttacaaaaaa tgcttaaaat 720 ctgaatccca tacgtcctct cagattcgca aacataaaaa gaaaagggat ctttttaaaa 780 atacccatct gtaaaattat ttttttaaaa atactaccat ctttttcatt gtttttaaaa 840 ataccttttc ataaattttt tttttcaaaa atacgatttg caacttttgc aacctcattt 900 gcaaccttgg gcggcgcagc cgtaaaagtt gccagtgagg ttgcaaaagt tgcaaatgag 960 tttgtaaaag ttgcaaatga ggttgcaaaa gttgcaaata aaaatggaaa gttgcaacag 1020 ttgcaactgc aattgcaact agttcaactg aaaactgtaa gttgcaaaag ttgcaaatga 1080 ggttgcaact aaatgcaact gaaaactgta agtaacaaca gatgtatggt gtgcccctgg 1140 cggggccgtt agattacaat agaatcaact gaatgcaatc atatgcaact gaatacaact 1200 atatgcaatc atatatgcaa ttacaaatcc tgatttcaag ttccagtttt cgaatgtcat 1260 tttcgaaatc gatatatata tatatatata tatatcgatt tcgaaaatga cattcgaaaa 1320 ctggaacttg aaatcaggaa ttcagctgca tatgaagttg caaaagaggt tgcaacacgg 1380 ctggcgccgc ctgtagttgc aaatgaggtt gcaaaagttg caaacagtat ttttgaaaaa 1440 aagattttat gaaaaggtat ttttaaaaat aattctggaa ggtagtattt ttgaaaacaa 1500 taaaagaaaa ggtaggtagt tttgtagatt tcccagacgg tatcgataag ctt 1553

Claims (29)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. (a) 서열 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 또는

   (b) 뉴클레오티드 서열이 서열 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 85% 이상의 상동성을 갖고, 게놈 유전자의 삽입 부위에서 표적 서열인 (A)nG(A)n [여기서, n은 1 이상의 정수임]의 중복을 야기할 수 있는 DNA

   로 이루어진 미니어처 역위-반복 전이 인자 (MITE)-유사 인자.
6. 삭제
7. (c) 서열 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 또는

   (d) 뉴클레오티드 서열이 서열 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 상동성을 갖고, 게놈 유전자의 삽입 부위에서 표적 서열인 TA의 중복을 야기할 수 있는 DNA

   로 이루어진 MITE-유사 인자.
8. 삭제
9. 전이 인자로서 제5항 및 제7항의 MITE-유사 인자로부터 선택된 하나 이상의 MITE-유사 인자를 함유하는 것을 특징으로 하는 전사 활성화 인자.
10. 삭제
11. 제9항에 있어서, 상기 전이 인자가

    (a) 서열 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 또는

    (b) 뉴클레오티드 서열이 서열 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 85% 이상의 상동성을 갖고, 게놈 유전자의 삽입 부위에서 표적 서열인 (A)nG(A)n [n은 1 이상의 정수임]의 중복을 야기할 수 있는 DNA

    로 이루어진 MITE-유사 인자, 및

    (c) 서열 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 또는

    (d) 뉴클레오티드 서열이 서열 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 상동성을 갖고, 게놈 유전자의 삽입 부위에서 표적 서열인 TA의 중복을 야기할 수 있는 DNA

    로 이루어진 MITE-유사 인자

    의 탠덤(tandem) 결합체인 전사 활성화 인자.
12. 서열 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA로 이루어진 전사 활성화 인자.
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 서열 14로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA로 이루어진 전사 활성화 인자.
21. 제9항의 전사 활성화 인자와, 상기 인자에 작동가능하게 결합된 DNA 서열을 포함하고, 도 11에 도시한 개열 지도를 갖는 트랜스진 (transgene) 발현 카세트.
22. 제21항에 있어서, 상기 전사 활성화 인자에 작동가능하게 결합된 DNA 서열이 프로모터 또는 터미네이터 또는 모두를 포함하는 것인 트랜스진 발현 카세트.
23. 제22항에 있어서, 전사 활성화 인자에 작동가능하게 결합된 DNA 서열로서, 발현시키고자 하는 트랜스진 서열을 더 포함하는 것인 트랜스진 발현 카세트.
24. 제9항의 전사 활성화 인자를 함유하고, 도 11에 도시한 개열 지도를 갖는 플라스미드.
25. 제21항의 트랜스진 발현 카세트를 함유하고, 도 11에 도시한 개열 지도를 갖는 플라스미드.
26. 제21항의 트랜스진 발현 카세트를 함유하고 캘러스(callus)에 의해 무성번식되는 트랜스제닉 식물.
27. 제26항에 있어서, 옥수수, 벼, 밀, 백합, 국화, 목화, 대두, 사탕무, 감자 또는 카리카 파파야인 트랜스제닉 식물.
28. 전사 활성화 인자에 작동가능하게 결합된 DNA 서열로서 프로모터 및 터미네이터, 및 임의로, 발현시키고자 하는 트랜스진 서열을 갖는 제21항의 트랜스진 발현 카세트를 식물에 도입시키는 것을 포함하는 트랜스제닉 식물의 생산 방법.
29. 제28항에 있어서, 상기 식물이 옥수수, 벼, 밀, 백합, 국화, 목화, 대두, 사탕무, 감자 또는 카리카 파파야인 트랜스제닉 식물의 생산 방법.

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