JP2000078989A - ヒト成長ホルモンの分泌生産方法 - Google Patents
ヒト成長ホルモンの分泌生産方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 微生物を用いた２０ＫｈＧＨのより効果的な
分泌生産方法を提供し、ペリプラズム抽出溶液中に夾雑
する不純物蛋白質がより少ない、微生物を用いた２０Ｋ
ｈＧＨの分泌生産方法を提供する。 【解決手段】 大腸菌ＯｐｐＡ蛋白質の分泌シグナルま
たはその改変体をコードする遺伝子の直後に２０ＫｈＧ
ＨをコードするＤＮＡを結合したＤＮＡ配列及びシグナ
ルペプチダーゼ１をコードするＤＮＡを含む組換えプラ
スミドを構築し、該プラスミドで大腸菌を形質転換し、
該大腸菌形質転換体を培養して２０ＫｈＧＨを大腸菌の
ペリプラズム中に分泌生産させる。 【効果】 ２０ＫｈＧＨが大腸菌のペリプラズムに従来
の方法に比べ効率よく分泌できる。また、得られるペリ
プラズム抽出溶液は夾雑蛋白質が少ないため２０ＫｈＧ
Ｈの精製が容易である。
分泌生産方法を提供し、ペリプラズム抽出溶液中に夾雑
する不純物蛋白質がより少ない、微生物を用いた２０Ｋ
ｈＧＨの分泌生産方法を提供する。 【解決手段】 大腸菌ＯｐｐＡ蛋白質の分泌シグナルま
たはその改変体をコードする遺伝子の直後に２０ＫｈＧ
ＨをコードするＤＮＡを結合したＤＮＡ配列及びシグナ
ルペプチダーゼ１をコードするＤＮＡを含む組換えプラ
スミドを構築し、該プラスミドで大腸菌を形質転換し、
該大腸菌形質転換体を培養して２０ＫｈＧＨを大腸菌の
ペリプラズム中に分泌生産させる。 【効果】 ２０ＫｈＧＨが大腸菌のペリプラズムに従来
の方法に比べ効率よく分泌できる。また、得られるペリ
プラズム抽出溶液は夾雑蛋白質が少ないため２０ＫｈＧ
Ｈの精製が容易である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、大腸菌を用いた分
子量約２００００のヒト成長ホルモンの分泌生産法に関
するものである。詳しくは、本発明は大腸菌またはサル
モネラ菌のＯｐｐＡの分泌シグナルまたは大腸菌Ｏｐｐ
Ａ分泌シグナルのアミノ酸改変体をコードするＤＮＡ断
片の３’末端に分子量約２００００のヒト成長ホルモン
をコードするＤＮＡ断片の５’末端が直列に結合したＤ
ＮＡ断片を有する組換えプラスミドで形質転換した大腸
菌形質転換体を培養して得られる培養液、菌体、または
それらの処理物を用いて、分子量約２００００のヒト成
長ホルモンを生産する方法に関する。
子量約２００００のヒト成長ホルモンの分泌生産法に関
するものである。詳しくは、本発明は大腸菌またはサル
モネラ菌のＯｐｐＡの分泌シグナルまたは大腸菌Ｏｐｐ
Ａ分泌シグナルのアミノ酸改変体をコードするＤＮＡ断
片の３’末端に分子量約２００００のヒト成長ホルモン
をコードするＤＮＡ断片の５’末端が直列に結合したＤ
ＮＡ断片を有する組換えプラスミドで形質転換した大腸
菌形質転換体を培養して得られる培養液、菌体、または
それらの処理物を用いて、分子量約２００００のヒト成
長ホルモンを生産する方法に関する。
【０００２】また、本発明は分子量約２００００のヒト
成長ホルモンをコードするＤＮＡ断片と大腸菌シグナル
ペプチダーゼ１をコードするＤＮＡとを有する組換えプ
ラスミドで形質転換した大腸菌形質転換体を培養して得
られる培養液、菌体、またはそれらの処理物を用いて、
分子量約２００００のヒト成長ホルモンを生産する方法
に関する。更に、本発明は上記の構成の組換えプラスミ
ドで形質転換した形質転換体を培養して分子量約２００
００のヒト成長ホルモンを生産する際の培地組成の変更
によりその生産量を増大させる方法にも関する。
成長ホルモンをコードするＤＮＡ断片と大腸菌シグナル
ペプチダーゼ１をコードするＤＮＡとを有する組換えプ
ラスミドで形質転換した大腸菌形質転換体を培養して得
られる培養液、菌体、またはそれらの処理物を用いて、
分子量約２００００のヒト成長ホルモンを生産する方法
に関する。更に、本発明は上記の構成の組換えプラスミ
ドで形質転換した形質転換体を培養して分子量約２００
００のヒト成長ホルモンを生産する際の培地組成の変更
によりその生産量を増大させる方法にも関する。
【０００３】
【従来の技術】下垂体由来のヒト成長ホルモン（ｈＧ
Ｈ）には、分子量約２２０００のもの（以下、２２Ｋｈ
ＧＨ）と分子量約２００００のもの（以下、２０ＫｈＧ
Ｈ）の存在が知られている。
Ｈ）には、分子量約２２０００のもの（以下、２２Ｋｈ
ＧＨ）と分子量約２００００のもの（以下、２０ＫｈＧ
Ｈ）の存在が知られている。
【０００４】２２ＫｈＧＨは、遺伝子組換え技術により
製造された医薬品が、下垂体不全性低身長症や小児慢性
腎不全などの治療に用いられている。ｈＧＨは、成長促
進活性のほか、免疫賦活作用や体脂肪分解促進作用など
優れた作用を有することが近年明らかになり、今後、適
応対象の拡大が大いに期待されている。
製造された医薬品が、下垂体不全性低身長症や小児慢性
腎不全などの治療に用いられている。ｈＧＨは、成長促
進活性のほか、免疫賦活作用や体脂肪分解促進作用など
優れた作用を有することが近年明らかになり、今後、適
応対象の拡大が大いに期待されている。
【０００５】その一方で、２２ＫｈＧＨの臨床使用にお
いて副作用発症のリスクが近年多く報告され、臨床にお
けるＧＨの安全性の保証や、今後の適応拡大を進める上
での大きな課題になっている。これまでの２２ＫｈＧＨ
のリスクに関する報告には、例えば、白血病誘発性や、
糖尿病原性などがある。ＧＨの適応拡大への期待がある
中で、副作用リスクの低いＧＨが臨床の現場において希
求されている。
いて副作用発症のリスクが近年多く報告され、臨床にお
けるＧＨの安全性の保証や、今後の適応拡大を進める上
での大きな課題になっている。これまでの２２ＫｈＧＨ
のリスクに関する報告には、例えば、白血病誘発性や、
糖尿病原性などがある。ＧＨの適応拡大への期待がある
中で、副作用リスクの低いＧＨが臨床の現場において希
求されている。
【０００６】２０ＫｈＧＨは、２２ＫｈＧＨを構成する
１９１個のアミノ酸のうち、アミノ酸配列のＮ末端から
数えて３２番目〜４６番目の１５個のアミノ酸が欠落し
た配列を有している。この２０ＫｈＧＨは２２ＫｈＧＨ
に比べ、白血病細胞の増殖促進活性能が低いことや、糖
尿病原性の指標である耐糖能異常誘発性が低いことが報
告され、２２ＫｈＧＨで指摘されている副作用発症のリ
スクが低いことが判明している。また、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏの実験結果からＧＨ受容体に対する結合様式において
も、２０ＫｈＧＨは２２ＫｈＧＨと異なることが近年明
らかになった。即ち、Ｍ．Ｗａｄａらは、２２ＫｈＧＨ
が生理濃度域で血清中に存在するＧＨ結合蛋白（ＧＨ受
容体膜外領域蛋白）と結合することにより細胞表面上の
ＧＨ受容体との結合活性が減弱してしまうのに対し、２
０ＫｈＧＨは生理濃度においてＧＨ結合蛋白と結合し難
いため、ＧＨ結合蛋白によるＧＨ受容体に対する結合能
の減弱がないこと、さらに、ＧＨがＧＨ受容体を介して
作用する際に必要な１：２会合体（ＧＨ１分子とＧＨ受
容体２分子の会合体）の形成についても、薬理濃度（高
濃度域）において２２ＫｈＧＨが１：１会合体（不活性
型）を形成するのに対して、２０ＫｈＧＨはＧＨ受容体
と１：２会合体（活性型）を形成する点で性質が異なる
ことを明らかにしている（Mol.Endo.12,1,p146-156(199
7)）。これらの結果から、２０ＫｈＧＨは、２２ＫｈＧ
Ｈよりも強い活性を有する可能性が期待される。また、
これまで不明であった脂肪分解促進作用についても、２
２ＫｈＧＨ同様に２０ＫｈＧＨが有していることも明ら
かになっている（特開平９−２１６８３２号公報、又は
欧州特許公開第０７５３３０７号明細書）。
１９１個のアミノ酸のうち、アミノ酸配列のＮ末端から
数えて３２番目〜４６番目の１５個のアミノ酸が欠落し
た配列を有している。この２０ＫｈＧＨは２２ＫｈＧＨ
に比べ、白血病細胞の増殖促進活性能が低いことや、糖
尿病原性の指標である耐糖能異常誘発性が低いことが報
告され、２２ＫｈＧＨで指摘されている副作用発症のリ
スクが低いことが判明している。また、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏの実験結果からＧＨ受容体に対する結合様式において
も、２０ＫｈＧＨは２２ＫｈＧＨと異なることが近年明
らかになった。即ち、Ｍ．Ｗａｄａらは、２２ＫｈＧＨ
が生理濃度域で血清中に存在するＧＨ結合蛋白（ＧＨ受
容体膜外領域蛋白）と結合することにより細胞表面上の
ＧＨ受容体との結合活性が減弱してしまうのに対し、２
０ＫｈＧＨは生理濃度においてＧＨ結合蛋白と結合し難
いため、ＧＨ結合蛋白によるＧＨ受容体に対する結合能
の減弱がないこと、さらに、ＧＨがＧＨ受容体を介して
作用する際に必要な１：２会合体（ＧＨ１分子とＧＨ受
容体２分子の会合体）の形成についても、薬理濃度（高
濃度域）において２２ＫｈＧＨが１：１会合体（不活性
型）を形成するのに対して、２０ＫｈＧＨはＧＨ受容体
と１：２会合体（活性型）を形成する点で性質が異なる
ことを明らかにしている（Mol.Endo.12,1,p146-156(199
7)）。これらの結果から、２０ＫｈＧＨは、２２ＫｈＧ
Ｈよりも強い活性を有する可能性が期待される。また、
これまで不明であった脂肪分解促進作用についても、２
２ＫｈＧＨ同様に２０ＫｈＧＨが有していることも明ら
かになっている（特開平９−２１６８３２号公報、又は
欧州特許公開第０７５３３０７号明細書）。
【０００７】以上のように、２０ＫｈＧＨは２２ＫｈＧ
Ｈよりもリスクが低く、かつ、同等以上の活性を有する
成長ホルモンであることなどが明らかになり新規成長ホ
ルモンとして医薬品としての有用性に期待が集まってい
る。
Ｈよりもリスクが低く、かつ、同等以上の活性を有する
成長ホルモンであることなどが明らかになり新規成長ホ
ルモンとして医薬品としての有用性に期待が集まってい
る。
【０００８】近年、組換えＤＮＡ技術の進歩により、微
生物を宿主として異種蛋白質を生産することが可能にな
った。微生物による蛋白質の生産には菌体内発現法と分
泌生産法がある。菌体内発現法はＮ末端にメチオニンが
付加した蛋白質が細胞質内に蓄積する。蛋白質のＮ末端
のメチオニン残基のない蛋白質を得るため、例えばペプ
チダーゼを用いてＮ末のメチオニン残基を含むアミノ酸
配列を酵素的に切断することが必要である。さらに菌体
内発現法で得られた蛋白質は立体構造が活性型でなく、
リフォールディリングの操作が必要である。菌体内発現
法は以上の点で効率よい蛋白質生産方法とは言えない場
合が多い。
生物を宿主として異種蛋白質を生産することが可能にな
った。微生物による蛋白質の生産には菌体内発現法と分
泌生産法がある。菌体内発現法はＮ末端にメチオニンが
付加した蛋白質が細胞質内に蓄積する。蛋白質のＮ末端
のメチオニン残基のない蛋白質を得るため、例えばペプ
チダーゼを用いてＮ末のメチオニン残基を含むアミノ酸
配列を酵素的に切断することが必要である。さらに菌体
内発現法で得られた蛋白質は立体構造が活性型でなく、
リフォールディリングの操作が必要である。菌体内発現
法は以上の点で効率よい蛋白質生産方法とは言えない場
合が多い。
【０００９】一方、大腸菌を用いた分泌生産法は、目的
蛋白質がペリプラズムに分泌蓄積される。このペリプラ
ズム抽出液からの精製は夾雑蛋白質量が菌体内発現法に
比較して少ないため精製が容易であるばかりでなく、分
泌された蛋白質はＮ末端にメチオニンを含まず、立体構
造も天然型の活性体である点で優れた方法である。
蛋白質がペリプラズムに分泌蓄積される。このペリプラ
ズム抽出液からの精製は夾雑蛋白質量が菌体内発現法に
比較して少ないため精製が容易であるばかりでなく、分
泌された蛋白質はＮ末端にメチオニンを含まず、立体構
造も天然型の活性体である点で優れた方法である。
【００１０】とはいえ、微生物を用いた蛋白質の分泌生
産法は高度な技術が必要なため工業的に実用化された例
は少ない。その理由は、細胞質内で合成された前駆体蛋
白質が細胞質膜を透過し、かつプロセッシングにより正
しく分泌シグナルが切断除去されることが必要なためで
ある。
産法は高度な技術が必要なため工業的に実用化された例
は少ない。その理由は、細胞質内で合成された前駆体蛋
白質が細胞質膜を透過し、かつプロセッシングにより正
しく分泌シグナルが切断除去されることが必要なためで
ある。
【００１１】微生物における蛋白質の分泌については、
そのメカニズム、関与する因子やその働きなどが明らか
になり、それらの知見に基づいて、蛋白質の効率的な分
泌方法に関する様々な試みがなされてきた。
そのメカニズム、関与する因子やその働きなどが明らか
になり、それらの知見に基づいて、蛋白質の効率的な分
泌方法に関する様々な試みがなされてきた。
【００１２】第１番目に挙げられるものに分泌シグナル
の検討がある。分泌シグナルは目的蛋白質を細胞質膜ま
で導くという蛋白質の分泌において極めて重要な働きを
果たす。分泌シグナルが作用するためには、そのＮ末端
の正電荷領域のポジティブチャ−ジと中央部疎水領域の
疎水性が必須であることが明らかになっている（J.Bio
l. Chem.,267,pp.4882-4888,1992）。鵜高らはこの分
泌シグナルの構造上の特徴に関する知見に基づき、バチ
ルス・ブレビス（Bacillus brevis）を宿主として用い
た分泌生産において、バチルス・ブレビス由来のＭＷＰ
（Middle WallProtein）の分泌シグナルのＮ末端正電荷
領域に塩基性アミノ酸（Ａｒｇ）を付加し、かつ中央部
疎水性領域に疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ）を付加する改変
を行い、ヒラメ成長ホルモンの分泌効率を６０ｍｇ／Ｌ
まで向上させたことを報告している（Nippon Nogeikaga
ku kaishi, 67(3), p.372, (1993)）。
の検討がある。分泌シグナルは目的蛋白質を細胞質膜ま
で導くという蛋白質の分泌において極めて重要な働きを
果たす。分泌シグナルが作用するためには、そのＮ末端
の正電荷領域のポジティブチャ−ジと中央部疎水領域の
疎水性が必須であることが明らかになっている（J.Bio
l. Chem.,267,pp.4882-4888,1992）。鵜高らはこの分
泌シグナルの構造上の特徴に関する知見に基づき、バチ
ルス・ブレビス（Bacillus brevis）を宿主として用い
た分泌生産において、バチルス・ブレビス由来のＭＷＰ
（Middle WallProtein）の分泌シグナルのＮ末端正電荷
領域に塩基性アミノ酸（Ａｒｇ）を付加し、かつ中央部
疎水性領域に疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ）を付加する改変
を行い、ヒラメ成長ホルモンの分泌効率を６０ｍｇ／Ｌ
まで向上させたことを報告している（Nippon Nogeikaga
ku kaishi, 67(3), p.372, (1993)）。
【００１３】とはいえ、分泌シグナルのアミノ酸配列の
改変方針については、普遍的な指導原理はなく、試行錯
誤により好ましい配列を見い出さなければならないのが
現状である。また、分泌生産させる蛋白質に対してどの
ような分泌蛋白質由来の分泌シグナルを選択すべきかに
ついて今日まで明確な指針はなく、分泌生産させる蛋白
質毎に適する分泌シグナルを見い出さなくてはならな
い。
改変方針については、普遍的な指導原理はなく、試行錯
誤により好ましい配列を見い出さなければならないのが
現状である。また、分泌生産させる蛋白質に対してどの
ような分泌蛋白質由来の分泌シグナルを選択すべきかに
ついて今日まで明確な指針はなく、分泌生産させる蛋白
質毎に適する分泌シグナルを見い出さなくてはならな
い。
【００１４】以上のことは、例えば特開平６−２９６４
９１号公報から理解される。該公報には、２２ＫｈＧＨ
の分泌生産に有効であったアルカリフォスファタ−ゼま
たはエンテロトキシン由来の分泌シグナルが、数種の真
核性蛋白質の分泌生産には必ずしも有効でないことが記
載されている。即ち、分泌シグナルと分泌蛋白質の組み
合わせ次第で、蛋白質が合成されなかった例、細胞質内
で蛋白質が発現するが分泌されず、前駆体蛋白質が細胞
質内に留まったままであった例が報告されている。
９１号公報から理解される。該公報には、２２ＫｈＧＨ
の分泌生産に有効であったアルカリフォスファタ−ゼま
たはエンテロトキシン由来の分泌シグナルが、数種の真
核性蛋白質の分泌生産には必ずしも有効でないことが記
載されている。即ち、分泌シグナルと分泌蛋白質の組み
合わせ次第で、蛋白質が合成されなかった例、細胞質内
で蛋白質が発現するが分泌されず、前駆体蛋白質が細胞
質内に留まったままであった例が報告されている。
【００１５】このように、分泌蛋白質の各々について適
切な分泌シグナルを選択する必要があるが、今日まで、
いかなる蛋白質の分泌にも使用可能な分泌シグナルは見
い出されてはいない。
切な分泌シグナルを選択する必要があるが、今日まで、
いかなる蛋白質の分泌にも使用可能な分泌シグナルは見
い出されてはいない。
【００１６】第２番目に挙げられる試みとしては、蛋白
の共発現による分泌生産性向上の検討がある。これまで
にＧＨ以外の蛋白質の分泌生産については、インターロ
イキン−６の分泌生産がＳｅｃＥ及びｐｒｌＡ４（Ｓｅ
ｃＹの変異蛋白質）の共発現により向上したこと（BIO/
TECHNOLOGY, 12, pp.178-180 (1994)）、Human Granulo
cyte-colony Stimulating factor（Ｇ-ＣＳＦ）の分泌
生産性がシャペロン蛋白を共発現させることにより向上
すること（Biochem. Biophys. Res. Commun.,210(2), p
p.524-529 (1995)）などが報告されている。
の共発現による分泌生産性向上の検討がある。これまで
にＧＨ以外の蛋白質の分泌生産については、インターロ
イキン−６の分泌生産がＳｅｃＥ及びｐｒｌＡ４（Ｓｅ
ｃＹの変異蛋白質）の共発現により向上したこと（BIO/
TECHNOLOGY, 12, pp.178-180 (1994)）、Human Granulo
cyte-colony Stimulating factor（Ｇ-ＣＳＦ）の分泌
生産性がシャペロン蛋白を共発現させることにより向上
すること（Biochem. Biophys. Res. Commun.,210(2), p
p.524-529 (1995)）などが報告されている。
【００１７】２０ＫｈＧＨの分泌生産に関しては、グル
タチオンレダクターゼを２０ＫｈＧＨと共発現させる方
法（特開平８−３２２５８６、又は欧州特許公開第０７
３５１４０号明細書）、大腸菌のＳｅｃ蛋白質を２０Ｋ
ｈＧＨと共発現させる方法（特開平９−３１３１９１、
又は欧州特許公開第０７９８３８０号明細書）が報告さ
れている。
タチオンレダクターゼを２０ＫｈＧＨと共発現させる方
法（特開平８−３２２５８６、又は欧州特許公開第０７
３５１４０号明細書）、大腸菌のＳｅｃ蛋白質を２０Ｋ
ｈＧＨと共発現させる方法（特開平９−３１３１９１、
又は欧州特許公開第０７９８３８０号明細書）が報告さ
れている。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】上述の特開平８−３２
２５８６（又は欧州特許公開第０７３５１４０号明細
書）のグルタチオンレダクターゼの共発現による２０Ｋ
ｈＧＨの生産方法によれば、１Ｌ培養液あたり約７０ｍ
ｇの生産が可能になったが、さらに高い生産性が望まれ
る。
２５８６（又は欧州特許公開第０７３５１４０号明細
書）のグルタチオンレダクターゼの共発現による２０Ｋ
ｈＧＨの生産方法によれば、１Ｌ培養液あたり約７０ｍ
ｇの生産が可能になったが、さらに高い生産性が望まれ
る。
【００１９】また、このようにグルタチオンレダクター
ゼの共発現により分泌生産性は向上したが、本発明者ら
の検討によれば、この方法においては、これらの菌体か
ら浸透圧ショック法により得られるペリプラズム抽出溶
液中には目的蛋白質である２０ＫｈＧＨ以外の夾雑蛋白
質が相当量含まれることが判明した。そのためペリプラ
ズム抽出溶液からの２０ｈＧＨの精製を煩雑なものに
し、２０ＫｈＧＨを医薬品グレード程度に高純度に精製
するために多大なコストを要する。
ゼの共発現により分泌生産性は向上したが、本発明者ら
の検討によれば、この方法においては、これらの菌体か
ら浸透圧ショック法により得られるペリプラズム抽出溶
液中には目的蛋白質である２０ＫｈＧＨ以外の夾雑蛋白
質が相当量含まれることが判明した。そのためペリプラ
ズム抽出溶液からの２０ｈＧＨの精製を煩雑なものに
し、２０ＫｈＧＨを医薬品グレード程度に高純度に精製
するために多大なコストを要する。
【００２０】本発明の課題は、微生物を用いた２０Ｋｈ
ＧＨのより効率的な分泌生産方法を提供することにあ
り、本発明の他の課題は、ペリプラズム抽出溶液中に夾
雑する不純蛋白質がより少ない、微生物を用いた２０Ｋ
ｈＧＨの分泌生産方法を提供することにある。
ＧＨのより効率的な分泌生産方法を提供することにあ
り、本発明の他の課題は、ペリプラズム抽出溶液中に夾
雑する不純蛋白質がより少ない、微生物を用いた２０Ｋ
ｈＧＨの分泌生産方法を提供することにある。
【００２１】本発明の目的は、大腸菌のＯｐｐＡの分泌
シグナルを改変した分泌シグナルをコードするＤＮＡの
３’末端に２０ＫｈＧＨをコードするＤＮＡの５’末端
が結合しているＤＮＡ断片を含むプラスミドを提供する
こと、該プラスミドで形質転換された大腸菌形質転換
体、該大腸菌形質転換体を使用した２０ＫｈＧＨの分泌
生産方法を提供することにある。
シグナルを改変した分泌シグナルをコードするＤＮＡの
３’末端に２０ＫｈＧＨをコードするＤＮＡの５’末端
が結合しているＤＮＡ断片を含むプラスミドを提供する
こと、該プラスミドで形質転換された大腸菌形質転換
体、該大腸菌形質転換体を使用した２０ＫｈＧＨの分泌
生産方法を提供することにある。
【００２２】本発明の他の目的は、２０ＫｈＧＨをコー
ドするＤＮＡと大腸菌シグナルペプチダーゼ１をコード
するＤＮＡとを有する組換えプラスミド、該プラスミド
で形質転換された大腸菌形質転換体、該大腸菌形質転換
体を使用した２０ＫｈＧＨの分泌生産方法を提供するこ
とにある。
ドするＤＮＡと大腸菌シグナルペプチダーゼ１をコード
するＤＮＡとを有する組換えプラスミド、該プラスミド
で形質転換された大腸菌形質転換体、該大腸菌形質転換
体を使用した２０ＫｈＧＨの分泌生産方法を提供するこ
とにある。
【００２３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、特開平８−３２２５８６（又は欧州
特許公開第０７３５１４０号明細書）に記載の公知菌株
であり、分泌シグナルとしてバチルス・アミロリキファ
シエンスの中性プロテアーゼ由来の分泌シグナルを改変
した分泌シグナルを用い、更に共発現蛋白質として大腸
菌由来のグルタチオンレダクターゼを用いている２０Ｋ
ｈＧＨを分泌生産可能な大腸菌形質転換株ＭＴ−１０７
６５（ＦＥＲＭ ＢＰ−５０２０）の改良を試みた。
を解決するために、特開平８−３２２５８６（又は欧州
特許公開第０７３５１４０号明細書）に記載の公知菌株
であり、分泌シグナルとしてバチルス・アミロリキファ
シエンスの中性プロテアーゼ由来の分泌シグナルを改変
した分泌シグナルを用い、更に共発現蛋白質として大腸
菌由来のグルタチオンレダクターゼを用いている２０Ｋ
ｈＧＨを分泌生産可能な大腸菌形質転換株ＭＴ−１０７
６５（ＦＥＲＭ ＢＰ−５０２０）の改良を試みた。
【００２４】先ずはじめに、２０ＫｈＧＨをより効率よ
く分泌生産し得る新しい分泌シグナルの検討を行った。
く分泌生産し得る新しい分泌シグナルの検討を行った。
【００２５】新しい分泌シグナルの有効性を確認するに
は、各分泌シグナルの２０ＫｈＧＨの分泌生産量に対す
る効果を確認することが必要である。その方法は、２０
ＫｈＧＨをコードするＤＮＡの５’末端に種々の分泌シ
グナルをコードするＤＮＡの３’末端を結合させたＤＮ
Ａ断片を含むプラスミドを構築し、該プラスミドで形質
転換された大腸菌を分離し、さらに得られた大腸菌形質
転換体を培養して、２０ＫｈＧＨの分泌生産量を測定す
るという一連の行程よりなる。
は、各分泌シグナルの２０ＫｈＧＨの分泌生産量に対す
る効果を確認することが必要である。その方法は、２０
ＫｈＧＨをコードするＤＮＡの５’末端に種々の分泌シ
グナルをコードするＤＮＡの３’末端を結合させたＤＮ
Ａ断片を含むプラスミドを構築し、該プラスミドで形質
転換された大腸菌を分離し、さらに得られた大腸菌形質
転換体を培養して、２０ＫｈＧＨの分泌生産量を測定す
るという一連の行程よりなる。
【００２６】本発明者らは、微生物で多量に分泌される
蛋白質の分泌シグナルを利用することにより２０ＫｈＧ
Ｈの生産性向上を試みた。しかし、この方法では２０Ｋ
ｈＧＨの分泌生産において従来知られている方法以上に
２０ＫｈＧＨの生産性を向上させる分泌シグナルを見出
すには至らなかった。
蛋白質の分泌シグナルを利用することにより２０ＫｈＧ
Ｈの生産性向上を試みた。しかし、この方法では２０Ｋ
ｈＧＨの分泌生産において従来知られている方法以上に
２０ＫｈＧＨの生産性を向上させる分泌シグナルを見出
すには至らなかった。
【００２７】蛋白質の分泌は、蛋白質がエネルギー依存
的に細胞膜を通過するという物理化学的な現象である。
そこで、本発明者らは２０ＫｈＧＨと構造上の類似性が
高い蛋白質の分泌シグナルが好ましいのではないかとい
う仮説を立て、これを検証した。２０ＫｈＧＨと構造上
の類似性が高い蛋白質として、アミノ酸配列の相同性の
高い蛋白質及び精製カラム内での挙動が２０ＫｈＧＨと
類似している蛋白質を選択した。アミノ酸配列の相同性
の高い蛋白質としては、アミノ酸配列のホモロジ−検索
により、ＴＲＢＣ（Meneewannakul, S. ら、J. Bacteri
ol. 173, 3872-3878 (1991)）及びＤＰＰＡ（Periplasm
ic Dipeptide Transport Protein Precursor (Dipeptid
e-Binding Protein)）（Olson, E. R. ら、J. Bacterio
l., 173,234-244 (1991)）を選択した。また、精製カラ
ムにおける挙動が２０ＫｈＧＨと類似している蛋白質と
しては、本発明者らの検討によりイオン交換カラム、親
和クロマトカラムにおける挙動が２０ＫｈＧＨと類似し
ていることが判明していた大腸菌ＯｐｐＡ（Periplasmi
c Oligopeptide Binding Protein）（K. Kashiwagiら、
J. Biol. Chem., 265, 8387-8391 (1990)）を選択し
た。
的に細胞膜を通過するという物理化学的な現象である。
そこで、本発明者らは２０ＫｈＧＨと構造上の類似性が
高い蛋白質の分泌シグナルが好ましいのではないかとい
う仮説を立て、これを検証した。２０ＫｈＧＨと構造上
の類似性が高い蛋白質として、アミノ酸配列の相同性の
高い蛋白質及び精製カラム内での挙動が２０ＫｈＧＨと
類似している蛋白質を選択した。アミノ酸配列の相同性
の高い蛋白質としては、アミノ酸配列のホモロジ−検索
により、ＴＲＢＣ（Meneewannakul, S. ら、J. Bacteri
ol. 173, 3872-3878 (1991)）及びＤＰＰＡ（Periplasm
ic Dipeptide Transport Protein Precursor (Dipeptid
e-Binding Protein)）（Olson, E. R. ら、J. Bacterio
l., 173,234-244 (1991)）を選択した。また、精製カラ
ムにおける挙動が２０ＫｈＧＨと類似している蛋白質と
しては、本発明者らの検討によりイオン交換カラム、親
和クロマトカラムにおける挙動が２０ＫｈＧＨと類似し
ていることが判明していた大腸菌ＯｐｐＡ（Periplasmi
c Oligopeptide Binding Protein）（K. Kashiwagiら、
J. Biol. Chem., 265, 8387-8391 (1990)）を選択し
た。
【００２８】以上３種類の蛋白質の分泌シグナルについ
て２０ＫｈＧＨの分泌生産性に与える効果に検討したと
ころ、ＴＲＢＣ、ＤＰＰＡ由来の分泌シグナルでは２０
ＫｈＧＨの分泌生産量が１ｍｇ／Ｌ以下で、２０ＫｈＧ
Ｈの分泌生産性の向上効果はなかった。しかし、驚いた
ことに大腸菌ＯｐｐＡ分泌シグナルを用いた場合には、
特開平８−３２２５８６（又は欧州特許公開第０７３５
１４０号明細書）に記載のＭＴ−１０７６５（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５０２０）を上回る２０ＫｈＧＨの分泌生産量
が得られることがわかった。
て２０ＫｈＧＨの分泌生産性に与える効果に検討したと
ころ、ＴＲＢＣ、ＤＰＰＡ由来の分泌シグナルでは２０
ＫｈＧＨの分泌生産量が１ｍｇ／Ｌ以下で、２０ＫｈＧ
Ｈの分泌生産性の向上効果はなかった。しかし、驚いた
ことに大腸菌ＯｐｐＡ分泌シグナルを用いた場合には、
特開平８−３２２５８６（又は欧州特許公開第０７３５
１４０号明細書）に記載のＭＴ−１０７６５（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５０２０）を上回る２０ＫｈＧＨの分泌生産量
が得られることがわかった。
【００２９】さらに、本発明者らはＯｐｐＡ由来の分泌
シグナルの改変による更なる２０ＫｈＧＨの分泌生産性
の向上を試みた。その結果、Ｎ末配列部分の正電荷領域
に塩基性アミノ酸であるリジンを、中央部疎水領域に疎
水性アミノ酸であるＬｅｕを適当なアミノ酸数を挿入し
た分泌シグナルは、天然型のＯｐｐＡ由来の分泌シグナ
ルに比べてさらに高い２０ＫｈＧＨの分泌生産性を示
し、１Ｌ培養液あたり１１０ｍｇ以上の分泌生産性が達
成された。
シグナルの改変による更なる２０ＫｈＧＨの分泌生産性
の向上を試みた。その結果、Ｎ末配列部分の正電荷領域
に塩基性アミノ酸であるリジンを、中央部疎水領域に疎
水性アミノ酸であるＬｅｕを適当なアミノ酸数を挿入し
た分泌シグナルは、天然型のＯｐｐＡ由来の分泌シグナ
ルに比べてさらに高い２０ＫｈＧＨの分泌生産性を示
し、１Ｌ培養液あたり１１０ｍｇ以上の分泌生産性が達
成された。
【００３０】大腸菌における分泌生産において、大腸菌
のＯｐｐＡ分泌シグナルが蛋白質の分泌に有効な機能を
果すことはすでに公知で本出願の請求の範囲外である
が、このような２０ＫｈＧＨの分泌生産にＯｐｐＡ分泌
シグナルの改変分泌シグナルが極めて有効であること
は、既知の情報からは類推不可能である。
のＯｐｐＡ分泌シグナルが蛋白質の分泌に有効な機能を
果すことはすでに公知で本出願の請求の範囲外である
が、このような２０ＫｈＧＨの分泌生産にＯｐｐＡ分泌
シグナルの改変分泌シグナルが極めて有効であること
は、既知の情報からは類推不可能である。
【００３１】本発明の課題を解決するための第２の試み
として、本発明者らは蛋白質の共発現に関する改良を検
討した。
として、本発明者らは蛋白質の共発現に関する改良を検
討した。
【００３２】その結果、大腸菌由来のシグナルペプチダ
ーゼ１が特開平８−３２２５８６号公報（又は欧州特許
公開第０７３５１４０号明細書）に記載のグルタチオン
レダクターゼとほぼ同等の２０ＫｈＧＨの分泌生産量を
与えることを見出した。
ーゼ１が特開平８−３２２５８６号公報（又は欧州特許
公開第０７３５１４０号明細書）に記載のグルタチオン
レダクターゼとほぼ同等の２０ＫｈＧＨの分泌生産量を
与えることを見出した。
【００３３】しかも、驚くべきことに、シグナルペプチ
ダーゼ１を共発現させた際には、グルタチオンレダクタ
ーゼを共発現させた場合と比較して、その培養菌体から
浸透圧ショック法により抽出されるペリプラズム溶液中
に存在する２０ＫｈＧＨ以外の夾雑蛋白質の割合が非常
に低いことを発見した。この原因は不明ではあるが、グ
ルタチオンレダクターゼよりもシグナルペプチダーゼ１
の方が、２０ＫｈＧＨ発現による菌体の受けるストレス
を低減させる働きが強く、その結果、培養菌体の溶菌傾
向が少なくなり、細胞質内蛋白質のペリプラズム抽出溶
液中への混入量が減少したものと推測された。このペリ
プラズム溶液中の夾雑蛋白質の減少はペリプラズム画分
抽出溶液からの２０ＫｈＧＨの精製を容易にする効果が
あり、精製効率の向上など２０ＫｈＧＨの製造コスト削
減などに大きく寄与する。
ダーゼ１を共発現させた際には、グルタチオンレダクタ
ーゼを共発現させた場合と比較して、その培養菌体から
浸透圧ショック法により抽出されるペリプラズム溶液中
に存在する２０ＫｈＧＨ以外の夾雑蛋白質の割合が非常
に低いことを発見した。この原因は不明ではあるが、グ
ルタチオンレダクターゼよりもシグナルペプチダーゼ１
の方が、２０ＫｈＧＨ発現による菌体の受けるストレス
を低減させる働きが強く、その結果、培養菌体の溶菌傾
向が少なくなり、細胞質内蛋白質のペリプラズム抽出溶
液中への混入量が減少したものと推測された。このペリ
プラズム溶液中の夾雑蛋白質の減少はペリプラズム画分
抽出溶液からの２０ＫｈＧＨの精製を容易にする効果が
あり、精製効率の向上など２０ＫｈＧＨの製造コスト削
減などに大きく寄与する。
【００３４】シグナルペプチダーゼ１は、細胞質内に生
成した前駆体蛋白質が膜を透過する際に分泌シグナルを
切断する酵素である。Jan Maarten van Dijlらは、様々
な分泌シグナルを接続したβ−ラクタマーゼの分泌生産
について、シグナルペプチダーゼ１を過剰に共発現させ
た際の効果を検討している（Jan Maarten van Dijl eta
l, Mol. Gen. Genet, 227, p40-48 (1991)）。その中
で、シグナルペプチダーゼ１の共発現によるプロッセッ
シング（シグナルを切断すること）の効率を向上させる
効果は、前駆体における分泌シグナル配列と分泌される
目的蛋白質の組み合わせにより様々であることを報告し
ている。
成した前駆体蛋白質が膜を透過する際に分泌シグナルを
切断する酵素である。Jan Maarten van Dijlらは、様々
な分泌シグナルを接続したβ−ラクタマーゼの分泌生産
について、シグナルペプチダーゼ１を過剰に共発現させ
た際の効果を検討している（Jan Maarten van Dijl eta
l, Mol. Gen. Genet, 227, p40-48 (1991)）。その中
で、シグナルペプチダーゼ１の共発現によるプロッセッ
シング（シグナルを切断すること）の効率を向上させる
効果は、前駆体における分泌シグナル配列と分泌される
目的蛋白質の組み合わせにより様々であることを報告し
ている。
【００３５】しかし、当該文献からは２０ＫｈＧＨの分
泌効率向上にシグナルペプチダーゼ１の共発現が効果を
有するかは全く不明であり、まして、共発現した場合に
細胞の溶菌傾向が少なくその培養菌体から抽出されるペ
リプラズム溶液中の夾雑蛋白質の含量が少なくなること
は、全く未知である。
泌効率向上にシグナルペプチダーゼ１の共発現が効果を
有するかは全く不明であり、まして、共発現した場合に
細胞の溶菌傾向が少なくその培養菌体から抽出されるペ
リプラズム溶液中の夾雑蛋白質の含量が少なくなること
は、全く未知である。
【００３６】さらに、本発明者らは培養条件を変更し、
更なる２０ＫｈＧＨの分泌生産量の向上を試みた。その
結果、従来知られている特開平８−３２２５８６号公報
（又は、欧州特許公開第０７３５１４０号明細書）記載
の公知菌株であるＭＴ−１０７６５（ＦＥＲＭ ＢＰ−
５０２０）では培養液中の炭素源濃度を増加させること
により８２ｍｇ／Ｌまで２０ＫｈＧＨの生産量を向上さ
せることに成功した。そこでさらに、本方法を本発明の
ＭＴ−１０８５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９０）、及び
ＭＴ−１０８５３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９１）に適応
した。すると例えばグリセロール３．６％、コハク酸
１．５％のとき、ＭＴ−１０８５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−
６２９０）では３６０ｍｇ／ｌ、ＭＴ−１０８５３（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−６２９１）では３５０ｍｇ／ｌと従来の４
〜５倍に生産量を増加させることに成功した。更にこの
時の各ペリプラズム抽出液中の総蛋白質に対する２０Ｋ
ｈＧＨの割合を特開平８−３２２５８６号公報（又は、
欧州特許公開第０７３５１４０号明細書）記載の公知菌
株であるＭＴ−１０７６５（ＦＥＲＭ ＢＰ−５０２
０）から該明細書記載の方法で抽出したペリプラズム抽
出液を１として比較した。するとグルタチオンリダクタ
ーゼを共発現したＭＴ−１０８５３（ＦＥＲＭ ＢＰ−
６２９１）で３．４であり、シグナルペプチダーゼ１を
共発現したＭＴ-１０８５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９
０）では８．３となった。これより本発明のＭＴ−１０
８５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９０）、及びＭＴ−１０
８５３（ＦＥＲＭＢＰ−６２９１）より抽出される２０
ＫｈＧＨの生産量及び精製の容易さは公知の方法と比較
して大幅に向上し、２０ＫｈＧＨの製造コスト削減等を
可能にする。かくして、本発明者らは本発明を成すに至
った。
更なる２０ＫｈＧＨの分泌生産量の向上を試みた。その
結果、従来知られている特開平８−３２２５８６号公報
（又は、欧州特許公開第０７３５１４０号明細書）記載
の公知菌株であるＭＴ−１０７６５（ＦＥＲＭ ＢＰ−
５０２０）では培養液中の炭素源濃度を増加させること
により８２ｍｇ／Ｌまで２０ＫｈＧＨの生産量を向上さ
せることに成功した。そこでさらに、本方法を本発明の
ＭＴ−１０８５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９０）、及び
ＭＴ−１０８５３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９１）に適応
した。すると例えばグリセロール３．６％、コハク酸
１．５％のとき、ＭＴ−１０８５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−
６２９０）では３６０ｍｇ／ｌ、ＭＴ−１０８５３（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−６２９１）では３５０ｍｇ／ｌと従来の４
〜５倍に生産量を増加させることに成功した。更にこの
時の各ペリプラズム抽出液中の総蛋白質に対する２０Ｋ
ｈＧＨの割合を特開平８−３２２５８６号公報（又は、
欧州特許公開第０７３５１４０号明細書）記載の公知菌
株であるＭＴ−１０７６５（ＦＥＲＭ ＢＰ−５０２
０）から該明細書記載の方法で抽出したペリプラズム抽
出液を１として比較した。するとグルタチオンリダクタ
ーゼを共発現したＭＴ−１０８５３（ＦＥＲＭ ＢＰ−
６２９１）で３．４であり、シグナルペプチダーゼ１を
共発現したＭＴ-１０８５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９
０）では８．３となった。これより本発明のＭＴ−１０
８５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９０）、及びＭＴ−１０
８５３（ＦＥＲＭＢＰ−６２９１）より抽出される２０
ＫｈＧＨの生産量及び精製の容易さは公知の方法と比較
して大幅に向上し、２０ＫｈＧＨの製造コスト削減等を
可能にする。かくして、本発明者らは本発明を成すに至
った。
【００３７】即ち、本発明は、（１） 大腸菌のＯｐｐ
Ａ分泌シグナルと６０％以上の相同性を有する分泌シグ
ナル（但し、大腸菌のＯｐｐＡ分泌シグナルとサルモネ
ラ菌のＯｐｐＡ分泌シグナルは除く）、（２） 上記
（１）の分泌シグナルをコードするＤＮＡ、（３） 大
腸菌のＯｐｐＡ分泌シグナルと６０％以上の相同性を有
する分泌シグナルをコードするＤＮＡと分子量約２００
００のヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡを含む組換
えプラスミドであって、該分子量約２００００のヒト成
長ホルモンをコードするＤＮＡが該分泌シグナルをコー
ドするＤＮＡの直後に結合していることを特徴とする組
換えプラスミド、（４） 上記（３）の組換えプラスミ
ドで形質転換された大腸菌形質転換体、（５） 上記
（４）の大腸菌形質転換体を培養し、得られた菌体から
ペリプラズム画分を抽出して得られたペリプラズム画分
溶液を精製して分子量約２００００のヒト成長ホルモン
を得ることを特徴とする分子量約２００００のヒト成長
ホルモンの製造方法、（６） 分泌シグナルをコードす
るＤＮＡ、分子量約２００００のヒト成長ホルモンをコ
ードするＤＮＡ、及び大腸菌のシグナルペプチダーゼ１
をコードするＤＮＡを含む組換えプラスミドであって、
該分子量約２００００のヒト成長ホルモンをコードする
ＤＮＡの５’末端が該分泌シグナルをコードするＤＮＡ
の３’末端に結合していることを特徴とする組換えプラ
スミド、（７）上記（６）の該組換えプラスミドで形質
転換された大腸菌形質転換体、（８）上記（７）の大腸
菌形質転換体を培養し、得られた菌体からペリプラズム
画分を抽出して得られた夾雑蛋白質の少ないペリプラズ
ム画分溶液を精製して分子量約２００００のヒト成長ホ
ルモンを得ることを特徴とする分子量約２００００のヒ
ト成長ホルモンの製造方法、である。更に、本発明は、
上記の構成の組換えプラスミドで形質転換した形質転換
体を培養して分子量約２００００のヒト成長ホルモンを
生産する際の培地組成の変更、すなわちグリセロール
０．０１〜１０％及びコハク酸０．０１〜５％の少なく
とも一方を含む培地を使用することによりその生産量を
増大させる方法も含む。
Ａ分泌シグナルと６０％以上の相同性を有する分泌シグ
ナル（但し、大腸菌のＯｐｐＡ分泌シグナルとサルモネ
ラ菌のＯｐｐＡ分泌シグナルは除く）、（２） 上記
（１）の分泌シグナルをコードするＤＮＡ、（３） 大
腸菌のＯｐｐＡ分泌シグナルと６０％以上の相同性を有
する分泌シグナルをコードするＤＮＡと分子量約２００
００のヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡを含む組換
えプラスミドであって、該分子量約２００００のヒト成
長ホルモンをコードするＤＮＡが該分泌シグナルをコー
ドするＤＮＡの直後に結合していることを特徴とする組
換えプラスミド、（４） 上記（３）の組換えプラスミ
ドで形質転換された大腸菌形質転換体、（５） 上記
（４）の大腸菌形質転換体を培養し、得られた菌体から
ペリプラズム画分を抽出して得られたペリプラズム画分
溶液を精製して分子量約２００００のヒト成長ホルモン
を得ることを特徴とする分子量約２００００のヒト成長
ホルモンの製造方法、（６） 分泌シグナルをコードす
るＤＮＡ、分子量約２００００のヒト成長ホルモンをコ
ードするＤＮＡ、及び大腸菌のシグナルペプチダーゼ１
をコードするＤＮＡを含む組換えプラスミドであって、
該分子量約２００００のヒト成長ホルモンをコードする
ＤＮＡの５’末端が該分泌シグナルをコードするＤＮＡ
の３’末端に結合していることを特徴とする組換えプラ
スミド、（７）上記（６）の該組換えプラスミドで形質
転換された大腸菌形質転換体、（８）上記（７）の大腸
菌形質転換体を培養し、得られた菌体からペリプラズム
画分を抽出して得られた夾雑蛋白質の少ないペリプラズ
ム画分溶液を精製して分子量約２００００のヒト成長ホ
ルモンを得ることを特徴とする分子量約２００００のヒ
ト成長ホルモンの製造方法、である。更に、本発明は、
上記の構成の組換えプラスミドで形質転換した形質転換
体を培養して分子量約２００００のヒト成長ホルモンを
生産する際の培地組成の変更、すなわちグリセロール
０．０１〜１０％及びコハク酸０．０１〜５％の少なく
とも一方を含む培地を使用することによりその生産量を
増大させる方法も含む。
【００３８】
【発明の実施の形態】本発明において用いられる分泌シ
グナルとしては、大腸菌（Escherichia coli)またはサ
ルモネラ菌（Salumonella typhimurium）のＯｐｐＡ蛋
白質の分泌シグナル（大腸菌ＯｐｐＡ分泌シグナルまた
はサルモネラ菌ＯｐｐＡ分泌シグナル）、及び大腸菌分
泌ＯｐｐＡシグナルのアミノ酸配列を、相同性６０％以
上で、分泌シグナルとしての機能を維持している状態で
改変した分泌シグナル（改変ＯｐｐＡ分泌シグナル）を
挙げることができる。
グナルとしては、大腸菌（Escherichia coli)またはサ
ルモネラ菌（Salumonella typhimurium）のＯｐｐＡ蛋
白質の分泌シグナル（大腸菌ＯｐｐＡ分泌シグナルまた
はサルモネラ菌ＯｐｐＡ分泌シグナル）、及び大腸菌分
泌ＯｐｐＡシグナルのアミノ酸配列を、相同性６０％以
上で、分泌シグナルとしての機能を維持している状態で
改変した分泌シグナル（改変ＯｐｐＡ分泌シグナル）を
挙げることができる。
【００３９】大腸菌ＯｐｐＡ分泌シグナルは配列表の配
列番号：１に記載のアミノ酸配列を有しており、そのＯ
ｐｐＡシグナルとしては、以下の改変： （１）配列番号：１の２〜７番の部分への１〜３個の塩
基性アミノ酸の挿入、 （２）配列番号：１の２〜７番の部分の酸性アミノ酸及
び中性アミノ酸のうちの１〜３個のアミノ酸の塩基性ア
ミノ酸への置換、 （３）配列番号：１の９〜２３番の部分への１〜９個の
疎水性アミノ酸の挿入、 （４）配列番号：１の９〜２３番の部分の非疎水性塩基
性アミノ酸の１〜９個のアミノ酸の疎水性アミノ酸への
置換、の少なくとも１つを有するものを挙げることがで
きる。
列番号：１に記載のアミノ酸配列を有しており、そのＯ
ｐｐＡシグナルとしては、以下の改変： （１）配列番号：１の２〜７番の部分への１〜３個の塩
基性アミノ酸の挿入、 （２）配列番号：１の２〜７番の部分の酸性アミノ酸及
び中性アミノ酸のうちの１〜３個のアミノ酸の塩基性ア
ミノ酸への置換、 （３）配列番号：１の９〜２３番の部分への１〜９個の
疎水性アミノ酸の挿入、 （４）配列番号：１の９〜２３番の部分の非疎水性塩基
性アミノ酸の１〜９個のアミノ酸の疎水性アミノ酸への
置換、の少なくとも１つを有するものを挙げることがで
きる。
【００４０】（１）及び（２）の改変における塩基性ア
ミノ酸としては、Ｌｙｓ及びＡｒｇを挙げることがで
き、これらのうちの少なくとも１つを用いることができ
る。また、（３）及び（４）の改変における疎水性アミ
ノ酸としては、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＡｌａより
成る群から選ばれた少なくとも１つのアミノ酸を用いる
ことができる。
ミノ酸としては、Ｌｙｓ及びＡｒｇを挙げることがで
き、これらのうちの少なくとも１つを用いることができ
る。また、（３）及び（４）の改変における疎水性アミ
ノ酸としては、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＡｌａより
成る群から選ばれた少なくとも１つのアミノ酸を用いる
ことができる。
【００４１】改変ＯｐｐＡシグナルの具体例としては、
配列番号：２〜２７に記載のアミノ酸配列を有する改変
ＯｐｐＡシグナルを挙げることができる。これらの配列
表の配列番号：２〜２７に記載の好ましい改変ＯｐｐＡ
分泌シグナルの中では、配列番号：２３に記載の改変Ｏ
ｐｐＡ分泌シグナルが最も高い分泌生産性を示す更に好
ましいものとして例示できる。
配列番号：２〜２７に記載のアミノ酸配列を有する改変
ＯｐｐＡシグナルを挙げることができる。これらの配列
表の配列番号：２〜２７に記載の好ましい改変ＯｐｐＡ
分泌シグナルの中では、配列番号：２３に記載の改変Ｏ
ｐｐＡ分泌シグナルが最も高い分泌生産性を示す更に好
ましいものとして例示できる。
【００４２】なお、サルモネラ菌のＯｐｐＡの分泌シグ
ナルは大腸菌のＯｐｐＡ分泌シグナルと非常に高い相同
性を有している。サルモネラ菌のＯｐｐＡ分泌シグナル
は公知であり、本出願の請求の範囲外であるが、サルモ
ネラ菌のＯｐｐＡ改変分泌シグナル（例えば、サルモネ
ラ菌ＯｐｐＡ分泌シグナルとアミノ酸配列において６０
％以上の相同性を有する改変分泌シグナル）は、大腸菌
のＯｐｐＡ分泌シグナルあるいはその改変分泌シグナル
と同等の効果があり、サルモネラ菌のＯｐｐＡ改変分泌
シグナルも本発明の範囲内である。
ナルは大腸菌のＯｐｐＡ分泌シグナルと非常に高い相同
性を有している。サルモネラ菌のＯｐｐＡ分泌シグナル
は公知であり、本出願の請求の範囲外であるが、サルモ
ネラ菌のＯｐｐＡ改変分泌シグナル（例えば、サルモネ
ラ菌ＯｐｐＡ分泌シグナルとアミノ酸配列において６０
％以上の相同性を有する改変分泌シグナル）は、大腸菌
のＯｐｐＡ分泌シグナルあるいはその改変分泌シグナル
と同等の効果があり、サルモネラ菌のＯｐｐＡ改変分泌
シグナルも本発明の範囲内である。
【００４３】本発明の組換えＤＮＡは、大腸菌またはサ
ルモネラ菌ＯｐｐＡ分泌シグナル、あるいはその改変体
をコードするＤＮＡの３’末端に、２０ＫｈＧＨをコー
ドするＤＮＡの５’末端を直接結合させた構造を有し、
これを宿主中で発現させることで、２０ＫｈＧＨのＮ末
端側に大腸菌またはサルモネラ菌ＯｐｐＡ分泌シグナ
ル、あるいはその改変体が結合した前駆体を得ることが
できる。
ルモネラ菌ＯｐｐＡ分泌シグナル、あるいはその改変体
をコードするＤＮＡの３’末端に、２０ＫｈＧＨをコー
ドするＤＮＡの５’末端を直接結合させた構造を有し、
これを宿主中で発現させることで、２０ＫｈＧＨのＮ末
端側に大腸菌またはサルモネラ菌ＯｐｐＡ分泌シグナ
ル、あるいはその改変体が結合した前駆体を得ることが
できる。
【００４４】２０ＫｈＧＨをコードするＤＮＡとして
は、化学合成により構築されたもの、また２０ＫｈＧＨ
のｍＲＮＡ配列に基づくｃＤＮＡ等の如何なるものでも
よく、公知のものが使用可能である。更に、２０ＫｈＧ
Ｈのアミノ酸配列のＮ末端から第１４番目のアミノ酸に
ついては、セリンとメチオニンの２種類の報告されてい
る。即ち、Masuda, N. et al, Biophyisica Acta, Vol.
949, p.125, (1988)では、ｃＤＮＡ塩基配列がＡＧＴ
（セリンをコード）であり、Martia1, J. A, eta1 Scie
nce, Vol, 205, p.602, (1979)では、ｍＲＮＡのＮ末端
から第１４番目のアミノ酸をコードするＲＮＡ配列はＡ
ＵＧ（メチオニンをコードする）である。それらのいず
れをコードするＤＮＡも本発明で使用可能である。ま
た、本発明における２０ＫｈＧＨとしてはそのアミノ酸
配列のうち１〜５個のアミノ酸が、２０ＫｈＧＨの特性
や機能を損なわない範囲で、置換、欠失、挿入、削除さ
れたものも本発明の範疇である。
は、化学合成により構築されたもの、また２０ＫｈＧＨ
のｍＲＮＡ配列に基づくｃＤＮＡ等の如何なるものでも
よく、公知のものが使用可能である。更に、２０ＫｈＧ
Ｈのアミノ酸配列のＮ末端から第１４番目のアミノ酸に
ついては、セリンとメチオニンの２種類の報告されてい
る。即ち、Masuda, N. et al, Biophyisica Acta, Vol.
949, p.125, (1988)では、ｃＤＮＡ塩基配列がＡＧＴ
（セリンをコード）であり、Martia1, J. A, eta1 Scie
nce, Vol, 205, p.602, (1979)では、ｍＲＮＡのＮ末端
から第１４番目のアミノ酸をコードするＲＮＡ配列はＡ
ＵＧ（メチオニンをコードする）である。それらのいず
れをコードするＤＮＡも本発明で使用可能である。ま
た、本発明における２０ＫｈＧＨとしてはそのアミノ酸
配列のうち１〜５個のアミノ酸が、２０ＫｈＧＨの特性
や機能を損なわない範囲で、置換、欠失、挿入、削除さ
れたものも本発明の範疇である。
【００４５】この組換えＤＮＡを、その宿主中での発現
を可能とするプロモーターと組み合わせて、宿主中での
複製が可能な複製オリジンを有する、例えば、大腸菌用
としてのｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９等のプラスミドに組
み込むことで、本発明の２０ＫｈＧＨ分泌用の組換えプ
ラスミドを得ることができる。プロモーターとしては、
組換えＤＮＡの宿主中での発現を可能とするものであれ
ばよく、用いる宿主の種類等に応じて選択して使用する
ことができる。
を可能とするプロモーターと組み合わせて、宿主中での
複製が可能な複製オリジンを有する、例えば、大腸菌用
としてのｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９等のプラスミドに組
み込むことで、本発明の２０ＫｈＧＨ分泌用の組換えプ
ラスミドを得ることができる。プロモーターとしては、
組換えＤＮＡの宿主中での発現を可能とするものであれ
ばよく、用いる宿主の種類等に応じて選択して使用する
ことができる。
【００４６】宿主としては、使用経験豊富で安全性が高
い大腸菌株が好ましく、そのようなものとして、ＪＭ１
０９株、ＨＢ１０１株、Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７
３２５）が挙げられる。ＡＴＣＣはアメリカン・タイプ
カルチャー・コレクションの番号である。
い大腸菌株が好ましく、そのようなものとして、ＪＭ１
０９株、ＨＢ１０１株、Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７
３２５）が挙げられる。ＡＴＣＣはアメリカン・タイプ
カルチャー・コレクションの番号である。
【００４７】組換えプラスミドの一例としては、プロモ
ーター、リボゾーム結合部位、分泌シグナルをコードす
るＤＮＡ及び２０ＫｈＧＨをコードするＤＮＡが、５’
から３’方向にこの順に結合された部分を有するものを
挙げることができる。
ーター、リボゾーム結合部位、分泌シグナルをコードす
るＤＮＡ及び２０ＫｈＧＨをコードするＤＮＡが、５’
から３’方向にこの順に結合された部分を有するものを
挙げることができる。
【００４８】一方、共発現系による２０ＫｈＧＨの分泌
生産に用いるシグナルペプチダーゼ１は大腸菌由来のも
のを示す。また、大腸菌由来のシグナルペプチダーゼ１
のアミノ酸配列を、本発明で目的とする共発現による２
０ＫｈＧＨの分泌量の向上効果が得られる範囲内で１〜
２個置換、挿入、欠損体も本発明の範疇である。
生産に用いるシグナルペプチダーゼ１は大腸菌由来のも
のを示す。また、大腸菌由来のシグナルペプチダーゼ１
のアミノ酸配列を、本発明で目的とする共発現による２
０ＫｈＧＨの分泌量の向上効果が得られる範囲内で１〜
２個置換、挿入、欠損体も本発明の範疇である。
【００４９】シグナルペプチダーゼ１の遺伝子は、本来
大腸菌の染色体内に予め存在するものであり、大腸菌由
来のシグナルペプチダーゼ１をコードするＤＮＡを用い
ることができる。従って、本発明において大腸菌を宿主
として使用する場合は、宿主本来のものとは別に、人為
操作によって追加的に導入されたものが発現すること
で、共発現による効果を得るものである。
大腸菌の染色体内に予め存在するものであり、大腸菌由
来のシグナルペプチダーゼ１をコードするＤＮＡを用い
ることができる。従って、本発明において大腸菌を宿主
として使用する場合は、宿主本来のものとは別に、人為
操作によって追加的に導入されたものが発現すること
で、共発現による効果を得るものである。
【００５０】シグナルペプチダーゼ１を発現させるプロ
モ−タ−としては、宿主で機能するプロモーターであれ
ばいかなるプロモーターも使用可能である。シグナルペ
プチダ−ゼ１の共発現量は２０ＫｈＧＨの分泌量に影響
を与えるため、あまり過剰に発現させないことが望まし
い。そのため、例えば、実施例に記載のようにｔａｃプ
ロモーターによるシグナルペプチダーゼ１の発現量をｌ
ａｃＩqにより抑制するなどの方法を用いることが望ま
しい。また、シグナルペプチダーゼ１の共発現は、２０
ＫｈＧＨをコードするＤＮＡと同一プラスミド内にシグ
ナルペプチダーゼ１をコードするＤＮＡを組み込む方
法、２０ＫｈＧＨをコードするＤＮＡとシグナルペプチ
ダーゼ１をコードするＤＮＡを別々のプラスミドに組み
込む方法、あるいは大腸菌が本来有しているシグナルペ
プチダーゼ１の遺伝子とは別に、シグナルペプチダーゼ
１をコードするＤＮＡを大腸菌の染色体に追加的に組み
込む方法などによって行うことができる。
モ−タ−としては、宿主で機能するプロモーターであれ
ばいかなるプロモーターも使用可能である。シグナルペ
プチダ−ゼ１の共発現量は２０ＫｈＧＨの分泌量に影響
を与えるため、あまり過剰に発現させないことが望まし
い。そのため、例えば、実施例に記載のようにｔａｃプ
ロモーターによるシグナルペプチダーゼ１の発現量をｌ
ａｃＩqにより抑制するなどの方法を用いることが望ま
しい。また、シグナルペプチダーゼ１の共発現は、２０
ＫｈＧＨをコードするＤＮＡと同一プラスミド内にシグ
ナルペプチダーゼ１をコードするＤＮＡを組み込む方
法、２０ＫｈＧＨをコードするＤＮＡとシグナルペプチ
ダーゼ１をコードするＤＮＡを別々のプラスミドに組み
込む方法、あるいは大腸菌が本来有しているシグナルペ
プチダーゼ１の遺伝子とは別に、シグナルペプチダーゼ
１をコードするＤＮＡを大腸菌の染色体に追加的に組み
込む方法などによって行うことができる。
【００５１】同一プラスミド中に２０ＫｈＧＨをコード
するＤＮＡとシグナルペプチダーゼ１をコードするＤＮ
Ａを組み込んだ構成の共発現系の組換えプラスミドとし
ては、例えば、プロモーター、リボゾーム結合部位、分
泌シグナルをコードするＤＮＡ、２０ＫｈＧＨをコード
するＤＮＡ、プロモーター及びシグナルペプチダーゼ１
をコードするＤＮＡが５’から３’方向にこの順に結合
している構成を有するものを挙げることができる。
するＤＮＡとシグナルペプチダーゼ１をコードするＤＮ
Ａを組み込んだ構成の共発現系の組換えプラスミドとし
ては、例えば、プロモーター、リボゾーム結合部位、分
泌シグナルをコードするＤＮＡ、２０ＫｈＧＨをコード
するＤＮＡ、プロモーター及びシグナルペプチダーゼ１
をコードするＤＮＡが５’から３’方向にこの順に結合
している構成を有するものを挙げることができる。
【００５２】共発現系用の組換えプラスミドに組み込む
分泌シグナルとしては、２０ＫｈＧＨの分泌を可能とす
るものであればよく、先に説明した、大腸菌またはサル
モネラ菌ＯｐｐＡ分泌シグナル、あるいはその改変体を
好ましいものとして挙げることができる。更に、２０Ｋ
ｈＧＨをコードするＤＮＡ及びそれを発現させるための
プロモーター、複製オリジン等は、先に説明したものが
利用できる。
分泌シグナルとしては、２０ＫｈＧＨの分泌を可能とす
るものであればよく、先に説明した、大腸菌またはサル
モネラ菌ＯｐｐＡ分泌シグナル、あるいはその改変体を
好ましいものとして挙げることができる。更に、２０Ｋ
ｈＧＨをコードするＤＮＡ及びそれを発現させるための
プロモーター、複製オリジン等は、先に説明したものが
利用できる。
【００５３】本発明の形質転換体は、上記の組換えプラ
スミドを宿主にそれ自体公知の方法で形質転換により導
入すればよい。組換えプラスミドによる宿主の形質転換
は、例えば塩化ルビジューム法によりコンピテントセル
を調製し、プラスミドを加え、４２℃、１分間のヒート
ショックを与えることによりプラスミドを宿主菌体内に
形質導入する方法など、常法により容易に実施可能であ
る。
スミドを宿主にそれ自体公知の方法で形質転換により導
入すればよい。組換えプラスミドによる宿主の形質転換
は、例えば塩化ルビジューム法によりコンピテントセル
を調製し、プラスミドを加え、４２℃、１分間のヒート
ショックを与えることによりプラスミドを宿主菌体内に
形質導入する方法など、常法により容易に実施可能であ
る。
【００５４】得られた形質転換体においては、プロモー
ターおよびリボゾーム結合部位配列からの指令により分
泌シグナルと２０ＫｈＧＨとが結合した前駆体が細胞質
内に発現し、この前駆体が内膜を通過する際に分泌シグ
ナルがシグナルペプチダーゼ１により切断され、天然型
の２０ＫｈＧＨが分泌される。大腸菌を宿主とした場合
には、大腸菌のペリブラズムヘ天然型の２０ＫｈＧＨが
分泌・蓄積される。
ターおよびリボゾーム結合部位配列からの指令により分
泌シグナルと２０ＫｈＧＨとが結合した前駆体が細胞質
内に発現し、この前駆体が内膜を通過する際に分泌シグ
ナルがシグナルペプチダーゼ１により切断され、天然型
の２０ＫｈＧＨが分泌される。大腸菌を宿主とした場合
には、大腸菌のペリブラズムヘ天然型の２０ＫｈＧＨが
分泌・蓄積される。
【００５５】２０ＫｈＧＨを分泌生産する本発明の大腸
菌形質転換体としてはＭＴ−１０８５３（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６２９１）もしくはＭＴ−１０８５２（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６２９０）を挙げることが出来る。これらの菌株
は、平成１０年（１９９８年）３月１１日付けにて、茨
城県つくば市東一丁目１番３号にある通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所に、特許手続上の微生物の
寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて、
上記寄託番号にて寄託されている。
菌形質転換体としてはＭＴ−１０８５３（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６２９１）もしくはＭＴ−１０８５２（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６２９０）を挙げることが出来る。これらの菌株
は、平成１０年（１９９８年）３月１１日付けにて、茨
城県つくば市東一丁目１番３号にある通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所に、特許手続上の微生物の
寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて、
上記寄託番号にて寄託されている。
【００５６】大腸菌を宿主として用いた場合における２
０ＫｈＧＨを分泌生産するための、大腸菌形質転換体の
培養方法としては、フラスコによる培養方法や培養槽で
の培養方法などを好適に選択できる。培養温度は、好ま
しくは２５〜３７℃、さらに好ましくは２８〜３０℃で
ある。培地組成は、通常大腸菌の培養に使用されるもの
を用いることができるが、２倍濃度のＬＢ培地（ポリペ
プトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ）、グリセロ
ール０．０１〜１０％、好ましくは０．１〜５％、コハ
ク酸０．０１〜５％、好ましくは０．１〜４％、より好
ましくは０．１〜３％含む培地が好ましい。グリセロー
ル及びコハク酸のこのような作用はグリセロール及びコ
ハク酸を同時に添加した場合に顕著であるが、グリセロ
ール或いはコハク酸を単独で培地へ添加した場合にも見
られる。
０ＫｈＧＨを分泌生産するための、大腸菌形質転換体の
培養方法としては、フラスコによる培養方法や培養槽で
の培養方法などを好適に選択できる。培養温度は、好ま
しくは２５〜３７℃、さらに好ましくは２８〜３０℃で
ある。培地組成は、通常大腸菌の培養に使用されるもの
を用いることができるが、２倍濃度のＬＢ培地（ポリペ
プトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ）、グリセロ
ール０．０１〜１０％、好ましくは０．１〜５％、コハ
ク酸０．０１〜５％、好ましくは０．１〜４％、より好
ましくは０．１〜３％含む培地が好ましい。グリセロー
ル及びコハク酸のこのような作用はグリセロール及びコ
ハク酸を同時に添加した場合に顕著であるが、グリセロ
ール或いはコハク酸を単独で培地へ添加した場合にも見
られる。
【００５７】大腸菌形質転換体からの２０ＫｈＧＨの調
製は、通常のペリプラズムからの蛋白質の抽出・精製方
法により容易に行うことが可能であり、例えば、浸透圧
ショック法（Nossal G. N; J. Biol. Chem., 241(13),
pp.3055-3062, 1966）などが挙げられる。抽出されたペ
リプラズム画分は、蛋白質に対する通常の精製方法、例
えばカラムクロマトグラフィー法により精製すればよ
い。この際、イオン交換カラムクロマトグラフィー法で
は、蛋白質を一度担体に担持させる必要があり、本発明
のように２０ＫｈＧＨ以外の不純蛋白質の少ないペリプ
ラズム画分溶液が得られることから、カラムの容量を小
さくできる利点がある。
製は、通常のペリプラズムからの蛋白質の抽出・精製方
法により容易に行うことが可能であり、例えば、浸透圧
ショック法（Nossal G. N; J. Biol. Chem., 241(13),
pp.3055-3062, 1966）などが挙げられる。抽出されたペ
リプラズム画分は、蛋白質に対する通常の精製方法、例
えばカラムクロマトグラフィー法により精製すればよ
い。この際、イオン交換カラムクロマトグラフィー法で
は、蛋白質を一度担体に担持させる必要があり、本発明
のように２０ＫｈＧＨ以外の不純蛋白質の少ないペリプ
ラズム画分溶液が得られることから、カラムの容量を小
さくできる利点がある。
【００５８】
【実施例】以下本発明を実施例により更に詳しく説明す
るがこれらの実施例は本発明の内容を何ら限定するもの
ではない。
るがこれらの実施例は本発明の内容を何ら限定するもの
ではない。
【００５９】［実施例１］ＯｐｐＡ分泌シグナルの有用
性検討
性検討
【００６０】［１］ＯｐｐＡ分泌シグナルを含む２０Ｋ
ｈＧＨ分泌プラスミドの作製 配列表の配列番号：２８及び配列番号：２９に記載のオ
リゴヌクレオチドをＰＣＲ法（Polymerase Chain React
ion法）により２本鎖化し、制限酵素ＳａｃＩ、Ｐｓｔ
Ｉで切断してバチルス アミロリキファシエンス（Baci
llus amyloliquefaciens）の中性プロテアーゼ由来のプ
ロモーター及びＯｐｐＡ分泌シグナルの前半部をコード
するＤＮＡフラグメント（１）を得た。また、特開平８
−３２２５８６号公報に記載のＭＴ−１０７６５株（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−５０２０）の有する分泌プラスミドｐＧ
ＨＲ１０をテンプレートとして、配列番号：３０及び配
列番号：３１に示すプライマーを使用し、ＰＣＲ法によ
りＯｐｐＡ分泌シグナルの後半部及び２０ＫｈＧＨをコ
ードするＤＮＡフラグメント増幅した。このＰＣＲ産物
を制限酵素ＰｓｔＩ、ＸｂａＩで切断することによりフ
ラグメント（２）を得た。更に、分泌プラスミドｐＧＨ
Ｒ１０を制限酵素ＳａｃＩ、ＸｂａＩで切断し、ベクタ
ー側フラグメント（３）を得た。以上のＤＮＡフラグメ
ント（１）、（２）、（３）をライゲーションすること
により、分泌プラスミドｐＧＨＲ５２を構築した。これ
らの行程を図１に示した。
ｈＧＨ分泌プラスミドの作製 配列表の配列番号：２８及び配列番号：２９に記載のオ
リゴヌクレオチドをＰＣＲ法（Polymerase Chain React
ion法）により２本鎖化し、制限酵素ＳａｃＩ、Ｐｓｔ
Ｉで切断してバチルス アミロリキファシエンス（Baci
llus amyloliquefaciens）の中性プロテアーゼ由来のプ
ロモーター及びＯｐｐＡ分泌シグナルの前半部をコード
するＤＮＡフラグメント（１）を得た。また、特開平８
−３２２５８６号公報に記載のＭＴ−１０７６５株（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−５０２０）の有する分泌プラスミドｐＧ
ＨＲ１０をテンプレートとして、配列番号：３０及び配
列番号：３１に示すプライマーを使用し、ＰＣＲ法によ
りＯｐｐＡ分泌シグナルの後半部及び２０ＫｈＧＨをコ
ードするＤＮＡフラグメント増幅した。このＰＣＲ産物
を制限酵素ＰｓｔＩ、ＸｂａＩで切断することによりフ
ラグメント（２）を得た。更に、分泌プラスミドｐＧＨ
Ｒ１０を制限酵素ＳａｃＩ、ＸｂａＩで切断し、ベクタ
ー側フラグメント（３）を得た。以上のＤＮＡフラグメ
ント（１）、（２）、（３）をライゲーションすること
により、分泌プラスミドｐＧＨＲ５２を構築した。これ
らの行程を図１に示した。
【００６１】［２］改変型ＯｐｐＡ分泌シグナルを含む
２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドの作製 ［１］で作製したｐＧＨＲ５２をテンプレートにして、
配列番号：３２に示すオリゴヌクレオチドと配列番号：
３３〜３９に示した種々のオリゴヌクレオチドを選択使
用してＰＣＲを行いバチルス アミロリキファシエンス
の中性プロテアーゼ由来のプロモーター及びＯｐｐＡ分
泌シグナルの改変部をコードするＤＮＡフラグメントを
増幅した。それぞれのＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｃＩ、
ＰｓｔＩで切断し、フラグメント（４）、（５）、
（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）を得た。そ
の後、前述のフラグメント（２）、（３）とフラグメン
ト（４）を混合し、ライゲーション後、大腸菌に形質転
換する（即ち図１に示すフラグメント（１）の代わりに
フラグメント（４）を使用する）ことにより分泌プラス
ミドｐＧＨＲ５２１を得た。同様にフラグメント（４）
に代えてフラグメント（５）を使用することにより分泌
プラスミドｐＧＨＲ５２３を、フラグメント（１）に代
えてフラグメント（６）を使用することにより分泌プラ
スミドｐＧＨＲ５２５を、フラグメント（１）に代えて
フラグメント（７）を使用することにより分泌プラスミ
ドｐＧＨＲ５２７を、フラグメント（１）に代えてフラ
グメント（８）を使用することにより分泌プラスミドｐ
ＧＨＲ５２９を、フラグメント（１）に代えてフラグメ
ント（９）を使用することにより分泌プラスミドｐＧＨ
Ｒ５２４を、フラグメント（１）に代えてフラグメント
（１０）を使用することにより分泌プラスミドｐＧＨＲ
５２６をそれぞれ得た（図２）。
２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドの作製 ［１］で作製したｐＧＨＲ５２をテンプレートにして、
配列番号：３２に示すオリゴヌクレオチドと配列番号：
３３〜３９に示した種々のオリゴヌクレオチドを選択使
用してＰＣＲを行いバチルス アミロリキファシエンス
の中性プロテアーゼ由来のプロモーター及びＯｐｐＡ分
泌シグナルの改変部をコードするＤＮＡフラグメントを
増幅した。それぞれのＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｃＩ、
ＰｓｔＩで切断し、フラグメント（４）、（５）、
（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）を得た。そ
の後、前述のフラグメント（２）、（３）とフラグメン
ト（４）を混合し、ライゲーション後、大腸菌に形質転
換する（即ち図１に示すフラグメント（１）の代わりに
フラグメント（４）を使用する）ことにより分泌プラス
ミドｐＧＨＲ５２１を得た。同様にフラグメント（４）
に代えてフラグメント（５）を使用することにより分泌
プラスミドｐＧＨＲ５２３を、フラグメント（１）に代
えてフラグメント（６）を使用することにより分泌プラ
スミドｐＧＨＲ５２５を、フラグメント（１）に代えて
フラグメント（７）を使用することにより分泌プラスミ
ドｐＧＨＲ５２７を、フラグメント（１）に代えてフラ
グメント（８）を使用することにより分泌プラスミドｐ
ＧＨＲ５２９を、フラグメント（１）に代えてフラグメ
ント（９）を使用することにより分泌プラスミドｐＧＨ
Ｒ５２４を、フラグメント（１）に代えてフラグメント
（１０）を使用することにより分泌プラスミドｐＧＨＲ
５２６をそれぞれ得た（図２）。
【００６２】［３］ＯｐｐＡ分泌シグナルを含む２０Ｋ
ｈＧＨ分泌プラスミドで形質転換した大腸菌形質転換体
の評価 ［１］で構築した分泌プラスミドｐＧＨＲ５２により大
腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７３２５）を形質転換
し、大腸菌形質転換株Ｗ３１１０／ｐＧＨＲ５２を得
た。この形質転換体をテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ
を含むＬＢ寒天培地で３０℃、１８時間培養した。この
培養菌体を液体培地（ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エ
キス１０ｇ／Ｌ、コハク酸１０ｇ/Ｌ、グリセロール１
０ｇ／Ｌ、テトラサイクリン３０ｍｇ／Ｌ）中で、３０
℃、２４時間培養した。培養後の菌体から、浸透圧ショ
ック法により分泌蓄積した２０ＫｈＧＨを含むペリプラ
ズム画分を回収し、該ペリプラズム画分抽出溶液中の２
０ＫｈＧＨの濃度を、ｈＧＨに対する抗体を用いた酵素
免疫測定法により測定した。その測定値から培養液１Ｌ
あたりの２０ＫｈＧＨの分泌生産量を換算した。分泌生
産量比較のため、ＭＴ−１０７６５（ＦＥＲＭ ＢＰ−
５０２０）も同様に培養した。結果を表１に示す。
ｈＧＨ分泌プラスミドで形質転換した大腸菌形質転換体
の評価 ［１］で構築した分泌プラスミドｐＧＨＲ５２により大
腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７３２５）を形質転換
し、大腸菌形質転換株Ｗ３１１０／ｐＧＨＲ５２を得
た。この形質転換体をテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ
を含むＬＢ寒天培地で３０℃、１８時間培養した。この
培養菌体を液体培地（ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エ
キス１０ｇ／Ｌ、コハク酸１０ｇ/Ｌ、グリセロール１
０ｇ／Ｌ、テトラサイクリン３０ｍｇ／Ｌ）中で、３０
℃、２４時間培養した。培養後の菌体から、浸透圧ショ
ック法により分泌蓄積した２０ＫｈＧＨを含むペリプラ
ズム画分を回収し、該ペリプラズム画分抽出溶液中の２
０ＫｈＧＨの濃度を、ｈＧＨに対する抗体を用いた酵素
免疫測定法により測定した。その測定値から培養液１Ｌ
あたりの２０ＫｈＧＨの分泌生産量を換算した。分泌生
産量比較のため、ＭＴ−１０７６５（ＦＥＲＭ ＢＰ−
５０２０）も同様に培養した。結果を表１に示す。
【００６３】
【表１】 表１の結果よりＯｐｐＡ分泌シグナルを使用したプラス
ミドで形質転換した大腸菌形質転換体は、従来のバチル
ス・アミロリキファシエンス中性プロテアーゼ由来改変
分泌シグナルを使用したプラスミドで形質転換した大腸
菌形質転換体よりも優れた２０ＫｈＧＨの分泌生産能を
有することが判明した。
ミドで形質転換した大腸菌形質転換体は、従来のバチル
ス・アミロリキファシエンス中性プロテアーゼ由来改変
分泌シグナルを使用したプラスミドで形質転換した大腸
菌形質転換体よりも優れた２０ＫｈＧＨの分泌生産能を
有することが判明した。
【００６４】［４］ 改変型ＯｐｐＡ分泌シグナルを使
用したプラスミドで形質転換した大腸菌形質転換体の評
価 ［２］で構築した各分泌プラスミドにより大腸菌Ｗ３１
１０株（ＡＴＣＣ ２７３２５）を形質転換した大腸菌
形質転換株を得た。これらの形質転換体を［３］に記載
方法と同様に培養し、同様に分泌量を測定した。結果を
表２に示す。
用したプラスミドで形質転換した大腸菌形質転換体の評
価 ［２］で構築した各分泌プラスミドにより大腸菌Ｗ３１
１０株（ＡＴＣＣ ２７３２５）を形質転換した大腸菌
形質転換株を得た。これらの形質転換体を［３］に記載
方法と同様に培養し、同様に分泌量を測定した。結果を
表２に示す。
【００６５】
【表２】 表２の結果から、改変ＯｐｐＡ分泌シグナルを使用した
組換えプラスミドで形質転換した大腸菌形質転換体は、
従来のバチルス・アミロリキファシエンス中性プロテア
ーゼ由来改変分泌シグナルを使用したプラスミドで形質
転換した大腸菌形質転換体よりも優れた２０ＫｈＧＨ分
泌生産能を示した。特に配列番号：３に示す配列の改変
ＯｐｐＡ分泌シグナルを含むｐＧＨＲ５２５により形質
転換された大腸菌形質転換体ＭＴ−１０８５３（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６２９１）が最も優れた分泌生産能を有して
いた。
組換えプラスミドで形質転換した大腸菌形質転換体は、
従来のバチルス・アミロリキファシエンス中性プロテア
ーゼ由来改変分泌シグナルを使用したプラスミドで形質
転換した大腸菌形質転換体よりも優れた２０ＫｈＧＨ分
泌生産能を示した。特に配列番号：３に示す配列の改変
ＯｐｐＡ分泌シグナルを含むｐＧＨＲ５２５により形質
転換された大腸菌形質転換体ＭＴ−１０８５３（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６２９１）が最も優れた分泌生産能を有して
いた。
【００６６】［実施例２］ シグナルペプチダーゼ１の
有用性検討
有用性検討
【００６７】［１］ＯｐｐＡ改変型分泌シグナルを使用
し、シグナルペプチダーゼ１を共発現させる２０ＫｈＧ
Ｈ分泌プラスミドの作成 シグナルペプチダーゼ１をコードするＤＮＡ断片を配列
番号：４０及び配列番号：４１に示すオリゴヌクレオチ
ドを用いて大腸菌Ｗ３１１０の染色体遺伝子よりＰＣＲ
法により増幅し、このＰＣＲ産物を制限酵素ＭｕｎＩ、
ＰｓｔＩで切断し、シグナルペプチダーゼ１をコードす
るＤＮＡフラグメント（１１）を得た。このフラグメン
ト（１１）と特開平８−３２２５８６記載のｐＧＨＲ１
０を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩで切断したベクター
側のフラグメント（１２）を混合し、常法によりライゲ
ーションした後、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３
２５）に形質転換することにより分泌プラスミドｐＧＨ
Ｓ１５（図３）を得た。得られたｐＧＨＳ１５を制限酵
素ＳａｃＩ、ＸｂａＩで切断し、ベクター側フラグメン
ト（１３）を得た。また、実施例１で得られた組換えプ
ラスミドｐＧＨＲ５２５を制限酵素ＳａｃＩ、ＸｂａＩ
で切断し、２０ＫｈＧＨ発現カセット側フラグメント
（１４）を得た。その後、フラグメント（１３）とフラ
グメント（１４）を混合し、ライゲーションすることに
より分泌プラスミドｐＧＨＳ５２５を得た（図３）。こ
のプラスミドを用いて大腸菌Ｗ３１１０を形質転換する
ことにより形質転換体Ｗ３１１０／ｐＧＨＳ５２５（Ｍ
Ｔ−１０８５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９０））を得
た。
し、シグナルペプチダーゼ１を共発現させる２０ＫｈＧ
Ｈ分泌プラスミドの作成 シグナルペプチダーゼ１をコードするＤＮＡ断片を配列
番号：４０及び配列番号：４１に示すオリゴヌクレオチ
ドを用いて大腸菌Ｗ３１１０の染色体遺伝子よりＰＣＲ
法により増幅し、このＰＣＲ産物を制限酵素ＭｕｎＩ、
ＰｓｔＩで切断し、シグナルペプチダーゼ１をコードす
るＤＮＡフラグメント（１１）を得た。このフラグメン
ト（１１）と特開平８−３２２５８６記載のｐＧＨＲ１
０を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩで切断したベクター
側のフラグメント（１２）を混合し、常法によりライゲ
ーションした後、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３
２５）に形質転換することにより分泌プラスミドｐＧＨ
Ｓ１５（図３）を得た。得られたｐＧＨＳ１５を制限酵
素ＳａｃＩ、ＸｂａＩで切断し、ベクター側フラグメン
ト（１３）を得た。また、実施例１で得られた組換えプ
ラスミドｐＧＨＲ５２５を制限酵素ＳａｃＩ、ＸｂａＩ
で切断し、２０ＫｈＧＨ発現カセット側フラグメント
（１４）を得た。その後、フラグメント（１３）とフラ
グメント（１４）を混合し、ライゲーションすることに
より分泌プラスミドｐＧＨＳ５２５を得た（図３）。こ
のプラスミドを用いて大腸菌Ｗ３１１０を形質転換する
ことにより形質転換体Ｗ３１１０／ｐＧＨＳ５２５（Ｍ
Ｔ−１０８５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９０））を得
た。
【００６８】［２］シグナルペプチダーゼ１を使用した
プラスミドで形質転換した大腸菌形質転換体の評価 ［１］で構築した形質転換体Ｗ３１１０／ｐＧＨＳ５２
５を実施例１［３］に記載の方法により培養し、２０Ｋ
ｈＧＨの分泌量を測定した。さらに実施例１［３］に記
載の方法で回収したＷ３１１０／ｐＧＨＲ１０、 Ｗ３
１１０／ｐＧＨＲ５２５、 Ｗ３１１０／ｐＧＨＳ５２
５のペリプラズム画分中の総蛋白量をＧｒｏｖｅｓらの
方法（Ｇｒｏｖｅｓ，Ｗ．Ｅ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，２２，１９５−２１０，１９６８）により測
定し、ペリプラズム画分における総蛋白質中の２０Ｋｈ
ＧＨの割合をＷ３１１０／ｐＧＨＲ１０を１として比較
した。結果を表３に示す。
プラスミドで形質転換した大腸菌形質転換体の評価 ［１］で構築した形質転換体Ｗ３１１０／ｐＧＨＳ５２
５を実施例１［３］に記載の方法により培養し、２０Ｋ
ｈＧＨの分泌量を測定した。さらに実施例１［３］に記
載の方法で回収したＷ３１１０／ｐＧＨＲ１０、 Ｗ３
１１０／ｐＧＨＲ５２５、 Ｗ３１１０／ｐＧＨＳ５２
５のペリプラズム画分中の総蛋白量をＧｒｏｖｅｓらの
方法（Ｇｒｏｖｅｓ，Ｗ．Ｅ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，２２，１９５−２１０，１９６８）により測
定し、ペリプラズム画分における総蛋白質中の２０Ｋｈ
ＧＨの割合をＷ３１１０／ｐＧＨＲ１０を１として比較
した。結果を表３に示す。
【００６９】
【表３】 表３の結果よりシグナルペプチダーゼ１を共発現する組
換えプラスミドで形質転換して得られた大腸菌形質転換
体では、２０ＫｈＧＨの分泌生産量が従来のグルタチオ
ンレダクターゼを共発現するプラスミドで形質転換して
得られた大腸菌形質転換体と同等以上であり、かつ、ペ
リプラズム抽出溶液の総蛋白質に占める２０ＫｈＧＨの
割合が著しく向上していることが判明した。
換えプラスミドで形質転換して得られた大腸菌形質転換
体では、２０ＫｈＧＨの分泌生産量が従来のグルタチオ
ンレダクターゼを共発現するプラスミドで形質転換して
得られた大腸菌形質転換体と同等以上であり、かつ、ペ
リプラズム抽出溶液の総蛋白質に占める２０ＫｈＧＨの
割合が著しく向上していることが判明した。
【００７０】［実施例３］ 培養条件変更による２０Ｋ
ｈＧＨ生産性の評価 実施例１の［４］で作製した大腸菌形質転換体ｗ３１１
０／ｐＧＨＲ５２５（ＭＴ−１０８５３（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６２９１））、ｗ３１１０／ｐＧＨＳ５２５（ＭＴ
−１０８５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９０））、及び比
較のため特開平８−３２２５８６号公報（又は、欧州特
許公開第０７３５１４０号明細書）記載の公知菌株であ
るｗ３１１０／ｐＧＨＲ１０（ＭＴ−１０７６５（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−５０２０）を培養方法を変更し，以下の評
価を行った。各形質転換体をテトラサイクリン１０μｇ
／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で３０℃、１８時間培養し
た。この培養菌体を液体培地（２０ｇ／Ｌポリペプト
ン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１５ｇ／Ｌコハク酸、３６
ｇ／Ｌグリセロール、３０ｍｇ／Ｌテトラサイクリン）
中で、３０℃，４２時間培養した。培養後の菌体から、
浸透圧ショック法によりペリプラズムに分泌蓄積した２
０ＫｈＧＨを回収し、該ペリプラズム画分溶液中の濃度
を、ｈＧＨに対する抗体を用いた酵素免疫測定法により
測定した。その測定値から培養液１ＬあたりのｈＧＨの
分泌量を換算した。また、各ペリプラズム画分中の総蛋
白量はＧｒｏｖｅｓらの方法（Ｇｒｏｖｅｓ，Ｗ．Ｅ．
ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２，１９５−２１
０，１９６８）により測定した。ペリプラズム画分にお
ける総蛋白質中の２０ＫｈＧＨの割合は、［実施例１］
の［３］に記載の方法で培養、ペリプラズム画分を抽出
したＷ３１１０／ｐＧＨＲ１０を１として表記した。結
果を、表４に示す。
ｈＧＨ生産性の評価 実施例１の［４］で作製した大腸菌形質転換体ｗ３１１
０／ｐＧＨＲ５２５（ＭＴ−１０８５３（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６２９１））、ｗ３１１０／ｐＧＨＳ５２５（ＭＴ
−１０８５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９０））、及び比
較のため特開平８−３２２５８６号公報（又は、欧州特
許公開第０７３５１４０号明細書）記載の公知菌株であ
るｗ３１１０／ｐＧＨＲ１０（ＭＴ−１０７６５（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−５０２０）を培養方法を変更し，以下の評
価を行った。各形質転換体をテトラサイクリン１０μｇ
／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で３０℃、１８時間培養し
た。この培養菌体を液体培地（２０ｇ／Ｌポリペプト
ン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１５ｇ／Ｌコハク酸、３６
ｇ／Ｌグリセロール、３０ｍｇ／Ｌテトラサイクリン）
中で、３０℃，４２時間培養した。培養後の菌体から、
浸透圧ショック法によりペリプラズムに分泌蓄積した２
０ＫｈＧＨを回収し、該ペリプラズム画分溶液中の濃度
を、ｈＧＨに対する抗体を用いた酵素免疫測定法により
測定した。その測定値から培養液１ＬあたりのｈＧＨの
分泌量を換算した。また、各ペリプラズム画分中の総蛋
白量はＧｒｏｖｅｓらの方法（Ｇｒｏｖｅｓ，Ｗ．Ｅ．
ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２，１９５−２１
０，１９６８）により測定した。ペリプラズム画分にお
ける総蛋白質中の２０ＫｈＧＨの割合は、［実施例１］
の［３］に記載の方法で培養、ペリプラズム画分を抽出
したＷ３１１０／ｐＧＨＲ１０を１として表記した。結
果を、表４に示す。
【００７１】
【表４】
【００７２】
【発明の効果】本発明により従来の方法に比べてより大
量に２０ＫｈＧＨを分泌生産させることが出来る大腸菌
を用いた２０ＫｈＧＨを分泌生産方法が提供される。
量に２０ＫｈＧＨを分泌生産させることが出来る大腸菌
を用いた２０ＫｈＧＨを分泌生産方法が提供される。
【００７３】また、本発明の方法では得られるペリプラ
ズム抽出溶液中の夾雑蛋白質が少ないため、該抽出溶液
を用いた精製が容易であり、純度の高い２０ＫｈＧを安
価に大量に生産することが可能となる。更に、グリセロ
ール０．０１〜１０％及びコハク酸０．０１〜５％の少
なくとも一方を含む培地を使用することで、２０ＫｈＧ
の生産量をさらに増大させることができる。
ズム抽出溶液中の夾雑蛋白質が少ないため、該抽出溶液
を用いた精製が容易であり、純度の高い２０ＫｈＧを安
価に大量に生産することが可能となる。更に、グリセロ
ール０．０１〜１０％及びコハク酸０．０１〜５％の少
なくとも一方を含む培地を使用することで、２０ＫｈＧ
の生産量をさらに増大させることができる。
【００７４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>Mitsui Chemicals, Incorporated <120>Method of Secretory Production of Human Growth Hormone <130>31990032 <150>JP 193003/1998 <151>1998-07-08 <160>41 <210>1 <211>26 <212>PRT <213>E. coli <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(26) <223>OppA secretion signal <400>1 Met Thr Asn lle Thr Lys Arg Ser Leu Val Ala Ala Gly Val 1 5 10 Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 15 20 25 <210>2 <211>27 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(27) <223>Modified OppA secretion signal <400>2 Met Thr Asn lle Thr Lys Arg Ser Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Leu 1 5 10 15 Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 20 25 <210>3 <211>28 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <220> <221>(1)...(28) <223>Modified OppA secretion signal <400>3 Met Thr Asn lle Thr Lys Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Ala Gly Val 1 5 10 15 Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 20 25 <210>4 <211>29 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(29) <223>Modified OppA secretion signal <400>4 Met Thr Asn lle Thr Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Gly 1 5 10 15 Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 20 25 <210>5 <211>30 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(30) <223>Modified OppA secretion signal <400>5 Met Thr Asn lle Thr Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala 1 5 10 15 Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 20 25 30 <210>6 <211>31 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(31) <223>Modified OppA secretion signal <400>6 Met Thr Asn lle Thr Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 20 25 30 <210>7 <211>32 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(32) <223>Modified OppA secretion signal <400>7 Met Thr Asn lle Thr Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 20 25 30 <210>8 <211>33 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(33) <223>Modified OppA secretion signal <400>8 Met Thr Asn lle Thr Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu 20 25 30 Ala <210>９ <211>34 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(34) <223>Modified OppA secretion signal <400>9 Met Thr Asn lle Thr Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala 20 25 30 Leu Ala <210>10 <211>27 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(27) <223>Modified OppA secretion signal <400>10 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Arg Ser Leu Val Ala Ala Gly Val Leu 1 5 10 15 Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 20 25 <210>11 <211>28 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(28) <223>Modified OppA secretion signal <400>11 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Arg Ser Leu Leu Val Ala Ala Gly Val 1 5 10 15 Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 20 25 <210>12 <211>29 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(29) <223>Modified OppA secretion signal <400>12 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Ala Gly 1 5 10 15 Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 20 25 <210>13 <211>30 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(30) <223>Modified OppA secretion signal <400>13 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala 1 5 10 15 Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 20 25 30 <210>14 <211>31 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(31) <223>Modified OppA secretion signal <400>14 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 20 25 30 <210>15 <211>32 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(32) <223>Modified OppA secretion signal <400>15 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 20 25 30 <210>16 <211>33 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(33) <223>Modified OppA secretion signal <400>16 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu 20 25 30 Ala <210>17 <211>34 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(34) <223>Modified OppA secretion signal <400>17 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala 20 25 30 Leu Ala <210>18 <211>35 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(35) <223>Modified OppA secretion signal <400>18 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val 20 25 30 Ala Leu Ala <210>19 <211>28 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(28) <223>Modified OppA secretion signal <400>19 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Lys Arg Ser Leu Val Ala Ala Gly Val 1 5 10 15 Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 20 25 <210>20 <211>29 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(29) <223>Modified OppA secretion signal <400>20 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Lys Arg Ser Leu Leu Val Ala Ala Gly 1 5 10 15 Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 20 25 <210>21 <211>30 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(30) <223>Modified OppA secretion signal <400>21 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Lys Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Ala 1 5 10 15 Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 20 25 30 <210>22 <211>31 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(31) <223>Modified OppA secretion signal <400>22 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 20 25 30 <210>23 <211>32 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(32) <223>Modified OppA secretion signal <400>23 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu Ala 20 25 30 <210>24 <211>33 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(33) <223>Modified OppA secretion signal <400>24 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala Leu 20 25 30 Ala <210>25 <211>34 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(34) <223>Modified OppA secretion signal <400>25 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val Ala 20 25 30 Leu Ala <210>26 <211>35 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(35) <223>Modified OppA secretion signal <400>26 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn Val 20 25 30 Ala Leu Ala 35 <210>27 <211>36 <212>PRT <213>Artificial Sequence <220> <221>SIGNAL <222>(1)...(36) <223>Modified OppA secretion signal <400>27 Met Thr Asn lle Thr Lys Lys Lys Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Gly Asn 20 25 30 Val Ala Leu Ala 35 <210>28 <211>80 <212>DNA <213>Artificial <220> <222>(1)...(80) <223>DNA sequence for PCR to produce a DNA fragment having a promoter of B. amyloliquefaciens and the first half part of OppA secretion signal. <400>28 ttcgagctcg gtacccggag tctagtttta tattgcagaa tgcgagattg ctggtttatt 60 atacaatata agttttcatt 80 <210>29 <211>83 <212>DNA <213>Artificial <220> <222>(1)...(83) <223>DNA sequence for PCR to produce a DNA fragment having a promoter of B. amyloliquefaciens and the first half part of OppA secretion signal. <400>29 cgcctgcagc tactaaactt ctcttggtga tgttggtcat atgaaatccc cctttttgaa 60 aataatgaaa acttatattg tat 83 <210>30 <211>14 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <222>(1)...(14) <223>Dsigned DNA sequence to act as a primer for PCR to produce the latt er half of a OppA secretion signal. <400>30 aatttaactg tgat 14 <210>31 <211>76 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <222>(1)...(76) <223>Dsigned DNA sequence to act as a primer for PCR to produce the latt er half of a OppA secretion signal. <400>31 gtagctgcag gcgttctggc tgcgctaatg gcagggaatg tcgcgctggc attcccaact 60 ataccacttt cgcgcc 76 <210>32 <211>15 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <222>(1)...(15) <223>Designed DNA sequence to act as a primer for PCR to produce a DNA f ragment having a promoter of B. amyloliquefaciens and a modified first h alf part of OppA secretion signal. <400>32 tgcaacttta tccgc 15 <210>33 <211>45 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <222>(1)...(45) <223>Designed DNA sequence to act as a primer for PCR to produce a DNA f ragment having a promoter of B. amyloliquefaciens and a modified first h alf part of OppA secretion signal. <400>33 gcctgcagct accagacttc ttttcttttt ggtgatgttg gtcat 45 <210>34 <211>51 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <222>(1)...(51) <223>Designed DNA sequence to act as a primer for PCR to produce a DNA f ragment having a promoter of B. amyloliquefaciens and a modified first h alf part of OppA secretion signal. <400>34 gcctgcagct accaataaca gacttctttt ctttttggtg atgttggtca t 51 <210>35 <211>57 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <222>(1)...(57) <223>Designed DNA sequence to act as a primer for PCR to produce a DNA f ragment having a promoter of B. amyloliquefaciens and a modified first h alf part of OppA secretion signal. <400>35 gcctgcagct accaggagca ataacagact tcttttcttt ttggtgatgt tggtcat 57 <210>36 <211>63 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <222>(1)...(63) <223>Designed DNA sequence to act as a primer for PCR to produce a DNA f ragment having a promoter of B. amyloliquefaciens and a modified first h alf part of OppA secretion signal. <400>36 gcctgcagct acgagcagca ggagcaataa cagacttctt ttctttttgg tgatgttggt 60 cat 63 <210>37 <211>69 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <222>(1)...(69) <223>Designed DNA sequence to act as a primer for PCR to produce a DNA f ragment having a promoter of B. amyloliquefaciens and a modified first h alf part of OppA secretion signal. <400>37 gcctgcagct accagcagga gcagcaggag caataacaga cttcttttct ttttggtgat 60 gttggtcat 69 <210>38 <211>54 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <222>(1)...(54) <223>Designed DNA sequence to act as a primer for PCR to produce a DNA f ragment having a promoter of B. amyloliquefaciens and a modified first h alf part of OppA secretion signal. <400>38 gcctgcagct acgagcaata acagacttct tttctttttg gtgatgttgg tcat 54 <210>39 <211>60 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <222>(1)...(60) <223>Designed DNA sequence to act as a primer for PCR to produce a DNA f ragment having a promoter of B. amyloliquefaciens and a modified first h alf part of OppA secretion signal. <400>39 gcctgcagct accagcagga gcaataacag acttcttttc tttttggtga tgttggtcat 60 <210>40 <211>30 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <222>(1)...(30) <223>Dsigned DNA sequence to act as a primer for PCR to produce a DNA fr agment encoding signal peptidase 1 <400>40 ttccaattga tggcgaatat gtttgccctg 30 <210>41 <211>30 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <222>(1)...(30) <223>Dsigned DNA sequence to act as a primer for PCR to produce a DNA fr agment encoding signal peptidase 1 <400>41 tttctgcagt taatggatgc cgccaatgcg 30
【図１】２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ５２の構
築方法を示す図である。
築方法を示す図である。
【図２】２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＲ５２１〜
５２９の構築方法を示す図である。
５２９の構築方法を示す図である。
【図３】２０ＫｈＧＨ分泌プラスミドｐＧＨＳ５２５の
構築方法を示す図である。
構築方法を示す図である。
NP promoter バチルス アミロリキファシエンスの
中性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター領域 20ＫｈＧＨ 分子量約２００００のヒト成長ホルモン ＧＲ 大腸菌由来グルタチオンレダクターゼ遺伝子 ｔａｃ ｔａｃプロモーター領域 ｌａｃＩｑ ｌａｃＩq遺伝子 ｔｅｔｒ テトラサイクリン耐性遺伝子 oppA signal 大腸菌ｏｐｐＡ蛋白質の分泌シグナル m-oppA signal 大腸菌ｏｐｐＡ蛋白質の改変型分泌
シグナル SPI シグナルペプチダーゼ１ rop pBR322由来rop遺伝子 ori pBR322由来複製開始点
中性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター領域 20ＫｈＧＨ 分子量約２００００のヒト成長ホルモン ＧＲ 大腸菌由来グルタチオンレダクターゼ遺伝子 ｔａｃ ｔａｃプロモーター領域 ｌａｃＩｑ ｌａｃＩq遺伝子 ｔｅｔｒ テトラサイクリン耐性遺伝子 oppA signal 大腸菌ｏｐｐＡ蛋白質の分泌シグナル m-oppA signal 大腸菌ｏｐｐＡ蛋白質の改変型分泌
シグナル SPI シグナルペプチダーゼ１ rop pBR322由来rop遺伝子 ori pBR322由来複製開始点
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 内田 博司 千葉県茂原市東郷1144番地 三井化学株式 会社内 (72)発明者 望月 大資 千葉県茂原市東郷1144番地 三井化学株式 会社内 (72)発明者 松本 和也 千葉県茂原市東郷1144番地 三井化学株式 会社内
Claims (21)
- 【請求項１】 大腸菌またはサルモネラ菌のＯｐｐＡ分
泌シグナルと異なるが、該大腸菌ＯｐｐＡ分泌シグナル
とアミノ酸配列において６０％以上の相同性を有する分
泌シグナルであって、該分泌シグナルをコードするＤＮ
Ａの３’末端と分子量約２００００のヒト成長ホルモン
をコードするＤＮＡの５’末端とが直接結合している組
換えＤＮＡを含む微生物を用いて分子量約２００００の
ヒト成長ホルモンを分泌生産し得ることを特徴とする分
泌シグナル。 - 【請求項２】 配列表の配列番号：１のアミノ酸配列に
おける以下の改変：（１）配列番号：１の２〜７番の部
分への１〜３個の塩基性アミノ酸の挿入、 （２）配列番号：１の２〜７番の部分の酸性アミノ酸及
び中性アミノ酸のうちの１〜３個のアミノ酸の塩基性ア
ミノ酸への置換、 （３）配列番号：１の９〜２３番の部分への１〜９個の
疎水性アミノ酸の挿入、 （４）配列番号：１の９〜２３番の部分の非疎水性アミ
ノ酸の１〜９個のアミノ酸の疎水性アミノ酸への置換、 の少なくとも１つを有する請求項１に記載の分泌シグナ
ル。 - 【請求項３】 配列表の配列番号：１の２〜７番の部分
に挿入または置換される塩基性アミノ酸がＬｙｓ及びＡ
ｒｇから選ばれたアミノ酸であり、配列表の配列番号：
１の９〜２３番の部分に挿入または置換される疎水性ア
ミノ酸がＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＡｌａより成る群
から選ばれたアミノ酸である請求項２に記載の分泌シグ
ナル。 - 【請求項４】 配列表の配列番号：２〜２７に記載のア
ミノ酸配列を有する請求項３に記載の分泌シグナル。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の分泌シ
グナルをコードするＤＮＡ。 - 【請求項６】 大腸菌のＯｐｐＡ分泌シグナルとアミノ
酸配列において６０％以上の相同性を有する分泌シグナ
ルをコードするＤＮＡと、分子量約２００００のヒト成
長ホルモンをコードするＤＮＡとを含む組換えＤＮＡで
あって、該分子量約２００００のヒト成長ホルモンをコ
ードするＤＮＡの５’末端と該分泌シグナルをコードす
るＤＮＡの３’末端とが直接結合している、ことを特徴
とする組換えＤＮＡ。 - 【請求項７】 大腸菌のＯｐｐＡ分泌シグナルとアミノ
酸配列において６０％以上の相同性を有する分泌シグナ
ルが、大腸菌またはサルモネラ菌のＯｐｐＡ分泌シグナ
ルの改変分泌シグナルである請求項６に記載の組換えＤ
ＮＡ。 - 【請求項８】 大腸菌のＯｐｐＡ分泌シグナルとアミノ
酸配列において６０％以上の相同性を有する分泌シグナ
ルが請求項２〜４に記載の分泌シグナルである請求項６
に記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項９】 プロモーターと、請求項６〜８のいずれ
かに記載の組換えＤＮＡとを含み、該組換えＤＮＡが該
プロモーターにより発現可能な位置に組み込まれている
ことを特徴とする組換えプラスミド。 - 【請求項１０】 前記プロモーターが大腸菌での前記組
換えＤＮＡの発現を可能とするものであり、大腸菌にお
ける複製オリジンを更に有する請求項９に記載の組換え
プラスミド。 - 【請求項１１】 請求項９又は１０に記載の組換えプラ
スミドで形質転換された大腸菌形質転換体。 - 【請求項１２】 大腸菌形質転換体が、ＦＥＲＭ ＢＰ
−６２９１である請求項１１に記載の大腸菌形質転換
体。 - 【請求項１３】 請求項１１又は１２に記載の大腸菌形
質転換体を培養し、得られた菌体からペリプラズム画分
を抽出して得られたペリプラズム画分溶液を精製して分
子量約２００００のヒト成長ホルモンを得ることを特徴
とする分子量約２００００のヒト成長ホルモンの製造方
法。 - 【請求項１４】 大腸菌形質転換体を培養するに際し
て、グリセロール０．０１〜１０％及びコハク酸０．０
１〜５％の少なくとも一方を含む培地を使用することを
特徴とする請求項１３に記載の製造方法。 - 【請求項１５】 分泌シグナルをコードするＤＮＡの
３’末端に分子量約２００００のヒト成長ホルモンをコ
ードするＤＮＡの５’末端を直接結合した組換えＤＮＡ
と、大腸菌のシグナルペプチダーゼ１をコードするＤＮ
Ａとを含むことを特徴とする組換えプラスミド。 - 【請求項１６】 分泌シグナルをコードするＤＮＡが、
大腸菌またはサルモネラ菌のＯｐｐＡ分泌シグナルをコ
ードするＤＮＡであるか、または請求項５に記載のＤＮ
Ａである請求項１５に記載の組換えプラスミド。 - 【請求項１７】 前記組換えＤＮＡの大腸菌での発現を
可能とするプロモーターと、前記大腸菌のシグナルペプ
チダーゼ１をコードするＤＮＡの大腸菌での発現を可能
とするプロモーターと、大腸菌での複製オリジンとを更
に有する請求項１５または１６に記載の組換えプラスミ
ド。 - 【請求項１８】 請求項１６又は１７に記載の組換えプ
ラスミドで形質転換された大腸菌形質転換体。 - 【請求項１９】 大腸菌形質転換体が、ＦＥＲＭ ＢＰ
−６２９０である請求項１８に記載の大腸菌形質転換
体。 - 【請求項２０】 請求項１８又は１９に記載の大腸菌形
質転換体を培養し、得られた菌体からペリプラズム画分
を抽出して得られた夾雑蛋白質の少ないペリプラズム画
分溶液を精製して分子量約２００００のヒト成長ホルモ
ンを得ることを特徴とする分子量約２００００のヒト成
長ホルモンの製造方法。 - 【請求項２１】 大腸菌形質転換体を培養するに際し
て、グリセロール０．０１〜１０％及びコハク酸０．０
１〜５％の少なくとも一方を含む培地を使用することを
特徴とする請求項２０に記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11194510A JP2000078989A (ja) | 1998-07-08 | 1999-07-08 | ヒト成長ホルモンの分泌生産方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10-193003 | 1998-07-08 | ||
| JP19300398 | 1998-07-08 | ||
| JP11194510A JP2000078989A (ja) | 1998-07-08 | 1999-07-08 | ヒト成長ホルモンの分泌生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000078989A true JP2000078989A (ja) | 2000-03-21 |
Family
ID=26507638
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11194510A Pending JP2000078989A (ja) | 1998-07-08 | 1999-07-08 | ヒト成長ホルモンの分泌生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000078989A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007501622A (ja) * | 2003-08-13 | 2007-02-01 | サンド・アクチエンゲゼルシヤフト | 組換えポリペプチドを精製するための方法 |
| WO2022191223A1 (ja) * | 2021-03-10 | 2022-09-15 | 株式会社カネカ | 原核生物細胞から標的タンパク質を抽出する方法 |
-
1999
- 1999-07-08 JP JP11194510A patent/JP2000078989A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007501622A (ja) * | 2003-08-13 | 2007-02-01 | サンド・アクチエンゲゼルシヤフト | 組換えポリペプチドを精製するための方法 |
| WO2022191223A1 (ja) * | 2021-03-10 | 2022-09-15 | 株式会社カネカ | 原核生物細胞から標的タンパク質を抽出する方法 |
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