RU2408726C1 - RECOMBINANT PROTEIN Collbd-CBD, RECOMBINANT PLASMID pOC-Collbd, STRAIN Escherichia coli-PRODUCER OF RECOMBINANT PROTEIN Collbd-CBD, METHOD TO PRODUCE RECOMBINANT PROTEIN Collbd-CBD - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: recombinant protein Collbd-CBD is described, consisting of collagen-binding domain Collbd (SPARC(w)), of extracellular calcium-dependent protein SPARC (VM-40 or osteonectin) of a human being and spacer sequence GGS. Method for its production is proposed, including growing of strain E. coli M15 [pREP4, pOC-Collbd]. According strain and plasmid are proposed.

EFFECT: invention makes it possible to provide a high level of recombinant protein Collbd-CBD production and simultaneously simple and efficient scheme for cleaning of this protein with its immobilization on collagen-containing sorbent included into composition of new generation of items and materials of medical purpose - implants and coatings.

4 cl, 1 dwg, 4 ex

Description

Изобретение относится к генной инженерии, биотехнологии, микробиологии, а также медицине. Рекомбинантные химерные белки, способные эффективно связываться с коллагеном и обладающие различной биологической активностью, могут быть использованы для разработки нового поколения изделий и материалов медицинского назначения - имплантатов, покрытий и пр. Кроме того коллагенсвязывающие домены могут использоваться в качестве аффинных доменов для одностадийной очистки химерных белков.The invention relates to genetic engineering, biotechnology, microbiology, as well as medicine. Recombinant chimeric proteins that can efficiently bind to collagen and have different biological activity can be used to develop a new generation of medical products and materials - implants, coatings, etc. In addition, collagen-binding domains can be used as affinity domains for one-step purification of chimeric proteins.

В настоящее время в медицине широко применяются высокоочищенные препараты различных рекомбинантных белков: факторов роста, адгезии и др. Производство материалов и покрытий с биологически активными факторами - весьма сложный и дорогостоящий процесс. Иммобилизация этих белков, основанная, как правило, на химической пришивке, многостадийна, трудоемка и дорогостояща. Важной проблемой остается разработка методов очистки конечных продуктов от высокотоксичных для организма липополисахаридов, балластных белков, ДНК и РНК штаммов-продуцентов, а также получение функционально активных биологических компонентов.At present, highly purified preparations of various recombinant proteins are widely used in medicine: growth factors, adhesion, etc. The production of materials and coatings with biologically active factors is a very complex and expensive process. The immobilization of these proteins, based, as a rule, on chemical sewing, is multistage, time-consuming and expensive. An important problem remains the development of methods for purification of final products from highly toxic lipopolysaccharides, ballast proteins, DNA and RNA of producer strains, as well as the production of functionally active biological components.

Повышение уровня экспрессии и стабильности чужеродных белков в бактериальной системе и разработка простых и эффективных схем тестирования и очистки белков могут быть достигнуты с помощью ряда генно-инженерных подходов. Одним из них является технология создания слитных (химерных) белков, в основе которой лежит метод, основанный на соединении в одной рамке трансляции двух генов (гена белка-носителя и гена исследуемого продукта), приводящая к синтезу в бактериальной системе химерного белка [Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems // Appi Microbiol Biotechnol. - 2003. Vol.60. - P.523-33]. Тенденция к минимизации белка-носителя способствовала развитию технологии аффинных доменов, основанной на специфическом молекулярном узнавании. Небольшие по молекулярному весу аффинные домены различной химической природы проявляют свою специфичность при использовании молекулярных взаимодействий различного типа [Terpe К. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems // Appi Microbiol Biotechnol. - 2003. Vol.60. - P.523-33].An increase in the level of expression and stability of foreign proteins in the bacterial system and the development of simple and effective protein testing and purification schemes can be achieved using a number of genetic engineering approaches. One of them is the technology for creating fused (chimeric) proteins, which is based on a method based on combining two genes (the carrier protein and the gene of the product under study) in one translation framework, leading to the synthesis of a chimeric protein in the bacterial system [Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems // Appi Microbiol Biotechnol. - 2003. Vol.60. - P.523-33]. The tendency to minimize carrier protein has contributed to the development of affinity domain technology based on specific molecular recognition. Small molecular weight affinity domains of various chemical nature show their specificity when using molecular interactions of various types [Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems // Appi Microbiol Biotechnol. - 2003. Vol.60. - P.523-33].

Ранее была разработана технология, заключающаяся в принципиально новом подходе к очистке рекомбинантных белков путем аффинной иммобилизации на целлюлозосодержащих сорбентах. Метод основан на способности целлюлозосвязывающих доменов (cellulose binding domain, CBD) - автономных белковых модулей - самопроизвольно взаимодействовать с полимерными целлюлозосодержащими сорбентами с высокой константой связывания [RU № 2278160 от 20 июня 2006 г., RU № 2270249 от 20 февраля 2006]. Использование CBD в качестве белка-носителя позволяет сделать процесс иммобилизации и очистки рекомбинантных белков, содержащих в своем составе CBD, одностадийным и практически безынструментальным.Previously, a technology was developed consisting in a fundamentally new approach to the purification of recombinant proteins by affinity immobilization on cellulose-containing sorbents. The method is based on the ability of cellulose binding domains (CBDs) - autonomous protein modules - to spontaneously interact with polymeric cellulose-containing sorbents with a high binding constant [RU No. 2278160 dated June 20, 2006, RU No. 2270249 dated February 20, 2006]. The use of CBD as a carrier protein allows the process of immobilization and purification of recombinant proteins containing CBD to be single-stage and practically toolless.

Однако еще более перспективным представляется использование в качестве аффинных доменов коллагенсвязывающих пептидов. Коллаген является одним из основных компонентов внеклеточного матрикса. Помимо этого он играет ключевую роль в столь разнообразных процессах, как морфогенез, заживление ран, воспалительные реакции, образование опухолевых метастазов, гемостаз и тромбоз. Следует отметить его низкую токсичность и антигенность, а также высокую механическую прочность. Указанные свойства коллагена выглядят крайне перспективными для его использования в качестве сорбента для очистки химерных белков, а также компонента биосовместимых материалов и покрытий.However, it seems even more promising to use collagen binding peptides as affinity domains. Collagen is one of the main components of the extracellular matrix. In addition, it plays a key role in such diverse processes as morphogenesis, wound healing, inflammatory reactions, the formation of tumor metastases, hemostasis and thrombosis. It should be noted its low toxicity and antigenicity, as well as high mechanical strength. The indicated properties of collagen look extremely promising for its use as an sorbent for the purification of chimeric proteins, as well as a component of biocompatible materials and coatings.

Исходя из структуры все стороны трех цепей молекулы коллагена, выходящие на поверхность, доступны для различных межмолекулярных взаимодействий. К лигандам, связывающимся с коллагеном, относятся поверхностные рецепторы клеток, такие как α1β1 и α2β1 интегрины и NG2 протеогликаны; несколько ростовых факторов; малые матричные протеогликаны и другие матричные белки, такие как нидоген, ВМ-40 и фактор фон Виллебранда. Большинство связываний происходит с интактной структурой тройной спирали [Т.Sasaki, E.Hohenester, W.Gohring, and R.Timpl. The EMBO Journal. 1998. 17(6): 1625-1634]. Коллаген в поврежденных тканях может быть потенциальной мишенью ростовых факторов, индуцирующих репарацию тканей. Кроме того, коллагеновые материалы могут быть полезны в качестве потенциальных переносчиков ростовых факторов при помещении их на металлический имплантат или поврежденную ткань.Based on the structure, all sides of the three chains of the collagen molecule that come to the surface are accessible for various intermolecular interactions. Collagen-binding ligands include surface cell receptors such as α1β1 and α2β1 integrins and NG2 proteoglycans; several growth factors; small matrix proteoglycans and other matrix proteins such as nidogen, BM-40 and von Willebrand factor. Most bindings occur with an intact triple helix structure [T. Sasaki, E. Hohenester, W. Gohring, and R. Timpl. The EMBO Journal. 1998.17 (6): 1625-1634]. Collagen in damaged tissues may be a potential target for growth factors inducing tissue repair. In addition, collagen materials can be useful as potential carriers of growth factors when placed on a metal implant or damaged tissue.

В основу заявленной группы изобретений положена задача создания штамма E.coli, обеспечивающего высокий уровень продукции рекомбинантного белка Collbd-CBD, и, одновременно, простую и эффективную схему очистки этого белка, с иммобилизацией его на коллагенсодержащем сорбенте, входящем в состав нового поколения изделий и материалов медицинского назначения - имплантатов и композиционных покрытий.The claimed group of inventions is based on the task of creating an E. coli strain that provides a high level of production of the recombinant Collbd-CBD protein, and, at the same time, a simple and effective scheme for the purification of this protein, with its immobilization on a collagen-containing sorbent, which is part of a new generation of products and materials medical purposes - implants and composite coatings.

Упомянутая задача решена за счет синтеза рекомбинантного белка Collbd-CBD в клетках Е.coli, в частности, за счет введения в состав рекомбинантного белка целлюлозосвязывающего домена (CBD) из эндоглюканазы Anaerocellum thermophilum, a также за счет введения между функциональными доменами спейсерной последовательности из 19 аминокислотных остатков для сохранения функции активации клеточного роста слитыми белками, связанными с коллагеновым матриксом. Помимо этого упомянутая задача решена за счет возможности одностадийной высокоэффективной очистки рекомбинантного белка Collbd-CBD, содержащего коллагенсвязывающий домен и иммобилизации его на коллагенсодержащем нанокомпозитном покрытии. Также упомянутая задача решена за счет использования для генно-инженерного конструирования плазмидного вектора рОС, кодирующего целлюлозосвязывающий домен (CBD) и глицин-сериновый спейсер [Н.Е.Шарапова, А.П.Котнова, З.М.Галушкина, Н.Н.Полетаева, Н.В.Лаврова, Е.И.Аксенова, А.С.Семихин, А.С.Карягина, В.Г.Лунин. Получение и характеристика коллагенсвязывающих доменов из фактора фон Виллебранда человека. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2009. - №4. - С.31-35], который позволяет обеспечить высокий уровень экспрессии получаемого химерного белка Collbd-CBD. Использование технологии создания химерных белков в данном случае является необходимьм условием для получения целевого белка, поскольку сам Collbd очень мал (содержит всего 20 аминокислотных остатков) и может подвергаться протеолизу в клетках-продуцентах.This problem was solved by synthesizing the recombinant Collbd-CBD protein in E. coli cells, in particular by introducing the cellulose binding domain (CBD) from the endoglucanase Anaerocellum thermophilum into the recombinant protein, and also by introducing a spacer sequence of 19 amino acid between the functional domains residues to preserve the function of activation of cell growth by fusion proteins associated with the collagen matrix. In addition, the mentioned problem was solved due to the possibility of a one-stage highly efficient purification of the recombinant Collbd-CBD protein containing a collagen-binding domain and its immobilization on a collagen-containing nanocomposite coating. Also, the aforementioned problem was solved by using for the genetic engineering construction of the plasmid vector pOC encoding the cellulose binding domain (CBD) and the glycine-serine spacer [N.E. Sharapova, A.P. Kotnova, Z.M. Galushkina, N.N. Poletaeva, N.V. Lavrova, E.I. Aksenova, A.S. Semikhin, A.S. Karyagin, V.G. Lunin. Obtaining and characterization of collagen-binding domains from human von Willebrand factor. // Molecular Genetics, Microbiology and Virology. - 2009. - No. 4. - S.31-35], which allows to provide a high level of expression of the resulting chimeric Collbd-CBD protein. The use of technology to create chimeric proteins in this case is a prerequisite for obtaining the target protein, since Collbd itself is very small (contains only 20 amino acid residues) and can undergo proteolysis in producer cells.

Сущность изобретения состоит в том, что рекомбинантная плазмида pOC-Collbd размером 3478 п.н. обеспечивает экспрессию рекомбинантного белка Collbd-CBD, состоящего из коллагенсвязывающего домена Collbd из внеклеточного кальцийзависимого белка Collbd человека, спейсера из остатков глицина и серина и целлюлозосвязывающего домена (CBD) из эндоглюканазы Anaerocellum thermophilum, и содержит:The essence of the invention lies in the fact that the recombinant plasmid pOC-Collbd size 3478 bp provides the expression of the recombinant Collbd-CBD protein, consisting of the collagen-binding domain of Collbd from the extracellular calcium-dependent protein Collbd of a person, a spacer from glycine and serine residues, and the cellulose-binding domain (CBD) from Anaerocellum thermophilum endoglucanase, and contains:

- искусственный бактериальный оперон химерных белков, включающий: промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 п.н.), обеспечивающую эффективную транскрипцию контролируемой мРНК; рекомбинантный ген, обеспечивающий экспрессию целевого химерного белка (коллагенсвязывающий домен Collbd - спейсер - целлюлозосвязывающий домен CBD) (117-794 п.н.); нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции (834-928 п.н.);- an artificial bacterial operon of chimeric proteins, including: the promoter region of the early promoter of the T5 bacteriophage (7-87 bp), which provides efficient transcription of controlled mRNA; a recombinant gene that provides expression of the target chimeric protein (Collbd collagen binding domain - spacer - CBD cellulose binding domain) (117-794 bp); the untranslated region of the transcription termination of the bacterial operon, which ensures the efficient termination of transcription (834–928 bp);

- бактериальный оперон bla (3263-2413 п.н. комплементарной цепи), кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для отбора клонов-трансформантов Е.coli методом контр-селекции;- bla bacterial operon (3263-2413 bp complementary chain) encoding a beta-lactamase protein, which is a selective marker for selection of E. coli transforming clones by counter-selection;

- бактериальный участок инициации репликации типа ColEl, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах Е. coli (1879 п.н.).- a bacterial site of ColEl-type replication initiation, which provides plasmid replication in E. coli strains (1879 bp).

Штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pOC-Collbd] получен трансформацией штамма Escherichia coli M15/pREP4 плазмидой pOC-Collbd. Полученный штамм является продуцентом рекомбинантного белка Collbd-CBD, состоящего из коллагенсвязывающего домена Collbd из внеклеточного кальций зависимого белка Collbd человека, спейсера из остатков глицина и серина и целлюлозосвязывающего домена (CBD).The strain Escherichia coli M15 [pREP4, pOC-Collbd] was obtained by transformation of the strain Escherichia coli M15 / pREP4 with the plasmid pOC-Collbd. The resulting strain is a producer of a recombinant Collbd-CBD protein consisting of the collbd binding domain of Collbd from the extracellular calcium dependent human Collbd protein, a spacer of glycine and serine residues, and a cellulose binding domain (CBD).

Рекомбинантный белок Collbd-CBD, состоящий из коллагенсвязывающего домена Collbd из внеклеточного кальцийзависимого белка Collbd человека, спейсера из остатков глицина и серина и целлюлозосвязывающего домена (CBD), обладает способностью самопроизвольно связываться с коллагенсодержащим сорбентом, а также с разными видами целлюлоз, благодаря наличию в составе белка CBD.The recombinant Collbd-CBD protein, consisting of the collb-binding domain of Collbd from the extracellular calcium-dependent human Collbd protein, the spacer from the glycine and serine residues and the cellulose-binding domain (CBD), has the ability to bind spontaneously to a collagen-containing sorbent, as well as due to the presence of various types of cellulose protein CBD.

Способ получения рекомбинантного белка Collbd-CBD включает выращивание клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pOC-Collbd], индукцию синтеза белка Collbd-CBD, разрушение клеток, получение супернатанта, содержащего белок, иммобилизацию белка путем добавления к супернатанту суспензии целлюлозосодержащего сорбента, инкубирование, отмывание сорбента со связавшимся белком, последующую элюцию белка с сорбента.A method of producing a recombinant Collbd-CBD protein includes growing cells of the Escherichia coli strain M15 [pREP4, pOC-Collbd], inducing the synthesis of Collbd-CBD protein, disrupting cells, obtaining a supernatant containing protein, immobilizing the protein by adding a suspension of cellulose-containing sorbent to the supernatant, incubation, washing the sorbent with the bound protein, subsequent elution of the protein from the sorbent.

Техническим результатом заявленного изобретения является обеспечение высокого уровня продукции рекомбинантного белка Collbd-CBD и одновременно обеспечение простой и эффективной схемы очистки этого белка, с иммобилизацией его на коллагенсодержащем сорбенте, входящем в состав нового поколения изделий и материалов медицинского назначения - имплантатов и покрытий.The technical result of the claimed invention is to provide a high level of production of the recombinant Collbd-CBD protein and at the same time to provide a simple and effective purification scheme for this protein, with its immobilization on a collagen-containing sorbent that is part of a new generation of medical products and materials - implants and coatings.

Таким образом, технический результат достигается за счет того, что создана рекомбинантная плазмида pOC-Collbd, кодирующая бифункциональный рекомбинантный белок Collbd-CBD, с одной стороны, содержащий аминокислотную последовательность коллагенсвязывающего домена Collbd, а с другой - обладающий способностью самостоятельно связываться с целлюлозосодержащим сорбентом, благодаря наличию CBD. При конструировании этой плазмиды коллагенсвязывающий домен Collbd получен синтетическим способом из четырех олигонуклеотидов, в которые были заложены сайты для эндонуклеаз рестрикции NcoI и BamHI. Благодаря этим сайтам можно получать химерные белки, у которых коллагенсвязывающий домен будет на N-конце.Thus, the technical result is achieved due to the fact that the created recombinant plasmid pOC-Collbd encoding the bifunctional recombinant protein Collbd-CBD, on the one hand, containing the amino acid sequence of the collagen-binding domain Collbd, and on the other hand, having the ability to independently bind to the cellulose-containing sorbent, thanks to the presence of CBD. When constructing this plasmid, the Collbd collagen-binding domain was synthesized from four oligonucleotides into which the restriction endonucleases NcoI and BamHI were inserted. Thanks to these sites, chimeric proteins can be obtained in which the collagen binding domain is at the N-terminus.

Также указанный технический результат достигается тем, что штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pOC-Collbd] является продуцентом рекомбинантного белка Collbd-CBD. При этом отсутствие в клетках Е. coli белков, способных связываться с коллагеном, служит гарантией того, что рекомбинантный белок Collbd-CBD является единственным белком штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pOC-Collbd], прочно связывающимся с используемым сорбентом, что обеспечивает возможность одностадийного получения высокоочищенного препарата указанного рекомбинантного белка, иммобилизованного на коллагенсодержащем сорбенте.Also, the specified technical result is achieved by the fact that the strain Escherichia coli M15 [pREP4, pOC-Collbd] is a producer of the recombinant protein Collbd-CBD. At the same time, the absence of proteins capable of binding to collagen in E. coli cells ensures that the recombinant Collbd-CBD protein is the only protein of the Escherichia coli M15 strain [pREP4, pOC-Collbd] that binds strongly to the used sorbent, which provides the possibility of one-step obtaining a highly purified preparation of the indicated recombinant protein immobilized on a collagen-containing sorbent.

Штамм Е.coli M15 [pREP4], содержащий плазмиду pOC-Collbd, - продуцент рекомбинантного белка Collbd-CBD - характеризуется следующими признаками.Strain E. coli M15 [pREP4] containing the plasmid pOC-Collbd, the producer of the recombinant protein Collbd-CBD, is characterized by the following features.

Культурально-морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, неподвижные, грамотрицательные. При рассеве на чашке с 1,5% LB-агаром рост в виде отдельных колоний, иногда в R-форме с неровными краями. Хорошо растет на плотных и жидких питательных средах (LB-бульон, LB-агар, МПА, МПБ).Cultural and morphological characters. Cells are straight, rod-shaped, motionless, gram-negative. When sieving on a plate with 1.5% LB agar, growth in the form of separate colonies, sometimes in the R-form with uneven edges. It grows well on solid and liquid nutrient media (LB-broth, LB-agar, MPA, MPB).

Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут в пределах +4-42°С при оптимуме рН 6,8-7,5. Штаммы разлагают глюкозу, маннит с образованием кислоты, не разлагают сахарозу, арабинозу, галактозу, сбраживают мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу. Существенным при использовании данных штаммов является их чувствительность к налидиксовой кислоте (25 мг/мл), стрептомицину (20 мг/мл) и рифампицину (25 мг/мл). Проявляют устойчивость к ампициллину (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pOC-Collbd, и к канамицину (до 25 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pREP4.Physiological and biochemical characteristics. Cells grow within + 4-42 ° C with optimum pH of 6.8-7.5. Strains decompose glucose, mannitol with the formation of acid, do not decompose sucrose, arabinose, galactose, ferment maltose, xylose, sorbitol, rhamnose. Significant when using these strains is their sensitivity to nalidixic acid (25 mg / ml), streptomycin (20 mg / ml) and rifampicin (25 mg / ml). Resistant to ampicillin (up to 100 μg / ml) due to the presence of the plasmid pOC-Collbd and to kanamycin (up to 25 μg / ml) due to the presence of plasmid pREP4.

Указанный технический результат достигается также тем, что рекомбинантный белок Collbd-CBD, включающий в себя аминокислотную последовательность CBD, определяющую способность данного белка связываться с целлюлозосвязывающим сорбентом, позволяет проводить в одну стадию концентрирование, очистку и иммобилизацию белка Collbd-CBD на целлюлозном сорбенте.The indicated technical result is also achieved by the fact that the recombinant Collbd-CBD protein, including the CBD amino acid sequence, which determines the ability of this protein to bind to the cellulose-binding sorbent, allows concentration, purification and immobilization of Collbd-CBD protein on the cellulose sorbent in one step.

Достигается указанный технический результат также тем, что способ очистки, концентрирования и получения иммобилизованного рекомбинантного белка Collbd-CBD заключается в обработке супернатанта гидролизата клеток штамма Е.coli M15 [pREP4, pOC-Collbd] целлюлозосодержащим сорбентом с последующей отмывкой сорбента с иммобилизованным рекомбинантным белком, последующей элюцией белка Collbd-CBD с сорбента и диализом.This technical result is also achieved by the fact that the method of purification, concentration and preparation of the immobilized recombinant Collbd-CBD protein consists in treating the supernatant of the cell hydrolyzate of E. coli strain M15 [pREP4, pOC-Collbd] with a cellulose-containing sorbent, followed by washing the sorbent with an immobilized recombinant recombinant Collbd-CBD protein elution with sorbent and dialysis.

Также указанный технический результат достигается тем, что рекомбинантный белок Collbd-CBD, содержащий аминокислотную последовательность коллаген-связывающего домена Collbd, способен взаимодействовать с коллагенсодержащим сорбентом (желатином).Also, the indicated technical result is achieved in that the recombinant Collbd-CBD protein containing the amino acid sequence of the collagen-binding domain of Collbd is capable of interacting with a collagen-containing sorbent (gelatin).

Изобретение проиллюстрировано чертежом.The invention is illustrated in the drawing.

На чертеже представлена схема плазмиды pOC-Collbd.The drawing shows a diagram of the plasmid pOC-Collbd.

В списке последовательностей: нуклеотидная последовательность плазмиды pOC-Collbd - последовательность №1, аминокислотная последовательность белка коллагенсвязывающего домена Collbd - последовательность №2, аминокислотная последовательность глицин-серинового спейсера - последовательность №3, аминокислотная последовательность целлюлозосвязывающего домена CBD-последовательность №4.In the list of sequences: the nucleotide sequence of the plasmid pOC-Collbd - sequence No. 1, the amino acid sequence of the collagen binding domain protein Collbd - sequence No. 2, the amino acid sequence of the glycine-serine spacer - sequence No. 3, the amino acid sequence of the cellulose-binding domain CBD sequence No. 4.

Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию и секвенирование ДНК проводили по известным методикам (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж., Молекулярное клонирование, М., Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д.Гловера, Пер. с англ., Москва, Мир, 1988; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Sharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Eriich H.A. Science, 1988. V.239, №4839, p.487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, V.74, p.5463-5467).All standard genetic engineering and microbiological manipulations, as well as amplification and DNA sequencing, were carried out according to well-known methods (Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J., Molecular cloning, M., Mir, 1984; DNA cloning. Methods. Ed. D. Glover, Translated from English, Moscow, Mir, 1988; Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S., Sharf SJ, Higuchi R., Horn GT, Mullis KB, Eriich HA Science, 1988. V.239, No. 4839, p. 487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson AR Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, V.74, p. 5463-5467).

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.The following are examples illustrating the invention.

Примеры.Examples.

Пример 1. Получение плазмиды pOC-Collbd.Example 1. Obtaining plasmids pOC-Collbd.

а) Химический синтез олигодезоксирибонуклеотидов.a) Chemical synthesis of oligodeoxyribonucleotides.

Олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы твердофазным фосфорамидитным методом с помощью синтезатора АСМ 100-2 (Новосибирск) и очищены методом электрофореза в 12%-ном ПААГ.Oligodeoxyribonucleotides were synthesized by the solid-state phosphoramidite method using an AFM 100-2 synthesizer (Novosibirsk) and purified by electrophoresis in 12% SDS page.

б) Получение гена Collbd с последующим его клонированием.b) Obtaining the Collbd gene followed by its cloning.

Коллагенсвязывающий домен из внеклеточного кальцийсвязывающего белка Collbd (BM-40 или остеонектина) человека был синтезирован с использованием 4 комплементарных олигонуклеотидов следующего состава (5'-3'):The collagen-binding domain of human extracellular calcium-binding protein Collbd (BM-40 or osteonectin) was synthesized using 4 complementary oligonucleotides of the following composition (5'-3 '):

Dir1: CATGCTGGACTCTGAACTGACCGAATTCCCDir1: CATGCTGGACTCTGAACTGACCGAATTCCC

Dir2:GCTGCGCATGCGTGACTGGCTGAAAAACCCGGGTGGTTCTGDir2: GCTGCGCATGCGTGACTGGCTGAAAACCCCGGGTGGTTCTG

Rev1: GATCCAGAACCACCCGGGTTTTTCAGCCAGTCACGCARev1: GATCCAGAACCACCCGGGTTTTTAGAGCCAGTCACGCA

Rev2:TGCGCAGCGGGAATTCGGTCAGTTCAGAGTCCAGRev2: TGCGCAGCGGGAATTCGGTCAGTTCAGAGTCCAG

Олигонуклеотиды были спланированы таким образом, что при сборке они образуют двухцепочечный фрагмент ДНК, содержащий липкие концы, соответствующие сайтам гидролиза рестриктаз NcoI и BamHI. При синтезе олигонуклеотиды были фосфорилированы по 5'-концу.The oligonucleotides were designed in such a way that upon assembly they form a double-stranded DNA fragment containing sticky ends corresponding to the NcoI and BamHI restriction enzyme hydrolysis sites. In the synthesis, oligonucleotides were phosphorylated at the 5'-end.

Для сборки двухцепочечного фрагмента ДНК смесь олигонуклетидов (по 20 пкМ) прогревали при 95°С (10 мин) и в течение 4 часов охлаждали до 25°С. Полученную смесь объединяли с фрагментом плазмиды рОС (3407 п.н.), гидролизованной эндонуклеазами рестрикции NcoI и BamHI при 37°С в буферном растворе, содержащем 66 мМ Трис-ацетат (рН 7,9 при 37°С), 20 мМ ацетат магния, 132 мМ ацетат калия в течение 1,5 часов. Лигирование проводили с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в буфере, содержащем 40 мМ Трис-HCl (рН 7,8 при 25°С), 10 мМ хлористого магния, 10 мМ ДТТ и 5 мМ АТФ. Лигированную смесь ДНК использовали для трансформации клеток Е.coli штамма M15 [pREP4] методом электропорации. Трансформированные клетки отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиками канамицином (25 мкг/мл) и ампициллином (100 мкг/мл). Из отобранных рекомбинантных клонов выделяли плазмидную ДНК методом щелочного лизиса. Отобранные клоны секвенировали и подтвердили наличие вставки, соответствующей коллагенсвязывающему домену из внеклеточного кальцийсвязывающего белка SPARC (ВМ-40 или остеонектина) человека.To assemble a double-stranded DNA fragment, a mixture of oligonucleotides (20 pcM each) was heated at 95 ° C (10 min) and cooled to 25 ° C for 4 hours. The resulting mixture was combined with a fragment of the plasmid pOC (3407 bp), hydrolyzed with restriction endonucleases NcoI and BamHI at 37 ° C in a buffer solution containing 66 mM Tris-acetate (pH 7.9 at 37 ° C), 20 mM magnesium acetate , 132 mM potassium acetate for 1.5 hours. Ligation was performed using T4 phage DNA ligase in a buffer containing 40 mM Tris-HCl (pH 7.8 at 25 ° C), 10 mM magnesium chloride, 10 mM DTT, and 5 mM ATP. The ligated DNA mixture was used to transform E. coli cells of strain M15 [pREP4] by electroporation. Transformed cells were selected on LB agar medium with antibiotics kanamycin (25 μg / ml) and ampicillin (100 μg / ml). Plasmid DNA was isolated from the selected recombinant clones by alkaline lysis. The selected clones were sequenced and confirmed the presence of an insert corresponding to the collagen binding domain from the extracellular calcium binding protein SPARC (BM-40 or osteonectin) of a person.

Пример 2. Получение штамма Е.coli - продуцента рекомбинантного белка Collbd-CBD, состоящего из коллагенсвязывающего домена Collbd, глицин-серинового спейсера и целлюлозосвязывающего домена CBD.Example 2. Obtaining a strain of E. coli - producer of the recombinant protein Collbd-CBD, consisting of collagen binding domain Collbd, glycine-serine spacer and cellulose-binding domain CBD.

Для получения штамма Е.coli - продуцента рекомбинантного белка Collbd-CBD, клетки штамма Е. coli M15 [pREP4] (Nal^s, Str^s, rif^s, lac-, ara-, gal-, mtl-, F-, recA+, uvr+) трансформировали плазмидой pOC-Collbd. Трансформированные клетки выращивали в 500 мл среды LB при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 600 нм, индуцировали 150 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида и выращивали в течение 8 часов.To obtain E. coli strain - producer of the recombinant protein Collbd-CBD, cells of the E. coli strain M15 [pREP4] (Nal ^s , Str ^s , rif ^s , lac-, ara-, gal-, mtl-, F-, recA +, uvr +) was transformed with the plasmid pOC-Collbd. Transformed cells were grown in 500 ml of LB medium at 37 ° C to an optical density corresponding to 1 unit. absorbance at a wavelength of 600 nm, 150 μl of a 0.1 M solution of isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside was induced and grown for 8 hours.

Для контроля продукции рекомбинантного белка Collbd-CBD клетками штамма Е.coli M15 [pREP4, pOC-Collbd] применяли метод электрофореза в ПААГе в присутствии додецилсульфата натрия. Разделение белков проводили в 12%-ном ПААГе в стандартной системе буферов (электродный буфер: 25 мМ Трис-HCl, 192 мМ глицина, 0,1% додецилсульфата натрия, рН 8,3; буфер для геля: 375 мМ Трис-HCl, рН 8,8). По окончании электрофореза гели окрашивали 0,15% раствором Кумасси G250 в 25% изопропаноле и 10% уксусной кислоте и отмывали в 10% уксусной кислоте. При сравнении спектра белков у штаммов Е.coli M15 [pREP4] и Е.coli M15 [pREP4, pOC-Collbd] обнаруживали появление дополнительной белковой полосы с молекулярной массой 25 кДа, что соответствует молекулярной массе рекомбинантного белка Collbd-CBD. Уровень синтеза белка Collbd-CBD определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Согласно полученным данным, клетки штамма Е.coli M15 [pREP4, pOC-Collbd] синтезируют около 20% Collbd-CBD от общего белка клеток.To control the production of the recombinant Collbd-CBD protein by cells of the E. coli M15 strain [pREP4, pOC-Collbd], the PAGE method was used in the presence of sodium dodecyl sulfate. Protein separation was carried out in 12% PAGE in a standard buffer system (electrode buffer: 25 mM Tris-HCl, 192 mM glycine, 0.1% sodium dodecyl sulfate, pH 8.3; gel buffer: 375 mm Tris-HCl, pH 8.8). At the end of electrophoresis, the gels were stained with 0.15% Coomassie G250 solution in 25% isopropanol and 10% acetic acid and washed in 10% acetic acid. When comparing the protein spectrum of strains of E. coli M15 [pREP4] and E. coli M15 [pREP4, pOC-Collbd], the appearance of an additional protein band with a molecular weight of 25 kDa, which corresponds to the molecular weight of the recombinant Collbd-CBD protein. The level of synthesis of Collbd-CBD protein was determined by comparing the color intensity of the band of the recombinant protein with the band of the corresponding protein — molecular weight standard. According to the data obtained, cells of the E. coli M15 strain [pREP4, pOC-Collbd] synthesize about 20% Collbd-CBD of the total cell protein.

Пример 3. Способ выделения препарата белка Collbd-CBD в целлюлозосодержащем сорбенте.Example 3. A method for isolating a Collbd-CBD protein preparation in a cellulose-containing sorbent.

Клетки Е.coli M15 [pREP4], трансформированные плазмидой pOC-Collbd, выращивали в 3,5 мл среды LB с ампициллином и канамицином при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 600 нм, добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида и выращивали в течение 4 ч. Культуру разводили до оптической плотности 0,7 при 530 нм, отбирали 400 мкл суспензии, осаждали клетки центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин. Клетки ресуспендировали в 500 мкл фосфатно-цитратного буфера (ФЦБ, 50 мМ, рН 6,0), разрушали ультразвуком, клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 16000 об/мин в течение 10 мин.E. coli M15 [pREP4] cells transformed with pOC-Collbd plasmid were grown in 3.5 ml of LB medium with ampicillin and kanamycin at 37 ° C to an optical density corresponding to 1 unit. absorbance at a wavelength of 600 nm, 3 μl of a 0.1 M solution of isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside was added and grown for 4 hours. The culture was diluted to an optical density of 0.7 at 530 nm, 400 μl of the suspension was taken, cells were precipitated by centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes Cells were resuspended in 500 μl of phosphate-citrate buffer (FCB, 50 mM, pH 6.0), sonicated, cell debris was removed by centrifugation at 16,000 rpm for 10 min.

К 100 мкл 50% суспензии микрокристаллической целлюлозы добавляли 2 мл буферного раствора, содержащего 30 мМ Трис, рН 8,0, и 0,15 М хлорида натрия, а также лизат клеток в 7 М растворе гуанидинхлорида. Инкубировали при +4°С в течение 2 ч, затем оставляли на 16 ч при той же температуре. Центрифугировали полученную суспензию в течение 5 мин при 5000 об/мин. Осадок сорбента со связавшимся белком трижды отмывали буферным раствором, содержащим 30 мМ Трис, рН 8,0, и 0,15 М хлорида натрия.To 100 μl of a 50% suspension of microcrystalline cellulose was added 2 ml of a buffer solution containing 30 mM Tris, pH 8.0, and 0.15 M sodium chloride, as well as a cell lysate in a 7 M solution of guanidine chloride. Incubated at + 4 ° C for 2 hours, then left for 16 hours at the same temperature. The resulting suspension was centrifuged for 5 minutes at 5000 rpm. The precipitate of the sorbent with the bound protein was washed three times with a buffer solution containing 30 mM Tris, pH 8.0, and 0.15 M sodium chloride.

Элюцию белка проводили буферным раствором, содержащим 7 М гуанидина гидрохлорида в объемном отношении 1:1 к полученному осадку сорбента с иммобилизованным белком в течение 10 мин при комнатной температуре. Анализ результатов связывания и элюции белка Collbd-CBD проводили методом электрофореза по Лэммли в 12% ПААГ в денатурирующих условиях.Protein elution was carried out with a buffer solution containing 7 M guanidine hydrochloride in a volume ratio of 1: 1 to the obtained sorbent precipitate with immobilized protein for 10 min at room temperature. The analysis of the results of binding and elution of Collbd-CBD protein was carried out by Laemmli electrophoresis in 12% SDS page under denaturing conditions.

По результатам электрофореза в ПААГ в присутствии ДСП концентрация белка Collbd-CBD составляла 15 мг на 1 мл сорбента.According to the results of SDS page electrophoresis in the presence of particleboard, the concentration of Collbd-CBD protein was 15 mg per 1 ml of sorbent.

Пример 4. Связывание рекомбинантного белка Collbd-CBD с коллагенсодержащим сорбентом.Example 4. The binding of the recombinant protein Collbd-CBD with a collagen-containing sorbent.

К 100 мкл 50% суспензии желатин-сефарозы добавляли 2 мл буферного раствора, содержащего 30 мМ Трис рН 8,0 и 0,15 М хлорида натрия, а также 200 мкл раствора элюированного белка в 7 М растворе гуанидинхлорида. Инкубировали при перемешивании во льду в течение 18 ч. Центрифугировали полученную суспензию в течение 5 минут при 5000 об/мин. Осадок сорбента со связавшимся белком трижды отмывали буферным раствором, содержащим 30 мМ Трис рН 8,0 и 0,15 М хлорида натрия.To 100 μl of a 50% suspension of gelatin-sepharose, 2 ml of a buffer solution containing 30 mM Tris pH 8.0 and 0.15 M sodium chloride, as well as 200 μl of a solution of the eluted protein in a 7 M solution of guanidine chloride were added. They were incubated with stirring in ice for 18 hours. The resulting suspension was centrifuged for 5 minutes at 5000 rpm. The precipitate of the sorbent with the bound protein was washed three times with a buffer solution containing 30 mM Tris pH 8.0 and 0.15 M sodium chloride.

Элюцию белка проводили буферным раствором, содержащим 6 М мочевины, 30 мМ Трис рН 8,0 и 10 мМ ЭДТА. Анализ результатов связывания и элюции белка Collbd-CBD с коллагенсодержащим сорбентом доменов проводили методом электрофореза по Лэммли в 12% ПААГ в денатурирующих условиях.Protein elution was performed with a buffer solution containing 6 M urea, 30 mM Tris pH 8.0 and 10 mM EDTA. The analysis of the results of binding and elution of Collbd-CBD protein with a collagen-containing sorbent of the domains was carried out by Laemmli electrophoresis in 12% PAG under denaturing conditions.

По результатам электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН показано практически 100% связывание рекомбинантного белка Collbd-CBD с желатин-сефарозой.According to the results of SDS page electrophoresis in the presence of SDS, almost 100% binding of the recombinant Collbd-CBD protein to gelatin-sepharose was shown.

Claims (4)

1. Рекомбинантный белок Collbd-CBD, состоящий из коллагенсвязывающего домена Collbd из внеклеточного кальцийзависимого белка SPARC человека с последовательностью SEQ ID NO: 2, спейсера из остатков глицина и серина с последовательностью SEQ ID NO: 3 и костного морфогенетического белка CBD с последовательностью SEQ ID NO: 4, обладающий биологическими свойствами белка CBD и способностью самопроизвольно связываться с коллагенсодержащим сорбентом.1. Recombinant Collbd-CBD protein, consisting of the collb-binding domain of Collbd from the extracellular calcium-dependent human SPARC protein with the sequence SEQ ID NO: 2, a spacer of glycine and serine residues with the sequence SEQ ID NO: 3 and bone morphogenetic protein CBD with the sequence SEQ ID NO : 4, which has the biological properties of the CBD protein and the ability to spontaneously bind to a collagen-containing sorbent. 2. Рекомбинантная плазмида pOC-Collbd с последовательностью SEQ ID NO: 1, обеспечивающая экспрессию рекомбинантного белка CollbdD-CBD по п.1, содержащая
искусственный бактериальный оперон химерных белков, включающий промоторную область раннего промотора бактериофага Т5, обеспечивающий эффективную транскрипцию контролируемой мРНК;
рекомбинантный ген, обеспечивающий экспрессию целевого химерного белка по п.1;
нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции;
бактериальный оперон bla, кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для отбора клонов-трансформантов Е.coli методом контрселекции;
бактериальный участок инициации репликации типа ColEl, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах Е.coli.2. Recombinant plasmid pOC-Collbd with the sequence of SEQ ID NO: 1, providing expression of the recombinant protein CollbdD-CBD according to claim 1, containing
artificial bacterial operon of chimeric proteins, including the promoter region of the early promoter of the T5 bacteriophage, providing efficient transcription of controlled mRNA;
a recombinant gene for the expression of the target chimeric protein according to claim 1;
the untranslated region of the transcription termination of the bacterial operon, which ensures the efficient termination of transcription;
bacterial operon bla encoding beta-lactamase protein, which is a selective marker for selection of E. coli transforming clones by counter-selection;
ColEl-type bacterial replication initiation site for plasmid replication in E. coli strains. 3. Штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2], полученный трансформацией штамма Escherichia coli M15/pREP4 плазмидой pCollbd-BMP-2 по n.2, - продуцент рекомбинантного белка Collbd-BMP-2 по п.1.3. The strain Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2], obtained by transforming the strain of Escherichia coli M15 / pREP4 with the plasmid pCollbd-BMP-2 according to n.2, is a producer of the recombinant protein Collbd-BMP-2 according to claim 1. 4. Способ получения рекомбинантного белка Collbd-CBD по п.1, включающий выращивание клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pOC-Collbd], индукцию синтеза белка Collbd-CBD по п.1, разрушение клеток, получение супернатанта, содержащего белок, иммобилизацию белка путем добавления к супернатанту суспензии коллагенсодержащего сорбента, инкубирование, отмывание сорбента со связавшимся белком, последующую элюцию белка с сорбента и диализ. 4. The method of producing the recombinant Collbd-CBD protein according to claim 1, comprising growing cells of the Escherichia coli strain M15 [pREP4, pOC-Collbd], inducing the synthesis of Collbd-CBD protein according to claim 1, cell disruption, obtaining a supernatant containing protein, immobilization protein by adding a suspension of a collagen-containing sorbent to the supernatant, incubating, washing the sorbent with the bound protein, subsequent elution of the protein from the sorbent and dialysis.

Images