CN108504672B

CN108504672B - 青枯菌n477胞外蛋白phd及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN108504672B
Application number: CN201810294230.1A
Authority: CN
Inventors: 刘红霞; 陈瑜; 赵杨扬
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2038-03-30
Also published as: CN108504672A

Abstract

本发明公开了青枯菌N477胞外蛋白PHD及其编码基因和应用。青枯菌N477胞外蛋白PHD，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。PHD或其编码基因在制备抗青枯病的生物源农药中的应用。设计引物，以基因组DNA为模板，扩增PHD编码区序列，产物连接至蛋白表达载体pET30a(+)载体，然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表达，用镍柱纯化PHD蛋白。温室试验结果显示，该蛋白还能诱导烟草抗烟草花叶病毒的侵染，防效为56.88％。

Description

青枯菌N477胞外蛋白PHD及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及青枯菌N477胞外蛋白PHD(PopW Harpin domain)及其编码基因和应用。

背景技术

绝大多数的革兰氏阴性细菌的hrp基因簇能在非寄主植物上引起过敏性反应，而在寄主植物上表现出致病性。hrp基因的产物在其表达及分泌过程中起着调控作用。如Erwinia amylovora的HrpN，Pseudomona syringae的HrpZ以及Ralstonia solanacearum的PopA类似的Harpin蛋白已经被鉴定出来，他们能够通过三型泌出***分泌到胞外引起非寄主植物发生过敏性反应，是一类富含甘氨酸、丝氨酸，缺少半胱氨酸并且耐热的一种蛋白，在氨基酸序列上没有相似性。

青枯病是一种毁灭性的土传病害，是世界上危害最大、分布最广、造成损失最严重的植物病害之一，至今尚无很有效的化学农药和其他防治办法。因此青枯病被称为植物的“癌症”。近年来，我国北方保护地面积明显扩大，南方塑料大棚蔬菜生产扩大，因此在部分地区青枯病有所发生和发展，甚至成为毁灭性灾害，造成了极严重的经济损失。

青枯菌能够在全世界范围内引起数百种农作物发生萎蔫，可侵染50多个科200多种植物，其中茄科植物受害最重，包括番茄、马铃薯、烟草、花生、香蕉等。病菌通过寄主根部伤口侵染进入木质部，然后快速扩散到整个植株。其致病机理是青枯菌在导管中生长时可产生大量的胞外多糖，能影响和阻碍植物体内的水分运输，特别是容易对叶柄结和小叶处较小孔径导管穿孔板造成堵塞，因而引起植株枯萎。在模式菌株GMI1000中，三个胞外蛋白已经被鉴定出来，分别是PopA1,PopB和PopC。PopA1，是一种通过三型泌出***分泌到胞外的蛋白，同时缺少N-末端92个氨基酸。PopA1的衍生物PopA3也已经从生长在营养贫瘠培养基的上清液中纯化出来。PopA1和PopA3均能引起矮牵牛花的过敏性反应。popA位于青枯菌hrp基因簇上游2kb，其表达受hrpB基因的调控。Arlat小组从青枯菌的基因组中发现了新蛋白PopB和PopC，PopB蛋白由173个氨基酸组成，含有两个核定位信号；PopC长1024个氨基酸，其中含有22个亮氨酸拉链。popB、popC以及popA都是同时受hrpB调控的。在刚果红诱导下，他们发现PopB和PopC是通过Hrp***分泌到胞外的。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供青枯菌N477胞外蛋白PHD。

本发明的另一目的是提供青枯菌N477胞外蛋白PHD编码基因。

本发明的又一目的是提供青枯菌N477胞外蛋白PHD编码基因的应用。

青枯菌N477胞外蛋白PHD，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因。

所述的青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因优选核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因的重组表达载体。

含有所述的青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因的基因工程菌。

所述的青枯菌N477胞外蛋白PHD在制备抗青枯病的生物源农药中的应用。

所述的青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因在制备抗青枯病的生物源农药中的应用。

所述的重组表达载体在制备抗青枯病的生物源农药中的应用。

所述的基因工程菌在制备抗青枯病的生物源农药中的应用。

含有所述的青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因的基因工程应用，包括：

1)PHD基因的克隆

青枯菌N477在30℃条件下培养于YGPA培养基，待菌株生长至对数期，按照细菌基因组提取试剂盒操作说明提取青枯菌基因组DNA；

设计扩增PHD的编码基因的引物，以基因组DNA为模板，使用高保真pfu聚合酶扩增PHD基因的编码区序列，扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃10min，产物切胶回收；所述的扩增PHD的编码基因的引物选自引物1：引物1上游引物如SEQ ID NO.3所示，引物1下游引物如SEQ ID NO.4所示；

2)PHD蛋白的表达及纯化

产物切胶回收后连接至中间载体酶切或直接酶切后连接至蛋白表达载体pET30a(+)载体，测序鉴定，得到重组载体pET-PHD，然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表达，将筛选到的阳性克隆接种到含有LB液体培养基的试管中，37℃，180rpm培养过夜，第二天按1:100的比例接种到10ml LB中，按照上述条件培养3h，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，使其终浓度为1mM，诱导培养2h后，4℃，6000rpm，离心10min，收集菌体，将其悬浮于20mMTris-HCl、pH 8.0，加入终浓度为1mM的笨甲基磺酰氟，然后在超声波破碎仪上对菌体进行破碎，当菌液变澄清时，离心吸取上清，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并用镍柱纯化PHD蛋白，具体操作参照High-Affinity Ni-IDA Resin操作说明书进行，获得纯化PHD。

有益效果

本发明人获得的PHD是一种耐热的harpin蛋白，能够引起烟草发生过敏性反应。PopW是无活性的果胶酶同源物，虽然也能引起HR反应，但经本发明发现起决定作用的是PHD，PHD能更有效抑制烟草抗TMV的侵染，且效果明显优于PopW。

3、本发明获得的PHD处理烟草，可以诱导烟草抵抗烟草花叶病毒的侵染，而且抗性不仅限于PHD处理的叶片，也包括其周围的叶片，并且该过程中伴随着PR-1基因的表达。说明PHD可以诱导烟草***获得抗病性。这说明PHD具有开发成生物源农药的价值。

附图说明

图1.PHD蛋白表达结果。

M是蛋白marker(SM0431，MBI)，1是1％BSA，2是PopW克隆表达结果，3是PHD克隆表达结果。

生物材料保藏信息

N477菌株，分类命名为茄科罗尔斯通氏菌属Ralstonia solanacearum，2018年1月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.15253。

具体实施方式

实施例1

(1)PopW基因序列的克隆

青枯菌(Ralstonia solanacearum)N477在30℃条件下培养于YGPA培养基(0.5％蛋白胨，0.5％酵母提取粉，1％葡萄糖和1.5％琼脂)，待菌株生长到对数期，提取基因组DNA(Axyprep Bacterial Genomic DNA kit,杭州)。根据模式菌青枯菌GMI1000全基因组序列设计扩增引物：

上游引物F1：ATGTCCATCCAGATTGATCGC(SEQ ID NO.4)

下游引物R1：GCCCGAGTAGGCCTTGTAG(SEQ ID NO.5)

以N477基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃10min，用1％的琼脂糖电泳检测PCR扩增产物1143bp，按照Agarose Gel DNA Purification Kit(TaKaRa，Dalian)手册进行回收。将回收到的产物4μl连接至载体pMD19-T上，在16℃反应16h后，用热激法转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取阳性克隆进行测序，测序结果表明青枯菌N477胞外蛋白基因PopW的完整编码区为1143bp(SEQ ID NO.3)。

(2)PopW蛋白表达

根据青枯菌N477胞外蛋白PopW基因的全长编码序列，设计两端分别加酶切位点的引物：

上游引物F2：CGCATATGTCCATCCAGATTGATCGC Nde I(SEQ ID NO.6)

下游引物R2：GCAAGCTTGCCCGAGTAGGCCTTGTAG Hind III(SEQ ID NO.7)

以N477的基因组DNA为模板，进行PCR扩增popW基因的编码区序列，扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃10min，产物大小为1143bp，切胶回收到的产物末端加A后将其连接至载体pMD19-T上，利用Nde I和HindIII酶切位点将其克隆至蛋白表达载体pET30a(+)载体，测序鉴定，得到重组质粒pET-PopW，然后转化至BL21(DE3)中进行蛋白表达，将培养好的含有上述重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)离心收集菌体，将其悬浮于20mM Tris-HCl(pH 8.0)，加入终浓度为1mM的蛋白酶抑制剂PMSF，在超声波破碎仪上进行蛋白破碎，然后提取蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，用镍柱纯化PopW蛋白。

(3)PHD的克隆

根据青枯菌N477胞外蛋白PopW基因的全长编码序列，设计扩增引物：

上游引物F3：GGTCGGCTCGGGCGGCTT(SEQ ID NO.8)

下游引物R3：TCCATCCAGATTGATCGCCCG(SEQ ID NO.9)

以N477基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性4min，94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃10min，用1％的琼脂糖电泳检测PCR扩增产物454bp，按照Agarose Gel DNA Purification Kit(TaKaRa，Dalian)手册进行回收。将回收到的产物4μl连接至载体pMD19-T上，在16℃反应16h后，用热激法转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取阳性克隆进行测序，测序结果表明N477胞外蛋白基因PHD的完整编码区为441bp。

(4)PHD蛋白表达

上游引物F4：ATAAGCTTGGTCGGCTCGGGCGGCTT Hind III(SEQ ID NO.10)

下游引物R4：GCCATATGTCCATCCAGATTGATCGCCCG Nde I(SEQ ID NO.11)

以N477基因组DNA为模板，PCR扩增PHD基因的编码区序列，扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃10min，产物大小为454bp，将其克隆至中间载体pMD19-T，利用引入的Nde I和Hind III酶切位点进一步克隆至蛋白表达载体pET30a(+)载体，测序鉴定，得到重组质粒pET-PHD，然后转化至BL21(DE3)中进行蛋白表达，将培养好的含有上述重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)离心收集菌体，将其悬浮于20mM Tris-HCl(pH 8.0)，加入终浓度为1mM的蛋白酶抑制剂PMSF，在超声波破碎仪上进行蛋白破碎，然后提取蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，用镍柱纯化PHD蛋白，得到蛋白浓度为25mg/LW(图1)。

实施例2

分别以上述获得的PopW可溶性蛋白和PHD蛋白，用喷雾法喷于烟草叶片，用不含PHD蛋白的灭菌水和空载体作为对照处理。两天以后，采用摩擦接种的方法分别对喷过PHD的叶片及其上面和下面的两片叶片接种烟草花叶病毒，每个处理3个重复，每次重复12株烟草苗。4天以后我们观察病斑的数目，通过病斑的数量来计算防效。防治效果＝[(对照叶片上枯斑数-处理叶片上枯斑数)/对照叶片上枯斑数]x 100％。结果显示，和没有处理的空白对照相比，PopW可溶性蛋白和PHD处理过的叶片上病斑数明显减少，防效分别可达45％和56.88％(表1)，说明PopW蛋白和PHD能够引起烟草的***抗性，但PHD能更有效抑制烟草抗TMV的侵染，从而有效抑制烟草花叶病毒的侵染。

表1 PHD对烟草花叶病毒病的生防效果

注：在处理4天后记录每张病叶上的枯斑数，计算枯斑抑制率，即为蛋白防治效果。

以上实施例表明本发明中克隆的一种青枯菌N477新胞外蛋白PHD，它具有Harpin的特征，包括氨基酸的组成，热稳定性，蛋白酶敏感以及在SDS-PAGE上迁移较慢等特性，PHD和PopW都能引起HR反应。本发明的PHD处理烟草，可以诱导烟草抵抗烟草花叶病毒的侵染，而且抗性不仅限于PHD处理的叶片，也包括其周围的叶片，并且该过程中伴随着PR-1基因的表达。说明PHD可以诱导烟草***获得抗病性，说明PHD可以开发成生物源农药。

Claims

1.青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因在制备抗烟草花叶病毒病的生物源农药中的应用；所述的青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.含有青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因的重组表达载体在制备抗烟草花叶病毒病的生物源农药中的应用，所述的青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.含有青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因的基因工程菌在制备抗烟草花叶病毒病的生物源农药中的应用，所述的青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。