KR100434949B1 - 유기태 셀레늄과 요오드 복합체를 함유하는 효모의제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 효모를 이용하여 친환경 복합 유기태 광물질인 유기태 셀레늄-요오드 복합체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 효모를 이용하여 무기태 광물질인 셀레늄(Se)과 요오드(I)를 유기태 광물질로 변환시키는 동시에 복합체를 형성시키는 것으로, 본 발명에 따라 제조되는 유기태 셀레늄-요오드 복합체는 각종 질병을 예방할 뿐만 아니라, 인체에 독성이 없고 흡수율이 높아 사료 첨가제, 건강기능식품 또는 의약품으로 활용될 수 있다.

Description

유기태 셀레늄과 요오드 복합체를 함유하는 효모의 제조방법{ Preparation method of yeast containing of organic Se-I complex}
본 발명은 효모를 이용한 유기태 셀레늄(se)-요오드(I) 복합체의 제조방법에 관한 것이다.
농업이 집약적으로 전개됨에 따라 토양내 이용 가능한 양질의 미량 광물질들은 해를 거듭할수록 감소되고 있는 실정으로, 그에 따라 토양에서 생산된 농작물에 있어서도 미량광물질들이 부족한 형편이다. 따라서 일반적으로 사료용 곡물 및 초지 등에서 미량광물질의 결핍을 보충하기 위하여 사료 배합 시에 무기태 미량광물질의 첨가가 필요하다.
미량광물질들의 동물 체내 함량은 다른 영양소에 비해 상대적으로 낮지만, 동물이나 인체에 미치는 효과 때문에 그 중요성은 점점 높아지고 있다. 동물들의 원료 사료 내에는 미량광물질의 함량이 부족 되는 경우가 많으므로 사료에 첨가하여 요구량을 충족시키기 위해서는 광물질 공급원들의 생물학적 이용성을 고려하는 것이 중요하다. 최근 들어 사료 첨가제로 무기태 광물질 보다 생물학적 이용성이 높을 뿐만 아니라 높은 소화 흡수율로 인해 적은 양으로 동물의 요구량을 공급 할 수 있으며, 또한 체내 흡수되므로 환경 친화적인 유기태 광물질에 대한 관심이 점점 높아지고 있다.
유기태 광물질은 소장에서 흡수될 때 일반적인 무기물 흡수경로인 능동수송 보다는 아미노산 또는 펩타이드가 흡수될 때 사용되는 활성 흡수를 통하여 체내로 흡수되므로 광물질간의 경합을 예방할 수 있으므로, 생물학적 이용율이 높을 뿐만 아니라 체내에서 빠르게 운송되어 장에서의 흡수가 촉진된다(Kim, Y. Y. and D. C. Mahan,J. Animal. Sci.,14(2), pp243-249, 2001). 켈리와 파워(Kelly, M. P. and R. F. Power,J. Dairy Sci.,78(suppl.1), p237, 1995)는 셀플렉스(selplex)의 형태로 세포질 용액(cell cytosol) 내 67 %의 셀레늄이 존재하며 미토콘드리아내에 11 % 존재 한다고 보고된 바 있다.
셀레늄(Selenium)은 1818년 스웨덴의 화학자 베렐리우스(J. J. Berelius)가 금속의 제련과정 중에 생긴 황산의 잔류물에서 발견하여 셀레늄이라 이름 붙인 것으로 50여 년 전까지는 중독광물질로 여겨져 왔었다. 그러나 1957년 스와쯔와 폴츠(Schwarz 와 Foltz)에 의해 셀레늄이 쥐의 간 손상을 예방할 수 있는 물질로 알려지고, 이후 생리적으로 세포질에서 항산화 역할을 하는 글루타치온 페록시다제(glutathione peroxidase, GSH-Px)의 구성성분이라는 것이 뒤늦게 밝혀지면서(Rotruck, J. T., et al.,Science,179, p588, 1973) 셀레늄이 필수 미량광물질로 인식되기 시작하였다. 특히 인체내 셀레늄 결핍시 GSH-Px의 활성을 떨어뜨려 대사과정 중에 생기는 산화물질인 H2O2를 효과적으로 제거하지 못하므로 세포의 기능장애 또는 세포의 파괴를 유발하게 된다(Sies, H., C., et al,FFES Lett.,27, pp171-175, 1972; Eklow, L., et al.,FESS Lett.,127, pp125-128, 1981). 또한, 동물이나 사람에게서 셀레늄의 결핍은 여러 가지 영양성 질병을 유발하는데, 생리적인 주요 변화로 성장지연, 피부병, 탈모, 시각장애, 번식장애, 간이나 근육의 괴사가 일어난다. 면양과 축우에서 발생하는 백근증(white muscle disease)은 근육조직의 괴사로 인하여 유발되는데, 셀레늄의 결핍으로 체내에서 형성된 과산화수소(H2O2)와 같은 산화물질들에 의해 근육내 미오글로빈이 파괴되어 근육 특유의 홍적색을 띄지 못하고 전체적으로 근육의 색깔이 엷어져서 흰색에 가까워 도살된 가축의 셀레늄 결핍 여부를 쉽게 판단할 수 있는 좋은 수단이 될 수 있다(Schwarz, K., et al.,Med. Clin. North Amercia,60, p745-457, 1976). 무기태 셀레늄(selenite 또는 selenate)은 단순 확산에 의해 흡수되므로 일반적으로 외관상 소화율이 80 %정도로 능동수송으로 운송되는 유기태 셀레늄 보다 높다(Kim, Y. Y. and D. C. Mahan,J. Animal. Sci.,14(2), pp243-249, 2001). 그러나 흡수된 무기태 셀레늄의 대부분은 뇨를 통해서 체외로 다시 배출되므로, 실제적으로 체내에 축적되는 셀레늄의 양은 체외로 배설되는 양이 상대적으로 적은 유기태 셀레늄 급여시에 더 높게 나타난다(Kim, Y. Y. and D. C. Mahan,J. Animal. Sci.,14(2), pp243-249, 2001).
최근 들어 셀레늄 강화 효모에 의한 유기태 셀레늄의 생산방법이 보편화되고 있는데, 황과 화학적 성질이 비슷한 셀레늄을 배지로 하여 효모를 배양한 후 효모 세포단백질을 수거하면 효모의 체단백질을 구성하고 있는 황 함유 아미노산들의 구성물질인 황이 셀레늄으로 치환되어 있으므로 황산염 대신 셀레늄을 함유한 유기태 셀레늄을 얻을 수 있다(Mahan, D. C.,Biotechnology in the feed industry,Proceedings of Alltech's 11th Annual symposium, pp257-267, 1995).
켈리와 파워(Kelly, M. P. and R. F. Power,J. Dairy Sci.,78(suppl.1), p237, 1995)는 셀레늄 강화 효모 중에 있는 94 %의 셀레늄은 여러 형태의 아미노산과 결합된 물질이며 그 중에서 셀레노메티오닌(selenomethionine)이 가장 대표적인 물질이라고 발표하였다.
이에 따라 효모를 이용한 유기태 셀레늄을 만들기 위한 많은 연구들이 진행되고 있다. 이들 연구들은 총 생산되는 효모의 양과 효모의 세포내로 유입되는 셀레늄의 양을 극대화하는 점에 초점이 맞추어져 있다.
요오드(Iodine)는 1811년 프랑스의 쿼타(B. Kurta)에 의해 발견되었으며, 가이루삭(J. L. Gayrusac)에 의해서, 그 증기가 보라색이므로 그러한 의미인 그리스어 요데스(iodes)라고 명명되었다. 요오드는 티록신(thyroxine)과 트리-요도-티록신(tri-iodo-thyroxine)을 합성하는데 이용되는데, 결핍되면 갑상선 비대증을 일으킨다. 갑상선종은 요오드가 부족하거나 또는 티록신의 요구량이 증가될 경우 갑상선이 이에 필요한 양을 전부 공급하기 위하여 무리한 작용을 하기 때문에 발생한다(Maeng, D. C. and Y. Y. Kim.,J. anim. Sci.,74, pp2711-2718, 1996)
따라서, 본 발명자는 셀레늄과 요오드의 효모 세포 내 축적률을 증가시킬 목적으로 먼저, 무기태 셀레늄과 요오드 농도에 따른 효모 균종(yeast strain) 별 성장률로 독성에 대한 내성 및 적응성을 평가하고, 그 결과를 바탕으로 선발된 셀레늄-요오드 생산 가능 균주의 특성을 평가한 다음, 그 결과를 바탕으로 유기태 전환율의 증대를 위한 최적 조건들을 결정함으로써, 효모를 이용한 유기태 셀레늄-요오드 복합체를 고수율로 생산하는데 성공하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 효모를 이용하여 친환경 복합 유기태 광물질인 유기태 셀레늄-요오드 복합체를 고수율로 생산하는 방법을 개발하기 위한 것이다.
도 1은 5 ℓ발효조 배양에서 YM 배지와 GY 배지를 이용한 각각 배양에서 균체의 생육에 관한 도이며,
도 2는 5 ℓ발효조에서 포도당의 농도변화에 따른 회분 배양에서 사카로마이세스 세레비지에의 균체량의 변화에 관한 도이며,
도 3a 내지 3c는 5 ℓ발효조에서 기하급수적 유가 배양에 의한 사카로마이세스 세레비지에의 시간대별 변화에 관한 것으로,
도 3a는 특이성장율 0.15 일때의 도이고,
도 3b는 특이성장율 0.2 일때의 도이며,
도 3c는 특이성장율, 0.25 일때의 도이며,
도 4는 배양 중 탄소원이 고갈되었을 때, 포도당을 가하는 간헐적 유가 배양을 행한 결과에 관한 도이고,
도 5는 5 ℓ종모 발효조에서 요오드와 셀레늄을 첨가하여 배양한 것에 관한 도이며,
도 6은 500 ℓ간헐적 유가배양한 것에 관한 도이고,
도 7은 액상발효물을 건조분말로 생산하는 방법에 대한 모식도이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효모를 이용한 유기태 셀레늄-요오드 복합체의 제조방법을 제공한다.
좀 더 구체적으로 본 발명은 (1)사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 칸디다 알비칸스(Candia albicans)의 종균을 배양하는 1단계, (2)사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)또는 칸디다 알비칸스(Candia albicans)의 종균을 본 배양하기 위하여, 요오드가 첨가된 배지에 접종하고 배양하는 2단계, (3)일정시간 배양 후, 셀레늄이 함유된 최적 유가배지를 첨가하고 배양하는 3단계, (4)복합 유기태 광물질로 셀레늄과 요오드 복합체를 함유하는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)또는 칸디다 알비칸스(Candia albicans) 균체를 농축, 세포파쇄 및 건조시켜 분말화하는 4단계를 포함하는 유기태 셀레늄-요오드 복합체의 제조방법을 제공한다.상기 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Ya(KCTC7107, 한국 생명공학 연구원 유전자 센터에서 분양), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Yb(KCTC7919, 한국 생명공학 연구원 유전자 센터에서 분양), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Yc(KCTC7928, 한국 생명공학 연구원 유전자 센터에서 분양), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Yd(KCTC7965, 한국 생명공학 연구원 유전자 센터에서 분양) 또는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Ye(KCTC7963, 한국 생명공학 연구원 유전자 센터에서 분양), 보다 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)Ya(KCTC7107, 한국 생명공학 연구원 유전자 센터에서 분양) 균주를 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 효모 배양용 배지는 모든 효모 배양용 배지를 포함하며, 바람직하게는 YM 배지 또는 GY 배지를 사용하고, 보다 바람직하게는 GY 배지를 사용한다.본 발명에서 상기 효모 배양시 파일럿 스케일은 5 ℓ, 500 ℓ, 또는 5000 ℓ의 발효조를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 5 ℓ의 발효조를 이용한다또한, 상기 효모 배양시 배지내 포도당과 효모 추출물의 비율은 배양액 1 ℓ당 40 내지 80:1, 바람직하게는 60 내지 70:1의 비율로 첨가할 수 있다.
한편, 포도당은 배양액 1 ℓ당 5 내지 20 g을 첨가할 수 있으며, 효모 추출물은 배양액 1 ℓ당 0.01 내지 1.0 g을 첨가하여 실시할 수 있다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 효모를 이용한 유기태 셀레늄-요오드 복합체의 제조방법은 (1)사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 칸디다 알비칸스(Candia albicans)의 종균을 배양하는 1단계, (2)사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 칸디다 알비칸스(Candia albicans)의 종균을 본 배양하기 위하여, 요오드가 첨가된 배지에 접종하고 배양하는 2단계, (3)일정시간 배양 후, 셀레늄이 함유된 최적 유가배지를 첨가하고 배양하는 3단계, (4)복합 유기태 광물질로 셀레늄과 요오드 복합체를 함유하는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 칸디다 알비칸스(Candia albicans) 균체를 농축, 세포파쇄 및 건조시켜 분말화하는 4단계를 포함한다.
구체적으로 제 1단계에서는, 상기 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 칸디다 알비칸스(Candia albicans)의 종균을 배양하기 위하여 테스트 튜브에 YMP 배지를 넣고 한천 평판의 콜로니를 접종하여 진탕배양기에서 25 내지 35 ℃, 120 내지 170 rpm의 조건으로 12 내지 48시간 배양하며, 이 배양액 1 내지 20 %(v/v)를 YMP배지가 들어있는 삼각 플라스크에 접종하여 상기와 동일한 조건으로 6 내지 24시간 배양하여 접종균으로 사용한다.
제 2단계에서는, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 칸디다 알비칸스(Candia albicans)의 종균을 본 배양하기 위하여 배양초기에 효모 배양배지에 요오드를 0.01 내지 1.0 g/ℓ, 바람직하게는 0.4 내지 0.6 g/ℓ, 더욱 바람직하게는 0.5 g/ℓ를 첨가한 다음(배지 내 요오드의 급여농도는 50 내지 5000 ppm으로 할 수 있으며, 바람직하게는 2000 ppm이하로 한다), 제 1단계에서 배양된 접종액을 1 내지 20 % 접종한 후에, 약산성 내지 중성의 pH에서 25 내지 35 ℃, 통기량 1 내지 5 vvm, 교반속도 10 내지 900 rpm의 조건으로 6 내지 48시간 배양한다. 이 때, 교반속도는 발효조의 크기에 따라 조절한다.
제 3단계에서는, 셀레늄을 함유한 유가배지를 첨가하는데, 상기 배지에는 배지의 구성성분으로 셀레늄 이외에, 포도당, 효모 추출물 및 황산나트륨이 부가적으로 포함될 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 셀레늄 공급원 중 무기 셀레늄으로는 셀레늄 및 셀레늄을 함유하는 모든 화합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 나트륨 셀레나이트(Na2SeO3)를 사용한다.
상기 유가배지 내 셀레늄의 급여농도는 50 내지 6000 ppm으로 할 수 있으며, 바람직하게는 500 ppm으로 한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 황산염(sulfate) 공급원으로는 황산나트륨(sodium sulfate), 황산칼륨(potassium sulfate), 황산암모늄(ammonium sulfate) 등 황산염을 함유하는 모든 화합물을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 황산나트륨을 사용한다.
셀레늄을 함유한 유가배지는 20 내지 40시간 배양 후 첨가하며, 셀레늄을 함유한 유가배지를 첨가한 후에 20 내지 30시간 더 배양한다.또한, 배양시 유가배양을 하며, 바람직하게는 간헐적 유가배양을 한다.
제 4단계에서는, 복합 유기태 광물질을 함유한 균체를 농축, 세포파쇄 및 건조하여 분말화하기 위하여, 막 분리 여과 장치를 이용한 농축, 세포 파쇄기를 이용한 세포파쇄 및 동결건조기를 이용하여 동결건조하여 복합 유기태 물질 즉, 셀레늄-요오드 복합체를 함유하는 효모를 제조한다..
본 발명에서 효모를 배양하기 위하여 회분 배양을 이용하며, 바람직하게는 유가 배양(fed-batch culture)을 한다.
또한, 유가배양시 기하급수적 유가 배양(Exponential fed-batch culture) 또는 간헐적 유가 배양(intermittent fed-batch culture)을 할 수 있으며, 바람직하게는 간헐적 유가 배양한다.
본 발명은 다음의 실시예 및 실험예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이에 의해 제한되지는 않는다.
참조예 1. MBRT(Methylene blue reduction time) 측정
세포외벽 셀레늄(Extra cellular selenium)의 농도는 나고다위타나 등(Nagodaawithana, T. et al., U. S. Patent, No. 4,530,846, 1985)의 방법에 따랐다.
먼저, 효모 균주 중 선택한 사카로마이세스 세레비지에(한국생명공학 연구원 유전자 센터) 1종의 배양액 1 ㎖를 원심분리(3000 ×g, 10 분)하여 얻은 침전물에 7 ㎖의 환원 용액(Reducing solution; 20 % 1-티오글리세롤(thioglycerol)/0.20 N 인산염 완충용액, pH 5.5)을 첨가하여 수초동안 혼합하였다. 3 분간 정치 후 질소 가스(Nitrogen gas)를 주입하고, 2 % 메틸렌 블루용액(Methylene blue solution) 100 ㎕를 첨가하여 혼합 시 푸른색이 사라지는 시간을 대조 셀레노메치오닌(Selenomethionine, Sigma사, USA)과 비교함으로서 유기태 전환율을 평가하였다
참조예 2. 요오드 정량
요오드의 정량은 ATSM(Standard test methods for I and Br ion in brackish water, seawater, and brines. D3869, 1995)의 방법에 따랐다.
먼저, 사카로마이세스 세레비지에 1종의 침전물(배양액 1 ㎖)을 0.85 % 염화나트륨용액으로 3 번 세척 후 알코올 5 %와 염화나트륨 1 %의 혼합용액 5 ㎖를 첨가하여 열풍건조기에서 60 ℃조건으로 24 시간동안 건조하였다. 건조 후 초음파 균질기로 30 분간 균질하여 효모균주를 완전히 파쇄한 후, 파쇄된 효모 균질액을 3000 rpm, 5분의 조건으로 원심분리하여 얻은 상등액에 염산 1㎖를 첨가하여 완전히 산성화시킨 후 다시 질산 칼륨 용액(KNO2) 1 ㎖를 첨가한 다음, 여기에 다시 사염화탄소(CCl4)용액 1 ㎖를 첨가하여 530 nm조건의 ELISA 리더에서 광학밀도를 측정하였다.
참조예 3. 셀레늄 정량
총 셀레늄의 농도는 시료 1 g을 비이커에 측량하고 질산(HNO3) 20 ㎖와 인산(H3PO4) 1㎖를 주입하여 하룻밤 방치한 후, 뜨거운 평판(Hot plate) 위에서 시료액이 반으로 줄어들 때까지 가열 증발 후, No.6 여과지로 여과하여 100 ㎖ 부피의 플라스크에 정용한 후, ICP 방출 스펙트로메터(ICP Emission Spectrometer, Jobin Yvon사, France)를 이용하여 측정하였다.
실시예 1. 효모 균주 선발
본 연구에 이용할 균주를 선발하기 위하여 한국 생명공학 연구원 유전자 센터로부터 사카로마이세스 세레비지에, 칸디다 알비칸스 균주 외 18종의 효모 균종(yeast strain)을 분양 받아 선발에 이용하였다.
분양받은 동결 균주는 해동하여 평판 배지에 도말, 24시간 배양한 후, 생성된 콜로니를 다시 YM 배지(YM media : 효모 추출물 3 g, 맥아 추출물 3 g, 펩톤 5 g, 포도당 20 g) 10 ㎖에 24시간 배양한 후, 50 % 글리세롤(Glycerol)과 1대 1로 혼합하여 -80 ℃ 초저온 냉동고(Deep freezer)에 보관하였다.
본 연구에서 셀레늄 및 요오드의 유기태 전환율이 높은 균주 선발을 위하여 각 균종의 양이온(cation) 이용효율을 검증하기 위한 기초 조사(Rose, A. H., F.A., 1980) 결과와 각각의 균종에 대한 선택 배지(selecting media)의 조성, 세포 중량, 온도, pH 등을 고려하여 5개의 균주를 선발하여 성장곡선과 세포 중량을 비교 검토하여 사카로마이세스 세레비지에 4종과 칸디다 알비칸스 1종 등 총 5종을 선발하였으며, 그 중 사카로마이세스 세레비지에 Ya 1종을 본 실험에 이용하였다.
실시예 2. 셀레늄과 요오드에 대한 효모 선택 균주의 유기태 전환율
효모 중 상기 실시예 1에서 선택된 균주인 사카로마이세스 세레비지에 Ya를 셀레늄(아셀렌산염 나트륨(Sodium selenite)으로 첨가) 500 ppm과 요오드(요오드 칼륨(potassium iodine)으로 첨가)를 500, 1000, 1500 및 2000 ppm의 농도로 첨가한 YM 배지에서 24 시간동안 배양하여 세포 중량 및 셀레늄, 요오드의 농도를 측정하였으며, 셀레늄의 유기태 전환율을 MBRT를 이용하여 평가하였다.
그 결과, 하기 표 1에서 볼 수 있는 것처럼, 세포중량(dry mater basis)은 요오드 농도가 각각 500, 1000, 1500 및 2000 ppm일 경우 1.65, 2.11, 2.18 및 1.87 %로, 1500 ppm에서 가장 높은 결과를 나타내었으며(P<0.05), 효모 세포 내에 존재하는 요오드의 양은 500 ppm 처리 시 3509 ppm으로서 다른 처리농도에 비해 유의하게 높았다(P<0.05).
효모 세포에 존재하는 셀레늄의 유기태 전환율 평가결과인 MBRT는 500, 1000, 1500 및 2000 ppm에서 각각 1420, 1657, 1890 및 2022로서 요오드 농도 증가에 따라 높아지는 경향을 나타내었다.
요오드첨가농도(ppm) 세포 중량(%) 요오드(ppm) MBRT(초)
500 1.65C±0.02 3509.09 ±9.000 1420.3 ±38.44
1000 2.11A±0.06 3347.00 ±337.00 1657.5 ±34.92
1500 2.18A±0.02 1813.00 ±173.00 1890.7 ±33.67
2000 1.87B±0.08 2890.00 ±10.00 2022.2 ±3.67
* 수치는 3회 반복 측정의 평균 ±SE같은 칼럼에서 다른 윗첨자를 가진 평균은 유의적으로 다르다(P<0.05)
실시예 3. 제조된 유기태 효모 셀레늄의 안전성 검토 및 흡수율 조사
흰쥐를 이용하여 파일럿 규모(pilot-scale)의 발효조를 이용하여 제조한 효모 셀레늄의 안전성 및 흡수효율을 무기태 셀레늄과 비교 조사하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 생후 5주령의 SD계 수컷 흰쥐 20마리를 공시하여 온도 22 ±2 ℃, 상대습도 50 ∼ 60 %, 12시간의 명암주기로 설정된 환경조절 대사실의 개별 우리(cage)에서 10일간의 적응기간을 거쳐 3일간의 실험에 공시하고, 실험사료 및 물을 자유롭게 섭취토록 하였다. 공시한 동물들을 10마리씩 2개의 처리구로 임의 배치하여 유기태 셀레늄은 효모 셀레늄을 사용하고, 무기태 셀레늄은 아셀렌산염 나트륨(sodium selenite)을 사용하였다. 각각의 처리구의 쥐에게 유기태와 무기태 셀레늄의 농도가 섭취사료 기준으로 2 mg/kg 되도록 매일 1 ㎖씩 경구투여 하였다.실험기간동안 흰쥐들의 사료섭취량, 체중 및 배설물은 매일 측정하였다. 배설물은 40 ℃에서 3일간 건조 후 곱게 분쇄하여 셀레늄 분석에 이용하였다.
그 결과 일당증체량은 하기 표 2에서 볼 수 있는 것처럼, 효모 셀레늄 급여구에서 5.1 g/일 이였으며, 아셀렌산염 나트륨(sodium selenite) 급여구에서 5.3 g/일 이였다. 이 증체량은 본 실험에서 공시한 SD계 흰쥐의 표준 증체량과 큰 차이가 없는 것으로 본 연구에서 제조한 효모 셀레늄은 비록 짧은 기간에서의 평가이지만 안전한 것으로 평가되었다.
셀레늄의 흡수효율을 무기태 셀레늄과 비교 조사한 결과, 하기 표3과 같이 효모 셀레늄의 Se의 흡수율이 79.16 %, 아셀렌산염 나트륨의 셀레늄의 흡수율이 78.72 %로 나타나 효모 셀레늄의 셀레늄 흡수율이 약간 높았으나 무기태인 아셀렌산염 나트륨의 셀레늄의 흡수율보다 유의하게 높은 결과를 나타내지 않았다.
처치 체중(g)
초기 종료 증가 증가/일
효모 셀레늄 171.0 ±1.5 227.0 ±8.8 56.0 ±8.0 5.1 ±0.7
아셀렌산염 나트륨 170.3 ±1.5 228.9 ±5.0 58.6 ±4.8 5.3 ±0.4
항목 효모 셀레늄 아셀렌산염 나트륨
셀레늄 흡수율 (%) 79.16 ±0.96 78.12 ±1.06
실시예 4. 파일럿 스케일(Pilot-scale)에서의 배양공정 개발
4-1. 유가배양에서의 사용균주 및 배양법
본 실험에 사용한 균주는 실시예 1에서 선택된 사카로마이세스 세레비지에 Ya 균주이다. 배양에 사용된 배지는 종균배양에서 YMP 배지를 기본배지로 사용하였으며 본 배양의 배지는 변형된 배지(modified medium, 이하 GY 배지로 명명함)을 사용하였다. 각각의 배지 조성은 포도당 10 g/ℓ, 효모 추출물 3g/ℓ, 맥아 추출물 3 g/ℓ, 펩톤 3 g/ℓ이고 포도당 15.0 g/ℓ, 효모 추출물 6.0 g/ℓ, 황산마그네슘(MgSO4) 0.5 g/ℓ, 황산암모늄((NH4)2SO43.0 g/ ℓ, 인산제이칼륨(K2HPO4) 1.5 g/ℓ이다. 유가배양에서의 유가(feeding)용 배지의 조성은 포도당 400.0 g/ℓ, 효모 추출물 40.0 g/ℓ, 황산마그네슘 6.0 g/ℓ, 황산암모늄 40.0 g/ℓ, 인산제이칼륨16.0 g/ℓ이다.
종균배양은 35 ㎖ 시료 튜브(test tube)에 10 ㎖의 YMP배지를 넣고 한천 평판(agar plate)의 콜로니를 접종하여 진탕 배양기(Jeio tech, SI-600R)에서 30 ℃, 150 rpm의 조건으로 21시간 배양하였으며, 이 배양액 5 %(V/V)를 YMP 배지 100 ㎖가 들어 있는 500 ㎖ 삼각 플라스크에 접종하여 30 ℃, 150 rpm의 조건으로 12시간 진탕 배양하여 접종균으로 사용하였다.
본 배양은 5 ℓ, 500 ℓ및 5000 ℓ-발효조에서 각각 구분하여 행하였다.
5 ℓ배양의 경우는 5 ℓ발효조에 2 ℓ의 GY배지를 넣고 상기의 접종액 5 %를 접종한 후에, pH 5.5, 30 ℃, 통기량 1~2 vvm 그리고 교반속도는 300 ~ 800 rpm으로 조절하였다.
500 ℓ배양의 경우는 온도, pH 및 통기 량은 5 ℓ발효조와 동일 조건으로 사용하였고, 교반속도는 각각 100 ~ 300 rpm과 50 ~ 170 rpm으로 조절하였으며, 접종균은 각각 상기 접종액 5 % 와 50 ℓ 발효조 (150 rpm, 14시간)배양액 10 %를 사용하였다.
균체량 측정은 배양액 중의 균체량은 분광광도계를 사용하여 600 nm에서 측정하였다. 흡광도로부터의 건조 균체 중량으로 환산은 흡광도치에 환산계수 0.276 (g 건조 세포/OD600)을 곱하여 계산하였다. 포도당 측정은 배양액 중에 잔존하는 포도당은 배양액 시료로부터 균체를 냉동원심분리기로 4 ℃, 8000 rpm, 30분간 원심 분리하여 균체를 제거한 상등액을 포도당 분석기(glucose analyzer)로 측정하였다. 유기태 셀레늄 측정은 건조 균체내에 유기태 셀레늄을 전부 셀레늄으로 분해시킨 후에 셀레늄량을 측정하는 것으로 형광분석(Fluorometric assay)법으로 형광분석기(spectroflurometer)로 측정하였다. 이 분석은 과학 기술 분석 센터에 의뢰하여 측정하였다.
4-2. 발효조 배양에서의 기초 실험
5 ℓ발효조 배양에서의 생산배지를 결정하기 위하여, 실시예 4-1의 플라스크 배양에서 사용한 YM배지와 일반적으로 사카로마이세스 세레비지에 발효조용 생산배지인 GY배지를 이용하여 각각 2 ℓ의 배지가 함유된 발효조에서 14시간 회분 배양하여 균체의 증식을 비교 검토하였으며, 또한 5 ℓ-발효조 배양에서의 균체의 최대생산을 위한 기본 테스트로 최적 유가(feeding )배지 즉, 0.5 g/ℓ셀레늄, 0.17 g/ℓ효모 추출물, 0.67 g/ℓ황산 나트륨 및 11.25 g/ℓ포도당이 포함된 배지를 배양 14시간째에 첨가하여 5 시간동안의 균체 증식을 조사하였다. 이때 요오드는 배양초기 배지에 0.5 g/ℓ되도록 첨가하였다. 한편 유가배양의 가능성 여부를 조사하기 위하여 먼저 탄소원인 포도당의 농도변화 즉, 1.5 g/ℓ, 3 g/ℓ및 15 g/ℓ에 따른 회분배양에서의 균체량의 변화를 배양 11시간 동안 검토하였다.
5 ℓ발효조 배양에서 YM배지와 GY배지를 이용하여 각각의 배양에서 균체 생육을 비교 검토하였으며 그 결과는 도 1과 같다.
도 1에서 보는바와 같이 배양 12시간 경과 후, GY배지와 YM배지에서의 균체량은 각각 7 g/ℓ와 3.5 g/ℓ로서 GY배지에서의 균체생육이 YM 배지에서보다 약 2배 높았다.
또한 5 ℓ-발효조 배양에서 최적 유가(feeding) 배지 즉, 셀레늄, 포도당, 효모 추출물 및 황산 나트륨(sodium sulfate)이 포함된 배지를 첨가하여 균체의 생육 상태를 확인하였는데, 이 때, 유가배지는 각각 탄소원이 고갈되는 시점인 배양 14시간째에 첨가하였고, 그 결과 유가배지 첨가로 인하여 균체 증가는 나타나지 않았으나 균체의 증식이 일정하게 유지되었으며, YM배지와 GY배지에서 같은 양상을 보이는 것을 알 수 있었다.
이와 같은 결과로 볼 때 YM배지 보다 GY 배지를 사용하는 경우에서 균체 생육이 우수할 뿐 아니라 셀레늄 배지 첨가의 영향이 같으므로 발효조 배양시 생산배지를 GY배지로 사용하였다.
한편 5 ℓ발효조에서 탄소원인 포도당의 농도변화(1.5 g/ℓ, 3 g/ℓ, 15 g/ℓ)에 따른 회분배양에서의 균체량의 변화를 검토하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이 포도당의 농도 증가에 따라 균체량은 증가를 보였다. 그러나 15 % 포도당에서는 배양초기 포도당의 양이 증가함에 따라 지체시간(lag time)이 길어지는 현상이 나타났으며, 균체량은 1.5 % 포도당에서 보다 단지 약 2배의 증가를 보였으며, 포도당 당 균체량은 감소하는 경향을 보였다. 이는 배양초기의 다량의 포도당이 균체 생육을 억제하기 때문에 나타나는 현상으로 다른 사카로마이세스 세레비지에 발효조 배양에서와 같은 결과를 보였다. 따라서 최적의 균체량을 얻기 위하여 유가회분(fed-batch)을 실시하는 것이 바람직한 것으로 평가되었다.
4-3. 유가배양 조건 검색 및 균체 최대생산
상기 실시예 4-2의 플라스크 배양의 결과를 바탕으로 복합 유기태 광물질이 함유된 균체를 효율적으로 얻기 위하여, 배양 24시간 후에 셀레늄, 포도당, 효모 추출물 및 황산 나트륨이 각각 0.5 g/ℓ, 11.25 g/ℓ, 0.17 g/ℓ및 0.67 g/ℓ 함유하도록 조제된 배지를 첨가한 후에 24시간 배양하는 조건이 최적 조건으로 설정되었다. 따라서 유가회분에서 복합 유기태 광물질을 함유한 균체를 대량생산 하기 위한 전략으로 먼저, 유가배양 조건으로 효모 성장에 따라 배지를 첨가하는 두 가지 방식 즉, 기하급수적 유가 배양(exponential fed-batch culture) 및 간헐적 유가 배양(intermittent fed-batch culture)의 조건으로 균체 최대생산에 맞는 최적 유가 방식을 검토한 후에 선택된 유가회분 조건으로 최대 균체량을 얻는 것으로 하였다. 두 번째로 최대 균체량이 얻어지는 배양시간에 셀레늄을 첨가하여 24시간 배양한 후에 얻어지는 균체를 회수하는 것으로 하였다.
기하급수적 유가 배양은 배지 내에 탄소원이 고갈되는 시점부터 미생물의 특정 성장율(1/h)에서의 탄소원에 대한 미생물 균체 수율을 구하여 배지의 공급을 조절하는 방식으로서 개인 컴퓨터로 조절된 기하급수적 유가 방법(personal computer-controlled exponetial feeding method)으로 실시하였다. 유가(Fed-batch)(F)는 미생물의 특정 성장율(μ, 1/h)값을 각각 0.15, 0.2 및 0.25로 하여 g하기 수학식 1을 이용하여 유가 배지를 공급하여 검토하였다.
유가(F) = (μ·V0·X0/ Y·SF)exp(μ·t)
μ= 특이 성장율(μ, 1/h)
V0, = 초기 발효액 부피(ℓ)
X0, = 초기 균체(세포) 농도(g/ℓ)
Y = 포도당에 대한 균체(세포) 수율(g-세포/g-포도당)
SF= 유가 포도당(feeding glucose) 농도
기하급수적 유가(Exponential fed-batch) 배양에서 유가는 배양 중에 효모에 의해 고갈되는 포도당이 고갈되는 시점을 배양 발효조에 부착된 CO2분석기의 온-라인(on-line) 데이터 값, 즉 배양 경과에 따라 측정된 CO2값이 급격히 감소하는 것을 신호로 하여 유가배양을 개시하였다. 두 가지 방식의 유가 배양은 2 ℓ의 초기 배지로 배양을 시작하여 1 ℓ의 유가 배지가 완전히 소모되는 시점에서 배양을 정지하였다.
간헐적 유가 배양(Intermittent fed batch culture)의 경우는 배지 내에 탄소원이 고갈된 후 배지의 pH가 상승하게 되고 이로 인해 산(acid)이 들어가는 원리(pH 스탓(stat))를 이용하여 유가 배지를 산 라인(acid line)에 연결한 후 배지의 pH가 상승하게 되면 일정량의 유가 배지가 발효조 내로 공급되도록 하여 유가배양을 행하였다.
5 ℓ종모 발효조(jar-fermenter)에서 기하급수적 유가 배양은 특정 성장율(the specific growth rate, μ,1/h)값을 각각 0.15, 0.2 및 0.25로 조절하여 실시하였으며, 그 결과를 도 3a, 도 3b 및 도 3c에 나타내었다.
도 3a에서 보는 바와 같이 포도당은 배양 5시간 후에 소모되었으며 이때의 균체량은 3.5 g/ℓ, 에탄올은 4.5 g/ℓ를 나타냈다. 따라서 유가(feeding)는 배양 5시간부터 시작되었으며 균체 증식은 유가 초기와 유가 후기에서 증식속도가 다른것을 알 수 있었다. 즉, μ값은 배양 14시간을 분기점으로 0.15와 0.060으로 조절되었으며, 배양 24시간에 유가가 완료되어 균체량이 29.4 g/ℓ이 얻어졌다. 배양 중에 에탄올은 배양 5시간에 4.5 g/ℓ을 생성한 후 변화가 없었으나 배양 16시간부터 서서히 생성되어 배양 24시간에 8 g/ℓ을 나타냈다. 이는 균체가 배양 16시간 이후부터 포도당을 소모하여 균체 뿐만 아니라 에탄올을 생성하는 것으로 나타났으며, 배양액에 축적된 에탄올은 균체 증식에 영향을 주어 배양후반부에 μ값을 감소시키는 것으로 나타났다.
도 3b는 μ값을 0.2로 조절(control)한 결과를 나타낸 것으로, μ값은 배양 14시간을 분기점으로 0.2와 0.066으로 조절되었으며, 배양 17.5시간에 유가가 완료되어 균체량이 23.14 g/ℓ얻어졌다. 배양 중에 에탄올은 배양 초부터 서서히 진행되어 배양 14시간에 6 g/ℓ을 나타냈으며, 14시간 이후부터는 급격히 생성되었다.
도 3c는 μ값을 0.25로 조절한 결과를 나타낸 것으로, μ값이 배양 12시간을 분기점으로 0.25와 0.1로 조절되었으며, 배양 16시간에 유가가 완료되어 균체량이 24.6 g/ℓ이 얻어졌다. 배양 중에 에탄올은 배양 초부터 서서히 진행되어 배양 12시간에 6 g/ℓ을 나타냈으며, 14시간 이후부터는 급격히 생성되어 19 g/ℓ까지 생성되었다. 위의 결과를 종합하여 볼 때 유가 중기에 μ값이 급격히 감소하는 것은 포도당이 에탄올을 생성하기 때문이고, μ값이 높을수록 균체량은 증가를 보이나 에탄올도 같이 생성되기 때문에 에탄올 생성량이 증가하여, 생성된 에탄올에 의해 균체 증식이 저해를 받는 것으로 나타났다. 이는 다른 사카로마이세스 세레비지에 균주 배양에서도 나타나는 현상으로 배지 중 5 g/ℓ이상의 에탄올에 의해서 균체생육이 저해되고 또한 10 kg/ℓ이상의 농도에 에탄올 생성을 저해시키는 것으로 알려져 있다. 하지만 본 실험에 사용된 균주는 μ값이 0.25일 때 에탄올이 19 g/ℓ까지도 생성되는 균주로 μ값을 낮게 조절해주면서 에탄올의 생성량을 줄이며 배양하는 것이 바람직하리라 사료된다. 그러나 낮은 μ값에서는 총 유가 시간이 길어져 생산성이 낮아지는 문제가 있다.
따라서 배양 중 탄소원이 고갈될 때 포도당을 가하는 상기의 간헐적 유가 배양을 행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
유가는 배양 8시간에 시작되었는데 이는 배양 5시간째에 포도당은 고갈되었으나 배지 중에 에탄올이 4.5 g/ℓ존재하므로 에탄올을 이용하여 균체의 증식이 진행되며 에탄올이 소모된 후에 pH가 상승되므로, 이를 신호로 유가되었기 때문이다. 도 6에서 볼 수 있는 것처럼, 유가 개시 후, μ값은 배양 14시간을 분기점으로 0.2와 0.1로 조절되었으며, 배양 35시간에 유가가 완료되어 균체량이 50 g/ℓ이 얻어졌다. 배양 중에 에탄올은 유가 개시 후 4.5 g/ℓ이하의 생성량을 나타내었으며 유가 후기에는 같은 생산량을 유지하여 이로 인해 균체 생성량이 증가하였다.
상기의 유가(fed-batch)의 결과를 평가하기 위하여 각 조건에서의 공정변수의 상관관계를 표 4에 나타내었다.
표 4에서 보는 바와 같이, 기하급수적 유가 배양에서는 μ값이 낮을수록 균체 수율치 및 최고 균체량이 증가를 보이나 유가시간이 길어져서 포도당 소모속도(Qs, 포도당/g 세포/h)값이 정상 값에 다다르지 못하였다. 이는 기하급수적 유가 배양으로는 낮은 μ값으로 조절한다고 해도 Qs값을 감소시킬 수 없으므로최고 균체량 Xm을 증가시킬 수 없는 것으로 사용된다. 간헐적 유가 배양 결과는 Qs값이 0.081으로 최대의 포도당 이용률을 보였을 뿐 아니라 Xm 및 Y x/s의 값이 가장 높아 본 실험에서 가장 우수한 유가배양 조건으로 평가되었다.
특정 성장률μ(1/h) 배양시간t (h) 세포 수율Yx/s(-) 최대 세포 농도Xm (g/ℓ) 세포 생산력Qp (g/ℓ/h) 포도당 소비율Qs (g/g/h)
0.15 24 0.2 29.4 1.17 0.20
0.2 17.5 0.16 23 1.28 0.35
0.25 16 0.17 24.6 1.49 0.36
간헐적 유가 35 0.34 50 1.36 0.08
4-4. 발효조 배양에서의 요오드와 셀레늄의 첨가
실시예 4-3의 최대 균체량 생산 조건인 간헐적 유가 배양으로 5 ℓ 종모 발효조(jar-fermenter)에서 행하였다. 요오드는 배양 초기에 0.5 g/ℓ가 되도록 요오드 칼륨(potassium iodine)을 YMP배지에 첨가하여 35시간 동안 진행하였다. 셀레늄은 35시간의 간헐적 유가 배양 후에 남아있는 에탄올을 소모시켜 균체를 기아 상태로 만들기 위하여, 3시간 경과 후에 나트륨 셀레나이트(sodium selenite)가 2 ℓ배양액에 0.05 g/ℓ함유하도록, 셀레늄, 포도당, 효모 추출물 및 황산나트륨을 각각 0.5 g/ℓ, 11.25 g/ℓ, 0.17 g/ℓ및 0.67 g/ℓ이 함유된 유가 배지 300 ㎖를 첨가하여 24시간 배양하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 볼 수 있는 것처럼, 요오드 칼륨 및 소디움 셀레나이트를 첨가한 후에 배양 4시간까지 균체량은 약간의 증가를 보였으나 그 이후 시간에 균체량은일정하게 유지되었다. 이는 유가 배지 내 최소량의 포도당 및 효모 추출물이 존재할 뿐 아니라 셀레늄이 일부 균체 증식의 에너지원으로 작용하기 때문으로 배양 24시간 후에 균체량의 감소 없이 52 g/ℓ의 균체를 얻을 수 있었다. 얻어진 배양액은 후기의 실시예 4-6의 균체의 분리 방법으로 균체 농축액을 회수하여 동결 건조하였으며, 건조분말내의 셀레늄 및 요오드 량을 참조예 2 내지 3의 방법에 따라 측정한 결과, 8147 ppm 과 4380 ppm이 함유되어 있는 것을 확인 할 수 있었다.
4-5. 파일럿-스케일에서의 균체 대량 생산
500 ℓ및 5000 ℓ발효조에서의 복합 유기태 광물질이 함유된 균체의 생산을 실현하기 위하여, 간헐적 유가 배양을 각각 행하였으며, 각 배양에 대한 공정변수들을 비교하였고, 도 6에 500 ℓ발효조에서 간헐적 유가 배양한 결과를 나타내었다.
도 6에서 볼 수 있는 것처럼, 배양 10시간째부터 유가는 시작되었고, 배양 14시간을 분기점으로 ℓ값은 각각 0.2와 0.6으로 조절되었다. 유가 배지는 배양 42시간에 다 소모되었으며, 이 때의 균체량은 45 g/ℓ였다.
또한, 간헐적 유가 배양, 5 ℓ, 500 ℓ및 5000 ℓ의 결과로부터 각 배양의 공정변수를 구하였으며, 하기 표 5에 나타내었다.
표 5에서 볼 수 있는 것처럼, 5 ℓ, 500 ℓ및 5000 ℓ에서의 총 배양시간은 각각 35 h, 42 h 및 43 h로써 500 ℓ배양시 총 배양시간이 5 ℓ배양과 비교해 볼 때 시간이 더 길어졌으며, 5000 ℓ와는 큰 차이가 없었으며, 이로 인하여 Y x/s,Xm, Qp 및 Qs에도 영향을 주어 5000 ℓ로 갈수록 낮아지는 결과를 보였다. 이와 같은 결과는 스케일 업(scale up)과정에서 생기는 현상으로 회전속도 및 공기(air)공급 등의 영향으로 인하여 나타났다.
발효 유형 배양시간t (h) 세포 수율Yx/s(-) 최대 세포 농도Xm(g/ℓ) 세포 생산력Qp (g/ℓ/h) 포도당 소비율Qs (g/g/h)
5 ℓ 35 0.34 50 1.36 0.080
500 ℓ 42 0.31 45 1.03 0.074
5000 ℓ 43 0.31 44.3 1.01 0.073
한편 각 배양액은 하기 실시예 4-6의 방법으로 건조분말을 얻었으며 유기태 셀레늄 함량을 예측하기 위해 건조분말내의 셀레늄 함량 및 요오드를 측정하여하기 표 6에 나타내었다.
하기 표 6에서 볼 수 있는 것처럼, 5ℓ, 500 ℓ및 5000 ℓ에서의 셀레늄 함량은 각각 8147 ppm, 7527 ppm 및 6082 ppm였고, 요오드 함량은 각각 4380 ppm, 3908 ppm 및 3600 ppm을 나타내었다. 셀레늄 및 요오드 함량은 발효조 스케일이 커질수록 적은 값을 나타내었다.
발효 유형 건조 분말에서 셀레늄 농도(ppm) 건조분말에서 요오드 농도(ppm)
5 ℓ 8147 4380
500 ℓ 7527 3908
5000 ℓ 6082 3600
4-6. 복합 유기태 광물질을 함유한 균체의 농축 및 건조
복합 유기태 광물질 건조물을 얻기 위하여 발효 배양액으로부터 균체를 농축 및 건조하는 공정을 개발하였다. 5000 ℓ발효조에서 배양을 종료한 후에 얻어진 3000 ℓ배양액으로부터 균체의 농축 및 건조는 5000 ℓ발효조에 연결된 막 분리 여과 장치(vibration membrane filter)인 Pall-sep (pall sep VMF 400 시스템), 분산매체를 비즈(beads)로 이용하는 세포파쇄기(SPM-15) 및 동결건조기를 사용하여 실시하였으며, 그 수율을 평가하였다. 균체의 농축 및 건조 분말 제조의 공정도는 도 7에 나타내었다.
도 7에서 보는 바와 같이 5000 ℓ발효조에서 배양을 종료한 후에 얻어진 3000 ℓ배양액으로부터 균체를 분리하기 위해서 5000 ℓ발효조에 연결된 막 분리 여과 장치(vibration membrane filter)인 Pall-sep (pallsep VMF 400system)을 이용하였다. Pall-sep의 0.45 ㎛ 여과막(membrane filter)에서 얻어진 균체 농축액은 다시 5000 ℓ　발효조로 회수하였고 600 ℓ의 농축 배양액을 얻었으며, 4시간이 소요되었다. 얻어진 균체는 세척하기 위하여 1200 ℓ의 물을 5000 ℓ 발효조에 첨가하여 다시 Pall-sep을 통과시켜 600 ℓ의 균체 농축액을 얻었으며, 소요 시간은 4시간이었다. 이러한 세척공정을 2회 반복하였으며, 마지막 세척공정에서는 300 ℓ까지 농축하였고 5시간이 소요되었다. 농축된 300 ℓ배양액은 다음 공정으로 세포파쇄기를 이용하여 균체를 파쇄하였다. 이 때, 세포파쇄기의 작업볼륨(working volume)은 16.9 ℓ로 100 rpm에서 연속공정으로 시간당 100 ℓ의 농축액을 처리하여 300 ℓ를 파쇄하는데 3시간이 소요되었다. 파쇄 농축액은 300 ℓ동결건조기에서 3일간 건조하여 138 kg의 균체를 얻었다.
즉, 표 7에서 보는 바와 같이 3000 ℓ배양액으로부터 농축과 동결건조를 거친 후에 얻어진 균체량은 138 kg으로써 수율은 4.3 % 였고, 배양액의 건조 균체량 대비 회수량은 90 %로 나타났다.
발효액 발효액에서 총 건조세포 동결건조로부터 얻어진 건조분말 발효액당회수율 발효액에서회수율
3000 ℓ 145 130 4.3 90
본 발명에 따라 제조되는 효모를 이용한 유기태 셀레늄-요오드 복합체는 각종 질병을 예방할 뿐만 아니라, 인체에 독성이 없으며, 흡수율이 높아 사료 첨가제, 건강기능식품 또는 의약품으로 활용될 수 있다.

Claims (14)

  1. (1)사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 칸디다 알비칸스(Candia albicans)의 종균을 배양하는 1단계, (2)사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)또는 칸디다 알비칸스(Candia albicans)의 종균을 본 배양하기 위하여, 요오드가 첨가된 배지에 접종하고 배양하는 2단계, (3)일정시간 배양 후, 셀레늄이 함유된 최적 유가배지를 첨가하고 배양하는 3단계, (4)복합 유기태 광물질로 셀레늄과 요오드 복합체를 함유하는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)또는 칸디다 알비칸스(Candia albicans) 균체를 농축, 세포파쇄 및 건조시켜 분말화하는 4단계를 포함하는 유기태 셀레늄-요오드 복합체의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Ya(KCTC7107, 한국 생명공학 연구원 유전자 센터에서 분양), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Yb(KCTC7919, 한국 생명공학 연구원 유전자 센터에서 분양), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Yc(KCTC7928, 한국 생명공학 연구원 유전자 센터에서 분양), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Yd(KCTC7965, 한국 생명공학 연구원 유전자 센터에서 분양) 또는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Ye(KCTC7963, 한국 생명공학 연구원 유전자 센터에서 분양)인 제조방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 (Saccharomyces cerevisiae)는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Ya(KCTC7107, 한국 생명공학 연구원 유전자 센터에서 분양)인 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 제 2단계 및 제 3단계에서 사용한 배지는 GY 배지인 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서, 제 2단계의 요오드는 효모 배양배지에 요오드를 0.1 내지 1.0. g/ℓ첨가됨을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제 1항에 있어서, 제 3단계에서 사용된 유가배지 내 셀레늄의 급여농도는 50 내지 6000 ppm인 제조방법.
  8. 제 7항에 있어서, 셀레늄의 급여농도는 500 ppm인 제조방법.
  9. 제 1항에 있어서, 제 3단계의 셀레늄을 함유한 유가배지는 배지의 구성성분으로 셀레늄 이외에, 포도당, 효모 추출물 및 황산나트륨이 부가적으로 포함된 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제 1항에 있어서, 제3단계의 셀레늄 공급원이 무기 셀레늄으로는 셀레늄 및 셀레늄을 함유하는 모든 화합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 셀레늄 공급원이 나트륨 셀레나이트인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제 1항에 있어서, 제 3단계에서 배양 종류는 간헐적 유가 배양인 제조방법.
  13. 제 1항에 있어서, 제 3단계에서 사용된 셀레늄을 함유한 유가배지는 20 내지 40시간 배양 후 첨가하며, 셀레늄을 함유한 유가배지를 첨가한 후에 20 내지 30시간 더 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제 1항에 있어서, 제 4단계에서, 복합 유기태 광물질을 함유한 균체를 막 분리 여과 장치를 이용한 농축, 세포 파쇄기를 이용한 세포파쇄 및 동결건조기를 이용하여 동결건조하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR100855357B1 (ko) 2007-01-29 2008-09-04 주식회사 한국수리미 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법 및 상기제조방법으로 제조된 사료 첨가제
KR101231652B1 (ko) * 2010-12-30 2013-02-08 건국대학교 산학협력단 개량된 유기태 셀레늄 생산성을 가지는 사카로마이세스 셀레비지애 돌연변이체
KR20220068629A (ko) * 2020-11-19 2022-05-26 강원대학교산학협력단 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자 및 그 제조방법

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KR102493040B1 (ko) 2020-11-19 2023-01-27 강원대학교산학협력단 고려엉겅퀴 잎 추출물을 이용한 셀레늄 나노 입자 및 그 제조방법

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