KR20030090918A - Recombinant Adenovirus with Enhanced Tumoricidal Effect and Pharmaceutical Composition Comprising the Same - Google Patents

Abstract

PURPOSE: A recombinant adenovirus having improved tumor killing effect and a pharmaceutical composition containing the same are provided. Therefore, a larger amount of genes are effectively transferred by administering a smaller amount of the recombinant adenovirus. CONSTITUTION: A recombinant adenovirus consists of adenovirus and protein containing VSV-G epitope derived from vesicular stomatitis virus which is connected to the adenovirus, wherein the adenovirus is YKL-1(KFCC-11099) or YKC-1(KFCC-11280); the VSV-G epitope connected region is adenovirus fiber knob region; the adenovirus fiber knob region is HI loop, pentone base or fiber terminal region; the VSV-G epitope has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; a linker is inserted between the adenovirus fiber and VSV-G epitope; the linker consists of one or more glycines; and the recombinant adenovirus is YCI-Ad-VSVG(KFCC-11215).

Description

개선된 종양 살상 효과를 갖는 재조합 아데노바이러스 및 그를 포함하는 약제학적 조성물{Recombinant Adenovirus with Enhanced Tumoricidal Effect and Pharmaceutical Composition Comprising the Same}Recombinant Adenovirus with Enhanced Tumoricidal Effect and Pharmaceutical Composition Comprising the Same}

본 발명은 항종양능이 향상된 재조합 아데노바이러스에 관한 것으로, 보다상세하게는 아데노바이러스에 베지큘러 스토마티티스(vesicular stomatitis) 바이러스의 감염 리간드를 도입시켜서, 항종양능을 향상시킨 재조합 아데노바이러스 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a recombinant adenovirus with improved anti-tumor activity, and more particularly, by introducing an infective ligand of vesicular stomatitis virus into adenovirus, the recombinant adenovirus having improved anti-tumor capacity and including the same It relates to pharmaceutical anti-tumor compositions.

현재 분자생물학의 눈부신 발달로 유전자 수준에서 암 및 난치성 질환의 치료제 개발에 커다란 진보가 이루어져 왔으며 1990년 유전자 치료가 임상적으로 처음으로 시도된 이래 치료용 유전물질의 전달방법에 관한 연구가 지속되어 왔다. 질병치료를 목적으로 하는 유전자 치료의 임상시험중 약 60% 이상이 암을 대상 질환으로 하고 있으며, 치료용 유전자를 대상세포에 전달해 주는 매개체로는 아데노바이러스가 가지는 많은 장점들 때문에 레트로바이러스를 대신하여 많이 사용되고 있다.Due to the remarkable development of molecular biology, great advances have been made in the development of therapeutic agents for cancer and intractable diseases at the genetic level. Since the first clinical trial of gene therapy in 1990, research on delivery of therapeutic genetic material has been continued. . More than 60% of the clinical trials for gene therapy aimed at treating diseases are cancer targets, and because of the many advantages of adenovirus as a mediator to deliver therapeutic genes to target cells, It is used a lot.

유전자 치료가 상용화되어 실질적인 치료법으로 되기 위해서는 무엇보다도 먼저 치료용 유전자를 원하는 부위에 안전하면서도 효과적으로 전달하여 주는 유전자 전달체의 개발이 선행되어져야 한다. 재조합 아데노바이러스를 유전자 전달체로서 이용한 유전자 전달의 가능성은 1984년 그레이엄(Graham)에 의하여 최초로 보고되었다 (Graham, F.L.,EMBO J.,1:2917-2922(1984)). 1990년 ADA (adenosine deaminase) 결핍증을 대상으로 한 첫 유전자 치료 임상시험 이후, 1990년대 중반까지 복제 불능 아데노바이러스 벡터 내에 특정 유전자를 삽입시켜 표적 세포 내에서 발현을 유도하는 유전자 치료법에 대한 연구가 활발해 졌는데, 이는 세포의 분열상태 여부에 관계없이 다양한 종류의 세포에 대한 유전자 전달능력이 우수하고, 높은 역가의 바이러스를 쉽게 생산할 수 있으며, 동결건조가 가능할 정도로 구조적으로안정하고, 약제화가 상대적으로 용이하다는 등의 아데노바이러스의 여러 가지 장점들이 부각되었기 때문이다 (Yeh, P. et al.,FASEB J., 11:615-622(1997)). 그 후로 아데노바이러스가 가지는 문제점들, 예를 들면 단기적인 유전자 발현과 인체내 도입시 강한 면역반응의 유도 등을 극복하고자 아데노바이러스의 구조를 변경시키는 노력들이 계속 시행되어져 왔다. 1996년 코카넥(Kochanek) 등은 아데노바이러스 유전자를 모두 제거한 구틀러스(gutless) 바이러스를 개발하여 이 바이러스를 이용한 벡터는 유전자 삽입능이 최대 30 kb로 개선되었고, 바이러스의 잔여단백질이 전혀 생산될 수 없어 (Kochanek, S.,Proc. Natl. Acad. Sci.93:5731-5736(1996)), 인체내 면역반응이 유도되지 않는다는 장점이 있다. 또한, 대한민국 특허 공개 제 1999-22941호에는 패키징 셀 라인에 의한 오버랩을 갖지 않는 아데노바이랄 벡터를 개시하고 있는데, 이는 아데노바이러스의 자가복제능을 제거하여 아데노바이러스가 엔캡시데이트되지 못하게 함으로써, 보다 효과적으로 면역적인 간섭을 억제할 수 있는 방법을 제공한다.In order for the gene therapy to be commercialized and become a practical treatment, first of all, the development of a gene carrier that safely and effectively delivers a therapeutic gene to a desired site must be preceded. The possibility of gene transfer using recombinant adenovirus as a gene carrier was first reported by Graham in 1984 (Graham, FL, EMBO J., 1: 2917-2922 (1984)). After the first gene therapy clinical trial in ADA (adenosine deaminase) deficiency in 1990, research into gene therapy to induce expression in target cells by inserting specific genes into non-replicating adenovirus vectors until the mid-1990s, It is excellent in gene delivery ability for various kinds of cells regardless of the state of division of cells, can easily produce high titer virus, structurally stable enough for lyophilization, relatively easy to chemical Many of the advantages of adenovirus have been highlighted (Yeh, P. et al., FASEB J. , 11: 615-622 (1997)). Since then, efforts have been made to alter the structure of adenoviruses in order to overcome the problems of adenoviruses, such as short-term gene expression and induction of strong immune responses upon introduction into the human body. In 1996, Kochanek et al. Developed a gutless virus from which all of the adenovirus genes were removed, and the vector using this virus improved the gene insertion capacity up to 30 kb, and the residual protein of the virus could not be produced at all. (Kochanek, S., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 5731-5736 (1996)), has the advantage of not inducing an immune response in the human body. In addition, Korean Patent Laid-Open Publication No. 1999-22941 discloses an adenovirus vector having no overlap by a packaging cell line, which removes the self-replicating ability of the adenovirus to prevent the adenovirus from being encapsulated. It provides a method that can effectively suppress immune interference.

재조합 아데노바이러스가 우수한 유전자 전달 효율을 보이며 높은 역가로 생산이 가능하고 쉽게 농축할 수 있어 생체내 (in vivo) 전달이 용이하다는 점이 보고되면서, 최근 5년 사이에 암을 대상으로 하는 유전자 치료에 재조합 아데노바이러스를 이용하는 빈도수가 급격히 증가하였다. 암을 유전자 요법으로 치료할 경우 장기적이고 지속적인 치료유전자의 발현을 필요로 하지 않고 바이러스에 의해 유도되는 숙주의 면역반응이 크게 문제시되지 않거나 오히려 장점이 될 수도 있기 때문에 아데노바이러스가 암치료용 유전자 전달체로 각광받기 시작했다 (Pallard, F.Hum.Gene Ther., 9:283-286(1998)).Recombinant adenoviruses show excellent gene transfer efficiency, can be produced at high titers, and can be easily concentrated.in vivo) Reported ease of delivery, the frequency of the use of recombinant adenoviruses in gene therapy for cancer has dramatically increased over the past five years. Treatment of cancer with gene therapy requires adenovirus as a gene carrier for cancer treatment because it does not require the expression of long-term, continuous therapeutic genes and the immune response of the virus-induced host is not a major concern or may be an advantage. Began to receive (Pallard, F.Hum.Gene ther, 9: 283-286 (1998).

암치료용 재조합 아데노바이러스는 대부분 일세대 바이러스로 최근의 연구동향은 특정 유전자를 단독으로 이용한 치료법보다는 성질이 서로 다른 치료용 유전자를 동시에 발현시키거나 기존의 암 치료 방법인 항암제 투여 또는 방사선 치료와의 병합치료에 따른 치료효과를 극대화하려는 시도들이 있다 (Roth, J.A. et al.J. Nat. Cancer Ins., 89:21-39(1997)). 예를 들어, 대한민국 특허 제 217463호에는 항암효과를 나타내는 것으로 알려진 p53 유전자를 포함하는 아데노바이러스를 사용하여 항암치료를 수행하는 방법을 제공하고 있는데, 이때 사용되는 아데노바이러스로는 상술한 재조합 아데노바이러스를 사용하여 증식성 변이 바이러스를 생산하지 않아 효과적으로 항암치료를 수행할 수 있는 것을 특징으로 한다.Recombinant adenoviruses for the treatment of cancer are mostly first-generation viruses, and recent research trends are to express different genes for treatment at the same time or to treat them with anticancer drugs or radiation therapy. Attempts have been made to maximize the therapeutic effect of combination therapy (Roth, JA et al. J. Nat. Cancer Ins. , 89: 21-39 (1997)). For example, Korean Patent No. 217463 provides a method for carrying out anticancer treatment using an adenovirus comprising a p53 gene known to exhibit an anticancer effect. The adenoviruses used herein include the recombinant adenovirus described above. It does not produce a proliferative mutant virus, characterized in that it can effectively perform chemotherapy.

그러나, 상기 연구결과들은 대부분이 증식불가능한 아데노바이러스를 유전자 전달체로 이용하는 경우로 일차 감염세포 또는 극히 일부의 주변세포에만 항암효과를 유발할 수 있어 임상적인 실용성면에서는 제약이 뒤따를 수밖에 없다. 이를 극복하는 수단으로 암세포에서 선택적으로 증식하여 암세포를 살상하는 종양세포 특이 증식 및 세포살상 재조합 아데노바이러스에 대한 연구가 맥코믹(McCormick) 그룹에 의해 처음 보고된 이후 종양세포특이 살상바이러스의 가능성이 다각도로 연구되고 있다. 맥코믹이 개발한 ONYX-015는 아데노바이러스의 E1B 55kD 유전자가 소실되어 있으며 대부분의 암세포 특히 p53 유전자가 비활성화된 암세포에서만 선택적으로 활발하게 바이러스가 증식하여 세포의 사멸을 유도하였다 (Heise, C. et al.,Nature Med., 3:639-645(1997)). 실제로, ONYX-015 재조합 아데노바이러스는 두경부 암환자를 대상으로 한 임상시험에서도 우수한 치료효과를 보여주었으며, 한편으로는 암특이적 유전자조절부위에 E1 유전자 등을 삽입하여 바이러스의 증식이 암조직에서만 특이적으로 가능하도록 재조합된 아데노바이러스도 개발되고 있다. 여기에 약제 감수성 유전자인 HSV-TK 또는 CD를 삽입시켜 항암효과를 증폭시킴과 동시에 바이러스의 증식을 인위적으로 억제함으로써 안전성이 개선될 수 있음이 또한 확인되어 (Freytag et al.Nat. Biotech., 15:866-870(1997)), 아데노바이러스의 임상 응용 가능성이 점차 증대되어 가고 있다. 이러한 점에 착안하여 이미 본 실험실에서는 아데노바이러스의 E1B 영역의 55 kDa 단백질의 유전자 발현이 저하된 재조합 아데노바이러스인 YKL-1을 특허출원한 바 있다 (대한민국 특허출원 제 1999-33011호). 특히 암세포특이 살상효과를 가지는 아데노바이러스는 뇌암에서와 같이 p53 돌여변이가 전체 빈도중 40%를 차지하여 기존의 화학요법이나 방사선치료에 저항성을 가지는 경우에 보다 효과적으로 이용될 수 있다 (Shinoura, N. et al. Cancer Res. 59:3411-3416, 1999). 그러나, 뇌에 많은 양의 아데노바이러스를 투여하는 경우에는 바이러스의 독성 때문에 사용이 제한적일 수밖에 없는 관계로, 유전자 전달율을 증가시켜 투여량을 감소시키는 방법이 선행되어야만 한다. 또한, 아데노바이러스가 세포안으로 들어가는 기작은 목적세포의 수용체로 CAR (Coxsackievirus and adenovirus receptor)를 통하여 주로 감염된다 (Tomko, R.P. et al. Proc. Natl. Sci. USA 94: 3352-3356, 1997).However, the results of the study are mostly in the case of using a non-proliferative adenovirus as a gene carrier can cause the anti-cancer effect only on the primary infected cells or a very small number of peripheral cells, which is bound to be limited in clinical practicality. As a means of overcoming this, the possibility of tumor cell specific killing virus has been multiplied since the study of tumor cell specific proliferation and cytotoxic recombinant adenovirus that selectively proliferates in cancer cells to kill cancer cells was first reported by McCormick group. Is being studied. ONYX-015, developed by McCormick, lacks the adenovirus E1B 55kD gene and selectively proliferates the virus only in most cancer cells, particularly in cancer cells where the p53 gene is inactivated (Heise, C. et al. , Nature Med. , 3: 639-645 (1997)). Indeed, ONYX-015 recombinant adenovirus showed excellent therapeutic effects in clinical trials of head and neck cancer patients. On the other hand, the growth of the virus was specific to cancer tissues by inserting the E1 gene into cancer-specific gene regulatory sites. Adenoviruses that are recombinantly possible have also been developed. It has also been confirmed that safety can be improved by inserting a drug-sensitive gene, HSV-TK or CD, amplifying anticancer effects and artificially inhibiting the proliferation of viruses (Freytag et al. Nat. Biotech. , 15 : 866-870 (1997)), the clinical application potential of adenovirus is increasing. With this in mind, the laboratory has already filed a patent application for YKL-1, a recombinant adenovirus with reduced gene expression of 55 kDa protein in the E1B region of adenoviruses (Korean Patent Application No. 1999-33011). In particular, adenoviruses having cancer-specific killing effects can be used more effectively when p53 mutations account for 40% of the total frequency, as in brain cancer, and are resistant to conventional chemotherapy or radiation therapy (Shinoura, N. et al. Cancer Res. 59: 3411-3416, 1999). However, when a large amount of adenovirus is administered to the brain, its use is limited due to the toxicity of the virus. Therefore, a method of increasing the gene delivery rate to reduce the dose should be preceded. In addition, the mechanism by which adenovirus enters the cell is mainly infected through the COxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) as a receptor of the target cell (Tomko, RP et al. Proc. Natl. Sci. USA 94: 3352-3356, 1997).

일반적으로, 대부분의 세포에서는 CAR의 발현이 충분히 되고 있지만 성숙한 뼈조직의 근세포, 림프세포, 섬유세포, 폐 마크로파지, 그외 일부 종양세포 등은CAR의 발현이 되지 않거나 극히 미약한 것으로 알려져 있으므로, 이들 조직세포들에 대한 아데노바이러스에 의한 유전자 전달은 낮을 수밖에 없다. 최근에 이루어진 아데노바이러스를 이용한 임상시험에서, 여러 종양세포로의 낮은 유전자 전달효율의 중요한 원인이 CAR 발현의 결손인 것으로 밝혀지고 있다. 또한, CAR 수용체를 통한 아데노바이러스의 감염은 CAR의 발현이 상대적으로 많은 정상세포에 아데노바이러스를 집중시켜 CAR의 발현이 낮은 대상세포 (종양세포)로의 감염율을 저하시키는 결과를 초래하기도 한다. 이러한 대상세포로의 낮은 형질 도입율을 극복하기 위하여, 임상시험에서 고역가의 아데노바이러스를 이용하여야 하는데, 이는 또한 아데노바이러스 전달체 자체에 대한 독성과 숙주의 면역반응을 증가시켜 안전하고 효과적인 임상치료를 위협하는 요인으로 작용된다.In general, CAR expression is sufficient in most cells, but muscle cells, lymph cells, fibroblasts, lung macrophages, and some tumor cells of mature bone tissues are not known to be CAR expression or extremely weak. Gene delivery by adenovirus to cells is inevitably low. In recent clinical trials using adenoviruses, it has been found that an important cause of low gene transfer efficiency to various tumor cells is a lack of CAR expression. In addition, infection of adenovirus through the CAR receptor may result in the concentration of adenovirus in normal cells with relatively high expression of CAR, resulting in a lower infection rate to target cells (tumor cells) with low expression of CAR. To overcome this low transduction rate into the target cells, high titers of adenovirus should be used in clinical trials, which also increase the toxicity to the adenovirus carrier itself and the host's immune response, threatening safe and effective clinical treatment. It acts as a factor.

이러한 CAR 수용체에 의존한 아데노바이러스의 유전자 전달의 제한점을 극복하기 위하여 CAR 수용체를 통하지 않고 세포를 감염시킬 수 있는 방안들이 연구되고 있다. 실제로 아데노바이러스 타입 2의 파이버 (fiber)를 아데노바이러스 타입 17의 파이버로 대치하여 표피세포에 대한 유전자 전달 효율을 증가 시켰으며, 아데노바이러스 타입 5의 노브 도메인 (knob domain)을 아데노바이러스 서브그룹 (subgroup) B의 노브 도메인으로 치환시킨 키메릭 (chimeric) 아데노바이러스가 아데노바이러스 타입 5에 의해 잘 감염이 되지 않는 조혈세포들을 효과적으로 감염시킬 수 있었다. 위크햄 (Wickham)은 아데노바이러스 파이버의 카르복실기 말단부위에 폴리리신 (polylysine)기 또는 RGD 모티프를 붙여, 각각의 아데노바이러스가 헤파린 (heparin)을 포함하는 세포막 수용체와 인테그린 (integrin)을 특이적으로 인식하고 접합하여 세포내로 성공적으로 삽입될 수 있음을 보고한 바 있다 (Wickham, T. J. J. Virol., 71:8221-8229, 1997). 또한, 카라스니크 (Krasnykh) 등은 목적세포의 특이적 수용체를 인지하고 결합할 수 있는 표적화기를 아데노바이러스 파이버의 카르복실기 말단부위 대신 파이버의 HI 루프 (loop)에 도입하여 바이러스를 효과적으로 재표적화할 수 있음을 보고하였다 (Kransnykh, V. et al. J. Virol., 72:1884-1852, 1998; Yoshida, Y. et al. Hum. Gene. Ther. 9:2503-2515, 1998; 및 Shinoura, N. et al. Cancer Res. 59:3411-3416, 1999). 그러나, 이러한 방법 역시 낮은 전달효율을 향상시키는데는 별다른 효과를 제공하지 못하였으므로, 전달효율을 향상시킬 수 있는 방법을 개발하려는 노력이 계속되고 있는 실정이다.In order to overcome the limitations of gene delivery of adenoviruses dependent on the CAR receptor, methods for infecting cells without the CAR receptor have been studied. In fact, adenovirus type 2 fibers were replaced with adenovirus type 17 fibers to increase the efficiency of gene transfer to epidermal cells, and the knob domain of adenovirus type 5 was replaced with the adenovirus subgroup. A chimeric adenovirus substituted with the knob domain of B) was able to effectively infect hematopoietic cells that are not well infected by adenovirus type 5. Wickham attaches a polylysine or RGD motif to the carboxyl terminus of adenovirus fibers so that each adenovirus specifically recognizes cell membrane receptors containing heparin and integrin. It has been reported that it can be successfully inserted into cells by conjugation (Wickham, TJJ Virol., 71: 8221-8229, 1997). In addition, Karasnykh et al. Introduce a targeting group capable of recognizing and binding specific receptors of a target cell to the HI loop of the fiber instead of the carboxyl terminal of the adenovirus fiber, thereby effectively retargeting the virus. (Kransnykh, V. et al. J. Virol., 72: 1884-1852, 1998; Yoshida, Y. et al. Hum. Gene. Ther. 9: 2503-2515, 1998; and Shinoura, N. et al. Cancer Res. 59: 3411-3416, 1999). However, this method also did not provide a significant effect to improve the low transmission efficiency, there is a continuing effort to develop a method that can improve the transmission efficiency.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this specification many patent documents and articles are referenced and their citations are indicated. The disclosures of cited patent documents and articles are incorporated herein by reference in their entirety, so that the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained.

따라서, 본 발명의 목적은 종양 살상능 효과가 향상된 재조합 아데노바이러스를 제공하는데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a recombinant adenovirus with improved tumor killing effect.

본 발명의 다른 목적은 상기한 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention to provide a pharmaceutical anti-tumor composition comprising the recombinant adenovirus described above.

한 가지 관점으로서, 본 발명은 아데노바이러스 및 이에 연결된 베지큘라 스토마티티스 바이러스로부터 유래된 VSV-G 에피토프를 포함한 단백질로 구성됨을 특징으로 하여 개선된 종양 살상 효과를 갖는 재조합 아데노바이러스를 제공한다.In one aspect, the present invention provides a recombinant adenovirus having improved tumor killing effect, characterized in that it consists of a protein comprising VSV-G epitope derived from adenovirus and associated Vesicular stomatitis virus.

다른 관점으로서, 본 발명은 (a) 아데노바이러스 및 이에 연결된 베지큘라 스토마티티스 바이러스로부터 유래된 VSV-G 에피토프를 포함한 단백질로 구성된 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a therapeutically effective amount of a recombinant adenovirus consisting of (a) a protein comprising a VSV-G epitope derived from an adenovirus and a Vesicular stomatitis virus linked thereto, and (b) a pharmaceutically acceptable carrier. It provides a pharmaceutical anti-tumor composition comprising a.

도 1은 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 파이버 단백질의 C-말단 에 VSV-G 에피토프와 글라이신 연결고리가 부착된 모식도이다.1 is a schematic diagram of a VSV-G epitope and glycine linkage attached to the C-terminus of the fiber protein of the recombinant adenovirus of the present invention.

도 2는 VSV-G 에피토프가 삽입된 YCI-Ad-VSVG의 재표적화 감염경로를 모식화한 그림이다.Figure 2 is a schematic of the retargeting infection path of YCI-Ad-VSVG into which the VSV-G epitope was inserted.

도 3은 YKL-1의 파이버 말단에 VSV-G 리간드가 삽입된 YCI-Ad-VSVG의 모식도와 바이러스의 제조방법을 나타내는 개략도이다.3 is a schematic diagram showing a schematic diagram of YCI-Ad-VSVG in which a VSV-G ligand is inserted into a fiber terminal of YKL-1 and a virus production method.

도 4는 dl324-LacZ 바이러스의 파이버 말단에 VSV-G 리간드가 삽입된dl324-LacZ-VSVG의 모식도와 바이러스의 제조방법을 나타내는 개략도이다.4 is a schematic diagram showing a schematic diagram of a dl324-LacZ-VSVG in which a VSV-G ligand is inserted into a fiber terminal of a dl324-LacZ virus and a method for producing a virus.

도 5는 제작된 재조합 아데노바이러스 YCI-Ad-VSVG의 E1 유전자 구성을 PCR로 확인하는 사진이다.5 is a photograph confirming the E1 gene configuration of the produced recombinant adenovirus YCI-Ad-VSVG by PCR.

도 6은 제작된 재조합 아데노바이러스 YCI-Ad-VSVG의 파이버 부분에 VSV-G 에피토프가 삽입되었는지를 PCR로 확인하는 사진이다.Figure 6 is a photograph confirming whether the VSV-G epitope is inserted into the fiber portion of the produced recombinant adenovirus YCI-Ad-VSVG by PCR.

도 7a는 세포주가 U343인 경우에 YCI-Ad-VSVG의 증가된 유전자 전달효율을나타내는 사진이다.Figure 7a is a photograph showing the increased gene transfer efficiency of YCI-Ad-VSVG when the cell line is U343.

도 7b는 세포주가 U118MG인 경우에 YCI-Ad-VSVG의 증가된 유전자 전달효율을 나타내는 사진이다.Figure 7b is a photograph showing the increased gene transfer efficiency of YCI-Ad-VSVG when the cell line is U118MG.

도 7c는 세포주가 U251N인 경우에 YCI-Ad-VSVG의 증가된 유전자 전달효율을 나타내는 사진이다.Figure 7c is a photograph showing the increased gene transfer efficiency of YCI-Ad-VSVG when the cell line is U251N.

도 7d는 세포주가 U87MGMG인 경우에 YCI-Ad-VSVG의 증가된 유전자 전달효율을 나타내는 사진이다.Figure 7d is a photograph showing the increased gene transfer efficiency of YCI-Ad-VSVG when the cell line is U87MGMG.

도 7e는 세포주가 CHO-K1인 경우에 YCI-Ad-VSVG의 증가된 유전자 전달효율을 나타내는 사진이다.7E is a photograph showing increased gene transfer efficiency of YCI-Ad-VSVG when the cell line is CHO-K1.

도 7f는 세포주가 Lec2인 경우에 YCI-Ad-VSVG의 증가된 유전자 전달효율을 나타내는 사진이다.Figure 7f is a photograph showing the increased gene transfer efficiency of YCI-Ad-VSVG when the cell line is Lec2.

도 7g는 세포주가 MCF-7인 경우에 YCI-Ad-VSVG의 증가된 유전자 전달효율을 나타내는 사진이다.Figure 7g is a photograph showing the increased gene transfer efficiency of YCI-Ad-VSVG when the cell line is MCF-7.

도 7h는 세포주가 Pro 5인 경우에 YCI-Ad-VSVG의 증가된 유전자 전달효율을 나타내는 사진이다.Figure 7h is a photograph showing the increased gene transfer efficiency of YCI-Ad-VSVG when the cell line is Pro 5.

도 8a는 세포주가 U343인 경우에 YCI-Ad-VSVG의 증가된 유전자 전달효율을 정량화한 그래프이다.8A is a graph quantifying the increased gene transfer efficiency of YCI-Ad-VSVG when the cell line is U343.

도 8b는 세포주가 U118MG인 경우에 YCI-Ad-VSVG의 증가된 유전자 전달효율을 정량화한 그래프이다.8B is a graph quantifying the increased gene transfer efficiency of YCI-Ad-VSVG when the cell line is U118MG.

도 8c는 세포주가 U251N인 경우에 YCI-Ad-VSVG의 증가된 유전자 전달효율을정량화한 그래프이다.8C is a graph quantifying the increased gene transfer efficiency of YCI-Ad-VSVG when the cell line is U251N.

도 8d는 세포주가 U87MGMG인 경우에 YCI-Ad-VSVG의 증가된 유전자 전달효율을 정량화한 그래프이다.8D is a graph quantifying the increased gene transfer efficiency of YCI-Ad-VSVG when the cell line is U87MGMG.

도 8e는 세포주가 CHO-K1인 경우에 YCI-Ad-VSVG의 증가된 유전자 전달효율을 정량화한 그래프이다.8E is a graph quantifying the increased gene transfer efficiency of YCI-Ad-VSVG when the cell line is CHO-K1.

도 8f는 세포주가 Lec2인 경우에 YCI-Ad-VSVG의 증가된 유전자 전달효율을 정량화한 그래프이다.8F is a graph quantifying the increased gene transfer efficiency of YCI-Ad-VSVG when the cell line is Lec2.

도 8g는 세포주가 MCF-7인 경우에 YCI-Ad-VSVG의 증가된 유전자 전달효율을 정량화한 그래프이다.8G is a graph quantifying the increased gene transfer efficiency of YCI-Ad-VSVG when the cell line is MCF-7.

도 8h는 세포주가 Pro 5인 경우에 YCI-Ad-VSVG의 증가된 유전자 전달효율을 정량화한 그래프이다.8h is a graph quantifying the increased gene transfer efficiency of YCI-Ad-VSVG when the cell line is Pro 5.

도 9a는 세포주 Hep3B에 대한 YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양특이 살상능력을 보여주는 세포 병변 분석 사진이다 (여기서, 1 = △E1, 2 = YKL-1, 3 = YCI-Ad-VSVG).FIG. 9A is a photograph of cell lesion analysis showing increased tumor specific killing capacity of YCI-Ad-VSVG against cell line Hep3B (wherein 1 = ΔE1, 2 = YKL-1, 3 = YCI-Ad-VSVG).

도 9b는 세포주 C33A에 대한 YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양특이 살상능력을 보여주는 세포 병변 분석 사진이다 (여기서, 1 = △E1, 2 = YKL-1, 3 = YCI-Ad-VSVG).9B is a photograph of cell lesion analysis showing increased tumor specific killing capacity of YCI-Ad-VSVG against cell line C33A (where 1 = ΔE1, 2 = YKL-1, 3 = YCI-Ad-VSVG).

도 9c는 세포주 U343에 대한 YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양특이 살상능력을 보여주는 세포 병변 분석 사진이다 (여기서, 1 = △E1, 2 = YKL-1, 3 = YCI-Ad-VSVG).9C is a photograph of cell lesion analysis showing increased tumor specific killing capacity of YCI-Ad-VSVG against cell line U343 (where 1 = ΔE1, 2 = YKL-1, 3 = YCI-Ad-VSVG).

도 9d는 세포주 U87MGMG에 대한 YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양특이 살상능력을 보여주는 세포 병변 분석 사진이다 (여기서, 1 = △E1, 2 = YKL-1, 3 = YCI-Ad-VSVG).FIG. 9D is a photograph of cell lesion analysis showing increased tumor specific killing capacity of YCI-Ad-VSVG against cell line U87MGMG (where 1 = ΔE1, 2 = YKL-1, 3 = YCI-Ad-VSVG).

도 9e는 세포주 Hep1에 대한 YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양특이 살상능력을 보여주는 세포 병변 분석 사진이다 (여기서, 1 = △E1, 2 = YKL-1, 3 = YCI-Ad-VSVG).FIG. 9E is a photograph of cell lesion analysis showing increased tumor specific killing capacity of YCI-Ad-VSVG against cell line Hep1 (where 1 = ΔE1, 2 = YKL-1, 3 = YCI-Ad-VSVG).

도 9f는 세포주 U251-N에 대한 YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양특이 살상능력을 보여주는 세포 병변 분석 사진이다 (여기서, 1 = △E1, 2 = YKL-1, 3 = YCI-Ad-VSVG).9F is a photograph of cell lesion analysis showing increased tumor specific killing capacity of YCI-Ad-VSVG against cell line U251-N, where 1 = ΔE1, 2 = YKL-1, 3 = YCI-Ad-VSVG .

도 9g는 세포주 HepG2에 대한 YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양특이 살상능력을 보여주는 세포 병변 분석 사진이다 (여기서, 1 = △E1, 2 = YKL-1, 3 = YCI-Ad-VSVG).9G is a photograph of cell lesion analysis showing increased tumor specific killing capacity of YCI-Ad-VSVG against cell line HepG2 (where 1 = ΔE1, 2 = YKL-1, 3 = YCI-Ad-VSVG).

도 9h는 세포주 MCF-7에 대한 YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양특이 살상능력을 보여주는 세포 병변 분석 사진이다 (여기서, 1 = △E1, 2 = YKL-1, 3 = YCI-Ad-VSVG).9H is a photograph of cell lesion analysis showing increased tumor specific killing capacity of YCI-Ad-VSVG against cell line MCF-7 (where 1 = ΔE1, 2 = YKL-1, 3 = YCI-Ad-VSVG) .

본 발명자들은 종양 세포를 선택적으로 제거할 수 있는 종양 특이증식 및 살상능 효과가 증가한 아데노바이러스, 특히 세포내로의 형질도입률이 크게 증가된 아데노바이러스를 개발하고자 하였다. 결국, 아데노바이러스에 VSV-G 에피토프를 포함한 단백질을 연결하여 제조된 재조합 아데노바이러스가 종양 세포를 보다 개선된 효율로 살상하고, 더욱이 CAR 수용체에 의존하지 않고 종양 세포를 살상할 수 있음을 확인하였다.The inventors of the present invention have attempted to develop adenoviruses capable of selectively removing tumor cells and adenoviruses having increased killing effects, particularly adenoviruses having a significantly increased transduction rate into cells. As a result, it was confirmed that recombinant adenoviruses prepared by linking proteins including VSV-G epitopes to adenoviruses could kill tumor cells with improved efficiency and further kill tumor cells without depending on the CAR receptor.

따라서, 본 발명은 아데노바이러스 및 이에 연결된 베지큘라 스토마티티스 바이러스로부터 유래된 VSV-G 에피토프를 포함한 단백질로 구성됨을 특징으로 하여 개선된 종양 살상 효과를 갖는 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다.Accordingly, the present invention relates to a recombinant adenovirus having an improved tumor killing effect, characterized by consisting of a protein comprising VSV-G epitopes derived from adenoviruses and associated Vesicular stomatitis viruses.

본 명세서에서, 용어 "VSV-G 에피토프를 포함한 단백질"은 숙주 세포, 예컨대 사람 세포의 세포막에 있는 인지질, 특히 포스파티딜세린과 결합하는데 직접적으로 관여하는 베지큘라 스토마티티스 바이러스의 막단백질의 일부분에 해당하는 에피토프 자체, 이러한 에피토프를 포함한 단백질 및 이로부터 유래된 모든 유도체를 포함한다. VSV-G 에피토프를 포함한 단백질이 결합하는 포스파티틸세린은 사람 세포의 세포막에 널리 다량으로 발현되어 존재하는 것이다.As used herein, the term "protein comprising a VSV-G epitope" corresponds to a portion of the membrane protein of the bacterium stomatitis virus that is directly involved in binding to phospholipids, in particular phosphatidylserine, on the cell membranes of host cells, such as human cells. Epitope itself, and proteins including such epitopes and all derivatives derived therefrom. Phosphatidylserine, to which proteins including VSV-G epitopes bind, is widely expressed in the cell membranes of human cells.

VSV-G 에피토프는 다양한 숙주 세포에로의 감염을 가능하게 하는 장점을 제공한다 (Ory, D. S., et al., Proc. Natl. Sci. USA, 93:11400-11406, 1996). 이에 본 발명자들은 VSV-G 에피토프를 포함한 단백질을 아데노바이러스에 삽입하여 다양한 암 세포주로의 감염율을 증가시켜 재조합 아데노바이러스를 이용한 유전자 치료 효과를 향상시키고자 하였다. 한 양태로서, 본 발명자들은 VSV-G 에피토프를 아데노바이러스의 파이버에 결합시킴으로써 상기 목적을 달성하였다(참조: 도 1 및 도 2).VSV-G epitopes offer the advantage of enabling infection with a variety of host cells (Ory, D. S., et al., Proc. Natl. Sci. USA, 93: 11400-11406, 1996). Accordingly, the present inventors have attempted to improve the gene therapy effect using recombinant adenovirus by inserting a protein including VSV-G epitope into adenovirus to increase the infection rate to various cancer cell lines. In one aspect, the inventors achieved this goal by binding VSV-G epitopes to the fibers of adenoviruses (see FIGS. 1 and 2).

따라서, 본 발명은 한 특정 양태로서 아데노바이러스 및 이에 연결된 베지큘라 스토마티티스 바이러스로부터 유래된 VSV-G 에피토프로 구성됨을 특징으로 하여 개선된 종양 살상 효과를 갖는 재조합 아데노바이러스를 제공한다.Accordingly, the present invention provides a recombinant adenovirus having improved tumor killing effect, characterized in that, in one particular embodiment, it consists of VSV-G epitopes derived from adenoviruses and Vesicular stomatitis viruses linked thereto.

본 발명의 재조합 아데노바이러스에 이용되는 아데노바이러스는 다양한 타입, 예컨대, 타입 1, 타입 2, 타입 3, 타입 4 및 타입 5 등이 이용될 수 있으나, 가장 바람직하게는 타입 5이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 아데노바이러스는 YKL-1 (KFCC-11099) 또는 YKC-1 (KFCC-11280)이고, 가장 바람직하게는 YKL-1이다. 상기 아데노바이러스는 종양에 대한 살상능을 개선하기 위하여, 본 발명자들에 의해 개발된 것이다.Adenoviruses used in the recombinant adenoviruses of the present invention may be of various types, such as type 1, type 2, type 3, type 4, and type 5, but are most preferably type 5. According to a preferred embodiment of the present invention, the adenovirus is YKL-1 (KFCC-11099) or YKC-1 (KFCC-11280), most preferably YKL-1. The adenovirus was developed by the present inventors in order to improve the ability to kill tumors.

한편, 아데노바이러스에 외래 리간드를 삽입하는 위치로는 크게 파이버 놉 (fiber knob)의 HI 루프, 펜톤 베이스 (penton base) 및 파이버 말단 등이 많이 이용된다 (Kirby, I. et al., J. Virol., 74:2804-2813, 2000). 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 VSV-G 에피토프를 포함한 단백질이 연결되는 아데노바이러스의 파이버는 놉 부위이고, 보다 바람직하게는 파이버 말단 부위이다.On the other hand, the position of inserting the foreign ligand into the adenovirus is largely used, such as the HI loop of the fiber knob (penton base) and the fiber end (Kirby, I. et al., J. Virol) , 74: 2804-2813, 2000). Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the fiber of the adenovirus to which the protein including the VSV-G epitope is linked is a knob portion, more preferably a fiber terminal portion.

상기 파이버 말단은 아데노바이러스 몸체로부터 가장 멀리 이격된 부분으로서 아데노바이러스 세포막에 존재하는 CAR 수용체와 결합하는데 실질적으로 관여하는 부분이다. 즉, 파이버 말단 부위는 VSV-G 에피토프가 특이적으로 인지하고 결합할 수 있는 세포막에 존재하는 포스파티딜세린과의 결합이 가장 용이한 부분이다.The fiber end is the part farthest from the adenovirus body and is the part that is substantially involved in binding to the CAR receptor present in the adenovirus cell membrane. In other words, the fiber terminal portion is the portion that is most easily bound to phosphatidylserine present in the cell membrane to which the VSV-G epitope can specifically recognize and bind.

파이버 말단 부위에 VSV-G 에피토프를 연결하는 방법은 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법에 의해 실시될 수 있으며, 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면 실시예 1과 같이 제조된다 (참조: 도 3 및 도 4).The method of linking the VSV-G epitope to the fiber terminal portion can be carried out by various methods conventionally practiced in the art, and is prepared as in Example 1 according to a specific embodiment of the present invention (see FIG. 3). And FIG. 4).

본 발명의 구현예에 따르면, 파이버의 말단에 결합하는 상기 VSV-G 에피토프는 숙주 세포의 세포막에 있는 인지질, 특히 포스파디딜세린과 결합하는 데 직접적으로 관여하는 베지큘라 스토마티티스 바이러스의 막단백질인 VSV-G의 일부분이면 어떠한 것도 가능하다. 보다 바람직하게는, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 에피토프이다.According to an embodiment of the invention, the VSV-G epitope that binds to the end of the fiber is a membrane protein of Vesicles stomatitis virus that is directly involved in binding to phospholipids, particularly phosphadidylserine, in the cell membrane of the host cell. Any part of the VSV-G that is available is possible. More preferably, they are epitopes having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

한편, VSV-G 에피토프를 파이버의 말단에 삽입할 때 적합한 공간적 배치를 할 수 있도록, 상기 아데노바이러스의 파이버 및 VSV-G 에피토프 사이에 링커가 연결되어 있는 것이 바람직하다. 상기 링커는 대체적으로 아미노산 5 ~ 15 개가 바람직하고, R-기의 크기가 작은 아미노산, 예컨대, 글리신 및 알라닌 등이 적합하다. 따라서, 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 링커는 1개 이상의 글리신으로 구성되는 것이다.On the other hand, it is preferable that a linker is connected between the fiber of the adenovirus and the VSV-G epitope so that a suitable spatial arrangement can be made when inserting the VSV-G epitope at the end of the fiber. The linker is generally preferably 5 to 15 amino acids, and amino acids having a small R-group, such as glycine and alanine, are suitable. Thus, according to a more preferred embodiment of the invention, the linker is composed of one or more glycines.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 YCI-Ad-VSVG (KFCC-11215)이다.According to the most preferred embodiment of the present invention, the recombinant adenovirus of the present invention is YCI-Ad-VSVG (KFCC-11215).

본 발명의 재조합 아데노바이러스는 다양한 종양 세포, 예컨대 간암 세포, 자궁암 세포, 유방암 세포, 뇌종양 세포 및 폐암 세포 등에 대하여 살상능을 갖을 뿐만 아니라, 살상 효율도 다른 종래의 재조합 아데노바이러스 보다 훨씬 월등하다.The recombinant adenovirus of the present invention not only has the ability to kill various tumor cells, such as liver cancer cells, uterine cancer cells, breast cancer cells, brain tumor cells and lung cancer cells, etc., but also the killing efficiency is far superior to other conventional recombinant adenoviruses.

다른 관점으로서, 본 발명은 (a) 아데노바이러스 및 이에 연결된 베지큘라 스토마티티스 바이러스로부터 유래된 VSV-G 에피토프를 포함한 단백질로 구성된 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention provides a therapeutically effective amount of a recombinant adenovirus consisting of (a) a protein comprising a VSV-G epitope derived from an adenovirus and a Vesicular stomatitis virus linked thereto, and (b) a pharmaceutically acceptable carrier. It relates to a pharmaceutical anti-tumor composition comprising a.

한 가지 특정 양태로서, 본 발명은 (a) 아데노바이러스 및 이에 연결된 베지큘라 스토마티티스 바이러스로부터 유래된 VSV-G 에피토프로 구성된 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물에 관한 것이다.In one specific embodiment, the present invention provides a therapeutically effective amount of a recombinant adenovirus consisting of (a) adenovirus and a VSV-G epitope derived from Vesicular stomatitis virus linked thereto and (b) a pharmaceutically acceptable carrier. It relates to a pharmaceutical anti-tumor composition comprising.

본 발명의 조성물에 포함되는 재조합 아데노바이러스는 상술한 바와 같이, 다양한 종양 세포에 대하여 살상 효능을 나타내므로, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암 등의 치료에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "치료"는 (ⅰ) 종양 세포 형성의 예방; (ⅱ)종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 억제; 및 (ⅲ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 "치료학적 유효량"은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.Since the recombinant adenovirus included in the composition of the present invention exhibits killing efficacy against various tumor cells as described above, the pharmaceutical composition of the present invention can be used for various diseases or diseases related to tumors such as gastric cancer, lung cancer, breast cancer, ovary Cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, cervical cancer and the like. As used herein, the term "treatment" refers to (i) prevention of tumor cell formation; (Ii) inhibition of diseases or disorders associated with tumors following removal of tumor cells; And (iii) alleviation of a disease or disorder associated with a tumor following removal of tumor cells. Thus, the term "therapeutically effective amount" as used herein means an amount sufficient to achieve the above pharmacological effect.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.Pharmaceutically acceptable carriers included in the compositions of the present invention are those commonly used in the formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, but are not limited thereto. no. In addition to the above components, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 상기 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 YCI-Ad-VSVG (KFCC-11215)이다.According to the most preferred embodiment of the present invention, the recombinant adenovirus is adenovirus YCI-Ad-VSVG (KFCC-11215).

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결정암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is preferably parenteral, and may be administered using, for example, intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, or topical administration. Intraperitoneal administration in ovarian cancer and in the portal vein in liver cancer can be administered by infusion method, in the case of breast cancer can be administered by direct injection into the tumor mass, in the case of crystalline cancer by direct injection into the enema It may be administered, and in the case of bladder cancer may be administered by injection directly into the catheter.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 5 ×1010 - 5 ×1011 pfu/㎖의 재조합 아데노바이러스를 포함하며, 통상적으로 재조합 아데노바이러스는 1×1010 pfu를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사한다.Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the invention vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex of the patient, degree of disease symptom, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction. In general, the skilled practitioner can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment. In general, the pharmaceutical composition of the present invention comprises 5 × 10 10 -5 × 10 11 pfu / ml of recombinant adenovirus, and typically, recombinant adenovirus is injected 1 × 10 10 pfu once every two days for two weeks.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention are prepared in unit dosage form by being formulated with pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients, according to methods which may be readily practiced by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporating into a multi-dose container. In this case, the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 프로카르바진 (procarbazine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란 (melphalan), 클로라부실 (chlorambucil), 비술판 (bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리코마이신 (plicomycin), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide), 탁목시펜 (tamoxifen), 택솔 (taxol), 트랜스플라티눔 (transplatinum), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 빈크리스틴 (vincristin), 빈블라스틴 (vinblastin) 및 메토트렉세이트 (methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.The pharmaceutical composition of the present invention may be used as a single therapy, but may also be used in combination with other conventional chemotherapy or radiation therapy, and when the combination therapy is performed, cancer treatment may be more effectively performed. Chemotherapeutic agents that can be used with the compositions of the present invention are cisplatin, carboplatin, procarbazine, mechlorethamine, cyclophosphamide, phospho Ifosfamide, melphalan, chlorambucil, bisulfan, nitrosourea, diactinomycin, daunorubicin, doxorubicin , Bleomycin, plicomycin, mitomycin, etoposide, tamoxifen, taxol, transplatinum, 5-fluoro 5-urauracil, vincristin, vinblastin, methotrexate and the like. Radiation therapy that can be used with the composition of the present invention is X-ray irradiation, γ-ray irradiation, and the like.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention to those skilled in the art. Will be self explanatory.

실시예 1: 재조합 아데노바이러스 YCI-Ad-VSVG의 제조 및 확인Example 1 Preparation and Identification of Recombinant Adenovirus YCI-Ad-VSVG

실시예 1-1: 재조합 아데노바이러스 YCI-Ad-VSVG의 제조Example 1-1 Preparation of Recombinant Adenovirus YCI-Ad-VSVG

아데노바이러스 Ad5의 E1 영역 중 E1B의 55kDa 단백질을 코딩하는 유전자가 결실된 YKL-1 아데노바이러스 (KFCC-11099)에 베지큘라 스토마티티스 바이러스의 막단백질을 코딩하는 유전자중 19개의 아미노산으로 이루어진 VSV-G 단백질의 에피토프를 삽입시킨 형태의 재표적화 아데노바이러스를 다음과 같이 제작하였다 (참조: 도 1, 도 2, 도 3 및 도 4).A VSV- consisting of 19 amino acids in the gene encoding the membrane protein of the bacterium stomatitis virus in the YKL-1 adenovirus (KFCC-11099), which lacks the gene encoding the 55 kDa protein of E1B in the E1 region of adenovirus Ad5. Retargeting adenoviruses in the form of inserting epitopes of G proteins were constructed as follows (see FIGS. 1, 2, 3 and 4).

우선, 아데노바이러스의 셔틀벡터를 제작하였다. 제작방법은SacⅡ 및KpnI으로 처리한 pBluescript SK 플라스미드 (Stratagene, 캐나다)에 아데노바이러스 타입 5의 파이버 부위를 포함하는 DNA 절편 5543 bp을 (pXC1, Microbix, 캐나다)SacⅡ 및KpnI으로 처리하여 서브클로닝 하여 pSK[5543] 재조합 벡터를 제조하였다.First, a shuttle vector of adenovirus was produced. The production method is by treatment with Sac Ⅱ and Kpn pBluescript SK plasmid treated with I (Stratagene, Canada), a DNA fragment 5543 bp containing the fiber portion of the adenovirus type 5 (pXC1, Microbix, Canada) in the Sac Ⅱ and Kpn I Subcloning produced the pSK [5543] recombinant vector.

이어, 파이버의 3' 말단 부위만을 다시 클로닝하기 위하여 pSK[5543]를 주형 DNA로 하고, 하기의 염기서열을 가지는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다:Subsequently, pSK [5543] was used as template DNA to clone back only the 3 'end portion of the fiber, and PCR was performed using a primer having the following nucleotide sequence:

센스: 5'-GGCCTTTACTTGTTTACAGC-3' (서열번호 1)Sense: 5'-GGCCTTTACTTGTTTACAGC-3 '(SEQ ID NO: 1)

안티센스: 5'-GGGGAGCTCGGATCCTCCTTCTTGGGCAATGTATG-3' (서열번호 2).Antisense: 5'-GGGGAGCTCGGATCCTCCTTCTTGGGCAATGTATG-3 '(SEQ ID NO: 2).

상기 안티센스 프라이머는 파이버의 종결 코돈 (TTA)을 글리신을 코딩하는 염기 서열 (TCC)로 치환되도록 특별히 제작하여 파이버 말단에 있는 종결 코돈을 제거하였으며, 차후에 연속적으로 실시되는 클로닝에 필요한BamHI 및SacI의 인식 부위를 삽입시켰다.The antisense primer was specifically designed to replace the terminating codon (TTA) of the fiber with a nucleotide sequence (TCC) encoding glycine to remove the terminating codon at the end of the fiber, and subsequently required Bam HI and Sac I for subsequent cloning. The recognition site of was inserted.

상기 PCR은 주형 DNA 100 ng 및 프라이머 10 ng을 사용하여 94℃에서 2분간 예열 단계를 거친후, 94℃ 1분, 55℃ 1분 및 72℃ 1분을 1 주기로 하여 총 30회 반복 수행한 후, 72℃에서 10분간 최종 신장반응을 수행하여 종결하였다. PCR로 얻어진 약 850 bp의 DNA 생성물을HindⅢ 및SacI으로 절단하고 이것을HindⅢ 및SacI으로 절단한 클로닝 벡터인 pSP72 (Promega, 미합중국)에 삽입시켜 pSP72[805]를 제작하였다.After the PCR was subjected to a preheating step at 94 ° C. for 2 minutes using 100 ng of template DNA and 10 ng of primer, a total of 30 repetitions were performed at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute. The reaction was terminated by performing a final stretch reaction at 72 ° C. for 10 minutes. Cutting the DNA product of about 850 bp obtained by PCR with Hin dⅢ and Sac I, and by inserting it into the Sac I and Hin dⅢ a cloning vector, pSP72 (Promega, USA) was prepared by cutting the pSP72 [805].

한편, 베지큘라 스토마티티스 바이러스가 세포내로 들어가는데 관여하는 VSG-G 막단백질의 에피토프로 알려진 아미노산 서열 118번부터 136번까지의 19개의아미노산 및 이의 염기서열은 다음과 같다:On the other hand, the amino acid sequence of amino acids sequence 118 to 136 known as epitopes of the VSG-G membrane protein involved in the cellular entry into the bacterium Stomatitis virus and the base sequence is as follows:

GTWLNPGFPPQSCGYATVT (서열번호 3); 및GTWLNPGFPPQSCGYATVT (SEQ ID NO: 3); And

5'-GGA/ACT/TGG/CTG/AAT/CCA/GGC/TTC/CCT/CCT/CAA/AGT/TGT/GGA/TAT/GCA/5'-GGA / ACT / TGG / CTG / AAT / CCA / GGC / TTC / CCT / CCT / CAA / AGT / TGT / GGA / TAT / GCA /

ACT/GTG/ACG-3' (서열번호 4).ACT / GTG / ACG-3 '(SEQ ID NO: 4).

상기 에피토프를 아데노바이러스 파이버의 3'-말단에 삽입할 때, 적당한 공간적 배치를 할 수 있도록 글리신 아미노산이 8개가 연속적으로 발현되는 연결 고리를 부착하였다.When the epitope was inserted at the 3'-end of the adenovirus fiber, a linking ring of eight consecutive glycine amino acids was attached to allow proper spatial arrangement.

이러한 형태의 DNA 단편을 상기 pSP72[805] 안으로 삽입시키기 위한 전 단계로서, 상기한 연결 고리를 포함한 VSV-G 에피토프의 서로 상보적인 5' 쪽 및 3'쪽 올리고 뉴클레오티드를 제작하였다. 이때 5' 쪽에는BamHI 제한효소 인식부위를 삽입하였고 3' 쪽에는SacI 인식부위를 삽입시켜서 다음의 서열을 갖도록 하였다:As a preliminary step for inserting this type of DNA fragment into the pSP72 [805], oligonucleotides 5 'and 3' complementary to each other of the VSV-G epitope including the linkage described above were prepared. The Bam HI restriction enzyme recognition site was inserted on the 5 'side and the Sac I recognition site was inserted on the 3' side to have the following sequence:

5'-GA/TCC/GGC/GGG/GGC/GGT/GGA/GGA/GGG/GGT/GGA/ACT/TGG/CTG/AAT/CCA/5'-GA / TCC / GGC / GGG / GGC / GGT / GGA / GGA / GGG / GGT / GGA / ACT / TGG / CTG / AAT / CCA /

GGC/TTC/CCT/CCT/CAA/AGT/TGT/GGA/TAT/GCA/ACT/GTG/ACG/TGA/GCT-3'(서열번호 5).GGC / TTC / CCT / CCT / CAA / AGT / TGT / GGA / TAT / GCA / ACT / GTG / ACG / TGA / GCT-3 '(SEQ ID NO: 5).

상기 올리고머와 상보적인 염기 서열을 가지는 올리고머를 DNA 합성기로 합성한 다음, 상기 상보적인 올리고머를 37℃에서 5분간 방치하여 서로 혼성화 되도록 하였다. 또한, 길이 27 mer에 해당하는 프라이머를 제작하였는데, 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머는 하기의 염기 서열을 갖는다:An oligomer having a base sequence complementary to the oligomer was synthesized by a DNA synthesizer, and the complementary oligomer was allowed to hybridize with each other by standing at 37 ° C. for 5 minutes. In addition, primers corresponding to a length of 27 mer were prepared, wherein the sense primers and antisense primers have the following base sequences:

센스: 5'-GAA/GGG/GGA/TCC/GGC/GGG/GGC/GGT/GGA-3' (서열번호 6)Sense: 5'-GAA / GGG / GGA / TCC / GGC / GGG / GGC / GGT / GGA-3 '(SEQ ID NO: 6)

안티센스: 5'-CCC/GAG/CTC/ACG/TCA/CAG/TTG/CAT/ATC-3' (서열번호 7).Antisense: 5'-CCC / GAG / CTC / ACG / TCA / CAG / TTG / CAT / ATC-3 '(SEQ ID NO: 7).

상기 프라이머 10 ng 및 상기 혼성화된 올리고머 100 ng을 주형 DNA로 이용하여 PCR을 상기한 조건대로 다시 수행하였다. PCR 생성물을BamHI과SacI으로 절단한 다음, 103 bp에 해당하는 DNA 절편을BamHI과SacI으로 절단된 상기 pSP72[805]에 삽입시켜 클로닝 벡터인 pSP72[805+103bp]를 제작하였다.PCR was again performed under the above conditions using 10 ng of the primer and 100 ng of the hybridized oligomer as template DNA. The PCR product was digested with Bam HI and Sac I, and then a DNA fragment corresponding to 103 bp was inserted into the pSP72 [805] digested with Bam HI and Sac I to prepare a cloning vector pSP72 [805 + 103 bp].

상기 pSP72[805+103bp]를HindⅢ 및EcoRI으로 절단하여 VSV-G 에피토프가 삽입된 아데노바이러스의 파이버 부위 [805+103bp]를 얻었다. 한편, 아데노바이러스의 파이버 부위를 포함하고 있는 셔틀벡터인 상기 pSK[5543]을HindⅢ 및 MfeI으로 절단하여 약 833 bp에 해당하는 DNA 절편을 제거한 다음, 상기한 [805+103bp]를 삽입시켜 아데노바이러스 셔틀벡터인 pSK[5510+103 bp]를 수득하였다.The pSP72 [805 + 103 bp] was digested with Hin dIII and Eco RI to obtain a fiber region [805 + 103 bp] of adenovirus into which the VSV-G epitope was inserted. Meanwhile, the pSK [5543], which is a shuttle vector containing a fiber portion of adenovirus, was cut with Hin dIII and MfeI to remove DNA fragments corresponding to about 833 bp, and then inserted [805 + 103 bp] to insert adenosine. Virus shuttle vector pSK [5510 + 103 bp] was obtained.

플라스미드 pYKL을SpeI 제한효소로 처리하여 단일 가닥으로 만든 후 이를 셔틀벡터인 상기 pSK[5510+103 bp]와 함께 대장균 BJ5183에 형질전환시켜 유전자 상동 재조합을 유도하였다. 형질전환된 대장균을 하룻 동안 배양하여 이로부터 DNA를 수득하였으며, 상기한 27 mer 길이의 프라이머를 사용하여 PCR 수행한 후 상기한 103 bp DNA 절편이 생성되는지를 확인하였다 (참조: 도 6).Plasmid pYKL was treated with Spe I restriction enzymes to make single strands, which were then transformed into E. coli BJ5183 along with the shuttle vector pSK [5510 + 103 bp] to induce homologous recombination. The transformed Escherichia coli was cultured for one day to obtain DNA therefrom, and PCR was performed using the 27 mer length primers described above to confirm whether the 103 bp DNA fragment was produced (see FIG. 6).

103 bp DNA 절편이 삽입된 것으로 확인된 DNA는 DNA 수득량이 우수한 DH5α(Gibco, 미합중국)에 다시 형질전환시켜 DNA를 증폭한 후PacI을 처리하였을 때 2 kb 밴드가 나타나는지의 유무와 HindⅢ 처리 후 아가로오스 겔 전기영동을 통하여 선택하였다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 "YCI-Ad-VSVG"라 명명하였다.DNA identified as having inserted a 103 bp DNA fragment was transformed into DH5α (Gibco, United States), which has a high yield of DNA, to amplify DNA, and then treated with Pac I. Agarose gel electrophoresis was selected. The recombinant adenovirus plasmid thus obtained was named "YCI-Ad-VSVG".

상기 pYCI-Ad-VSVG를PacI으로 처리하여 단일가닥으로 만든 후 293 세포주 (Microbix, 캐나다국)에 트랜스펙션시켜 바이러스를 생산하였으며 생산된 바이러스에서 103 bp의 VSV-G 리간드가 만들어지는지를 바이러스 지놈 DNA를 뽑아 PCR을 수행하여 확인하였다 (참조: 도 6). 이를 "YCI-Ad-VSVG" 바이러스라 명명하고, 2000년 9월 19일자로 한국 미생물 보존센터에 기탁하였다 (수탁 번호 KFCC-11215).The pYCI-Ad-VSVG was treated with Pac I to make a single strand, and then transfected into a 293 cell line (Microbix, Canada) to produce a virus, and whether the virus produced 103 bp of VSV-G ligand from the virus. Genome DNA was extracted and confirmed by PCR (see FIG. 6). This was named "YCI-Ad-VSVG" virus and was deposited on September 19, 2000 to the Korea Microbial Conservation Center (Accession No. KFCC-11215).

또한, VSV-G 에피토프에 의한 유전자 형질도입율의 증가 유무를 알 수 있는 표식 바이러스로서 LacZ를 발현하는 증식 불능 아데노바이러스는 다음과 같이 제작하였다. 먼저, pcDNAhygroLacZ 플라스미드 (Invitrogen, 미합중국)를SpeI과XbaI으로 절단하여 LacZ 단편을 얻은 뒤 이것을XbaI으로 절단된 아데노바이러스 셔틀벡터인 pCA14 (Microbix, 캐나다국)에 삽입시켜 pCA14LacZ 플라스미드를 제작하였다. 아데노바이러스 벡터로서 E1과 E3가 소실된 dl324 (Heider, H. et al.,Biotechniques, 28(2):260-265, 268-270(2000))를BstBI으로 절단한 후 상기한 유전자 상동재조합 방법으로 dl324/pCA14LacZ를 얻었다. 다음으로 dl324/pCA14/LacZ 바이러스에 VSV-G 에피토프를 파이버의 3' 말단에 삽입하기 위하여, VSV-G 에피토프가 삽입되어 있는 셔틀벡터인 상기 pSK[5510+103bp]를SacⅡ와KpnI으로 절단한 다음,SpeI으로 절단한 dl324/pCA14LacZ와 함께 대장균 BJ5183에 형질전환시켜 유전자 상동 재조합을 유도하여 바이러스를 제조하여 "dl324-LacZ-VSVG"로 명명하였다. 각각의 재조합 아데노바이러스는 293 세포주에서 증폭시킨 다음, 한계 희석 방법 또는 광학 밀도 분석방법을 이용하여 바이러스의 역가를 결정하였다.In addition, a non-proliferative adenovirus expressing LacZ as a marker virus showing an increase in gene transduction rate by VSV-G epitope was produced as follows. First, the pcDNAhygroLacZ plasmid (Invitrogen, USA) was cut with Spe I and Xba I to obtain a LacZ fragment, which was then inserted into pCA14 (Microbix, Canada), an adenovirus shuttle vector cut with Xba I, to prepare a pCA14LacZ plasmid. Adenoviral vectors as E1 and E3 is missing dl324 (Heider, H. et al, Biotechniques, 28 (2):. 260-265, 268-270 (2000)) was cut with Bst BI to the gene homologous recombination The method gave dl324 / pCA14LacZ. Then cut with dl324 / pCA14 / LacZ to the VSV-G epitope on a virus to insert the 3 'end of the fiber, the VSV-G epitope is inserted into the shuttle vector of the pSK [5510 + 103bp] in the Sac Ⅱ and Kpn I Next, E. coli BJ5183 was transformed with dl324 / pCA14LacZ digested with Spe I to induce homologous recombination to produce a virus, which was named "dl324-LacZ-VSVG." Each recombinant adenovirus was amplified in 293 cell lines and then titer of virus was determined using either limit dilution or optical density analysis.

실시예 1-2:재조합 아데노바이러스 YCI-Ad-VSVG의 E1 부위 유전자 구성 분석 Example 1-2 E1 Site Gene Composition Analysis of Recombinant Adenovirus YCI-Ad-VSVG

인체 간암 세포주인 Hep3B (ATCC, 미합중국)에 Ad-ΔE1 (E1 영역 전체가 결손된 아데노바이러스), YKL-1, YCI-Ad-VSVG 및 야생형 아데노바이러스인 XC1을 MOI (Multiplicity of infection) 10으로 각각 감염시키고, 2일이 경과한 다음 지놈 분리 키트 (Qiagen, 미합중국)로 바이러스 지놈을 회수하였다. 이어, 분리한 바이러스 지놈을 주형으로 하고, E1 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이용된 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머는 다음의 서열을 갖는다:Hep3B (ATCC, United States), a human liver cancer cell line, has Ad-ΔE1 (adenovirus lacking the entire E1 region), YKL-1, YCI-Ad-VSVG, and XC1, a wild-type adenovirus, as a multiplicity of infection (MOI) 10, respectively. After infection, two days later, the virus genome was recovered by genome isolation kit (Qiagen, USA). Subsequently, the isolated virus genome was used as a template, and PCR was performed using a primer set capable of amplifying the E1 gene. The sense primers and antisense primers used have the following sequence:

센스: 5'-TTTGTGTTACTCATAGCGCGT-3' (서열번호 8)Sense: 5'-TTTGTGTTACTCATAGCGCGT-3 '(SEQ ID NO: 8)

안티센스: 5'-ATTCTTTCCCACCCTTAAGCC-3' (서열번호 9).Antisense: 5'-ATTCTTTCCCACCCTTAAGCC-3 '(SEQ ID NO: 9).

상기 각각의 PCR 생성물들을 아가로즈 겔에 로딩하여 전기 영동하였다 (참조: 도 5). 도 5에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 YCI-Ad-VSVG 바이러스는 YKL-1 바이러스와 동일한 E1 유전자로 구성되어 있으므로 E1B 55kD 유전자의 선택적 소실로 약 2 kb 크기의 PCR 산물을 생성하였으며, 이에 반하여 야생형 아데노바이러스는 E1 부위의 E1A, E1B 19kD, 그리고 E1B 55kD 유전자들이 모두 내재하므로 약 3.2 kb PCR 산물을 확인할 수 있었다.Each of the PCR products was loaded onto an agarose gel and electrophoresed (see FIG. 5). As can be seen in Figure 5, since the YCI-Ad-VSVG virus of the present invention is composed of the same E1 gene as YKL-1 virus, the PCR product of about 2 kb size was generated by selective loss of E1B 55kD gene, whereas wild type Adenovirus was found to be about 3.2 kb PCR product because all of the E1A, E1B 19kD, and E1B 55kD gene in the E1 region is inherent.

실시예 1-3: 재조합 아데노바이러스 YCI-Ad-VSVG의 파이버 부위에 VSV-G 에피토프 삽입 여부 확인Example 1-3 Confirmation of VSV-G Epitope Insertion into the Fiber Site of Recombinant Adenovirus YCI-Ad-VSVG

본 발명의 재조합 아데노바이러스 YCI-Ad-VSVG의 파이버 3' 말단에 VSV-G 에피토프가 삽입되었는지를 확인하기 위하여, VSV-G 에피토프를 증폭할 수 있도록 하기의 염기서열을 가지는 프라이머와 실시예 1-2에서 이용된 바이러스 지놈들을(Ad-ΔE1, YKL-1, 및 YCI-Ad-VSVG) 주형으로 PCR을 상기한 조건대로 수행하였다:In order to confirm whether the VSV-G epitope is inserted into the fiber 3 'end of the recombinant adenovirus YCI-Ad-VSVG of the present invention, Example 1- and a primer having the following nucleotide sequence to amplify the VSV-G epitope Viral genomes used in 2 (Ad-ΔE1, YKL-1, and YCI-Ad-VSVG) templates were performed with PCR as described above:

센스: 5'-GAA/GGG/GGA/TCC/GGC/GGG/GGC/GGT/GGA-3' (서열번호 10)Sense: 5'-GAA / GGG / GGA / TCC / GGC / GGG / GGC / GGT / GGA-3 '(SEQ ID NO: 10)

안티센스: 5'-CCC/GAG/CTC/ACG/TCA/CAG/TTG/CAT/ATC-3' (서열번호 11).Antisense: 5'-CCC / GAG / CTC / ACG / TCA / CAG / TTG / CAT / ATC-3 '(SEQ ID NO: 11).

VSV-G 에피토프 PCR 산물을 생성할 수 있는 양성 대조군으로서는 VSV-G 에피토프가 8개의 글리신 링커로 연결된 103 bp를 포함하는 클로닝 벡터인 pSP72[805+103bp]를 이용하였다.As a positive control capable of producing VSV-G epitope PCR products, pSP72 [805 + 103 bp], a cloning vector containing 103 bp of VSV-G epitopes linked by eight glycine linkers, was used.

상기 각각의 PCR 생성물들을 아가로즈 겔에 로딩하여 전기 영동하였다 (참조: 도 6). 도 6에서 확인할 수 있듯이, 아데노바이러스의 파이버 부위가 정상인 경우의 YKL-1과 Ad-ΔE1의 경우는, PCR 산물이 전혀 생성되지 못한 반면, 아데노바이러스의 파이버 3' 말단에 VSV-G 에피토프가 삽입된 YCI-Ad-VSVG의 경우는 약 103 bp의 산물이 형성되었으며, 양성대조군인 pSP72[805+103bp]에서도 같은 크기의 PCR 산물이 형성되어짐을 확인할 수 있었다.Each of the PCR products was loaded onto an agarose gel and electrophoresed (see Figure 6). As shown in FIG. 6, in the case of YKL-1 and Ad-ΔE1 in which the fiber portion of the adenovirus is normal, no PCR product was produced, whereas the VSV-G epitope was inserted into the fiber 3 ′ end of the adenovirus. In the case of YCI-Ad-VSVG, a product of about 103 bp was formed, and it was confirmed that PCR products of the same size were formed in the positive control pSP72 [805 + 103 bp].

실시예 2: dl324-LacZ-VSVG의 증가된 유전자 전달 효율 규명Example 2: Characterization of Increased Gene Delivery Efficiency of dl324-LacZ-VSVG

아데노바이러스의 파이버에 VSV-G 에피토프를 삽입하여 유도되어지는 대상 세포로의 증가된 감염 효율을 규명하기 위하여, 표지 유전자로서 LacZ가 발현되는 dl324-LacZ-VSVG 바이러스를 이용하여 여러 암세포로의 유전자 전달효율을 평가하였다. 사람의 뇌암 세포주들인 U343, U118MG, U251N 및 U87MG (ATCC, 미합중국), 그리고 CAR의 발현이 낮은 세포주들인 CHO-K1, MCF-7, Pro 5 및 Lec2 (ATCC, 미합중국)을 대상으로 대조군 아데노바이러스인 dl324-LacZ 및 VSV-G 에피토프가 부착된 아데노바이러스인 dl324-LacZ-VSVG를 각각 여러 다른 MOI로 감염시킨 후 이틀 뒤에 X-gal 염색을 실시하였다 (참조: 도 7a, 도 7b, 7c, 도 7d, 도 7e, 도 7f, 도 7g 및 도 7h). 도 7a는 세포주가 U343인 경우를 나타내는 사진이고, 도 7b는 세포주가 U118MG인 경우를 나타내는 사진이며, 도 7c는 세포주가 U251N인 경우를 나타내는 사진이고, 도 7d는 세포주가 U87MGMG인 경우를 나타내는 사진이며, 도 7e는 세포주가 CHO-K1인 경우를 나타내는 사진이고, 도 7f는 세포주가 Lec2인 경우를 나타내는 사진이며, 도 7g는 세포주가 MCF-7인 경우를 나타내는 사진이고, 도 7h는 세포주가 Pro 5인 경우를 나타내는 사진이다. 도 7a 내지 도 7h에서 확인할 수 있듯이, 상기한 모든 세포주들에서 dl324-LacZ-VSVG는 증가된 감염효율로 인한 LacZ 유전자 발현효율이 향상되었음을 알 수 있다. 특히, 아데노바이러스의 천연 수용체인 CAR의 발현이 낮아 정상적인 아데노바이러스들에 의해 잘 감염이 되지 않는 CHO-K1, MCF-7, Pro 5, 그리고 Lec2 세포주들에서도 CAR와의 결합에 의존하지 않고 세포막에 널리 발현되어 있는 포스파티딜세린을 통한 감염으로 유전자 전달효율이 현격히 증가하였음을 알 수 있었다.In order to investigate the increased infection efficiency of the adenovirus fibers into the target cells induced by inserting the VSV-G epitope, gene transfer to various cancer cells using dl324-LacZ-VSVG virus expressing LacZ as a marker gene The efficiency was evaluated. Human adenocarcinoma cell lines U343, U118MG, U251N and U87MG (ATCC, United States), and CHO-K1, MCF-7, Pro 5, and Lec2 (ATCC, United States), which are low-expressing CARs, are the control adenoviruses. X-gal staining was performed two days after infection with dl324-LacZ-VSVG, an adenovirus with dl324-LacZ and VSV-G epitopes, respectively, with different MOIs (see FIGS. 7A, 7B, 7C, and 7D). 7E, 7F, 7G and 7H). 7A is a photograph showing a case where the cell line is U343, FIG. 7B is a photograph showing a case where the cell line is U118MG, FIG. 7C is a photograph showing a case where the cell line is U251N, and FIG. 7D is a photograph showing a case where the cell line is U87MGMG 7E is a photograph showing a case where the cell line is CHO-K1, FIG. 7F is a photograph showing a case where the cell line is Lec2, FIG. 7G is a photograph showing a case where the cell line is MCF-7, and FIG. 7H is a cell line This is a picture showing the case of Pro 5. As can be seen in Figures 7a to 7h, it can be seen that dl324-LacZ-VSVG in all the cell lines described above improved LacZ gene expression efficiency due to increased infection efficiency. In particular, CHO-K1, MCF-7, Pro 5, and Lec2 cell lines, which are not easily infected by normal adenoviruses due to low expression of CAR, a natural receptor of adenovirus, are widely used in cell membranes without relying on binding to CAR. Infection with the expressed phosphatidylserine significantly increased the gene transfer efficiency.

이러한 VSV-G 에피토프의 삽입에 의한 유전자 전달 효율의 증가를 정량화하기 위하여, X-gal 염색을 실시한 후, 이를 용출하여 그래프로 도식화하였다 (참조: 도 8a, 도 8b, 도 8c, 도 8d, 도 8e, 도 8f, 도 8g 및 도 8h). 도 8a는 세포주가 U343인 경우를 나타내는 그래프이고, 도 8b는 세포주가 U118MG인 경우를 나타내는 그래프이며, 도 8c는 세포주가 U251N인 경우를 나타내는 그래프이고, 도 8d는 세포주가 U87MGMG인 경우를 나타내는 그래프이며, 도 8e는 세포주가 CHO-K1인 경우를나타내는 그래프이고, 도 8f는 세포주가 Lec2인 경우를 나타내는 그래프이며, 도 8g는 세포주가 MCF-7인 경우를 나타내는 그래프이고, 도 8h는 세포주가 Pro 5인 경우를 나타내는 그래프이다. 도 8a 내지 도 8h에서 확인할 수 있듯이, 상기한 모든 세포주들에서 dl324-LacZ-VSVG는 증가된 감염효율로 인한 LacZ 유전자 발현효율이 크게 향상되어 U251N (MOI 1), U118MG (MOI 50), CHO-KI (MOI 50), 그리고 Pro5 (MOI 50) 등의 세포주들에서는 유전자 전달 효율이 상기한 바이러스 역가에서 약 100% 이상 증가하였으며 그외 다른 세포주들에서도 유전자 전달 효율이 현격히 증가하였다. 특히, 정상적인 아데노바이러스의 감염시 필요한 수용체인 CAR의 발현이 낮은 세포주들인 CHO-KI, Lec2, MCF-7, 그리고 Pro5의 경우 모두에서, VSV-G 에피토프가 삽입되어 CAR에 의존하지 않고 대상세포를 감염시킬 수 있는 dl324-LacZ-VSVG 바이러스는 정상적인 파이버를 가진 dl324-LacZ 바이러스에 비해 훨씬 더 잘 감염시킬 수 있었으며, 감염시 넣어준 역가에 비례해서 LacZ 유전자의 발현이 현격히 증가하였다.In order to quantify the increase in gene transfer efficiency due to the insertion of the VSV-G epitope, X-gal staining was performed, followed by elution and graphing it (see FIGS. 8A, 8B, 8C, 8D, and 8). 8e, 8f, 8g and 8h). 8A is a graph showing a case where the cell line is U343, FIG. 8B is a graph showing the case where the cell line is U118MG, FIG. 8C is a graph showing the case where the cell line is U251N, and FIG. 8D is a graph showing a case where the cell line is U87MGMG. 8E is a graph showing the case where the cell line is CHO-K1, FIG. 8F is a graph showing the case where the cell line is Lec2, FIG. 8G is a graph showing the case where the cell line is MCF-7, and FIG. 8H is a cell line. It is a graph showing the case of Pro 5. As can be seen in Figure 8a to 8h, dl324-LacZ-VSVG in all the cell lines described above is significantly improved LacZ gene expression efficiency due to increased infection efficiency U251N (MOI 1), U118MG (MOI 50), CHO- In cell lines such as KI (MOI 50), and Pro5 (MOI 50), the gene transfer efficiency increased more than about 100% in the viral titers described above, and in other cell lines the gene transfer efficiency increased significantly. In particular, in the case of CHO-KI, Lec2, MCF-7, and Pro5 cell lines with low expression of CAR, which is a receptor required for normal adenovirus infection, VSV-G epitopes are inserted to target cells without depending on CAR. The infectious dl324-LacZ-VSVG virus was able to infect much better than the dl324-LacZ virus with normal fiber, and the expression of the LacZ gene was significantly increased in proportion to the titer given during infection.

실시예 3: YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양세포 살상능력 규명Example 3: Characterization of increased tumor cell killing ability of YCI-Ad-VSVG

YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양세포 살상능력을 규명하기 위하여 종양세포주인 Hep3B, Hep1, HepG2, C33A, U343, U87MG, U251-N, 및 MCF-7 들을 이용하였다. 상기 세포주들을 증식 불능 아데노바이러스 dl324/LacZ, YKL-1, 그리고 YCI-Ad-VSVG로 각각 MOI 10, 1 또는 0.1 이 되도록 감염시킨 후 세포의 사멸정도를 관찰하였다. 살상 능력을 가시화 하기 위하여 감염세포를 거의 사멸시킨 시점에 남아있는 세포들을 1% 크리스탈 바이올렛 (50% 메탄올)으로 20분 동안 고정하고 염색한 후, 사진을 찍었다 (참조: 도 9a, 도 9b, 도 9c, 도 9d, 도 9e, 도 9f, 도 9g 및 도 9h). 도 9a는 세포주 Hep3B에 대한 YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양특이 살상능력을 보여주는 세포 병변 분석 사진이고, 도 9b는 세포주 C33A에 대한 YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양특이 살상능력을 보여주는 세포 병변 분석 사진이며, 도 9c는 세포주 U343에 대한 YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양특이 살상능력을 보여주는 세포 병변 분석 사진이고, 도 9d는 세포주 U87MGMG에 대한 YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양특이 살상능력을 보여주는 세포 병변 분석 사진이며, 도 9e는 세포주 Hep1에 대한 YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양특이 살상능력을 보여주는 세포 병변 분석 사진이고, 도 9f는 세포주 U251-N에 대한 YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양특이 살상능력을 보여주는 세포 병변 분석 사진이며, 도 9g는 세포주 HepG2에 대한 YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양특이 살상능력을 보여주는 세포 병변 분석 사진이고, 도 9h는 세포주 MCF-7에 대한 YCI-Ad-VSVG의 증가된 종양특이 살상능력을 보여주는 세포 병변 분석 사진이며, 도 9a 내지 도 9h에서 1번 레인은 아데노바이러스 d1324/LacZ인 경우를 나타내고, 2번 레인은 아데노바이러스 YKL-1인 경우를 나타내며, 3번 레인은 아데노바이러스 YCI-Ad-VSVG인 경우를 나타낸다. 도 9a 내지 도 9h에서 보듯이, YCI-Ad-VSVG의 살상능력은 Hep3B와 U343에서 YKL-1 에 비하여 약 100배정도 증가된 것을 볼 수 있었으며, 다른 여러 세포주들에서도 약 10배정도 증가된 살상능력을 나타내었다Tumor cell lines Hep3B, Hep1, HepG2, C33A, U343, U87MG, U251-N, and MCF-7 were used to identify the increased tumor cell killing ability of YCI-Ad-VSVG. The cell lines were infected with a non-proliferative adenovirus dl324 / LacZ, YKL-1, and YCI-Ad-VSVG to MOI 10, 1 or 0.1, respectively, and observed the degree of cell death. In order to visualize the killing ability, the cells remaining at the time of nearly killing the infected cells were fixed with 1% crystal violet (50% methanol) for 20 minutes and stained, and photographs were taken (see FIGS. 9A, 9B, and 5). 9c, 9d, 9e, 9f, 9g and 9h). 9A is a cell lesion analysis picture showing increased tumor specific killing capacity of YCI-Ad-VSVG against cell line Hep3B, and FIG. 9B is a cell lesion showing increased tumor specific killing capacity of YCI-Ad-VSVG against cell line C33A. Analytical picture, Figure 9c is a cell lesion analysis showing the increased tumor-specific killing capacity of YCI-Ad-VSVG against cell line U343, Figure 9d is an increased tumor-specific killing capacity of YCI-Ad-VSVG against cell line U87MGMG Figure 9e is a cell lesion analysis picture, Figure 9e is a cell lesion analysis picture showing the increased tumor specific killing capacity of YCI-Ad-VSVG against cell line Hep1, Figure 9f is a picture of YCI-Ad-VSVG for cell line U251-N Cell lesion analysis picture showing increased tumor specific killing ability, Figure 9g is a cell lesion analysis picture showing increased tumor specific killing capacity of YCI-Ad-VSVG against cell line HepG2, Figure 9h is cell line MCF-7 Analysis of cell lesions showing increased tumor specific killing capacity of YCI-Ad-VSVG for FIG. 9A to FIG. 9H, lane 1 shows adenovirus d1324 / LacZ, and lane 2 shows adenovirus YKL-1. Lane 3 represents adenovirus YCI-Ad-VSVG. As shown in Figures 9a to 9h, the killing capacity of YCI-Ad-VSVG was about 100 times increased compared to YKL-1 in Hep3B and U343, about 10 times increased killing capacity in other cell lines. Indicated

따라서, 본 실시예에서 시험된 모든 종양 세포주들에 대하여 본 발명의 YCI-Ad-VSVG은 대조군인 YKL-1과 비교하여 세포살상효과가 VSV-G 에피토프의 첨가에 의하여 현격히 증가되었음을 알 수 있다.Therefore, the YCI-Ad-VSVG of the present invention for all the tumor cell lines tested in this example can be seen that the cytotoxic effect was significantly increased by the addition of VSV-G epitope compared to the control group YKL-1.

이상에서 설명하였듯이, 본 발명은 아데노바이러스에 베지큘러 스토마티티스바이러스의 감염 리간드의 일부만을 도입시켜서, 항종양능을 향상시킨 재조합 아데노바이러스 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 감염 효율이 저조한 여러 암세포들에 대한 감염 효율을 증가시킴으로서 이로 인한 유전자 형질도입의 증가와 암세포내 바이러스의 복제량이 증가되어 암 치료효과를 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 이미 치료효과가 있는 세포에서는 증가된 감염 효율로 인하여 치료에 필요한 바이러스의 투여량을 감소시켜 인체 조직에서의 면역반응을 최소화시킴으로써 방사선 치료와 약물치료같은 기존의 암 치료법과의 병행요법을 통하여 치료효과를 극대화하는 등 새로운 암 치료법의 개발에 활용될 수 있을 것이다.As described above, the present invention relates to a recombinant adenovirus and a pharmaceutical anti-tumor composition comprising the same by introducing only a part of the infectious ligand of Vesicular stomatitis virus into the adenovirus. According to the present invention, by increasing the infection efficiency of several cancer cells of low infection efficiency, the gene transduction and the replication amount of the virus in the cancer cells can be increased, thereby improving the cancer treatment effect as well as having a therapeutic effect. In cells, the increased infection efficiency reduces the dose of virus required for treatment, thereby minimizing the immune response in human tissues, thereby maximizing the therapeutic effect through combination therapy with existing cancer therapies such as radiation and drug therapy. It could be used to develop cancer therapy.

Claims (12)

아데노바이러스 및 이에 연결된 베지큘라 스토마티티스 바이러스로부터 유래된 VSV-G 에피토프를 포함한 단백질로 구성됨을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.Recombinant adenovirus, characterized in that it consists of a protein comprising a VSV-G epitope derived from adenovirus and the associated St. custostomatitis virus. 제1항에 있어서, 아데노바이러스의 파이버 및 이에 연결된 베지큘라 스토마티티스 바이러스로부터 유래된 VSV-G 에피토프로 구성됨을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.The recombinant adenovirus of claim 1, wherein the recombinant adenovirus consists of a VSV-G epitope derived from a fiber of adenovirus and a Vesicular stomatitis virus linked thereto. 제1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 YKL-1 (KFCC-11099) 또는 YKC-1 (KFCC-11280)인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.The recombinant adenovirus of claim 1, wherein the adenovirus is YKL-1 (KFCC-11099) or YKC-1 (KFCC-11280). 제2항에 있어서, 상기 VSV-G 에피토프가 연결되는 부위가 아데노바이러스의 파이버는 놉 부위인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.The recombinant adenovirus according to claim 2, wherein a fiber of the adenovirus is a knob portion at which the VSV-G epitope is connected. 제4항에 있어서, 아데노바이러스의 파이버 놉 부위가 HI 루프, 펜톤 베이스 또는 파이버 말단 부위인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.5. The recombinant adenovirus of claim 4, wherein the fiber knob portion of the adenovirus is an HI loop, fenton base, or fiber terminal portion. 제2항에 있어서, 상기 VSV-G 에피토프는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.The recombinant adenovirus according to claim 2, wherein the VSV-G epitope has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. 4. 제1항 내지 6항중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노바이러스의 파이버 및 VSV-G 에피토프 사이에 링커가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.The recombinant adenovirus according to any one of claims 1 to 6, wherein a linker is connected between the fiber and the VSV-G epitope of the adenovirus. 제7항에 있어서, 상기 링커는 1개 이상의 글리신으로 구성되는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.8. The recombinant adenovirus of claim 7, wherein said linker consists of one or more glycines. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 YCI-Ad-VSVG (KFCC-11215)인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.The recombinant adenovirus according to any one of claims 1 to 8, wherein the recombinant adenovirus is YCI-Ad-VSVG (KFCC-11215). (a) 아데노바이러스 및 이에 연결된 베지큘라 스토마티티스 바이러스로부터 유래된 VSV-G 에피토프를 포함한 단백질로 구성된 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물.A pharmaceutical anti-tumor comprising (a) a therapeutically effective amount of a recombinant adenovirus consisting of a protein comprising VSV-G epitope derived from adenovirus and linked Vesicular stomatitis virus and (b) a pharmaceutically acceptable carrier. Composition. 제10항에 있어서, (a) 아데노바이러스의 파이버 및 이에 연결된 베지큘라 스토마티티스 바이러스로부터 유래된 VSV-G 에피토프로 구성된 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물.The method of claim 10 comprising (a) a therapeutically effective amount of a recombinant adenovirus consisting of a VSV-G epitope derived from a fiber of an adenovirus and a Vesicular stomatitis virus linked thereto and (b) a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutical anti-tumor composition. 제10항 또는 11항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스가 YCI-Ad-VSVG (KFCC-11215)인 것을 특징으로 하는 약제학적 항종양 조성물.The pharmaceutical anti-tumor composition according to claim 10 or 11, wherein said recombinant adenovirus is YCI-Ad-VSVG (KFCC-11215).