KR100787108B1

KR100787108B1 - 백혈병 진단용 키트

Info

Publication number: KR100787108B1
Application number: KR1020060114127A
Authority: KR
Inventors: 천성민; 한병돈; 오용택
Original assignee: (주)예비티
Priority date: 2006-11-17
Filing date: 2006-11-17
Publication date: 2007-12-21

Abstract

본 발명은 다수의 환자로부터 얻어진 다수의 시료를 한번의 중합효소연쇄반응으로 분석하여 보다 신속하게 백혈병의 발병여부를 진단할 수 있는 백혈병 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 백혈병 진단용 키트는 서열번호 1 내지 23의 탐침이 부착된 마이크로스피어 비드; 서열번호 24 내지 44의 시료 증폭용 프라이머; 및, 서열번호 45 내지 67의 바이오틴 표지용 프라이머를 포함한다. 본 발명의 백혈병 진단용 키트를 이용하면, 다수의 시료를 한번의 중합효소연쇄반응으로 증폭시킬 수 있어, 보다 신속하게 백혈병을 진단할 수 있으므로, 백혈병의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

백혈병 진단용 키트, 중합효소연쇄반응, 조기진단

Description

백혈병 진단용 키트{A Kit for Diagnosis of Leukemia}

도 1은 본 발명의 백혈병 진단용 키트를 이용하여, 백혈병을 진단하는 원리를 나타내는 모식도이다.

본 발명은 백혈병 진단용 키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 다수의 환자로부터 얻어진 다수의 시료를 한번의 중합효소연쇄반응으로 분석하여 보다 신속하게 백혈병의 발병여부를 진단할 수 있는 백혈병 진단용 키트에 관한 것이다.

백혈병은 다양한 발병원인이 밝혀지고 있으나, 가장 일반적인 원인은 염색체의 전좌(translocation)에 의하여 발생하는 것으로 알려져 있는데, 이러한 전좌의 종류에 따라, 환자의 치료방향이 결정되고, 질병의 예후를 판단할 수 있기 때문에, 분자생물학적 결과가 중요한 의미를 가진다.

이러한 염색체 전좌를 확인하기 위하여는, 주로 전좌된 부위에 존재하는 융합유전자의 재조합정도를 정량하는 방법이 사용되고 있으며, 보다 용이하게 융합유전자의 재조합정도를 정량할 수 있는 방법을 개발하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있다. 예를 들어, 장거리 역방향 중합효소연쇄반응(long distance inverse polymerase chain reaction)을 이용하여 융합유전자의 배열을 확인하는 방법(참조: Joseph Wiemeles et al., Blood, 99:3801-3805, 2003), 세포유전학과 FISH(fluorescent in situ hybridization)를 결합한 진단방법(참조: Mancini et al, British Journal of Haematology, 91:878-884, 1995), 체세포 DNA에 대한 PCR을 이용한 방법(참조: Tashiro et al, Japanese Journal of Cancer Research, 84:110-113, 1993) 및 RT-PCR을 이용한 방법(참조: Castaigne et al., Blood, 79:3110-3115, 1991; Fukutani et al, Leukemia, 9:588-593, 1995) 등이 개발되었다. 그러나, 상기 방법 중 FISH는 염색체 전좌가 발생된 개별세포를 직접 검출하는 방법으로, 백혈병의 초기에는 검출되지 않으며, PCR 또는 RT-PCR에 의한 방법은 민감도는 뛰어나나, 시료의 오염 등으로 인하여 오류양성(false-positive) 반응을 나타낼 수 있으며, 질병의 진행정도를 정확하게 파악할 수 없다는 단점이 있다.

상술한 단점을 극복하기 위한 방법으로, 최근에는 미량의 시료로부터 표적 RNA의 정량까지 가능한 실시간 RT-PCR 방법을 활용한 백혈병 진단 키트들이 개발되어 시판되고 있으나, 한명의 환자로부터 수득한 시료를 대상으로 할 경우에도, 진단의 정확성을 향상시키기 위하여 백혈병의 발병과 관련된 다양한 유전자를 검사하여야만 하므로, 상당한 비용과 시간이 소요되기 때문에, 보다 신속한 백혈병의 진 단을 수행하기가 어렵다는 단점이 있다.

따라서, 보다 신속하게 백혈병이 의심되는 환자를 진단할 수 있는 키트를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 보다 신속하게 백혈병이 의심되는 환자를 진단할 수 있는 키트를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 증폭하고자 하는 유전자의 염기서열의 프라이머 제작 시, 돌출부(burge)를 형성하도록 가운데 2~4bp의 염기서열을 5~8bp의 dNTP로 대체하고, 대체된 부위를 제외한 부분은 증폭하고자 하는 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 형태의(specific bulge specific, SBS) 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 진단키트를 사용할 경우, 다수의 시료를 한번의 중합효소연쇄반응으로 증폭시킬 수 있어, 보다 신속하게 백혈병을 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 가운데 부분에 돌출부(bulge)가 형성된 프라이머를 포함하는 백혈병 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 보다 신속하게 백혈병으로 의심되는 환자를 진단할 수 있는 키트를 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 환자에서 수득한 시료에 포함된 백혈병의 원인이 되는 모든 융합유전자를 한번의 중합효소연쇄반응으로 증폭시킬 수 있다면, 백혈병의 진단에 소요되는 비용과 시간을 대폭적으로 감축시킬 수 있을 것이라는 점에 착안하였다.

이에, 본 발명자들은 한번의 중합효소연쇄반응만으로 다수의 유전자를 증폭시킬 수 있는 방법을 개발하기 위하여, 다양한 연구를 수행하던 중, 주형으로 사용되는 각각의 유전자와 이에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머가 각각 특이적으로 결합할 수 있다면, 다수의 유전자를 한번의 중합효소연쇄반응으로 증폭시킬 수 있을 것이라는 점에 주목하고, 주형 유전자에 대한 프라이머의 특이적인 선택성을 향상시키는 연구를 수행하였다.

그 결과, 증폭하고자 하는 유전자의 염기서열의 프라이머 제작 시 가운데 2 내지 4bp의 염기서열을 주형의 염기서열과 상보적으로 결합하지 않아, 중합효소연쇄반응시 주형 유전자와 혼성화될 경우 중앙에 돌출부(bulge)를 형성할 수 있도록 5 내지 8bp의 dATP(또는 다른 원하는 데옥시 올리고뉴클레오티드)로 대체하고, 3'말단과 5'말단부분의 염기서열은 증폭하고자 하는 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 형태의(specific bulge specific, SBS) 염기서열로 구성된 프라이머(이하, 'SBS 프라이머'라 함)를 이용할 경우 주형 유전자에 대한 프라이머의 특이적인 선택성이 향상되어, 다수의 주형 유전자와 이에 상응하는 각각의 프라이머를 혼합하여 한번의 중합효소연쇄반응을 수행할 경우에도, 각각의 주형 유전자가 정상적으로 증폭될 수 있음을 확인하였다.

한편, 전기 SBS 프라이머로 증폭된 시료로부터 백혈병의 원인이 되는 다양한 종류의 융합유전자를 보다 용이하게 검출하기 위하여, 전기 각각의 융합유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 다양한 염기서열을 갖는 탐침을 고안하였으며, 이처럼 고안된 탐침을 미세한 크기의 구형 입자(마이크로스피어 비드)에 결합시켰다.

끝으로, 전기 마이크로스피어 비드에 결합된 융합유전자의 결합여부를 보다 효과적으로 확인하기 위하여, 전기 증폭된 시료가 전기 마이크로스피어 비드와 결합할 경우, 마이크로스피어 비드에서 표지물질을 정량할 수 있도록, 전기 SBS 프라이머로 증폭된 시료에 표지물질을 결합시키고자 하였다. 이를 위하여, 본 발명자들은 탐침 상보적 프라이머 확장법을 이용하여 전기 증폭된 시료에 바이오틴을 표지시킬 수 있는 프라이머를 고안하였다.

결국, 본 발명의 백혈병 진단용 키트는 (i) 서열번호 1 내지 23의 탐침이 결합된 마이크로스피어 비드; (ii) 서열번호 24 내지 44의 시료 증폭용 프라이머; 및, (iii) 서열번호 45 내지 67의 바이오틴 표지용 프라이머를 포함한다. 이때, 마이크로스피어 비드는 탐침의 5'말단의 아민기와 마이크로스피어 비드의 카르복시기의 결합에 의하여 탐침과 결합됨이 바람직하다.

본 발명의 백혈병 진단용 키트를 사용하여, 환자로부터 백혈병의 발병여부를 진단하는 원리를 도 1에 간략히 도시하였다. 도 1은 본 발명의 백혈병 진단용 키트를 이용하여, 백혈병을 진단하는 방법을 나타내는 모식도이다. 즉, 환자로부터 RNA 시료를 수득하고, 이를 역전사시켜서 cDNA를 수득한 다음, 전기 cDNA를 주형으로 하고, 백혈병 진단용 키트에 포함된 시료 증폭용 프라이머를 사용하여, 한번의 중합효소연쇄반응을 수행하여, 백혈병의 발병원인이 되는 융합유전자를 증폭시킨다. 이때, cDNA에 백혈병의 발병원인이 되는 융합유전자가 없다면, 증폭산물을 수득할 수 없을 것이고, cDNA에 1종의 융합유전자가 존재한다면, 1종의 증폭산물 만을 수득할 것이며, cDNA에 다수의 융합유전자가 존재한다면 다양한 증폭산물을 수득할 수 있을 것이다.

그런 다음, 백혈병 진단용 키트에 포함된 바이오틴 표지용 프라이머를 이용하여, 전기 증폭산물을 바이오틴으로 표지한 다음, 전기 바이오틴이 표지된 증폭산물을 백혈병 진단용 키트에 포함된 마이크로스피어 비드와 교잡반응시키고, 반응이 종료된 마이크로스피어 비드로부터 바이오틴을 검출하여, 융합유전자의 존재여부를 확인함으로써, 백혈병의 발병여부를 진단한다.

본 발명의 백혈병 진단용 키트를 이용하면, 다수의 시료를 한번의 중합효소연쇄반응으로 증폭시킬 수 있어, 보다 신속하게 백혈병을 진단할 수 있으므로, 백혈병의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

이하, 백혈병 특이 융합유전자의 발현 유무를 확인하는 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 백혈병 진단용 키트의 제조

실시예 1-1: 탐침의 작제

백혈병 특이 유전자를 진단하기 위하여 백혈병 특이적 융합유전자에 대한 탐침 올리고뉴클레오티드와, 대조군으로 이용하기 위한 정상유전자에 대한 탐침 올리고뉴클레오티드를 작제하였다. 백혈병 특이적 융합유전자는 두 개의 정상 유전자가 특정 부위에서 잘려져서 서로 융합하여 만들어졌기 때문에, 융합한 부위를 중심으로 서로 다른 두 개의 유전자 염기서열이 존재한다. 따라서, 이러한 융합 유전자를 진단하기 위한 탐침 염기서열은 융합 부위를 중심으로 양 옆으로 서로 다른 유전자 염기서열을 지니는 단일 염기사슬로 고안하고, 상기 고안된 탐침의 5'말단에 아민기(amine)를 부가시켜서, 각각의 탐침을 작제하였다. 이때, 대조군으로는 융합되지 않은 정상유전자를 검출할 수 있는 염기서열을 가지는 탐침을 사용하였고, 이들의 염기서열은 다음과 같다:

백혈병 특이 융합유전자 진단용 탐침

탐침 1: b3a2 5'- GCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAG -3' (서열번호 1)

탐침 2: b2a2 5'- CCATCAATAAGGAAGAAGCCC -3' (서열번호 2)

탐침 3: e1a2 5'- GGAGACGCAGAAGCCCTTC -3' (서열번호 3)

탐침 4: c3a2 5'- CCTTCGACGTCAAAGCCCTTCA -3' (서열번호 4)

탐침 5: aml/eap 5'- GAGAACCTCGAAAATCATGGATG -3' (서열번호 5)

탐침 6: aml/mds 5'- GAACCTCGAAATAATGAGTGTG -3' (서열번호 6)

탐침 7: aml/eto 5'- GAGAACCTCGAA ATCGTACTGA -3' (서열번호 7)

탐침 8: aml/eto-1 5'- GAGAACCTCGAAATAAACCCCA -3' (서열번호 8)

탐침 9: aml/eto-2 5'- GAGAACCTCGAA CGCACGCG -3' (서열번호 9)

탐침 10: pmla1/rara 5'- GGGGAGG CA GCCATTGAGAC -3' (서열번호 10)

탐침 11: pmlb1/rara 5'- CAGGGGAAA GCCATTGAGAC -3' (서열번호 11)

탐침 12: numa/rara 5'- GGGGCCCCTCCAGCCATTGA -3' (서열번호 12)

탐침 13: plzf/rara 5'- ACTGGCTCATT CAGCCATTGA -3' (서열번호 13)

탐침 14: cbfb/myh-e7 5'- AGGAAATGGAG TTCAAGAGGG -3' (서열번호 14)

탐침 15: cbfb/myh-e8 5'- GGAAATGGAG AATGAAGTTGAG -3' (서열번호 15)

탐침 16: cbfb/myh-e9 5'- AGGAAATGGAG GAGCTGCTTC -3' (서열번호 16)

탐침 17: cbfb/myh-e12 5'- AGGAAATGGAG GTCCATGAGCT -3' (서열번호 17)

상기 탐침 1은 BCR유전자의 exon 14번과 ABL 유전자의 exon 2번이 융합된 유 전자를 검출할 수 있고, 탐침 2는 BCR유전자의 exon 13번과 ABL 유전자의 exon 2번이 융합된 유전자를 검출할 수 있으며, 탐침 3은 BCR 유전자의 exon 1번과 ABL 유전자의 exon 2번이 융합된 유전자를 검출할 수 있고, 탐침 4는 BCR 유전자의 exon 19번과 ABL 유전자의 exon 2번이 융합된 유전자를 검출할 수 있으며, 탐침 5는 AML1 유전자와 EAP 유전자가 융합된 유전자를 검출할 수 있고, 탐침 6은 AML1 유전자와 MDS 유전자가 융합된 유전자를 검출할 수 있으며, 탐침 7은 AML1 유전자와 ETO 유전자가 융합된 유전자를 검출할 수 있고, 탐침 8은 AML1 유전자와 ETO-1 유전자가 융합된 유전자를 검출할 수 있으며, 탐침 9는 AML1 유전자와 ETO-2 유전자가 융합된 유전자를 검출할 수 있고, 탐침 10은 PMLa1 유전자와 Rara 유전자가 융합된 유전자를 검출할 수 있으며, 탐침 11은 PMLb1 유전자와 Rara 유전자가 융합된 유전자를 검출할 수 있고, 탐침 12는 NUMA 유전자와 Rara 유전자가 융합된 유전자를 검출할 수 있으며, 탐침 13은 PLZF 유전자와 Rara 유전자가 융합된 유전자를 검출할 수 있고, 탐침 14는 CBFB 유전자와 MYH-e7 유전자가 융합된 유전자를 검출할 수 있으며, 탐침 15는 CBFB 유전자와 MYH-e8 유전자가 융합된 유전자를 검출할 수 있고, 탐침 16은 CBFB 유전자와 MYH-e9 유전자가 융합된 유전자를 검출할 수 있으며, 탐침 17은 CBFB 유전자와 MYH-e12 유전자가 융합된 유전자를 검출할 수 있다.

대조군 탐침

탐침 18: abl 5'- TATCTGGAAGAAGCCCTTCAGC -3' (서열번호 18)

탐침 19: bcr13 5'- AATAAGGAAGATGATGAGTCTCCG -3' (서열번호 19)

탐침 20: bcr14 5'- AGCAGAGTTCAAATCTGTACTGCAC -3' (서열번호 20)

탐침 21: aml1 5'- GAGAACCTCGAAGACATCGGCA -3' (서열번호 21)

탐침 22: cbfb 5'- AGGAAATGGAGGTGAGAGTTTC -3' (서열번호 22)

탐침 23: rara 5'- CCCCAGCCACCATTGAGAC -3' (서열번호 23)

상기 탐침 18은 정상적인 abl 유전자를 검출할 수 있고, 탐침 19는 정상적인 bcr13 유전자를 검출할 수 있으며, 탐침 20은 정상적인 bcr14 유전자를 검출할 수 있고, 탐침 21은 정상적인 aml1 유전자를 검출할 수 있으며, 탐침 22는 정상적인 cbfb 유전자를 검출할 수 있고, 탐침 23은 정상적인 rara 유전자를 검출할 수 있다.

실시예 1-2 : 백혈병 진단용 탐침이 결합된 마이크로스피어 비드의 작제

카르복실 그룹이 표면에 돌출된 마이크로스피어 비드(Luminex. Co., LTD, USA) 5x10⁵(약 40㎕)를 1.5ml 튜브에 넣고 8,000g에서 1분간 원심분리하여, 침전된 마이크로스피어 비드를 수득한 다음, 20㎕의 완충용액(100mM MES(4-morpholineethanesulfonic acid; 2-(N-morpholino)ethane-sulfonic acid), pH 4.5), 전기 실시예 1-1에서 작제한 각각의 탐침 2㎕(100μM) 및 EDC(N-(3-dimethylaminoprophyl)-N'-ethylcarbodiimide) 수용액(10mg/ml) 1㎕를 첨가한 후, 빛을 차단한 곳에서 30분간 교반하며 반응시켰다. 그런 다음, 동일한 EDC 수용액 1㎕를 다시 첨가하고 빛을 차단한 곳에서 30분 동안 추가로 교반하며 반응시켰다.

이어, 0.02%(v/v) Tween-20 수용액 500㎕를 가하고, 8,000 g로 1분간 원심분리한 다음, 침전물을 수득하고, 다시 0.1%(w/v) SDS(sodium dodecyl sulfate) 수용액 500㎕ 가하고 8,000 g로 1분간 원심분리시켜, 침전된 마이크로스피어 비드를 수득한 다음, 200㎕의 TE 완충용액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)을 가하여, 각각의 백혈병 진단용 탐침이 결합된 마이크로스피어 비드를 각각 작제하였다.

실시예 1-3: 시료 증폭용 프라이머의 작제

환자로부터 얻어진 시료에서 백혈병 발병의 원인이 되는 융합 유전자를 증폭시키기 위한 중합효소연쇄반응에 사용되는 프라이머를 작제하였으며, 이의 서열은 다음과 같다:

센스 프라이머

abl-F: 5'- GGCGCAAAATGTTG aaaaaa GATCTGCCTGAAG-3' (서열번호 24)

bcr13/14-F: 5'- GTGGAGCTGCAGAT aaaaaa TGACCAACTCGTGT-3' (서열번호 25)

aml1-F: 5'- CTCAGGTTTGTCGG aaaaaa GAAGTGGAAGAGG-3' (서열번호 26)

bcr1-F: 5'- GCTCTCCCTCGCAG aaaaaa CTCGCAACAGTCC-3' (서열번호 27)

bcr19-F: 5'- GTGCGTGGAGGAGA aaaaaa GAGCGCCGAGGC-3' (서열번호 28)

rara-F: 5'- GGTACCCGGTGCCT aaaaaa CTACGCCTTCTTCT-3' (서열번호 29)

pmla1-F: 5'- CATCAAGATGGAGT aaaaaa GAGGAGGGGAAGG-3' (서열번호 30)

pmlb1-F: 5'- AGGAGGAGCCCCG aaaaaa CCTGCAAGCTGC-3' (서열번호 31)

plzf-F: 5'- TGCAGCGTGTGTGG aaaaaa TCGAGCTTCCTGAT-3' (서열번호 32)

numa-F: 5'- AGGCTAGCCTGCGA aaaaaa CACCTCCTCTACTC-3' (서열번호 33)

cbfb-F: 5'- ACAACAGGCCTTTG aaaaaa GAGGCTCGGAGAA-3' (서열번호 34)

안티 센스프라이머

abl-R: 5'-TGGAGTTCCAACGA aaaaaa GGCTTCACTCAGAC-3' (서열번호 35)

bcr13/14-R: 5'-CAGTTTGGCTCAGC aaaaaa TGTCCCTGTAGACG-3' (서열번호 36)

aml1-R: 5'-TTCACTGAGCCGCT aaaaaa GAAAAGGACAAGCTC-3' (서열번호 37)

eap-R: 5'-TCACGGTGATCTTG aaaaaa CTTGCTCCTTTCGAT-3' (서열번호 38)

rara-R : 5'-ACAAAGCAAGGCTT aaaaaa AGATGCGGGGTAGA-3' (서열번호 39)

cbfb-R: 5'-GTAAAGATGGGCAG aaaaaa CACATCTGCTGTGC-3' (서열번호 40)

eto-R: 5'-TGGAGCTCCTTGAG aaaaaa GTTGGGGGAGGTG-3' (서열번호 41)

mds-R: 5'-GGAGTGCTGGCTAC aaaaaa CATCTGCATCTGGC-3' (서열번호 42)

myh11(e7/8/9)-R: 5'-CTCCAGCTGGCGCA aaaaaa TTCGTA GACACGTTG-3' (서열번호 43)

myh11(e12)-R: 5'-GCTGCGTCTTCATC aaaaaa CTCCATCTGGGTCT-3' (서열번호 44)

실시예 1-4: 시료 표지용 프라이머의 작제

상기 실시예 1-3의 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭된 융합유전자에 바이오틴을 표지시키기 위한 프라이머를 작제하였으며, 이의 서열은 다음과 같다:

프라이머

abl: 5'- GCTGAAGGGCTT CTTCCAGAT-3' (서열번호 45)

bcr13: 5'- GACTCATCAT CTTCC TTATT-3' (서열번호 46)

bcr14: 5'- CAGTACAGAT TTGAACTCTG-3' (서열번호 47)

aml1: 5'- CCGATGTCA TTCGAGGTT-3' (서열번호 48)

rara: 5'- CTCAATGG TGGCTGGG-3' (서열번호 49)

cbfb: 5'- AAACTCTCAC CTCCATTTCC-3' (서열번호 50)

b3a2: 5'- TGAAGGGCTT TTGAACTCT -3' (서열번호 51)

b2a2: 5'- GGGCTT CTTCC TTATTGA -3' (서열번호 52)

e1a2: 5'- AAGGGCTT CTGCGTCTC -3' (서열번호 53)

c3a2: 5'- AAGGGCTT TGACGTCGA -3' (서열번호 54)

aml/eap: 5'- CATCCATGATT TTCGAGGT -3' (서열번호 55)

aml/mds: 5'- CACACTCATTA TTTCGAGG -3' (서열번호 56)

aml/eto: 5'- TCAGTACGAT TTCGAGGTT -3' (서열번호 57)

aml/eto-1: 5'- GGGGTTTATTTCGAGGTTC -3' (서열번호 58)

aml/eto-2: 5'- GCGTGCGTTCGAGGTTC-3' (서열번호 59)

pmla1/rara: 5'- TCTCAATGG CTGCCTCCC-3' (서열번호 60)

pmlb1/rara: 5'- TCTCAATGG CTTTCCCCT-3' (서열번호 61)

numa/rara: 5'- TCAATGG CTGGAGGGG -3' (서열번호 62)

plzf/rara: 5'- TCAATGG CTGAATGAGCC -3' (서열번호 63)

cbfb/myh-e7: 5'- CCTCTTGAACTCCATTTCC-3' (서열번호 64)

cbfb/myh-e8: 5'- TCAACTTCATTCTCCATTTC-3' (서열번호 65)

cbfb/myh-e9: 5'- AGCAGCTCCTCCATTTCC-3' (서열번호 66)

cbfb/myh-e12: 5'- CTCATGGACCTCCATTTC-3' (서열번호 67)

실시예 2: 백혈병 진단용 키트를 이용한 백혈병 관련 유전자의 검출

실시예 2-1: RNA의 수득 및 cDNA 합성

8명의 백혈병의 발명이 의심되는 환자로부터 혈액을 수득하였다. 전기 각 혈액에서 림프구를 피콜(Ficoll-Hypaque)을 이용한 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation)방법으로 분리하고, 분리된 림프구에서 RNAsol용액(PnE RNAsol, YeBT, INC.)을 이용하여 각각의 총 RNA를 수득하였다. 전기 수득한 총 RNA 2㎍과 100μM 랜덤 프라이머(random 9mer primer) 1㎕를 혼합하고, 70℃에서 5 분간 가열한 다음, 4℃에서 5분간 냉각시켰다. 이어, 100units 역전사효소(M-MLV Reverse Transcriptase, Promega, USA), 20units 수퍼라제(SUPERase·In^TM, Ambion, USA, 1.25mM dNTP(Takara, USA) 및 5X 합성완충용액을 가하고, 증류수를 가하여 총 20㎕로 적정한 다음, 38℃에서 2시간, 95℃에서 5분 및 4℃에서 5분간 반응시켰다. 이어, 1N NaOH를 7㎕ 첨가하고 70℃에서 10분간 가열시켜 반응을 종료시키고, 10㎕의 1M Tris-HCl 완충용액을 첨가하여, 각각의 단일가닥 cDNA를 합성하였다.

실시예 2-2: cDNA의 증폭

전기 합성한 각각의 cDNA 2㎕, 10X 중합효소연쇄반응 완충용액(750mM Tris-HCl(pH 9.0), 20mM MgCl₂, 500 mM KCl, 200mM (NH₄)₂SO₄,) 2㎕, 2.5mM dNTP 혼합물(2.5mM dATP, 2.5mM dGTP, 2.5mM dTTP, 2.5mM dCTP) 2㎕, Taq 중합효소(Biotools, Spain) 2.0unit 및 전기 실시예 1-3에서 작제한 서열번호 24 내지 44의 염기서열을 갖는 프라이머 혼합물(0.5μM) 1㎕를 혼합하고, 3차 증류수를 가하여 20㎕로 적정한 다음, 중합효소연쇄반응을 수행하여(94℃에서 5분, 94℃에서 20초, 50℃에서 30초, 72℃에서 40초, 35사이클), 증폭산물을 수득하였다.

실시예 2-3: 탐침 상보적 프라이머 확장법을 이용한 증폭산물의 표지화

전기 실시예 2-2에서 수득한 증폭산물에 탐침 상보적 프라이머 확장법으로 바이오틴을 표지하였다.

즉, 전기 증폭산물 4㎕, 10X 중합효소연쇄반응 완충용액(750mM Tris-HCl(pH 9.0), 20mM MgCl₂, 500 mM KCl, 200mM (NH₄)₂SO₄,) 2㎕, 1mM dA/G/TTP 혼합물(1mM dATP, 1mM dGTP, 1mM dTTP) 2㎕, 0.4mM biotin-14-dCTP 0.25㎕, Taq 중합효소(Biotools, Spain) 1.0unit 및 전기 실시예 1-4에서 작제한 서열번호 45 내지 67의 염기서열을 갖는 프라이머의 혼합물(0.5μM) 1㎕를 혼합하고, 3차 증류수를 가하여 20㎕로 적정한 다음, 중합효소연쇄반응을 수행하여(94℃에서 5분, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 60초, 35사이클), 바이오틴이 표지된 증폭산물을 수득하였다.

실시예 2-4: 백혈병 진단 마이크로스피어 탐침 비드를 이용한 교잡반응 및 마이크로스피어 비드의 형광값 검출을 이용한 융합유전자의 검출

전기 실시예 1-2에서 작제한 각각의 마이크로스피어 비드와 전기 실시예 2-3에서 수득한 바이오틴이 표지된 증폭산물을 혼합하고, 40℃에서 30분간 교잡반응을 실시하였다. 반응이 종료된 후, 반응액을 0.45㎛ 크기의 구멍을 가지는 필터를 통과시켜서, 마이크로스피어 비드와 결합된 증폭산물을 제외한 반응물을 제거하고, 세척액(0.2M NaCl, 0.1M Tris-HCl, 0.08% Triton X-100, pH 8.0) 200㎕로 3회 세척 한 후, 피코에리트린-스트렙트아비딘 용액(Streptavidin-R-Phycoerythrin; Moss, Inc., USA) 100㎕를 가하고, 암실에서 15분간 교반하며 반응시켰다.

반응이 종료된 후, 각각의 반응물을 형광검출기(Luminex100, Linco Research Inc., USA)에 적용하여 피코에리트립에서 발색되는 형광(532nm 및 633nm)을 측정하여, 각 시료에 대하여 200 내지 5000MFI(median fluorescence intensity)를 나타내는 비드를 검출하였다(참조: 표 1).

본 발명의 백혈병 진단용 키트를 이용한 시료의 진단결과

시료번호	형광발색된 비드에 결합한 탐침번호	분석결과
1	1, 18, 19, 20, 21, 22, 23	BCR유전자의 exon 14번과 ABL 유전자의 exon 2번의 융합유전자에 의한 백혈병
2	2, 18, 19, 20, 21, 22, 23	BCR유전자의 exon 13번과 ABL 유전자의 exon 2번의 융합유전자에 의한 백혈병
3	3, 18, 19, 20, 21, 22, 23	BCR유전자의 exon 1번과 ABL 유전자의 exon 2번의 융합유전자에 의한 백혈병
4	4, 18, 19, 20, 21, 22, 23	BCR유전자의 exon 19번과 ABL 유전자의 exon 2번의 융합유전자에 의한 백혈병
5	10, 18, 19, 20, 21, 22, 23	PMLa1유전자와 Rara 유전자의 융합유전자에 의한 백혈병
6	11, 18, 19, 20, 21, 22, 23	PMLb1유전자와 Rara 유전자의 융합유전자에 의한 백혈병
7	17, 18, 19, 20, 21, 22, 23	CBFB유전자와 MYH11 유전자의 융합유전자에 의한 백혈병
8	1, 2, 3, 4, 7, 10, 11, 18, 19, 20, 21, 22, 23	BCR유전자의 exon 14번과 ABL 유전자의 exon 2번, BCR유전자의 exon 13번과 ABL 유전자의 exon 2번, BCR유전자의 exon 1번과 ABL 유전자의 exon 2번, BCR유전자의 exon 19번과 ABL 유전자의 exon 2번, AML1 유전자와 ETO 유전자, PMLa1유전자와 Rara 유전자 및 PMLb1유전자와 Rara 유전자의 융합유전자에 의한 백혈병

상기 표 1에서 보듯이, 백혈병의 원인이 되는 융합유전자를 개별적으로 검출할 수 있었다. 상기 표 1에 개시된 형광발색된 비드에 결합한 탐침번호 중에서, 18 내지 23은 대조군이며, 상기 모든 시료에서 대조군의 탐침이 검출되었다는 것은 정상적인 진단이 수행되었음을 의미한다.

특히, 시료 8에서는 다양한 종류의 융합유전자를 모두 검출할 수 있었는데, 이는 본 발명의 백혈병 진단용 키트가, 단순히 백혈병의 발병여부만을 진단하는데 사용되는 것이 아니라, 구체적인 발병원인을 규명하는데에도 이용될 수 있다는 점을 시사한다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 다수의 환자로부터 얻어진 다수의 시료를 한번의 중합효소연쇄반응으로 분석하여 보다 신속하게 백혈병의 발병여부를 진단할 수 있는 백혈병 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 백혈병 진단용 키트를 이용하면, 다수의 시료를 한번의 중합효소연쇄반응으로 증폭시킬 수 있어, 보다 신속하게 백혈병을 진단할 수 있으므로, 백혈병의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구 항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

(i) 서열번호 1 내지 23의 탐침이 결합된 마이크로스피어 비드;

(ii) 서열번호 24 내지 44의 시료 증폭용 프라이머; 및,

(iii) 서열번호 45 내지 67의 바이오틴 표지용 프라이머를 포함하는, 백혈병 진단용 키트.
제 1항에 있어서,

마이크로스피어 비드는 탐침의 5'말단의 아민기와 마이크로스피어 비드의 카르복시기의 결합에 의하여 탐침과 결합되는 것을 특징으로 하는

백혈병 진단용 키트.