KR20030021162A - 단일 카피 게놈 교잡 프로브 및 이의 생성 방법 - Google Patents

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KR20030021162A
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크놀조안에이치.엠.
로간피터케이.
카자로페이트리시아엠.
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Abstract

알려져있는 서열의 표적 핵산의 추정된 단일 카피 서열에 교잡하는 표지된 단일 카피 핵산을 포함하는 핵산(예, DNA) 교잡 프로브가 개시된다. 반복 서열을 실제적으로 함유하지 않는 상기 프로브는 반복 서열 차단 핵산을 첨가하지 않고 교잡 분석에 사용될 수 있다. 따라서, 염색체 이상의 신속하고 정밀한 검출이 가능하게 된다. 상기 프로브는 표적 핵산 서열의 최소한 하나의 단일 카피 간격으로 이루어진 서열을 결정하고 상기 추정된 단일 카피 서열의 최소한 일부분에 교잡하는 상응하는 교잡 프로브를 발생시킴으로써 디자인되는 것이 바람직하다. 실제적으로, 상기 표적 서열과 알려져있는 게놈 반복 서열은 서로 비교됨으로써 상기 단일 카피 서열 간격의 위치가 추정된다. 상기 단일 카피 프로브는 정제된 게놈 단편의 PCR 증폭, 제한 또는 엑소뉴클레아제 소화, 또는 DNA 서열의 직접 합성과 같은 여러 가지의 방법에 의해 발생될 수 있다. 다음에, 상기 프로브는 표지되고 표적 서열에 교잡된다.

Description

단일 카피 게놈 교잡 프로브 및 이의 생성 방법{SINGLE COPY GENOMIC HYBRIDIZATION PROBES AND METHOD OF GENERATING SAME}
염색체 이상은 선천적 또는 후천적일 수 있는 유전 질환과 관련이 있다. 이러한 염색체 이상은 3개의 일반적인 유형, 즉 추가(extra) 또는 모자라는(missing) 개개 염색체(이수성), 염색체의 추가 또는 모자라는 부분(결실, 중복, 여분 및 표지 염색체 포함), 또는 염색체 재배열의 유형을 가진다. 후자의 범주로는 전위(하나의 염색체로부터 또 다른 염색체로의 조각의 전이), 역위(염색체 분절의 극성 전환), 삽입(하나의 염색체로부터 또 다른 염색체로의 조각의 전이), 및 등완 염색체(동일한 염색체 분절로부터 유도한 염색체 팔)이 있다. 이러한 이상은 세포의 아형(subset), 또는 모든 세포에서 존재한다. 250명의 신생아마다 한명꼴로 여러 가지 유형의 유전적 또는 체질적 이상이 발생함으로써, 실제적으로 양성이거나,심각하거나 또는 심지어는 치사에 이르는 하는 결과가 얻어질 수 있다. 염색체 이상은 일반적인 것이며 흔히 백혈병 또는 기타 암과 같은 유전 질환으로 진단된다.
염색체 분석 및 이상 진단을 위하여 교잡 프로브가 개발되어 왔다. 이러한 프로브는 클로닝 또는 증폭된 게놈 서열 또는 cDNA를 함유한다. 예를 들어, 미합중국 특허 제 5,447,841호, 5,663,319호 및 5,756,696호는 표적 염색체 DNA내의 핵산 분절(nucleic acid segment)에 대하여 상보적인 표지된 핵산 형태의 교잡 프로브를 개시하고 있다. 그러나, 이러한 프로브는 반복 서열(repetitive sequence)을 함유하므로, 표지된 프로브의 반복 서열에 대하여 실제적으로 상보적인 차단 핵산(blocking nucleic acid)과 함께 사용되어야 한다. 즉, 상기 종래 기술의 프로브는 차단 핵산과 전반응(pre-reaction)함으로써 상기 반복 서열을 결합 및 차단하거나, 또는 상기 차단 핵산은 교잡 반응 혼합물의 형태로 존재한다. 상기 프로브의 반복 서열이 어떤 방식으로 무력화되지 않는 경우, 상기 프로브는, 상기 반복 서열이 위치하는 표적 염색체 DNA의 다수의 위치와 반응함으로써 단일 카피 표적 서열(single copy target sequence)과 특이적으로 반응하지 않게 된다. 이러한 문제는, 게놈의 도처에 폭넓게 분산되어 있지만 DNA 분자상에서 모여지거나(clustered) 또는 연속(contiguous)적으로 직렬 반복(tandem repeat)되면서 존재하는 분산 반복 서열의 경우에 특히 심각하게 된다. 상보성 차단 핵산을 이용하여 반복 서열을 무력화(disabilization)하면, 존재하는 프로브의 감도(sensitivity)가 저하된다. 신뢰할 수 있고 용이하게 검출할 수 있는 신호는 약 40-100kb의 DNA 프로브를 필요로 한다.
또한, 종래 기술에서는 단일 카피 서열을 함유하는 것으로 추정되는 클로닝된 프로브(cloned probe)는 방사성표지 전체 게놈 DNA에 대한 교잡의 결핍에 기초하여 확인될 수 있는 것으로 개시하고 있다. 이러한 다른 연구에 있어서, 개별적으로 선택되어 단일 카피 서열 또는 매우 낮은 카피의 반복 서열에 교잡되어진 재조합 DNA 클론을 가지는 클론 풀(pool)을 함유하는 프로브를 이용하여 교잡이 우선 수행된다. 이러한 종래 기술에서 필수 단계는 서던(Southern) 또는 점 블롯 교잡 (dot blot hybridization)에 의해 표지된 게놈 DNA를 후보 DNA 프로브에 실험적으로 교잡하여 단일 카피 서열을 확인하는 것이다. 일반적으로, 표지 DNA 프로브를 이용한 포지티브 교잡 결과, 상기 후보 DNA 프로브는 반복 서열을 함유하므로 단일 카피 프로브로서 고려되지 않는다. 또한, 전체 게놈 DNA에 의한 DNA 프로브의 실험적 교잡에 의하여는 게놈내에서 많지 않거나(<100 카피)드물게 존재하는 다수 카피(multicopy) 반복 서열의 존재가 확인되지 못할 수 있다. 이러한 서열은 상기 표지된 게놈 DNA의 작은 부분을 나타내는 것으로서 이들에 의해 얻어지는 신호는 검출 한계 이하가 된다.
또한, 실험적 과정에 의해 프로브로부터 반복 서열을 물리적으로 제거하는 것이 제안되었다(Craig 등,Hum. Genet., 100:472-476(1977); Drum 등,Biotech., 24:820-825(1988)). 이러한 과정은 DNA 표적에 프로브를 가하기 전에 중합효소 연쇄 반응(PCR)-증폭된 게놈 프로브를 과량의 정제된 반복 서열 DNA로 예비교잡하는 것을 포함한다. 얻어지는 정제된 프로브는 감소된 반복 서열을 갖는다. 이러한 과정은 프로브의 반복 서열의 교잡을 무력화하는 다른 과정들과 원칙적으로 아주유사하지만, 시간 소모적인 외에도 미합중국 특허 제 5,447,841호 및 5,756,696호에서 설명된 프로브와 비교하여 이점을 전혀 없다.
관련 출원
이 출원은 2000년 5월 16일자 출원된 미합중국 특허출원 제 09/573,080호의 일부 계속 출원이다.
서열 목록
본 발명과 관련하여 컴퓨터 판독가능한 ASCII 파일 형태의 613개의 서열을 갖는 서열 목록(Sequence Listing)이 본원에 참조로 통합되며, 37 CFR 1.821(c)에 따라 하나(1)의 콤팩트 디스크 원본, 37 CFR 1.821(e)에 따라 상기 디스크의 동일한 카피, 및 37 CFR 1.52(e)에 따라 상기 디스크의 동일한 카피로서 본원에 첨부된다.
컴퓨터 프로그램 목록 부록
본 발명에서 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램의 소오스 코드(source code)를 갖는 컴퓨터 프로그램 서열 목록이 본원에 참조로 통합되며 하기와 같은 전체 3개의 파일을 함유하는 하나(1)의 콤팩트 디스크 원본 및 이것의 동일한 카피로서 본원에 첨부된다:
작성일 크기(바이트) 파일명
04/18/01 26KB FINDL.PL
04/18/01 19KB PRIM.IN
04/18/01 20KB PRIM.WKG
본 발명은 진핵세포 유래의 시료에서 특정 핵산 서열의 존재 유무를 측정하기 위한 세포유전학 및 분자유전학 분야에서 유용한 단일 카피 교잡 프로브(single copy hybridization probe)에 관한 것이다. 예를 들어, 상기 프로브는 후천성 또는 선천성 유전 질환의 검출을 위한 것으로 원위치 교잡(in situhybridization)에 의해 특정의 염색체 위치를 분석하기 위해 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 게놈 반복 서열을 실제적으로 함유하지 않음으로써 통상의 프로브에서 요구되는 바와 같이 반복 서열을 무력화할 필요가 없는 프로브, 이러한 프로브를 이용한 교잡 방법 및 이러한 프로브를 발생하기 위한 기술에 관한 것이다.
도 1 내지 도 12는, 여러 가지의 유전자 특이 디작시게닌(digoxigenin)-dUPT 표지 프로브가 중기 세포상에서 교잡되어 디작시게닌에 대한 로다민 접합 항체로 검출되고 염색체가 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 대조염색되어지는 FISH 실험의 CCD 카메라 이미지를 각각 나타낸다. 교잡된 하나 또는 두 개의 염색분체를 가지는 염색체는 화살표로 도시되는 반면에, 별모양은 일반적으로 예상되는 교잡이 없다는 것을 나타낸다.
특히, 도 1은 정제된 반복 DNA 서열과 반응한 것으로 실시예 1에서 설명한 5170 bp HIRA 프로브를 예시하고;
도 2는 정제된 DNA 서열과 전반응시키지 않은 동일한 5170 bp HIRA 프로브를 이용하는 교잡으로서 도 1에서 도시한 것과 동일한 비교 교잡을 예시하며;
도 3은 정제된 반복 DNA와 전반응시킨 3544 bp 15q11-q13 프로브를 이용하여 얻은 교잡 결과를 예시하며;
도 4는 정제된 반복 DNA와 전반응시키지 않은 3544 bp 15q11-q13을 이용한 비교 실험 결과를 예시하며;
도 5는 정제된 반복 DNA 서열과 전반응시키지 않고 실시예 2에서 설명한 4166bp, 3544 bp, 및 2290 bp 15q11-q13 프로브를 이용하여 얻은 교잡 결과를 예시하며;
도 6은 정제된 반복 DNA 서열과 전반응시키지 않고 실시예 1에서 설명한 5170 bp, 3691 bp, 3344 bp 및 2848 bp HIRA 프로브를 이용하여 얻은 교잡 결과를 예시하며;
도 7은 정제된 반복 DNA 서열과 전반응시키지 않고 정상 개체의 중기 세포상에서 실시예 2의 4823 bp 1p36.3 프로브를 이용하여 얻은 교잡 결과를 도시하고;
도 8은 정제된 반복 DNA 서열과 전반응시키지 않고 도 7의 4823 bp 1p36.3 프로브를 이용하여 얻은 비교 교잡 결과를 예시하며;
도 9는 정제된 DMA 서열과 전반응시킨 실시예 2의 4724 bp 및 4823 bp 1p36.3 프로브를 이용하여 얻은 교잡 결과를 예시하는데, 상동 쌍의 염색체 1s에서단일 카피 교잡이 관찰되며;
도 10은 정제된 반복 DNA 서열과 전반응시키지 않고 실시예 2의 4724 bp 및 4723 bp 1p36.3프로브를 이용하여 얻은 비교 교잡 결과를 예시하는 것으로 도 9에서 도시한 것과 동일한 단일 카피 교잡을 나타내며;
도 11은 하나의 염색체 대립유전자 마다 15q11-q13 서열이 결손되어 있는 것으로 알려져있고 Prader-Willi 증후군을 갖는 환자의 중기 세포상에서, 정제 DNA 서열과 전반응하지 않고 실시예 2의 4166 bp, 3544 bp 및 2290 bp 15q11-q13 프로브를 이용하여 얻은 교잡 결과를 예시하는데, 별모양은 염색체 결손 위치에서 교잡이 결핍된 것을 나타내고, 화살표는 단일 염색체에 대한 교잡을 나타내며;
도 12는 22q11.2 서열의 결손된 것으로 알려져 있으며 DiGeorge/Velo-Cardio Facial 증후군(VCFS)를 갖는 환자의 중기 세포상에서, 정제 DNA 서열과 전반응(pre-reaction)시키지 않고 실시예 1의 3691 bp, 3344 bp 및 2848 bp HIRA 프로브를 이용하여 얻은 교잡 결과를 예시하는데, 별모양은 염색체의 결손 위치에서 교잡이 결핍된 것을 나타내고, 화살표는 정상적인 동족체를 나타내며;
도 13은 실시예 4에서와 같이 만성 성인 골수성 백혈병의 경우 및 급성 임파구성 골수성 백혈병의 경우에 일반적이게 되는 분열 증상을 갖는 것으로, 22번 염색체의 절단 클러스터 영역 유전자(BCR) 프로모터에서 확인되는 단일 카피 프로브에 대한 염기쌍 좌표의 산포도(scatterplot)이며;
도 14는 실시예 4에서와 같이 만성 성인 골수성 백혈병의 경우 및 급성 임파구성 골수성 백혈병의 경우에 일반적이게 되는 분열 증상을 갖는 것으로, 9번 염색체의 ABL1 유전자에서 확인되는 단일 카피 프로브에 대한 염기쌍 좌표의 산포도이며;
도 15는 ABL1 암유전자(서열 확인 번호 520-525)의 염색체 9p34-특이 디작시게닌-dUTP 표지 프로브를 이용하고, 만성 골수성 백혈병(CML)을 갖는 환자의 DAPI 염색 중기 세포에 의해 디작시게닌에 대한 로다민(red) 접합 항체로서 검출되는 FISH 실험의 CCD 카메라 이미지로서, 실시예 4에서와 같이 염색체 절단점을 정확히 측정하기 위하여 사용되는 ABL1 유전자와 BCR 유전자 사이의 융합 부위의 하류측에서 프로브를 사용하는 것을 예시하는 도면이며, 유도 22번 염색체 및 정상적인 9번 염색체가 도시되어 있으며;
도 16은 ABL1 암유전자(서열 확인 번호 516-525)의 염색체 9p34-특이 디작시게닌-dUTP 표지 프로브를 이용하고, CML을 갖는 환자의 DAPI 염색 중기 세포에 의해 디작시게닌에 대한 로다민(red) 접합 항체로서 검출되는 FISH 실험의 CCD 카메라 이미지로서, 실시예 4에서 설명한 바와 같이 염색체 절단점을 정확히 측정하기 위하여 사용되는 ABL1 유전자와 BCR 유전자 사이의 융합 부위의 각각의 측면으로부터 프로브를 사용하는 것을 예시하는 도면이며, 유도 22번 염색체, 유도 9번 염색체 및 정상적인 9번 염색체가 도시되어 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 알려진 서열의 표적 핵산의 추정된 단일 카피 서열 간격(interval)에 교잡되는 표지된 단일 카피 핵산을 함유하는 핵산(예, DNA) 교잡 프로브를 제공한다. 일반적으로 말해서, 본 발명의 프로브는 표적 핵산을, 이것을 일부분으로 함유하는 게놈의 알려진 반복 서열과 비교함으로써 디자인되는데, 이러한 정보에 의하여 상기 표적내의 단일 카피 서열(즉, 특이성의 결핍으로 인해 단일 카피 서열의 교잡 신호를 은폐시킬 수 있는 반복 서열이 실제적으로 없는 서열)을 추정하는 것이 가능하다. 이러한 초기 단계는 인간 게놈 프로젝트 및 관련된 바이오인포메틱(bioinformatic) 연구때문에 더욱 더 이용되고 있는 정보로서 상기 표적 및 게놈 서열 모두의 이해를 필요로 한다. 또한, 쉽게 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 필요한 단일 카피 서열을 추정한다.
본 발명의 프로브는 표적 서열에 대하여 상보적인 것이 가장 바람직하다. 즉, 프로브 뉴클레오티드와 표적 서열 사이의 일치성은 100%인 것이 가장 바람직하다. 더욱 광범위하게, 프로브가 표적 서열에 충분히 교잡되는 경우 100% 미만의 일치성을 갖는 프로브가 사용될 수 있다. 즉, 표적 서열에 대한 보체(complement)인 서열과 프로브 사이의 서열 동일성은 약 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상일 수 있다.
상기 추정된 단일 카피 서열에 대응하는 핵산 단편(fragment)은 정제된 게놈 단편의 PCR 증폭, 제한 또는 엑소뉴클레아제 소화(exonuclease digestion), 또는 직접 핵산 합성과 같은 여러 가지 방법에 의해 생성될 수 있다. 다음에, 상기 단일 카피 단편은 전기영동 또는 변성 고압 액체 크로마토그래피와 같은 방법에 의하여 정제되어, 오염을 일으킬 수 있는 반복 서열이 제거되는데, 이것은 관계가 없는 게놈 서열의 위조 교잡 및 검출을 제거하기 때문에 아주 바람직한 것이다.
다음에, 상기 프로브 단편은 재조합 DNA 벡터로 클로닝되거나 또는 직접 표지될 수 있다. 상기 프로브는 변형 또는 직접 표지된 뉴클레오티드를 이용한 틈 번역(nick translation)에 의해 표지되는 것이 바람직하다. 다음에, 상기 표지된 프로브는 변성되고, 현미경 슬라이드상에 고정된 염색체 제제에 교잡되거나 또는 그렇지 않으면 필터, 슬라이드, DNA 칩, 또는 기타 기질상에 고정된 정제 핵산에 교잡된다. 다음에, 상기 프로브는 미합중국 특허 제 5,985,549호 또는 5,447,841호에서 설명된 것과 같은 통상적인 형광 원위치 교잡(fluorescencein situhybridization; FISH) 방법에 따라 염색체에 교잡되거나 또는 그렇지 않으면 미합중국 특허 제 5,110,920호 또는 5,273,881호에서 설명된 기술에 따라 고정화 핵산에 교잡된다. 형광, 면역 또는 효소 검출 시약을 이용하는 것과 같은 여러 가지 방법에 의해 프로브 신호가 시각화될 수 있다.
본 발명의 프로브를 이용하면, 원위치 교잡에 의해서는 아직까지 얻어질 수 없었던 분리 수준까지 염색체 절단점(breakpoint)을 더욱 정확하게 측정할 수 있다. 이러한 분석에 있어서, 절단점의 대향한 측면들에 있는 것으로 믿어지는 영역으로부터 초기 프로브 세트(set)들이 제조될 수 있다. 이것을 확인하기 위한 초기 분석(assay)후, 단일 카피 전략을 이용하여, 상기 절단점에 더욱 근접하는 연속적인 추가의 프로브들을 디자인할 수 있다. 이런 방식으로, 상기 절단점의 정확한 영역을 측정할 수 있다.
추정된 단일 카피 프로브를 이용하면, 게놈내에서 지금까지 알려지지 않은 반복 서열의 존재 유무를 측정할 수 있는 것으로 확인되었다. 다음에, 상기 알려지지않은 반복 서열 패밀리(family)는 다음의 단일 카피 프로브의 디자인에 사용될 수 있도록 반복 서열 데이터베이스에 내장될 수 있다.
또한, 프로브는 표적 서열의 증가된 길이 때문에 더욱 강한 교잡을 나타낼 수 있는 게놈내에서 중복 또는 삼중복(triplication)되는 서열을 함유할 수도 있는 것으로 확인되었다. 또한, 이러한 중복물(duplicon) 또는 삼중복물(triplicon)은 단일 카피 프로브를 이용하여 그대로 확인될 수 있는데, 이러한 확인은 상업적으로 이용가능한 프로브에 의해서는 더욱 어려운 것이다.
본 발명은 유전 또는 종양 질환의 검출에 유용한 핵산(예, DNA) 교잡 프로브에 관한 것이다. 상기 프로브는 표적 서열(target sequence)에 대한 교잡을 검출할 수 있는 표지 핵산 단편 또는 이들의 콜렉션(collection) 형태로 존재한다. 또한, 본 발명은 이러한 프로브를 발생, 생성 및 표지하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 표지된 프로브는 반복 서열을 함유할 수 있는 어떠한 핵산 표적 서열과 함께 사용될 수 있다. 이러한 표적 서열로는 전사물의 통합 성분 형태의 반복 서열을 함유하는 염색체 또는 정제된 핵 DNA, 이종핵 RNA, 또는 mRNA 종 등이 있다. 하기의 설명에 있어서, DNA 표적 서열 및 DNA 프로브의 일반적인 경우가 논의되지만, 이 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자는 이러한 논의가 기타 핵산 종에도 균등하게 적용될 수 있음을 알 수 있다(표적 서열과 프로브의 특성때문에 기술적으로 인식되는 차이가 있음).
본 발명의 프로브의 중요한 특징은, 표적 DNA 영역의 최소한 일부분에 대하여 상보적이고, 표적 영역을 일부분으로 함유하는 게놈의 반복 서열에 대하여 상보적인 서열이 실제적으로 없는 단일 카피(single copy) 또는 특이(unique) DNA 서열을 포함한다는 것이다. 따라서, 단일 카피 또는 특이 서열로 구성되는 프로브는 대응하는 게놈에서 단지 하나의 서열에 대하여만 상보적이게 된다.
아주 최근에, 인간 게놈은 게놈내에서 두 개의 비대립유전자 카피 형태로 존재하는 경우 이른바 중복물(duplicon)을 가지거나, 또는 세 개의 카피 형태로 존재하는 경우 삼중복물(troplicon)을 가지는 아주 유사한 영역(domain)들을 함유한다는 것이 발견되었다(Ji 등,Genome Res.,10:597-610(2000)). 이러한 서열을 함유하는 염색체 영역의 중복 또는 삼중복은, 일부의 경우 비인간 영장류가 이러한 서열의 다중 카피를 함유하지 않는다는 것과 소집단 서열들의 상이한 카피들 사이의고도의 서열 유사성을 고려할 때 최근의 혁신적인 결과였다. 이러한 낮은 카피의 중복물(또는 삼중복물)은 게놈 도처에서 산포되거나 또는 동일한 염색체 간격으로 수백 내지 수천회에 걸쳐서 직렬로 반복되기 쉬운 고전적인 반복 서열 패밀리와 구별되는 것이다. 따라서, 중복물 또는 삼중복물의 프로브는 단일 카피 프로브의 범위내에 있는 것으로 판단되는 본 발명의 목적을 위한 것이다.
이러한 중복물 또는 삼중복물은, 알려진 서열 패밀리의 복잡한 거의 단일 카피의 분절 및 이웃한 멤버로 구성되는 전체 게놈 영역의 서열 및 편성이 각각의 중복물 및 삼중복물내에 완전히 보존되도록 발달했다. 몇 킬로베이스 내지 메가베이스 크기의 중복 또는 삼중복 길이가 보고되었다(International Genome Sequencing Consortium,Nature,409:860-922(2001)). 흔히, 중복물/삼중복물은 직렬로 배열되고, 거의 항상 동일 염색체상에 존재하므로, 게놈내에서 군집(cluster)을 이루고있다. 소집단 프로브 서열들을 분리시키는 간격은 중복/삼중복 영역의 크기, 중복물(삼중복물)의 서로에 대한 배향(직접 또는 전화), 및 중복물/삼중복물을 분리시키는 관련이 없는 서열 간격의 길이로 나타내어진다.
본원에서 사용되는 용어 핵산 서열에 관한 "단일 카피"는 엄밀히 말해서 특이적인(즉, 대응하는 게놈의 단지 하나의 서열에 대하여만 상보성을 가지는) 서열을 의미하는 것으로서, 중복물 및 삼중복물을 포함한다. 달리 말해서, 바람직한 형태의 단일 카피는 게놈의 세 개 미만의 위치를 교잡하게 된다.
본원에서 사용되는 용어 "반복 서열"은 표적 DNA를 일부분으로 함유하는 게놈에서 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상의 반복 서열 동일성을 가지고서 반복적으로 나타나는 서열로서, 표적 DNA에 대한 프로브의 원하는 특이 교잡을 방해하지 않는(즉, 상기 프로브는 반복 서열의 다수 카피를 이용하여 교잡한다) 길이 또는 기타 품질을 가지는 서열을 의미하는 것이다. 일반적으로 말해서, 반복 서열은 게놈에서 최소한 약 10번, 더욱 바람직하게는 최소한 약 50번, 가장 바림직하게는 최소한 약 200번 나타나고, 최소한 약 50개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 최소한 약 100개 뉴클레오티드의 길이를 가진다. 반복 단위는 어떠한 종류(예, 표적 서열 및 일부의 경우에는 게놈의 일부의 카피를 갖는 직렬, 산재, 회문 또는 공유 반복 서열)의 것일 수 있고, 단일 염색체 또는 일부 또는 전부의 염색체에 걸쳐서 분포된 염색체의 중심절에 인접하여 나타날 수 있다. 일반적으로, 몇 가지를 제외하고, 반복 서열은 생리학적으로 유용한 단백질을 발현하지 않는다.
반복 서열은 반수체 게놈에서 다수의 카피로 발생한다. 카피의 수는 최소한 수십에서 수십만에 이르기까지 다양할 수 있는데, 반복 DNA의 Alu 패밀리는 많은 변종중에서 대표적인 것이다. 반복 서열의 카피는 게놈 도처에서 군집을 형성하거나 산재되어 있다. 반복 서열은 예를 들어 각각의 염색체의 중심절 근처에서 발생하는 반복 서열 및 다양한 수의 직렬 반복 서열(VNTRs)과 같이 게놈내의 하나 이상의 위치에서 군집을 형성하거나(Nakamura 등,Science, 235:1516(1987), 또는 상기 반복 서열은 다음문헌(Bardoni 등,Cytogenet. Cell Genet.,46:575(1987))에 설명된 바와 같이 X 염색체상에서만 확인되는 반복 서열과 같이 단일 염색체에 걸쳐서 분포할 수 있거나, 또는 반복 서열의 Alu 과와 같이 모든 염색체에 걸쳐서 분포할 수 있다.
낮은 복잡성을 갖는 간단한 반복 서열이 유전자내에서 확인될 수 있지만 비암호화 게놈 서열에서 더욱 일반적으로 확인된다. 이러한 반복 요소는 직렬 단위내에 정렬된 모노-, 디-, 트리-, 테트라-, 또는 펜타 뉴클레오티드 코어 서열 요소들로 구성된다. 흔히, 이러한 반복 서열을 포함하는 직렬 단위들의 수는 상이한 개체의 게놈들 사이의 동일 위치에서 변화한다. 이러한 반복 서열은 게놈 서열에서 코어 서열 요소의 연속적인 경로를 조사함으로써 확인할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "서열 동일성"은 두 개이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 즉 기준 서열과 이와 비교될 소정의 서열 사이의 관계를 의미하는 것이다. 서열 동일성(sequence identity)은 문자열(string)들 사이의 짝짓기(match)에 의해 측정되는 것으로, 최고 수준의 서열 유사성이 얻어지도록 서열들을 최적으로 정렬한 후 소정의 서열을 기준 서열과 비교함으로써 측정된다. 이러한 정렬시에, 서열 동일성이 위치마다 확인되는데, 예를 들어 특정의 위치에서 뉴클레오티드들이 동일한 경우 그 위치에서 서열들은 동일하다. 다음에, 이러한 위치 동일성의 총수는 기준 서열의 뉴클레오티드 또는 잔류물의 총수로 나누어짐으로써 서열 동일성%가 얻어진다. 서열 동일성은 다음문헌(Computational Molecular Biology, Lesk A. N., 발행, Oxford University Press, New York(1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith D.W., 발행, Academic Press, New York(1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin A.M., 및 Griffin H.G., 발행, Humana Press, New Jersey(1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge G., Academic Press(1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov M. 및Devereux J., 발행, M. Stockton Press, New York(1991); 및 Carillo H., 및 Lipman D., SIAM J. Applied Math., 48:1073(1988))에서 설명된 방법을 포함한 공지의 방법에 의해 쉽게 계산할 수 있다. 서열 동일성을 측정하기 위한 바람직한 방법은 시험되는 서열들 사이의 가장 큰 일치(match)를 제공하도록 디자인된다. 서열 동일성을 측정하기 위한 방법은 소정의 서열들 사이의 서열 동일성을 측정하는 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 성문화되어 있다. 이러한 프로그램의 예로는 GCG 프로그램 패키지(Devereux 등,Nuc. Ac. Res., 12(1):387(1984), BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul 등,J. Molec. Biol.,215:403-410(1990)) 등이 있다. 상기 BLASTX 프로그램은 NCBI 및 기타 소오스(BLAST Manual, Altschul 등, NCBI, NLM, NIH, Bethesda, MD20894; Altschul 등, J. Molec. Biol., 215:403-410(1990))로부터 공개적으로 이용가능한 것이다. 이러한 프로그램은 소정의 서열과 기준 서열 사이의 최고 수준의 서열 동일성을 얻기 위하여 디폴트 갭 중량(default gap weight)을 이용하여 서열들을 최적으로 정렬한다. 예를 들어, 기준 뉴클레오티드 서열에 대하여 예를 들어 최소한 95%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의하여, 소정의 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 상기 소정의 뉴클레오티드 서열이 상기 기준 뉴클레오티드 서열의 100개의 뉴클레오티드 마다 5 이하의 차이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고 기준 서열과 동일한 것이다. 즉, 상기 기준 뉴클레오티드 서열에 대하여 95% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 기준 서열의 뉴클레오티드의 5%이하는 삭제 또는 다른 뉴클레오티드로 교체될 수 있거나, 또는 상기 기준 서열의 전체 뉴클레오티드의 5% 이하의 다수의 뉴클레오티드는 상기 기준 서열에 삽입될 수 있다. 어느 한쪽 서열의 역위(inversion)는 상동 시험 서열의 안티센스 가닥(antisense strand)에 대한 기준 서열의 유사성에 기초하여 상기 컴퓨터 프로그램으로부터 검출된다. 기준 서열의 이러한 변형체는, 기준 서열내의 하나 이상의 인접 그룹에 산재하거나 또는 기준 서열의 뉴클레오티드들 사이에 개별적으로 산재하는 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 상기 말단 위치들 사이의 어떤 장소에서 발생할 수 있다.
본 발명의 단일 카피 프로브는 바람직하게는 최소한 약 50개의 뉴클레오티드의 길이, 더욱 바람직하게는 최소한 약 100개의 뉴클레오티드의 길이를 가진다. 이러한 길이의 프로브는 서던 블롯 분석을 위하여 충분한 것이다. 그러나, FISH와 같은 다른 분석이 이용되는 경우, 상기 프로브는 다소 길어진다. 즉, 상기 프로브는 최소한 500개의 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 최소한 약 2000개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 상기 프로브는 결손, 중복, 삽입, 추가, 역위 또는 전위와 같은 실질적으로 어떤 유형의 염색체 재배열을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 프로브를 생성하기 위하여는 상기 표적 DNA 영역의 서열을 알아야 한다. 상기 표적 영역은 전체의 염색체일 수 있거나 또는 재배열이 확인되는 그 일부분일 수 있다. 이러한 서열 이해에 의하여, 상기 표적 영역내의 단일 카피 또는 특이 서열들의 경계가 측정된다. 이것은 상기 표적 서열내의 경쟁 서열의 위치로부터 추정하여 달성하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 상기 표적 영역의 서열은 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 대응하는 게놈의 알려진 반복 서열과 비교된다. 상기 표적 서열내의 반복 서열이 확인되면, 개재 서열은 단일 카피(즉, 인접한 반복 서열들 사이의 서열)인 것으로 추정된다.
비교를 위한 표적 및 반복 서열의 최적 정렬은 다음문헌(Smith 등,Adv. Appl. Math., 2:482(1981))의 국소적 상동 연산(local homology algorithm) 또는 다음문헌(Needleman 등,J. Mol. Biol., 48:443(1970))의 상동 정렬 연산에 의하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 발견적인 방법(Pearson 등,Proc. Natl. Acad. Sci.,85:244(1988); Altschul 등,J. Molec. Biol.,215:403-410(1990))으로부터 얻어진 결과는 상기 Smith 등 및 Needleman 등의 방법 만큼이나 포괄적이지는 않다. 그러나, 상기 발견적인 방법은 상기 두 방법보다 더욱 신속하다.
단일 카피 서열 정보가 얻어지면, 특정의 단일 카피 서열(일반적으로는 가장 긴 서열)이 교잡 프로브를 디자인하기 위해 사용된다. 이러한 경우에 있어서, 다음문헌(Britten 등,Mehtods of Enzymol., 29:363(1974))에서 정의되고 다음문헌(Cantor 등,Biophysical Chemistry: Part III: The Behavior of Biological Macromolecules.pp.1228-1230)에서 더욱 더 설명되는 바와 같은 다양한 복잡성(complexity)을 가질 수 있다. 선택되는 프로브의 복잡성은 그 프로브 디자인의 용도에 의존한다. 서열 세트를 검출하기 위해 요구되는 프로브의 복잡성은 교잡 감도가 증가함에 따라 감소하게 된다. 높은 감도 및 낮은 배경(background)에서, 더욱 작고 덜 복잡한 프로브가 사용될 수 있다.
오늘날의 교잡 방법에 있어서, 본 발명에 따른 비교적 작은 프로브를 이용하여 신뢰할 수 있고 용이하게 검출할 수 있는 신호를 얻는 것이 가능하다. 쉽게 검출할 수 있는 신호가 FISH 기술 및 약 2kb 길이의 프로브를 이용하여 얻어졌다. 본 발명의 이러한 감도는 본 발명의 프로브가 균질한 단일 카피 서열이므로 종래 기술(미합중국 특허 제 5,756,696호)과 비교하여 개선된 것이다. 그러나, 비반복 서열을 포함하는 더욱 작은 증폭 분절들이 충분한 신호를 달성하기 위한 프로브로서 조합하여 원위치 교잡에 사용될 수도 있다. 또한, 중복 또는 삼중복된 표적 서열에 교잡되는 복잡한 단일 카피 프로브가 교잡 신호를 증가시킬 수도 있다.
다수 분절 단편의 한 가지 용도는 상이한 염색체들 사이의 전위(translocation)를 검출하는 것이다. 또한, 프로의 복잡성을 균형잡히게 증가시키면 게놈의 다수의 콤팩트한 영역들을 동시에 분석할 수 있다. 단일 염색체의 경우, 절단점의 한 측면으로 표적되는 프로브의 부분이 표지될 수 있고, 상기 절단점의 다른 측면으로 표적되는 것과 상이하게 검출됨으로써 유도 또는 전위된 염색체가 하나의 표지(label)에 의해 검출되어 두 표지를 가지는 손상되지 않은 정상 염색체와 구별될 수 있다.
본 발명은 통상적인 프로브를 이용하는 것보다 더욱 높은 게놈 밀도로 단일 카피 프로브를 생성할 수 있다. 21번 및 22번 염색체가 포괄적으로 서열분석되었으며, 이웃한 단일 카피 간격들이 상기 염색체상에서 모여질 수 있는 것으로 측정되었다. 예를 들어, 22번 염색체에서, 단일 카피 간격의 39%가 단지 500-1000 bp에 의해 분리된다. 2.3 kb 이상의 단일 카피 간격이 21번 염색체에서는 29.2 kb, 그리고 22번 염색체에서는 22.3kb에 의해 분리된다.
단일 카피 프로브를 발생하기 위해 필요한 게놈 간격의 크기를 평가하기 위하여, 21q 및 22q 염색체상의 중복되는 균일한 길이의 게놈 간격들에서 최소한 하나의 단일 카피 서열을 검출할 확률을 측정하였다. 2.0 kb 이상의 길이를 갖는 단일 카피 분절이 상기 염색체의 대부분의 100 kb 게놈 간격에서 확인된다(22q 염색체의 96% 및 21q 염색체의 88%). 게놈 서열의 크기를 150 kb까지 증가시키면 22q 염색체의 99% 및 21q 염색체의 96%가 덮여진다. 따라서, 21번 및 22번 염색체의 포괄적인 덮임율(100-150 kb당 최소한 한번)을 확보하기 위하여 단일 카피 프로브는 약 2 kb 이다. 단일 카피 서열이 다른 염색체들 상에서 균일하게 분포된다고 가정하면, 대부분의 임상학적으로 관련있는 염색체 재배열의 원위치 교잡을 위한 프로브를 개발할 수 있다.
관련있는 염색체 영역의 적절한 단일 카피 서열이 확인되면, 적절한 DNA를 증폭하여 프로브를 얻기위하여 PCR을 사용하는 것이 바람직하다. PCR은 기하학적 진행(geometric progression)으로 특이 DNA 분절을 증폭하기 위한 잘 알려진 방법으로서, 증폭될 DNA 분절의 3' 말단의 보체 및 5' 말단에 대하여 성동성을 가지는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 DNA 중합효소-촉매작용 연장의 반복 사이클에 기초한다.
PCR 주형(template)으로 이용되는 핵산(예, DNA)은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, DNA가 단일 가닥인 경우, 이것은 이중 가닥으로 전환되는 것이 대표적이다. 상기 주형 DNA의 길이는 50 bp 정도로 짧을 수 있지만, 일반적으로는 최소한 약 100 bp, 더욱 일반적으로는 최소한 약 150 bp의 길이를 가지며, 10,000bp 또는 그 이상으로 길수도 있지만, 일반적으로는 50,000 bp의 길이, 더욱 일반적으로는 20,000 bp의 길이를 초과하지는 않는다. 상기 DNA는 용액으로 유리될 수 있으며 한 말단 또는 양 말단이 비주형 DNA의 측면에 위치할 수 있으며, 플라스미드 등과 같은 클로닝 벡터로 존재할 수 있는데, 유일한 기준은 DNA가 프라이머 연장 반응에서 침전을 위해 이용될 수 있어야 한다는 것이다. 상기 주형 DNA는 표적 염색체 또는 고정된 DNA 서열에 대하여 상보적인 경우 여러 가지의 상이한 소오스로부터 유도될 수 있다. 다른 시약과 결합되는 주형 DNA의 양은 약 1 분자 내지 1 pmol, 일반적으로는 약 50 분자 내지 0.1 pmol, 더욱 일반적으로는 약 0.01 pmol 내지 100 fmol 이다. 상기 주형 핵산과 접촉하는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 결합반응(annealing) 조건하에서 상보성 주형 DNA를 교잡하기에 충분한 길이를 갖지만, 중합 조건하에서는 주형 DNA로서 안정한 잡종(hybrid)을 형성하기에 불충분한 길이를 가지게 된다. 상기 프라이머는 최소한 약 10개 뉴클레오티드(nt)길이, 바람직하게는 최소한 15개 nt 길이, 더욱 바람직하게는 최소한 16개 nt 길이를 가지며, 상기 프라이머는 30 nt 또는 그 이상의 길이, 일반적으로 18-50 nt 길이, 보통은 20-35 nt 길이를 가질 수 있다. 30-35 nt의 프라이머 및 고충실도(fidelity) 중합효소(미합중국 특허 제 5,436,149호에서 설명)를 이용하여 더욱 긴 증폭 생성물의 수율을 강화할 수 있다.
원위치 교잡(in situ hybridization)동안에 얻어지는 신호 세기를 최대화하기 위하여, 각각의 단일 카피 게놈 서열 간격의 거의 전길이에 걸쳐있는 DNA 단편을 증폭시에 생성하는 프라이머 서열 쌍이 바람직하다. 따라서, 인접하거나 또는밀접하게 이격된(소프트웨어는 단일 카피 간격 길이의 70% 이하로 분리되는 쌍들은 제외시킴) 프라이머 쌍들은 원위치 교잡을 위한 프로브를 생성하기 위한 고려에서 일반적으로 제외된다. 증가된 수의 표적 분자때문에 더욱 짧은 프로브의 신호 세기이면 일반적으로 충분하므로, 세포유전학적 제제를 제외하고, 이러한 기준은 고정된 클로닝 또는 합성된 핵산 표적 서열에 대하여 교잡되는 프로브에는 일반적으로 적용할 수 없다는 것이다.
그러나, PCR 반응의 수율 및 반응속도를 최적화하기 위하여, 원하는 프라이머 서열은 다른 기준을 만족시켜야 한다. 우선, 프라이머 서열은 제 2 프라이머에 대하여 자동 상보성 또는 상보성이 아니어야 한다. 특히, 프라이머의 3' 말단 및 또 다른 서열 또는 제 2 프라이머(6개 이상의 염기쌍으로 정의됨)를 포함하는 안정한 잡종을 형성할 수 있는 가능한 프라이머 서열은 제외된다. 그 밖에, 상기 프라이머 쌍의 한 멤버의 Tm은 주형에 대하여 거의 동시에 변성 및 결합될 수 있는 그 대응물(counterpart)의 2℃ 이내에서 발생하여야 한다. 모든 바람직한 기준을 만조시키는 프라이머 서열을 확인하기 위한 소프트웨어가 이 분야에서 잘 알려져있다(예를 들어, http://www.genome.wi.edu/ftp/pub/software/primer.0.5/ 또는 http://www.oligo.net/Oligo-6-tour.htm 참조).
일반적으로, 상기 PCR 반응 혼합물은 일가 이온의 소오스, 이가 양이온의 소오스 및 완충제를 포함하는 수성 완충 배지를 추가로 포함할 수 있다. 상기 완충제에 존재하는 일가 이온 소오스의 양이 약 500 내지 20,000 마이크로옴, 일반적으로는 약 1000 내지 10,000 마이크로옴, 더욱 일반적으로는 3,000 내지 6,000 마이크로옴의 도전성을 제공하기에 충분한 양으로 존재하는 경우, KCl, K-아세테이트, NH4-아세테이트, K-글루타메이트, NH4Cl, 황산암모늄 등과 같은 일가 이온의 어떠한 소오스를 이용할 수 있다. 상기 이가 양이온은 마그네슘, 망간, 아연 등일 수 있으며, 마그네슘이 바람직하다. MgCl2, Mg-아세테이트 등을 포함한 마그네슘 양이온의 어떤 편리한 소오스가 이용될 수 있다. 상기 완충액에 존재하는 Mg2+의 양은 0.5 내지 10 mM, 바람직하게는 2 내지 4 mM, 더욱 바람직하게는 약 2.25 내지 2.75mM, 가장 바람직하게는 약 2.45mM일 수 있다. 상기 완충액에 존재할 수 있는 대표적인 완충제 또는 염은 Tris, Tricine, HEPES, MOPS 등일 수 있는데, 상기 완충제의 양은 약 5 내지 150 mM, 일반적으로는 10 내지 100 mM, 더욱 일반적으로는 약 20 내지 50 mM 이며, 특정의 바람직한 구현예에서 상기 완충제는 약 6.0 내지 9,5의 pH를 제공하기에 충분한 양으로 존재하며, 가장 바람직한 것은 72℃에서 pH 7.3이다. 상기 완충액에 존재할 수 있는 기타 시약으로는 EDTA, EGTA 등과 같은 킬레이트제가 있다.
또한, 상기 PCR 반응 혼합물에 존재하는 것은 융점 감소제, 즉 DNA의 융점을 저하시키는 시약이다. 적당한 융점 감소제로는 두 개의 뉴클레오티드의 수소 결합 상호작용을 방해하는 것들이 있으며, 대표적인 염기쌍 불안정화제로는 베타인, 포름아미드, 우레아, 티오우레아, 아세트아미드, 메틸우레아, 글리신아미드 등이 있는데, 베타인이 바람직한 시약이다. 상기 융점 감소제는 대표적으로 약 20 내지500 mM, 일반적으로는 약 50 내지 200 mM, 더욱 일반적으로는 약 80 내지 150 mM의 양으로 존재한다.
상기 PCR 반응 혼합물을 제조하는데 있어서, 여러 가지의 구성 성분들이 어떤 적절한 순서로 결합될 수 있다. 예를 들어, 완충제가 프라이머와 결합된 다음, 중합효소와 주형 DNA가 결합될 수 있거나, 또는 모든 여러 가지 구성 성분들이 동시에 결합됨으로써 반응 혼합물을 생성할 수 있다.
PCR 반응 혼합물의 제조후, 상기 혼합물은 다수의 반응 사이클을 받는데, 각각의 반응 사이클은 (1) 변성(denaturation) 단계, (2) 결합(annealing) 단계, 및 (3) 중합 단계를 포함한다. 반응 사이클의 수는 수행되는 용도에 따라 변화할 수 있지만, 일반적으로는 최소한 15, 더욱 일반적으로는 최소한 20 이고, 그리고 60 이상으로 많을 수도 있는데, 상이한 사이클의 수는 약 20 내지 40이 대표적이다. 약 25 사이클, 일반적으로는 약 30 사이클 이상으로 수행되는 방법의 경우, 효소적 프라이머 연장(enzymatic primer extension)에 적당한 조건이 유지되도록 추가의 중합 효소를 상기 반응 혼합물에 도입하는 것이 편리 또는 바람직할 수 있다.
변성 단계(denaturation step)는 상기 반응 혼합물을 승온으로 가열하고 상기 혼합물을 상기 승온에서, 상기 반응 혼합물에 존재하는 어떤 이중 가닥 또는 교잡 핵산을 해리시키기에 충분한 시간동안 유지하는 것을 포함한다. 변성을 위하여, 상기 반응 혼합물의 온도는 약 3초 내지 120초, 일반적으로는 약 5초 내지 30초 동안, 약 85 내지 100 ℃, 일반적으로는 약 90 내지 98℃, 더욱 일반적으로는 약 93 내지 96℃의 온도로 상승 또는 그 온도로 유지된다.
변성 후, 상기 PCR 혼합물은 상기 혼합물에 존재하는 주형 DNA에 프라이머를 결합(annealing)하기에 충분한 조건을 받는다. 이러한 조건을 달성하기 위해 저하되는 상기 반응 혼합물의 온도는 일반적으로 최적 효율 및 특이성이 제공되도록 선택되는데, 약 50 내지 75℃, 바람직하게는 약 55 내지 70℃, 더욱 바람직하게는 약 60 내지 68℃이다. 결합 조건은 약 15초 내지 30분, 일반적으로는 약 30초 내지 5분동안 유지된다.
주형 DNA에 프라이머의 결합후 또는 주형 DNA에 프라이머의 결합동안, 상기 반응 혼합물은, 프라이머를 주형에 교잡하기 하기 위한 DNA를 이용하여 상기 DNA가 5' 에서 3' 방향으로 연장되도록 뉴클레오티드를 프라이머 말단에 중합시키기에 충분한 조건, 즉 프라이머 연장 생성물의 효소적 생성을 위해 충분한 조건에 처해진다. 중합 조건을 달성하기 위하여, 상기 반응 혼합물의 온도는 약 15초 내지 20분 동안, 일반적으로는 약 30초 내지 약 5분동안, 약 65 내지 75 ℃, 일반적으로는 약 67 내지 73℃의 온도로 상승 또는 유지된다.
상기 변성, 결합 및 중합 사이클은 열사이클러(thermal cycler)로서 일반적으로 알려져있는 자동화 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 이용될 수 있는 열사이클러는 미합중국 특허 제 5,612,473호, 5,602,756호, 5,538,871호 및 5,475,610호에 설명되어 있다.
상기의 모든 기준에 기초하여, 일련의 프라이머들이 정상 개체의 게놈 DNA를 이용하여 PCR에 의해 생성 및 확인되었다. 적당한 프라이머를 이해하면, 본 발명에 따른 대응하는 PCR-생성 프로브를 한정할 수 있음은 물론이다. 따라서, 서열확인 번호(SEQ ID No.) 429로부터 출발하여, 서열 확인 번호 429-446 및 480-613으로 확인되는 인접한 쌍들의 서열들은 각각, 특정의 유용한 프로브를 생성하기 위해 발생되는 포워드/리버스 PCR 프라이머이다. 따라서, 서열 확인 번호 429 및 430의 조합을 이용하여 유용한 프라이머를 생성할 수 있고, 계속되는 쌍들의 서열 확인 번호들에 의하여 추가의 프라이머들이 한정된다. 일반적으로 말해서, 본 발명의 특정의 바람직한 프라이머는 상술한 인접 쌍들의 프라이머 서열에 의해 정의되는 프로브에 대하여 최소한 약 80%의 서열 동일성, 바람직하게는 약 90%의 서열 동일성을 가져야 한다.
상기 PCR 외에도, 결손 돌연변이 발생, 제한 소화, 직접 합성 및 DNA 결찰 등을 포함한 기타 여러가지 방법에 의하여 특이 서열에 대응하는 DNA 분절이 얻어질 수도 있다.
반복 서열을 함유하는 DNA로부터 증폭 또는 정제하여 게놈 단편을 얻는 경우, 상기 단편은 표지 및 교잡 이전에 정제되어야 한다. 균일한 크기의 DNA 단편을 정제하는 것은 전기영동 및 고압 크로마토그래피 등을 포함한 여러가지 방법에 의하여 달성될 수 있다. 바람직한 방법에 있어서, 증폭된 단편은 트리스 아세테이트 완충액을 이용하여 Seakem LE Agarose에서 겔 전기영동하여 크기에 따라 분리되고(Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]), 이티듐 브로마이드(ethidium bromide) 또는 Syber-Green과 같은 염료로 염색되고, 자외선(300 nm)을 이용하여 시각화되고, 스켈펠(scalpel)을 이용하여 겔로부터 절제된다. 다음에, 스핀 원심분리에 의해 Micro-con 100 (Millipore Watertown, MA) 컬럼을 이용하여 겔 단편으로부터 각각의 DNA 단편이 회수된다.
상기 증폭된 DNA의 페놀-클로로포름 추출은 충분한 정제 방법이 아니다. 이러한 방법을 시험하면, 상기 정제 방법은 반복 서열의 교잡에 의해 생성되는 패턴과 일치하는 것으로, 그 전체 길이를 따라 모든 염색체에 비특이적 교잡을 제공했다(데이터는 도시하지 않음). 이것은, PCR 공정동안, 초기 주형이 게놈 DNA 서열을 함유하는 경우 DNA 중합효소가 복제 가닥을 제 2 프라이머의 위치를 지나 인접 반복 서열들 내로 연장시키기 때문에 발생하는 것이다. 증폭 생성물보다 더욱 긴 이러한 연장 생성물은 모든 PCR 반응에서 존재한다. PCR 반응의 페놀-포름알데히드 추출은 이러한 연장 생성물을 제거하지 않는다. 이러한 반응 혼합물을 함유하는 PCR 반응 혼합물은 상기 표적 서열 외에도 반복 게놈 DNA에 교잡될 수 있다. 따라서, 게놈 DNA로부터 직접 얻어진 것이건 또는 PCR에 의해서 얻어진 것이건 상관없이 상기 정제된 게놈 증폭 단편을 분리하는 것은 본 발명의 바람직한 구현예이므로 당업자에 자명하지 않은 것이다.
대장균, 효모, 또는 기타 종에서 번식될 수 있는 플라스미드, 박테리오파지, 또는 염색체 클로닝 운반체내로 상기 정제된 단편을 삽입하면 단일 카피 프로브의 반복적인 제조에 요구되는 비용 및 노동력이 절감될 수 있다. PCR 생성물을 함유하는 벡터의 신속한 결찰 및 선별을 위하여 여러 가지의 클로닝 벡터(cloning vector)들이 최적화되어 왔다(예를 들어, 미합중국 특허 제 5,487,993호 및 5,766,891호). 프로브를 다중 교잡에 사용하는 경우, 클로닝된 재조합 형태는 동일한 게놈 DNA 주형의 반복 PCR 증폭에 의한 것보다 더욱 다량으로 제조하는데 비용이 덜 든다. 그 밖에, 벡터와 재결합된 단편이 반복 서열을 함유할 수 있는 다른 어떤 DNA 없이 번식하므로, 상기 클로닝된 프로브(cloned probe)는 분리될 필요가 없다. 끝으로, 상기 클로닝된 운반체는 많은 프로브 소오스를 제공하는 반면에, 천연 게놈 DNA 주형은 세포주 또는 기타 소오스로부터 재분리하여야 한다. 전술한 PCR 증폭에 의해 얻어지는 단일 카피 DNA 단편은 겔 전기영동에 의해 크기별로 분리되고 당업계에 잘 알려진 바와 같이 컬럼에 의해 정제된다.
다음에, 이러한 단편은 형광발색단(fluorophore), 효소 접합물, 또는 비오틴 또는 아비딘, 스트렙타비딘 또는 기타 항체에 의하여 인식되는 기타 부분으로 구성되는 군에서 선택되는 것과 같은 비동위원소 동정 표지물(nonisotopic identifying label)로 표지된다. 몇 가지 유형의 비동위원소 동정 표지물이 존재한다. 한 가지 유형은 프로브에 화학적으로 결합하고 동정 및 국소화(localization)를 위한 수단으로 이용되는 표지물(label)이다. 이러한 유형의 한가지 예는 적당한 파장의 방사선의 적용시에 고에너지 상태로 여기되어 형광을 방출하게 되는 형광크롬 부분(fluorochrome moiety)일 수 있다. 상기 프로브는 화학적으로 합성되거나, 또는 바람직하게 dATP 또는 dUTP와 같은 뉴클레오티드에 접합된 선택된 동정 표지물을 포함하는 반응물을 이용한 통상의 방법에 따라 틈 번역 방법(Rigby 등,J. Mol. Biol., 113:237-251(1977)) 또는 Klenow 표지(Feinberg 등,Anal. Biochem., 137:266-267)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 단편은 형광체 표지 뉴클레오티드에 의하여 직접적으로 표지될 수 있거나, 또는 후술하는 바와 같이 단편내로 통합되는 변형된 뉴클레오티드를 인식하는 형광성-표지 항체에 상기 표지된 이중나선(duplex)을 결합시킴으로써 간접적으로 표지될 수 있다. 틈 번역(100㎕ 반응)은 엔도뉴클라아제가 없는 DNA 중합효소(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) 및 DNaseI(Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ)를 이용한다. 각각의 단편은 DNA 중합효소(20units/microgram DNA), DNaseI(10 microgram/100 ㎕ 반응), 표지된 뉴클레오티드(0.05 mm 최종) 및 틈 번역 완충제와 결합된다. 15℃에서 45분 내지 2 시간동안 반응이 수행됨으로써 100 내지 500 bp 사이즈 범위의 상이한 뉴클레오티드의 표지된 프로브 단편들이 얻어진다.
통상적으로 사용되는 프로브를 표지 및 검출하기 위한 다른 방법이, 본 발명에 의해 생성되는 단일 카피 DNA 프로브에 적용될 수도 있다. 이러한 방법은, 교잡이 명백히 일어나는 것을 확보하기 위하여 이용되고 어느 정도 이격되기 보다는 교잡 부위에서 정밀한 검출을 가능하게 하는 개개의 염색 분체상의 표지를 분석하는 형광크롬 표지물, 적당한 시약(예를 들어, 반응하여, 표적 서열의 존재 및 위치를 확인하는 검출가능한 색상 변화를 제공하는 알칼리성 포스페이타제, 고추냉이 퍼옥시다제 및 갈락토시다제)과 결합된 때 확인가능한 변화를 제공하는 화학제, 및 특이적으로 결합하는 실체의 간접 결합 매커니즘(예, 프로브가 통상적인 방법에 의해 비오틴에 바람직하게 결합되고, 상기 프로브에 형광크롬 또는 효소를 부착하기 위한 특이성을 제공하는 아비딘- 또는 스트렙타비딘-접합 형광 크롬 또는 효소에 상기 프로브가 첨가되는 비오틴-아비딘 시스템)을 포함한다.
또한, 기타 동정 표지물들이 전술한 프로브와 함께 사용될 수 있음을 알 수있다. 이러한 기타 동정 표지물로는 에너지 전달 그룹, 접합 단백질, 항체 및 항원과 같은 형광 조성물 또는 방사성 동위원소가 있다.
염색체 교잡 또는 검출은 본 발명에 따라 발생되는 DNA 프로브의 바람직한 용도이다. 본 발명에 의해 발생되는 DNA 프로브는 세포내의 상보성 핵산에 직접 교잡되거나(원위치 교잡; in situ hybridization) 또는 기질상에 고정된 핵산에 교잡될 수 있다. 바람직한 사용 방법은 미합중국 특허 제 5,985,549호, 5,447,841호, 5,756,696호, 및 5,869,237호에서 설명된 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있는 원위치 교잡 방법이다. 다음문헌(Gall 및 Pardue,Proc. Natl. Acad. Sci., 63:378-383, 1969)에서 설명된 초기의 연구에 기초하여, 1970년대에 동위원소 원위치 교잡이 확립된 다음(예를 들어, Gerhard 등,Proc. Natl. Acad. Sci., 78:3755-3759, 1981 및 Harper 등,Proc. Natl. Acad. Sci., 78:4458-4460, 1981 참조), 비동위원소 원위치 교잡(nonisotopic in situ hybridization)이 확립되었다. 다음 문헌(Knoll 및 Lichter,Current Protocol in Human Genetics,Vol. 1, Unit 4.3 (Green-Wiley, New York, 1994)) 및 미합중국 특허 제 5,985,549호에 의해 비동위원소 원위치 교잡 기술이 검토되고 염색체 교잡에서 사용하기 위한 프로토콜이 제공되었다. 이러한 기술은, 하나의 가닥이 표지 프로브 분자로부터 유도되고 또 다른 가닥이 검출될 표적물을 포함하는 이중나선(duplex) 핵산종을 형성하는 것에 기초한다. 표적 분자는 염색체 또는 세포 핵산을 포함할 수 있다. 프로브를 표지하고 이중나선을 시각화하기 위한 다수의 방법들이 개발되었다.
본 발명의 방법은 반복 서열을 함유하는 어떠한 핵산 표적물과 함께 사용하기 위한 것이다. 상기 표적 핵산 서열을 함유하는 표본은 세포핵, 형태학적으로 손상되지 않은 세포 (또는 조직), 염색체, 기타 세포 물질 성분, 또는 합성적으로 생성한 핵산으로부터 제조될 수 있다. 상기 표본은 생체검사 또는 사후(post-mortem)에 의하여 질병 또는 질환을 가지는 것으로 의심되는 포유 동물, 바람직하게는 사람의 체액 또는 조직으로부터, 또는 식물로부터 얻어질 수도 있다.
예를 들어, 염색체 제제는 하기의 방법에 따라 제조될 수 있다: 파이토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)-자극 말초 림프구를 37 ℃로 72 시간동안 10% 송아지 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 배양한다. 수확하기 1 시간 30분 전에 이티듐 브로마이드(ethidium bromide)를 첨가한다. 이티듐 브로마이드로서 배양하는 동안의 최종 20분 동안에 콜세미드(colcemid)를 첨가한다. 다음에, 세포를 원심 분리로 펠리트화하고 37 ℃로 약 20분간 0.075M KCl에서 배양한다. 다음에, 세포를 다시 펠리트화하고, 통상적인 세포유전학 방법을 이용하여 Carnoy 고정액(3:1 메탄올:아세트산 체적비)에 고정시킨다. 말초 혈액 세포로부터 염색체 제제의 검토에 대하여는, 다음문헌(Bangs 및 Donlon, Dracopoli 등 발행,Current Protocols in Human Genetics,Vol.1, Unit 4.1(Green-Wiley, New York, 1994))을 참조한다. 다음에, 현탁액중의 핵 또는 세포를 습기있는 환경에서 투명한 유리 커버슬립 또는 현미경 슬라이드상에 적가하여 염색체 확산(spreading)을 촉진시킬 수 있다. 다음에, 상기 커버슬립 또는 현미경 슬라이드는 밤새 건조된 다음, 원위치 교잡에 사용하기 위해 요구될 때 까지 숙성 또는 저장될 수 있다.
원위치 교잡 과정에서 염색체 변성 바로 전에, 상기 건조 또는 저장된 염색체 제제는 37 ℃로 30분동안 미리가온된 2 x SCC (Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989])에서 전처리된 후 일련의 에탄올(70%, 80%, 90% 및 100% 에탄올에서 각각 2분)에서 탈수될 수 있다.
표적 핵산 서열이 DNA인 경우, 표본내의 DNA는 열 또는 알칼리에 의해 변성될 수 있다. 알칼리 변성에 대하여는 다음문헌[Harper 등,Proc. Natl. Acad. Sci., 78:4458-60(1981) 및 Gall 등,Proc. Natl. Acad. Sci., 63:370-383(1969)]을 참조한다. 변성은 DNA 가닥들이 최소의 전단, 분해 또는 산화에 의하여 분리되도록 수행된다.
오늘날의 바람직한 방법에 있어서, 표지된 단일 카피 프로브는 탈이온 포름아미드에 재현탁되고 70-75℃에서 변성된다. 염색체 주형은 70% 포름아미드/2 x SSC을 함유하는 pH 7.0 용액에서 변성된 다음, 일련의 에탄올(차가운 70% 에탄올 및 실온의 80%, 90% 및 100% 에탄올에서 각각 2분)에서 탈수된다. 상기 표지된 프로브를 상응하는 주형(template)에 교잡시키는 것은 50% 포름아미드/2 x SSC/10% 덱스트란 설페이트/BSA(소 혈청 알부민, 1mg/ml 최종)를 함유하는 용액에서 몇 시간동안 내지 밤새 수행된다. 상기 교잡 시간은 프로브의 복잡성에 따라 변화한다. 교잡후, 교잡되지 않은 과량의 프로브를 세척 과정에 의해 분리한다. 얻어지는 이중나선을 일련의 15-30 분간의 세척에 의하여 처리하는데, 우선 39-45℃에서 50% 포름알데히드/2 x SSC 용액으로 처리하고, 39-45℃에서 2 x SSC 용액으로 처리한 다음, 실온에서 15-30분간 1 x SCC 용액으로 처리한다. 상기 교잡된 서열은 적절한 수단에 의하여 검출된다. 예를 들어, 디작시게닌(digoxgenin)-dUTP 등이 로다민 또는 형광색소(fluorescein) 접합 항체(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)와 같은 다작시게닌에 대한 항체에 의하여 검출될 수 있다. 검출 후, 변화하는 SSC 및 SSC/triton-X 농도로 세척하여 위조 검출 시약을 제거하고, 염색체를 DAPI와 같은 염료로 대조염색하고, 교잡된 제제를 Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA)와 같은 안티페이드(antifade) 용액에 위치시킨다. 상기 세포들을 적당한 필터 세트를 구비하는 형광 현미경으로 검사하고 전하 결합 소자(CCD)를 이용하여 이미지화한다.
본 발명의 중요한 측면은 상기 프로브 또는 표적 DNA가 정제 반복 서열과 같은 비특이적 핵산 경쟁자와의 전반응을 필요로하지 않거나, 또는 상기 프로브는 반복 서열이 없는 단일 카피이므로, 단일 카피 단편 또는 재조합 클론 프로브가 반복 서열을 함유하지 않는다는 실험적 검증(미합중국 특허 제 5,985,549호, 5,447,841호, 5,663,319호, 및 5,756,696호)을 필요로하지 않는 다는 것이다. 따라서, 신호 대 잡음비가 상당히 개선된다. 신호 대 잡음비는 표지 프로브의 비특이적 결합에 의해 발생되는 배경을 검출하는 확률에 대한, 표적 핵산 서열의 교잡의 진실한 신호를 검출하는 확률의 비로서 정의된다.
본 발명의 프로브를 이용하여 수행되는 교잡 반응 그 자체는 실제적으로 통상적인 것이다. 나타낸 바와 같이, 두 가지의 대표적인 유형의 교잡은 당업자에게 잘 알려져있는 서던 블롯(Southern blot) 및 FISH 기술이다. 그러나, 지시 패턴(indicator pattern)으로 명명되는 것으로 상기 프로브의 사용에 의해 얻어지는 시각적인 패턴은 세포유전학적 분석, 특히 분자 세포유전학적 분석을 위한 아주 유용한 도구가 된다. 이러한 지시 패턴은 정상 또는 이상 염색체의 현미경 동정 및/또는 유세포 분석 동정 및 유전자 이상의 특성화를 촉진한다. 프로브의 시각화를 위한 다수의 방법들이 이용될 수 있으므로, 프로브의 상이한 성분들의 결합 패턴이 예를 들어 색으로 구별될 수 있다. 따라서, 본 발명은 한 가지 이상의 색(다수 색상 지시 패턴) 및/또는 기타 지시 방법에 의해 시각화되는 염색체상의 어떤 원하는 지시 패턴을 시각적으로 생성할 수 있다.
본 발명의 프로브를 이용하여 얻어지는 바람직한 지시 패턴은 프로브가 결합된 표적 DNA 서열을 포함하는 게놈의 기준점을 의미하는 하나 이상의 "밴드"(band)를 포함할 수 있는데, 얻어지는 이중나선은 일부의 지시자에 의해 검출될 수 있다. 교잡 세척 및 검출 조건에 의존하여, 밴드는 하나의 영역에 신뢰할 수 있는 신호를 제공하는 서열의 좁은 배경으로부터 단일 또는 복수의 염색체상의 다수의 영역으로 연장될 수 있다. 본 발명의 프로브로부터 연장되는 이러한 지시 밴드는 전처리 및 화학적 염색에 의해 발생되는 밴드와 구별되는 것이다. 본 발명의 프로브에 의해 얻어지는 밴드는 DNA 서열들의 상보성에 따라 변화하지만, 화학적 염색에 의해 생성되는 밴드는 DNA 서열에 대한 교잡이 아니라 구조 또는 단백질 조성과 같은 염색체의 자연적 특성에 따라 변화한다. 또한, 화학적 염색 기술은 중기 염색체에 대하여만 유용하지만, 본 발명의 프로브에 의해 생성되는 프로브는 중기 및 간기 염색체 모두에 대하여 유용하다.
하기의 실시예는 게놈의 표적 DNA 서열에 교잡하기 위해 디자인되는 특이DNA 프로브의 발생, 생성, 표지 및 사용을 위해 이용되는 바람직한 방법을 설명한다. 그러나, 이러한 실시예는 예시의 목적으로 제공되는 것으로서 본 발명의 전체 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않음은 물론이다.
실시예 1
HIRA 유전자 프로브의 발생
인간의 22번 염색체에 대하여 알려진 유전 질환은 염색체 밴드 22q11.2에서 HIRA 유전자의 결손을 포함한다. 즉, 정상 개체에는 HIRA의 두 개의 카피가 있지만, 질환이 있는 개체에는 하나의 카피만이 존재한다. 이러한 결손은, 불충분한 양의 유전자 생성물(들)이 정상 배아 발생을 분열시킬 수 있으므로, DiGeorge 및 Velo-Cardio-Facial 증후군(VCFS)과 같은 반수체기능부전 증후군의 원인이 되는 것으로 판단된다 (Fibison 등,Amer. J. Hum. Genet., 46:888-95(1990); Consevage 등,Amer. J. Cardiol., 77:1023-1205(1996)). Cat Eye 증후군 및 유도 22번 염색체 증후군을 포함한 기타 증후군은 이러한 영역에서 과량의 게놈 서열에 의하여 발생된다(Mears 등,Amer. J. Hum. Genet., 55:134-142(1994); Knoll 등,Amer. J. Med. Genet., 55:221-224(1995)).
우선, 검색어 "HIRA"를 이용한 컴퓨터-지원 검색을, the National Library of Medicine 웹사이트의 Entrez Nucleotide 소프트웨어를 이용하여 수행했다. 그 결과, 유존자은행에서 HIRA 유전자에 대한 일련의 cDNA 서열을 확인했다. 3859 bp를 갖는 온길이 cDNA 서열을 선별했다(유전자은행 기탁번호 제 X81844호). 다음에, 이러한 cDNA 서열을 the National Library of Medicine의 드라프트 서열(draftsequence)을 포함하는 게놈 서열과 비교했다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&ORG=Hs). 이것은 충분한 길이의 게놈 서열이 프로브의 발생에 이용될 수 있는 지를 판단하기 위해서 수행된 것이다. 이러한 비교 결과, 전체의 HIRA 게놈 서열이 알려져있으며, 암호화 서열 간격은 염색체에서 100,836 bp의 길이에 해당함을 확인하였다. 유전자은행의 이용가능한 인접 게놈 서열은 상기 암호화 간격(coding interval)을 초과하였으므로, 5' 말단에 유전자 프로모터의 서열 및 3' 말단에 비번역 서열 및 폴리아데닐화 신호를 포함시키기 위하여 상기 암호화 영역보다 더욱 긴 간격을 선택하는 것이 가능했다. 따라서, 약 103 kb의 전체 게놈 간격이 선택되었다. 이러한 ~103 kb의 간격의 위치 1은 유전자 은행의 기탁 번호 NT 001039의 위치 798,334에 해당하는 것이다.
다음에, 상기 선택된 103kb 게놈 간격을, 시험 게놈 서열 (서열 확인 번호 1-428) 및 인간 게놈에서 존재하는 것으로 알려진 최소한 17개의 뉴클레오티드 길이(모노-, 디-, 트리-, 및 테트라뉴클레오티드 단위)의 저복잡성 직렬 반복 서열(서열 확인 번호 447-479)들의 모든 조합에 대하여 정렬되는 알려져있는 고복잡성 반복 서열의 멤버 또는 컨센서스 서열(consensus sequence)과 비교하였다. 이러한 비교는 the Genetic Information Research Institute 웹사이트인 www.girinst.org에서 확인될 수 있는 공중에게 이용가능한 CENSOR 프로그램을 이용하여 수행되었다. 이러한 프로그램은 상기 게놈 간격내의 반복 서열의 위치 및 분포를 측정하기 위하여 Smith-Waterman 포괄 정렬 비교 연산을 이용한다. 게놈 서열에 대한 반복서열의 Smith-Waterman 정렬은 하기의 파라미터에 따라 수행되었다: 마진 서열(margin sequence)의 길이: 50 nt, 삽입을 추출하기 위한 최소 길이: 12 nt, 매칭 단편(matching fragment)을 결합하기 위한 최소 마진: 30, 유사성 역치: 22, 매치(match)를 항상 유지하기 위한 유사성 역치: 35, 비율 역치: 2.8, 상대 유사성 역치: 2.8, 간격 상수(gap constant) D1: 1.90, 및 미스매치 벌칙(mismatch penalty): -1.0. 이러한 분석에 의하여, 하기의 표 1을 작성했다. 표 1은 인간 HIRA 유전자 암호화 서열에서 또는 그에 인접한 위치에서 확인되는 반복 서열 패밀리 멤버의 좌표를 열거한다.
상기 데이터로부터 비반복 서열의 길이를 계산했다. 예를 들어, 인접한 Alu-Sz와 Alu-Sx 반복 요소들의 경계를 한정하는 좌표 위치 853779와 859137 사이에서 5358 bp의 비반복 서열 간격이 측정되었다. 다음에, 상기 비반복 서열 간격을 개개의 길이에 따라 분류했다. 4개의 비반복 서열 간격, 즉 상기의 5358 bp 서열, 3847 bp 서열(좌표 819757 및 823604), 3785 bp 서열(좌표 843271 및 847056) 및 3130 bp 서열(좌표 874990 및 878120)을 프로브 발생을 위해 선별했다.
다음에, 긴 PCR 기술을 이용하여 상기 4개의 확인된 단일 카피 간격의 부분을 증폭시켰다. 5358 bp 간격을 증폭하기 위해 사용되는 기술이 아래에 상세히 설명된다. 나머지 3개의 단일 카피 간격을 증폭하기 위해 유사한 방법을 사용했다.
FISH 실험을 위해 최대 길이의 프로브가 요구되었다. 그러나, 이러한 프로브를 생성하는 PCR 반응을 최적화하기 위하여, 상기 전체의 비반복 서열 간격보다 다소 짧은 증폭 생성물을 제공하는 다른 요건들이 충족되어야 했다. 프라임 컴퓨터 프로그램을 이용하여 PCR을 위한 프라이머의 선별을 최적화했다(Genetics Computer Group 소프트웨어 패키지, Madison, WI). 긴 PCR을 위해 이용되는 상기 PCR 프라이머를 하기의 조건으로 제어하였다: 30-35개 뉴클레오티드의 길이; 50-85%의 GC 함량; 65-70℃의 융점; 상기 프라이머는 8개 이상의 뉴클레오티드 길이의 머리핀 구조를 갖는 3' 말단에서 자동결합되지 않음; 상기 프라이머는 14개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는 어떤 위치에서 자동결합되지 않음; 및 상기 프라이머는 표적 서열의 단일 위치에서만 결합하고 프라이머-프라이머 결합은 3' 말단에서는 8 bp 이하로 제한되고 어떤 다른 지점에서는 14 bp 이하로 제한됨. 그 밖에, 긴 PCR을 최적화하기 위하여 다음과 같은 특정의 조건들이 상기 증폭 PCR 생성물에 적용되었다: 5100-5358개 뉴클레오티드의 길이, 40-60%의 GC 함량, 70-95℃의 융점, 포워드 프라이머(forward primer)의 융점과 리버스 프라이머(reverse primer)의 융점 사이의 차이는 2℃임. 따라서, 517개의 포워드 프라이머 및 382개의 리버스 프라이머를 얻고, 전체 928개의 생성물을 얻었다. 상기의 조건을 이용하는 프라임 프로그램을 이용하여 프라이머 쌍들을 분류했다. 하기의 표 2에서 기재한 바와 같이 최상으로 분류되는 프라이머들을 합성을 위해 선별했다. 이러한 프라이머들은 상업적으로 제조되었다(Oligos, Etc., Wilsonville, OR).
유전자 염색체 밴드 유전자 은행 기탁 번호, 염색체 게놈 서열 최대 단일 카피 간격의 좌표, 처음/끝 포워드 PCR 프라이머 좌표, 처음/끝 리버스 PCR 프라이머 좌표, 처음/끝 PCR 프라이머 서열 확인 번호, 처음/끝 프로브 길이(bp)
HIRA 22q11.2 NT_001039 853779/859137 853946/853975 859116/859085 429/430 5170
HIRA 22q11.2 NT_001039 819757/823604 819901/819933 823592/823559 431/432 3691
HIRA 22q11.2 NT_001039 843271/847056 843602/843631 846946/846915 433/434 3344
HIRA 22q11.2 NT_001039 874990/878120 875226/875257 878074/878042 435/436 2848
이러한 프라이머를 이용하면서, 1 마이크로그램의 고분자량 게놈 DNA(페놀 추출에 의해 정제) 및 200 μM의 각각의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 긴 PCR 반응(50㎕)을 수행하여 상기 5170 bp 프로브를 증폭시켰다. 구체적으로, 고충실도 DNA 중합효소(LA-Taq, Takara Chemical Co)가 하기의 열사이클 프로토콜에 따라 사용되었다:
단계 1: 94℃에서 5분
단계 2: 98℃에서 20초
단계 3: 65℃에서 7분
단계 4: 단계 2까지 14회
단계 5: 98℃에서 20초
단계 6: 65℃에서 7분 15초
단계 7: 단계 5까지 14회
단계 8: 72℃에서 10분
단계 9: 0℃
단계 10: 종료
상기 5170 bp 프로브를 증폭시키는 것은 더욱 짧은 길이의 단편을 증폭시키는 것보다 덜 효율적이므로, 초기 PCR 반응은 다수의 교잡 실험을 위한 다량의 프로브를 생성하지 않았다. 따라서, 하기의 프로토콜을 이용하여 상기 최초의 DNA 증폭 반응의 4㎕ 분취량(aliquot)을 다시 증폭하였다: 94℃에서 1.5분간 단계 1을 수행한 후 상기 최초 PCR 반응의 단계 2-10을 수햄함. 충분한 양의 5170 bp 프로브가 얻어졌다. 상기 재증폭에 대한 대안의 방법은 단계 7을 최소한 10 사이클 이상 증가시키는 것이다.
다음에, 상기 증폭된 생성물을 겔 전기영동으로 정제한 다음, 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 우선, 상기 증폭 생성물을 1X 변형 TAE 완충액에 함유된 0.8% Seakem LE 아가로스 겔(FCB Bioproducts)상에 분리하였다. 다음에, 상기 겔을 에티듐 브로마이드로 염색하고 UV 광을 이용하여 시각화했다. 정확한 간격 크기에 해당하는 단편을 Ultrafree-DA 스핀 컬럼(Millipore)에서 절제하고 5000g으로 10분간 원심분리하였다. 상기 DNA를 용액 상태로 회수하고 -20℃로 1/10 V NaOHAc 및 2.5 V 95% EtOH(밤새)에 침전시켰다. 다음에, 상기 침전된 DNA를 원심분리하고, 차가운 70% EtOH로 세척하고, 공기 건조하고, 20㎕의 살균 탈이온수에 다시 현탁시켰다. 상기 DNA를 0.8% 아가로스 겔(Sigma)상에서 검사하여 DNA 농도를 측정하였다.
프로브 표지, 교잡, 비특이적으로 결합된 프로브의 제거 및 프로브 검출의 상세한 과정은 다음문헌(Knoll 및 Lichter, Dracopoli 등 발행,Current Protocols in Human Genetics Volume 1,Unit 4.3(Green-Wiley, New York, 1994)에서 설명되어 있다. 간단히 말해서, 프로브를 표지하기 위하여, 표지물로서 디작시게닌-11-dUTP를 이용하여 표준 틈 번역 반응을 수행했다(Rigby 등,J. Mol. Biol.,113:237-251, (1977)). 따라서, 5170 bp 프로브를 포함하는 일련의 중복되는 300-500 bp 표지된 단편을 얻었다.
다음에, -20℃에서 밤새 1/10 V NaOAc + 2.5 V 95% EtOH 및 운반체 DNA를 첨가하여 상기 표지된 단편을 침전시켰다. 다음날, 상기 침전된 DNA를 원심분리하고, 동결건조하고, 탈이온 살균수에 125ng/20㎕의 농도로 재현탁시켰다.
미합중국 특허 제 5,447,841호, 5,663,319호 및 5,756,696호에서 설명된 유형의 차단 핵산을 갖는 단편 및 이러한 핵산을 갖지 않는 단편을 이용하여 정상인의 변성된 중기 세포에 의하여 비교용 교잡을 수행했다. 다음에, 20㎕의 재현탁 및 표지된 단편을 동결건조하고 10㎕의 탈이온 포름아미드에 재현탁시키고 70-75℃로 5분간 변성시켜서 단일가닥 핵산을 제조하였다. 비교를 위하여, 10 마이크로그램의 C0t1 DNA(Life Technologies)에 125ng(또는 20㎕)의 표지된 프로브를 첨가하고 그 혼합물을 동결건조하여 프로브를 정제된 반복 DNA와 전반응시켰다. 다음에, 상기 혼합물을 70℃로 5분간 변성시킨다음 37℃로 30분간 전반응(또는 전결합)시켜서 상기 프로브내의 단일 가닥 반복 서열을 이중가닥 핵산으로 전환했다. 따라서, 상기 서열과 표적 DNA 주형으로서 염색체 사이의 교잡이 무력화된다.
다음에, 정제된 반복 DNA를 갖거나 갖지않는 변성된 프로브(즉, C0t 1)를 4 x SSC/2mg/ml 뉴클레아제없는 소 혈청 알부민/20% 덱스트란 설페이트/30% 살균 탈이온수로 구성되는 1V 예열된 교잡 용액과 혼합하고 변성 표적 DNA상에 도포하였다. 현미경 슬라이드에 고정된 염색체 표적 DNA를 50% 포름알데히드/2 x SSC에서 72℃로 2분간 변성시켰다. 상기 슬라이드상의 프로브 교잡 혼합물 위에 커버슬립(coverslip)을 위치시키고, 네일 폴리쉬 에나멜(nail polish enamel)로 밀봉하여 증발을 방지하고 39℃로 밤새 모이스트 챔버에 위치시켰다.
교잡후, 비특이적으로 결합되는 프로브를, 염 농도 및 온도를 변화시키면서 세척하였다. 반복 서열 교잡이 무력화되도록 전반응한 표지된 프로브 및 이러한 전반응(pre-reaction)을 받지 않은 프로브를 디작시노겐-11-dUPT에 대한 로다민-표지 항체를 이용하여, 통상적인 FISH 프로토콜에 따라 검출하였다(Knoll 및 Lichter,Current Protocol in Human Genetics,Vol. 1, Unit 4.3, Green-Wiley, New York, 1994). 염색체 DNA를 DAPI로 대조염색하였다. 다음에, 상기 현미경 슬라이드 상의 세포 제제를 안티페이드 용액(antifade solution)(예, Vectashield, Vector Laboratories, Burlingame, CA)에 위치시키고 적당한 형광 필터 세트를 갖는 형광 현미경을 이용하여 시각적으로 검사했다. 도 1 및 도 2는 이러한 비교 교잡을 예시하는 사진인데, 도 1은 차단 반복 서열을 이용한 교잡을 나타내는 반면에, 도 2는 정제된 반복 DNA와 전반응시키지 않은 교잡을 나타내는 것이다. 이러한 사진은 두 개의 정상 염색체 22a11.2 영역 상의 두개의 대립유전자들에 대한 교잡을 도시한다. 상기 사진들을 비교하면, 본 발명의 프로브를 이용하는 경우 차단 반복 서열이 존재할 필요가 없다는 것이 입증된다.
표 2에서 확인되는 나머지 3개의 프로브들을 하기와 같이 PCR-증폭 및 표지하였다. 이러한 프로브들을 일련의 FISH 실험에 사용하여 프로브의 효능을 측정했다. 따라서, 4개의 모든 프로브들은 반복 서열의 전결합(pre-annealing)이 없이 사용하였고(도 6), 상기 3개의 짧은 프로브들의 조합은 예전에 확인된 결손이 있는 DiGeorge/VCFS 환자의 세포에 사용하였다(도 12). 도 6의 사진에서, 프로브는 화살표로 도시한 바와 같이 정상 개체의 22s번 염색체의 단일 영역에 교잡되었다. 도 12에서, 화살표로 도시한 바와 같이 프로브는 단지 하나의 22번 염색체에만 교잡반응하였다. 별모양으로 나타낸 바와 같이 다른 22번 염색체는 이러한 영역의 결손을 가지므로 프로브에 교잡반응하지 않는다.
실시예 2
NECDIN 및 CDC2L1 유전자 프로브의 발생
실시예 1에서 설명한 기술을 이용하여 1번 염색체에 관하여 알려진 유전 질환(Monosomy 1p36.3 증후군; Slavotinek 등,J. Med. Genet.36:657-63(1999)) 및 15번 염색체에 관한 유전 질환(Prader-Willi 또는 Angelman 증후군)을 검출하기 위한 일련의 프로브를 발생했다. Prader-Willi 또는 Angelman 증후군을 갖는 환자의 약 70%는 NECDIN 유전자를 함유하는 서열의 접합성 결손(hemizygous deletion)을 나타낸다(Knoll 등,Amer. J. Med. Genet., 32:285-290(1989); Nicholls 등,Amer. J. Med. Genet., 33:66-77(1989)). 이러한 유전자의 과량의 카피가 존재하는 것은 간질성 중복(interstitial duplication) 또는 과잉의 유도 또는 이중심절 15번 염색체를 갖는 환자의 비정상 표현형의 특징 증상이다(Cheng 등,Amer. J. Hum. Genet., 55:753-759(1994); Repetto 등,Am. J. Med. Genet., 79:82-89(1998)).하기의 표 3은 추정된 단일 카피 간격, PCR 프라이머 좌표, 서열 확인 번호, 및 얻어지는 프로브의 길이를 나타낸다.
유전자 염색체밴드 유전자운행 기탁번호, 염색체 게놈 서열 최대 단일 카피 간격의 좌표, 처음/끝 포워드 PCR 프라이머 좌표, 처음/끝 리버스 PCR 프라이머 좌표, 처음/끝 PCR 프라이머 서열 확인 번호, 포워드/리버스 프로브 길이(BP)
CDCL11 1p36.3 AL031282 8823/17757 9137/9167 13960/13931 444/443 4823
CDCL11 1p36.3 AL031282 8823/17757 13028/13057 17752/17720 445/446 4724
NECDIN 15q11-q13 AC006596 94498/99152 94501/94535 98567/98601 439/440 4166
NECDIN 15q11-q13 AC006596 68031/75948 72122/72156 75666/75637 437/438 3544
NECDIN 15q11-q13 AC006596 76249/79221 76608/76639 78898/78867 441/442 2290
1전체 간격에 걸쳐서 연장되는 두 개의 PCR 프로브 단편을 생성하기 위해 두 조의 프라이머를 사용했음.
표 3의 CDC2L1 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하고, 그 생성물을 실시예 1에서 기재한 바와 같이 표지, 교잡 및 검출하였다. 상기 표지된 프로브를 일련의 FISH 실험에 사용하여 도 7 내지 도 10의 교잡 이미지를 얻었다. 도 7에서 도시한 실험에서, 가장 긴 4823 bp 프로브를 이용하였고, 정제된 반복 DNA를 전결합(pre-annealing)시켜 교잡 반복 서열을 무력화시켰다. 비교를 위하여, 정제된 반복 DNA를 전결합시키지 않은 동일한 프로브를 사용했다(도 8). 교잡 결과, 반복 서열 교잡을 차단하기 위한 정제된 DNA가 존재할 필요가 없음이 입증되었다. 둘 모두의 경우에 있어서, 교잡된 하나 또는 두 개의 염색 분체를 갖는 염색체는 화살표로 도시된다. 도 9 및 도 10에서 나타낸 실험에 있어서, 정제된 반복 DNA를 전결합시키거나(도 9) 또는 전결합시키지 않은(도 10) 4823 bp 및 4724 bp 프로브를 사용했다. 다시, 본 발명의 프로브를 이용하면 상기 정제된 반복 DNA를 전반응(pre-reaction)시킬 필요가 없다는 것이 확인되었다.
또한, NECDIN 프로브를 도 3 내지 도 5 및 도 11에서 도시한 바와 같은 일련의 FISH 실험에 사용하였다. 이러한 프로브는 NECDIN 유전자의 36 및 62 kb 말단 사이의 DNA 유전자를 검출했다. 3544 bp 프로브(서열 확인 번호 437-438)는 MAGEL2 유전자의 3' 말단을 검출했다. 도 3에서, 3544 bp 프로브를 정제된 반복 서열을 이용하여 전결합시키면서 정상 개체의 중기 세포에 사용하였으며, 도 4는 전결합이 없는 비교도이다. 도 11에서, 하나의 15번 염색체의 15q11-q13 서열이 결손되어 있는 것으로 알려진 Prader-Willi 증후군을 갖는 환자의 중기 세포에 모든 3개의 프로브들을 조합으로 사용하였다. 상기 정상 동족체는 화살표로 도시되며 단일 염색분체에 대한 교잡 반응을 나타낸다. 검출된 염색체의 위치는 별모양으로 도시된다. 이것은 프로브와의 교잡 반응을 나타내지 않는다.
전술한 예들은 DNA 단편들의 혼합된 조합이 개별적으로 사용되는 단편과 동일한 교잡 결과를 제공한다는 것을 입증한다. 따라서, 개별적으로 또는 조합으로 사용되는 단편들중 어느 것도 게놈의 어떤 다른 위치에 교잡하지 않으므로 반복 서열을 갖지 않는다는 것이 확증된다. 또한, 단일 카피 게놈 프로브를 디자인 및 생성하기 위한 본 발명의 유효성이 추가적으로 확인된다.
오늘날, 상업용 및 연구용 게놈 프로브를 이용하여 상기 질환을 검출하는데 있어서는 상기 프로브를 중기 또는 간기 염색체에 결합하기 전에 반복 서열의 교잡을 무력화시킬 필요가 있다. 따라서, 프로토콜을 수행하는데 요구되는 단계들의 수가 증가되고, 임상 진단 실험에 허용될 수 없는 절차상의 에러가 발생할 수 있는 가능성이 증가될 수 있다. 도 7의 결과는 이러한 이상을 검출하기 위한 관련있는 상업적으로 이용가능한 게놈 프로브를 이용하여 얻은 결과와 비교되는 것이다. 따라서, 도 7의 프로브는 상기 유전 질환을 검출하는데 유용하게 된다. 이러한 프로브 그 자체 또는 교잡 또는 검출에 필요한 기타 방법과의 조합은 이러한 유전 질환의 검출을 위한 키트(kit)로서 임상 실험에 제공될 수 있다.
또한, 본원에서 예로서 제시한 것들 이외의 게놈 서열로부터 발생된 프로브는 유전성, 산발성, 또는 후천성 염색체 재배열을 검출하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 재배열은 위에서 나타낸 예들 외에도 다수의 다른 알려진 유전 이상(신생물 포함) 및 증후군에 해당하게 되는 것이다. 따라서, 본 발명은 상업적인 프로브가 이용될 수 없거나 또는 부정확한 경우 게놈 유전자로부터 프로브를 생성하기 위해 사용될 수도 있다.
원칙적으로, 본 발명의 방법은 DNA 서열이 이용될 수 없고 게놈의 반복 서열 요소들의 포괄적인 세트가 목록에 분류되어진 경우 어떤 게놈 간격에 대한 단일 카피 프로브를 디자인, 발생 및 생성하기 위해 이용될 수 있다. 오늘날, 하기의 유기체 게놈 목록이 이용될 수 있다(http://www.girinst.org): 인간(homo sapiens), 생쥐(Mus musculus), 애기장대(Arabidopsis thaliana), 꼬마선충(Caenorhabditis elegans), 초파리(Drosophila melanogaster), 및 제브라피쉬(Danio rerio).
실시예 3
이 실시예에서는, 본 발명의 원리를 이용하여, 추가의 유전 질환 및 세포유전학적 이상에 대하여 특이적인 다수의 프로브들을 발생하였다. 또한, 단일 카피 프로브를 디자인하기 위한 공정을 촉진하기 위하여 소프트웨어를 개발 및 개량하였다(위에서 나타내고 첨부한 CD-R에 제공되어 있는 것으로, findi.pl, prim_wkg, 및 prim). 다음에, 상기 프로브를 시험하고 그 유용성을 원위치 교잡에 의해 확인했다.
단일 카피 서열의 확인
단일 카피 프로브 서열의 위치는 길고 인접한 게놈 DNA 서열로부터 직접 측정된다. 상기 위치는 반복 서열 패밀리 멤버를 표적 게놈 서열과 정렬시키는 소프트웨어에 의해 측정된다. 표적 서열을 반복 패밀리 멤버의 미리 측정된 서열과 비교함으로써 표적내에서 반복 서열의 경계를 확인 및 한정했다. 컴퓨터 프로그램, 즉 RepeatMasker (http://ftp.genome.washing-ton.edu/RM/RepeatMasker.html; Smit A.F.A.&Green P., 결과는 공개하지 않음)를 이용하여, 일반적으로 ~100 kb 길이의 인접한 게놈 서열들의 반복 서열 패밀리의 위치를 측정하였다. RepeatMasker는 게놈 서열을 인간 게놈에서 다수의 카피로 존재하는 반복 서열 패밀리의 편집물과 비교한다(http://www.girinst.org/~server/repbase.html). 이러한 반복 서열 데이터베이스는 대부분의 인간 반복 서열 패밀리의 대표적이고 인접한 서열들을 함유한다. 상기 데이터베이스는 실시예 6에서 나타낸 바와 같이 새로이 발견되는 반복 서열 패밀리를 추가함으로써 확장될 수 있다.
Perl 스크립트(findi.pl)는 RepeatMasker 출력으로부터 반복 절편의 경계의좌표를 분석한 다음, 인접 단일 카피 간격을 파라미터 역치(대부분의 경우 ~2kb) 이상의 크기로 추정 및 분류하였다. 이러한 스크립트는 반복 패밀리 요소의 위치 및 길이의 테이블을 함유하는 RepeatMasker에 의해 생성되는 출력 파일의 크기에 따라 분류되는 단일 카피 간격의 위치 및 길이를 측정한다. 인접한 단일 카피 간격들의 경계는 반복 서열 요소의 상류 경계로부터 하나의 뉴클레오티드 위치를 공제하고 상기 요소의 하류 경계에 하나의 뉴클레오티드 위치를 추가함으로써 추정되었다. 동일한 상류 및 하류 좌표를 갖는 단일 카피 간격(1 bp 길이)들은 인접한 반복 서열들인 것으로 간주되었다. 다음에, 중복물 또는 삼중복물 또는 기타 덜 보존된 간격들과 같은 게놈내의 다른 장소의 서열에 대한 유사성이 있는 지를 측정하기 위하여, 프로브 서열을 인간 게놈 서열 데이터베이스(Altschul 등,J. Miol. Biol., 215:403-410(1990))와 비교하였다. 게놈의 다른 장소에서 약하게 보존되는 프로브 서열은 상기 표적 서열에 교잡되지 않는다.
최장 단일 카피 간격들의 PCR 증폭을 위하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 선택했다. Unix 래퍼 스크립트(prim_wkg)는 프라이머(prim)를 디자인하기 위한 명령을 함유하는 파일의 스위치를 반복적으로 변형시킴으로써, 프로그램, 즉 Prime (Genetics Computer Group; Madison, WI)에의 입력을 위한 하기의 파라미터를 변화시켜서 프라이머의 선별을 최적화한다: Tm: 70-60℃, G/C 조성: 55-40%, 및 최소 간격 길이: 단일 카피 간격 길이의 90-80%.
프로브 발생 및 염색체의 원위치 교잡
제조자(Panvera, Madison, WI)에 의해 추천된 바와 같이 LA-Taq를 이용한 긴 PCR (Cheng 등,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,91:5695-5699(1994))에 의하여 DNA 단편을 증폭하였다. 긴 PCR을 위한 다른 효소는 인디에나주 Indianapolis에 소재한 Roche Molecular Biochemicals, 캘리포니아주 LaJolla에 소재한 Stratagene, 및 캘리포니아주 Carlsbad에 소재한 Invitrogen에 의해 제조되는 것을을 포함한 비교가능한 결과를 나타내는 것으로 입증되었다. 상기 증폭 산물(amplicon)을 저융점 아기로스 겔 전기영동에 의해 정제한 다음, Micro-con 100 칼럼(Millopore, Bedford, CA)를 이용하여 크로마토그래피 정제하여, 반복 서열을 함유하는 오염 연장 산물을 제거하였다.
디작시노겐-dUTP 또는 비오틴-dUTP(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)와 같은 변형된 뉴클레오티드를 이용하여 프로브 단편을 틈 번역하여 표지하였다. C0t1 DNA와 같은 반복 DNA와 프로브(들)의 결합반응(annealing)이 평행한 세트의 교잡에 이용되지 않는다는 것을 제외하고, 이전에 설명한 조건(Knoll 및 Lichter,Current Protocols in Human Genetics,Vol. 1, Unit 4.3, Green-Wiley, New York(1994))을 이용하여, 상기 표지된 프로브를 변성시키고 현미경 슬라이드상의 고정된 염색체 제제에 교잡시켰다. ~100 kb의 단일 염색체 영역의 프로브를 개별적으로 또는 조합으로 교잡하여 비특이적 결합을 제거했다. 교잡후, 2xSSC의 50%포름알데히드에서 42℃로 세척을 수행한 다음, 39℃로 2xSSC에서 한번, 그리고 실온으로 1xSSC에서 한번 세척을 수행했다. 필요한 경우 세척을 증가시켜서 게놈내의 다른 장소의 관련된 서열에 대한 프로브의 교잡을 제거하였다. 변형된 뉴클레오티드에 대한 형광크롬(예, 로다민 또는 플루오르세인) 표지 항체를 이용하여, 교잡된 프로브를 검출하였다. 상기 세포 DNA를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 대조염색(counterstaining)하여 염색체 동정을 수행했다. 모터 구동 다중-여기 형광크롬 필터 바퀴를 구비한 형광 현미경(Olympus, Melville, NY)을 이용하여, 교잡된 염색체를 검사했다. C0t1 DNA에 결합되거나 결합되지 않은 각각의 프로브 또는 프로브들의 조합마다, 최소한 20개의 중기 세포 및 50-100 개 핵산의 교잡 패턴을 기록했다. CCD 카메라(Cohu, Inc. San Diego, CA) 및 CytoVision ChromoFluor 소프트웨어(Applied Imaging, Santa Clare, CA)를 이용하여 세포들을 이미지화했다.
하기의 표 4는 알려진 질환 및 세포유전학적 이상에 대한 다수의 프로브들에 관하여, 전술한 과정을 이용하여 얻은 데이터를 기재한다. 이상의 지칭을 위하여, ISCN 1995(An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (1995), Mittleman F 발행)에 기재된 표준 학명이 사용된다.
실시예 4
이 실시예에서는, 본 발명의 프로브를 이용하여 염색체 절단점을 더욱 정밀하게 측정했다. 구조적 염색체 재배열은 특정의 암의 경우에서와 같이 유전 질환이거나 또는 후천적일 수 있다. 이러한 재배열은 역위, 결손 또는 중복과 같이 단일 염색체에서 발생할 수 있거나 또는 전위와 같이 상동 또는 비상동 염색체들의 사이에서 발생할 수 있다. 본 발명의 프로브를 이용하면, 정확한 절단 영역을 전례가없는 분해능 수준으로 측정할 수 있다. 이러한 분해능에 의하여, 재배열의 형성시에 분열되는 유전자 또는 세포의 검출이 가능하게 됨으로써 병인, 예후 및/또는 치료의 통찰이 제공될 수 있다. 유전적인 인접한 유전자 증후군에 있어서, 염색체 절단점의 정밀한 국소화에 의하여 결손 또는 중복의 정도를 한정할 수 있고 따라서 그 질환의 예후를 한정할 수 있다(Cheng 등,Am. J. Hum. Genet.,55:753-759(1994)).
하기의 실시예에서는, 본 발명의 단일 카피 프로브가 동일 염색체 영역에 대하여 상업적으로 이용가능한 클론 프로브보다 더욱 정밀한 정보를 어떻게 제공하는 지를 예시한다.
대부분 경우의 만성 성인 골수성 백혈병(CML;90%) 및 일부 경우의 급성 임파구성 백혈병(ALL; 25-30% 성인; 2-10% 어린이)(Perkins 등,Cancer Genet. Cytogenet., 96(1):64-80(1997); Rubintz 등,J. Pediatr. Hematol. Oncol., 20(1):1-11(1998))에서는, 9q34 와 22q11.2 염색체 사이의 상호적인 전위가 나타난다(Rowley,Nature, 243:290-392(1973)). 이러한 전위로부터 얻어지는 비정상 또는 유도 22번 염색체는 9번 염색체상의 ABL1 암유전자를 22번 염색체상의BCR(breakage cluster region) 프로모터상에 융합시킨다. 상기 ABL1 암유전자는 선택적으로 접합된 제1 엑손, 공통 엑손 2-11에 접합된 엑손 1b 및 1a를 갖는 6 kb 또는 7kb mRNA 전사체로서 발현된다. 엑손 1b는 엑손 1a 의 ~250 kb 근위부이고 이러한 매우 긴 인트론은 전위를 위한 주요 표적이다. CML에 있어서, 상기 ABL1 유전자는 9번 염색체로부터 22번 염색체상의 BCR 유전자의 프로모터로 전위함으로써 키메릭 BCR-ABL1 단백질이 생성된다(Bernards 등,Mol.Cell.Biol., 7:3231-3236(1987)). 상기 BCR 절단점은 CML 및 ALL에서 차이가 있다. CML에서, 대부분의 절단점은 엑손12-17에 대응하는 5.8 kb 주절단점 클러스터 영역(M-BCR)에서 발생하는 반면에, 대부분의 ALL 에서, BCR 유전자는 엑손 1 및 2(부 또는 m-BCR)사이에서 절단된다. 따라서, 상이한 크기의 단백질을 생성하는 상이한 분자 재배열이 각각의 질환마다 발생한다. 이러한 재배열은 본 발명의 프로브에 의해 구별될 수 있다.
DNA 수준에서, 이중 색상-이중 프로브 형광 원위치 교잡(FISH) 전략을 이용하여, 중기 염색체 및 간기 핵의 BCR-ABL1 전위를 검출할 수 있다(Bentz 등,Blood, 83:1922-1928(1994); Sinclair 등,Blood, 90:1395-1402(1997); Buno 등,Blood, 92:2315-2321(1998). 통상적인 FISH에 있어서, 초기 전략은 하나의 색(즉, 적색)으로 검출되는 ABL1 암세포 영역(절단점의 말단 및 ~200 kb 크기) 및 또 다른 색(즉, 녹색)으로 검출되는 BCR 영역(절단점의 근위부)을 위한 프로브를 제공하는 것이었다. 따라서, 유도 22번 염색체의 양성 세포에서, 적색 및 녹색 신호는 유도 22번 염색체의 존재를 나타내는 황색 교잡 신호를 제공하도록 공동으로 국소화되는반면에, 정상의 9번 염색체 및 22번 염색체는 독립적인 적색 및 녹색 신호로서 유지되었다. 더욱 최근에, ABL1 전위 전달점의 양측면에 걸쳐서 연장되는 더욱 큰 클론 DNA 프로브가 전위의 검출에 이용되었다. 이러한 전략에 있어서, 절단점에 근접하는 프로브의 부분은 이상 9번 염색체에 남아있고 절단점의 말단 부분은 예전의 전략과 같이 BCR과 공동으로 국소화된다. 따라서, 전위된 9번 염색체상에서 과잉 신호(ES)가 얻어지므로, 많은 임상 세포유전학적 실험에서 사용되는 BCR-ABL1 ES 이중 컬러 전위 프로브(Vysis, Inc., Downers Grove, IL)보다 열등한 전략이다(Herens 등,Br. J. Haem., 110(1):214-216(2000); Sinclair 등,Blood, 95(3):738-744(2000)). 상기 ES 시스템에 있어서, ABL1 프로브 칵테일은 ABL1 유전자보다 상당히 더 긴 게놈 표적에 걸쳐서 연장되어 있다. 이러한 칵테일은 ABL1 유전자의 ~250 kb 상류인 아르기노숙신에이트 신테아제 유전자(ASS)로부터 ABL1 유전자 및 몇 kb 하류를 통해 연장되어 있다.
ABL1 및 BCR에서 단일 카피 간격의 경계를 확인함으로써 상기 위치들에 대한 몇 개의 단일 카피 프로브들을 디자인했다. 도 13 및 도 14는 상기 BCR 및 ABL1 내에서 단일 카피 프로브의 위치를 각각 나타낸다. 2kb 길이를 초과하는 11개의 간격들이 상기 BCR 유전자를 통해 분포되어 있으며, 이중 5개는 오늘날 프로브로서 디자인되었다. 이러한 유전자에서 유사한 수의 더욱 짧은 추가의 단일 카피 영역(1.5 내지 2.0 kb)들이 결합됨으로써 전위 절단점을 더욱 정밀하게 한정할 수 있었다. ABL1 유전자에 있어서, 2kb를 초과하는 10개의 간격들이 확인되었는데, 이중 6개가 프로브로서 디자인되었다.
BCR(도 13) 및 ABL1(도 14) 모두에 대한 다수의 단일 카피 프로브들이 추정되었으며 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트들이 유도되었다. BCR의 경우, 상기 프로브들은 주절단점(도 13 및 서열확인번호 510-515)으로부터 부절단점(도 13)을 구별시킨다. BCR-ABL1 ES 프로브를 이용하는 통상적인 FISH 시험은 BCR 유전자에서 주(M) 절단점의 재배열로부터 부(m) 절단점의 재배열을 구별시키지 않는다. m-BCR 프로브들의 혼합물은 ALL을 갖는 환자에서 흔히 확인되는 부절단점을 검출하고, M-BCR(서열확인번호 510-515)로 지칭되는 것들은 CML을 갖는 대부분의 환자에서 확인되는 주절단점을 검출한다. 상기 모든 프로브들이 9번 염색체로 전위하는 경우, 상기 유전자는 부절단점(minor breakpoint)에서 저지된다. M-BCR 프로브만이 22번 염색체에서 유도 9번 염색체로 전위하고 m-BCR 프로브가 22번 유도 염색체에 계속 남아있는 경우, 상기 유전자는 주절단점에서 저지된다.
ABL1의 경우, 두 개의 프로브들이 절단점의 근접부(서열 확인 번호 516/517 및 518/519)인 것으로 추정되며, 다른 것들은 절단점의 말단부(서열 확인 번호 520-531)인 것으로 추정된다. CML에서 절단점의 말단부에 3개의 ABL1 프로브를 교잡한 결과, 상기 프로브들은 22번 염색체로 이동한 반면에(도 15), 절단 간격(breakage interval)에 걸쳐서 연장되는 4개의 ABL1 프로브들의 조합은 유도 9번 염색체상에 그대로 남아있는 한편 다른 것들은 유도 22번 염색체로 이동하였다(도 16). 이러한 결과 및 상기 프로브들의 위치에 기초하면, 절단점 간격은 도 14의 11004 bp 위치 내지 65951 bp 위치에 걸쳐서 연장되는 것으로 추정될 수 있다. 서열 확인 번호 519 및 520 사이의 단일 카피 간격의 프로브를 교잡함으로써 절단영역이 더욱 정밀하게 구별될 수 있음은 당업자에 명백한 것이다. 다음에, 구별된 절단 영역의 게놈 서열로부터 절단점에서의 정확한 위치를 측정할 수 있다.
상업적으로 이용가능한 ES 프로브를 이용하는 최근의 연구 결과(Herens등, Br.J.Haem., 110:214-216(2000), ~10%의 CML 환자는 ABL1 유전자의 상류에서 서열의 결손이 있기 때문에 유도 9번 염색체에서 과잉 교잡 신호를 나타내지 않는 것으로 입증되었다. 일부의 경우, 이러한 결손은 ASS 유전자까지 연장되며, 또한 이러한 결손은 급성기(blast crisis)와 같은 불충분한 나쁜 예후와 관련이 있다. ~100-200 kb의 더욱 짧은 프로브가 교잡되는때 CML 환자의 1/3 이하에서 결손 검출 속도가 증가되는 것에 의해 입증되는 바와 같이, 상기의 큰 FISH 프로브는 ASS와 ABL1 영역 사이의 간질성 결손을 검출하는데 유용하지 않다(Sinclair 등,Blood, 95(3):738-744(2000)). 일부의 환자는 유도 또는 전위 9번 염색체에서 ABL1 절단점에 근접한 서열이 결손되어 있으므로, 단일 카피 프로브는 이러한 염색체 영역에서의 접합성(hemizygosity) 정도를 나타내기 위하여 사용된다. 결손 절단점과 임상 결과의 관계에 의하여, 이러한 염색체 간격에서 특이 유전자의 상실이 급성기와 같은 임상 발견을 위한 예후가 되는 지를 판단할 수 있다.
실시예 5
이 실시예는 중복 게놈 영역의 프로브 서열에 의하여 교잡 신호의 증가가 발생될 수 있음을 입증한다. 이전에 설명한 것과 아주 유사한 중복물 또는 삼중북물의 일부인 몇 개의 단일 카피 프로브 서열들을 디자인했다.
급성 골수성 백혈병-Type M4의 전위 절단점에 근접하는 것으로 16p13.1 염색체로부터 얻은 몇 개의 프로브(서열 확인 번호 536-543)는 이러한 영역에서 거의 완전한 삼중복에 해당하는 서열들을 함유한다. 게놈 드라프트 서열에 있어서, 이러한 영역들중 두개는 프로브 서열들을 40kb로 분리하면서 직렬로 배열되고, 제3의 말단 간격은 1.2mb로 분리된다. 상기 세 간격 서열들은 단지 ~1.5% 정도로 차이가 있다. 이러한 프로브를 이용하여 교잡한 결과, 두 개의 모여졌지만 명백히 분리가능한 신호들이 얻어졌다. 하나의 교잡은 제 1 및 제 2의 결합된 파라로그(paralog)에 해당하며 또 다른 교잡은 이러한 서열의 제3 카피에 해당하는 것이다.
Smith-Magenis 증후군에서 일반적으로 검출되는 17p11.2 염색체의 프로브(서열 확인 번호 586-587)는 거의 완전한 삼중복물을 함유했다. 이러한 프로브는 SHMT1 유전자의 IVS4에서 단일 카피 서열내의 결손을 검출하기 위한 것이다. 그러나, SMHT1 서열과 99.8% 동일성을 나타내는 것으로, ~15kb로 분리되는 두 개의 파라로거스 서열(paralogous sequence)들이, 이러한 질환을 갖는 환자에서 일반적으로 검출되는 유전자 간격내의 ~2.7mb 중심립 ZNF 127 유전자와 PAIP1 유전자 사이의 게놈 드라프트에서도 검출되었다. 17번 염색체에 대한 상기 서열들의 근접성 때문에, 단일 교잡 위치가 관찰되었다.
다운 증후군 임계 영역의 두 개의 프로브(서열 확인 번호 504/505-508/509)을 80kb 이상의 길이를 갖는 동일한 크기의 중복물에 각각 삽입하였다. 이러한 중복 서열들은 1.1mb로 분리되고, 염색체 밴드 21q22.2의 중심부 및 말단부에 각각 존재한다. 상기 중복 서열들을 1.1mb로 분리하였음에도 불구하고, 각각의 프로브를 이용하여 21번 염색체 영역에서 단일 교잡 신호를 검출하였다. 따라서, 17p11.2 염색체와 마찬가지로 21번 염색체 영역은 16p13.1의 서열 보다는 중기 염색체에 더욱 집중되는 것으로 판단되는데, 유사한 간격으로 분리되는 중복 서열들이 구별될 수 있었다.
이러한 영역으로부터 발생된 단일 카피 프로브는 알려진 반복 서열 요소를 갖지 않음은 물론이다. 그러나, 각각의 카피 프로브는 대부분의 교잡 세척 조건하에서도 계속 교잡된 상태로 유지되므로 상기 프로브는 모든 파라로거스 카피에 일반적으로 교잡된다. 염색체상에 다수의 타이트하게 밀집된 부위들이 특정의 간격으로 교잡되므로, 이러한 교잡으로부터 얻어지는 신호는 반수성 게놈당 한번 나타나는 비교가능한 프로브 서열로부터 예상되는 것과 비교하여 더욱 명백한 것이다. 따라서, 이러한 게놈 중복물 또는 삼중복물은 프로브의 유효 표적 크기를 증가시킨다. 따라서, 이러한 영역으로부터 발생되는 더욱 짧은 프로브들은 더욱 긴 프로브에 의해 발생되는 것과 비교될 수 있는 세기의 교잡 신호를 제공한다는 것을 알 수 있다. 중복 게놈 영역으로부터 더욱 짧은 프로브를 선택하는 것은 긴 단일 카피 간격이 나타나는 게놈 영역에 대한 프로브를 개발하는데 특히 유용하게 된다.
실시예 6
정밀한 드라프트 인간 게놈 서열의 이용성이 증가함에 따라, 예전에는 접근하기 어려웠던 많은 염색체 영역에 대한 본 발명의 단일 카피 프로브의 개발이 촉진되었다. 오늘날 대부분의 포괄적인 최신 서열 데이터베이스는 상기 드라프트 서열에 존재하는 반복 요소를 검출하기 위해 사용되어왔지만(http://www.girinst.org/repbase), 단일 카피 프로브를 중기 염색체에 교잡한 결과 몇 개의 프로브는 예전에 알려지지 않은 반복 서열들을 함유한다는 것이 입증되었다. 이것은 지도작성되는 것으로 알려진 상동 염색체 밴드 및 드라프트 게놈 서열에서 확인되지 않은 다른 위치에 대한 프로브의 교잡을 기록함으로써 확인되었다.
상기 드라프트 게놈 서열은 불완전한 것인데, 진정염색질형(euchromatic) 게놈의 ~90%가 서열분석되었다(International Genome Sequencing Consortium, Initial Sequencing and Analysis of the Human Genome,Nature, 409:860-922(2001)). 결손 서열들의 사이에 존재하는 것들과 같은 일부의 반복 서열 패밀리는 검출되지 않은 것으로 판단되었다. 알려져있는 반복 서열들의 스크리닝에도 불구하고, 몇 개의 진정염색질형 단일 카피 프로브는, 동원체 염색체(13번, 14번, 15번, 21번, 및 22번 염색체)의 짧은 팔(arm)의 다수의 카피에서 주로 확인되는 반복 서열 패밀리의 상동체를 함유하는 것으로 보인다. 이러한 프로브들은 21번 염색체의 다운 증후군 임계 영역으로부터 유도되는 세 개의 서열(서열 확인 번호 504/505, 506/507, 및 508/509로 증폭됨), 급성 골수성 백혈병-Type M4의 염색체 역위 부위에 놓여지는 16p13.1 염색체로부터 유도되는 두 개의 서열(서열 확인 번호 536/537 및 538/539로서 증폭됨)를 함유했다.
핵소체 형성체 영역(nucleolar organizer region)으로 명명되는 이러한 염색체 영역들은 직렬로 길게 절렬하여 배열되는 리보솜 RNA 시스트론의 수천 개의 카피들을 함유하는 것으로 알려져있다(Sylvester 등,Hum. Genet., 73:193-8(1986)).인간 게놈의 드라프트 게놈 서열은 이러한 염색체 영역들의 컨티규어스 서열(contiguous sequence)들이 결여되어 있다. 국제 서열분석 협회(International Sequencing Consortium)는 이러한 직렬 반복 서열(예, 이질염색질)을 함유하는 클론의 서열의 어떤 어셈블리는 모호하여 신뢰할 수 없으므로 상기의 클론을 초기의 서열 분석을 위한 고려에서 제외하였다. 리보솜 RNA 유전자로부터 구별되지만 그 유전자와 함께 공동으로 국소화되는 다른 서열들이 상기 염색체의 핵소체 형성체 영역에서 직렬로 배열될 수도 있다. 이러한 간격의 서열 정보가 없기 때문에, 예전에는 게놈내의 다른 장소의 서열에 관계되는 것들 내에서 서열들의 분포를 알 수 없었다. 이러한 프로브를 이용하여 단일 카피 FISH를 실시한 결과, 예상된 진정염색질형 간격으로의 국소화가 입증되었지만, 몇 개의 동원체 염색체의 짧은 팔에 대한 상당한 추가적인 교잡이 확인되었다. 교잡 전에 C0t1 DNA를 첨가하면 상기 반복 서열에 대한 교잡이 제거되었다. 이러한 추가적인 신호는 동원체 염색체의 짧은 팔의 프로브에 관계되는 서열들의 직렬 배열된 다수의 카피와 일치하는 것이다.
그 밖에, RepeatMaster 소프트웨어를 이용하여 단일 카피 프로브들을 반복 서열에 대하여 여과하였음에도 불구하고, 산재된 반복 서열에 대한 단일 카피 프로브의 교잡이 검출되었다. Smith-Magenis 증후군에서 일반적으로 결손되는 간격내의 17p11.2 염색체에 대한 하나의 프로브(서열 확인 번호 586/587로서 증폭됨)는 산재된 반복서열과 교잡하는 것으로 확인되었다. 또한, 9p34 염색체의 전위 절단점에 근접하는 서열(서열 확인 번호 518/519 및 526/527로서 증폭됨)은 이러한 프로브들의 조합과 상기 영역의 또 다른 프로브의 교잡에 따라, 산재된 반복 서열을 함유할 수 있다. 이러한 프로브에 대하여 지도작성된 위치의 교잡 신호는 교잡 서열에 대하여 관찰된 신호보다 강하지 않으며, 상기 교잡 서열은 세척 과정의 증가에 따라 제거되지 않았다. 따라서, 상기 프로브는 공지된 산재 반복 단위들의 아주 발산적인 카피가 아니라 예전에 인식하지 못한 반복 서열 패밀리를 함유한다는 것을 알 수 있다.
이러한 모든 프로브들은 예전에 인식하지못한 반복 서열 패밀리 멤버를 함유하는 것으로 판단되지만, 상기 프로브 그 자체는 단일 카피 및 반복 서열 모두로 이루어질 수 있다. 각각의 프로브 서열의 상이한 PCR-발생 아형(subset)을 염색체 DNA에 반복적으로 교잡함으로써 상기 서열 성분들을 분리하는 것이 가능하다. 그러나, 각각의 전체 프로브 서열이 공지되어 있으므로, 상기 서열은 새롭고 추가적인 단일 카피 프로브를 개발하기 위해 사용되는 반복 서열 데이터베이스에 추가될 수 있다. 상기 프로브 서열들은 길지 않으며, 일부의 산재된 반복 서열 패밀리들은 최장 단일 카피 프로브보다 실제적으로 더욱 길게되므로, 인간 반복 서열 패밀리의 데이터베이스에 상기 서열들을 추가함으로써 추가적인 컴퓨터 조작 비용을 최소화할 수 있다. 이러한 예전에 알려지지 않은 반복 서열 패밀리 멤버를 추가하면, 반복 서열 데이터베이스가 더욱 넓어짐으로써 단일 카피 프로브의 디자인이 개선된다. 이와 같이 더욱 넓은 반복 서열 데이터베이스를 이용하여 디자인되는 단일 카피 프로브는 이러한 새로운 반복 서열들을 함유하지않게 된다. 이러한 발견적인 연산에 의하여 단일 카피 프로브에서 단일 카피 서열의 순도가 개선된다.
일반적으로 말해서, 본 발명은 게놈에서 예전에 알려지지않은 반복 서열 패밀리의 존재 여부를 측정하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 표지된 추정 단일 카피 핵산을 게놈과 반응시키고, 상기 프로브를 교잡시키는 것을 포함한다. 상기 프로브가 3개 이상의 상이한 위치, 바람직하게는 10개 이상의 상이한 위치에서 교잡되는 경우, 새롭고 예전에 알려지지않은 반복 서열이 확인될 수 있다.
위에서 인용한 모든 참조문헌은 특별히 본원에 참조로 통합된다. 그 밖에, 2000년 3월 27일자 출원된 개시 서류(Disclosure Document)#471449의 주제가 본원에 참조로 통합된다.

Claims (45)

  1. 알려진 서열의 표적 핵산의 추정된 단일 카피 서열 간격에 교잡하게 되는 표지된 단일 카피 핵산을 포함하고, 최소한 약 50개 뉴클레오티드의 길이를 가지는 핵산 교잡 프로브.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 프로브는 상기 표적 핵산의 개개의 추정된 단일 카피 서열 간격에 교잡하게 되는 다수의 상이하고 표지된 핵산을 포함하며, 상기 각각의 핵산 프로브는 최소한 약 50개 뉴클레오티드의 길이를 가지는 것인 프로브.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 최소한 100개 뉴클레오티드의 길이를 가지는 것인 프로브.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 최소한 약 2000개 뉴클레오티드의 길이를 가지는 것인 프로브.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 표적 핵산은 DNA, RNA 및 mRNA로 이루어진 군에서 선택되는 것인 프로브.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 표적 핵산은 DNA인 프로브.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 단일 가닥인 프로브.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 프로브는 상기 표적 핵산을 일부분으로 함유하는 게놈내의 반복 서열에 교잡하게 되는 차단 핵산 서열을 실제적으로 함유하지 않는 것인 프로브.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 형광크롬-반응 표지물, 형광크롬, 비색 화학제, 접합 단백질, 항체, 항원 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 표지물로 표지되는 것인 프로브.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 형광크롬-반응 표지물로 표지되는 것인 프로브.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 프로브와 상기 표적 서열의 보체인 서열 사이의 서열 동일성이 최소한 약 80%인 프로브.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 프로브는 상기 표적 서열에 상보적인 것인 프로브.
  13. 표적 핵산 서열과 상기 표적 핵산 서열의 최소한 일부분에 교잡하는 핵산 프로브를 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 단계와, 상기 프로브를 상기 표적 핵산 서열에 교잡시키는 단계를 포함하는 교잡 방법에 있어서, 알려진 서열의 표적 핵산의 추정된 단일 카피 서열에 교잡하는 표지된 단일 카피 핵산을 상기 프로브로서 이용하며, 상기 핵산 프로브는 최소한 약 50개 뉴클레오티드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 교잡 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 프로브는 상기 표적 핵산의 각각의 추정된 단일 카피 서열 간격에 교잡하는 다수의 상이하고 표지된 핵산을 포함하며, 상기 각각의 핵산 프로브는 최소한 약 50개 뉴클레오티드의 길이를 가지는 것인 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 최소한 100개 뉴클레오티드의 길이를 가지는 것인 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 최소한 약 2000개 뉴클레오티드의 길이를 가지는 것인 방법.
  17. 제 13 항에 있어서, 상기 표적 핵산은 DNA, RNA 및 mRNA로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 표적 핵산은 DNA인 방법.
  19. 제 13 항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 단일 가닥인 방법.
  20. 제 13 항에 있어서, 상기 프로브는 상기 표적 핵산을 일부분으로 함유하는 게놈내의 반복 서열에 교잡하게 되는 차단 핵산 서열을 실제적으로 함유하지 않는 것인 방법.
  21. 제 13 항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 형광크롬-반응 표지물, 형광크롬, 비색 화학제, 접합 단백질, 항체, 항원 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 표지물로 표지되는 것인 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 핵산 프로브는 형광크롬-반응 표지물로 표지되는 것인 방법.
  23. 제 13 항에 있어서, 상기 교잡 방법은 원위치 교잡, 서던 블롯, 및 핵산을 고정하는 기타 방법으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  24. 제 13 항에 있어서, 상기 프로브와 상기 표적 서열의 보체인 서열 사이의 서열 동일성이 최소한 약 80%인 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 프로브는 상기 표적 서열에 상보적인 것인 방법.
  26. 게놈의 일부를 구성하는 표적 핵산 서열에 대한 교잡 프로브를 발생하기 위한 방법으로서,
    상기 표적 핵산 서열의 최소한 하나의 단일 카피 서열로 이루어진 서열을 결정하는 단계와;
    상기 단일 카피 서열의 최소한 일부분에 교잡하는 교잡 프로프를 발생시키는 단계를 포함하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 표적 핵산 서열로 이루어진 서열을 결정하는 단계와;
    상기 게놈에서 확인되는 반복 서열을 결정하는 단계와;
    상기 표적 핵산 서열로 이루어진 서열을 상기 반복 서열과 비교하여 상기 최소한 하나의 단일 카피 서열로 이루어진 서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  28. 제 26 항에 있어서, 상기 프로브 발생 단계는 상기 단일 카피 서열의 최소한 일부분을 얻는 단계와, 상기 단일 카피 서열의 상기 일부분을 정제하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 정제 단계는 PCR을 수행하는 것을 포함하는 것인발법.
  30. 제 26 항에 있어서, 상기 교잡 프로브를 표지하는 단계를 포함하는 방법.
  31. 제 26 항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열 및 프로브는 DNA인 방법.
  32. 제 26 항에 있어서, 상기 교잡 프로브는 상기 단일 카피 서열에 대하여 최소한 약 80%의 서열 동일성을 가지는 것인 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 교잡 프로브는 상기 단일 카피 서열에 대하여 상보적인 것인 방법.
  34. 서열 확인 번호 429-446으로 이루어진 군에서 선택되는 멤버에 대하여 최소한 약 80%의 서열 동일성을 가지는 DNA 서열.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 서열은 최소한 약 90%의 서열 동일성을 가지는 것인 DNA 서열.
  36. 서열 확인 번호 429-446 및 480-613으로 이루어진 군에서 선택되는 DNA 서열.
  37. 서열 확인 번호 429로부터 출발하여 서열 확인 번호 429-446 및 480-613으로 확인되는 서열들의 인접한 쌍들을 PCR 프라이머로 이용하여 생성되는 PCR-증폭 서열과 최소한 약 80%의 서열 동일성을 가지는 DNA 서열.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 서열은 최소한 약 90%의 서열 동일성을 가지는 것인 서열.
  39. 게놈내에 예전에 알려지지 않은 반복 서열이 존재하는 지를 결정하기 위한 방법으로서, 표지된 추정 단일 카피 핵산 프로브를 상기 게놈과 반응시키는 단계와, 상기 프로브를 교잡시키는 단계와, 새로운 반복 서열 패밀리를 결정하기 위하여 상기 프로브가 3개 이상의 상이한 위치에서 상기 게놈에 교잡하는 지를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 프로브가 10개 이상의 상이한 위치에서 교잡하는 지를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  41. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산은 중복 또는 삼중복 서열 간격으로부터 유도되는 것인 프로브.
  42. 제 13 항에 있어서, 중복 또는 삼중복 서열 영역에 교잡하게 되는 단일 카피 핵산을 선별하는 단계를 포함하는 방법.
  43. 제 26 항에 있어서, 상기 결정 단계는 중복 또는 삼중복 서열 영역으로부터 상기 단일 카피 영역을 선별하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  44. 염색체 절단점을 결정하기 위한 방법으로서,
    상기 절단점의 대향한 측면에서 각각 교잡하도록 디자인되는 것으로서, 예정된 서열로 이루어지는 한 쌍의 분리되고 표지된 단일 카피 핵산 프로브들을 제공하는 단계와;
    상기 한 쌍의 프로브를 상기 절단점을 함유하는 염색체 표적 서열과 반응시키고, 상기 프로브를 상기 표적 서열에 교잡시키는 단계와;
    상기 절단점의 위치를 확인하기 위하여 상기 교잡된 프로브를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 절단점의 한 측면에서 교잡되도록 디자인되는 것으로서, 예정된 서열로 이루어지는 다수의 분리되고 표지된 단일 카피 핵산 프로브를 제공하는 단계와, 상기 절단점의 다른 측면에서 교잡되도록 디자인되는 것으로서, 예정된 서열로 이루어지는 다수의 분리되고 표지된 단일 카피 핵산 프로브를 제공하는 단계를 포함하는 방법.
KR1020027015374A 2000-05-16 2001-05-15 단일 카피 게놈 교잡 프로브 및 이의 생성 방법 KR20030021162A (ko)

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Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6828097B1 (en) * 2000-05-16 2004-12-07 The Childrens Mercy Hospital Single copy genomic hybridization probes and method of generating same
NZ539223A (en) * 2000-05-16 2006-10-27 Childrens Mercy Hospital Single copy genomic hybridization probes and method of generating same
US20090065471A1 (en) * 2003-02-10 2009-03-12 Faris Sadeg M Micro-nozzle, nano-nozzle, manufacturing methods therefor, applications therefor
US20060194265A1 (en) * 2001-10-23 2006-08-31 Morris David W Novel therapeutic targets in cancer
AU2003231740A1 (en) * 2002-04-19 2003-11-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health Compositions and methods for diagnostics and therapeutics for hydrocephalus
US20040161773A1 (en) * 2002-09-30 2004-08-19 The Children's Mercy Hospital Subtelomeric DNA probes and method of producing the same
US20070258949A1 (en) * 2004-03-01 2007-11-08 Five Prime Therapeutics, Inc. Human Cdna Clones Comprising Polynucleotides Encoding Polypeptides and Methods of Their Use
CA2566395A1 (en) * 2004-03-26 2005-10-13 The Children's Mercy Hospital Computational selection of probes for localizing chromosome breakpoints
US20060160116A1 (en) * 2004-12-16 2006-07-20 The Regents Of The University Of California Repetitive sequence-free DNA libraries
US7905100B2 (en) * 2004-12-16 2011-03-15 Danfoss A/S Method for controlling temperature in a refrigeration system
US7906635B2 (en) * 2005-01-27 2011-03-15 Compugen Ltd. Nucleotide and amino acid sequences, and assays and methods of use thereof for diagnosis of ovarian cancer
EP1848819A4 (en) * 2005-02-16 2010-01-06 Genetic Technologies Ltd METHOD FOR GENETIC ANALYSIS WITH AMPLIFICATION OF COMPLEMENTARY DUPLICATES
US20060223075A1 (en) * 2005-03-29 2006-10-05 Exagen Diagnostics, Inc. Unique sequence hybridization probes (USP)
US7734424B1 (en) * 2005-06-07 2010-06-08 Rogan Peter K Ab initio generation of single copy genomic probes
US8407013B2 (en) 2005-06-07 2013-03-26 Peter K. Rogan AB initio generation of single copy genomic probes
JP2009507472A (ja) * 2005-08-16 2009-02-26 ザ チルドレンズ マーシー ホスピタル マイクロスフェア懸濁ハイブリダイゼーションの定量化およびその用途
DE102006001081A1 (de) * 2006-01-02 2007-07-05 Institut für Gemüse- und Zierpflanzenbau Großbeeren / Erfurt e.V. Verfahren zur Prognose und Diagnose eines Pilzbefalls an Salatpflanzen
CA2630416A1 (en) * 2005-11-18 2007-06-28 The Children's Mercy Hospital Mitigation of cot-1 dna distortion in nucleic acid hybridization
US7702468B2 (en) 2006-05-03 2010-04-20 Population Diagnostics, Inc. Evaluating genetic disorders
US10522240B2 (en) 2006-05-03 2019-12-31 Population Bio, Inc. Evaluating genetic disorders
CA2661713C (en) 2006-09-01 2016-08-02 Ventana Medical Systems, Inc. Method for producing nucleic acid probes
EP2079850B1 (en) 2006-09-20 2016-02-24 Colorado State University Research Foundation Detection of chromosomal inversions
DK2444806T3 (da) 2006-11-01 2014-07-21 Ventana Med Syst Inc Haptener, haptenkonjugater, sammensætninger deraf og fremgangsmåde til deres fremstilling og anvendelse
EP2129800A4 (en) * 2007-03-28 2010-08-04 Childrens Mercy Hospital METHOD FOR IDENTIFYING AND SELECTING NUCLEIC ACID SEGMENTS WITH LOW NUMBER OF COPIES
US7682789B2 (en) * 2007-05-04 2010-03-23 Ventana Medical Systems, Inc. Method for quantifying biomolecules conjugated to a nanoparticle
DK2167963T3 (da) 2007-05-23 2019-06-24 Ventana Med Syst Inc Polymerbærere til immunhistokemi og in situ-hybridisering
US8249306B2 (en) * 2008-03-18 2012-08-21 Certusview Technologies, Llc Virtual white lines for delimiting planned excavation sites
WO2009149013A2 (en) 2008-06-05 2009-12-10 Ventana Medical Systems, Inc. Compositions comprising nanomaterials and method for using such compositions for histochemical processes
WO2010014651A1 (en) * 2008-07-31 2010-02-04 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Pharmacogenetic markers for susceptibility to drug-induced pancreatic toxicity
CN102782156A (zh) * 2009-12-31 2012-11-14 文塔纳医疗***公司 用于生成独特特异性核酸探针的方法
USPP22463P3 (en) * 2010-02-16 2012-01-17 Menachem Bornstein Gypsophila plant named ‘Pearl Blossom’
EP2561095A1 (en) * 2010-04-20 2013-02-27 Ventana Medical Systems, Inc. Two-color chromogenic in situ hybridization
WO2012018387A2 (en) 2010-08-02 2012-02-09 Population Diagnotics, Inc. Compositions and methods for discovery of causative mutations in genetic disorders
US9090935B2 (en) 2010-10-11 2015-07-28 Kromatid, Inc. Characterization of chromosomal inversions using anti-parallel probes
EP2766483B1 (en) 2011-10-10 2022-03-23 The Hospital For Sick Children Methods and compositions for screening and treating developmental disorders
WO2013064895A1 (en) * 2011-10-31 2013-05-10 Genomic Vision Methods for the detection, visualization and high resolution physical mapping of genomic rearrangements in breast and ovarian cancer genes and loci brca1 and brca2 using genomic morse code in conjunction with molecular combing
WO2013064896A1 (en) 2011-10-31 2013-05-10 Genomic Vision Method for identifying or detecting genomic rearrangements in a biological sample
US11180807B2 (en) 2011-11-04 2021-11-23 Population Bio, Inc. Methods for detecting a genetic variation in attractin-like 1 (ATRNL1) gene in subject with Parkinson's disease
WO2013120018A1 (en) 2012-02-09 2013-08-15 Population Diagnostics, Inc. Methods and compositions for screening and treating developmental disorders
US9976180B2 (en) 2012-09-14 2018-05-22 Population Bio, Inc. Methods for detecting a genetic variation in subjects with parkinsonism
EP2900835A4 (en) 2012-09-27 2016-05-11 Population Diagnotics Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTING AND TREATING DEVELOPMENTAL DISORDERS
EP2891722B1 (en) 2013-11-12 2018-10-10 Population Bio, Inc. Methods and compositions for diagnosing, prognosing, and treating endometriosis
US9710451B2 (en) * 2014-06-30 2017-07-18 International Business Machines Corporation Natural-language processing based on DNA computing
GB2558326B (en) 2014-09-05 2021-01-20 Population Bio Inc Methods and compositions for inhibiting and treating neurological conditions
WO2016077426A1 (en) * 2014-11-11 2016-05-19 Abbott Molecular Inc. Hybridization probes and methods
US10388404B2 (en) 2015-10-27 2019-08-20 International Business Machines Corporation Using machine-learning to perform linear regression on a DNA-computing platform
US20230183780A1 (en) * 2016-07-25 2023-06-15 InVivo BioTech Services GmbH Dna probes for in situ hybridization on chromosomes
US10240205B2 (en) 2017-02-03 2019-03-26 Population Bio, Inc. Methods for assessing risk of developing a viral disease using a genetic test
ES2935891T3 (es) 2018-08-08 2023-03-13 Pml Screening Llc Métodos para evaluar el riesgo de desarrollar leucoencefalopatía multifocal progresiva causada por virus de John Cunningham mediante pruebas genéticas
KR102397822B1 (ko) * 2021-11-19 2022-05-13 주식회사 클리노믹스 염색체 구조의 상태 정보를 이용한 세포 분석 장치 및 방법

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4699876A (en) * 1984-01-27 1987-10-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nonradiometric polynucleotide probes
US5447841A (en) 1986-01-16 1995-09-05 The Regents Of The Univ. Of California Methods for chromosome-specific staining
US5756696A (en) 1986-01-16 1998-05-26 Regents Of The University Of California Compositions for chromosome-specific staining
US5721098A (en) * 1986-01-16 1998-02-24 The Regents Of The University Of California Comparative genomic hybridization
US6040140A (en) * 1991-12-11 2000-03-21 Thomas Jefferson University Methods for screening and treating leukemias resulting from all-1 region chromosome abnormalities
US6121419A (en) * 1992-06-17 2000-09-19 Arch Development Corp. Compositions and methods for detecting gene rearrangements and translocations
CA2154265C (en) * 1993-01-21 2011-01-04 Spencer B. Farr Methods and diagnostic kits utilizing mammalian stress promoters to determine toxicity of a compound
US6150137A (en) * 1994-05-27 2000-11-21 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Immunosuppressant target proteins
US6150160A (en) * 1995-11-16 2000-11-21 The John Hopkins University Compositions and methods of use of mammalian retrotransposons
US6222029B1 (en) * 1997-08-01 2001-04-24 Genset 5′ ESTs for secreted proteins expressed in brain
DE69940928D1 (de) * 1998-12-04 2009-07-09 Du Pont 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphat-reduktoisomerasen aus pflanzen
US6828097B1 (en) * 2000-05-16 2004-12-07 The Childrens Mercy Hospital Single copy genomic hybridization probes and method of generating same
NZ539223A (en) 2000-05-16 2006-10-27 Childrens Mercy Hospital Single copy genomic hybridization probes and method of generating same
JP3572612B2 (ja) * 2000-07-31 2004-10-06 日産自動車株式会社 変速比無限大無段変速機のイナーシャトルク補償制御装置
WO2002093130A2 (en) * 2001-05-14 2002-11-21 Cancer Genetics, Inc. Methods of analyzing chromosomal translocations using fluorescence in situ hybridization (fish)
EP2270197A3 (en) * 2002-03-26 2011-02-16 Massachusetts Institute of Technology Targets, methods, and reagents for diagnosis and treatment of schizophrenia
WO2007001259A1 (en) * 2005-06-16 2007-01-04 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods and materials for identifying polymorphic variants, diagnosing susceptibilities, and treating disease
CA2658853A1 (en) * 2006-07-26 2008-01-31 Yale University Diagnosis and treatment of age related macular degeneration
US9758817B2 (en) * 2010-01-13 2017-09-12 Agilent Technologies, Inc. Method for identifying a nucleic acid in a sample

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US6828097B1 (en) 2004-12-07
US7014997B2 (en) 2006-03-21

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