KR100515206B1

KR100515206B1 - 백두옹 추출물을 주성분으로 함유하는 미백 화장용 조성물

Info

Publication number: KR100515206B1
Application number: KR10-2002-0057653A
Authority: KR
Inventors: 김혜영; 김종석; 김종욱
Original assignee: 김종석; 김종욱; 김혜영
Priority date: 2002-09-23
Filing date: 2002-09-23
Publication date: 2005-09-16
Also published as: KR20040026272A; EP1549285A1; AU2003263624A1; CN100408023C; WO2004026275A1; CN1684660A; CA2499603A1; JP2006517180A; EP1549285A4

Abstract

본 발명은 백두옹의 추출물을 주성분으로 함유하고, 필요하면, 여기에 백두옹의 추출물에서 얻어진 라누쿨린(ranunculin), 데옥시포드필로톡신 (deoxypodophyllotoxin), 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실 (1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드(SB365)에서 선택된 1종이상의 성분을 함유하고, 여기에 유피 및 감초추출물에서 선택된 1종이상의 보조성분을 함유하는 미백 화장용 조성물을 제공하는 것이며, 본 발명의 조성물은 탁월한 미백효과를 가진다.

Description

백두옹 추출물을 주성분으로 함유하는 미백 화장용 조성물 {Cosmetic composition having whitening effect comprising extract of Pulsatilla Radix as main ingredient}

본 발명은 백두옹 추출물을 주성분으로 함유하는 미백 화장용 조성물에 관한 것이다.

인간의 피부는 표피(epidermis)와 진피(dermis)로 구성되어 있다. 표피에는 손톱, 모발이 생성되고 땀샘도 존재한다. 진피에는 신경망, 혈관, 모발샘과 땀샘이 있다. 멜라닌을 생성하는 멜라닌세포(melanocyte)는 표피에 존재한다. 멜라닌 생성의 출발 물질은 필수 아미노산의 하나인 타이로신(tyrosine)이 타이로신 하이드록시라제에(tyrosine hydroxylase, TH)) 의하여 산화되어 3,4-디하드록시페닐알라닌 (3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)으로 되고 이 물질이 여러 가지 반응단계를 거쳐 흑색의 폴리머인 멜라닌으로 변화된다. TH 기능이 선천적으로 결여되면 백피병(albinism)으로 나타난다.

따라서 멜라닌의 생합성 기전에서 미백물질의 개발의 가장 중요한 타깃이 되는 것은 TH로서 이 효소의 활성을 저해하는 물질을 찾는 것이 무엇보다 중요하다.

천연물로부터 타이로시나제 저해물질(tyrosinase inhibitor)를 찾기 위한 노력도 경주되고 있다. 특허공개 특2002-0023168에는 치자 추출물이 TH에 대하여 동시에 실험한 아르부틴(arbutin) 보다 3배 정도 더 강한 저해효과를 보인다고 하였다. 그러나 치자가 함유하는 어떠한 물질이 TH저해 작용을 보이는지를 밝히지 않음으로써 사람의 피부에 대한 유해작용을 평가할 수가 없다.

종래 TH저해제로 사용한 물질군은 디하이드록시벤젠(dihydroxybenzene) 유도체, 레티노이드계 물질, 스테로이드 호르몬계 물질등으로, 이들은 모두 피부에 대하여 부작용을 보이고 있어서 그 사용이 제한적이다.

본 발명은 백두옹(할미꽃(Pulsatilla koreana)의 뿌리)로부터 용매 추출하여 미백효과가 있는 엑기스 제제를 만드는 것과, 이 추출물을 주제로 하고 이것과 유백피의 추출물을 혼합하여 미백효과가 진전된 복방을 만드는 것을 그 제 1 목적으로 하며, 백두옹 추출물로부터 미백효과 물질을 분리하고 이것과 유백피와 혼합하여 미백효과가 개선된 제제를 제조하는 것을 제 2 목적으로 한다.

백두옹은 Radix Pulsatillae로 표시하며 Pulsatilla koreana, P..cerna, P. chinensis등 Pulsatilla 속 식물 전체를 포함한다, 한방에서는 이를 산열, 해독, 지사의 목적으로 사용되며, 살균, 살 아메바, 항 진균제등의 약리효과를 갖는다.

최근에는 항암효과가 인정되어 임상 시험 중에 있다. 유백피 (Ulmus macrocarpa의 피)는 약리 효과로써 장내 기생충증, 식체에 유효하고, 특히 회충약으로 자주 처방된다. 또한 여러 가지 백선증에 유효하다고 보고되어 있다(Oreintal Materia Medica, H-Y Hsu et.al., Oriental Healing Arts Institute, pp 749) 그러므로 백선피는 피부 보호효과를 갖고 있는 것으로 사료된다.

본 발명의 목적은 백두옹의 추출물을 주성분으로 함유하는 미백 화장용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 백두옹의 추출물을 주성분으로 함유하고, 여기에 유피, 인삼 및 감초추출물을 보조성분으로 함유하는 미백 화장용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 백두옹의 추출물을 주성분으로 함유하고, 여기에 백두옹의 추출물에서 얻어진 라누쿨린(ranunculin), 데옥시포드필로톡신 (deoxypodophyllotoxin), 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실 (1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드(SB365)에서 선택된 1종이상의 성분을 함유하는 미백 화장용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 백두옹의 추출물을 주성분으로 함유하고, 여기에 백두옹의 추출물에서 얻어진 라누쿨린(ranunculin), 데옥시포드필로톡신 (deoxypodophyllotoxin), 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실 (1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드(SB365)에서 선택된 1종이상의 성분을 함유하고, 여기에 유피 및 감초추출물에서 선택된 1종이상의 보조성분을 함유하는 미백 화장용 조성물을 제공하는 것이다.

백두옹추출물에서 분리된 데옥시포도필로톡신은 다음의 구조식을 가지는 공지 화합물이다.

Deoxypodophyllotoxin

백두옹추출물에서 분리된 라눈쿨린은 다음의 구조식을 가지는 공지 화합물이다.

Ranunculin

백두옹추출물에서 분리된 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드(SB365)는 헤데라게닌으로 다음의 구조식을 가지는 공지의 화합물이다.

SB365

이들 물질들은 미백효과가 탁월한 것으로 본 발명에 의하여 확인되었다.

본 발명에서는 크림제, 액제, 주사제, 정제, 캡슐제등에 통상으로 사용되는 부형제를 첨가하여 통상의 제제의 제조방법으로 제형화할 수 있다.

본 발명에서 추출용매로는 물, 메탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올과 같은 저급알카놀, 메틸렌클로라이드, 아세톤 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다.

다음에 실시예 및 실험예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1

일반적 백두옹 엑기스 제조

양질의 백두옹을 40-100메쉬가 되게 분쇄한 다음 일정량을 취하여 추출기에 넣고 저급알코올 수용액으로 추출하였다. 사용한 저급 알코올은 메탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올등이 이었으며 그 중 에탄올 수용액이 활성 물질 추출에 있어서 가장 좋은 선택성을 보였다. 50% 에탄올 수용액을 사용하는 경우 극성이 매우 큰 물질과 분자량이 큰 포리머등은 추출되지 않았다. 추출 온도는 15℃내지 35℃로 하였으며 가장 적절한 온도는 범위는 20℃ 내지 25℃ 였다. 추출 시간은 1시간에서 시간 단위로 추출 하였던바 3시간이 적합하였다. 백두옹을 50% 에탄올을 사용하여 25℃, 3시간 추출한 엑기스를 ET분획이라 표시하고 이를 그대로 미백효과 측정에 사용하였다.

실시예 2

1. 미백효과가 있는 물질의 분리

한편 미백효과는 다음의 실험예에서 일단 사람을 대상으로 한 임상실험에서 효과를 확인하였다. 미백효과 물질의 분리는 사람을 대상으로 할 수는 없음으로 일반 적으로 사용하는 타이로신아제 저해효과측정 방법으로 행하였다.

ET분획에 아세톤을 가하여 저분자, 중등정도의 극성 물질을 추출해내었다. 남아 있는 부분을 PT분획, 아세톤 추출물을 PA 라 표시하였다.

PT 및 PA 분획은 5mg/ml에서 각각 tyrosinase에 대하여 그 활성을 10%,와 73% 저해하였다.

2. PT분획의 활성 물질 1

PT분획을 세파덱스에서 재 분획화를 시행할 때 얻은 분획 3을 정제하여 활성 물질을 얻었다. 활성 물질은 헤데라게닌 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드 임이 밝혀졌다. 이는 이미 항암성 물질로 특허화되어 있다(특허 출원중). 이 물질은 타이로시나제(tyrosinase)에 대하여는 활성을 보이지 않고 있으나, 임상에서는 탁월한 미백효과를 보이는 것으로 보아 다른 기전의 미백작용을 갖고 있음이 활실하다. 사포닌(Saponin)유도체들과 세포 표면과의 관계를 생각할 때 멜라노좀(melanosome)의 이동을 방해하여 케라티노사이트(keratinocyte)에 메라닌이 축적되 못하게 하는 작용을 갖는 것으로 가정한다.

3. PT분획의 미백 물질 2

PT분획을 세파덱스(Sephadex)로 분획할 때 얻은 SPX2분획은 tyrosinase에 대하여 48%의 저해작용을 보였다. 이 분획을 다시 실리카겔 칼럼에 통과시켜 실리카겔 박막에서 Rf=0.3을 보이는 물질을 확인하였으며(전개용매;메치렌 클로라이드/메탄올=4:1) 이 Rf치는 ranunculin의 그것과 일치하였다. 알려진 방법으로 물질을 분리하였던 바 그의 NMR은 ranunculin의 그것과 같았다.

ranunculin은 미나리 아재비과 식물에 널리 퍼져있는 물질로서 세포분열독성(mitotoxicity)이 있는 것으로 알려졌다(Vonderbank, Pharmazie 5, 21(1950). 순수한 ranunculin은 tyrosinase에 대하여 51%의 저해효과를 보였다.

4. PA분획의 활성 물질

데옥시포도필로톡신(Deoxypodophyllotoxin)은 전호등 여러 종류의 식물에 함유되어 있고 세포분열독성(mitotoxicity)보인다(안병준, 김송배, 김용: 데옥시포도필로톡신의 항암제로서의 용도, 특허 제 315200호). 또한 이물질은 사람의 배꼽 내피 세포의 혈관 형성을 저지한다고 보고되어 있다(Yong Kim, Song-Bae Kim, byung-Zun Ahn, Deoxypodophyllotoxin; the cytotoxic and antiangiogenic component from Pulsatilla koreana Nakai, Planta Medica, 68, 271-274(2002). 이 물질은 0.03 ug/ml에서 tyrosinase의 활성을 38% 저해하였다. 물에 대한 용해도가 낮아서 더 높은 농도에서는 실험하기 힘들다.

실시예 3

잘게 분쇄한 백두옹 50g과 50% 에타올 500ml을 추출기에 가하고 실온에서 3시간 교반 한다음 여과한다. 여액은 보관하고 식물 잔체에는 다시 50%에탄올 500ml를 가하고 3시간 실온에서 추출한단 여과한 다음 식물 잔체에 대하여는 같은 추출을 한번 더 반복한다. 추출액은 감압 증류하여 건고한다. 수율 23g.

실시예 4

Tyrosinase 저해 분획 PT 및 PA분획의 제조

이 추출물 20g을 덜어내어 아세톤 200ml를 가하고 현탁시킨 다음 10분간 흔들어 준다. 여과하여 아세톤 물용분과 용해분을 얻은다. 아세톤 불용분은 아세토 200ml에 현탁시킨 다음 10분간 흔들어 준 다음 여과한다. 불용분을 건조하여 PT분획이라 표시하고(17.4g), 아세톤 용해분을 건조하여 PA분획(3.5g)이라 표시한다.

실시예 5

PT분획으로부터 tyrosinase 저해물질 PTpur의 분리

분획 PT 560 ㎎을 메탄올:물=80:20을 사용하여 세파덱스 LH20 칼럼(200 g, 60×4 cm)에서 유출속도를 1 분당 1 ㎖, 분획량을 한 개의 튜브당 0.5 ㎖로 하여 분획을 행하였다. 이들 분획을 차례대로 실리카겔 박막 상에 점적한 후 전개하여 분획을 나누었다(전개용매; 부탄올:아세트산:물=4:1:1, 색반응; 황산을 분무한 후 가열함). 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서, PT1(139 ㎎, 24.8%)은 시험관 번호 26∼66을 모은 것으로 주 반점은 4 개이고 아래 것은 황산과 황색으로 반응한다. PT2(344 ㎎, 61.4%)는 시험관 번호 66∼91을 모은 것으로 2 개의 주 반점으로 구성되는 분획이다. PT3(61 ㎎, 10.9%)는 시험관 91∼111을 모은 것이며 황산 분무 후 가열시 처음에는 적색을 나타내다가 시간이 경과하면 청색을 나타내며, Rf 값이 평균적으로 0.48∼0.50 사이에 있는 반점을 주 물질로 하는 분획이다. PT4(15.7 ㎎, 2.8%)는 시험관 111∼138을 모은 분획이며, SPX3 와 SPX4는 박막 상에서는 한 개의 반점을 보이는 비교적 순도가 높은 분획들이다. 분획은 그림 1에 표시하였다.

세파덱스 LH20 칼럼 크로마토그래피를 통하여 SPX1, SPX2, SPX3 및 SPX4를 얻었다.

SPX3은 비교적 순수한 분획으로써 물 0.5 ml에 가하여 녹인 다음 방치하여 생성되는 백색 결정을 취하여 말린다(PTpur).

실시예 5

PTpur의 구조 결정

상기에서 분리한 물질 PTpur는 m.p. 239∼241 ℃, [α]_D=+23.6 °(c, 0.2, MeOH)의 백색 무정형으로 리베르만-부카르트 반응에서 양성으로 나타난 것으로 보아 배당체로 확인되었다. 또한, IR(cm^-1)에서는 3400(br, -OH), 2940(br, C-H), 1695(C=O), 1455, 1040(C-O)에서 관찰되었으며, 1000-1100, 3000-3400상의 흡수대를 보면 배당체일 가능성이 큰 것으로 판단하였다.

¹H-NMR을 보면 전형적인 사포닌의 NMR 패턴을 따르고 있으며, 6 개의 -CH₃기들이 0.91, 0.92, 0.98, 1.00, 1.07, 1.21 ppm에서 관찰되었고, 또 하나의 -CH₃기가 1.64 ppm에서 더블렛(doublet)으로 관찰되었는데 이로부터 구성 당 중 1 개의 람노스가 존재할 것으로 추정되었으며, 아노머 프로톤(anomeric proton)이 6.25(br.), 5.11(1H, J=7.80 Hz)와 4.97 ppm(1H, J=6.66 Hz)에서 관찰되었다. 따라서 PTpur는 3 개의 당이 결합된 배당체인 것으로 확인되었다.

¹³C-NMR에서는 65.4 ppm(C-23)에서 하이드록시메틸기가 관찰되었으며 3 개의아노머 탄소 시그널들이 각각 140.2(C-1′), 106.7(C-1˝′), 101.7 ppm (C-1′)에서, 두 개의 올레핀 탄소가 122.5 ppm(C-12)과 144.8 ppm(C-13)에서 관찰되었고, 하나의 카복시 탄소가 180.2 ppm(C-28)에서 관찰되었다. 통상적으로 28 위치에 당이 결합될 때 약 4 Hz의 글리코실화 업필드 쉬프트(glycosylation upfield shift)가 나타나지만(180.2 ppm →176.2 ppm), 이 화합물에서는 위와 같은 현상이 발견되지 않은 것으로 보아 28 위치에 당이 결합된 배당체는 아닌 것으로 확신할 수 있었다.

다음으로 당의 구성과 아글리콘(aglycone)의 구조를 확인하기 위하여 에탄올/황산에서 가수분해를 수행하였다. 가수분해 산물인 아글리콘의 물리화학적 데이터와 ¹³C-NMR과 ¹H-NMR을 비교해본 결과 PTpur가 헤데라게닌임을 확인하였다. 또한, 가수분해된 당은 비교 TLC에 의하여 람노스, 아라비노스 및 글루코스인 것으로 확인되었다.

이상의 결과와 발표된 문헌의 데이터를 종합 분석한 결과, PTpur는 본 식물로부터 이미 분리된 바 있는 사포닌인, 헤데라게닌 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드임을 확인하였다.

PTpur의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 데이터는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

표 1.

실시예 6

PT분획으로부터 tyrosinase 저해물질인 PTculin의 분리

PT과 ranunculin을 시리카겔 박막상에서 전개한 결과 Rf=0.3에서 동일 반점이 나타남을 확인하였다. (용매; 메칠렌 클로라이드/메탄올=4:1).

실시예 7

PA로부터 tyrosinase 저해물질인 PApur의 분리.

PA분획 30mg을 메탄올 2ml에 용해시키고 여기에 헥산 3ml를 가하여 흐들어 준다. 방치후 헥산 용해분을 따룬다. 이 추출을 2회 더 반복한다. 헥산 용해분을 합친 후 건고한 다음 시리카겔 박막상에서 deoxypodophyllotoxin과 비교 크로마토그래피를 행하였다. PA추출물의 헥산 용해물 중에는 Deoxypodophyllotoxin과 같은 위치에 나타나는 반점이 확인되었으며, 이를 분취용 시리카겔 박막으로 분리하여 3mg의 deoxypodophyllotoxin을 얻어 NMR을 측정한 결과 표준 품과 동일하였다.

다음에 제제실시예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

제제실시예 1

유제

유상기제의 조성(g);

세틸 옥타노에이트 4.0

사이클로메티콘 3.0

유동 파라핀 4.0

폴리소르베이트 60 5.0

소르비탄 스테아레이트 3.0

위 기제(19g)에 ET분획 100mg, 400mg, 800mg, 1000mg씩을 각각 균질이 되게 혼합하여 제제P100, 제제P400, 제제P800, 제제P1000mg으로 표시하였다.

제제실시예 2

주사제

백두옹을 주제로 하고, 유피, 인삼, 감초등을 보조제로 첨가한 처방으로 이를 50% 에탄올 수용액으로 추출한다. 이 추출물을 주사제 제조방법에 따라 동결건조한 것이다.

제제실시예 3

실시예 3의 조성물 100mg

전분 100mg

유당 50mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조하였다.

제제실시예 4

실시예 3의 조성물 100mg

유당 50mg

스테아린산 마그네슘 적량

탈크 적량

상기의 성분을 통상의 정제의 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

제제실시예 5

실시예 3의 조성물 3.0g

이성화당 50.0g

소디움 알지네이트 50.0mg

소디움 벤조에이트 적량

정제수 적량

상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라 제조하고 100ml용량의 갈색병에 충진하여 액제를 제조하였다.

제제실시예 6

실시예 3의 조성물 50mg

라눈큘린 10mg

주사용 증류수 적량

상기의 성분을 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1ml의 앰플에 충진하고 밀전하여 주사제를 제조하였다.

제제실시예 7

실시예 3의 조성물 100mg

데옥시포도필로톡신 10mg

SB 365 10mg

전분 100mg

유당 50mg

스테아린산 마그네슘 적량

제제실시예 8

실시예 3의 조성물 100mg

데옥시포도필로톡신 10mg

유당 50mg

스테아린산 마그네슘 적량

탈크 적량

제제실시예 9

실시예 3의 조성물 3.0g

SB 365 100mg

이성화당 50.0g

소디움 알지네이트 50.0mg

소디움 벤조에이트 적량

정제수 적량

실험예 1

백두옹 추출물의 임상적 미백효과

미백효과는 일단 여성 자원자 20명을 대상으로 행하였다. 그 중 10명은 얼굴 부위에 주근깨가 있었고 10명은 기미가 있는 여성들이었다.

주근깨 여성 10명을 A, A', B, B', C, C', D, D', E, E'로 표시하고 A그룹에게는 제제 P100를, B 그룹에게는 제제 P400을 C그룹에는 제제 P800을, D 그룹에게는 제제P1000을, 그리고 마지막으로 E 그룹에게는 기제만을 바르게 하였다. 바르는 위치는 주근깨가 있는 얼굴 부분이었다.

기미 여성 10명도 동일하게 분류하고 약물과 기제를 바르게 하였다.

적용 용량은 제제 및 기제를 피부 5x5 cm²당 500mg이며, 적용회수는 하루에 3회로 하였다. 약물을 바를 때에는 매번 세면을 하게 하였다. 약물 적용 일수는 3주로 하였다.

효과는 3인의 관찰자가 실험 초기부터 비교 관찰하고 협의하여 유효, 다소 유효와 무효로 판정하였다.

그 결과는 표 2에 표시하였다.

표 2. 주근깨 및 기미 여성에 대한 할미꽃 제제의 효과

주근깨 기미

A,A'(100mg) A 무효, A' 무효 G,G'(100mg) G 무효, G'무효

B,B'(400mg) B 유효, B‘, 다소유효 H,H'(400mg) H 다소 유효, H'다소 유효

C,C'(600mg) C 치료, C' 유효 I, I' (600mg) I 치료, I' 치료

D,D'(800mg) D 치료, D' 치료 J, J' (800mg) J 치료 , J' 치료

E,E'(1000mg) E 치료, E' 치료 K, K'(1000mg) K 치료, K' 치료

F,F'(기제) 모두 무효 L, L'(기제) 모두 무효

치료; 주근깨 또는 기미가 없어진 상태; 유효; 주근깨 또는 기미가 전반적으로 줄어든 상태, 따소 유효; 주근깨 또는 기미가 다소산 줄어든 상태

상기 표 2에서 볼 수 있듯이 백두옹 추출물 100mg을 기제 19g과 혼화한 제제 P100은 주근깨 그룹 A,A'(100mg), 기미 그룹 G,G'(100mg)에서 효과를 보이지 않았으며, B,B'(400mg), H,H'(400mg) 그룹이서는 다소간 효과가 있다. 그 이상의 투여량에서는 유효하다. 기미의 경우에는 600mg이상 투여 군에서는 모두 치료효과를 보였고, 주근깨의 경우에는 800g 이상에 군에서 치료효과를 보였다.

실험예 2

주사제의 미백효과 임상

기미가 있는 여성 5명을 택하여 A, B, C, D, E로 표시하였다. 이들 각각에게 주사제 5.0 ml를 하루에 한번씩 3 일간 계속 주사하고 14일 후에 다시 동일하게 투약하였다. 동시에 연구제를 투약하였다. 여성 A,B,C 는 주사 및 연고제 적용 후 5일에 기미가 치료되었으며, D,E는 유효하였다.

주사제 투여가 주사없이 피부에 도포하는 방법 보다 속효성임을 알 수 있다.

한편 미백효과는 일단 사람을 대상으로 한 임상실험에서 효과를 확인하였다. 미백효과 물질의 분리는 사람을 대상으로 할 수는 없음으로 일반적으로 사용하는 타이로신아제 저해효과측정 방법으로 행하였다.

PT 및 PA분획은 5mg/ml에서 각각 타이로시나제에 대하여 그 활성을 10%와 73% 저헤하였다.

순수한 라눈쿨린은 타이로시나제에 대하여 51%의 저해효과를 나타내었다.

데옥시포도필로톡신은 0.03ug/ml에서 타이로시나제의 활성을 38% 저해하였다. 물에 대한 용해도가 낮아서 더 높은 농도에서는 실험하기 힘들었다.

실험예 3

Ranunculin, Deoxypodophyllotoxin, SB365로 구성된 제제의 미백효과 임상시험

약물 구성; Ranunculin 10 mg, Deoxypodophyllotoxin 50mg, SB365 15 mg을 위의 기제 (19g)와 혼합한 후 이를 기미 부위에 문지른다. 하루 3회씩 기미가 치료될때가지 바른다.

기미 여성 5 (A,B,C,D,E)중 A,B는 약물 투여 후 10일에 치료 되었으며, C는 19일 D는 27일 만에 치료 되었다. E는 약간 유효하였으나 치료되지는 아니하였다.

다음으로는 처방전 중 tyrosinase에 효과 없었던 SB365를 제외한 제제를 사용하여 기미 여성 5명 (F,G,I,J,K)에 적용하였다. FG는 26일 만에 치료효과가 있었고 I는 35일만애, J와 K는 유효한 수준이었다.

이 임상의 결과로 보면 SB365는 Tyrosinase를 저해하지는 않으면서도 매백효과를 보임을 알수 있다. SB365는 메란닌 분비세포(melanocyte)에 작용하여 melanin이 keratinocyte로 이동하는 과정을 저지하는 작용을 할 가능성도 있다. 확실한 기전의 규명은 학문적 가치가 있을 것이다.

미백효과가 있는 백두옹 제제에 인삼, 감초, 유백피등을 첨가로 인하여, 백두옹 미백효과에 대하여 상승작용은 물론, 사포닌의 살균성을 통한 피부 보호, 또 그 피부 세척 및 침투효과등 미용 상의 이점을 기대할 수 있다.

실험예 4

Tyrosinase 저해작용측정

Tyrosinase는 Sigma사에서 구입하였다. 효소의 기질인 3,4-디하이드로페닐알라닌 인산소다(sodium phosphate) 완충액 (0.1M, pH 6.0)에 용해시켜 농도가 1.6mg/ml가 되게 조절한다. 시료를 인산소다 완충액에 용해시키고 용해되지 않은 부분을 원심분리하여 제거한다. 완충액 0.7ml, 시료 0.2 ml와 효소액 0.1 ml(15.7 unit/ml)를 혼합하고 60초 후에 스펙트로포토미터로 옮겨 475nm에서 흡광도를 측정한다.

다음 식에 의하여 tyrosinase저해율(%)를 계산하였다.

타이로시나제 활성 저해율(%)=[1-(S-B)/C] x 100

여기서 S; 효소 및 시료 첨가 시험관, B; S로 부터 효소만 제외된 시험관, C; S로부터 시료만 제외된 시험관.

실험예 5

본 발명의 실시예 3의 조성물을 제 1표에 나타낸 농도에 첨가한 소의 태아혈청 10%을 함유하는 이-글 MEM 배양배지에 마우스 흑색종 유래의 B-16 배양세포를 접종하여 37 C, 5% CO2 조건하에 5일간 배양한후 세포를 트립신으로 분산하여 1,000rpm x 5분간 원심분리하여 세포를 모아 그 흑색도를 육안으로 보아 판정하였다.

판정의 기준은 다음과 같다.

-: 실시예 3의 조성물을 첨가하지 않은 것과 같은 정도

+: 약간 백색화

++: 상당히 백색화

+++: 대부분 백색화

표 3

실시예 3의 조성물의 양(농도: 중량%) 결과

대조군 - -

0.01 +-

0.1 ++

0.3 ++

0.5 ++

0.7 +++

1.0 +++

상기의 결과에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 흑색종유래의 멜라닌색소의 백색화효과가 탁월함을 알 수 있다.

실험예 6

피시험자(건강한 남성, 여성 지원자 각각 15명 계 30명)의 상 우완 내측부의 부위에 2x2cm의 부위를 설정하고 피시험부위를 온수로 잘 세정한후 피시험부위에만 자외선이 조사되도록 알루미늄 포-일로 다른 부위를 마스킹시키고 10cm 거리에서 도시바(주)제품 FL20SBLB 램프 및 FL20S E-30램프를 각 2개 동시에 0.8X10erg/cm³/회/일로 연속 3회 조사(照射)하였다. 조사후, 그 부위에 다음의 표 2에 나타낸 시료를 일일 3회(아침, 낮, 밤)도포하였다. 평가는 육안으로 3주간후의 색소침착도를 판정하고 그 개선도를 현저한 효력, 유효, 무효의 3단계로 평가하였다. 그 결과는 다음의 표 4와 같다.

표 4

성 분 농도(중량부)

실시예 3의 조성물 0.5

폴리옥시에틸렌(40)모노스테아레이트 2.0

글리세롤모노스테아레이트 5.0

스테아린산 5.0

베헤닐알콜 1.0

유동파라핀 1.0

그리세릴트리옥타노에이트 10.0

1.3-부닐렌글리콜 5.0

정제수 적량

1,3-부틸렌글리콜 및 정제수를 제외한 성분을 가열용해하고(油狀), 별도로 1,3-부틸렌글리콜과 정제수를 혼합가열하였다(液狀). 유상에 액상을 첨가하고 교반하여 유화시킨후 냉각시켜서 바니싱크림을 제조하였다.(백두옹 추출물 바니싱크림)

별도로 표 4에서 백두옹 추출물만을 제외하고 바니싱크림을 제조하여 대조로 사용하였다.

그 결과는 다음 표 5와 같다.

표 5

성 분 저효(명) 유효(명) 무효(명)

백두옹 추출물 17 10 3

대 조 0 3 27

상기의 실험결과로부터 본 발명의 백두옹 추출물을 함유하는 화장품이 탁월한 멜라닌생성의 억제효과를 가진 것임을 알 수 있다.

도 1은 세파덱스 LH20 칼럼 크로마토그래피를 통한 PT 분획의 크로마토그래피 결과이다.

Claims

유효성분으로 라눈쿨린(ranunculin), 데옥시포드필로톡신(deoxypodophyllotoxin) 및 3-0-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드를 가지는 백두옹 추출물을 함유하는 미백 화장용 조성물.
백두옹 추출물에 백두옹의 성분인 라누쿨린(ranunculin), 데옥시포드필로톡신(deoxypodophyllotoxin), 3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)]-α-L-아라비노피라노사이드(SB365)에서 선택된 1종이상의 성분을 더 함유하는 미백 화장용 조성물.
제 1항 또는 2항에 있어서, 유백피, 인삼 및 감초에서 선택된 1종 이상의 보조성분의 추출물을 함유하는 미백 화장용 조성물.
제 1항 내지 제 3항의 조성물을 유효성분으로 함유하고 화장용 조성물로 제형화한 미백 화장용 제제.