KR100432953B1 - Recombinant Adenovirus with Enhanced Tumoricidal Effect - Google Patents
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Abstract
본 발명은 개선된 종양 살상 효과를 나타내는 아데노바이러스 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아데노바이러스 ElB 19 유전자의 발현이 억제되도록 ElB 19 유전자에 변이를 유발하여 종양 세포 괴사 및 고사를 동시에 유도하여 종양 세포 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 감염된 세포에서 세포 괴사 및 세포 고사를 동시에 유도하여 종양 세포 살상능이 크게 향상되어 종래의 재조합 아데노바이러스에 의한 종양 치료 방법의 한계를 극복할 수 있으며, 더욱이 본 발명의 약제학적 조성물은 종래의 암 치료방법, 특히 세포 고사를 유도하는 암 치료 방법과 병행하여 이용되는 경우에는 치료 효과를 극대화할 수 있다.The present invention relates to an adenovirus and a pharmaceutical anti-tumor composition comprising the same, which exhibit an improved tumor killing effect, and more particularly, tumor cell necrosis by causing mutations in the ElB 19 gene so that expression of the adenovirus ElB 19 gene is suppressed. And it relates to a recombinant adenovirus and a pharmaceutical anti-tumor composition comprising the same by inducing apoptosis at the same time, the tumor cell killing effect, the recombinant adenovirus of the present invention induces cell necrosis and cell death in infected cells simultaneously to kill tumor cells The ability to greatly improve the ability to overcome the limitations of the conventional method for treating tumors by recombinant adenovirus, moreover, the pharmaceutical composition of the present invention is used in combination with the conventional cancer treatment method, in particular cancer treatment method that induces cell death In case of maximum therapeutic effect Can.
Description
본 발명은 아데노바이러스에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 보다 개선된 종양 살상 효과를 나타내는 아데노바이러스 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to adenoviruses and, more particularly, to adenoviruses exhibiting improved tumor killing effects and pharmaceutical antitumor compositions comprising the same.
1990년, ADA (adenosine deaminase) 결핍증을 대상으로 한 첫 유전자 치료 임상시험 이후 1990년대 중반까지 복제 불능 아데노바이러스 벡터 내에 특정 유전자를 삽입시켜 표적 세포 내에서 발현을 유도하는 유전자 치료법에 대한 연구가 활발해 졌다.In 1990, after the first gene therapy clinical trial for adenosine deaminase (ADA) deficiency, research into gene therapy to induce expression in target cells by inserting specific genes into non-replicating adenovirus vectors until the mid-1990s became active. .
아데노바이러스는 기존의 레트로바이러스 시스템에 비해 고농도로 농축할 수 있고 유전자 전달 효율이 월등히 높다는 장점들 때문에 점차 많은 빈도로 유전자 치료에 이용되어졌으나 증식 불능 아데노바이러스는 1차 감염된 세포에서만 그 치료효과를 보이고 생체 내에서는 원하는 만큼의 유전자 전달 효율을 보이기 어렵고 면역체계에 의한 아데노바이러스의 비활성화 등으로 인하여 치료 효과가 한계에 부딪히게 되었다.Adenoviruses have been used for gene therapy on a more frequent basis because of their higher concentration and higher gene transfer efficiency than conventional retrovirus systems. However, non-proliferative adenoviruses are only effective in primary infected cells. It is difficult to show gene transfer efficiency as desired in vivo, and the therapeutic effect is limited due to inactivation of adenovirus by the immune system.
그러나 1996년, McCormick 등은 아데노바이러스 초기 유전자인 E1B 55kD이 부분적으로 결실된 dl1520 (ONYX-015)를 개발하였으며 이는 p53 유전자가 돌연변이 되거나 결실된 종양세포 내에서만 선택적으로 증식이 가능하여 암세포를 특이적으로 살상할 수 있는 아데노바이러스를 보고한 바 있으며 (Bischoff, J. et al.,Science, 274:373-376(1996)), 현재 이를 이용한 임상시험이 진행 중에 있다.However, in 1996, McCormick et al. Developed dl1520 (ONYX-015), in which the early adenovirus gene E1B 55kD was partially deleted, which was able to selectively proliferate only in tumor cells where the p53 gene was mutated or deleted. There have been reports of adenoviruses that can be killed (Bischoff, J. et al., Science , 274: 373-376 (1996)), and clinical trials are currently underway.
이후 낮은 유전자 도입 효율의 한계를 갖는 증식 불능 아데노바이러스 대신에 복제에 있어 필수적인 E1A 유전자를 재도입하여 복제 가능 재조합 아데노바이러스를 개발하려는 시도가 계속 이루어지고 있으며, 본 발명자들도 암세포를 선택적으로 살상 할 수 있는 재조합 아데노바이러스인 YKL-1을 제작하고 이를 이용한 항종양 실험에서 긍정적인 결과를 보고한 바 있다 (대한민국 특허출원 제 1999-33011호).Subsequent attempts have been made to develop cloneable recombinant adenoviruses by re-introducing the E1A gene, which is essential for replication, instead of the nonproliferative adenoviruses, which have a limitation of low transfection efficiency, and the present inventors have also been able to selectively kill cancer cells. YKL-1, a recombinant adenovirus that can be produced, has been reported in antitumor experiments using the same (Korean Patent Application No. 1999-33011).
또한, 아데노바이러스의 복제에 필수적인 E1A 유전자를 특정 유전자 조절 부위 아래에 삽입시켜 종양 특이적 발현을 유도하는 표적 지향성 아데노바이러스의 개발이나 항 종양 화학치료요법 (anticancer-chemotherapy)을 병행, 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus)의 티미딘 키나아제와 같은 자살 유전자를 증식 가능한 아데노바이러스 내에 삽입시켜 항 종양 효과를 개선한 연구가 계속 진행되고 있다 (Morris, J.C. et al.,Molecular Ther., 1(1):56-62(2000))).In addition, E1A genes essential for replication of adenoviruses can be inserted under specific gene regulatory sites to develop target-directed adenoviruses that induce tumor specific expression, or anticancer chemotherapy, or herpes simplex. Research continues to improve the antitumor effect by inserting suicide genes such as the thymidine kinase of the virus (herpes simplex virus) into proliferative adenoviruses (Morris, JC et al., Molecular Ther. , 1 (1)). : 56-62 (2000)).
아데노바이러스 복제에 필수적인 역할을 하는 E1A 단백질은 감염된 세포 내에서 S-단계를 유도하여 아데노바이러스의 후기 발현 유전자들의 전사를 촉진시킨다. 또한, E1A 단백질은 RB (retinoblastoma) 단백질과 결합해 E2F 단백질을 해리시켜 세포 주기를 계속적으로 가동시킴으로써 아데노바이러스의 복제에 필요한 여러 전사 단백질들을 제공되게 하며, 감염된 세포 내에서는 종양 억제 단백질로 잘 알려진 p53 등의 활성화로 인한 세포 고사 (apoptosis)를 촉진시킨다 (Shenk, T.Adenoviridae: the viruses and their replication. 3rd ed. New York: Lippincott-Raven, 2111-2148(1996) 및 Shenk, T. et al.,Adv Cancer Res, 57:47-85(1991)).E1A protein, which plays an essential role in adenovirus replication, induces S-phase in infected cells to promote transcription of late-expressing genes of adenovirus. In addition, the E1A protein binds to the retinoblastoma (RB) protein to dissociate the E2F protein, thereby continually operating the cell cycle, providing several transcriptional proteins necessary for the replication of adenoviruses, and p53, a well known tumor suppressor protein in infected cells. To promote apoptosis due to activation (Shenk, T. Adenoviridae: the viruses and their replication . 3rd ed. New York: Lippincott-Raven, 2111-2148 (1996) and Shenk, T. et al. Adv Cancer Res , 57: 47-85 (1991).
또 다른 아데노바이러스의 초기 발현 유전자인 E1B 유전자는 E1B 19 kDa과 E1B 55 kDa을 코딩하며, 이들 중 E1B 19 kDa 단백질은 강력한 세포 고사 억제작용을 하며 Bcl-2와 염기 서열 및 그 기능이 유사하다. (Imazu, T. et al.,Oncogene, 18:4523-4529(1999)). E1B 55 kDa 단백질은 p53 단백질과 결합해 그 기능을 억제하고 아데노바이러스의 mRNA들을 세포질로 이동시켜 단백질 합성을 촉진하는 기능을 하며 E1B 55 kDa 단백질이 결실된 아데노바이러스는 p53 단백질의 기능이 비활성화된 종양세포 내에서 선택적으로 증식 가능하다는 보고들이 있었다 (Bischoff, J. et al.,Science, 274:373-376(1996) 및 Heiss, C. et al.,Nature Medicine, 3:639-645(1997)).Another early expression gene of the adenovirus, the E1B gene encodes E1B 19 kDa and E1B 55 kDa, of which E1B 19 kDa protein is a potent cell death inhibitory activity and similar in sequence and function to Bcl-2. (Imazu, T. et al., Oncogene , 18: 4523-4529 (1999)). E1B 55 kDa protein binds to p53 protein, inhibits its function, transfers adenovirus mRNAs into the cytoplasm, promotes protein synthesis, and adenovirus depleted of E1B 55 kDa protein is a tumor in which p53 protein is inactivated. There have been reports of selective proliferation in cells (Bischoff, J. et al., Science , 274: 373-376 (1996) and Heiss, C. et al., Nature Medicine , 3: 639-645 (1997) ).
그러나 E1B 55 kDa 단백질은 아데노바이러스의 효과적인 복제에 필요한 유전자로서, 이것이 소실된 재조합 아데노바이러스는 암세포 내에서 제한된 증식을 나타내기 때문에 이로 인한 항종양 효과가 감소되는 문제점이 초래된다.However, the E1B 55 kDa protein is a gene necessary for the effective replication of adenovirus, and since the lost recombinant adenovirus shows limited proliferation in cancer cells, the antitumor effect thereof is reduced.
결국, 이와 같은 문제점들을 극복하기 위해서는 아데노바이러스의 효율적인 증식에 의한 세포 괴사 (necrosis) 촉진과 더불어 세포 고사억제기능을 제거하여 세포고사 유도를 촉진하게 함으로써 결과적으로 암세포의 효과적인 살상을 유도 할 수 있는 재조합 아데노바이러스의 개발이 요구 되어지고 있다.After all, in order to overcome such problems, recombination can induce effective killing of cancer cells by promoting cell death by promoting cell necrosis (necrosis) by efficient propagation of adenovirus and by removing apoptosis inhibitory function. Development of adenoviruses is required.
미합중국 특허 제 5,677,178 호, 제 5,856,181 호 및 제 5972706 호는 p53 또는 Rb 단백질을 비활성화시키는 유전자가 결핍된 복제 불능한 재조합 아데노바이러스를 종양 세포에 처리하여 상기 종양 억제 유전자의 발현이 결핍되어 있는 종양 세포를 선택적으로 제거하는 방법을 개시하고 있다.U.S. Pat.Nos. 5,677,178, 5,856,181 and 5972706 describe tumor cells that lack expression of the tumor suppressor gene by treating the tumor cells with a non-replicating recombinant adenovirus that lacks a gene that inactivates the p53 or Rb protein. A method of selectively removing is disclosed.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this specification many patent documents and articles are referenced and their citations are indicated. The disclosures of cited patent documents and articles are incorporated herein by reference in their entirety, so that the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained.
따라서, 본 발명의 목적은 종양 세포 살상 효과가 개선된 재조합 아데노바이러스를 제공하는 데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a recombinant adenovirus with improved tumor cell killing effect.
본 발명의 다른 목적은 상기한 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical anti-tumor composition comprising the recombinant adenovirus described above.
도 1은 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 일 구현예인 YKC-1의 제조방법을 나타내는 개략도;1 is a schematic view showing a method for producing YKC-1, which is an embodiment of the recombinant adenovirus of the present invention;
도 2는 실시예 1-2에서 증폭되는 서열을 보여 주는 개략도;2 is a schematic showing the sequence amplified in Examples 1-2;
도 3은 실시예 1-2에서 증폭된 서열의 전기영동 결과를 나타내는 사진;Figure 3 is a photograph showing the results of electrophoresis of the amplified sequence in Example 1-2;
도 4는 본 발명의 YKC-1 바이러스에서 E1B 19 단백질을 발현되지 않음을 나타내는 웨스턴 블롯팅 결과 사진;4 is a photograph of Western blotting results showing that E1B 19 protein is not expressed in the YKC-1 virus of the present invention;
도 5는 본 발명의 YKC-1 바이러스가 다양한 종양 세포에 대하여 살상 효과를 나타냄을 보여주는 세포 병변 분석 사진;Figure 5 is a cell lesion analysis showing that the YKC-1 virus of the present invention has a killing effect on various tumor cells;
도 6은 본 발명의 YKC-1 바이러스의 증식 속도를 나타내는 플라크 분석 결과 사진;Figure 6 is a plaque analysis photograph showing the proliferation rate of the YKC-1 virus of the present invention;
도 7a는 본 발명의 YKC-1 바이러스의 자궁암 세포 C33A에 대한 살상 효과를 나타내는 그래프;7A is a graph showing the killing effect of YKC-1 virus on cervical cancer cell C33A of the present invention;
도 7b는 본 발명의 YKC-1 바이러스의 자궁암 세포 HeLa에 대한 살상 효과를 나타내는 그래프;Figure 7b is a graph showing the killing effect on uterine cancer cells HeLa of the YKC-1 virus of the present invention;
도 8a는 본 발명의 YKC-1 바이러스에 의해 감염된 자궁암 세포 C33A에서 바이러스 재생산 효율을 나타내는 그래프;8A is a graph showing virus reproduction efficiency in uterine cancer cells C33A infected with YKC-1 virus of the present invention;
도 8b는 본 발명의 YKC-1 바이러스에 의해 감염된 자궁암 세포 HeLa에서 바이러스 재생산 효율을 나타내는 그래프;8B is a graph showing virus reproduction efficiency in uterine cancer cells HeLa infected with YKC-1 virus of the present invention;
도 9는 본 발명의 YKC-1 바이러스의 종양 세포 살상능이 세포 괴사 뿐만 아니라 세포 고사 기작을 통해서도 발휘됨을 보여주는 광학 현미경 관찰 사진;9 is an optical microscope photograph showing that tumor cell killing ability of the YKC-1 virus of the present invention is exerted not only through cell necrosis but also through cell death mechanisms;
도 10은 본 발명의 YKC-1 바이러스의 종양 세포 살상능이 세포 괴사 뿐만 아니라 세포 고사 기작을 통해서도 발휘됨을 보여주는 전자 현미경 관찰 사진;10 is an electron micrograph showing that tumor cell killing ability of the YKC-1 virus of the present invention is exerted not only through cell necrosis but also through cell death mechanisms;
도 11은 본 발명의 YKC-1 바이러스에 의해 유도되는 세포 고사를 확인하기 위한 튜널 분석 결과를 보여주는 사진; 및Figure 11 is a photograph showing the results of the tunnel analysis to confirm cell death induced by the YKC-1 virus of the present invention; And
도 12는 누드 마우스를 모델로 한 본 발명의 YKC-1 바이러스의 항종양 효과를 나타내는 그래프.12 is a graph showing the antitumor effect of the YKC-1 virus of the present invention modeled on nude mice.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 아데노바이러스 ElB 19 유전자의 발현이 억제되도록 ElB 19 유전자에 변이 (mutation)를 유발하여 종양 세포 괴사 (necrosis) 및 고사 (apoptosis)를 동시에 유도하여 종양 세포 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스를 제공한다.According to an aspect of the present invention, the present invention induces mutations in the ElB 19 gene so as to inhibit the expression of the adenovirus ElB 19 gene, thereby inducing tumor cell necrosis and apoptosis at the same time, thereby killing tumor cells. Provided are recombinant adenoviruses that are effective.
본 발명자들은 종래의 항종양 아데노바이러스가 갖고 있는 종양 세포내 증식 능력을 유지하면서도, 세포 고사를 유발하여 보다 효율적으로 종양 세포를 살상할 수 있는 재조합 아데노바이러스를 개발하고자 하였다. 결국, 본 발명자들은 E1B 영역의 유전자 중 19 kDa 단백질 (세포 고사 억제 단백질)을 코딩하는 유전자의 발현을 억제하여 기능적인 E1B 19 kDa 단백질의 생성을 억제시키면, 상기한 목적에 적합한 재조합 아데노바이러스가 생성됨을 확인하였다.The present inventors have attempted to develop a recombinant adenovirus capable of killing tumor cells more efficiently by inducing cell death while maintaining the intracellular tumor cell proliferation ability of conventional antitumor adenoviruses. After all, the present inventors inhibit the expression of the gene encoding the 19 kDa protein (cell death inhibiting protein) in the gene of the E1B region to inhibit the production of the functional E1B 19 kDa protein, a recombinant adenovirus suitable for the above purpose is produced It was confirmed.
본 명세서에서 용어 "E1B 19 kDa 유전자" 및 "E1B 19 유전자"는 모두 아데노바이러스의 E1B 19 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.As used herein, the terms "E1B 19 kDa gene" and "E1B 19 gene" both refer to a nucleotide sequence encoding the E1B 19 protein of adenovirus.
본 발명에 있어서, E1B 19 유전자에서의 변이는 아데노바이러스 ElB 19 유전자의 발현이 억제되도록 하는 것으로서, 아데노바이러스 ElB 19 유전자의 발현 자체를 억제하는 것 뿐만 아니라, 기능성이 없는 아데노바이러스 ElB 19 단백질, 예컨대, 절단된 (truncated) 형태의 ElB 19 단백질이 생성되도록 하는 것을 포함한다. 상기 E1B 19 유전자에서의 변이는 다양한 접근 방법으로 실시될 수 있다. 예컨대, E1B 19 유전자 전체의 제거 (deletion), E1B 19 유전자 내에서의 정지 코돈 형성 등을 통해서, E1B 19 유전자의 발현을 억제하는 변이를 만들 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, ElB 19 유전자에서의 변이는 ElB 19 유전자의 개시 코돈에 변이가 발생되도록 한 것이고, 보다 바람직하게는 ElB 19 유전자의 개시 코돈ATG가CTG로 치환되고 개시 코돈 바로 다음의 GAG가 정지 코돈 TAG로 치환된 것이다.In the present invention, the mutation in the E1B 19 gene is to suppress the expression of the adenovirus ElB 19 gene, not only suppresses the expression of the adenovirus ElB 19 gene itself, but also has no functional adenovirus ElB 19 protein, such as And causing the production of the truncated form of ElB 19 protein. Mutations in the E1B 19 gene can be implemented in a variety of approaches. For example, mutations that inhibit the expression of the E1B 19 gene can be made through deletion of the entire E1B 19 gene, stop codon formation in the E1B 19 gene, and the like. Thus, according to a preferred embodiment of the invention, the mutation in the ElB 19 gene is to cause a mutation in the start codon of the ElB 19 gene, more preferably the start codon A TG of the ElB 19 gene is substituted with C TG The GAG immediately after the start codon is replaced with the stop codon TAG.
이와 같은 변이 방식은 E1B 19 kDa 단백질에 대한 전사물은 합성되지만, 단백질 합성 개시를 전혀 일어나지 못하게 하여 E1B 19 kDa 단백질의 생성이 이루어지지 않는 이점이 있다.Such a mutant method has the advantage that the transcript for the E1B 19 kDa protein is synthesized, but the initiation of protein synthesis does not occur at all, thereby producing the E1B 19 kDa protein.
상기 변이는 바람직하게는 위치-지정 변이 유발 (site-directed mutagenesis)를 통하여 실시할 수 있고, 위치-지정 변이 유발은 PCR 등을 통하여 할 수 있다. PCR에 의해 위치-지정 변이 유발을 하는 경우에는, 특정 위치에의 염기가 치환된 서열을 갖는 프라이머를 이용한다.The mutation may preferably be carried out through site-directed mutagenesis, and the site-directed mutagenesis may be carried out through PCR or the like. When position-directed mutation is caused by PCR, a primer having a sequence substituted with a base at a specific position is used.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 정상적인 E1A 유전자 및 정상적인 E1B 55 유전자를 포함한다. 상기 두 유전자는 아데노바이러스의 복제 및 증식에 중요한 역할을 하는 것으로서, 이러한 유전자를 갖는 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 종양 세포 내에서의 우수한 증식능을 갖게 된다.According to a preferred embodiment of the invention, the recombinant adenovirus of the invention comprises a normal E1A gene and a normal E1B 55 gene. The two genes play an important role in the replication and proliferation of adenoviruses. The recombinant adenoviruses of the present invention having such genes have excellent proliferative capacity in tumor cells.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 E3 유전자가 제거되어 있다. 상기 E3 유전자는 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al.,Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al.,Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, 본 발명의 아데노바이러스는 외래 유전자를 운반 및 발현할 수 있는 벡터로서의 용도도 갖게 된다.According to a preferred embodiment of the present invention, the recombinant adenovirus of the present invention is free of the E3 gene. The E3 gene is removed from conventional adenovirus vectors to provide a site for insertion of foreign genes (Thimmappaya, B. et al., Cell , 31: 543-551 (1982); and Riordan, JR et al., Science , 245: 1066-1073 (1989). Therefore, the adenovirus of the present invention also has a use as a vector capable of carrying and expressing foreign genes.
한편, 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 YKC-1 (KFCC-11280)이다.Meanwhile, according to the most preferred embodiment of the present invention, the recombinant adenovirus of the present invention is adenovirus YKC-1 (KFCC-11280).
본 발명의 재조합 아데노바이러스는 다양한 종양 세포, 예컨대 간암 세포, 자궁암 세포, 유방암 세포, 뇌종양 세포 및 폐암 세포 등에 대하여 살상능을 갖을 뿐만 아니라, 살상 효율도 다른 종래의 재조합 아데노바이러스 보다 훨씬 월등하다. 또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 복제 및 증식 속도도 매우 크기 때문에, 감염된 세포 주위로 확산되는 속도가 매우 크다. 본 발명이 상기한 이점을 나타내는 것은, 본 발명의 재조합 아데노바이러스가 세포 괴사 뿐만 아니라 세포 고사도 동시에 유도하기 때문이다.The recombinant adenovirus of the present invention not only has the ability to kill various tumor cells, such as liver cancer cells, uterine cancer cells, breast cancer cells, brain tumor cells and lung cancer cells, etc., but also the killing efficiency is far superior to other conventional recombinant adenoviruses. In addition, since the recombinant adenovirus of the present invention has a very high rate of replication and proliferation, the rate of spreading around infected cells is very high. The present invention exhibits the above-mentioned advantages because the recombinant adenovirus of the present invention induces cell necrosis as well as cell necrosis.
또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 개별적 세포 수준에서의인 비트로종양 살상 효과도 우수하지만, 개체 수준에서의인 비보종양 살상 효과도 우수하다. 종래에 개발된 다수의 재조합 아데노바이러스가인 비트로에서만 종양 살상 효과를 나타내고,인 비보에서는 명확한 효과를 발휘하지 못하였다는 점을 고려하면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 우수성을 파악할 수 있다.In addition, the recombinant adenovirus of the present invention is excellent in vitro tumor killing effect at the individual cell level, but also in vivo tumor killing effect at the individual level. Considering the fact that many recombinant adenoviruses developed in the prior art exhibited tumor killing effects only in vitro , and did not exert clear effects in vivo , the superiority of the recombinant adenovirus of the present invention can be grasped.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 아데노바이러스 ElB 19 유전자의 발현이 억제되도록 ElB 19 유전자에 변이를 유발하여, 종양 세포 괴사 및 고사를 동시에 유도하여 종양 세포 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a recombinant adeno (a) by inducing a mutation in the ElB 19 gene so that the expression of the adenovirus ElB 19 gene is suppressed, thereby inducing tumor cell necrosis and apoptosis at the same time to exhibit a tumor cell killing effect Therapeutically effective amount of virus; And (b) provides a pharmaceutical anti-tumor composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
본 발명의 조성물에 포함되는 재조합 아데노바이러스는 상술한 바와 같이, 다양한 종양 세포에 대하여 살상 효능을 나타내므로, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암 등의 치료에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "치료"는 (ⅰ) 종양 세포 형성의 예방; (ⅱ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 억제; 및 (ⅲ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 "치료학적 유효량"은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.Since the recombinant adenovirus included in the composition of the present invention exhibits killing efficacy against various tumor cells as described above, the pharmaceutical composition of the present invention can be used for various diseases or diseases related to tumors such as gastric cancer, lung cancer, breast cancer, ovary Cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, cervical cancer and the like. As used herein, the term "treatment" refers to (i) prevention of tumor cell formation; (Ii) inhibition of a disease or condition associated with the tumor following removal of the tumor cells; And (iii) alleviation of a disease or disorder associated with a tumor following removal of tumor cells. Thus, the term "therapeutically effective amount" as used herein means an amount sufficient to achieve the above pharmacological effect.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.Pharmaceutically acceptable carriers included in the compositions of the present invention are those commonly used in the formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, but are not limited thereto. no. In addition to the above components, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 ElB 19 유전자에서의 변이는 ElB 19 유전자의 개시 코돈에 변이가 발생되도록 한 것이고, 보다 바람직하게는 ElB 19 유전자의 개시 코돈ATG가CTG로 치환되고 개시 코돈 바로 다음의 GAG가 정지 코돈 TAG로 치환된 것이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the mutation in the ElB 19 gene is to cause a mutation in the start codon of the ElB 19 gene, more preferably the start codon A TG of the ElB 19 gene is replaced with C TG and initiated The GAG immediately after the codon was replaced with the stop codon TAG.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 재조합 아데노바이러스는 정상적인 E1A 유전자 및 정상적인 E1B 55 유전자를 포함한다.According to another preferred embodiment of the present invention, the recombinant adenovirus comprises a normal E1A gene and a normal E1B 55 gene.
본 발명의 또 따른 변형 예에 따르면, 상기 재조합 아데노바이러스는 E3 유전자가 제거되어 있는 것이다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 상기 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 YKC-1 (KFCC-11280)이다.According to another modification of the present invention, the recombinant adenovirus is the E3 gene is removed. According to the most preferred embodiment of the invention, the recombinant adenovirus is adenovirus YKC-1 (KFCC-11280).
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결정암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is preferably parenteral, and may be administered using, for example, intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, or topical administration. Intraperitoneal administration in ovarian cancer and in the portal vein in liver cancer can be administered by infusion method, in the case of breast cancer can be administered by direct injection into the tumor mass, in the case of crystalline cancer by direct injection into the enema It may be administered, and in the case of bladder cancer may be administered by injection directly into the catheter.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 5 ×1010-5 ×1011pfu/㎖의 재조합 아데노바이러스를 포함하며, 통상적으로 재조합 아데노바이러스는 1×1010pfu를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사한다.Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the invention vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex of the patient, degree of disease symptom, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction. In general, the skilled practitioner can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment. In general, the pharmaceutical compositions of the present invention comprise 5 × 10 10 −5 × 10 11 pfu / ml of recombinant adenovirus, and typically recombinant adenovirus is injected 1 × 10 10 pfu once every two days for two weeks. .
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention are prepared in unit dosage form by being formulated with pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients, according to methods which may be readily practiced by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporating into a multi-dose container. In this case, the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 프로카르바진 (procarbazine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실 (chlorambucil), 비술판 (bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리코마이신 (plicomycin), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide), 탁목시펜 (tamoxifen), 택솔 (taxol), 트랜스플라티눔 (transplatinum), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 빈크리스틴 (vincristin), 빈블라스틴 (vinblastin) 및 메토트렉세이트 (methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.The pharmaceutical composition of the present invention may be used as a single therapy, but may also be used in combination with other conventional chemotherapy or radiation therapy, and when the combination therapy is performed, cancer treatment may be more effectively performed. Chemotherapeutic agents that can be used with the compositions of the present invention are cisplatin, carboplatin, procarbazine, mechlorethamine, cyclophosphamide, phospho Ifosfamide, melphalan, chlorambucil, bisulfan, nitrosourea, diactinomycin, daunorubicin, doxorubicin , Bleomycin, plicomycin, mitomycin, etoposide, tamoxifen, taxol, transplatinum, 5-fluoro 5-urauracil, vincristin, vinblastin, methotrexate and the like. Radiation therapy that can be used with the composition of the present invention is X-ray irradiation, γ-ray irradiation, and the like.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention to those skilled in the art. Will be self explanatory.
실시예 1: 재조합 아데노바이러스 YKC-1의 제조 및 확인Example 1 Preparation and Identification of Recombinant Adenovirus YKC-1
실시예 1-1:재조합 아데노바이러스 YKC-1의 제조 Example 1-1 Preparation of Recombinant Adenovirus YKC-1
재조합 아데노바이러스 셔틀 벡터 pΔE1B 19를 제작하기 위해, 우선 pXC1(Microbix, 캐나다국)을XbaI 및BamHI 제한효소로 절단하여 얻어진 1.3 kb DNA를 pSP72 클로닝 벡터 (Promega, 미합중국)에 삽입시켰다. 이어, 상기 벡터를 주형으로 하고, 센스 프라이머 5'-GTTACATCTGACCTCCTGTAGGCTAGCGAGTGTTTGGAAG-3' 및 안티센스 프라이머 5'-CTTCCAAACACTCGCTAGCCTACAGGAGGTCAGATGTAAC-3'를 이용하여 위치-지정 변이유발 (site-directed mutagenesis) PCR을 실시하였다. 위치-지정 변이유발은 Stratagene사의 위치-지정 변이유발 키트를 이용하여 실시하였다. 상기의 E1B19 돌연변이 프라이머는 E1B 19 kD 유전자의 개시 코돈 (ATG)을CTG로 치환하고 개시코돈 바로 다음의GAG를 정지 코돈 (TAG)으로 치환하는 것이다.To construct the recombinant adenovirus shuttle vector pΔE1B 19, first, 1.3 kb DNA obtained by cleaving pXC1 (Microbix, Canada) with Xba I and Bam HI restriction enzymes was inserted into a pSP72 cloning vector (Promega, United States). Subsequently, the vector was used as a template, and site-directed mutagenesis PCR was performed using sense primers 5'-GTTACATCTGACCTCCTGTAGGCTAGCGAGTGTTTGGAAG-3 'and antisense primers 5'-CTTCCAAACACTCGCTAGCCTACAGGAGGTCAGATGTAAC-3'. Site-directed mutagenesis was performed using Stratagene's site-directed mutagenesis kit. The E1B19 mutant primer replaces the start codon ( A TG) of the E1B 19 kD gene with C TG and the G AG immediately following the start codon with the stop codon ( T AG).
PCR은 주형 DNA 10 ng, 프라이머 100 ng 및 pfu DNA 중합효소 (Stratagene) 2 유니트를 사용하여 94℃에서 2 분 동안 예열 단계를 거친 다음, 94℃ 30초, 55℃ 1분 및 68℃ 8분을 주기로 하여 총 18 사이클을 실시하고, 94℃에서 5분 동안 최종 신장 반응을 실시하였다.PCR was preheated at 94 ° C. for 2 minutes using 10 ng template DNA, 100 ng primer and 2 units of pfu DNA polymerase (Stratagene), followed by 94 ° C. 30 seconds, 55 ° C. 1 minute, and 68 ° C. 8 minutes. A total of 18 cycles were carried out in cycles, and a final elongation reaction was carried out at 94 ° C. for 5 minutes.
상기 위치-지정 변이유발 PCR을 통해 수득한 플라스미드를 "pSP72/pXC1/1.3kb/Δ19mt"라 명명하였고, 목적의 변이 (E1B 19 kD 유전자의 개시 코돈 (ATG)을CTG로 치환하고 개시코돈 바로 다음의GAG를 정지 코돈 (TAG)으로 치환하는 것)를 염기 서열 분석 (ABI Prism 377, Perkin Elmer)으로 확인하였다.The plasmid obtained through the position-directed mutagenesis PCR was named "pSP72 / pXC1 / 1.3kb / Δ19mt", and the desired codon (E1B 19 kD gene initiation codon ( A TG) was replaced with C TG and the initiation codon Subsequent replacement of G AG with a stop codon ( T AG)) was confirmed by sequencing (ABI Prism 377, Perkin Elmer).
그런 다음, 상기 pSP72/pXC1/1.3kb/Δ19mt 플라스미드를XbaI 및BamHI으로 다시 절단하고 pXC1 내에 재삽입시켜, "pΔE1B 19" 셔틀 벡터를 제작하였다. 그리고 나서, E1 영역 및 E3 영역을 제외한 아데노바이러스 전체 지놈을 갖으며BstBI 제한효소로 처리된 dl324BstBI (스위스국의 Fribourgh 대학의 Verca 박사로부터 구입; Heider, H. et al.,Biotechniques, 28(2):260-265, 268-270(2000))와 함께XmnI 제한효소로 절단한 pΔE1B 19 셔틀벡터를 대장균 BJ5183 (스위스국의 Fribourgh 대학의 Verca 박사로부터 구입)에 42℃ 순간 열처리 방법으로 동시적으로 형질 전환시켜 유전자 상동 재조합을 유도하였다.The pSP72 / pXC1 / 1.3kb / Δ19mt plasmid was then cut back with Xba I and Bam HI and reinserted into pXC1 to produce a “pΔE1B 19” shuttle vector. Then, E1 region and has had the entire adenovirus genome, excluding the E3 region obtained from the dl324BstBI (Switzerland station Verca Dr Fribourgh University treated with Bst BI restriction enzyme;. Heider, H. et al, Biotechniques, 28 (2 PΔE1B19 shuttle vector digested with Xmn I restriction enzyme was co- examined with Escherichia coli BJ5183 (purchased from Dr. Verca of Fribourgh University, Switzerland) using 42 ° C instantaneous heat treatment. Gene homologous recombination was induced.
이어, 상동 재조합된 플라스미드 DNA를 회수하고,HindⅢ 제한효소로 처리하여 E1B 19 kD 유전자의 개시 코돈 (ATG)을CTG로 치환하고 개시코돈 바로 다음의GAG를 정지 코돈 (TAG)으로 치환된 Ad-pΔE1B 19 생성물을 확인하고 회수하였다. 재조합 아데노바이러스 플라스미드 Ad-pΔE1B 19를PacI으로 절단하여 단일 가닥으로 만든 다음, 293 세포주 (Microbix, 캐나다국)에 트랜스펙션하여 바이러스를 생산하였고, 생산된 재조합 아데노바이러스를 "YKC-1"이라 명명하고, 기탁기관 한국미생물보존센터에 2001년 8월 22일자로 기탁하고, 기탁번호 KFCC-11280을 부여 받았다.The homologously recombined plasmid DNA was then recovered and treated with Hin dIII restriction enzyme to replace the start codon ( A TG) of the E1B 19 kD gene with C TG and the G AG immediately following the start codon to the stop codon ( T AG). The substituted Ad-pΔE1B 19 product was identified and recovered. Recombinant adenovirus plasmid Ad-pΔE1B 19 was cut into Pac I into single strands and then transfected into a 293 cell line (Microbix, Canada) to produce a virus, and the resulting recombinant adenovirus was termed “YKC-1”. It was deposited on August 22, 2001 with the Korea Microorganism Conservation Center and was assigned the deposit number KFCC-11280.
도 1은 본 발명의 YKC-1 바이러스의 제조방법을 개략적으로 나타내는 도면이다. 도 1에서 ψ는 ITR (inverted terminal repeat) 및 패키지 시그널을 포함하는 서열을 나타내며, 기호 Ad는 아데노바이러스의 축약어이고, Δ는 서열의 제거 (deleted)에 대한 기호이다.1 is a view schematically showing a method for producing YKC-1 virus of the present invention. In FIG. 1, ψ represents a sequence including an inverted terminal repeat (ITR) and a package signal, the symbol Ad is an abbreviation of adenovirus, and Δ is a symbol for deletion of the sequence.
한편, 대조군 바이러스들인 증식 불능 아데노바이러스 Ad-ΔE1 (E1 영역 전체가 결손된 것) 및 증식 가능 아데노바이러스 YKL-1 (E1B 55가 결손된 것, 대한민국 특허출원 제 1999-33011 호 참조)과 Ad-ΔE1B (E1B 영역 전제가 결손된 것), 그리고 야생형 재조합 아데노바이러스 Ad-wt는 각각 pCA14와 pXC1 (Microbix, 캐나다국)를 셔틀벡터로 이용해 동일한 방법으로 획득하였다. 각각의 재조합 아데노바이러스는 293 세포주에서 증폭시킨 다음, 한계 희석 방법 또는 플라크 분석 방법을 이용하여 바이러스의 역가를 결정하였다.On the other hand, the control viruses, nonproliferative adenovirus Ad-ΔE1 (deleting the entire E1 region) and proliferative adenovirus YKL-1 (deleting E1B 55, see Korean Patent Application No. 1999-33011) and Ad- ΔE1B (with missing E1B region premise) and wild type recombinant adenovirus Ad-wt were obtained by the same method using pCA14 and pXC1 (Microbix, Canada) as shuttle vectors, respectively. Each recombinant adenovirus was amplified in 293 cell lines and then titer of virus was determined using either limit dilution method or plaque assay method.
실시예 1-2:재조합 아데노바이러스 DNA의 분리와 PCR 분석 Example 1-2 Isolation and PCR Analysis of Recombinant Adenovirus DNA
인체 간암 세포주인 Hep3B (ATCC, 미합중국) 에 상기 실시 예 1-1의 Ad-ΔE1, Ad-ΔE1B, YKC-1, YKL-1 및 Ad-wt 바이러스를 MOI (Multiplicity of infection) 10으로 각각 감염시키고. 2일이 경과한 다음, 지놈 분리 키트 (Qiagen, 미합중국)로 바이러스 지놈을 회수하였다. 이어, 분리한 바이러스 지놈을 주형으로 하고, E1A, E1B 19 kD 또는 E1B 55 kD의 증폭에 유용한 각각의 프라이머 세트를 이용하여 상기 실시예 1-1과 동일하게 PCR을 수행하였다. 이용된 프라이머는 E1A의 PCR의 경우, 센스 프라이머 5'-GATCGAAGAGGTACTGGCTGATA-3' 및 안티센스 프라이머 5'-CCACAGGTCCTCATATAGCAAAG-3', E1B 19 kD의 경우, 센스 프라이머 5'-ATCTGACCTCATGGAGGCTTGG-3' 및 안티센스 프라이머 5'-GCGGACGGAAGACAACAGTAGC-3' 그리고 E1B 55 kD의 경우, 센스 프라이머 5'-GATAGATACGGAGGATAGGGTGG-3' 및 안티센스 프라이머 5'-TGGAGTTACCCTCAGACAGGATA-3'이다.Hep3B (ATCC, United States), a human liver cancer cell line, was infected with the Ad-ΔE1, Ad-ΔE1B, YKC-1, YKL-1 and Ad-wt viruses of Example 1-1 with MOI (Multiplicity of infection) 10, respectively. . After 2 days, the virus genome was recovered by genome isolation kit (Qiagen, USA). Subsequently, the isolated virus genome was used as a template, and PCR was performed in the same manner as in Example 1-1 using the respective primer sets useful for amplification of E1A, E1B 19 kD or E1B 55 kD. The primers used were sense primers 5'-GATCGAAGAGGTACTGGCTGATA-3 'and antisense primers 5'-CCACAGGTCCTCATATAGCAAAG-3' for PCR of E1A, sense primers 5'-ATCTGACCTCATGGAGGCTTGG-3 'and antisense primer 5' for E1B 19 kD. For -GCGGACGGAAGACAACAGTAGC-3 'and E1B 55 kD, sense primer 5'-GATAGATACGGAGGATAGGGTGG-3' and antisense primer 5'-TGGAGTTACCCTCAGACAGGATA-3 '.
도 2는 증폭되는 서열을 야생형 아데노바이러스 지놈으로 나타낸 것이다.Figure 2 shows the sequence to be amplified by wild type adenovirus genome.
상기 각각의 PCR 생성물들을 혼합한 다음, 아가르스 겔에 로딩하여 전기영동하였다 (참조: 도 3). 도 3에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 YKC-1 바이러스는 야생형 Ad-wt와 동일하게 E1A, E1B 19 및 E1B 33에 대한 유전자를 모두 갖고 있음을 알 수 있다.Each of the PCR products were mixed and then loaded onto an Agar gel and electrophoresed (see FIG. 3). As can be seen in Figure 3, the YKC-1 virus of the present invention can be seen that it has all the genes for E1A, E1B 19 and E1B 33 the same as wild-type Ad-wt.
실시예 1-3:재조합 아데노바이러스 감염 세포주의 삽입 DNA 유전자 발현 확인 Example 1-3 Confirmation of Insertion DNA Gene Expression of Recombinant Adenovirus Infected Cell Lines
U343 뇌암 세포주 (ATCC, 미합중국)에 상기 실시예 1-1의 Ad-ΔE1, Ad-ΔE1B, YKC-1, YKL-1 및 Ad-wt 바이러스를 MOI 10으로 감염시키고, 18시간이 경과한 다음, 감염된 세포를 회수하여 용해 완충액 (0.15 M NaCl, 0.5 % Nonidet P-40 and 프로테아제 억제제 (PMSF, TLCK 및 TPCK)를 포함하는 50 mM HEPES, pH 7.5)로 용해시키고, SDS-PAGE (sodium-dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 전기영동 하였다. 이어, PVDF 막에 단백질들을 이동시킨 후 E1A 및 E1B 19 kDa를 특이적으로 인지하는 항체를 (E1A에 대한 항체: sc-430, Santacruz, 미합중국; 및 E1B 19 kDa에 대한 항체: DP17, Oncogene, 미합중국)을 각각 일차 항체로 혼성화시키고 각 일차항체에 대한 이차 항체 (Pierce, 미합중국)를 다시 혼성화시켰다. 그런 다음, ECL (Enhanced Chemi-Luminescence: RPN 2108, Amersham, 미합중국) 방법으로 X-선 필름에 감광시켜 막 상의 단백질과 항체와의 결합 여부를 조사하여 각 단백질의 발현 양상을 확인하였다 (참조: 도 3).U343 brain cancer cell line (ATCC, US) was infected with Ad-ΔE1, Ad-ΔE1B, YKC-1, YKL-1, and Ad-wt virus of Example 1-1 with MOI 10, and 18 hours later, Infected cells were recovered and lysed with lysis buffer (50 mM HEPES, pH 7.5 containing 0.15 M NaCl, 0.5% Nonidet P-40 and protease inhibitors (PMSF, TLCK and TPCK), and SDS-PAGE (sodium-dodecyl sulfate Electrophoresis was performed using -polyacrylamide gel electrophoresis. Subsequently, after moving the proteins to the PVDF membrane, antibodies that specifically recognize E1A and E1B 19 kDa (antibodies to E1A: sc-430, Santacruz, United States; and antibodies to E1B 19 kDa: DP17, Oncogene, United States) ) Hybridized to the primary antibody, respectively, and the secondary antibody (Pierce, United States) for each primary antibody. Then, the expression pattern of each protein was confirmed by photosensitive X-ray film by ECL (Enhanced Chemi-Luminescence: RPN 2108, Amersham, United States) method to examine the binding of the protein on the membrane and antibody. 3).
도 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 YKC-1 바이러스는 E1A 단백질은 정상적으로 발현을 하나, E1B 19 kDa 단백질은 발현하지 못함을 알 수 있다.As can be seen in Figure 4, the YKC-1 virus of the present invention can be seen that E1A protein is normally expressed, E1B 19 kDa protein is not expressed.
실시예 2: YKC-1의 종양 세포 살상능력 규명Example 2: Characterization of tumor cell killing ability of YKC-1
실시예 2-1:다양한 종양 세포에서의 살상능 비교 Example 2-1 Comparison of Killing Capacity in Various Tumor Cells
본 발명의 재조합 아데노바이러스 YKC-1의 종양 세포에 대한 세포 살상 능력을 검증하기 위하여, 인간 간암 세포주 (SK-Hep1 및 Hep3B, ATCC, 미합중국), 뇌암 세포주 (U343 및 U-251N, ATCC, 미합중국), 그리고 폐암 세포주 (A549, ATCC, 미합중국) 각각에 MOI 10, 1 및 0.1의 Ad-ΔE1, Ad-ΔE1B, YKC-1, YKL-1, 그리고 Ad-wt 재조합 아데노바이러스를 각각 처리 하였다. 다섯 종류의 바이러스 중 한 종류의 아데노바이러스에 의해 MOI 0.1에서 암세포를 완전히 괴사시킨 시점에 모든 배지를 제거한 다음, 50% 메탄올에 함유되어 있는 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 잔존한 세포들을 고정시키고 염색하여 분석하였다 (참조: 도 5).In order to verify the cell killing ability of tumor cells of the recombinant adenovirus YKC-1 of the present invention, human liver cancer cell lines (SK-Hep1 and Hep3B, ATCC, United States), brain cancer cell lines (U343 and U-251N, ATCC, United States) , And lung cancer cell lines (A549, ATCC, US) were treated with Ad-ΔE1, Ad-ΔE1B, YKC-1, YKL-1, and Ad-wt recombinant adenoviruses of MOI 10, 1 and 0.1, respectively. All media were removed at the time of complete necrosis of cancer cells at MOI 0.1 by one of the five adenoviruses, followed by fixation, staining and analysis of the remaining cells with 0.5% crystal violet in 50% methanol. (See FIG. 5).
도 5에서 확인할 수 있듯이, 상기한 모든 세포주에서 본 발명의 YKC-1은 현격히 높은 종양 세포 살상 효과를 보였으며, YKL-1 또는 Ad-ΔE1B 보다는 약 10-100배 정도의 살상효과를, 그리고 야생형 아데노바이러스인 Ad-wt 보다는 약 5-10배 정도의 높은 살상 효과를 나타내었다. 반면 음성 대조군인 복제 불능 아데노바이러스인 Ad-ΔE1으로 감염된 암 세포들에는 아무런 살상효과도 관찰할 수 없었다.As can be seen in Figure 5, YKC-1 of the present invention in all the above cell lines showed a significantly higher tumor cell killing effect, about 10-100 times more killing effect than YKL-1 or Ad-ΔE1B, and wild type The killing effect was about 5-10 times higher than that of adenovirus Ad-wt. On the other hand, no killing effect was observed in cancer cells infected with Ad-ΔE1, a non-replicating adenovirus, a negative control.
따라서, 본 실시예에서 시험된 모든 종양 세포에 대하여 본 발명의 YKC-1은 야생형 아데노바이러스를 포함한 여러 다른 복제 가능 아데노바이러스와 비교하여 가장 빠른 진행속도의 살상 효과를 나타냄을 알 수 있다.Thus, for all tumor cells tested in this example, it can be seen that the YKC-1 of the present invention exhibits the fastest killing effect compared to several other replicable adenoviruses, including wild type adenovirus.
실시예 2-2:바이러스 감염에 의한 플라크 형성능 비교 Example 2-2 : comparison of plaque formation ability by virus infection
상기 실시예 2-1에서는 본 발명의 YKC-1이 야생형 아데노바이러스와 여러 다른 복제 가능 아데노바이러스들 보다 높은 효율의 종양 세포 괴사 효과를 나타내었는데, 본 실시 예에서는 고체 배지에서 각각의 바이러스들이 형성하는 플라크의 진행속도를 조사 하였다. 이러한 플라크 분석은 감염된 종양 세포에서 생성된 바이러스가 주위 종양 세포로 퍼져 나가는 효율을 조사하기 위한 것이다.In Example 2-1, YKC-1 of the present invention exhibited higher efficiency of tumor cell necrosis than wild-type adenoviruses and various other replicable adenoviruses. The rate of plaque progression was investigated. This plaque assay is intended to examine the efficiency of the spread of virus produced in infected tumor cells to surrounding tumor cells.
우선, 0.7% 아가로스-DMEM 고체 배지 (5% 우태아 혈청 포함)에서 성장하는 세포주 293, Hep3B 및 U343를 상기 실시예 1-1의 Ad-ΔE1, YKC-1 및 Ad-wt로 2×102pfu 로 감염시킨 다음 37℃에서 7-10일 동안 배양하였다. 이어, 고체 배지를 제거하고, 50% 메탄올에 함유되어 있는 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 잔존한 세포들을 고정시키고 염색 하였다.First, cell lines 293, Hep3B and U343, grown in 0.7% agarose-DMEM solid medium (including 5% fetal bovine serum), were subjected to 2 × 10 with Ad-ΔE1, YKC-1 and Ad-wt of Example 1-1. Infected with 2 pfu and incubated for 7-10 days at 37 ℃. The solid medium was then removed and the remaining cells were fixed and stained with 0.5% crystal violet contained in 50% methanol.
도 6에서 보는 바와 같이, 복제에 필요한 E1 단백질이 제공되는 293 세포주에서는 각 바이러스들의 E1 유전자 구성과는 무관하게 Ad-ΔE1, YKC-1 및 Ad-wt이 모두 같은 크기의 플라크를 형성하였다. 그러나, Hep3B 및 U343 세포를 대상으로 감염시켰을 때에는 Ad-ΔE1은 플라크를 전혀 형성하지 못하는 반면, YKC-1은 Ad-wt보다 크기가 현저하게 큰 플라크를 형성하였으며, 같은 역가의 바이러스를 첨가하였음에도 더 많은 개수의 플라크를 형성하였다.As shown in FIG. 6, in the 293 cell line provided with the E1 protein required for replication, Ad-ΔE1, YKC-1 and Ad-wt all formed plaques of the same size regardless of the E1 gene composition of each virus. However, when infected with Hep3B and U343 cells, Ad-ΔE1 did not form plaque at all, whereas YKC-1 formed plaques that were significantly larger than Ad-wt, even though the same titer of virus was added. A large number of plaques formed.
따라서, 본 발명의 YKC-1 바이러스는 종양 세포로 이루어진 조직에서 주위 종양 세포로 퍼져 나가는 효율이 우수함을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that the YKC-1 virus of the present invention has excellent efficiency of spreading to surrounding tumor cells in tissue consisting of tumor cells.
실시예 2-3:다른 종양 세포주에서의 살상 능력 규명 Example 2-3 : Determination of Killing Capacity in Other Tumor Cell Lines
자궁암 세포주 (C33A 및 HeLa; ATCC, 미합중국)에 상기 실시예 1-1의 Ad-ΔE1, Ad-ΔE1B, YKC-1, YKL-1 및 Ad-wt 바이러스를 MOI 1로 감염시킨 다음, 1일, 2일, 3일, 그리고 4일 (C33A의 경우) 또는 1일, 3일, 5일, 그리고 8일 (HeLa의 경우)째 되는 날 각각 상층액을 걷어내고 0.5% 크리스탈 바이롤렛으로 잔존한 세포들을 고정시키고 염색하였다. 염색된 배양기구 내에 잔존한 세포들의 생존량을 조사하기 위해 100% 메탄올을 500 ㎕씩 첨가하고 30분 동안 방치시킨 후 파이펫으로 염색된 잔존세포들을 용출시킨 다음 200 ㎕만 걷어내어 96-웰 투명 플레이트에 첨가하였다. 595 nm 흡광기에서 그 수치를 읽어서 상대적 세포 성장율 곡선 (도 7a 및 도 7b)을 도출하였다. 도 7a, 및 도7b에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 YKC-1이 야생형 및 다른 바이러스 보다 훨씬 효율적인 종양세포 살상 효과를 나타내었으며, 특히 HeLa 세포주에서 그 살상 효과가 크게 월등함을 보여주었다. 이와 같은 결과는, 상기 실시예 2-1 및 도 5에서 보여준 결과와 유사한 종양 살상 효과이며, 감염 후 배양 기구 표면으로부터 해리되어 떨어져 나가는 세포들이 C33A 세포주의 경우에는, 2일 후부터 살상 효과의 차이가 발생하였으며, HeLa 세포주의 경우에는 3일 후부터 YKC-1의 살상 효과가 야생형 및 다른 바이러스 보다 현저하게 구별될 수 있을 정도로 차이가 나타났다.Uterine cancer cell lines (C33A and HeLa; ATCC, US) were infected with MOI 1 of the Ad-ΔE1, Ad-ΔE1B, YKC-1, YKL-1 and Ad-wt viruses of Example 1-1, then Cells with supernatant removed and remaining in 0.5% crystal vial on days 2, 3, and 4 (for C33A) or 1, 3, 5, and 8 (for HeLa), respectively Were fixed and stained. To examine the viability of the remaining cells in the stained culture apparatus, add 500 µl of 100% methanol, leave for 30 minutes, elute the remaining cells stained with pipette, and then remove only 200 µl to clear 96-well. Was added to the plate. The values were read on a 595 nm absorber to derive relative cell growth curves (FIGS. 7A and 7B). As can be seen in Figures 7a and 7b, YKC-1 of the present invention showed a far more efficient tumor cell killing effect than wild-type and other viruses, particularly showed that the killing effect is significantly superior in HeLa cell line. This result is a tumor killing effect similar to the results shown in Examples 2-1 and FIG. 5, and in the case of C33A cell lines that are dissociated and separated from the surface of the culture apparatus after infection, the difference in killing effect is observed from 2 days later. In the case of HeLa cell line, the killing effect of YKC-1 was significantly different from wild type and other viruses after 3 days.
한편, 실제 살상 효과와 살상되어 해리되는 세포들 내에서의 바이러스 생산량이 동일한 효율을 나타내는지를 확인하기 위하여, 상기 감염된 세포와 배양액을 회수한 다음 얼림-녹임 과정 (freeze-and-thaw)을 3번 되풀이 한 다음, 원심분리시켜 상층액을 회수하였다. 이 상층액을 101-106배 희석시키고 6-웰 플레이트에 미리 배양시킨 293 세포주에 감염시키고 실시예 2-2의 0.7% 아가로스-DMEM 고체배지 (5% 우태아 혈청 포함)를 첨가하여 37℃에서 7일-8일 동안 배양시켜 형성되는 플라크 개수를 계산하여 역가를 측정하였다. 도 8a 및 도 8b에 나타난 바와 같이, 복제 불능 재조합 아데노바이러스는 전혀 바이러스를 생산하지 못하는 반면, Ad-△E1B 및 YKL-1은 야생형 아데노바이러스에 비해 낮은 효율로 바이러스를 생산하였다. 그러나 빠른 살상 효과를 보이는 본 발명의 YKC-1은 야생형와 거의 유사한 효율로 바이러스를 재생산해냄을 확인할 수 있었다.On the other hand, in order to confirm that the actual killing effect and virus production in the killing and dissociating cells show the same efficiency, the infected cells and the culture medium are recovered and then freeze-and-thaw is performed three times. After repeating, centrifugation to recover the supernatant. The supernatant was diluted 101-106 fold and infected with 293 cell lines pre-cultured in 6-well plates and added to 0.7% agarose-DMEM solid medium (containing 5% fetal calf serum) of Example 2-2 at 37 ° C. The titer was determined by counting the number of plaques formed by incubating for 7-8 days at. As shown in FIGS. 8A and 8B, non-replicating recombinant adenovirus produced no virus at all, whereas Ad-ΔE1B and YKL-1 produced virus with lower efficiency than wild type adenovirus. However, YKC-1 of the present invention showing a fast killing effect was able to confirm that the virus reproduces with almost the same efficiency as the wild type.
결론적으로 상기한 실시예 2-1 내지 2-3을 종합해 보면, 본 발명의 YKC-1이 야생형 및 다른 재조합 바이러스 보다 훨씬 높은 효율로 종양 세포를 살상하며 또한 새롭게 생성되어지는 바이러스들도 다른 재조합 바이러스 보다 높은 효율로 재생산되고, 야생형과 유사한 짐을 확인할 수 있었다. 또한, 주위 종양세포가 훨씬 많이 둘러 싸여져 있을 경우에는, 그 확산효과가 훨씬 더 배가될 수 있음을 추측할 수 있었다.In conclusion, summarizing the above Examples 2-1 to 2-3, YKC-1 of the present invention kills tumor cells with much higher efficiency than wild-type and other recombinant viruses, and newly produced viruses also have other recombinants. The virus was reproduced with higher efficiency than the virus and confirmed to be similar to wild type. In addition, if the surrounding tumor cells are much more enclosed, it can be assumed that the diffusion effect can be much more doubled.
실시예 2-4:재조합 아데노바이러스로 감염된 종양 세포의 형태학적 변화 Example 2-4 Morphological Changes of Tumor Cells Infected with Recombinant Adenovirus
상기 실시예 1-1의 Ad-ΔE1, YKC-1 및 Ad-wt 각각을 Hep3B 간암 세포주에 MOI 10으로 감염시킨 다음, 플라크 형성 과정을 광학 현미경 (Axiovert25; Zeiss, 독일) 및 전자 현미경으로 관찰 하였다.Each of Ad-ΔE1, YKC-1 and Ad-wt of Example 1-1 was infected with Hep3B liver cancer cell line with MOI 10, and then the plaque formation was observed by light microscopy (Axiovert25; Zeiss, Germany) and electron microscopy. .
광학 현미경적 관찰 (100배 배율)에 따르면, Ad-wt에 의해 괴사되는 세포들은 배양 플라스크 표면으로부터 둥글게 형성되어져 떨어져 나가는 전형적인 아데노바이러스에 의한 세포 살상 형태를 보였으나, YKC-1으로 감염된 세포들은 플라크 중심부와 가장 자리에 있는 세포들의 세포막이 찢겨진 형태로 괴사되어 가는 것을 관찰할 수 있었다 (참조: 도 9).According to optical microscopic observation (100-fold magnification), cells necrosed by Ad-wt showed a cell killing morphology by a typical adenovirus that formed rounded off the surface of the culture flask, while cells infected with YKC-1 were plaque. The cell membranes of the cells at the center and the edges were observed to be necrotic in a torn form (see FIG. 9).
도 10에서 확인할 수 있듯이, 전자 현미경적 관찰 (4,400배 및 20,000배 배율)에 따르면, 감염되지 않은 Hep3B 세포의 핵 및 세포 내 다른 소기관들은 정상적인 모양을 갖추고 있었다. 또한, Ad-wt으로 감염된 세포의 경우, 핵 내에 고루 퍼져 있는 바이러스 입자를 쉽게 발견할 수 있었으며, 세포 내 소기관들은 정상적인 형태를 갖추고 있었고, 세포막 및 핵막 역시 감염되지 않은 세포처럼 잘 보존되어 있었으며 전반적으로 아데노바이러스 감염 시 나타나는 전형적인 세포 괴사 형태를 보였다.As can be seen in FIG. 10, electron microscopic observations (4,400 and 20,000 times magnification) showed that the nuclei and other organelles of uninfected Hep3B cells had a normal shape. In addition, in the case of cells infected with Ad-wt, it was easy to find virus particles evenly spread in the nucleus, and intracellular organelles had a normal shape, and cell membranes and nuclear membranes were preserved as well as uninfected cells. It showed a typical cell necrosis pattern during adenovirus infection.
본 발명의 YKC-1으로 감염된 세포에서는 세포 내 소기관들의 형태를 구별하기 힘들었으며, 세포막 및 핵막 또한 심하게 찢겨져 있어 생성된 아데노바이러스들이 세포질에 널리 흩어져 있는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 염색체들이 덩어리지면서 핵막 쪽으로 심하게 밀리는 세포 고사 초기 단계 모양을 나타내었다. 그러나 세포 고사의 또 하나의 특징인 세포막의 쭈그러짐 현상 (membrane blebbing)은 발견할 수 없었다. Ad-wt으로 감염된 세포에서도 염색체가 덩어리져 핵막 쪽으로 이동된 모습을 발견할 수 있었으나, 아주 낮은 빈도였고 비정상적으로 핵이 비대해져 있음을 관찰할 수 있었으나 대부분의 염색체는 핵막 내에 고루 퍼져있어 정상적인 핵 모양을 나타내었다.In the cells infected with YKC-1 of the present invention, it was difficult to distinguish the types of intracellular organelles, and the cell membranes and the nuclear membranes were also severely torn, so that the resulting adenoviruses were widely dispersed in the cytoplasm. In addition, the chromosomes clumped up to form a nascent early stage of cell death. However, membrane blebbing, another feature of cell death, was not found. In the cells infected with Ad-wt, chromosomes were found to be lumped and moved to the nuclear membrane. However, it was very low and abnormally enlarged nucleus was observed. Indicated.
따라서, 본 발명의 YKC-1 바이러스는 종양 세포의 괴사 뿐만 아니라 고사를 유발하여 종양 세포를 살상함을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that the YKC-1 virus of the present invention kills tumor cells by causing death as well as necrosis of tumor cells.
실시예 2-5:튜널 분석을 통한 YKC-1의 세포 고사 유발 검증 Example 2-5 Verification of Induced Apoptosis of YKC-1 by Tunnel Analysis
아데노바이러스가 숙주세포 내로 감염되면, 세포 내에서 아데노바이러스의 초기 발현 단백질인 E1A가 발현되어 이에 의한 p53의 활성화가 유도되고, 이에 따라 세포 성장 중지 (Go-G1arrest) 또는 세포 고사 등을 초래하게 되는데, 이때 아데노바이러스의 또 다른 초기 발현 단백질인 E1B 19 kD이 발현되어 백스 (Bax) 및 카스파아제 (caspase)와 같이 세포 고사를 직접 또는 간접적으로 유도하는 단백질들에 E1B 19 kD 단백질이 결합하거나 또는 백스 및 카스파아제 단백질의 발현을 유도하는 기전을 방해해 세포 고사를 억제한다는 실험 결과들이 보고된 바 있다 (Pearson, A.S. et al.,Clinical Cancer Research, 6:887-890(2000)).When adenovirus is infected into a host cell, E1A, an early expression protein of adenovirus, is expressed in the cell, thereby inducing p53 activation, thereby preventing cell growth (G o -G 1 arrest) or cell death. In this case, E1B 19 kD protein, which is another early expression protein of adenovirus, is expressed and binds E1B 19 kD protein to proteins that directly or indirectly induce cell death, such as Bax and caspase. Experimental results have been reported to inhibit cell death by interfering with the mechanisms that induce the expression of Bax and caspase proteins (Pearson, AS et al., Clinical Cancer Research , 6: 887-890 (2000)).
이러한 세포 고사 억제 단백질인 E1B 19 kD을 선택적으로 합성하지 못하도록 변이시킨 본 발명의 YKC-1이 E1B 19 kD를 발현하는 야생형 아데노바이러스에 비해 감염 시 세포 고사를 더욱 증폭하는지를 알아보기 위하여, 튜널 분석법 (TUNEL Assay; Moore, M. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:11295-11301(1996))을 통해 A549 폐암 세포주를 이용하여 세포 고사의 한 특징인 DNA 절편화 (DNA fragmentation)를 조사하였다. 우선, A549 폐암 세포주 (2 ×104세포)를 챔버 슬라이드에 분주한 다음, Ad-wt 및 YKC-1 바이러스 각각을 상기 세포주에 MOI 10으로 감염시켰다. 4일 후 배지를 제거하고, 아폽택 키트 (ApopTag Kit; Oncor, Inc., 미합중국)를 이용하여 튜널 분석을 실시한 다음, 그 결과를 광학현미경으로 관찰 하였다. 세포 고사 유도 화학물질인 캄토테킨 (Camptothecin: CPT, Sigma Aldrich, 미합중국)을 1 μM 처리한 A549 종양 세포주를 양성 대조군으로 이용하였다.In order to determine whether YKC-1 of the present invention, which is mutated not to selectively synthesize E1B 19 kD, which inhibits apoptosis, amplifies cell death upon infection, compared to wild type adenovirus expressing E1B 19 kD, DNA fragmentation, a hallmark of cell death using an A549 lung cancer cell line via TUNEL Assay; Moore, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 93: 11295-11301 (1996)). ) Was investigated. First, an A549 lung cancer cell line (2 × 10 4 cells) was dispensed on a chamber slide, and then each Ad-wt and YKC-1 virus was infected with the MOI 10. After 4 days, the medium was removed and subjected to tunnel analysis using an ApopTag Kit (Oncor, Inc., United States), and the results were observed under an optical microscope. A549 tumor cell line treated with 1 μM of apoptosis-inducing chemical camptothecin (Camptothecin: CPT, Sigma Aldrich, USA) was used as a positive control.
도 11에서 확인할 수 있듯이, Ad-wt에 의해 감염된 A549 세포는 전체 중 약 5% 미만의 세포들이 진한 갈색으로 염색되었다. 반면, YKC-1에 의해 감염된 세포는 약 70-80% 정도가 갈색으로 염색되어, E1B 19 kD 단백질을 발현하는 Ad-wt에 비해 훨씬 높은 빈도로 세포 고사가 진행되고 있음을 확인할 수 있었다.As can be seen in Figure 11, A549 cells infected with Ad-wt, less than about 5% of the cells stained dark brown. On the other hand, about 70-80% of the cells infected with YKC-1 were stained brown, and it was confirmed that the cell death proceeded at a much higher frequency than Ad-wt expressing the E1B 19 kD protein.
따라서, 세포 고사 억제 (antiapoptotic) 기능을 하는 것으로 잘 알려진 E1B 19 kD 단백질의 존재 유무에 따라, 아데노바이러스의 세포 고사 진행 경로가 달라짐을 알 수 있었으며, 본 발명의 YKC-1 아데노바이러스가 암세포 내에서 증식할 뿐만 아니라 세포 고사까지 유도시킴으로써 보다 빠른 살상 효과를 초래한다는 것을 확인할 수 있다.Therefore, it was found that the path of progression of apoptosis of adenovirus depends on the presence or absence of the E1B 19 kD protein, which is well known to have an antiapoptotic function, and the YKC-1 adenovirus of the present invention is used in cancer cells. It can be seen that not only proliferation but also apoptosis leads to a faster killing effect.
실시예 2-6:누드 마우스를 모델로 한 재조합 아데노바이러스 YKC-1의 항종양 효과 Example 2-6 Antitumor Effect of Recombinant Adenovirus YKC-1 Modeled on Nude Mouse
상기한 실시예는 재조합 아데노바이러스 YKC-1의 종양세포 살상능 효과가 다른 증식 가능 아데노바이러스들 뿐만 아니라 야생형 아데노바이러스 보다 훨씬 우수함을인 비트로수준에서 보여 준다. 본 실시예는 실제로 누드 마우스를 모델로 하여, 본 발명의 YKC-1 바이러스가인 비보수준에서도 항종양 효과가 우수한지를 확인하기 위한 것이다.The above-described embodiment shows, as well as the tumor cell-killing effect of recombinant adenovirus function YKC-1 other possible proliferative adenovirus in much Great the in vitro level than wild-type adenovirus. In this example, a nude mouse is used as a model to confirm whether the YKC-1 virus of the present invention is excellent in antitumor effect even at the in vivo level.
우선, 5-6주령의 누드 마우스 (Charles River Japan Inc., 일본국)의 복부 피하에 인체 간암 세포주 Hep3B를 주사하여 종양의 크기가 5 × 5 ㎜ 정도에 도달했을 때, 재조합 아데노바이러스 (초원심분리로 회수하여 PBS로 투석한 바이러스) 5 ×108pfu/50 ㎕를 종양 내에 주사한 다음, 2-3일에 한번씩 캘리퍼로 종양의 크기를 측정하였다.First, the human liver cancer cell line Hep3B was injected into the abdomen subcutaneously in a nude mouse (Charles River Japan Inc., Japan) of 5-6 weeks of age when the tumor size reached about 5 × 5 mm. 5 × 10 8 pfu / 50 μl of virus) recovered by separation and dialyzed with PBS was injected into the tumor, and the tumors were measured by calipers every 2-3 days.
도 12에서 볼 수 있듯이, 음성 대조군으로 PBS를 주사한 경우에는 종양의 크기가 계속 성장해 나가는 반면 본 발명의 YKC-1를 주사한 경우에는 종양의 성장이 현저히 억제되었으며 완전히 종양이 괴사되어 없어지는 경우도 관찰할 수 있었다. 또한, 다른 증식 가능 아데노바이러스들 (Ad-ΔE1B 및 YKL-1)을 주사한 경우에도 YKC-1을 주사한 경우처럼 종양의 성장이 억제되었으나 재조합 아데노바이러스 YKC-1에 비해 항종양 효능이 떨어짐을 확인할 수 있었다.As can be seen in Figure 12, when the injection of PBS as a negative control the tumor size continues to grow while the injection of YKC-1 of the present invention significantly inhibited the growth of tumors and completely necrotic tumor disappears It could also be observed. In addition, the injection of other proliferative adenoviruses (Ad-ΔE1B and YKL-1) also inhibited tumor growth as in the case of injecting YKC-1, but showed lower antitumor efficacy compared to recombinant adenovirus YKC-1. I could confirm it.
따라서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 YKC-1는인 비보에서도 우수한 항종양 효과를 나타냄을 알 수 있고, 세포 고사를 동시에 유발하는 특성 때문에 기존의 세포 고사를 유도하는 시스플라틴 (cisplantin)과 같은 항암제와 함께 병행요법을 실시할 때 보다 우수한 항암 효과를 기대할 수 있게 된다.Therefore, it can be seen that the recombinant adenovirus YKC-1 of the present invention shows excellent antitumor effect even in vivo , and due to the property of inducing apoptosis at the same time, with an anticancer agent such as cisplantin (cisplantin) that induces apoptosis. When combined therapy is expected to be more effective anticancer effect.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail a specific part of the present invention, it is apparent to those of ordinary skill in the art that such a specific technology is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.
이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 종양 세포 살상 효과가 개선된 재조합 아데노바이러스를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공한다. 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 감염된 세포에서 세포 괴사 및 세포 고사를 동시에 유도하여 종양 세포 살상능이 크게 향상되어 종래의 재조합 아데노바이러스에 의한 종양 치료 방법의 한계를 극복할 수 있으며, 더욱이 본 발명의 약제학적 조성물은 종래의 암 치료방법, 특히 세포 고사를 유도하는 암 치료 방법과 병행하여 이용되는 경우에는 치료효과를 극대화할 수 있다.As described in detail above, the present invention provides a recombinant adenovirus with improved tumor cell killing effect. The present invention also provides a pharmaceutical anti-tumor composition comprising the recombinant adenovirus of the present invention. The recombinant adenovirus of the present invention can induce cell necrosis and cell death in infected cells at the same time, thereby greatly improving tumor cell killing ability, thereby overcoming the limitations of the conventional method for treating tumors by recombinant adenovirus, and moreover, the pharmaceutical of the present invention The composition may maximize the therapeutic effect when used in combination with conventional cancer treatment methods, especially cancer treatment methods that induce cell death.
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| ( The Journal of biological chemistry , 1996-00-00 , 271(34) , 20392-20398 * |
| 75-124쪽 2부 아데노 바이러스 벡터를 이용한 종양백신 개발 * |
| Human Gene Therapy, Vol.11(3):379-388(2000. 2.) * |
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