상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 베라진, 에피-베라진 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 피부미백용 화장료를 제공한다.
상기 베라진, 에피-베라진 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 함량은 화장료 총 중량을 기준으로 0.000001 내지 10중량%인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 베라진(Verazine), 에피-베라진(epi-Verazine)은 녹총 (Veratrum album), 여로(Veratrum nigrum) 등과 같은 식물에서 추출될 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 피부미백용 화장료를 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 피부미백용 화장료는 독성이 없고 안정성이 우수하며, 멜라닌 생성 억제 활성을 갖는 물질인 베라진, 에피-베라진 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함한다.
베라진 (verazine, (3S,20S,25S)-22,26-iminocholesta-5,22(N)-dien-3-ol, C27H43NO, Mw 397, mp 175-178)과 에피-베라진(epi-verazine, (3S,20R,25S)-22,26-iminocholesta-5,22(N)-dien-3-ol, C27H43NO, Mw 397)은 각각 하기 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 화합물이다.
이와 같은 베라진과 에피-베라진은 항진균효과(Chem. Pharam. Bull, 35(12), 1987, 4862-7)와 암세포의 DNA fromation 억제 효과(Lanzhou Daxue Xuebao, Ziran Kexueban, 21(2), 1985, 86-90)가 있는 것으로 알려져 있으나, 피부 미백과 관련하여 기술하고 있는 문헌은 없다. 본 발명자들은 이들을 이용하여 멜라닌 합성 유도 자체를 억제하는 물질까지 스크리닝(screening)할 수 있는 쥐의 멜라노마 세포(B16 mouse melanoma cell)를 대상으로 실험한 결과, 이들이 매우 강력한 멜라닌 생성 억제 효과 및 미백효과를 나타냄을 밝혀냈다. 따라서, 베라진과 에피-베라진을 피부외용 연고, 에센스, 크림 등의 화장료에 첨가하여 피부에 도포하면, 피부에 별다른 부작용 없이 강력한 미백효과를 나타낼 수 있다.
베라진과 에피-베라진은 합성방법을 통하여, 또는 시중에서 구입할 수 있는 한약재로부터 쉽게 추출할 수 있다. 이러한 한약재 원료 식물로는 Veratrum album, Veratrum nigrum, Veratrum maakii, Veratrum patulum, Eclipta alba, Veratrum taliense, Veratrum loblianum, Zigadenus sibiricus, Veratrum dahuricum 및 Veratrum oxisepalum 등이 알려져 있다. 이들 식물로부터 베라진 또는 에피-베라진을 추출하는 방법은 예를 들어 다음과 같다.
먼저, 여로(Veratrum nigrum), 녹총(Veratrum album) 등을 물 또는 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급알코올 , 에틸아세테이트, 아세톤 등의 유기용매로 가열추출한 후, 헥산, 클로로포름, 부탄올 등을 이용한 용매분획을 통하여 분취, 정제하면 고순도의 베라진 및 에피-베라진을 얻을 수 있다.
얻어진 베라진 또는 에피-베라진은 각각 또는 동시에 피부외용연고나 로션 같은 여러 화장료에 함유되어 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 화장료 제조시에 함유되는 베라진, 에피-베라진 또는 이들의 혼합물의 함량은 화장료 총중량을 기준으로 0.000001 내지 10중량%인 것이 바람직하다. 함량이 0.000001중량% 미만이면 뚜렷한 멜라닌 생성 억제 효과 및 미백효과를 기대하기 어려우며, 10중량%를 초과하면 증가하는 함유량만큼 뚜렷한 효과가 기대되지 않는다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어져서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되어지는 것이다.
베라진 및 에피-베라진 추출예
추출예 1
시판되는 여로(Veratrum nigrum)의 건조된 뿌리를 구입하여 분쇄한 분쇄물 1000g을 메탄올에 투입하고, 냉각콘덴서가 달린 환류 추출기에서 끓여 추출하였다. 이어서, 이 결과물을 100메쉬 여과포로 여과한 후, 잔사를 같은 방법으로 1회 더 추출하였다. 각각의 추출액을 합하여 상온에서 화트만(Whatman) 2번 여과지로 여과하여 불용성 물질을 제거한 후, 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압농축한 후 동결건조하여 52g의 건조 추출물을 얻었다. 이 추출물을 부탄올, 핵산, 클로로포름에 투입하고 용매분획을 통하여 헥산, 클로로포름 분획을 제거한 후, 얻은 분획을 수포화된 부탄올로 3회 분획하여 부탄올 분획 24g을 얻었다. 이어서, 수득한 부탄올 분획을 수회의 실리카 컬럼 크로마토그래피(Silica column chromatography)를 통하여 베라진과 에피-베라진이 포함된 분획 1g을 얻었다. 그런 다음, 얻어진 분획을 분취용 박층 크로마토그래피(Preparative TLC)를 이용하여 베라진과 에피-베라진을 분취하였다. 수득한 각각의 베라진과 에피-베라진의 성분을 NMR과 Mass Spectrography를 이용하여 분석한 결과, 순도가 99.9%이상인 것을 확인하였다.
추출예 2
여로(Veratrum nigrum) 대신 녹총(Veratrum album)을 사용한 것을 제외하고는 추출예 1과 동일한 방법으로 실시하였고, 수득한 각각의 베라진과 에피-베라진의 성분을 NMR과 Mass Spectrography를 이용하여 분석한 결과, 순도가 99.9%이상인 것을 확인하였다.
추출예 3
시판되는 여로(Veratrum nigrum)의 건조된 뿌리를 구입하여 분쇄한 분쇄물 1000g을 메탄올에 투입하고, 냉각콘덴서가 달린 환류 추출기에서 끓여 추출하였다. 이어서, 이 결과물을 100메쉬 여과포로 여과한 후, 잔사를 같은 방법으로 1회 더 추출하였다. 각각의 추출액을 합하여 상온에서 화트만(Whatman) 2번 여과지로 여과하여 불용성 물질을 제거한 후, 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압농축한 후 동결건조하여 52g의 건조 추출물을 얻었다. 이 추출물을 클로로포름에 용해시킨 후, 5%의 염산 수용액으로 수회 용매분획하여 알칼리성 물질 분획을 얻었다. 이어서, 수산화나트륨을 첨가하여 수층의 pH를 산성으로 조절한 후, 클로로포름으로 용매 분획하여 알칼리성 물질을 클로로포름으로 옮기고 감압농축하여 알칼리성 물질 분획을 얻었다. 이어서, 수득한 알칼리성 물질 분획을 수산화나트륨 처리한 실리카 컬럼 크로마토그래피(Silica column chromatography)에 통과시켜 베라진과 에피-베라진이 포함된 분획 1g을 얻었다. 그런 다음, 얻어진 분획을 분취용 박층 크로마토그래피(Preparative TLC)를 이용하여 베라진과 에피-베라진을 분취하였다. 수득한 각각의 베라진과 에피-베라진의 성분을 NMR과 Mass Spectrography를 이용하여 분석한 결과, 순도가 99.9%이상인 것을 확인하였다.
실시예 1~12
상기 추출예로부터 얻은 베라진 및 에피-베라진과 알부틴을 쥐의 멜라노마세포(B-16 mouse melanoma cell)의 배양액에 첨가하여 세포수준에서의 미백 효과를 실험하였다(Lotan R., Lotan D. Cancer Res. 40:3345-3350, 1980). 본 발명에 따른 베라진 및 에피-베라진과, 종래의 피부미백용 유효성분인 알부틴을 각각 하기 표 1에 기재된 농도로 각각 B-16 멜라노마 세포의 배양배지에 첨가하여 3일간 배양한 후, 세포들을 트립신(trypsin)처리하여 배양용기로부터 떼어내 원심분리한 후 멜라닌을 추출하였다.
여기에 수산화나트륨 용액(1N 농도) 1㎖를 가하여 10분간 끓여 멜라닌을 녹이고 분광 광도계를 이용, 400nm에서 흡광도를 측정하여 생성된 멜라닌의 양을 단위 세포수당(106cell) 흡광도로 나타내었다. 또한, 대조군에 대한 상대적인 멜라닌 생성량을 저해율(%)로 계산하여 그 결과를 하기 표 1에 나타냈다.
시료 |
적용농도(%) |
멜라닌 생성량 |
저해율(%) |
대조군(무첨가) |
- |
0.054±0.003 |
- |
실시예 1 |
베라진 |
최종농도(0.1㎍/ml) |
0.031±0.001 |
39% |
실시예 2 |
최종농도(1㎍/ml) |
0.026±0.001 |
47% |
실시예 3 |
최종농도(5㎍/ml) |
0.019±0.001 |
62% |
실시예 4 |
최종농도(20㎍/ml) |
0.009±0.001 |
79% |
실시예 5 |
에피-베라진 |
최종농도(0.1㎍/ml) |
0.032±0.001 |
37% |
실시예 6 |
최종농도(1㎍/ml) |
0.027±0.001 |
46% |
실시예 7 |
최종농도(5㎍/ml) |
0.019±0.001 |
62% |
실시예 8 |
최종농도(20㎍/ml) |
0.008±0.001 |
81% |
알부틴 |
최종농도(200㎍/ml) |
0.026±0.001 |
47% |
*반복수 = 3
표 1을 참조하면, 본 발명에 따른 베라진 또는 에피-베라진은 대조군과 비교할 때 배양된 쥐의 멜라노마 세포에 대하여 매우 강력한 멜라닌 생성 억제능이 있음을 알 수 있다. 특히, 첨가된 베라진 또는 에피-베라진의 농도가 낮은 것을 고려한다면, 동일농도에서의 베라진 또는 에피-베라진의 멜라닌 생성 억제능이 종래의 피부미백 물질인 알부틴보다 매우 우수하다는 것을 알 수 있다.
이하에서는, 베라진 또는 에피-베라진을 피부 외용연고제, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스에 첨가하여 화장료를 제조하고, 피실험자를 대상으로 이들을 처방하여 나타난 색소침착 저해효과를 살펴 본다.
제조예 1 내지 3
베라진과 에피-베라진을 하기 표 2에 기재된 성분과 함량으로 첨가하여 피부 외용연고제를 제조하였다.
비교예 1
베라진과 에피-베라진을 첨가하지 않고, 하기 표 2에 기재된 성분과 함량으로 피부 외용연고제를 제조하였다.
조성물(중량%) |
제조예 |
비교예 |
1 |
2 |
3 |
1 |
베라진 |
2 |
- |
1 |
- |
에피-베라진 |
- |
2 |
1 |
- |
디에틸 세바케이트 |
8 |
8 |
8 |
8 |
경납 |
5 |
5 |
5 |
5 |
폴리옥시에틸렌올레일에테르 포스페이트 |
6 |
6 |
6 |
6 |
벤조산 나트륨 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
바셀린 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
제조예 4 내지 6
베라진과 에피-베라진을 하기 표 3에 기재된 성분과 함량으로 첨가하여 크림을 제조하였다.
비교예 2
베라진과 에피-베라진을 첨가하지 않고, 하기 표 3에 기재된 성분과 함량으로 크림을 제조하였다.
조성물(중량%) |
제조예 |
비교예 |
4 |
5 |
6 |
2 |
베라진 |
0.5 |
- |
0.25 |
- |
에피-베라진 |
- |
0.5 |
0.25 |
- |
스테아린산 |
15.0 |
15.0 |
15.0 |
15.0 |
세탄올 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
수산화칼륨 |
0.7 |
0.7 |
0.7 |
0.7 |
글리세린 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
프로필렌 글리콜 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
방부제 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
향 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
정제수 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
제조예 7 내지 9
베라진과 에피-베라진을 하기 표 4에 기재된 성분과 함량으로 첨가하여 유연화장수를 제조하였다.
비교예 3
베라진과 에피-베라진을 첨가하지 않고, 하기 표 4에 기재된 성분과 함량으로 유연화장수를 제조하였다.
조성물(중량%) |
제조예 |
비교예 |
7 |
8 |
9 |
3 |
베라진 |
0.2 |
- |
0.1 |
- |
에피-베라진 |
- |
0.2 |
0.1 |
- |
에탄올 |
10.0 |
10.0 |
10.0 |
10.0 |
폴리라우린산폴리옥시에틸렌소르비탄 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
파라옥시안식향산메틸 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
글리세린 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
1,3-부틸렌글리콜 |
6.0 |
6.0 |
6.0 |
6.0 |
향 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
색소 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
정제수 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
제조예 10 내지 12
베라진과 에피-베라진을 하기 표 5에 기재된 성분과 함량으로 첨가하여 영양화장수를 제조하였다.
비교예 4
베라진과 에피-베라진을 첨가하지 않고, 하기 표 5에 기재된 성분과 함량으로 영양화장수를 제조하였다.
조성물(중량%) |
제조예 |
비교예 |
10 |
11 |
12 |
4 |
베라진 |
0.1 |
- |
0.05 |
- |
에피-베라진 |
- |
0.1 |
0.05 |
- |
와셀린 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
세스퀴올레인산소르비탄 |
0.8 |
0.8 |
0.8 |
0.8 |
폴리옥시에틸렌올레일에틸 |
1.2 |
1.2 |
1.2 |
1.2 |
파라옥시안식향산메틸 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
프로필렌글리콜 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
에탄올 |
3.2 |
3.2 |
3.2 |
3.2 |
카르복시비닐폴리머 |
18.0 |
18.0 |
18.0 |
18.0 |
수산화칼륨 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
색소 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
향 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
정제수 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
제조예 13 내지 15
베라진과 에피-베라진을 하기 표 6에 기재된 성분과 함량으로 첨가하여 팩을 제조하였다.
비교예 5
베라진과 에피-베라진을 첨가하지 않고, 하기 표 6에 기재된 성분과 함량으로 팩을 제조하였다.
조성물(중량%) |
제조예 |
비교예 |
13 |
14 |
15 |
5 |
베라진 |
0.2 |
- |
0.1 |
- |
에피-베라진 |
- |
0.2 |
0.1 |
- |
글리세린 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
프로필렌글리콜 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
폴리비닐알코올 |
15.0 |
15.0 |
15.0 |
15.0 |
에탄올 |
8.0 |
8.0 |
8.0 |
8.0 |
폴리옥시에틸렌올레일에틸 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
파라옥시안식향산메틸 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
향 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
색소 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
정제수 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
제조예 16 내지 18
베라진과 에피-베라진을 하기 표 7에 기재된 성분과 함량으로 첨가하여 에센스를 제조하였다.
비교예 6
베라진과 에피-베라진을 첨가하지 않고, 하기 표 7에 기재된 성분과 함량으로 에센스를 제조하였다.
조성물(중량%) |
제조예 |
비교예 |
16 |
17 |
18 |
6 |
베라진 |
1 |
- |
0.5 |
- |
에피-베라진 |
- |
1 |
0.5 |
- |
프로필렌글리콜 |
10.0 |
10.0 |
10.0 |
10.0 |
글리세린 |
10.0 |
10.0 |
10.0 |
10.0 |
히알루론산나트륨수용액(1%) |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
에탄올 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
폴리옥시에틸렌경화피마자유 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
파라옥시안식향산메틸 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
향 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
정제수 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
전술한 바와 같이 제조한 피부 외용연고제, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스에 의한 색소 침착 저해 효과를 검증하기 위해 사용한 방법은 다음과 같다.
먼저, 건강한 남녀 20명씩을 선정하여 양팔의 하박부에 직경 7㎜ 크기의 구멍이 6개씩 2줄로 파인 알루미늄 호일을 붙이고, 팔에서 10㎝ 떨어진 거리에서 ORIEL solar simulaltor 1000W를 사용하여 60mJ/㎠의 광량을 조사하였다. 조사전에 70% 에탄올 수용액으로 조사부위를 잘 세척하였다. 조사하기 3일전부터 조사후 3주째까지 1일 2회씩 제조예 1 내지 18에 따라 제조된 베라진 및/또는 에피-베라진을 함유하는 화장료와, 비교예 1 내지 6에 따라 베라진 및 에피-베라진이 함유되지 않은 기제를 한 쌍으로 같은 줄에 도포하였다. 여기서, 제조예 9, 10 및 비교예 5의 팩제는 도포한 다음 15분 후에 떼어냈다.
상기 방법에 따라 각각의 제조예와 비교예에 따른 화장료를 처방한 후, 색소침착도를 육안으로 판정하고, 각 제조예에 따른 화장료와 비교예에 따른 화장료의 색소침착 억제 정도를 비교하여 효과 있음, 효과 없음의 2단계로 평가하고, 아울러피부 부작용 발생여부를 조사하여 그 결과를 하기 표 8에 나타냈다.
실험물질 |
효과 있음(명) |
효과 없음(명) |
부작용(명) |
제조예 1 |
16 |
4 |
0 |
제조예 2 |
17 |
3 |
0 |
제조예 3 |
16 |
4 |
0 |
제조예 4 |
14 |
6 |
0 |
제조예 5 |
16 |
4 |
0 |
제조예 6 |
15 |
5 |
0 |
제조예 7 |
14 |
6 |
0 |
제조예 8 |
14 |
6 |
0 |
제조예 9 |
16 |
4 |
0 |
제조예 10 |
13 |
7 |
0 |
제조예 11 |
14 |
6 |
0 |
제조예 12 |
14 |
6 |
0 |
제조예 13 |
14 |
6 |
0 |
제조예 14 |
15 |
5 |
0 |
제조예 15 |
15 |
5 |
0 |
제조예 16 |
16 |
4 |
0 |
제조예 17 |
15 |
5 |
0 |
제조예 18 |
17 |
3 |
0 |
상기 표 8에 나타난 바와 같이, 제조예 1 내지 18에 따라 제조된 베라진 및/또는 에피-베라진이 함유된 화장료는 피시험자 20명중 최소 13명 이상에 대하여 상당한 피부 미백효과를 나타내었으며, 피부내에 어떤 부작용도 나타나지 않았음을 알 수 있었다.