KR100749859B1 - Recombinant Adenovirus Expressing Specific with Enhanced Oncolytic Activity - Google Patents

Recombinant Adenovirus Expressing Specific with Enhanced Oncolytic Activity Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 아데노바이러스의 ITR (inverted terminal repeat) 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 서열목록 제1서열의 VEGF-A (vascular endothelial growth factor-A)의 mRNA에 상보적이며 VEGF-A 유전자의 발현을 억제하는 siRNA (small interfering RNA) 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 siRNA 분자는 상기 아데노바이러스의 종양세포 괴사능을 향상시키는 것을 특징으로 하는 종양세포 살상능이 개선된 재조합 아데노바이러스 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물에 관한 것이다. VEGF-A 특이적 siRNA를 발현하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 모든 종류의 VEGF-A 동형체의 발현을 저해하여 종양내 신생혈관의 형성을 선택적으로 억제함으로써 항종양 효과를 극대화한다. 그리고 VEGF-A 특이적 siRNA를 발현하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 낮은 역가의 바이러스로도 높은 살상 효과를 유도할 수 있기 때문에 투여된 체내에서서의 안전성이 매우 우수하다.The present invention is complementary to (a) the inverted terminal repeat (ITR) nucleotide sequence of adenovirus and (b) mRNA of vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) of SEQ ID NO: 1 and expresses the VEGF-A gene. It comprises a nucleotide sequence encoding a siRNA (small interfering RNA) molecule that inhibits the siRNA molecule, characterized in that it improves the tumor cell necrosis of the adenovirus, a recombinant adenovirus with improved tumor cell killing ability and the same It relates to a pharmaceutical anti-tumor composition. Recombinant adenovirus of the present invention expressing VEGF-A specific siRNA inhibits the expression of all types of VEGF-A isoforms to maximize the antitumor effect by selectively inhibiting neovascularization in tumors. In addition, the recombinant adenovirus of the present invention expressing VEGF-A specific siRNA is highly excellent in the administered body because it can induce a high killing effect even with a low titer virus.

아데노바이러스, 종양, 암, VEGF, siRNA Adenovirus, tumor, cancer, VEGF, siRNA

Description

ＶＥＧＦ―Ａ 특이적 ｓｉＲＮＡ를 발현하는 개선된 종양 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스{Recombinant Adenovirus Expressing ＶＥＧＦ―ＡSpecific ｓｉＲＮＡ with Enhanced Oncolytic Activity}Recombinant Adenovirus Expressing Remarkable Adenovirus Expressing Enhanced Oncolytic Activity Expressing Improved Oncolytic Activity Expressing Specific Specific RNA

도 1a-1b는 혈관내피 성장인자-A (vascular endothelial growth factor-A: VEGF-A)의 발현 억제에 관여하는 짧은 억제 RNAs (small interfering RNAs: siRNAs)의 디자인을 보여준다. 도 1a는 실시예에서 이용된 VEGF-A의 2종 siRNA의 작용 위치를 보여준다. 도 1b는 pSilencer-U6 플라스미드 또는 아데노바이러스에서 전사된 항-인간 shVEGF의 예상되는 2차 구조를 나타낸다.1A-1B show the design of small interfering RNAs (siRNAs) involved in inhibiting expression of vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A). 1A shows the site of action of two siRNAs of VEGF-A used in the Examples. 1B shows the expected secondary structure of anti-human shVEGF transcribed from pSilencer-U6 plasmid or adenovirus.

도 2는 VEGF-A 유전자의 shRNA-매개 인 비트로 녹다운 결과를 나타낸다. VEGF-A mRNA를 RT-PCR로 정량하였다. 6-웰 플레이트 내의 U343 세포를 shVEGF-1 또는 shVEGF-2를 발현하는 pSilencer-U6 플라스미드로 안정되게 형질전환시켰다. 형질전환 48시간 후에 세포내 RNA를 분리하고 VEGF-A 발현의 녹다운을 RT-PCR로 측정하였다. 덴시토미터 분석을 실시하였고, 각각의 밴드에 대한 상대적인 발현량은 β-액틴으로 정규화 하였다.Figure 2 shows the knock down result of shRNA-mediated in vitro of the VEGF-A gene. VEGF-A mRNA was quantified by RT-PCR. U343 cells in 6-well plates were stably transformed with pSilencer-U6 plasmids expressing shVEGF-1 or shVEGF-2. 48 hours after transformation, intracellular RNA was isolated and knockdown of VEGF-A expression was measured by RT-PCR. Densitometer analysis was performed and the relative expression level for each band was normalized to β-actin.

도 3a-3i는 실시예에서 이용된 재조합 아데노바이러스 벡터의 유전자 지도를 나타낸다. 모든 아데노바이러스 벡터는, E. coli에서 박테리아 벡터로 클로닝되 고 조작된 전장 아데노바이러스 지놈으로부터 유래된 것이다. 도 3a 및 도 3b에서, dl-Z는 E1 영역 전체가 결손되어 있고, 여기에 삽입된 CMV 프로모터의 조절 하에 LacZ 유전자를 발현한다. dl-Z-shVEGF는 dl-Z의 E3 영역에 삽입된 shVEGF 서열을 포함한다. 도 3c-도 3f에서, Ad-B7는 변이된-E1A를 포함하며, E1B 19kDa과 E1B 55 kDa은 결실되어 있고, Ad-B7-shVEGF는 E3 영역에 삽입된 shVEGF 서열을 포함한다. “★”는 E1A의 Rb (retinoblastoma) 결합 위치인 CR1에서 45번째 아미노산의 글루탐산 (Glu)이 글라이신 (Gly)로 치환된 것과 CR2에서 7개 아미노산 (DLTCHEA)이 7개 글라이신 (GGGGGGG)으로 치환된 변이를 나타낸다. 결실된 E3 영역에서의 숫자, 28592-30470는 Ad5 지놈에서의 위치를 나타낸다. 도면에서, Δ는 해당서열이 결실된 것을 나타내고, ITR은 inverted terminal repeat의 축약어이고, Ψ는 패키지 시그널을 포함하는 서열을 나타내며, 기호 Ad는 아데노바이러스의 축약어이고, CMV는 CMV 프로모터를 나타내며, U6는 U6 프로머터이고, IX는 아데노바이러스의 단백질 IX 유전자를 나타낸다.3A-3I show gene maps of the recombinant adenovirus vectors used in the Examples. All adenovirus vectors are derived from full length adenovirus genomes cloned and engineered into bacterial vectors in E. coli . In FIGS. 3A and 3B, dl-Z lacks the entire El region and expresses the LacZ gene under the control of a CMV promoter inserted therein. dl-Z-shVEGF comprises a shVEGF sequence inserted into the E3 region of dl-Z. 3C-3F, Ad-B7 comprises mutated-E1A, E1B 19kDa and E1B 55 kDa are deleted, and Ad-B7-shVEGF comprises an shVEGF sequence inserted into the E3 region. “★” indicates that 45th amino acid glutamic acid (Glu) was substituted with glycine (Gly) at CR1, the Rb (retinoblastoma) binding position of E1A, and 7 amino acids (DLTCHEA) were substituted with 7 glycine (GGGGGGG) at CR2. Indicates variation. Numbers in the deleted E3 region, 28592-30470, represent positions in the Ad5 genome. In the figure, Δ indicates that the corresponding sequence is deleted, ITR is an abbreviation of inverted terminal repeat, Ψ represents a sequence including the package signal, the symbol Ad is an abbreviation of adenovirus, CMV represents the CMV promoter, U6 Is the U6 promoter and IX represents the Protein IX gene of adenovirus.

도 4는 종양살상 아데노바이러스로 감염된 U343에 의해 분비된 VEGF-A를 정량한 결과를 보여준다. 인간 U343 신경교세포를 Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF를 이용하여 10-20 MOIs로 감염시켰다. 감염후 72시간과 96시간째에 배양 상등액에서의 VEGF-A 농도를 ELISA로 측정하였다. VEGF-A 농도는 아무것도 처리하지 않은 경우에 비해 Ad-ΔB7- 및 Ad-ΔB7-shVEGF-감염된 세포 배양 상등액에서 현저하게 감소하였다. 각각의 값은 최소 3번의 독립적인 실험들의 평균이다.Figure 4 shows the results of quantifying the secreted VEGF-A secreted by U343 infected with oncolytic adenovirus. Human U343 glial cells were infected with 10-20 MOIs using Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF. At 72 and 96 hours after infection, VEGF-A levels in the culture supernatants were measured by ELISA. VEGF-A concentrations were significantly reduced in Ad-ΔB7- and Ad-ΔB7-shVEGF-infected cell culture supernatants compared to no treatment. Each value is the average of at least three independent experiments.

도 5는 종양살상 아데노바이러스로 감염된 U343에 의해 분비된 VEGF-A를 정 량한 결과를 보여준다. 인간 U343 신경교세포를 dl-Z, YKL-1, Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF를 이용하여 10-20 MOIs로 감염시켰다. 감염후 72시간과 96시간째에 배양 상등액에서의 VEGF-A 농도를 ELISA로 측정하였다. VEGF-A 농도는 복제 가능 아데노바이러스 (YKL-1, Ad-ΔB7- 및 Ad-ΔB7-shVEGF)로 감염된 세포 배양 상등액에서 크게 감소하였다. 각각의 값은 최소 3번의 독립적인 실험들의 평균이다.Figure 5 shows the results of quantifying the secreted VEGF-A secreted by U343 infected with oncolytic adenovirus. Human U343 glial cells were infected with 10-20 MOIs using dl-Z, YKL-1, Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF. At 72 and 96 hours after infection, VEGF-A levels in the culture supernatants were measured by ELISA. VEGF-A concentrations were significantly reduced in cell culture supernatants infected with replicable adenoviruses (YKL-1, Ad-ΔB7- and Ad-ΔB7-shVEGF). Each value is the average of at least three independent experiments.

도 6은 복제 불능 아데노바이러스에 의해 감염된 여러 암세포로부터 분비된 VEGF-A 정량 결과를 보여준다. 여러 인간 암세포주를 dl-Z 또는 dl-Z-shVEGF 복제 불능 아데노바이러스를 이용하여 10-500 MOIs로 감염시켰다. 감염후 96시간째에 배양 상등액에서의 VEGF-A 농도를 ELISA로 측정하였다. VEGF-A 농도는 감염량 의존적으로 감소하였다. 모든 데이터는 3회 실험의 평균± SD이다.Figure 6 shows the results of quantification of VEGF-A secreted from several cancer cells infected by non-replicating adenovirus. Several human cancer cell lines were infected with 10-500 MOIs using dl-Z or dl-Z-shVEGF incapable adenoviruses. 96 hours after infection, VEGF-A concentration in the culture supernatant was measured by ELISA. VEGF-A concentrations decreased dose dependently. All data are mean ± SD of 3 experiments.

도 7a-7b는 인간 내피세포에서 shVEGF에 의한 관형성 억제를 보여준다. HUVEC 세포를 dl-Z- 또는 dl-Z-shVEGF-감염된 콘디션드 배지로 중합된 마트리젤 상에서 감염시켰다. HUVEC 세포를 마트리젤-코팅 플레이트에 2 x 105 세포/웰 밀도로 플레이팅하고 dl-Z- 또는 dl-Z-shVEGF-감염된 콘디션드 배지와 반응시켰다. 16시간 이후, 세포 형태 변화를 도립 현미경 (X40, X400)으로 관찰하였다. VEGF-A (10 ng/ml) 재조합 정제 단백질에 의해 자극된 HUVECs는 마트리젤 비드 상에서 루멘을 갖는 비어있는 튜브를 정상적으로 형성하였고, 이는 포지티브 대조군으로 이용되었다. 관 네트워크에 의해 덮여 있는 면적을 Image-Pro Plus 소프트웨어를 사용하여 정량하였으며, VEGF-A 정제 단백질을 처리한 경우를 100%로 보정하여 상 대적인 수치를 구하였다(32). 실험을 두 번 반복하였고, 값은 3회 실험의 평균± SE로 나타내었다.7A-7B show the inhibition of tubulation by shVEGF in human endothelial cells. HUVEC cells were infected on matrigel polymerized with dl-Z- or dl-Z-shVEGF-infected conditioned medium. HUVEC cells were plated at 2 × 10 5 cells / well density in Matrigel-coated plates and reacted with dl-Z- or dl-Z-shVEGF-infected conditioned medium. After 16 hours, cell morphology changes were observed with inverted microscope (X40, X400). HUVECs stimulated with VEGF-A (10 ng / ml) recombinant purified protein normally formed empty tubes with lumens on Matrigel beads, which were used as positive controls. The area covered by the vascular network was quantified using Image-Pro Plus software, and relative values were calculated by calibrating the VEGF-A purified protein to 100% (32). The experiment was repeated twice and the values were expressed as mean ± SE of 3 experiments.

도 8a-8b는 shVEGF에 의한 관 스프라우팅의 억제를 나타낸다. 스프라그 돌리 래트로부터 분리된 대동맥의 얇은 고리(ring)를 VEGF-A (20 ng/ml) 재조합 정제 단백질, 비감염 컨디션드 배지, dl-Z- 또는 dl-Z-shVEGF-감염된 컨디션드 배지와 반응시킨 다음, 6일째에 Diff-Quick으로 염색시켰다. 도 8b에서, 점수 0 (least positive) 내지 5 (most positive)를 부여하여 실시하였고, 데이터는 평균 ± SE로 나타내었다.8A-8B show inhibition of vascular sprouting by shVEGF. Reaction of aorta's thin ring isolated from Sprague Dolly rats with VEGF-A (20 ng / ml) recombinant purified protein, uninfected conditioned medium, dl-Z- or dl-Z-shVEGF-infected conditioned medium And then stained with Diff-Quick on day 6. In FIG. 8B, the test was performed with a score of 0 (least positive) to 5 (most positive), and data are expressed as mean ± SE.

도 9는 마트리젤 플러그 분석 결과를 보여준다. (A1-A2) 복제 불능 아데노바이러스 (dl-Z, dl-Z-shVEGF)로 감염된 마트리젤 플러그, (B1-B2) 복제 가능 아데노바이러스 (Ad-ΔB7, Ad-ΔB7-shVEGF)로 감염된 마트리젤 플러그.9 shows the results of the Matrigel plug analysis. (A1-A2) Matrigel plug infected with non-replicating adenovirus (dl-Z, dl-Z-shVEGF), (B1-B2) Matrigel infected with replicable adenovirus (Ad-ΔB7, Ad-ΔB7-shVEGF) plug.

도 10은 shVEGF-발현 종양살상 아데노바이러스의 세포병변 효과 (CPE)를 보여준다. 세포를 dl-Z, Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF으로 감염시켰다. 감염 후 4-10일째, 생존 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 복제 불능 아데노바이러스인 dl-Z는 네가티브 대조군으로 이용하였다. 각각의 세포주에 대하여 적어도 3회 시험하였고, 도면의 데이터는 각각의 대표적인 실험 결과이다.10 shows the cytopathic effect (CPE) of shVEGF-expressing oncolytic adenovirus. Cells were infected with dl-Z, Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF. 4-10 days after infection, viable cells were stained with crystal violet. Non-replicating adenovirus dl-Z was used as a negative control. Each cell line was tested at least three times and the data in the figures is representative of each experimental result.

도 11은 shVEGF-발현 종양살상 아데노바이러스에 의한 종양 성장의 억제를 보여준다. U343 인간 신경교세포로부터 유래된 피하 이식된 종양을, 네가티브 대조군으로서 PBS (●)와 함께 Ad-ΔB7 (■) 또는 Ad-ΔB7-shVEGF (▲)으로 처리하였다. 아데노바이러스 처리 후 시간 경과에 따라 종양 용적을 모니터링 하였다. 아데노바이러스 투여 (1 x 108 PFU/mouse) 시점은 화살표로 나타내었다. 값은 각각의 그룹 당 8마리로부터 얻은 데이터의 평균± SE이다.11 shows inhibition of tumor growth by shVEGF-expressing oncolytic adenovirus. Subcutaneously transplanted tumors derived from U343 human glial cells were treated with Ad-ΔB7 (■) or Ad-ΔB7-shVEGF (▲) together with PBS (•) as negative control. Tumor volume was monitored over time after adenovirus treatment. Adenovirus administration (1 × 10 8 PFU / mouse) time points are indicated by arrows. Values are the mean ± SE of data from 8 animals in each group.

도 12는 PBS, Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF의 처리 후의 VEGF-A 발현의 감소를 보여주는 그래프이다. U343 종양에 PBS, Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF를 주입한 후, ELISA 키트를 이용하여 종양 균질액에서의 VEGF-A 발현 정도를 측정하였다. Ad-ΔB7-shVEGF의 처리 후에 VEGF-A 발현이 크게 감소하였다.12 is a graph showing the reduction of VEGF-A expression after treatment with PBS, Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF. After injection of PBS, Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF into U343 tumors, the degree of VEGF-A expression in tumor homogenates was measured using an ELISA kit. After treatment with Ad-ΔB7-shVEGF, VEGF-A expression was significantly reduced.

도 13은 PBS, Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF의 투여에 따른 U343 종양 조직의 변화를 보여주는 H & E-염색 단면 사진이다. Ad-ΔB7-shVEGF로 처리된 종양은, 전체적으로 주로 괴사세포로 이루어져 있다.FIG. 13 is a H & E-stained cross-sectional photograph showing the change in U343 tumor tissue following administration of PBS, Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF. Tumors treated with Ad-ΔB7-shVEGF are composed mainly of necrotic cells as a whole.

도 14a-14b는 혈관 밀도를 평가하기 위한 CD31에 대한 면역조직화학 염색 결과를 보여준다 (헤마토자일린으로 카운터염색됨). 도 14a에서, 갈색으로 염색된 것은 PBS, Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF으로 처리된 마우스의 내피세포에 대한 포지티브 염색을 나타낸다. 도 14b에서, CD31-포지티브 혈관의 수를 계수하였다. LPF (low-power field, X 100). 3개의 슬라이드의 평균± SE. 14A-14B show immunohistochemical staining results for CD31 to assess vascular density (counter-stained with hematoxylin). In FIG. 14A, staining in brown represents positive staining for endothelial cells of mice treated with PBS, Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF. In FIG. 14B, the number of CD31-positive vessels was counted. LPF (low-power field, X 100). Mean of three slides ± SE.

도 15는 종양 조직에서 아데노바이러스의 국소위치를 확인하기 위한 헥손 단백질의 면역조직화학 염색 결과를 보여준다 (헤마토자일린으로 카운터염색됨). Ad-ΔB7을 투여한 종양의 경우에는 종괴의 넓은 부위에서 아데노바이러스를 검출할 수 있었다. 그러나 Ad-ΔB7-shVEGF-주입 종양에서는, shVEGF에 의한 혈관신생의 억제에 따라 종양내의 대부분의 조직이 괴사되어 일부 국소적 부위에서만 아데노바 이러스가 관찰되었다. FIG. 15 shows the results of immunohistochemical staining of hexon proteins to identify local locations of adenoviruses in tumor tissues (counter-stained with hematozain). In the case of tumors treated with Ad-ΔB7, adenoviruses could be detected in large areas of the mass. However, in Ad-ΔB7-shVEGF-injected tumors, most tissues in the tumor were necrotic due to the inhibition of angiogenesis by shVEGF, and adenoviruses were observed only at some local sites.

본 발명은 VEGF-A 특이적 siRNA를 발현하는 개선된 종양 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다.The present invention relates to a recombinant adenovirus that exhibits an improved tumor killing effect of expressing VEGF-A specific siRNAs.

RNA-매개 방해 (RNA-mediated interference: RNAi)는 21-25 뉴클레오타이드(nt) 크기의 작은 RNA 조각이 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 선택적으로 결합하여 분해함으로써 단백질 발현을 억제하는 현상이다(1). RNAi 현상은 1995년에 C. elegance와 식물에서 유전자를 조절하는 메커니즘의 일부로 처음 발견되었으며, 1998년 미국 카네기 연구소의 Andrew Fire와 매사츄세츠 의과대학의 Craig Mello 팀의 실험을 통해, 특정 유전자의 염기서열에 해당하는 이중쇄 RNA (dsRNA)를 선충(Caenorphabditis elegans)의 체내에 주입하였을 때 그 유전자의 발현이 현저히 억제될 수 있음이 밝혀졌다(2). C. elegans에 주입된 장쇄의 dsRNA는 RNase Ⅲ 패밀리에 속하는 Dicer라는 효소에 의해 21-25 bp 크기의 작은 방해 RNA (small interfering RNA: siRNA)로 절단되고, 그 절단된 짧은 dsRNA는 RISC (RNA-induced silencing complex) 효소 결합체에 합체되어 siRNA의 이중나선이 풀리게 된다. 이후, 단일 가닥으로 분리된 siRNA는 상보적인 서열을 갖는 특정 유전자의 mRNA에 결합하여 분해함으로써 그 유전자의 발현을 억제한다(3). RNA-mediated interference (RNAi) is a phenomenon in which small RNA fragments of size 21-25 nucleotides (nt) selectively bind to and degrade the mRNA having complementary sequences to inhibit protein expression (1). The RNAi phenomenon was first discovered in 1995 as part of C. elegance and the mechanisms that regulate genes in plants. When the double-stranded RNA (dsRNA) corresponding to the sequence was injected into the body of nematode Caenorphabditis elegans , expression of the gene was found to be significantly suppressed (2). The long-chain dsRNA injected into C. elegans is cleaved into small interfering RNA (siRNA) of 21-25 bp by an enzyme called Dicer belonging to the RNase III family. induced silencing complex) is combined with an enzyme conjugate to release the double helix of the siRNA. The siRNA separated into single strands then binds to and degrades the mRNA of a particular gene with complementary sequences to inhibit expression of that gene (3).

하지만, 포유류 같은 고등동물에서는 이와 같은 장쇄 dsRNA에 의한 특정 유전자의 발현 억제 현상이 관찰되지 않았다. 포유동물에서는 체내에 주입된 장쇄 dsRNA에 의해 단백질 키나아제 R (PKR)을 활성화시키는 비특이적 인터페론 (IFN) 유도와 같은 생체내 방어 기전이 활성화되고, 결과적으로 유전자의 발현 억제 현상이 비특이적으로 일어난다(4). 그러나 2001년, Elbashir 연구팀에서 21개 염기의 짧은 dsRNA (siRNA)를 배양된 포유동물 세포에 주입하여 특정 유전자의 발현을 선택적으로 억제할 수 있음을 보고한 후, 포유동물세포에서의 RNAi 이용 가능성이 크게 증가하였다(5).However, the inhibition of expression of specific genes by long chain dsRNA was not observed in higher animals such as mammals. In mammals, long-chain dsRNA injected into the body activates defense mechanisms in vivo, such as induction of nonspecific interferon (IFN), which activates protein kinase R (PKR), resulting in non-specific inhibition of gene expression (4). . However, in 2001, Elbashir's team reported that 21 dM of short dsRNA (siRNA) could be injected into cultured mammalian cells to selectively inhibit the expression of certain genes. Significantly increased (5).

현재, siRNA를 이용한 유전자 발현 억제 기술은 다양한 종류의 유전자들의 기능을 이해하는데 널리 이용되고 있을 뿐 아니라, 암, 감염성 질환과 같은 난치성 질환을 치료하는 치료제로서도 활발히 개발되고 있다(6). 종양 형성에 밀접히 관련된 Bcl-2와 c-Raf와 같은 암발생 (oncogenic) 유전자들에 특이적인 siRNA를 이용하여 인체 골수성 류케미아 세포에서 세포고사를 유도할 수 있음이 보고되었고(7), 만성 골수성 류케미아 (chronic myelogenous leukemia: CML)에서 특징적으로 다량 발현되는 Bcr-abl 융합 유전자에 특이적인 siRNA를 이용하여 BCR-ABL 단백질의 발현량을 현저하게 감소시킬 수 있음이 보고되었다(8). 또한, HIV RNA에 상보적인 siRNA 또는 HIV-1의 보조 수용체 (co-receptor)인 CXCR4/CCR5 RNA에 상보적인 siRNA를 이용하여 HIV 바이러스의 감염을 저하시키고자 하는 방안들이 활발히 연구되고 있다(9). 최근에는 간염 바이러스에 상보적인 합성 siRNA를 이용하여 간염 바이러스의 유전자 발현을 현저하게 억제할 수 있음이 보고되었다(6). Currently, gene expression suppression technology using siRNA is not only widely used to understand the functions of various kinds of genes, but is also actively developed as a therapeutic agent for treating intractable diseases such as cancer and infectious diseases (6). SiRNAs specific for oncogenic genes such as Bcl-2 and c-Raf, which are closely related to tumor formation, have been reported to induce apoptosis in human myeloid rheumatoid cells (7). It has been reported that siRNAs specific for the Bcr-abl fusion gene, which is characteristically expressed in cyclic myelogenous leukemia (CML), can be used to significantly reduce the expression level of BCR-ABL protein (8). In addition, methods for reducing infection of HIV virus using siRNA complementary to HIV RNA or siRNA complementary to CXCR4 / CCR5 RNA, a co-receptor of HIV-1, have been actively studied (9). . Recently, synthetic siRNA complementary to hepatitis virus has been reported to significantly inhibit gene expression of hepatitis virus (6).

siRNA를 이용하여 동물세포내의 특정 유전자의 발현을 억제하는 방법으로 생체외 (in vitro)에서 siRNA를 합성한 뒤 세포내로 도입시키는 방법 (in vitro preparation of siRNA)이 많이 이용되었는데, siRNA를 생합성하는 가격이 고가이고, 또한 세포 내로 합성된 siRNA를 주입하는 방법인 세포 형질감염의 효율이 매우 낮기 때문에 siRNA에 의한 유전자 발현 억제가 충분히 일어나지 않고 RNAi 효과가 2-3일간만 유지되는 단점들이 부각되었다(10). 이를 극복하기 위해서, siRNA를 세포내에서 발현시킬 수 있는 siRNA 발현 벡터 (plasmid vector)를 세포내로 도입시키는 방법이 개발되었다. 특히, RNA 중합효소 Ⅲ의 프로모터로부터 siRNA 타깃 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5-9개의 염기로 구성된 루프를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA: shRNA)를 발현하는 siRNA 발현 벡터의 경우에는, 세포내로 도입된 후 발현된 shRNA가 세포내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소 (Dicer 또는 RNase Ⅲ)에 의해 siRNA로 전환되어 특정 유전자의 발현을 선택적으로 억제할 수 있는 특징이 있다(11). method by using a siRNA that is introduced into then synthesized siRNA in vitro (in vitro) as a way of suppressing the expression of certain genes in animal cells was used a lot (in vitro preparation of siRNA), the price to the biosynthesis of siRNA Because of the high efficiency and low efficiency of cell transfection, which is a method of injecting the synthesized siRNA into cells, the drawback of the fact that the inhibition of gene expression by siRNA does not sufficiently occur and the RNAi effect is maintained for only 2-3 days has been highlighted (10 ). In order to overcome this, a method of introducing an siRNA expression vector (plasmid vector) capable of expressing siRNA intracellularly has been developed. In particular, in the case of siRNA expression vectors expressing short hairpin RNA (shRNA) from the promoter of RNA polymerase III, the sense and antisense sequences of the siRNA target sequence are interposed between loops of 5-9 bases. In addition, shRNA expressed after being introduced into cells is converted to siRNA by siRNA processing enzyme (Dicer or RNase III) present in the cell, thereby selectively inhibiting the expression of a specific gene (11).

Yang Shi 연구팀은 cdk-2와 라민 (lamin)과 같은 여러 종류의 내재성 유전자들의 발현을 DNA 벡터-기반 shRNA로 현저하게 억제할 수 있음을 보고하였으며(11, 12), Thomas Becker 연구팀은 GLUT2 유전자에 상보적인 shRNA를 발현하는 복제 불능 아데노바이러스를 이용하여 초기 래트 아일릿 세포내의 GLUT2 발현을 90% 이상 억제할 수 있음을 보고하였다(13). 또한, Sven Reske 연구팀은 p53 유전자에 상보적인 shRNA를 발현하는 복제 불능 아데노바이러스를 이용하여 유방암 세포주인 MCF-7과 폐암 세포주인 A549에서 p53의 발현을 선택적으로 억제할 수 있음을 보고하였다(14). 그러나, 플라스미드를 이용한 shRNA 발현 벡터 시스템의 경우, 플라스미드를 세포내로 주입하는 방법인 형질전환의 효율이 낮고 또한 shRNA의 발현이 지속적이지 않은 단점이 있고, 복제 불능 바이러스를 이용할 경우에는 비교적 높은 효율로 형질감염이 가능하다는 장점이 있지만 shRNA의 발현이 약 7-10일 이상 지속되지 않는 단점이 있다(15).Yang Shi's team reported that DNA vector-based shRNAs can significantly inhibit the expression of several endogenous genes, such as cdk-2 and lamin (11, 12), and Thomas Becker's team used the GLUT2 gene. Non-replicating adenoviruses expressing complementary shRNA have been reported to be able to inhibit 90% or more of GLUT2 expression in early rat eyelet cells (13). In addition, Sven Reske and colleagues report that they can selectively inhibit the expression of p53 in breast cancer cell line MCF-7 and lung cancer cell line A549 using non-replicating adenoviruses that express complementary shRNAs to the p53 gene (14). . However, in the shRNA expression vector system using a plasmid, there is a disadvantage in that the transformation efficiency, which is a method of injecting the plasmid into the cell, is low and the expression of shRNA is not sustained. Although there is an advantage that infection is possible, there is a disadvantage that expression of shRNA does not last for about 7-10 days or more (15).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this specification, numerous citations and patent documents are referenced and their citations are indicated. The disclosures of cited documents and patents are incorporated herein by reference in their entirety, so that the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained.

본 발명자들은 외래 서열을 아데노바이러스 지놈에 삽입시키는 전략으로 아데노바이러스의 종양세포 살상능 (oncolytic activity)을 향상시키기 위하여 연구 노력한 결과, VEGF-A (vascular endothelial growth factor-A)의 mRNA를 타겟팅하는 siRNA (small interfering RNA) 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 아데노바이러스의 지놈에 삽입시켜 발현시키면 아데노바이러스의 종양세포 살상능이 크게 향상되는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have tried to improve the tumor cell oncolytic activity of adenoviruses by inserting foreign sequences into the adenovirus genome, and as a result, siRNA targeting mRNA of VEGF-A (vascular endothelial growth factor-A) The present invention was completed by discovering that the expression of a nucleotide sequence encoding a small interfering RNA molecule by inserting it into the genome of an adenovirus greatly improves tumor cell killing ability of the adenovirus.

따라서, 본 발명의 목적은 VEGF-A에 대한 siRNA 분자를 발현하는 종양세포 살상능이 개선된 재조합 아데노바이러스를 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a recombinant adenovirus with improved tumor cell killing ability to express siRNA molecules for VEGF-A.

본 발명의 다른 목적은 VEGF-A에 대한 siRNA 분자를 발현하는 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical anti-tumor composition comprising a recombinant adenovirus expressing siRNA molecules for VEGF-A.

본 발명의 또 다른 목적은 VEGF-A 유전자 발현 억제용 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a nucleotide sequence for inhibiting VEGF-A gene expression.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 아데노바이러스의 ITR (inverted terminal repeat) 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 서열목록 제1서열의 VEGF-A (vascular endothelial growth factor-A)의 mRNA에 상보적이며 VEGF-A 유전자의 발현을 억제하는 siRNA (small interfering RNA) 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 siRNA 분자는 상기 아데노바이러스의 종양세포 괴사능을 향상시키는 것을 특징으로 하는 종양세포 살상능이 개선된 재조합 아데노바이러스를 제공한다.According to one aspect of the invention, the invention complements the mRNA of (a) an inverted terminal repeat (ITR) nucleotide sequence of adenovirus and (b) vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) of SEQ ID NO: 1 A nucleotide sequence encoding a small interfering RNA (siRNA) molecule that inhibits the expression of the VEGF-A gene, wherein the siRNA molecule has tumor cell killing ability, characterized by enhancing tumor cell necrosis of the adenovirus. Provided are improved recombinant adenoviruses.

본 발명자들은 외래 서열을 아데노바이러스 지놈에 삽입시키는 전략으로 아데노바이러스의 종양세포 살상능 (oncolytic activity)을 향상시키기 위하여 연구 노력한 결과, VEGF-A (vascular endothelial growth factor-A)의 mRNA를 타겟팅하는 siRNA (small interfering RNA) 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 아데노바이러스의 지놈에 삽입시켜 발현시키면 아데노바이러스의 종양세포 살상능이 크게 향상되는 것을 발견하였다.The present inventors have tried to improve the tumor cell oncolytic activity of adenoviruses by inserting foreign sequences into the adenovirus genome, and as a result, siRNA targeting mRNA of VEGF-A (vascular endothelial growth factor-A) It was found that the expression of nucleotide sequences encoding small interfering RNA molecules by inserting them into the genome of adenoviruses significantly improved tumor cell killing ability of adenoviruses.

기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 신생 혈관 형성은 종양이 성장하고 전이되는데 있어 매우 중요한 역할을 한다(16). 신생혈관 형성이 일어나기 위해서는 여러 종류의 성장인자들이 필요한데, 이들 중 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 특히 VEGF-A가 신생혈관 형성에 주로 관여함이 밝혀졌다. VEGF-A가 세포 수용체에 결합하면, 혈관내피세포의 세포분열 및 케모탁시스를 유도하고 혈관 투과도를 증가시킴으로써 새로운 혈관을 형성하거나 종양의 성장을 촉진시킨다(17-18). 오늘날 까지 확인된 인간 VEGF-A 동형체들은 7종류 (VEGF121, VEGF145, VEGF148, VEGF165, VEGF183, VEGF189 및 VEGF206)이며, VEGF-A 단일 유전자로부터 8개의 엑손으로 구성된 초기 VEGF-A mRNA가 만들어지고, 택일적 스플라이싱에 의해 7종류의 동형체들이 생성된다. 이들 isoform들 중 VEGF121의 염기서열은 모든 동형체들에 공유되어 있다(18-20). Neovascularization, in which new blood vessels form from existing vessels, plays a very important role in tumor growth and metastasis (16). Various types of growth factors are required for neovascularization to occur, of which vascular endothelial growth factor (VEGF), particularly VEGF-A, has been found to be mainly involved in neovascularization. When VEGF-A binds to cellular receptors, it induces cell division and chemotaxis of vascular endothelial cells and increases vascular permeability, forming new blood vessels or promoting tumor growth (17-18). There are seven human VEGF-A isoforms identified to date (VEGF 121 , VEGF 145 , VEGF 148 , VEGF 165 , VEGF 183 , VEGF 189 and VEGF 206 ), and the initial VEGF consisting of eight exons from a single VEGF-A gene -A mRNA is produced and seven types of isoforms are produced by alternative splicing. Of these isoforms, the nucleotide sequence of VEGF 121 is shared by all isoforms (18-20).

본 명세서에서 사용되는 용어 “VEGF-A”는 인간 VEGF-A 동형체 7종류를 모두 의미하며, 바람직하게는 VEGF121를 의미한다.As used herein, the term “VEGF-A” refers to all seven types of human VEGF-A isoforms, preferably VEGF 121 .

본 발명에 있어서, 서열목록 제1서열의 VEGF-A mRNA에 상보적인 VEGF-A 유전자의 발현을 억제하는 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 아데노바이러 스의 지놈 골격에 탑재된다. 본 발명에서 이용되는 siRNA 분자는 VEGF-A mRNA에 상보적인 서열을 포함하는데, 용어 “상보적”은 100% 상보적인 경우뿐만 아니라, RNA 방해 (interference) 기전을 통해 VEGF-A 유전자의 발현을 억제할 수 있을 정도의 불완전한 상보성도 포괄하는 의미이며, 바람직하게는 90%의 상보성, 보다 바람직하게는 98%의 상보성, 가장 바람직하게는 100%의 상보성을 의미한다. 본 명세서에서 100% 상보성을 표현하는 경우에는 “완전 상보적 (completely complementary)"으로 특별하게 기재된다.In the present invention, the nucleotide sequence encoding the siRNA molecule that suppresses the expression of the VEGF-A gene complementary to the VEGF-A mRNA of SEQ ID NO: 1 is mounted on the genome backbone of the adenovirus. The siRNA molecule used in the present invention includes a sequence complementary to VEGF-A mRNA, the term "complementary" is not only 100% complementary, but also inhibits the expression of the VEGF-A gene through RNA interference mechanism Incomplete complementarity as much as possible is also meant to encompass, preferably 90% complementarity, more preferably 98% complementarity, and most preferably 100% complementarity. When expressing 100% complementarity herein, it is specifically described as "completely complementary".

본 명세서에서 용어 “siRNA 분자”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다 (참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914).As used herein, the term “siRNA molecule” refers to a nucleic acid molecule capable of mediating RNA interference or gene silencing (see WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99). / 07409 and WO 00/44914).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 VEGF-A mRNA 서열의 379-399 뉴클레오타이드 또는 그의 일부를 포함하는 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 재언컨대, 본 발명의 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 VEGF-A mRNA 서열의 379-399 뉴클레오타이드 또는 그의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 최소 필요서열로 포함한다. 상기 379-399 뉴클레오타이드의 일부 서열은 VEGF-A 유전자 사일런싱을 매개하는 데 유효한 최소 길이 10 뉴클레오타이드 (nt), 바람직하게는 최소 15 nt, 보다 바람직하게는 최소 18 nt, 가장 바람직하게는 최소 20 nt 길이의 서열이다.According to a preferred embodiment of the invention, the nucleotide sequence encoding the siRNA molecule of the invention has a nucleotide sequence complementary to the sequence comprising 379-399 nucleotides or portions thereof of the VEGF-A mRNA sequence of SEQ ID NO: 1 . In other words, the nucleotide sequence encoding the siRNA molecule of the present invention includes a nucleotide sequence complementary to 379-399 nucleotides or a portion thereof of the VEGF-A mRNA sequence of SEQ ID NO: 1 sequence as the minimum necessary sequence. Some sequences of the 379-399 nucleotides have a minimum length of 10 nucleotides (nt), preferably at least 15 nt, more preferably at least 18 nt, most preferably at least 20 nt effective for mediating VEGF-A gene silencing. Sequence of length.

본 발명의 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기의 최소 서열 을 포함하며, 최대 100 nt, 바람직하게는 최대 50 nt, 보다 바람직하게는 최대 40 nt, 보다 더 바람직하게는 최대 30 nt, 가장 바람직하게는 19-25 nt이다.The nucleotide sequence encoding the siRNA molecule of the present invention comprises the minimum sequence described above, at most 100 nt, preferably at most 50 nt, more preferably at most 40 nt, even more preferably at most 30 nt, most preferably Is 19-25 nt.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the nucleotide sequence encoding the siRNA molecule of the present invention comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 sequence.

본 발명의 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 캐리어가 ds DNA 지놈을 갖는 아데노바이러스이기 때문에, DNA 분자가 바람직하다.The nucleotide sequence encoding the siRNA molecule of the present invention is preferably a DNA molecule because the carrier is an adenovirus having a ds DNA genome.

본 발명의 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, siRNA 분자를 코딩하는 일반적인 서열과 같이, 센스 가닥 (VEGF-A mRNA 서열에 상응하는 (corresponding) 서열)과 안티센스 가닥 (VEGF-A mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 자기-상보성 (self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.Nucleotide sequences encoding siRNA molecules of the invention, like the general sequences encoding siRNA molecules, are complementary to the sense strand (corresponding sequence corresponding to the VEGF-A mRNA sequence) and the antisense strand (VEGF-A mRNA sequence). Sequences) may be positioned opposite each other to form a double chain. In addition, according to another embodiment, the nucleotide sequence encoding the siRNA molecule of the present invention may have a single chain structure having self-complementary sense and antisense strands.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 자기-상보성 (self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열 (예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가지며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the nucleotide sequence encoding the siRNA molecule of the present invention comprises a short nucleotide sequence (eg, about 5-15 nt) inserted between the self-complementary sense and antisense strands. In this case, siRNA molecules formed by the expression of the nucleotide sequence form a hairpin structure by intramolecular hybridization, and form a stem-and-loop structure as a whole. This stem-and-loop structure is processed in vitro or in vivo to produce an active siRNA molecule capable of mediating RNAi.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 VEGF-A mRNA 서열의 379-399 뉴클레오타이드 또는 그의 일부를 포함하는 서열에 해당하는 서열 (corresponding sequence) 및 상보적인 서열 (complementary sequence)을 가지며, 상기 해당하는 서열과 상보적인 서열 사이에 헤어핀 구조를 형성하게 하는 서열 (5-15 nt, 바람직하게는 8-12 nt)이 삽입되어 있다.According to a preferred embodiment of the invention, the nucleotide sequence encoding the siRNA molecule is a corresponding sequence and complement corresponding to the sequence comprising 379-399 nucleotides or portions thereof of the VEGF-A mRNA sequence of SEQ ID NO: 1 A sequence (5-15 nt, preferably 8-12 nt) having a complementary sequence and allowing a hairpin structure to be formed between the corresponding sequence and the complementary sequence is inserted.

보다 바람직하게는, siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 보다 더 바람직하게는 제3서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열목록 제3서열에서 "n"은 루프 (헤어핀) 구조를 형성시킬 수 있는 어떠한 염기도 가능하며, 길이는 5-15 nt, 바람직하게는 8-12 nt이다. 가장 바람직하게는, siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.More preferably, the nucleotide sequence encoding the siRNA molecule comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, even more preferably comprises the nucleotide sequence of the third sequence. "N" in SEQ ID NO: 3 may be any base capable of forming a loop (hairpin) structure and is 5-15 nt in length, preferably 8-12 nt. Most preferably, the nucleotide sequence encoding the siRNA molecule comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.

VEGF-A를 타겟팅하는 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 아데노바이러스 지놈에 탑재된다. siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트 (expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, siRNA-코딩 뉴클레오타이드 서열은 프로머터에 작동적으로 연결되는 (operatively linked) 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, siRNA-코딩 뉴클레오타이드 서열에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 siRNA-코딩 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, U6 프로모터, H1 프로모터, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 유도성 (inducible) 프로모터, 암세포 특이적 프로모터 (예컨대, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 및 AFP 프로모터) 및 조직 특이적 프로모터 (예컨대, 알부민 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, U6 프로모터이다.The nucleotide sequence encoding the siRNA molecule targeting VEGF-A is loaded into the adenovirus genome. The nucleotide sequence encoding the siRNA molecule is preferably present in a suitable expression construct. In the expression construct, the siRNA-coding nucleotide sequence is preferably operatively linked to the promoter. As used herein, the term “operably linked” refers to a functional binding between a nucleic acid expression control sequence (eg, an array of promoters, signal sequences, or transcriptional regulator binding sites) and other nucleic acid sequences, thereby The regulatory sequence will control the transcription and / or translation of said other nucleic acid sequence. In the present invention, a promoter bound to an siRNA-coding nucleotide sequence is preferably capable of controlling transcription of the siRNA-coding nucleotide sequence by operating in an animal cell, more preferably a mammalian cell, which is derived from a mammalian virus. And promoters derived from genomes of mammalian cells, such as U6 promoter, H1 promoter, cytomegalo virus (CMV) promoter, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, tk promoter of HSV , RSV promoter, EF1 alpha promoter, metallothionine promoter, beta-actin promoter, promoter of human IL-2 gene, promoter of human IFN gene, promoter of human IL-4 gene, promoter of human lymphotoxin gene, human GM -CSF gene promoter, inducible promoter, cancer cell specific Promoter (for example, TERT promoter, PSA promoter, PSMA promoter, CEA promoter, E2F promoter, and the AFP promoter) and a tissue specific promoter, including, (e. G., Albumin promoter), and the like. Most preferably, it is a U6 promoter.

암을 대상으로 유전자 치료를 시행하는 경우에는 일생동안 치료 유전자의 발현을 지속시킬 필요가 없고, 국소 투여할 경우에 아데노바이러스에 의한 면역반응이 크게 문제시 되지 않거나, 오히려 장점이 될 수 있기 때문에 아데노바이러스를 이용한 암유전자 치료제 개발 연구가 활발하게 이루어지고 있다(23-25). 따라서, 본 발명에서도 기본적으로 아데노바이러의 지놈 골격을 이용하여 암의 유전자 치료를 달성하고 있다.In the case of gene therapy for cancer, adenosine does not need to sustain the expression of the therapeutic gene for life, and when administered locally, the adenovirus immune response may not be a major problem or may be an advantage. Research into the development of cancer gene therapy using viruses has been actively conducted (23-25). Therefore, in the present invention, gene therapy of cancer is basically achieved using the genome skeleton of adenovirus.

아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광 범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.Adenoviruses are widely used as gene transfer vectors because of their medium genome size, ease of manipulation, high titers, wide range of target cells and excellent infectivity. Both ends of the genome contain 100-200 bp of Inverted Terminal Repeat (ITR), which is an essential cis element for DNA replication and packaging. The genome El region (E1A and E1B) encodes proteins that regulate transcription and transcription of host cell genes. The E2 regions (E2A and E2B) encode proteins that are involved in viral DNA replication.

아데노바이러스 지놈의 작은 부분만이 cis에서 필요한 것으로 알려져 있기 때문에 (Tooza, J. Molecular biology of DNA Tumor viruses, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1981)), 아네노바이러스는 대량의 외래 DNA 분자를 운반할 수 있는 능력이 있으며, 이는 특히 293과 같은 특정 세포주를 이용하는 경우에 그러하다. 이러한 측면에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스에 있어서, siRNA-코딩 뉴클레오타이드 서열 이외에 다른 아데노바이러스의 서열은 적어도 ITR 서열을 포함한다.Because only a small portion of the adenovirus genome is known to be required in cis (Tooza, J. Molecular biology of DNA Tumor viruses , 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1981)), Has the ability to carry foreign DNA molecules, especially when using certain cell lines such as 293. In this aspect, in the recombinant adenovirus of the present invention, the sequence of other adenoviruses in addition to the siRNA-coding nucleotide sequence comprises at least an ITR sequence.

siRNA-코딩 뉴클레오타이드 서열은 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 E3 영역에 삽입된다. 한편, 다른 외래 뉴클레오타이드 서열 (예: 사이토카인, 면역-보조자극 인자, 자살 유전자 및 종양 억제 유전자)도 추가적으로 아데노바이러스에 포함시킬 수 있으며, 이는 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역)에 삽입된다. 또한, 상기 삽입 서열들은 E4 영역에도 삽입될 수 있다. The siRNA-coding nucleotide sequence is preferably inserted into the E1 region (E1A region and / or E1B region, preferably E1B region) or E3 region, more preferably in the E3 region. On the other hand, other foreign nucleotide sequences (e.g., cytokines, immune-suppressive factors, suicide genes and tumor suppressor genes) may additionally be included in the adenovirus, which is an E1 region (E1A region and / or E1B region, preferably It is preferably inserted into an E1B region or an E3 region, more preferably in an E1 region (E1A region and / or E1B region, preferably E1B region). In addition, the insertion sequences may be inserted in the E4 region.

또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다. 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.In addition, because adenovirus can pack up to about 105% of the wild-type genome, about 2 kb can be additionally packaged. Thus, the above-described foreign sequence inserted into the adenovirus may additionally bind to the genome of the adenovirus.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 비활성화된 E1B 19 유전자, E1B 55 유전자 또는 E1B 19/E1B 55 유전자를 갖는다. 본 명세서에서, 유전자와 관련하여 사용되는 용어 “비활성화”는 그 유전자의 전사 및/또는 해독이 정상적으로 이루어지지 아니하여, 그 유전자에 의해 코딩되는 정상적인 단백질의 기능이 나타나지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 비활성화 E1B 19 유전자는 그 유전자에 변이 (치환, 부가, 부분적 결실 또는 전체적 결실)가 발생되어 활성의 E1B 19 kDa 단백질을 생성하지 못하는 유전자이다. E1B 19가 결실되는 경우에는 세포고사능을 증가시킬 수 있고, E1B 55 유전자가 결실된 경우에는 종양세포 특이성을 갖게 한다 (참조: 특허출원 제2002-23760호). 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, “결실”은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다. In a preferred embodiment of the invention, the recombinant adenovirus of the invention has an inactivated E1B 19 gene, E1B 55 gene or E1B 19 / E1B 55 gene. As used herein, the term “inactivation” as used in connection with a gene means that the transcription and / or translation of the gene is not performed normally, so that the function of the normal protein encoded by the gene does not appear. For example, an inactivated E1B 19 gene is a gene in which a mutation (substitution, addition, partial deletion or total deletion) occurs in that gene, resulting in no active E1B 19 kDa protein. Deletion of E1B 19 may increase cytotoxicity, and deletion of E1B 55 gene results in tumor cell specificity (Patent Application 2002-23760). As used herein, the term "deletion" as used in connection with a viral genome sequence has the meaning including not only a complete deletion of the sequence, but also a partial deletion.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 활성의 E1A 유전자를 포함한다. E1A 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스는 복제 가능한 특성을 갖게 된다. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 비활성화된 E1B 19 유전자 및 활성의 E1A 유전자를 포함한다. 본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 비활성화된 E1B 19 유전자 및 활성의 E1A 유전자를 포함하고, siRNA-코딩 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E3 영역에 삽입되어 있는 것이다 (예: 도 3e). 도 3e의 유전자 지도에 있어서, shRNA는 VEGF-A 유전자 발현을 억제하기 위한 siRNA를 나타내며, 이의 상세한 내용은 위에 기재되어 있는 것과 동일하다.According to a preferred embodiment of the invention, the recombinant adenovirus of the invention comprises an active E1A gene. Recombinant adenoviruses comprising the E1A gene will have replicable properties. According to a more preferred embodiment of the invention, the recombinant adenovirus of the invention comprises an inactivated E1B 19 gene and an active E1A gene. According to a further preferred embodiment of the invention, the recombinant adenovirus of the invention comprises an inactivated E1B 19 gene and an active E1A gene, wherein the siRNA-coding nucleotide sequence is inserted into the deleted E3 region (e.g., 3e). In the genetic map of FIG. 3E, shRNA represents siRNA for inhibiting VEGF-A gene expression, the details of which are the same as described above.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 비활성화된 E1B 19 유전자 및 변이된 활성의 E1A 유전자를 포함하고, siRNA-코딩 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E3 영역에 삽입되어 있는 것이다 (예: 도 3d). 여기서 변이된 활성의 E1A 유전자는 Rb (retinoblastoma 단백질) 결합 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 중에서 45번째 Glu 잔기가 Gly으로 치환된 변이 및 121-127번째 아미노산 서열이 전체적으로 Gly으로 치환된 변이를 갖는다.According to the most preferred embodiment of the invention, the recombinant adenovirus of the invention comprises an inactivated E1B 19 gene and a mutated active E1A gene, wherein the siRNA-coding nucleotide sequence is inserted into the deleted E3 region (eg : Figure 3d). Herein, the mutated active E1A gene has a mutation in which the 45th Glu residue is replaced by Gly in the nucleotide sequence encoding the Rb (retinoblastoma protein) binding site, and the Gly by the 121-127 amino acid sequence as a whole.

종양 세포에서는 p53 단백질의 변이뿐 아니라 Rb의 돌연변이 혹은 Rb 관련 신호기전이 상당부분 손상되어 있기 때문에, Rb와의 결합능이 소실된 아데노바이러스는 정상 세포에서는 Rb의 활성으로 아데노바이러스의 복제가 억제 되지만 Rb의 기능이 억제된 종양 세포에서는 활발하게 복제되어 암세포를 선택적으로 살상할 수 있다(26, 27). 따라서, 상술한 Rb 결합 부위에서의 변이를 포함하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 암세포 특이성이 매우 우수하다.Because tumor mutations, as well as mutations in Rb or Rb-related signaling mechanisms, are largely impaired in p53 proteins, adenoviruses that lose their ability to bind to Rb can inhibit replication of adenovirus due to Rb activity in normal cells. Tumor cells that are inhibited in function can be actively replicated to selectively kill cancer cells (26, 27). Therefore, the recombinant adenovirus of the present invention including the mutation at the Rb binding site described above is very excellent in cancer cell specificity.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 도 3b 및 도 3d-도 3I로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자 지도를 갖는다. 보다 바람직하게는, 도 3d-도 3I의 유전자 지도를 가지며, 보다 더 바람직하게는 도 3d-도 3f의 유전자 지도를 가지고, 가장 바람직하게는 도 3d의 유전자 지도를 갖는다.According to a preferred embodiment of the present invention, the recombinant adenovirus of the present invention has a genetic map selected from the group consisting of FIGS. 3B and 3D-I. More preferably, it has a genetic map of FIGS. 3D-3I, even more preferably a genetic map of FIGS. 3D-3F, most preferably a genetic map of FIG. 3D.

하기의 실시예에서 예증된 바와 같이, VEGF-A 특이적 siRNA를 발현하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 모든 종류의 VEGF-A 동형체의 발현을 저해하여 종양내 신생혈관의 형성을 선택적으로 억제함으로써 항종양 효과를 극대화한다. 그리고 VEGF-A 특이적 siRNA를 발현하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 낮은 역가의 바이러스로도 높은 살상 효과를 유도할 수 있기 때문에 투여된 체내에서서의 안전성이 매우 우수하다.As exemplified in the Examples below, the recombinant adenovirus of the present invention expressing VEGF-A specific siRNA inhibits the expression of all types of VEGF-A isoforms to selectively inhibit the formation of neovascularization in tumors. Maximizes antitumor effects In addition, the recombinant adenovirus of the present invention expressing VEGF-A specific siRNA is highly excellent in the administered body because it can induce a high killing effect even with a low titer virus.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 VEGF-A 특이적 siRNA를 발현하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a therapeutically effective amount of the recombinant adenovirus of the present invention expressing the above-described VEGF-A specific siRNA; And (b) provides a pharmaceutical anti-tumor composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명의 약제학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 재조합 아데노바이러스는 상술한 본 발명의 재조합 아데노바이러스와 동일한 것이므로, 재조합 아데노바이러스에 대한 상세한 설명은 본 발명의 약제학적 조성물에도 그대로 적용된다. 따라서, 본 명세서의 불필요한 반복 기재에 의한 과도한 복잡성을 피하기 위하여 공통 사항은 그 기재를 생략한다.Since the recombinant adenovirus included as an active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention is the same as the recombinant adenovirus of the present invention described above, the detailed description of the recombinant adenovirus also applies to the pharmaceutical composition of the present invention as it is. Therefore, in order to avoid excessive complexity by unnecessary repetitive description of this specification, common description is abbreviate | omitted.

본 발명에서 개발된 VEGF-A 특이적 siRNA를 발현하는 재조합 아데노바이러스는 신생혈관 형성을 효과적으로 억제하여 항종양 효과가 현격히 증대되며, 특히 E1B 55 유전자가 비활성화 되거나 E1A에서 Rb 결합 부위가 변이가 된 경우에는, 암세포 특이성이 매우 우수하다. 이는 결과적으로 암치료에 필요한 바이러스 투여량을 감소시킬 수 있어 바이러스에 의한 생체내 독성과 면역반응을 크게 줄일 수 있다.The recombinant adenovirus expressing the VEGF-A specific siRNA developed in the present invention effectively inhibits neovascularization and significantly increases the antitumor effect, particularly when the E1B 55 gene is inactivated or the Rb binding site is mutated in E1A. Cancer cell specificity is very excellent. As a result, the virus dose required for cancer treatment can be reduced, greatly reducing in vivo toxicity and immune response by the virus.

본 발명의 조성물에 포함되는 재조합 아데노바이러스는, 다양한 종양 세포에 대하여 살상 효능을 나타내므로, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 뇌암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 식도암, 췌장암, 방광암, 전립선암, 대장암, 결장암 및 자궁경부암 등의 치료에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 (ⅰ) 종양 세포 형성의 예방; (ⅱ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 억제; 및 (ⅲ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 “치료학적 유효량”은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.Since the recombinant adenovirus included in the composition of the present invention exhibits killing efficacy against various tumor cells, the pharmaceutical composition of the present invention can be used for various diseases or diseases associated with tumors such as brain cancer, gastric cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, It can be used for the treatment of liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, prostate cancer, colon cancer, colon cancer and cervical cancer. As used herein, the term “treatment” means (i) prevention of tumor cell formation; (Ii) inhibition of a disease or condition associated with the tumor following removal of the tumor cells; And (iii) alleviation of a disease or disorder associated with a tumor following removal of tumor cells. Thus, the term “therapeutically effective amount” herein means an amount sufficient to achieve the above pharmacological effect.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.Pharmaceutically acceptable carriers included in the compositions of the present invention are those commonly used in the formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, but are not limited thereto. no. In addition to the above components, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 종양내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하 여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is preferably parenteral, and may be administered using, for example, intravenous administration, intraperitoneal administration, intratumoral administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, or topical administration. Intraperitoneal administration in ovarian cancer and in the portal vein in liver cancer can be administered by infusion method, in the case of breast cancer can be directly injected into the tumor mass, in the case of colon cancer by direct injection into the enema In the case of bladder cancer, it may be administered by injection directly into the catheter.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 1 × 105 - 1 × 1015 PFU/㎖의 재조합 아데노바이러스를 포함하며, 통상적으로 1 × 1010 PFU를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사한다.Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the invention vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex of the patient, degree of disease symptom, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction. In general, the skilled practitioner can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment. In general, the pharmaceutical compositions of the present invention comprise 1 × 10 5 -1 × 10 15 PFU / mL of recombinant adenovirus, and typically are injected 1 × 10 10 PFU once every two days for two weeks.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention are prepared in unit dosage form by being formulated with pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients, according to methods which may be readily practiced by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporating into a multi-dose container. In this case, the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 프로카르바진 (procarbazine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실 (chlorambucil), 비술판 (bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리코마이신 (plicomycin), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide), 탁목시펜 (tamoxifen), 택솔 (taxol), 트랜스플라티눔 (transplatinum), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 빈크리스틴 (vincristin), 빈블라스틴 (vinblastin) 및 메토트렉세이트 (methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.The pharmaceutical composition of the present invention may be used as a single therapy, but may also be used in combination with other conventional chemotherapy or radiation therapy, and when the combination therapy is performed, cancer treatment may be more effectively performed. Chemotherapeutic agents that can be used with the compositions of the present invention are cisplatin, carboplatin, procarbazine, mechlorethamine, cyclophosphamide, phospho Ifosfamide, melphalan, chlorambucil, bisulfan, nitrosourea, diactinomycin, daunorubicin, doxorubicin , Bleomycin, plicomycin, mitomycin, etoposide, tamoxifen, taxol, transplatinum, 5-fluoro 5-urauracil, vincristin, vinblastin, methotrexate and the like. Radiation therapy that can be used with the composition of the present invention is X-ray irradiation, γ-ray irradiation, and the like.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 VEGF-A (vascular endothelial growth factor-A) mRNA 서열의 379-399 뉴클레오타이드 또는 그의 일부를 포함하는 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 가지는 VEGF-A 유전자 발현 억제용 siRNA 분자 또는 이를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.According to another aspect of the invention, the invention has a nucleotide sequence complementary to a sequence comprising 379-399 nucleotides or portions thereof of the vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) mRNA sequence of SEQ ID NO: 1 Provided is an siRNA molecule for inhibiting VEGF-A gene expression or a nucleotide sequence encoding the same.

VEGF-A를 타겟팅하는 본 발명의 siRNA-코딩 뉴클레오타이드 서열은 위에 기재된 내용을 인용하여 보다 상세하게 설명된다.The siRNA-coding nucleotide sequences of the present invention targeting VEGF-A are described in more detail by citing the above description.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .

실시예Example

실험재료 및 방법Experimental Materials and Methods

1. 세포주 및 세포배양1. Cell line and cell culture

실험에 사용된 세포주들은 인체 뇌암세포주 (U343, U87MG), 간암세포주 (SK-Hep1, Hep3B), 폐암세포주 (A549), 자궁암세포주 (C33A), 만성 골수성 류케미아 세포주 (chronic myelogenous leukemia cell line, K562) 및 인간 제대혈관 내피 세포 (human umbilical vascular endothelial cell: HUVEC)이며, 모두 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)에서 구입하였다. 그리고 아데노바이러스 초기 발현 유전자인 E1 부위가 숙주 유전체 내에 내재되어 있는 HEK293 세포주(ATCC)를 아데노바이러스 생산 세포주로 사용하였다. Hep3B를 제외한 모든 세포주들은 10%의 우태아 혈청 (Gibco-BRL, Grand Island, NY)이 포함된 DMEM 배양액 (항생제 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco-BRL) 함유)에서 5% CO2의 존재 하에 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. Hep3B 와 HUVEC 세포주는 같은 조건하에 MEM (Gibco-BRL) 와 M199 (Invitrogen) 배양액으로 각각 배양하였다.The cell lines used in the experiment were human brain cancer cell lines (U343, U87MG), liver cancer cell lines (SK-Hep1, Hep3B), lung cancer cell lines (A549), uterine cancer cell lines (C33A), chronic myelogenous leukemia cell lines (K562). ) And human umbilical vascular endothelial cells (HUVEC), both purchased from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). In addition, the HEK293 cell line (ATCC) in which the E1 site, which is an adenovirus early expression gene, is embedded in the host genome was used as an adenovirus producing cell line. All cell lines except Hep3B were 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 in DMEM cultures containing 10% fetal bovine serum (Gibco-BRL, Grand Island, NY) (containing antibiotic penicillin / streptomycin (Gibco-BRL)). The cells were incubated in an incubator. Hep3B and HUVEC cell lines were cultured in MEM (Gibco-BRL) and M199 (Invitrogen) cultures under the same conditions.

2. 실험 동물2. Experimental Animal

생체내 항종양 실험은 6-8주령의 수컷 누드 생쥐 (BALB/c-nu)를 SLC(Japan SLC, Inc., Japan)에서 구입하여 사용하였다. 동물 사육실의 온도는 22± 2℃, 습도는 55-60%로 유지시켰으며, 명암 순환이 12 시간 단위로 조절되게 하였고, 방사선 조사로 멸균한 고형사료 (중앙실험동물, Seoul, Korea)와 멸균된 급수를 자유로이 섭취하게 하였다.In vivo anti-tumor experiments were performed using 6-8 week old male nude mice (BALB / c-nu) purchased from SLC (Japan SLC, Inc., Japan). The temperature of the animal breeding room was maintained at 22 ± 2 ℃, the humidity was 55-60%, the contrast cycle was controlled every 12 hours, and the sterilized solid feed (Central Laboratory Animal, Seoul, Korea) and sterilization The water supply was freely consumed.

3. 3. VEGFVEGF -A에 특이적인 Specific to -A shRNAshRNA 을 발현하는 플라스미드 벡터 제작Plasmid vector expression

VEGF-A의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 siRNA 염기서열을 선정하기 위하여, 2 종류의 siRNA 염기서열 (siVEGF-1; 5'-AAGTTCATGGATGTCTATCAG-3', siVEGF-2; 5'-AAATGTGAATGCAGACCAAAG-3')을 siRNA 염기 서열 선정 프로그램(dharmacon.com)을 이용하여 선별하였다 (도 1a). siVEGF-1 또는 siVEGF-2의 센스 및 안티센스 서열이 9개의 염기 (ttcaagaga)로 구성된 루프를 사이에 두고 위치하고, 양 끝에 BamHI과 HindIII 제한효소 염기서열을 가진 68개의 염기로 구성된 올리고뉴클레오타드와 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 각각 합성하였다 (도 1b). 합성된 올리고뉴클레오타이드들을 95℃에서 5분 동안 가열하여 변성시키고 서서히 감온시켜 서로 어닐링되도록 한 후, BamHI 부위와 HindIII 부위를 절단하여 siRNA 클로닝 벡터인 pSilencer 2.0-U6 (Ambion, Austin, TX)에 삽입시켜 pSilencer-U6-shVEGF-1 및 pSilencer-U6-shVEGF-2를 각각 제작하였다.In order to select siRNA sequences that can effectively inhibit the expression of VEGF-A, two kinds of siRNA sequences (siVEGF-1; 5'-AAGTTCATGGATGTCTATCAG-3 ', siVEGF-2; 5'-AAATGTGAATGCAGACCAAAG-3') Were selected using the siRNA sequencing program (dharmacon.com) (FIG. 1A). Oligonucleotides consisting of 68 bases with the sense and antisense sequences of siVEGF-1 or siVEGF-2 interspersed with a loop consisting of 9 bases (ttcaagaga) with BamH I and Hind III restriction enzyme sequences at both ends And oligonucleotides complementary thereto were synthesized (FIG. 1B). By a synthetic oligonucleotide was modified to heat the nucleotides at 95 ℃ for 5 minutes, slowly thermosensitive After allowing annealing to each other, the BamH I site and the Hind III site cut by siRNA cloning vectors in pSilencer 2.0-U6 (Ambion, Austin , TX) for PSilencer-U6-shVEGF-1 and pSilencer-U6-shVEGF-2 were prepared by insertion.

4. 4. shRNAshRNA 에 의한 On by VEGFVEGF -A 전사 억제 확인-A transcription inhibition confirmation

상기에서 제작된 2 종류의 shRNA를 발현하는 pSilencer-U6-shVEGF-1 및 pSilencer-U6-shVEGF-2 플라스미드를 음성 대조군인 pSilencer-U6 플라스미드와 함께 K562 세포주에 형질전환 하였다. 형질전환 후 48시간 경에, RNeasy 미니 키트 (Cat. #74104; Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 RNA를 분리한 다음, VEGF-A를 검출할 수 있는 프라이머 세트 (센스 프라이머; 5'-CTACCTCCACCATGCCAAGT-3', 안티센스 프라이머; 5'-ATGTTGGACTCCTCAGTGGG-3')를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 VEGF-A의 mRNA 양을 비교 검증하였다.PSilencer-U6-shVEGF-1 and pSilencer-U6-shVEGF-2 plasmids expressing two kinds of shRNAs prepared above were transformed into a K562 cell line together with a pSilencer-U6 plasmid as a negative control. 48 hours after transformation, RNA was isolated using RNeasy mini kit (Cat. # 74104; Qiagen, Valencia, Calif.), Followed by a primer set (sense primer; 5'-CTACCTCCACCATGCCAAGT) to detect VEGF-A. RT-PCR was performed using -3 ', antisense primer; 5'-ATGTTGGACTCCTCAGTGGG-3') to compare and verify mRNA levels of VEGF-A.

5. 5. 아데노바이러스들의Of adenoviruses 제작, 생산 및  Production, production and 역가Titer 산출 Calculation

아데노바이러스의 E1 부위에서 LacZ 유전자를 발현하고, E3 부위에서 U6 프로모터에 의해 shVEGF를 발현하는 복제 불능 아데노바이러스를 제작하기 위하여, 먼저 상기에서 제작된 pSilencer-U6-shVEGF-2를 EcoRI과 HindⅢ 제한효소로 처리하여 U6 프로머터와 shVEGF-2 부위로 구성된 402 bp 크기의 DNA 절편을 잘라낸 뒤, 이를 아데노바이러스 E3 셔틀벡터인 pSP72-E3 (Cancer Gene Therapy, 12:61-71( 2005))에 삽입하여 pSP72-E3-U6-shVEGF-2 셔틀벡터를 제작하였다. 제작된 E3 셔틀벡터를 XmnI 제한효소로 처리하여 선형화시키고, E1과 E3 유전자가 소실된 복제 불능 아데노바이러스인 dl324 (스위스국 Fribourgh 대학의 Verca 박사; Heider, H. et al., Biotechniques, 28(2):260-265, 268-270(2000))의 소실된 E1 부위에 표지 유전자로서 LacZ가 삽입된 바이러스 벡터인 dl-Z를 SpeI 제한효소를 처리하여 선형화시킨 뒤, 이들을 함께 대장균 BJ5183 (스위스국 Fribourgh 대학의 Verca 박사; Heider, H. et al., Biotechniques, 28(2):260-265, 268-270(2000))에 동시 형질전환시켜 유전자 상동 재조합 (homologous recombination)을 유도하여 LacZ 유전자와 VEGF-A 특이적 shRNA를 동시에 발현하는 복제 불능 아데노바이러스 벡터인 dl-Z-shVEGF를 제작하였다 (도 3a). In order to prepare a non-replicating adenovirus expressing the LacZ gene at the E1 site of the adenovirus and expressing the shVEGF by the U6 promoter at the E3 site, pSilencer-U6-shVEGF-2 prepared above was used as EcoR I and Hind III. Treatment with restriction enzymes cut a 402 bp DNA fragment consisting of the U6 promoter and shVEGF-2 site, which was then transferred to the adenovirus E3 shuttle vector pSP72-E3 ( Cancer Gene Therapy , 12: 61-71 (2005)). PSP72-E3-U6-shVEGF-2 shuttle vector was constructed by insertion. The produced E3 shuttle vector was linearized by treatment with Xmn I restriction enzyme and dl324 , a non-replicating adenovirus that lost the E1 and E3 genes (Verca, Dr. Verca of Fribourgh University, Switzerland; Heider, H. et al., Biotechniques , 28 ( 2): 260-265, 268-270 (2000)), dl-Z, a viral vector with LacZ inserted as a marker gene, was linearized by Spe I restriction enzymes, and then co-cultured with E. coli BJ5183 ( Dr. Verca of the University of Fribourgh, Switzerland; Heider, H. et al., Biotechniques , 28 (2): 260-265, 268-270 (2000)) induce homologous recombination by inducing homologous recombination. Dl-Z-shVEGF, a non-replicating adenovirus vector expressing genes and VEGF-A specific shRNAs simultaneously, was constructed (FIG. 3A).

VEGF-A 특이적 shRNA를 발현하는 종양 특이적 살상 아데노바이러스를 제작하기 위해서는, 상기에서 제작된 pSP72-E3-U6-shVEGF-2 아데노바이러스 E3 셔틀벡터를 XmnI 제한효소로 처리하여 선형화시킨 뒤, SpeI 제한효소를 처리하여 선형화 된 pAd-ΔB7 아데노바이러스 토탈 벡터 (E1A의 Rb 결합 부위가 변이되고, E1B 19kDa 유전자와 E1B 55kDa 유전자가 함께 소실된 종양 특이적 살상 아데노바이러스; KCCM-10569)와 함께 대장균 BJ5183에서 동시 형질전환시켜 pAd-ΔB7-shVEGF 종양 선택적 살상 아데노바이러스 벡터를 제작하였다 (도 3b). 상동 재조합된 아데노바이러스 벡터들을 HindⅢ 제한효소로 처리하여 상동 재조합 유무를 확인한 후, 확인된 플라스미드들은 PacI 제한효소로 절단한 뒤 HEK293 세포주 (Microbix, 캐나다국)에 형질전환하여 Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스를 생산하였다. 대조군으로 사용된 바이러스들은 E1 부위가 완전히 결손되고 LacZ 유전자를 발현하는 복제가 불가능한 dl-Z 아데노바이러스와 E1B 55kDa 유전자가 결손된 Ad-ΔE1B55 (YKL-1; 대한민국 특허출원 제1999-33011호 참조), E1A 부위의 Rb 결합 부위가 변이되고, 동시에 E1B 19kDa와 E1B 55kDa유전자들이 모두 결손된 Ad-ΔB7(12, 14; KCCM- 10569)이며, 각각의 아데노바이러스는 HEK293 세포주에서 증식시켜 CsCl 농도구배로 농축하여 순수 분리하였으며, 한계희석분석 (limiting titration assay) 또는 플라크 분석으로 역가 (plaque forming unit: PFU)를 산출하였다 (Hitt, M. et. al., Construction and propagation of human adenovirus vectors. Cell biology: a laboratory handbook. New York: Academic Press Inc, 479-490(1994)).In order to prepare tumor specific killing adenovirus expressing VEGF-A specific shRNA, the pSP72-E3-U6-shVEGF-2 adenovirus E3 shuttle vector prepared above was linearized by treatment with Xmn I restriction enzyme. With a pAd-ΔB7 adenovirus total vector linearized by treatment of Spe I restriction enzyme (tumor specific killing adenovirus with mutations in the Rb binding site of E1A and loss of E1B 19kDa gene and E1B 55kDa gene; KCCM-10569) Co-transfection in E. coli BJ5183 produced a pAd-ΔB7-shVEGF tumor selective killing adenovirus vector (FIG. 3B). After homologous recombination adenovirus vectors were treated with Hind III restriction enzymes to confirm homologous recombination, the identified plasmids were digested with Pac I restriction enzyme and transformed into HEK293 cell line (Microbix, Canada) to ad-ΔB7-shVEGF. Adenovirus was produced. Viruses used as controls include dl-Z adenovirus, a non-replicable dl-Z adenovirus expressing the LacZ gene, and Ad-ΔE1B55 lacking the E1B 55kDa gene (YKL-1; see Korean Patent Application No. 1999-33011). , Rb binding site of the E1A site is mutated, and at the same time E1B 19kDa and E1B 55kDa genes are both deleted Ad-ΔB7 (12, 14; KCCM-10569), each adenovirus is propagated in the HEK293 cell line to a CsCl concentration gradient Concentration and pure separation were performed, and the titer (plaque forming unit (PFU)) was calculated by limiting titration assay or plaque analysis (Hitt, M. et. Al., Construction and propagation of human adenovirus vectors.Cell biology: a laboratory handbook.New York: Academic Press Inc, 479-490 (1994).

6. 6. VEGFVEGF -A 특이적 -A specific shRNAshRNA 를 발현하는 Expressing 아데노바이러스에Adenovirus 의한  by VEGFVEGF -A 발현 억제 검증-A expression suppression verification

VEGF-A 특이적 shRNA를 발현하는 아데노바이러스에 의해 VEGF-A의 발현이 효과적으로 억제되는지를 검증하기 위하여, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)를 시행하였다. 먼저 여러 종류의 인체 암세포주들인 뇌암세포주(U343, U87MG), 간암세포주(SK-Hep1, Hep3B), 폐암세포주(A549) 그리고 자궁암세포주(C33A)를 6-웰 플레이트에 각각 분주한 뒤, 다음날 아데노바이러스를 여러 농도의 MOI (multiplicity of infection)로 감염시키고 2 시간 후, 5% DMEM 배지로 교체하였다. 바이러스 감염 후 72, 96 시간에 배지를 수득하고, 3000 rpm으로 원심분리하여 상층액을 분리한 뒤, 이 중 100 ㎕의 상층액을 이용하여 VEGF-A ELISA 분석을 시행하였다. ELISA의 전과정은 인간 VEGF Quantikine Immunoassay (R & D Systems, Minneapolis, MN) 제조회사가 제시한 방법에 따라 시행하였다. 배지를 회수한 후, 남아있는 세포는 150 ㎕의 차가운 라이시스 용액으로 세포를 용해시킨 다음, 10,000 x g에서 15분간 원심분리하여 단백질을 분리하고, 단백질 분석 키트 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 세포내 단백질 양을 정량하였다. ELISA 분석에 의해 산출된 VEGF-A 양을 세포내 단백질 양으로 보정하였다.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to verify whether the expression of VEGF-A is effectively inhibited by adenovirus expressing VEGF-A specific shRNA. First, various types of human cancer cell lines, brain cancer cell lines (U343, U87MG), liver cancer cell lines (SK-Hep1, Hep3B), lung cancer cell lines (A549) and uterine cancer cell lines (C33A) were divided into 6-well plates, and then adeno Viruses were infected with different concentrations of multiplicity of infection (MOI) and after 2 hours, they were replaced with 5% DMEM medium. Media was obtained 72, 96 hours after virus infection, and the supernatant was separated by centrifugation at 3000 rpm, and then 100 μl of the supernatant was used for VEGF-A ELISA analysis. The whole process of ELISA was performed according to the method suggested by the human VEGF Quantikine Immunoassay (R & D Systems, Minneapolis, MN). After recovering the medium, the remaining cells were lysed with 150 μl of cold lysate solution, then centrifuged at 10,000 × g for 15 minutes to separate proteins and protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). ) Was used to quantify the amount of intracellular protein. The amount of VEGF-A calculated by the ELISA assay was corrected with the amount of intracellular protein.

7. 7. 관형성Tubular formation 분석 (Tube Formation Assay) Analysis (Tube Formation Assay)

VEGF-A 특이적 shRNA 발현에 따른 VEGF-A의 감소로 혈관내피세포의 관형성 기능이 억제되는지를 알아보기 위해서, HUVEC 세포를 이용하여 관형성 분석을 시행하였다. 먼저, 250 ㎕의 성장인자-감소 마트리젤 (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA)을 24-웰 플레이트에 천천히 흔들어서 균일하게 분주한 뒤, 37℃에서 30분간 중합반응을 실시하였다. HUVEC (3-5 계대 배양) 세포는 6시간 동안 1% FBS을 포함한 M199 배지에서 배양하여 혈청기아한 뒤, 트립신을 처리하여 세포수를 측정하였다. 마트리젤이 분주된 24-웰 플레이트에 혈청기아 전처리 된 HUVEC (2 x 105 cells/well) 세포를 200 MOI의 dl-Z 또는 dl-shVEGF로 감염하여 96시간 뒤에 회수한 U343 세포 배양액을 새로운 배지와 1: 1로 혼합한 뒤 넣고 배양하였다. 양성 대조군으로서는 10 ng/㎖의 VEGF-A 정제 단백질 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)을 이용하였다. 배양 후 20시간째에, 배양액을 제거하고 PBS로 2번 세척한 뒤 현미경으로 관형성을 관찰하였다. 형성된 관은 Image-Pro Plus (Media Cybermetics Inc., Silver Spring, MD) 프로그램을 사용하여 정량하였하였으며, VEGF-A 정제 단백질을 처리한 경우를 100%로 보정하여 상대적인 수치를 구하였다(32).In order to determine whether the vascular endothelial function of vascular endothelial cells was inhibited by the reduction of VEGF-A according to the expression of VEGF-A specific shRNAs, HUVEC cells were used. First, 250 μl of growth factor-reducing Matrigel (Collaborative Biomedical Products, Bedford, Mass.) Was shaken slowly on a 24-well plate and evenly dispensed, followed by polymerization at 37 ° C. for 30 minutes. HUVEC (3-5 passage culture) cells were cultured in M199 medium containing 1% FBS for 6 hours, serum starved, and then treated with trypsin to determine cell number. In a 24-well plate dispensed with Matrigel, U343 cell cultures recovered 96 hours after infection with serum starvated HUVEC (2 x 10 5 cells / well) cells with 200 MOI of dl-Z or dl-shVEGF, were cultured in fresh medium. And 1: 1 was mixed and incubated. 10 ng / ml VEGF-A purified protein (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) was used as a positive control. 20 hours after the culture, the culture solution was removed, washed twice with PBS, and tube formation was observed under a microscope. The tube formed was quantified using the Image-Pro Plus (Media Cybermetics Inc., Silver Spring, MD) program, and the relative value was calculated by correcting 100% of the treated VEGF-A purified protein (32).

8. 8. 엑스 비보X Vivo 대동맥 고리 분석 Aortic Ring Analysis

VEGF-A 특이적 shRNA 발현에 따른 혈관 형성 억제를 관찰하기 위해, 대동맥 고리 스프라우팅 분석을 시행하였다. 6 주령의 스프라그 돌리 래트로부터 대동맥을 분리하고, 대동맥 주변의 섬유-지방조직을 제거한 뒤, 1 ㎜ 두께의 고리로 얇게 잘랐다 (In Vitro Cell Dev . Biol ., 26:119-28(1990)). 48-웰 플레이트에 마트리젤 (120 ㎕/웰)을 분주하고 37℃에서 30분간 중합반응시킨 뒤, 대동맥 고리를 각각의 웰에 얹고, 50 ㎕의 마트리젤을 오버레이 하였다. 약 30분 후 마트리젤이 굳으면, 관형성 분석에서 사용된 것과 같은 세포 배양액 (U343 세포주에 200 MOI의 dl-Z 또는 dl-shVEGF 바이러스를 처리하고 96 시간 뒤 회수한 세포 배양액) 250 ㎕를 각각의 웰에 처리하여 배양하였다. 양성 대조군으로는 VEGF-A 정제 단백질 (10 ng/well)을 처리하였으며, 음성 대조군으로는 U343 배양 배지만을 처리하였다. 배양 후 6일째에 현미경 (optical imaging technique)으로 대동맥 고리로부터 생성되어진 혈관들을 관찰하였다(33). 형성된 혈관들은 대동맥 고리를 5 부위로 나누어서 혈관 형성이 가장 왕성한 부위(most positive)를 1점, 혈관 형성이 가장 적게 일어난 부위(least positive)를 0점으로 점수를 부여하여 분석하였으며, 5 부위에 대한 점수(0-5점)를 합산하였다. 각각의 실험군에 대해 6개의 대동맥 고리를 대상으로 대동맥 고리 스프라우팅 분석을 수행하였다(32).To observe the inhibition of angiogenesis following VEGF-A specific shRNA expression, an aortic ring sprouting assay was performed. The aorta was isolated from 6-week-old Sprague Dawley rats, the fibrous-fatty tissue around the aorta was removed, and cut into 1 mm thick rings ( In Vitro Cell Dev . Biol . , 26: 119-28 (1990)). . Matrigel (120 μl / well) was dispensed into 48-well plates and polymerized at 37 ° C. for 30 minutes, then aortic rings were placed in each well and 50 μl of Matrigel was overlaid. After approximately 30 minutes, when the Matrigel solidified, 250 μl of the same cell cultures (cell cultures recovered after 96 hours of treatment with 200 MOI of dl-Z or dl-shVEGF virus in the U343 cell line) were used. In wells and incubated. The positive control was treated with VEGF-A purified protein (10 ng / well), and the negative control was treated only with U343 culture medium. Six days after the incubation, blood vessels generated from the aortic ring were observed by an optical imaging technique (33). The formed blood vessels were analyzed by dividing the aortic rings into 5 sites, giving a score of 1 for the most positive vessel formation and 0 for the least positive vessel formation. Scores (0-5 points) were added together. Aortic ring spouting analysis was performed on six aortic rings for each experimental group (32).

9. 9. 마트리젤Matrigel 플러그 분석 ( Plug analysis ( MatrigelMatrigel plug assay) plug assay)

VEGF-A 특이적 shRNA 발현에 따른 신생혈관 형성 억제를 생체내에서 관찰하 기 위해, 6-웰 플레이트에 2 x 105개의 U343 세포주를 분주한 뒤, 다음날 복제 불능 아데노바이러스 (dl-Z 또는 dl-Z-shVEGF) 또는 복제 가능 아데노바이러스(Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF)로 각각 감염시키고, 4시간 후 5% DMEM 배지로 교체하였다. 바이러스 감염 후 4시간째에, 세포들을 트립신으로 처리하여 회수한 뒤 100 ㎕의 HBSS 완충용액에 재현탁하고 500 ㎕의 차가운 마트리젤과 균일하게 혼합하고, 주사기를 이용하여 누드 생쥐의 등 (ventral groins)에 피하 주사하였다. 주사된 마트리젤은 빠르게 고형의 젤 플러그를 형성하였으며, 14일 후 피부를 박피하여 마트리젤 내부와 주변으로 형성된 혈관들을 관찰하였다. 혈관수를 정량화하기 위하여 마트리젤을 적출하여 4% 파라포름알데하이드 용액에 넣은 뒤 4℃에서 4-8시간 동안 고정시키고, 30% 수크로오스 용액에서 12시간 정도 탈수 시켰다. 탈수된 마트리젤을 O.C.T compound로 동결 박편한 뒤 헤마토자일린과 에오신 (H & E)으로 염색하여 혈관수를 관찰하여 정량하였다(34). To observe the inhibition of neovascularization following VEGF-A specific shRNA expression in vivo, 2 x 10 5 cells were placed in a 6-well plate. The U343 cell line was dispensed and then infected with non-replicating adenovirus (dl-Z or dl-Z-shVEGF) or replicable adenovirus (Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF) the next day, respectively, 5% DMEM after 4 hours. Replaced with medium. Four hours after virus infection, cells were treated with trypsin, recovered, resuspended in 100 μl of HBSS buffer, uniformly mixed with 500 μl of cold Matrigel, and ventral groins of nude mice using a syringe. ) Subcutaneously. The injected Matrigel quickly formed a solid gel plug, and after 14 days, the skin was peeled off and the blood vessels formed in and around the Matrigel were observed. To quantify the blood vessels, Matrigel was extracted, placed in 4% paraformaldehyde solution, fixed at 4 ° C for 4-8 hours, and dehydrated in 30% sucrose solution for 12 hours. The dehydrated matrigel was lyophilized with OCT compound and stained with hematoxylin and eosin (H & E) to measure the number of blood vessels (34).

10. 10. VEGFVEGF -A 특이적 -A specific shRNAshRNA 를 발현하는 종양 선택적 살상 Tumor selective killing 아데노바이러스의Adenovirus 세포  cell 살상능Killing power 검증 Verification

VEGF-A 특이적 shRNA의 발현 여부가 아데노바이러스의 복제에 어떠한 영향을 미치는지 검증하기 위하여, 바이러스의 복제 결과로 나타나는 세포병변 효과(CPE)를 검증하였다. 뇌암 세포주(U343, U87MG), 간암 세포주(Hep3B, Hep1), 자궁암 세포주(C33A), 폐암 세포주(A549) 등의 인체 종양 세포주들을 24-웰 플레이트에 각 각 분주하고, 24 시간 후 dl-Z, Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스를 여러 농도의 MOI로 감염시켰다. 가장 낮은 MOI의 바이러스로 감염시킨 세포들이 거의 사멸된 시점에 배지를 제거하고 플레이트 바닥에 남아있는 세포들을 0.5% 크리스탈 바이올렛 (50% 메탄올)으로 고정하고 염색한 후 분석하였다.To verify how the expression of VEGF-A specific shRNA affects the replication of adenovirus, the cytopathic effect (CPE) resulting from the replication of the virus was examined. Human tumor cell lines such as brain cancer cell lines (U343, U87MG), hepatic cancer cell lines (Hep3B, Hep1), uterine cancer cell lines (C33A), lung cancer cell lines (A549), and the like are divided into 24-well plates, and after 24 hours, dl-Z, Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF adenovirus was infected with various concentrations of MOI. At the time when cells infected with the lowest MOI virus were nearly killed, the medium was removed and the cells remaining at the bottom of the plate were fixed with 0.5% crystal violet (50% methanol) and stained.

11. 11. 인 비보In Vivo 항종양 효과 검증  Antitumor Effect Verification

생후 7-8주 정도 경과된 누드 생쥐에 1 x 107개의 인체 뇌암 세포주인 U343을 복부 피하에 주사하였다. 종양의 용적이 약 70-80 mm3 정도 되었을 때, 1 x 108 PFU의 Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스와 음성 대조군으로서 PBS를 각각 이틀 간격으로 세 번 종양 내에 직접 주사한 후 종양의 크기를 2, 3일 간격으로 측정하였다. 종양의 용적은 캘리퍼를 이용하여 종양의 장축과 단축을 측정한 후 다음과 같은 공식으로 산출하였다: 종양의 용적 (mm3) = (단축 mm)2x 장축mm x 0.523.Nude mice aged 7-8 weeks of age were injected subcutaneously with U343, a human brain cancer cell line 1 × 10 7 . When the tumor volume was about 70-80 mm 3 , 1 x 10 8 PFU of Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF adenovirus and PBS as a negative control were injected directly into the tumor three times at two-day intervals, respectively. The size of was measured at 2, 3 days intervals. Tumor volume was calculated using the caliper to measure the long and short axis of the tumor and was calculated using the following formula: volume of tumor (mm 3 ) = (short mm) 2 x long axis mm x 0.523.

12. 종양조직 내 12. In tumor tissue VEGFVEGF -A의 발현량 측정Expression level of -A

약 6-8 주령의 누드 생쥐의 복벽에 뇌암 세포주인 U343을 피하 주사한 후 종양의 크기가 약 70-120 mm3 정도 되었을 때, 1 x 108 PFU의 Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스를 음성 대조군인 PBS와 함께 3회 종양 내 투여하였다. 마지 막 바이러스 투여 후 10일 뒤에 종양을 적출하여 액체 질소에 담근 후, 막자사발로 분쇄하고 단백질 억제자 칵테일 (Sigma)이 첨가된 PBS에 부유하였다. 종양 조직을 보다 미세하게 분쇄하기 위하여 균질화기 (ART-MICCRA D-8, ART modern Labortechnik, Munchen, Germany)로 균질화한 후, 3000 rpm으로 10분간 원심분리한 뒤 상층액만 수득하여 종양 내 VEGF-A 단백질의 발현 정도를 ELISA로 측정하였다. VEGF-A의 ELISA는 상기의 “VEGF-A 특이적 shRNA를 발현하는 아데노바이러스에 의한 VEGF-A 발현 억제 검증”과 같은 방법으로 수행하였다.Tumor size was approximately 70-120 mm 3 after subcutaneous injection of U343, a brain cancer cell line, into the abdominal wall of nude mice about 6-8 weeks of age. When intact, 1 × 10 8 PFU of Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF adenovirus was administered intratumorally three times with negative control PBS. Ten days after the last virus administration, tumors were extracted, soaked in liquid nitrogen, ground with a mortar and suspended in PBS with added Protein Inhibitor Cocktail (Sigma). Homogenize with a homogenizer (ART-MICCRA D-8, ART modern Labortechnik, Munchen, Germany) to finely grind the tumor tissue, centrifuge at 3000 rpm for 10 minutes, then obtain supernatant to obtain VEGF- The expression level of A protein was measured by ELISA. ELISA of VEGF-A was performed by the same method as the above "Verification of VEGF-A expression inhibition by adenovirus expressing VEGF-A specific shRNA".

13. 13. VEGFVEGF -A 특이적 -A specific shRNAshRNA 를 발현하는 복제 가능 Can be cloned to express 아데노바이러스Adenovirus 투여에 따른 종양  Tumors Following Administration 조직내Within the organization 신생 혈관형성 억제효과 검증 Validation of angiogenesis inhibitory effect

약 6-8주령의 누드 생쥐의 복벽에 뇌암 세포주인 U343을 피하 주사한 후 종양의 크기가 약 70-120 mm3 정도 되었을 때, 1 x 108 PFU의 Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스를 음성 대조군인 PBS와 함께 3회 종양 내 투여하였다. 마지막 바이러스 투여 후 7일 경에 종양을 적출하여 IHC Zinc fixative (포르말린-부재) (BD Bioscience Pharmingen, San Diego, CA) 용액에서 고정시킨 뒤, 파라핀 블록을 제작하였다. 제작된 파라핀 블록을 4 ㎛ 두께로 절단하여 슬라이드로 만든 뒤, 이를 자일렌, 100%, 90%, 70% 에탄올 용액에 차례로 담궈 파라핀을 제거(deparafinization)한 후 헤마토자일린과 에오신 (H & E)으로 염색하였다. VEGF-A 특이적 shRNA 발현에 의해 종양조직 내 혈관형성이 억제 되었는지 확인하기 위 해, 혈관내피 세포 특이적 항원인 CD31을 선택적으로 인지할 수 있는 항체(platelet/endothelial cell adhesion molecule 1; BD Biosciences PharMingen)를 이용하여 조직 면역염색을 시행하였다. 파라핀이 제거된 4 ㎛ 두께의 종양 조직을 3% H2O2 용액에서 10분간 반응시켜 내인성 과산화효소의 작용을 차단시키고, CAS-BLOCK (Zymed, San Francisco, CA)로 30분간 비특이적인 항체반응을 블롯킹한 다음, α-CD31 항체를 1차 항체로 반응시키고, 바이오틴이 결합된 폴리클로날 항-래트 (multiple adsorption) 항체 (BD Biosciences PharMingen)를 이차 항체로 반응시키고, DAB(DACO, Carpinteria, CA, USA)를 이용하여 CD31의 발현양상을 규명하였다. 또한, 동일한 부위의 파라핀 블록을 이용하여, 아데노바이러스의 헥손 부위를 검출할 수 있는 조직 면역염색을 시행하였다. 상기와 같은 방법으로 파라핀을 제거한 후 아데노바이러스의 헥손 부위와 선택적으로 결합하는 항체 (MAB 8052 chemicon, Temecula, CA)를 일차 항체로, 그리고 염소 항-래트 IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology)를 이차 항체로 반응시키고 DAB를 첨가하여 발색시켜 관찰하였다. 종양 내 현성된 혈관수를 정량하기 위해서는, 혈관내피 세포 특이적 항원인 CD31 (platelet/endothelial cell adhesion molecule 1) 양성으로 염색된 종양 내 혈관을 먼저 저배율로 관찰하여 무작위로 사진을 촬영한 후, 배율을 높여 100배 시야에서 관찰되는 혈관의 수를 정량하였다. 세장의 슬라이드로부터 각각 5개 시야를 선택하여 혈관 수를 계산하고 평균값을 산출하여 그 값을 대표값으로 사용하였다(34).Tumor size was approximately 70-120 mm 3 after subcutaneous injection of U343, a brain cancer cell line, into the abdominal wall of nude mice about 6-8 weeks of age. When intact, 1 × 10 8 PFU of Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF adenovirus was administered intratumorally three times with negative control PBS. Tumors were extracted 7 days after the last virus administration and fixed in IHC Zinc fixative (formalin-free) (BD Bioscience Pharmingen, San Diego, Calif.) Solution to prepare paraffin blocks. The prepared paraffin block was cut into 4 μm thickness into slides, which were then immersed in xylene, 100%, 90%, and 70% ethanol solution to remove paraffin (deparafinization), followed by hematoxylin and eosin (H & Stained with E). To determine whether angiogenesis in tumor tissues was inhibited by VEGF-A specific shRNA expression, antibodies capable of selectively recognizing CD31, a vascular endothelial cell specific antigen (platelet / endothelial cell adhesion molecule 1; BD Biosciences PharMingen Tissue immunostaining was performed. Paraffin-free 4 μm thick tumor tissue was reacted in 3% H 2 O 2 solution for 10 minutes to block the action of endogenous peroxidase, and nonspecific antibody reaction with CAS-BLOCK (Zymed, San Francisco, CA) for 30 minutes. And then react the α-CD31 antibody with the primary antibody and the biotin-bound polyclonal anti-rat antibody (BD Biosciences PharMingen) with the secondary antibody, DAB (DACO, Carpinteria) , CA, USA) to determine the expression pattern of CD31. In addition, tissue immunostaining was performed to detect hexon sites of adenoviruses using paraffin blocks of the same site. After removing paraffin in this manner, the antibody (MAB 8052 chemicon, Temecula, CA) that selectively binds to the hexon site of adenovirus is used as a primary antibody, and the goat anti-rat IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology) is a secondary antibody. It was observed by the color development by the addition of DAB. In order to quantify the number of blood vessels manifested in tumors, intravascular tumors stained with CD31 (platelet / endothelial cell adhesion molecule 1) positive, which is a vascular endothelial cell specific antigen, were first observed at low magnification and randomly photographed. The number of blood vessels observed at 100-fold field of view was increased. Five visual fields were selected from three slides, and the number of blood vessels was calculated, and an average value was calculated and used as a representative value (34).

실험결과Experiment result

1. One. VEGFVEGF -A의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 Can effectively suppress the expression of -A siRNAsiRNA 염기서열 선정 Sequence Selection

siRNA 기술을 이용하여 신생혈관 형성에 있어 중요한 기능을 하는 VEGF-A의 발현을 효과적으로 억제하기 위한 본 연구의 목적을 위해서, 먼저 VEGF-A의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 2 종류의 siRNA 염기서열 (siVEGF-1 및 siVEGF-2)을 siRNA 염기 서열 선정 프로그램 (dharmacon.com)을 이용하여 선별하였다 (도 1a). 두 종류의 siRNA의 센스 및 안티센스 서열이 9개의 염기(ttcaagaga)로 구성된 루프를 사이에 두고 위치하고, 양 끝에 BamHI과 HindIII 제한효소 염기서열을 가진 68개의 염기로 구성된 올리고뉴클레오타이드와 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 각각 합성하였다 (도 1b). 각각의 상보적인 올리고뉴클레오타이드들을 95℃에서 5분 동안 가열하여 변성시키고 서서히 감온하여 서로 어닐링시킨 뒤, BamHI 부위와 HindⅢ 부위를 절단하여 siRNA 클로닝 벡터인 pSilencer-U6에 삽입시켜 pSilencer-U6-shVEGF-1 및 pSilencer-U6-shVEGF-2를 각각 제작하였다. 제작된 2 종류의 VEGF-A 특이적 shRNA를 발현하는 pSilencer-U6-shVEGF-1과 pSilencer-U6-shVEGF-2 플라스미드 중 VEGF-A의 전사를 가장 효과적으로 억제할 수 있는 shRNA를 선별하기 위하여, 음성 대조군인 pSilencer-U6 플라스미드와 함께 이들 두 종류의 플라스미드들을 각각 K562 세포주에 형질전환시켰다. 형질전환 후 48시간 경에 RNA를 분리한 뒤, VEGF-A를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트(센스 프라이머; 5'-CTACCTCCACCATGCCAAGT-3', 안티센스 프라이머; 5'-ATGTTGGACTCCTCAGTGGG- 3')를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 VEGF-A의 mRNA 양을 비교 검증하였다. For the purpose of this study to effectively suppress the expression of VEGF-A, which plays an important role in neovascularization using siRNA technology, two types of siRNA sequences that can effectively inhibit the expression of VEGF-A ( siVEGF-1 and siVEGF-2) were selected using the siRNA sequencing program (dharmacon.com) (FIG. 1A). Oligonucleotides consisting of 68 bases with BamH I and Hind III restriction enzyme sequences at both ends, with sense and antisense sequences of two siRNAs, with a loop consisting of 9 bases (ttcaagaga), complementary oligos Nucleotides were synthesized respectively (FIG. 1B). Each of the complementary oligonucleotides was denatured by heating at 95 ° C. for 5 minutes, slowly deteriorated, and annealed to each other. Then, the BamH I site and the Hind III site were cleaved and inserted into the siRNA cloning vector pSilencer-U6 to insert pSilencer-U6-shVEGF. -1 and pSilencer-U6-shVEGF-2 were produced, respectively. To select negative shRNAs that can most effectively inhibit VEGF-A transcription among pSilencer-U6-shVEGF-1 and pSilencer-U6-shVEGF-2 plasmids expressing two types of VEGF-A specific shRNAs, These two plasmids were transformed into K562 cell lines, respectively, along with the control group pSilencer-U6 plasmid. After 48 hours of transformation, RNA was isolated and a primer set capable of specifically amplifying VEGF-A (sense primer; 5'-CTACCTCCACCATGCCAAGT-3 ', antisense primer; 5'-ATGTTGGACTCCTCAGTGGG-3') RT-PCR was used to compare and verify mRNA levels of VEGF-A.

도 2에서 볼 수 있듯이, 아무 것도 처리하지 않은 K562 세포와 대조군 플라스미드인 pSilencer-U6을 형질전환 한 K562 세포, 그리고 pSilencer-U6-shVEGF-1 플라스미드를 형질전환 한 K562 세포의 경우에는 VEGF-A의 mRNA 양이 높게 검출되었으나, pSilencer-U6-shVEGF-2 플라스미드를 형질전환한 K562 세포의 경우에는 VEGF-A의 mRNA 양이 매우 낮게 검출되어, shVEGF-2의 전사 시스템을 통하여 VEGF-A의 전사를 효과적으로 저해할 수 있음을 확인할 수 있었으며, 이후의 모든 실험들에서는 VEGF-A 특이적 siRNA로서 shVEGF-2의 염기 서열을 사용하였다.As can be seen in Figure 2, K562 cells that did not process anything, K562 cells transformed with the control plasmid pSilencer-U6, and K562 cells transformed with the pSilencer-U6-shVEGF-1 plasmid, Although mRNA levels were detected high, K562 cells transformed with the pSilencer-U6-shVEGF-2 plasmid detected very low mRNA levels of VEGF-A, resulting in transcription of VEGF-A through the shVEGF-2 transcription system. It was confirmed that it can effectively inhibit, and all subsequent experiments used the nucleotide sequence of shVEGF-2 as VEGF-A specific siRNA.

2. 2. sVEGFsVEGF -A 특이적 -A specific shRNAshRNA 를 발현하는 Expressing 아데노바이러스에Adenovirus 의한  by VEGFVEGF -A 발현 억제 검증-A expression suppression verification

siRNA가 특정 유전자를 효과적으로 낙-다운시키는데 유용한 방법이긴 하지만 전달 효율이 떨어지고 일시적으로만 효과가 나타나기 때문에, 이를 보완할 수 있는 개선된 벡터 시스템이 요구된다(15). 신생혈관 형성에 중요하게 관여하는 VEGF-A 특이적 siRNA를 암세포 특이적으로 그리고 지속적으로 높게 전사시킴으로써 종양 선택적 살상능을 더욱 개선시킬 목적으로, 상기에서 시행한 RT-PCR 분석을 통하여 선별된 shVEGF-2 전사 시스템을 Ad-ΔB7 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 E3 부위에 삽입하여 Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스를 제작 및 생산하였다 (도 3b). Although siRNAs are a useful way to effectively knock down certain genes, they are less efficient and only temporarily effective, requiring an improved vector system that can compensate for this (15). ShVEGF- selected through RT-PCR analysis for the purpose of further improving tumor selective killing ability by transcriptively transcribing VEGF-A specific siRNAs important for neovascularization to cancer cells A 2 transcription system was inserted at the E3 site of the Ad-ΔB7 tumor selective killing adenovirus to produce and produce Ad-ΔB7-shVEGF adenovirus (FIG. 3B).

먼저, Ad-ΔB7-shVEGF 종양 선택적 살상 아데노바이러스에 의해서 VEGF-A의 발현이 효과적으로 억제 되는지를 검증하기 위하여, VEGF-A 발현양이 높은 인체 뇌 암 세포주인 U343을 10-20 MOI의 Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스로 감염시키고 세포로부터 배지를 회수하여 ELISA를 시행하여 VEGF-A의 발현양을 정량하였다 (도 4). 그 결과, Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스를 감염시킨 세포 배양액뿐만 아니라, Ad-ΔB7 아데노바이러스를 감염시킨 세포 배양액에서도 VEGF-A의 발현이 현저하게 감소되어 shVEGF의 전사에 따른 VEGF-A의 발현 억제 여부를 확인할 수 없었다. Zhou 연구팀은 2003년, 아데노바이러스의 E1A 유전자에 의해서 신생혈관 형성 유도체인 VEGF-A 발현이 감소된다는 결과를 발표한 바 있는데 (35), Ad-ΔB7 및 Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스로부터 발현되는 E1A에 의해서 VEGF-A 발현이 억제되는지를 검증하기 위하여, 대조군 복제 불능 아데노바이러스로서 dl-Z와 함께 Ad-ΔB7, Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스를 10-20 MOI의 역가로 U343 세포주를 감염시킨 뒤, 배지를 회수하여 상기와 동일한 방법으로 ELISA를 시행하였다. E1A를 발현하는 또 다른 대조군 복제 가능 아데노바이러스로서 E1B 55 kDa 유전자가 소실된 YKL-1 바이러스도 함께 사용하여 실험을 진행하였다. 도 5에서 볼 수 있듯이, E1A를 발현하는 모든 3 종류의 복제 가능 아데노바이러스 (YKL-1, Ad-ΔB7 및 Ad-ΔB7-shVEGF)들을 감염시킨 세포 배양액에서는 처리해준 바이러스의 역가에 비례하여 VEGF-A의 발현이 현저하게 감소된 반면, E1A를 발현하지 못하는 복제 불능 아데노바이러스인 dl-Z를 감염시킨 세포 배양액에서는 VEGF-A의 발현이 약간 감소하여, E1A의 발현에 따른 VEGF-A 발현 억제현상을 확인할 수 있었다. First, in order to verify whether the expression of VEGF-A is effectively inhibited by Ad-ΔB7-shVEGF tumor selective killing adenovirus, U343, a human brain cancer cell line with high VEGF-A expression, was selected from 10-20 MOI of Ad-ΔB7. Alternatively, the cells were infected with Ad-ΔB7-shVEGF adenovirus and the medium was recovered from the cells, and ELISA was performed to quantify the expression level of VEGF-A (FIG. 4). As a result, the expression of VEGF-A was significantly reduced not only in the cell culture medium infected with Ad-ΔB7-shVEGF adenovirus but also in the cell culture medium infected with Ad-ΔB7 adenovirus, thereby suppressing the expression of VEGF-A due to the transcription of shVEGF. Could not confirm. Zhou and his team reported in 2003 that the expression of angiogenesis derivative VEGF-A was reduced by the E1A gene of adenoviruses (35). E1A expressed from Ad-ΔB7 and Ad-ΔB7-shVEGF adenoviruses. In order to verify that VEGF-A expression is inhibited by infection of U343 cell line with a titer of 10-20 MOI, Ad-ΔB7, Ad-ΔB7-shVEGF adenovirus with dl-Z as a control non-replicating adenovirus , EL medium was recovered and cultured in the same manner as above. As another control replicable adenovirus expressing E1A, experiments were also carried out using YKL-1 virus that lacked the E1B 55 kDa gene. As can be seen in Figure 5, in cell cultures infected with all three replicable adenoviruses expressing E1A (YKL-1, Ad-ΔB7 and Ad-ΔB7-shVEGF), the VEGF- was proportional to the titer of the treated virus. While the expression of A was significantly reduced, the expression of VEGF-A in cell cultures infected with dl-Z, a non-replicating adenovirus that did not express E1A, slightly decreased, thus inhibiting VEGF-A expression following E1A expression. Could confirm.

따라서 VEGF-A 특이적 shRNA에 의한 VEGF-A 발현 억제 효과를 알아보기 위해서, shVEGF-2 전사 시스템을 E1 부위가 소실된 복제 불능 아데노바이러스인 dl-Z의 E3 부위에 삽입하여 dl-Z-shVEGF 복제 불능 아데노바이러스를 제작 및 생산하였다 (도 3a). 제작된 dl-Z-shVEGF 복제 불능 아데노바이러스를 대조군 바이러스인 dl-Z와 함께 다양한 인체 종양 세포주 (U343, Hep3B, U87MG, SK-Hep1, A549 및 C33A)를 여러 역가로 각각 감염시키고, 96시간 후에 배지를 수득하여 ELISA를 시행하여 VEGF-A의 발현양을 정량하였다. 도 6에서 볼 수 있듯이, 본 연구에서 사용된 모든 세포주들에서 dl-Z-shVEGF 아데노바이러스로 감염된 세포에서는 투여된 아데노바이러스의 역가가 증가함에 따라 VEGF의 발현 양이 용량 비례적으로 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 특히, U343 세포주에 500 MOI의 바이러스로 감염시킨 경우, dl-Z (1790 pg/ml)에 비해 dl-Z-shVEGF (66 pg/ml) 바이러스로 감염시킨 세포에서 약 27배 정도 낮은 농도의 VEGF-A가 검출됨을 확인하였다. 이러한 결과들을 통하여, 아데노바이러스에 의해 세포내에서 shVEGF가 효과적으로 전사되고, 전사된 짧은 헤어핀 구조의 VEGF-A 특이적 shRNA는 세포내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소 (Dicer 또는 RNaseⅢ)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 VEGF-A의 발현을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.Therefore, in order to investigate the inhibitory effect of VEGF-A expression by VEGF-A-specific shRNA, the shVEGF-2 transcription system was inserted into the E3 site of dl-Z, a non-replicating adenovirus that lacks the E1 site, and then dl-Z-shVEGF Nonreplicated adenoviruses were produced and produced (FIG. 3A). The resulting dl-Z-shVEGF non-replicating adenovirus was infected with various titers of various human tumor cell lines (U343, Hep3B, U87MG, SK-Hep1, A549 and C33A) together with the control virus dl-Z, respectively, and 96 hours later. Media was obtained and ELISA was performed to quantify the expression level of VEGF-A. As can be seen in Figure 6, in all the cell lines used in this study, in the cells infected with dl-Z-shVEGF adenovirus, the amount of VEGF expression decreased proportionally with increasing titer of adenovirus administered. Could. In particular, when infected with the U343 cell line with 500 MOI of virus, VEGF was about 27 times lower in cells infected with dl-Z-shVEGF (66 pg / ml) virus than with dl-Z (1790 pg / ml). It was confirmed that -A was detected. These results indicate that shVEGF is effectively transcribed intracellularly by adenovirus, and the transcribed short hairpin structured VEGF-A specific shRNA is siRNA having the correct structure by the siRNA processing enzyme (Dicer or RNase III) present in the cell. It was confirmed that the conversion to effectively inhibit the expression of VEGF-A.

3. 3. VEGFVEGF -A 특이적 -A specific shRNAshRNA 발현에 따른 신생혈관 형성 억제 검증  Inhibition of neovascularization according to expression

VEGF-A 특이적 shRNA 발현에 따른 VEGF-A의 감소로 혈관내피세포의 분화가 억제되는지를 알아보기 위해서, HUVEC 세포주를 이용하여 관형성 분석을 시행하였다. 인체 뇌암 세포주인 U343에 200 MOI의 dl-Z와 dl-Z-shVEGF를 각각 감염시키고 96시간 후 세포로부터 배지를 회수하여 HUVEC 세포주에 처리한 뒤, 관형성을 관 찰하였다 (도 7). 혈관 형성을 유도하는 양성 대조군으로는, 10 ng/ml 농도의 VEGF-A 정제 단백질을 처리하였다. 그 결과, 아무 것도 처리하지 않은 세포 배양액과 dl-Z를 감염시킨 세포 배양액을 처리한 경우에는, 양성 대조군과 마찬가지로 튼튼하고 굵은 관이 형성된 반면, dl-Z-shVEGF를 감염시킨 세포 배양액을 처리한 경우에는 가늘고 부분적으로 끊어진 관이 형성된 것을 관찰할 수 있었다. 형성된 관을 Image-Pro Plus 프로그램을 이용하여 정량한 결과, VEGF-A 정제 단백질을 처리한 경우를 100%로 하였을 때, 아무것도 처리하지 않은 U343 세포 배양액과 dl-Z 아데노바이러스를 감염시킨 세포 배양액을 처리한 경우에는 각각 77.26%와 59.28%의 혈관이 형성된 반면에 dl-Z-shVEGF 아데노바이러스를 감염시킨 세포 배양액을 처리한 경우에는 27.57%의 관이 형성되어 혈관형성이 현저하게 감소되었음을 확인하였다 (도 7b).In order to determine whether VEGF-A-induced differentiation of vascular endothelial cells was inhibited by VEGF-A-specific shRNA expression, an angiogenesis assay was performed using HUVEC cell line. U343, a human brain cancer cell line, was infected with 200 MOI of dl-Z and dl-Z-shVEGF, respectively, and 96 hours later, the medium was recovered from the cells, treated with HUVEC cell lines, and observed for tube formation (FIG. 7). As a positive control to induce angiogenesis, 10 ng / ml concentration of VEGF-A purified protein was treated. As a result, when the cell culture medium treated with nothing and the cell culture medium infected with dl-Z were treated, the same as the positive control, a strong and thick tube was formed, whereas the cell culture medium infected with dl-Z-shVEGF was treated. In this case, a thin, partially broken tube was formed. The tube formed was quantified using the Image-Pro Plus program, and when the VEGF-A purified protein was treated at 100%, the U343 cell culture medium and the cell culture medium infected with dl-Z adenovirus were treated. In the case of treatment, 77.26% and 59.28% of blood vessels were formed, whereas in the case of treatment with the cell culture infected with dl-Z-shVEGF adenovirus, 27.57% of the blood vessels were formed, indicating that angiogenesis was significantly reduced ( 7b).

상기의 인 비트로 실험들에서 확인된 VEGF-A 특이적 shRNA 발현에 따른 VEGF-A의 발현 감소 및 이에 따른 신생혈관 형성 억제 현상이 대동맥 고리를 이용한 ex vivo 실험을 통해서도 검증될 수 있는지를 알아보기 위하여, 6-8주령의 래트로부터 대동맥 고리를 분리하여, 관형성 분석과 같은 조건과 방법으로 준비된 세포 배양액을 처리하여 혈관 스프라우팅 분석을 시행하였다 (도 8). 양성 대조군인 20 ng/ml의 VEGF-A 정제 단백질을 처리한 경우에는 미세혈관의 스프라우팅이 왕성하게 일어났으며, 아무것도 처리하지 않은 U343 세포 배양액과 dl-Z 아데노바이러스를 감염시킨 세포 배양액 (U343 세포주에 200 MOI의 dl-Z 아데노바이러스를 처 리하고 96 시간 뒤 회수한 세포 배양액)을 처리하였을 경우에도 양성 대조군을 처리한 경우와 마찬가지로 혈관의 스프라우팅이 왕성하게 일어났다. 하지만 이와는 대조적으로, dl-Z-shVEGF를 감염시킨 세포 배양액을 처리하였을 경우에는 혈관의 형성이 현저하게 억제되는 것을 관찰하였다 (도 8a). 이를 보다 정량적으로 비교 검증하기 위하여, 대동맥 고리를 5부위로 나누어 혈관 형성이 가장 왕성한 부위(most positive)를 1점, 혈관 형성이 가장 적게 일어난 부위(least positive)를 0점으로 각각 점수를 부여하여 분석한 결과, 양성 대조군으로 사용된 VEGF-A 단백질을 처리한 모든 대동맥에서 4 ± 0.63으로 혈관형성이 왕성하게 일어남을 확인할 수 있었으며, 또한 아무것도 처리하지 않은 U343 세포 배양액과 dl-Z 아데노바이러스를 감염시킨 세포 배양액을 처리한 경우에도 약 3.83 ± 0.75와 3.5 ± 0.55의 혈관이 형성되었음을 확인할 수 있었다. 이와는 대조적으로, dl-Z-shVEGF 아데노바이러스를 감염시킨 세포의 배양액을 처리한 경우에는 1.33 ± 0.52의 혈관만이 형성되어 dl-Z-shVEGF에 의해 혈관형성이 현저하게 억제됨을 확인하였다 (도 8b).In order to examine whether the expression decreased and thus the neovascularization inhibition according to the VEGF-A in accordance with the specific shRNA expression of VEGF-A identified in the in vitro experiments can be verified through the ex vivo tests using the aortic ring Aortic rings were separated from rats aged 6-8 weeks, and cell cultures prepared in the same conditions and methods as in tubular analysis were subjected to vascular spouting analysis (FIG. 8). Treatment of 20 ng / ml VEGF-A purified protein, a positive control, resulted in the vigorous microvascular throttling, and the U343 cell cultures without any treatment and the cell cultures infected with dl-Z adenovirus (U343). When cell lines were treated with 200 MOI of dl-Z adenovirus and recovered 96 hours later, the blood vessels spouted vigorously as with the positive control. However, in contrast, when treated with the cell culture medium infected with dl-Z-shVEGF it was observed that the formation of blood vessels is significantly inhibited (Fig. 8a). To quantitatively compare and verify this, the aortic rings are divided into 5 sites and scored 1 point for the most positive vessel formation and 0 point for the least positive vessel formation. As a result, it was confirmed that angiogenesis occurred vigorously at 4 ± 0.63 in all aorta treated with VEGF-A protein used as a positive control, and also infected with untreated U343 cell culture medium and dl-Z adenovirus. Even when the treated cell culture solution was confirmed that the blood vessels of about 3.83 ± 0.75 and 3.5 ± 0.55 was formed. In contrast, when treated with the culture medium of cells infected with dl-Z-shVEGF adenovirus, only 1.33 ± 0.52 of blood vessels were formed, indicating that angiogenesis was significantly suppressed by dl-Z-shVEGF (FIG. 8B). ).

또한 상기의 생체외 실험들에서 확인된 VEGF-A 특이적 shRNA 발현에 따른 VEGF-A의 발현 감소 및 이에 따른 신생혈관 형성 억제 현상이 마트리젤을 이용한 인 비보 실험을 통해서도 검증될 수 있는지를 알아보기 위하여 마트리젤 플러그 분석을 수행하였다. U343 세포주를 dl-Z(100 MOI), dl-Z-shVEGF(100 MOI), Ad-ΔB7(10 MOI) 또는 Ad-ΔB7-shVEGF(10 MOI) 아데노바이러스로 각각 감염시키고 마트리젤과 함께 혼합하여 누드생쥐의 등에 피하 주사하여 고형의 젤 플러그를 형성시 킨 뒤, 14일 후 마트리젤 내부와 주변에 형성된 혈관들을 관찰하였다 (도 9). 그 결과, VEGF-A 특이적 shRNA를 발현하지 않는 대조군 아데노바이러스(dl-Z, Ad-ΔB7)로 감염시킨 경우에는 마트리젤의 주변과 내부에서 혈관 형성이 매우 활발하게 진행되어 많은 개수의 혈관들을 관찰할 수 있는 반면, VEGF-A 특이적 shRNA를 발현하는 아데노바이러스(dl-Z-shVEGF, Ad-ΔB7-shVEGF)로 감염시킨 경우에는 고형화된 마트리젤 주변과 내부에 형성된 혈관의 개수가 적음을 확인하였다. 상기의 실험 결과들을 통하여, VEGF-A 특이적 shRNA를 발현하는 두 종류의 아데노바이러스들인 dl-Z-shVEGF와 Ad-ΔB7-shVEGF에 의해 VEGF-A의 발현이 억제되고, 그 결과 혈관내피 세포의 분화 및 신생혈관 형성이 효과적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.In addition, whether the reduction of VEGF-A expression according to the expression of VEGF-A specific shRNA and the inhibition of neovascularization according to the ex vivo experiments can be verified through in vivo experiments using Matrigel. Matrigel plug analysis was performed for this purpose. U343 cell line was infected with dl-Z (100 MOI), dl-Z-shVEGF (100 MOI), Ad-ΔB7 (10 MOI) or Ad-ΔB7-shVEGF (10 MOI) adenovirus, respectively, and mixed with Matrigel Subcutaneous injection of nude mice to form a solid gel plug, after 14 days was observed blood vessels formed in and around the Matrigel (Fig. 9). As a result, when infected with the control adenovirus (dl-Z, Ad-ΔB7) that does not express VEGF-A specific shRNA, blood vessel formation was very active in and around the Matrigel, resulting in a large number of blood vessels. On the other hand, when infected with adenoviruses expressing VEGF-A specific shRNAs (dl-Z-shVEGF, Ad-ΔB7-shVEGF), the number of blood vessels formed around and inside the solidified matrigel is small. Confirmed. Through the above experimental results, the expression of VEGF-A is inhibited by two kinds of adenoviruses expressing VEGF-A specific shRNAs, dl-Z-shVEGF and Ad-ΔB7-shVEGF. It was confirmed that differentiation and neovascularization were effectively inhibited.

4. 4. VEGFVEGF -A 특이적 -A specific shRNAshRNA 를 발현하는 종양 선택적 살상 Tumor selective killing 아데노바이러스의Adenovirus 세포  cell 살상능Killing power 검증 Verification

VEGF-A 특이적 shRNA 발현이 아데노바이러스의 복제에 미치는 영향을 알아보기 위하여 아데노바이러스의 복제에 따른 세포 사멸 정도를 CPE 분석으로 관찰하였다. 여러 종류의 인체 종양 세포주들을 dl-Z, Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스로 각각 0.1-20 MOI로 감염시키고 잔류 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 아데노바이러스의 복제에 따른 세포 살상 정도를 비교 관찰하였다 (도 10). 음성 대조군인 dl-Z 복제 불능 아데노바이러스로 감염된 세포들에서는 아데노바이러스가 복제되지 않기 때문에 세포 살상효과가 나타나지 않았으나, 복제 가능 아데노바이러스들인 Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF로 감염된 경우는 투여된 바이 러스 양이 증가함에 따라 세포 살상 효과가 증가되었다. 본 연구에 사용된 모든 종양 세포주들(A549, Hep1, U343, U87MG, Hep3B 및 C33A)에서 Ad-ΔB7와 Ad-ΔB7-shVEGF의 세포 사멸 정도가 비슷하였다. 이러한 결과들에 의해, VEGF-A 특이적 shRNA의 발현으로 아데노바이러스의 복제가 저해되지 않고 그 결과, 세포 살상능도 감소하지 않음을 확인할 수 있었다. In order to examine the effect of VEGF-A specific shRNA expression on the replication of adenovirus, the degree of cell death following replication of adenovirus was observed by CPE analysis. Different types of human tumor cell lines were infected with dl-Z, Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF adenovirus at 0.1-20 MOI, respectively, and residual cells were stained with crystal violet to compare the degree of cell death following replication of adenovirus. Observation was made (FIG. 10). Cells infected with the dl-Z non-replicating adenovirus, a negative control, did not have a cytotoxic effect because the adenovirus did not replicate, but when infected with the replicable adenoviruses Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF As the amount of russ increased, the cytotoxic effect increased. All tumor cell lines used in this study (A549, Hep1, U343, U87MG, Hep3B and C33A) had similar levels of apoptosis of Ad-ΔB7 and Ad-ΔB7-shVEGF. From these results, it was confirmed that the expression of VEGF-A specific shRNA did not inhibit the replication of adenovirus and, as a result, did not decrease cell killing ability.

5. 5. VEGFVEGF -A 특이적 -A specific shRNAshRNA 를 발현하는 종양 선택적 살상 Tumor selective killing 아데노바이러스의Adenovirus 생체내In vivo 항종양 효과 검증  Antitumor Effect Verification

VEGF-A 특이적 shRNA를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 Ad-ΔB7-shVEGF의 생체내 항종양 효과를 검증하기 위해, 인체 뇌암 세포주인 U343 세포주를 누드마우스의 복부 피하에 주사하고 형성된 종양에 1 x 108 PFU의 Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스를 음성 대조군인 PBS와 함께 이틀 간격으로 3번 종양 내에 투여한 후 종양의 성장을 관찰하였다 (도 11). 본 실험에서는 암세포 특이적 살상 아데노바이러스인 Ad-ΔB7과 Ad-ΔB7-shVEGF의 항종양 효과를 비교하기 위해서, Ad-ΔB7의 항종양 효과를 검증한 이전 연구들에 비해 5 배 낮은 역가의 바이러스를 투여하였다. To verify the in vivo antitumor effect of Ad-ΔB7-shVEGF, a tumor-selective adenovirus expressing VEGF-A specific shRNA, U343 cell line, a human brain cancer cell line, was injected subcutaneously in nude mice and 1 Tumor growth was observed after administration of x 10 8 PFU of Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF adenovirus into the tumor three times at two-day intervals with PBS, a negative control (FIG. 11). In order to compare the antitumor effects of Ad-ΔB7 and Ad-ΔB7-shVEGF, the cancer cell specific killing adenoviruses, we compared the anti-tumor virus with a 5-fold lower titer than the previous studies verifying the anti-tumor effect of Ad-ΔB7. Administered.

음성 대조군인 PBS를 투여 받은 생쥐의 경우, 바이러스 투여 후 36 일경에 종양의 용적이 약 2531 ± 256 mm3으로 급격히 성장하였으나, 종양 특이적 살상 아데노바이러스인 Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF을 투여한 경우에는 종양의 성장이 크 게 지연됨을 확인하였다. 즉, Ad-ΔB7와 Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스를 투여 받은 생쥐의 경우, 바이러스 투여 후 36 일경에 종양의 용적이 각각 973.51 ± 313.5 mm3과 292 ± 241 mm3로, 이들 아데노바이러스의 뚜렷한 항종양 효과를 관찰할 수 있었으며, 특히 Ad-ΔB7을 투여한 경우보다 Ad-ΔB7-shVEGF를 투여한 경우에 보다 향상된 항종양 효과를 확인할 수 있었다. 또한 Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스를 투여한 총 8 마리의 마우스들 중 1 마리는 바이러스 투여 후 35 일경에 종양이 완전히 소멸되어 없어졌으며, 60 일이 지나도 종양의 재성장은 관찰되지 않았다. 이러한 결과를 통하여, 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 Ad-ΔB7-shVEGF는 E1A 유전자의 발현에 따른 VEGF-A 발현 억제뿐만 아니라 VEGF-A 특이적 shRNA의 발현에 따른 VEGF-A 발현 억제도 함께 유도할 수 있어, 생체내 항종양 효과를 현저하게 증진시킬 수 있음을 확인하였다.In mice receiving PBS, a negative control group, the tumor volume rapidly increased to about 2531 ± 256 mm 3 at 36 days after virus administration, but the tumor-specific adenovirus Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF was administered. In one case, it was confirmed that tumor growth was significantly delayed. That is, in mice treated with Ad-ΔB7 and Ad-ΔB7-shVEGF adenoviruses, the tumor volume was approximately 973.51 ± 313.5 mm 3 and 292 ± 241 mm 3 at 36 days after virus administration, respectively. Tumor effects were observed, and especially when Ad-ΔB7-shVEGF was administered, the antitumor effect was improved. In addition, one of the eight mice treated with Ad-ΔB7-shVEGF adenovirus completely disappeared by 35 days after virus administration, and no tumor regrowth was observed after 60 days. Through these results, Ad-ΔB7-shVEGF, a tumor selective killing adenovirus, can induce not only VEGF-A expression inhibition by expression of E1A gene but also VEGF-A expression inhibition by expression of VEGF-A specific shRNA. It has been confirmed that the antitumor effect can be significantly enhanced in vivo.

6. 6. 종양내Intratumor VEGFVEGF -A의 발현량 측정Expression level of -A

VEGF-A 특이적 shRNA를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 종양세포 감염 및 복제에 따른 VEGF-A 특이적 shRNA의 발현에 의해 종양 내 VEGF-A 발현이 실질적으로 감소되었는지를 알아보기 위하여, 바이러스 투여 후 10일 경에 종양조직을 적출하여 미세하게 분쇄한 뒤 VEGF-A ELISA 분석을 시행하였다 (도 12). 음성 대조군인 PBS를 종양내로 투여한 실험동물에서는 종양 조직 1 g당 2429 ± 0.7698 pg의 VEGF-A가 발현된 반면, 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF을 투여한 실험동물에서는 각각 1617 ± 0.6558 pg과 851 ± 1.296 pg의 VEGF-A가 생성되어, 암조직 내에서 Ad-ΔB7와 Ad-ΔB7-shVEGF의 감염에 의해 종양 조직내 VEGF-A의 발현이 효과적으로 억제되고, 특히 Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스의 감염에 의해 종양 조직내 VEGF-A의 발현이 보다 효과적으로 억제됨을 확인하였다. To determine whether VEGF-A expression in tumors was substantially reduced by expression of VEGF-A specific shRNAs following tumor cell infection and replication of tumor selective adenovirus expressing VEGF-A specific shRNAs. After 10 days, the tumor tissue was extracted and finely ground and subjected to VEGF-A ELISA analysis (FIG. 12). Experimental animals treated with PBS, a negative control, intratumorally expressed 2429 ± 0.7698 pg of VEGF-A per gram of tumor tissue, whereas experimental animals receiving Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF, tumor-selective adenoviruses VEGF-A of 1617 ± 0.6558 pg and 851 ± 1.296 pg was produced, respectively, and the expression of VEGF-A in tumor tissues was effectively inhibited by infection of Ad-ΔB7 and Ad-ΔB7-shVEGF in cancer tissues. It was confirmed that the expression of VEGF-A in tumor tissues was more effectively inhibited by the infection of Ad-ΔB7-shVEGF adenovirus.

7. 7. VEGFVEGF -A 특이적 -A specific shRNAshRNA 를 발현하는 종양 선택적 살상 Tumor selective killing 아데노바이러스Adenovirus 투여에 따른 종양조직의 변화 관찰 Observation of changes in tumor tissue following administration

앞서 진행된 여러 실험들을 통하여 확인된 VEGF-A 특이적 shRNA 발현에 따른 VEGF-A의 발현 감소 및 이에 따른 개선된 항종양 효과가 실제로 종양 내 혈관 형성 억제에 의한 것인지를 확인하기 위해서, H & E 염색 및 혈관내피 세포 특이적 항원인 CD31의 발현을 조직 면역염색을 시행하여 검증하였다. 먼저, 인체 뇌암 세포주인 U343 세포주를 누드 생쥐 복벽 피하에 접종한 후 형성된 종양에 Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스를 음성 대조군인 PBS와 함께 이틀 간격으로 3 회 종양 내 주사한 후 7일 경에 종양 조직을 적출하여 헤마토자일린과 에오신으로 염색하여 조직의 상태를 검증하였다. In order to confirm whether the reduction of VEGF-A expression and the improved anti-tumor effect according to the VEGF-A specific shRNA expression confirmed through the above experiments are actually due to the inhibition of angiogenesis in tumor, H & E staining And expression of CD31, a vascular endothelial cell specific antigen, was verified by tissue immunostaining. First, 7 days after injecting the human brain cancer cell line U343 cell line subcutaneously into the nude mouse abdominal wall subcutaneous injection of Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF adenovirus with PBS as a negative control three times in two days intervals Tumor tissue was removed from the neck and stained with hematoxylin and eosin to verify the condition of the tissue.

도 13에서 볼 수 있듯이, Ad-ΔB7 아데노바이러스를 투여한 종양의 경우는 종괴의 중심부위에서 자연히 발생하는 세포괴사와 바이러스가 투여된 종괴의 가장자리의 국소적 부위에서만 세포괴사가 진행된 반면, Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스를 투여한 종양의 경우에는 종괴의 중심부위뿐 아니라 바이러스가 투여된 종괴의 가장자리까지 넓은 부위에서 세포괴사가 활발하게 진행되었음을 관찰할 수 있었고, 특히 종양의 내부가 대부분 괴사되어 근접 총 세포괴사 (near total necrosis)가 일어났음을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 13, in the case of tumors to which Ad-ΔB7 adenovirus was administered, cell necrosis occurred naturally at the center of the mass and cell necrosis proceeded only at the local region of the edge of the virus-administered mass, while Ad-ΔB7 In the case of -VEVEGF adenovirus-administered tumors, cell necrosis was actively observed not only at the center of the mass but also at the edge of the virus-administered mass. Necrosis (near total necrosis) was confirmed that occurred.

이러한 종양내 변화의 현상이 실제로 VEGF-A 특이적 shRNA에 의한 혈관 형성 억제 때문인지를 좀 더 면밀하게 확인하기 위해, 동일한 블록의 슬라이드를 사용하여 CD31 면역염색을 시행하였다. 그 결과, 음성 대조군인 PBS를 처리한 종양 조직 내부에는 크고 많은 수의 혈관들이 관찰된 반면에, Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스를 투여한 종양 내부에는 형성된 혈관의 개수와 크기가 감소하였다. 특히, VEGF-A 특이적 shRNA를 발현하는 Ad-ΔB7-shVEGF 아데노바이러스를 투여한 종양의 경우에는, 새로이 형성된 혈관의 개수도 현저히 감소하였을 뿐 아니라 혈관의 크기도 매우 작음을 확인하였다 (도 14a). 종양조직 내부에 새로이 형성된 혈관의 밀도를 정량하기 위하여, CD31 양성으로 염색된 종양 내 혈관을 100 배 배율에서 무작위로 5 부위를 선택하여 혈관 개수를 계수하였다 (도 14b). 음성 대조군인 PBS를 투여한 종양에서는 평균 117.7 ± 8.7개의 혈관이 관찰된 반면, 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7-shVEGF을 투여한 경우에는 종양내 혈관의 수가 각각 101.9 ± 6.2개와 23.8 ± 4.5개의 혈관들이 관찰되어, VEGF-A 특이적 shRNA를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스를 투여한 경우에 신생혈관 형성이 현저히 억제됨을 확인할 수 있었다. 특히, 혈관의 크기와 상관없이 혈관 개수만을 계수한 본 연구의 혈관 밀도 정량화 방법으로는(34), Ad-ΔB7 아데노바이러스의 투여에 의한 신생혈관 형성 억제효과가 크지 않게 나타났지만, 종양내 형성된 신생혈관의 크기가 대조군인 PBS를 처리한 경우에 비해 현저하게 작음을 관찰할 수 있었으며, Ad-ΔB7-shVEGF를 투여한 종양에서는 혈관의 개수뿐만 아니라 크기도 Ad-ΔB7을 투여한 경우보다 현저하게 감소되어, VEGF-A 특이적 shRNA의 발현에 따른 상승적인 혈관 형성 억제 현상을 확인할 수 있었다. CD31 immunostaining was performed using slides of the same block to more closely determine whether this phenomenon of intratumoral change was indeed due to inhibition of angiogenesis by VEGF-A specific shRNA. As a result, a large and large number of blood vessels were observed inside the tumor tissue treated with PBS, which was a negative control, while the number and size of blood vessels formed in the tumor treated with Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF adenovirus decreased. It was. In particular, in the case of tumors administered with Ad-ΔB7-shVEGF adenovirus expressing VEGF-A specific shRNA, the number of newly formed blood vessels was significantly reduced and the size of the blood vessels was also very small (FIG. 14A). . In order to quantify the density of newly formed blood vessels inside the tumor tissue, blood vessels were counted by randomly selecting 5 sites at 100-fold magnification of blood vessels stained with CD31 positive cells (FIG. 14B). An average of 117.7 ± 8.7 vessels were observed in tumors treated with PBS, a negative control group, whereas the number of intravascular tumors was 101.9 ± 6.2 and the tumor-selective adenoviruses Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7-shVEGF, respectively. 23.8 ± 4.5 blood vessels were observed, indicating that neovascularization was significantly inhibited when tumor selective adenovirus expressing VEGF-A specific shRNA was administered. In particular, the vascular density quantification method of the present study, which counted only the number of blood vessels regardless of the size of blood vessels (34), showed little effect on the inhibition of neovascularization by administration of Ad-ΔB7 adenovirus, but the formation of neovascularization within tumors The size of the blood vessels was significantly smaller than that of the control group treated with PBS. In tumors treated with Ad-ΔB7-shVEGF, not only the number of blood vessels but also the size of the vessels were significantly reduced compared to those treated with Ad-ΔB7. As a result, synergistic inhibition of angiogenesis caused by expression of VEGF-A specific shRNA was confirmed.

또한, 종양 조직 내 아데노바이러스의 복제 양상을 검증하기 위하여, 아데노바이러스의 헥손 부위와 선택적으로 결합하는 항체를 이용하여 IHC를 시행하였다. 도 15에서 볼 수 있듯이, Ad-ΔB7을 투여한 종양의 경우에는 종괴의 넓은 부위에서 아데노바이러스를 검출할 수 있어 아데노바이러스가 종양내부에서 활발히 복제함을 확인할 수 있었으나, Ad-ΔB7-shVEGF를 투여한 종양에서는 종양내의 대부분의 조직이 이미 괴사되어 아데노바이러스를 검출할 수 없었으며 종양 가장자리 일부 국소적 부위에서만 아데노바이러스가 검출되었다.In addition, to verify the replication pattern of adenovirus in tumor tissues, IHC was performed using an antibody that selectively binds to the hexon site of adenovirus. As can be seen in Figure 15, in the case of the tumor administered Ad-ΔB7 adenovirus can be detected in a large area of the mass was confirmed that the adenovirus is actively replicating in the tumor, Ad-ΔB7-shVEGF administered In one tumor, most tissues in the tumor were already necrotic and could not detect adenovirus, but only at some localized areas of the tumor edge.

VEGF-A 특이적 siRNA를 발현하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 모든 종류의 VEGF-A 동형체의 발현을 저해하여 종양내 신생혈관의 형성을 선택적으로 억제함으로써 항종양 효과를 극대화한다. 그리고 VEGF-A 특이적 siRNA를 발현하는 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 낮은 역가의 바이러스로도 높은 살상 효과를 유도할 수 있기 때문에 투여된 체내에서서의 안전성이 매우 우수하다.Recombinant adenovirus of the present invention expressing VEGF-A specific siRNA inhibits the expression of all types of VEGF-A isoforms to maximize the antitumor effect by selectively inhibiting neovascularization in tumors. In addition, the recombinant adenovirus of the present invention expressing VEGF-A specific siRNA is highly excellent in the administered body because it can induce a high killing effect even with a low titer virus.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

참조 문헌Reference

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Claims (19)

(a) 아데노바이러스의 ITR (inverted terminal repeat) 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 서열목록 제1서열의 VEGF-A (vascular endothelial growth factor-A)의 mRNA에 상보적이며 VEGF-A 유전자의 발현을 억제하는 siRNA (small interfering RNA) 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 siRNA 분자는 상기 아데노바이러스의 종양세포 괴사능을 향상시키는 재조합 아데노바이러스로서, (a) an inverted terminal repeat (ITR) nucleotide sequence of adenovirus and (b) mRNA of vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) of SEQ ID NO: 1, which is complementary to the expression of the VEGF-A gene. a nucleotide sequence encoding a small interfering RNA (siRNA) molecule, wherein the siRNA molecule is a recombinant adenovirus that enhances tumor cell necrosis of the adenovirus, 상기 재조합 아데노바이러스는 E3 유전자 영역이 결실된 것이고, 상기 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 E3 유전자 영역에 삽입되고,The recombinant adenovirus is deleted from the E3 gene region, the nucleotide sequence encoding the siRNA molecule is inserted into the E3 gene region, 상기 재조합 아데노바이러스는 비활성화된 E1B 19 유전자, E1B 55 유전자 또는 E1B 19/E1B 55 유전자를 가지며, The recombinant adenovirus has an inactivated E1B 19 gene, E1B 55 gene or E1B 19 / E1B 55 gene, 상기 재조합 아데노바이러스는 활성의 E1A 유전자를 포함하고,The recombinant adenovirus includes an active E1A gene, 상기 재조합 아데노바이러스는 ElA 유전자 서열에 위치한 Rb 결합 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 중에서 45번째 Glu 잔기가 Gly으로 치환된 변이 및 121-127번째 아미노산 서열이 전체적으로 Gly으로 치환된 변이를 갖는 것을 특징으로 하는 종양세포 살상능이 개선된 재조합 아데노바이러스. The recombinant adenovirus has a mutation in which the 45th Glu residue is substituted with Gly and the 121-127 amino acid sequence is completely substituted with Gly in the nucleotide sequence encoding the Rb binding site located in the ElA gene sequence. Recombinant adenovirus with improved cell killing ability. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 VEGF-A mRNA 서열의 379-399 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.The recombinant adenovirus of claim 1, wherein the nucleotide sequence encoding the siRNA molecule has a 379-399 nucleotide sequence of the VEGF-A mRNA sequence of SEQ ID NO: 1. 제 6 항에 있어서, 상기 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 VEGF-A mRNA 서열의 379-399 뉴클레오타이드 서열과 이에 상보적인 서열이 동일한 가닥 (strand)에 모두 존재하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.The nucleotide sequence encoding the siRNA molecule is characterized in that the 379-399 nucleotide sequence of the VEGF-A mRNA sequence of SEQ ID NO: 1 sequence and the complementary sequence are all present in the same strand (strand) Recombinant adenovirus. 제 1 항에 있어서, 상기 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.The recombinant adenovirus of claim 1, wherein the nucleotide sequence encoding the siRNA molecule comprises SEQ ID NO: 2. 제 7 항에 있어서, 상기 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 VEGF-A mRNA 서열의 379-399 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 서열 (corresponding sequence) 및 상보적인 서열 (complementary sequence)을 가지며, 상기 해당하는 서열과 상보적인 서열 사이에 헤어핀 구조를 형성하게 하는 서열이 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.The nucleotide sequence encoding the siRNA molecule has a corresponding sequence and a complementary sequence corresponding to the 379-399 nucleotide sequence of the VEGF-A mRNA sequence of SEQ ID NO: 1 Recombinant adenovirus, characterized in that the sequence is inserted between the corresponding sequence and the complementary sequence to form a hairpin structure. 제 9 항에 있어서, 상기 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.10. The recombinant adenovirus of claim 9, wherein the nucleotide sequence encoding the siRNA molecule comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. 제 10 항에 있어서, 상기 siRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아 데노바이러스.The recombinant adenovirus according to claim 10, wherein the nucleotide sequence encoding the siRNA molecule comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4. 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 도 3d - 도 3I로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자 지도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.The recombinant adenovirus of claim 1, wherein the recombinant adenovirus has a genetic map selected from the group consisting of FIGS. 3D-3I. (a) 상기 제 1 항 및 제 6 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물. (a) a therapeutically effective amount of the recombinant adenovirus of any one of claims 1 and 6-12; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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