KR100341014B1

KR100341014B1 - 진단영상용의테크네튬-99m표지된펩티드

Info

Publication number: KR100341014B1
Application number: KR1019950703516A
Authority: KR
Inventors: 리차아드티.딘
Original assignee: 다이아타이드, 인코포레이티드
Priority date: 1993-02-19
Filing date: 1994-02-18
Publication date: 2002-11-13
Also published as: AU696874B2; US5552525A; ES2265145T3; AU6441994A; CA2156390A1; WO1994019024A2; ATE325625T1; EP0684843B1; KR960700758A; WO1994019024A3; CA2156390C; JPH08507295A; DE69434729D1; EP0684843A1; DK0684843T3

Abstract

본 발명은 방사선진단 시약 및 펩티드, 상기 방사선 진단 시약을 사용하는 방법 및 상기 라벨링된 방사선 진단제를 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 테크네튬-99m (TC-99m) 라벨링된 시약, 상기 시약을 제조하기 위한 방법 및 키트, 및 포유동물 몸체에서의 이미지 부위에 대해 상기 시약을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

진단 영상용의 테크네튬-99m 표지된 펩티드

발명의 배경

1.발명의 분야

본 발명은 방사선진단용 시약 및 펩티드, 이들 방사선 진단용 시약을 사용하는 방법 및 이러한 표지된 방사선진단용 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 테크네튬-99m(Tc-99m) 표지된 시약, 이러한 시약을 제조하기 위한 방법 및 킷, 및 이러한 시약을 사용하여 포유동물 체내의 부위를 영상화시키는 방법에 관한 것이다.

2.선행기술의 설명

병소 또는 국부 감염 부위의 위치 및/또는 범위를 측정할 수 있는 것이 임상적으로 요구되고 있다. 상당수의 환자의 경우, 이학적 검사, X-레이, CT 및 초음파검사와 같은 통상적인 진단 방법으로는 이러한 부위(예를 들어, 농양)를 확인할 수 없다. 생체 검사법이 사용될 수 있지만, 적어도 공지된 위치에서 농양을 일으키는 병원체를 확인하는 데에 침습적 방법이 진단학적으로 적합해질 때까지는 이러한 침습적 방법을 피하는 것이 바람직하다. 이러한 "잠재적" 감염 부위를 확인하는 것이 중요한데, 그 이유는 문제의 신속한 국부화 및 확인이 효과적인 치료 개입에 중요하기 때문이다.

핵의학 분야에서 특정 병리학적 질환은 국부화될 수 있거나, 이러한 질환의 범위는 병리학적 부위에 특이적으로 축적되는 투여된 방사성표지된 트레이서 화합물(즉, 방사성트레이서 또는 방사성 약물)의 내부 분포를 영상화시킴으로씨 결정될 수 있다.⁶⁷Ga,^99mTc(Tc-99m),¹¹¹In,¹²³I,¹²⁵I,¹⁶⁹Yb 및¹⁸⁶Re를 포함하는 다양한 방사성 핵종이 방사선영상화에 유용한 것으로 공지되어 있다.

그러나, 농양을 많은 가능한 병원체 중 어느 하나에 의해 유발될 수 있어서, 특정 병원체에 대해 특이적인 방사성트레이서는 제한된 범위를 가지게 된다. 다른 한편으로, 감염은 거의 변함없이 조직 손상에 대한 신체의 일반적 반응인 염증을 수반한다. 따라서, 감염 부위에 대해 특이적인 방사성트레이서는 임의의 병원체에 의해 유발되는 감염 부위를 국부화시키는 데에 유용할 뿐만 아니라, 다른 염증 부위를 국부화시키는 데에 유용한 것으로 예상될 것이다.

염증과 관련된 주현상 중 하나는 염증 부위에서의 백혈구(백혈구 세포), 일반적으로 단구 및 호중구의 국부화이다. 백혈구에 대해 특이적인 방사성트레이서는 국부화된 감염 부위에서 백혈구를 검출하는 데에 유용할 것이다. 감염 부위를 영상화시키기 위한 것으로 현재 공인된 핵의학적 방법은 인듐-111 표지된 백혈구(¹¹¹In-WBC)(참조: Peters, 1992, J. Nucl, Med.33: 65-67) 또는 갈륨-67(⁶⁷Ga) 시트레이트(참조: Ebright et al., 1982. Arch, Int. Med.142: 246-254)를 사용한다.¹¹¹In 표지된 WBC를 사용하는 데에 있어서의 주된 단점은 방사성트레이서의 제조에않은 기술적 단계, 즉, 자가 혈액의 멸균적 분리 단계, 혈액으로부터의 백혈구의 멸균적 단리 단계, 세포를 손상시키지 않는 조건을 사용하는(왜냐하면 손상된 WBC가 재주입시에 세망 내피계에 의해 흡수되기 때문이다) 백혈구의 멸균적 표지화 단계, 및 환자에게 백혈구(이제는 표지화된)의 멸균적 귀환(재주입) 단계가 필요하다는 점이다. 또한, 최적의 영상을 얻기 위해 주입과 영상화 사이에 12 내지 48시간의 지연이 필요할 수 있다. Tc-99m 표지된 백혈구가 이러한 지연 기간을 단축시키는 데에 사용될 수 있지만(참조: Vorne et al., 1989, J, Jucl. Med.30: 1332-1336), 체외 표지화가 여전히 필요하다. 바람직한 방사성트레이서는 자가 혈액 성분의 분리 및 조작을 필요로 하지 않는 트레이서일 것이다.

대안적으로,⁶⁷Ga-시트레이트가 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 그러나, 상기 화합물은 감염 또는 염증 부위에 대해 특이적이지 않다. 더욱이, 방사성트레이서의 주입과 영상화 사이에 72시간 이하의 지연이 종종 필요하다. 또한,⁶⁷Ga의 γ(감마) 방출 에너지는 통상적인 감마 카메라에 만족스러울 정도로 적합하지 않다.

사람 백혈구(단구, 호중구, 과립구 및 다른 세포 유형을 포함함)에 대해 유도된 방사성표지된 모노클로날 및 폴리클로날 항체가 개발되었다. Tc-99m 표지된 항과립구 모노클로날 항체(참조: Lind et al., 1990, J. Nucl. Med.31: 417-473) 및¹¹¹In 표지된 비특이적인 사람 면역글로불린(참조: LaMuraglia et al., 1989, J. Vasc. Surg.10: 20-28)이 감염에 대해 2차적인 염증의 검출에 대해 시험되었다.¹¹¹In 표지된 IgG는 주입과 최적 영상화 사이에 24 내지 48 시간이 필요하는 점에서¹¹¹In 표지된 WBC의 단점을 공유한다. 또한, 모든 방사성표지된 항체는 생성시키기가 어렵고, 이들이 관리기관에 의해 생물학적 제제로서 일상적으로 분류되므로 승인 과정에 장시간이 소요된다.

작고 쉽게 합성되는 분자가 일상적으로 사용되는 방사성 약물로서 바람직하다. 환자에게로 직접 주입될 수 있고, 백혈구가 축적된 부위에 국부화됨으로써 감염 및 염증 부위를 영상화시키는 작은 합성 분자가 명백히 요구된다. 이러한 응용에 유용한 한 종류의 작고 용이하게 합성되는 분자는 펩티드이다.

방사성표지된 펩티드를 사용하는 영상화 방법의 민감성은 당 분야에 공지된 다른 기법 보다 훨씬 더 높은데, 그 이유는 방사성 펩티드의 특이적 결합이 방사성 신호를 관심있는 영역, 예를 들어 염증 부위 상에 집중시키기 때문이다. 또한, 작은 펩티드를 고수율로 화학적으로 합성하기 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다.

백혈구에 결합하는 것으로 공지된 한 부류의 펩티드는 백혈구가 펩티드 농도 구배를 상승시키도록 유도시키는 화학주성(chemotactic) 펩티드이다[참조: Wilkinson, 1988, Meth. Enzymol.162: 127-132]. 이들 화합물은 매우 높은 친화성을 가지면서 백혈구의 표면 상에 있는 수용체에 결합한다. 이들 펩티드는 보체 인자, 박테리아, 터프트신(tuftsin), 엘라스틴, 피브리노펩티드 B, 피브리노겐 Bβ, 혈소판 인자 4 등을 포함하는 다수의 공급원으로 부터 유도된다. 이들 화학주성 화합물로부터 유도되고 방사성표지된 작은 합성 펩티드가 생체내의 염증 부위를 영상화시키기 위한 방사성트레이서로서 매우 유용할 것이다.

방사성표지된 펩티드는 당 분야에 보고되어 있다.

조비(Zoghbi) 등의 문헌[1981, J. Nucl. Med.22: 32(Abst)]에는¹¹¹In 표지된 트랜스페린에 결합된 박테리아로부터 유도된 포르밀 펩티드 화학주성 인자(fMLF)가 기술되어 있다.

지앙(Jiang) 등의 문헌[1991, J, Nucl. Med.32: 482-491]에는¹²⁵I로 방사성표지된 포르밀화된 펩티드(fMLF)가 기술되어 있다.

피쉬맨(Fischman) 등의 문헌[1991, J. Nucl. Med.32: 482-491]은 화학주성 포르밀 펩티드(fMLF)-¹¹¹In 표지된 DTPA 컨쥬게이트에 관한 것이다.

EPC 90108734.6호는 화학주성 포르밀 펩티드(fMLF)-¹¹¹In 표지된 DTPA 컨쥬게이트에 관한 것이다.

미국 특허 제 4,986,979호는 광친화성 표지를 통해 체외에서 백혈구를 방사성표지시키기 위한 방사성표지된 화학주성 포르밀 펩티드(fMLF)의 용도에 관한 것이다.

PCT WO90/10463호는 광친화성 표지를 통해 체외에서 백혈구를 방사성표지시키기 위한 방사성표지된 화학주성 포르밀 펩티드(fMLF)의 용도에 관한 것이다.

상기 언급된 분야에 공지된 표지된 포르밀-메리오닐-류실-페닐알라닐(fMLF)펩티드의 사용은 이 펩티드가 호중구로부터 초산화물 방출을 유발시키며 (Niedel and Cuatrecasas, 1980,Formyl Peptide Chemotactic Receptors of Leukocytes and Macrophages, in Curr. Top. Cell. Reg.17: 137-170), 충분한 투여량에서 백혈구 감소증을 유발시킬 수 있는(Jiang et al., 1982, Nuklearmed.21: 110-113) 심각한 단점을 수반한다.

혈소판 인자 4는 70개의 아미노산으로 구성된 천연 화학주성 펩티드로서, 생체내에서 염증 및 호중구 및 단구, 감염 부위와 관련된 것으로 알려진 세포형에 결합하는 것으로 이미 공지되어 있다.

토르벡케(Thorbecke) 및 주케어(Zucker)의 1989년 유럽 특허출원 제88111962.2호에는 면역 조절량의 혈소판 인자 4 또는 이로부터 유도된 펩티드를 투여하는 것을 포함하여 면역 반응을 조절하기 위한 조성물 및 방법이 기술되어 있다.

듀엘(Deuel) 등의 문헌[1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA74: 2256-2258]에는 사람 혈소판 인자 4의 아미노산 서열이 기술되어 있다.

듀엘 등의 문헌[1981, Proc. Natl, Acad. Sci. USA78: 4584-4587]에는 혈소판 인자 4가 생체내에서 호중구 및 단구에 대해 화학주성임이 기술되어 있다.

오스터만(Osterman) 등의 문헌[1982, Biochem. Biophys. Res. Comm.107: 130-135]에는 혈소판 인자 4의 카르복실 말단 트리데카펩티드가 화학주성 특성을 가짐이 기술되어 있다.

홀트(Holt) 및 니비아로브스키(Niewiarowski)의 문헌[1985, Sem. Hematol,22: 151-163]은 혈소판 인자 4를 포함하는 혈소판 α-과립 단백질의 생화학의 개관을 제공한다.

골드만(Goldman) 등의 문헌[1985, Immunol.54: 163-171]은 fMLF 수용체 매개된 흡수가 사람 호중구에서 혈소판 인자 4 및 이것의 카르복실 말단 도데카펩티드에 의해 억제됨을 밝혀내었다.

베버위(Bebawy) 등의 문헌[1986, J. Leukocyte. Biol.39: 423-434]에는 생체외 호중구의 혈소판 인자 4 매개된 화학주성 반응이 기술되어 있다.

로스칼조(Loscalzo) 등의 문헌[1985, Arch. Biochem. Biophys.240: 446-455]에는 혈소판 인자 4와 헤파린과 같은 글리코사미노글리칸 사이의 생화학적 상호작용이 기술되어 있다.

메이온(Maione) 등의 문헌[1989, Science247: 77-79]에는 맥관 형성이 재조합 사람 혈소판 인자 4 및 이것의 펩티드 단편에 의해 억제됨이 기술되어 있다.

폴리펩티드를 방사성표지시키기 위한 킬레이트화제의 용도, 및 펩티드 및 폴리펩티드를 Tc-99m으로 표지시키는 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 본원에 참고문헌으로 인용된 공동 계류중인 미국 특허출원 제 07/653,012호, 제 07/807,062호, 제 07/851,074호, 제 07/871,282호, 제 07/886,752호, 제 07/893,981호, 제 07/902,935호, 제 07/955,466호 및 제 08/044,825호에 기술되어 있다.

발명의 요약

본 발명은 방사성표지된 펩티드인 신티그래피 영상화 시약을 제공한다. 본 발명의 시약은 착화기가 방사성 동위원소에 결합되어 있는 방사성 동위원소 착화기에 공유결합되는 생체내 부위, 특히 감염 및 염증 부위 뿐만 아니라 혈전증, 동맥경화증 및 종양 부위에 특이적으로 결합하는 펩티드로 구성된다.

본 발명은 생체내의 다수의 부위에 결합하는 시약, 이러한 시약과 테크네튬-99m의 방사성표지된 착물, 이러한 착물을 제조하는 방법, 상기 방사성표지된 착물을 사용하여 포유동물 체내의 감염, 염증, 혈전증, 동맥경화증 및 종양 성장 부위를 영상화시키는 방법, 및 본 발명의 시약을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 제 1 일면에서, 방사성표지 결합 부분이 특이적 결합 펩티드에 공유결합되어 있는 포유동물 체내의 부위를 영상화시킬 수 있는 방사성표지된 펩티드가 제공되며, 이러한 펩티드는, 하기 일반식(Ⅰ)의 방사성 표지 결합 부분에 공유결합된, 포유동물 체내의 감염, 염증, 혈전증, 동맥경화증 및 종양 성장 부위에 결합하는 혈소판 인자 4 또는 이것의 펩티드 단편을 포함하는 특이적 결합 펩티드를 포함하며, 여기서, 방사성표지 결합 부분이 특이적 결합 펩티드에 공유결합되어 있다.

상기 식에서,

Cp는 보호된 시스테인 잔기이고,

(aa)는 아미노산이다.

바람직한 구체예에서, 아미노산은 글리신이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 방사성표지 결합 부분은 1종 이상의 아미노산을 통해 특이적 펩티드에 결합된다.

제 2 일면에서, 본 발명은 하기 일반식(Ⅱ)을 갖는 방사성표지 결합 부분에 공유결합되는 염증 영상화 펩티드를 제공한다;

상기 식에서,

A는 H, HOCC, H₂NOC, (펩티드)-HNOC, (펩티드)-OOC 또는 R⁴이고,

Z는 H 또는 R⁴이고,

B는 H, SH 또는 -NHR³, -N(R³)-(펩티드) 또는 R⁴이고,

X는 SH 또는 -NHR³, -N(R³)-(펩티드) 또는 R⁴이고,

R¹, R², R³및 R⁴는 각각 H 또는 선형, 분지형 또는 고리형 저급 알킬이고,

n은 0, 1 또는 2이며 ;

(1) B가 -NHR³또는 -N(R³)-(펩티드)인 경우, X는 SH이고, n은 1 또는 2이고,

(2) X가 -NHR³또는 -N(R³)-(펩티드)인 경우, B는 SH이고, n은 1 또는 2이고,

(3) B가 H 또는 R⁴인 경우, A는 HOOC, H₂NOC, (펩티드)-NHOC, (펩티드)-OOC이고, X는 SH이고, n은 0 또는 1이고,

(4) A가 H 또는 R⁴이고 B가 SH인 경우, X는 -NHR³또는 -N(R³)-(펩티드)이며, X가 SH인 경우, B는 -NHR³또는 -N(R³)-(펩티드)이고,

(5) X가 H 또는 R⁴인 경우, A는 HOOC, H₂NOC, (펩티드)-NHOC, (펩티드)-OOC이고, B는 SH이고,

(6) Z가 메틸인 경우, X는 메틸이고, A는 HOOC, H₂NOC, (펩티드)-NHOC, (펩티드)-OOC이고, B는 SH이고, n은 0이고,

(7) Z가 SH이고 X가 SH인 경우, n은 0이 아니며,

티올 부분은 환원된 형태이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기 일반식(Ⅲ) 또는 (Ⅳ)의 방사성 표지 결합 부분에 공유결합된 혈소판 인자 4 또는 이것의 펩티드 단편을 포함하는 특이적 결합 펩티드를 포함하는, 포유동물 체내의 부위를 영상화시키기 위한 방사성표지된 신티그래피 영상화 시약을 제공한다 :

[본 발명을 위해, 상기 구조를 갖는 방사성표지 결합 부분은 피콜린산(Pic)을 기재로 하는 부분으로서 일컬어질 것이다]

[본 발명을 위해, 상기 구조를 갖는 방사성표지 결합 부분은 피콜릴아민(Pica)을 기재로 하는 부분으로서 일컬어질 것이다]

상기 식에서,

X는 H 또는 보호기이고 ;

(아미노산)은 임의의 아미노산이고 ;

방사성표지 결합 부분은 펩티드에 공유결합되며, 방사성표지 결합 부분과 방사성표지의 착물은 전기적으로 중성이다.

바람직한 구체예에서, 아미노산은 글리신이고, X는 아세트아미도메틸보호기이다. 추가의 바람직한 구체예에서, 펩티드는 아미노산, 가장 바람직하게 글리신을 통해 방사성표지 결합 부분에 공유결합되며, 방사성표지는 테크네튬-99m이다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 특이적 결합 펩티드와 펩티드에 공유결합되는 비스아미노 비스티올 방사성표지 결합 부분을 포함하는, 방사성 표지화 시약이 포유동물 체내의 부위를 영상화시키기 위해 제공된다. 본 발명의 이러한 구체예 중의 비스아미노 비스티올 방사성표지 결합 부분은 하기 일반식(Ⅴ) 및 (Ⅵ)로구성된 군으로부터 선택된 일반식을 갖는다:

(상기 식에서,

각각의 R⁵는 독립적으로 H, CH₃또는 C₂H₅일 수 있고 ;

각각의 (pgp)^s는 독립적으로 티올 보호기 또는 H일 수 있고 ;

m, n 및 p는 독립적으로 2 또는 3이고 ;

A는 선형 또는 고리형 저급 알킬, 아릴, 헤테로사이클릴 또는 이들의 조합체 또는 치환된 유도체이며 ;

X는 펩티드이다.)

(상기 식에서,

각각의 R⁵는 독립적으로, H, 탄소수 1 내지 6개의 저급 알킬, 페닐, 또는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로 치환된 페닐이고 ;

m, n 및 p는 독립적으로 1 또는 2이고 ;

A는 선형 또는 고리형 저급 알킬, 아릴, 헤테로사이클릴, 또는 이들의 조합체 또는 치환된 유도체이고 ;

V는 H 또는 CO-펩티드이고 ;

R⁶는 H 또는 펩티드이며, 단, V가 H인 경우, R⁶는 펩티드이고, R⁶가 H인 경우, V는 펩티드이다. [본 발명을 위해, 이들 구조는 갖는 방사성표지 결합 부분은 "BAT" 부분으로서 일컬어질 것이다]. 바람직한 구체예에서, 펩티드는 아미노산, 가장 바람직하게 글리신을 통해 방사성표지 결합 부분에 공유결합되며, 방사성표지는 테크네튬-99m이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드와 Tc-99m의 착물, Tc-99m으로 방사성표지된 본 발명의 펩티드를 제조하기 위한 킷, 본 발명의 펩티드를 Tc-99m으로 방사성 표지화시키는 방법, 및 포유동물 체내의 감염, 염증, 혈전증, 동맥경화증 및 종양 성장 부위를 감마 신티그래피에 의해 영상화시키기 위해 본 발명의 방사성표지된 펩티드를 사용하는 방법을 포함한다.

본 발명은 본 발명의 펩티드 시약과 Tc-99m의 착물인 신티그래피 영상화제, 및 본 발명의 펩티드 시약을 Tc-99m으로 방사성표지시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 제공되는 방사성표지된 착물은 환원제의 존재하에서 본 발명의 펩티드 시약을 Tc-99m과 반응시킴으로씨 생성된다. 바람직한 환원제로는 디티오나이트 이온, 주석(II) 이온 및 철(II) 이온이 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 또한, 본발명의 착물은 본원에 제공된 사전환원된 Tc-99m 착물의 리간드 교환에 의해 본 발명의 펩티드 시약을 Tc-99m으로 표지화시킴으로씨 생성된다.

또한, 본 발명은 Tc-99m으로 방사성표지된 본 발명의 펩티드 시약인 신티그래피 영상화제를 제조하기 위한 킷을 제공한다. 본 발명의 펩티드 시약을 Tc-99m으로 표지시키기 위한 킷은 소정량의 본 발명의 펩티드 시약과 시약을 Tc-99m으로 표지시키기에 충분한 양의 환원제가 함유된 밀봉된 바이알(vial)로 구성된다.

본 발명은 생체외 화학 합성에 의해 본 발명의 펩티드 시약을 제조하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 특이적 결합 펩티드는 고체상 펩티드 합성에 의해 합성된다.

본 발명은 생체내 감마 신티그래피 영상을 수득하여 포유동물 체내의 염증 및 감염 부위를 영상화시키기 위한 Tc-99m 표지된 펩티드 시약인 신티그래피 영상화제를 사용하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 진단적 유효량의 본 발명의 Tc-99m 표지된 펩티드 시약을 투여하고, 포유동물 체내의 염증 부위에 국부화된 Tc-99m 표지에 의해 방출된 감마 방사선을 검출하는 것을 포함한다.

감염 및 염증 부위에 국부화되는 것 이외에, 백혈구는 혈전증에 대한 부위에 국부화되는 것으로 또한 알려져 있다 [참조: Kwaan et al., 1989, "Pathogenesis of Thrombosis", inClinical Thrombosis, Kwaan & Samama, eds, CRC Press : Boca Raton, La. p. 35]. 따라서, 감염 및 염증 부위를 영상화시키는 데에 유용한 방사성트레이서를 제공하는 것 이외에, 본 발명의 PF₄유도된 방사성트레이서는 또한 심부정맥(deep vein) 혈전증 및 폐동맥 색전증 부위를 영상화시키는 데에 유용한 방사성트레이서를 제공한다.

또한, PF₄는 헤파린 및 다른 글리코사미노글리칸에 결합하는 것으로 공지되어 있다 [참조: Loscalzo et al., 1985, ibid]. 동맥경화증의 경우, 과도한 세포 증식, 특히 평활근 세포 증식은 주성분이 글루코사미노글루칸인 세포외 매트릭스 유도된 물질을 과다하게 유도시킨다. 따라서, 본 발명의 방사성표지된 PF₄유도된 펩티드는 또한 동맥경화증 부위를 영상화시키는 데에 유용한 방사성트레이서를 제공한다.

또한, PF₄및 PF₄단편이 종양 관련된 맥관형성을 억제시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다 [참조: Sharpe et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:848-853 and Marione et al., 1990, ibid.]. 따라서, 본 발명의 방사성표지된 PF₄유도된 펩티드는 종양 부위를 영상화시키는 데에 또한 유용한다.

또한, 본 발명의 특이적 결합 펩티드는 다가 결합 부분에 공유결합될 수 있다. 본 발명의 다가 결합 부분은 특이적 결합 펩티드 또는 Tc-99m 결합 부분에 공유결합될 수 있는 2개 이상의 링커 작용기로 구성된다. 바람직한 링커 작용기로는 일차 또는 이차 아민, 히드록실기, 카르복실산기 또는 2-할로아세텔기 및 말레이미도기와 같은 티올 반응성 기가 있다. 바람직한 구체예에서, 다가 결합 부분은 비스-숙신이미딜메틸에테르(BSME), 4-(2,2-디메틸아세틸)벤조산(DMAB), 트리스(숙신이미딜에틸)아민(TSEA), 트리스-아세트아미도에틸아민 및 1,10-비스아세트아미도-4,7-디옥사데칸으로 구성된다.

본 발명의 특정한 바람직한 구체예는 하기의 특정 바람직한 구체예의 더욱 상세한 설명 및 특허청구의 범위로부터 명백해질 것이다.

본 발명은 포유동물 체내의 감염, 염증, 혈전증, 동맥경화증 및 종양 성장 부위에 특이적으로 결합하는 포유동물 체내의 표적 부위를 영상화시키기 위한 Tc-99m 표지된 펩티드 시약을 제공하며, 여기에서 특이적 결합 펩티드는 방사성 동위원소에 결합하는 방사성표지 결할 부분에 공유결합되어 있다.

본 발명의 펩티드 시약은 포유동물 체내의 감염, 염증, 혈전증, 동맥 경화증 및 종양 성장 부위에 특이적으로 결합한다. 또한, 이들 시약은 백혈구, 바람직하게는 단구 및 호중구, 가장 바람직하게는 호중구에 결합할 수 있다. 본 발명은 위해, "백혈구에 결합하는"이라는 표현은 본 발명의 특이적 결합 펩티드 및 펩티드 시약이 감마 신티그래피에 의해 감염 또는 염증 부위에서의 본원에 기술된 본 발명의 시약으로부터 제조된 방사성표지된 착물의 축적을 검출할 수 있도록 하기에 충분할 정도로 포유동물 체내의 감염 및 염증 부위에 축적될 수 있다는 것을 의미하도록 의도된다.

또한, 본원에 사용된 "백혈구에 결합하는"이라는 표현의 의미에는, 백혈구가 혈전증 부위에서 국부화될 수 있다는 사실에 기인하여, 본 발명의 특이적 결합 펩티드 및 펩티드 시약이 혈전증 부위에 축적될 수 있음이 포함된다.

또한, 본 발명의 시약은 동맥경화증 부위에 존재하는 헤파린 및 다른 글리코사미노글리칸에 결합할 수 있다. 본 발명을 위해, "헤파린 및 다른 글리코사미노글리칸에 결합하는"이라는 표현은 글리코사미노글리칸을 포함하는 세포외 매트릭스 물질이 동맥경화증 부위에 국부화될 수 있다는 사실에 기인하여, 본 발명의 특이적 결합 펩티드가 동맥경화증 부위에 축적될 수 있음을 의미하도록 의도된다.

본 발명의 PF₄유도된 펩티드 시약은 종양 관련된 맥관 형성을 억제시킬 수 있고, 본 발명의 특이적 결합 펩티드는 이러한 펩티드가 이러한 종양 부위로 국부화될 수 있다는 사실에 기인하여 생체내 종양 부위에 축적될 수 있다.

본 발명의 바람직한 펩티드로는 혈소판 인자 4 및 이것으로부터 유도된 펩티드가 있다. 본 발명을 위해, "이것으로부터 유도된 펩티드"라는 용어는 혈소판 인자 4 아미노산 서열의 일부 또는 편부에 대해 상동성인 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 천연 혈소판 인자 4 단백질의 단백질분해에 의해 발생되거나 혈소판 인자 4 아미노산 서열 일부의 화학 합성에 의해 발생되는 혈소판 인자 4의 펩티드 단편이 상기 용어에 포함되도록 의도된다. 본 발명의 실시에 유용한 펩티드 단편으로는 포유동물 체내의 감염 및 염증 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단편이 있다. 이러한 펩티드의 예는 하기의 실시예에 나타나 있다.

Cp(aa)Cp 함유 펩티드에 있어서, Cp는 보호된 시스테인이며, 여기에서 S-보호기는 동일하거나 상이하며, 하기에 예시된 기일 수 있지만 이들로 제한되지는 않는다 :

-CH₂-아릴 (아릴은 페닐, 또는 알킬 또는 알킬옥시 치환된 페닐임);

-CH-(아릴)₂(아릴은 페닐, 또는 알킬 또는 알킬옥시 치환된 페닐임);

-C-(아릴)₃(아릴은 페닐, 또는 알킬 또는 알킬옥시 치환된 페닐임);

-CH₂-(4-메틸옥시페닐);

-CH-(4-피리딜)(페닐)₂;

-C(CH₃)₃;

-9-페닐플루오레닐;

-CH₂NHCOR (R은 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 아릴임);

-CH₂-NHCOOR (R은 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 아릴임);

-CONHR (R은 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 아릴임);

-CH₂-S-CH₂-페닐.

본 발명의 비스아미노, 비스티올 부분과 같은 "(pgp)^S"로 표시되는 시스테인-황 보호기를 포함하는 방사성표지 결합 부분은 상기 언급된 보호기 목록에 의해 또한 기술된다.

바람직한 보호기는 일반식 -CH₂-NHCOR을 가지며, 예기에서 R은 탄소수 1 내지 8개의 저급 알킬, 페닐 또는 저급 알킬로 치환된 페닐, 히드록실, 저급 알콕시, 카르복시 또는 저급 알콕시카르보닐이다.

Tc-99m에 의한 표지화기 본 발명의 잇점인데, 그 이유는 이러한 동위원소의 핵 및 방사능 특성이 이것을 이상적인 신티그래피 영상화제로 되게 하기 때문이다.이러한 동위원소는 140keV의 단일 광자 에너지 및 약 6시간의 방사능 반감기를 가지며,⁹⁹Mo-^99mTc 발생기로부터 용이하게 입수할 수 있다. 종래에 공지된 다른 방사성 핵종은 훨씬 더 긴 유효 반감기(예를 들어,¹¹¹In의 경우, 67.4시간의 반감기를 갖는다)를 가지거나 독성(예를 들어¹²³I)이다.

본 발명의 펩티드는 생체외에서 화학적으로 합성될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 일반적으로 펩티드 합성기로 제조하는 것이 유리할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 합성될 수 있으며, 여기에서 방사성표지 결합 부분은 당 업자들에게 널리 공지된 기법을 사용하여 화학적 생체외 합성 동안에 펩티드에 공유결합된다. 합성시에 방사성표지 결합 부분에 공유결합되는 이러한 펩티드가 유리한데, 그 이유는 공유결합의 특정 부위가 측정될 수 있기 때문이다.

본 발명의 방사성표지 결합 부분은 펩티드 합성 도중에 표적 특이적 펩티드 내로 도입될 수 있다. 피콜린산(Pic-)을 포함하는 구체예[예를 들어, Pic-Gly-Cys(보호기)-]의 경우, 방사성표지 결합 부분은 합성시에 최종(즉, 아미노-말단) 잔기로서 합성될 수 있다. 또한, 피콜린산 함유 방사성 표지 결합 부분은 리신의 ε-아미노기에 공유결합되어, 예를 들어 αN(Fmoc)-Lys-εN[Pic-Gly-Cys(보호기)]를 제공할 수 있으며, 상기 부분은 펩티드 사슬 내의 임의의 위치에 혼입될 수 있다. 이러한 서열은 이것이 표적 결합 펩티드 내로 혼입되는 용이한 방식을 제공하기 때문에 특히 유리하다.

유사하게는, 펩티드 사슬의 카르복실 말단에 서열[-Cys(보호기)-Gly-]을 포함시킴으로씨, 피콜릴아민(Pica) 함유 방사성표지 결합 부분[-Cys(보호기)-Gly-Pica]이 펩티드 합성 도중에 제조될 수 있다. 수지로부터 펩티드를 절단시킨 후, 펩티드의 카르복실 말단이 활성화되어 피콜릴아민에 커플링된다. 이러한 합성 루트는 반응성 곁사슬 작용성이 차단된(보호된) 상태로 유지되어 피콜릴아민의 컨쥬게이션 도중에 반응하지 않는 것을 필요로 한다.

Pic-Gly-Cys-킬레이터를 함유하는 작은 합성 펩타드의 예는 하기의 실시예에 나타나 있다. 본 발명은 이들 킬레이터를 실질적으로 임의의 혈소판 인자 4 유도된 펩티드 내로 혼입시켜서 Tc-99m 방사성표지된 펩티드를 생성시킨다.

또한, 본 발명은 Tc-99m으로 표지될 수 있는 비스아민 비스티올(BAT) 킬레이터를 혼입시키는 특이적 결합성 작은 합성 펩티드를 제공한다.

방사성 테크네튬과 본 발명의 펩티드 시약의 착물을 생성시키는 데에 있어서, 테크네튬 착물, 바람직하게는 Tc-99m 퍼테크네테이트의 염이 환원제의 존재하에서 본 발명의 펩티드 시약과 반응하는데; 바람직한 구체예에서, 환원제는 염화 제1주석이다. 착물 및 이러한 착물을 제조하기 위한 수단은 표지화시키려는 소정량의 본 발명의 펩티드 시약 및 시약을 Tc-99m으로 표지시키기에 충분한 양의 환원제를 함유하는 밀봉된 바이알을 포함하는 킷의 형태로 제공되는 것이 편리하다. 대안적으로, 착물은 본 발명의 펩티드 시약을 테크네튬과 트랜스퍼 리간드로서 공지된 또 다른 화합물의 사전형성된 불안정성 착물과 반응시킴으로씨 생성될 수 있다. 이러한 방법은 리간드 교환으로서 공지되어 있고, 당업자에게 널리 알려져 있다. 불안정성 착물은 예를 들어 타르트레이트, 시트레이트, 글루코네이트 또는 만니톨과같은 트랜스퍼 리간드를 사용하여 생성될 수 있다. 본 발명에 유용한 Tc-99m 퍼테크네레이트 염으로는 나트륨염과 같은 알칼리 금속염, 또는 암모늄염 또는 저급 알킬 암모늄염이 있다. 본 발명의 펩티드 시약과 Tc-퍼테크네테이트 또는 사전형성된 Tc-99m 불안정성 착물의 반응은 실온에서 수성 매질 중에서 수행될 수 있다. 음이온성 착물이 수성 매질 중에서 형성되는 경우, 방사성표지된 착물은 나트륨 양이온, 암모늄 양이온, 모노-, 디- 또는 트리-저급 알킬 아민 양이온 또는 임의의 약제학적으로 허용되는 양이온과 같은 적당한 양이온과의 염의 형태로 존재한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 테크네튬 표지된 펩티드를 제조하기 위한 킷이 제공된다. 본 발명의 펩티드 시약은 당업자에게 잘 알려져 있고 하기에 기술되는 방법 및 수단을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 펩티드는 방사성 동위원소에 결합하는 방사성 표지 결합 부분에 공유결합된다. 적당량의 펩티드 시약이 시약을 Tc-99m으로 표지시키기에 충분한 양의 염화 제1주석 또는 고체상 환원제와 같은 환원제를 함유하는 바이알 내로 도입된다. 기술된 적당량의 트랜스퍼 리간드(예를 들어, 타르트레이트, 시트레이트, 글루코네이트 및 만니톨)가 또한 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 테크네튬 표지된 펩티드는 적당량의 Tc-99m 또는 Tc-99m 착물을 바이알 내로 첨가시키고, 하기 실시예 2에 기술된 조건하에서 반응시킴으로씨 제조될 수 있다.

적당량의 방사능을 갖는 본 발명에 의해 제공된 방사성표지된 펩티드 시약이 제공된다. Tc-99m 방사성 착물을 형성하는데 있어서, 1㎖당 약 0.01밀리퀴리(mCi) 내지 100mCi의 농도로 방사능을 함유하는 용액 중에서 방사성 착물을 형성시키는것이 일반적으로 바람직하다.

본 발명에 의해 제공되는 테크네튬 표지된 펩티드 시약은 농양 및 "잠재적" 감염 부위를 포함하는 염증 부위를 가시화시키는 데에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 테크네튬 표지된 펩티드는 염증성 장질환 및 관절염과 같은 질병을 포함하는 조직 허혈에 의해 유발되는 염증 부위를 가시화시키는 데에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드는 동맥 경화증 및 혈전증 부위를 가시화시키는 데에 사용될 수 있을 뿐만 아니라 생체내 종양 부위, 특히 다른 식으로 검출하기에는 너무 작은 1차 또는 전이성 종양 부위를 국부화시키는 데에 유용하다.

본 발명에 따르면, 테크네튬 표지된 펩티드, 또는 약제학적으로 허용가능한 대이온과의 염 또는 착물로서의 착물은 하나의 단위 주입 용량으로 투여된다, 멸균 식염 용액 또는 혈장과 같은 당업자에게 공지된 통상의 임의의 캐리어가, 본 발명에 따라 각종 기관, 종양 등을 진단학적으로 영상화시키기 위한 주입 용액을 제조하기 위해 방사성 표지 후에 사용될 수 있다. 일반적으로, 투여하려는 단위 용량은 약 0.01mCi 내지 약 100mCi, 바람직하게는 1mCi 내지 20mCi의 방사능을 갖는다. 단위 용량으로 주입하려는 용액은 약 0.O1㎖ 내지 약 10㎖이다. 정맥내 투여후, 생체내에서의 기관 또는 종양의 영상화는 수 분 후에 수행될 수 있다. 그러나, 영상화는 소망에 따라 환자에게 주입된 지 수 시간 이상이 지난 후에 수행될 수 있다. 대부분의 경우, 충분량의 투여 용량이 약 6분 내에 영상화시키려는 영역에 축적되어, 신티포토(scintiphoto)를 취할 수 있을 것이다. 진단을 위한 임의의 통상적인 신티그래피 영상화 방법이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 테크네튬 표지된 펩티드 및 착물은 수성 식염 매질과 같은 정맥내 주입용의 임익의 통상적인 매질, 또는 혈장 매질에 함유된 형태로 정맥내 투여될 수 있다. 또한, 이러한 매질은 예를 들어 삼투압을 조절하기 위한 약제학적으로 허용되는 염, 완충제, 방부제 등과 같은 통상적인 약제학적 보조 물질을 함유할 수 있다. 바람직한 매질로는 전형적인 식염 및 혈장이 있다.

이들 화합물을 제조하고 표지화하기 위한 방법은 하기의 실시예에서 더욱 상세히 예시된다. 이들 실시예는 상기 기술된 방법 및 유리한 결과의 특정 일면을 예시하는 것이다. 이들 실시예는 예시를 위한 것이지, 제한을 위한 것은 아니다.

실시예 1

고체상 펩티드 합성

어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 모델 431A 펩티드 합성기를 사용하고, 디시클로헥실카르보디이미드/히드록시벤조트리아졸 또는 2-(1H-벤조-트리아졸-1-일)-1,1,3,3,-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트/히드록시벤조트리아졸(HBTU/HOBT)과 커플링하는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 아미노-말단 보호를 사용하고, 카르복실 말단 산에 대한 ρ-히드록시메틸페녹시메틸-폴리스티렌(HMP) 수지 또는 카르복시 말단 아미드에 대한 링크(Rink) 아미드 수지를 사용하여, 고체상 펩티드 합성(SPPS)을 0.25 밀리몰(mmole) 규모로 수행하였다. 적합한 경우, 수지 결합된 펩티드를 N-메틸피롤리돈(NMP) 중의 아세트산 무수물로 처리하여 N-α-아세틸기를 도입시켰다. 수지 결합된 생성물을 실온에서 1.5 내지 3시간 동안 100:5:5:2.5:2의 비로 준비한 트리플루오로아세트산, 물, 티오아니솔, 에탄디티올 및 트리에틸실란으로 구성된 용액을 사용하여 통상적으로 절단시켰다. 미정제 펩티드를, 워터스 델타 팩(Waters Delta Pak) C18 칼럼 및 아세토니트릴로 개질시킨 물 중의 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하는 구배 용리를 사용하여 제조용 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제하였다. 아크릴로니트릴을 용리된 분획으로부터 증발시킨 후, 동결건조시켰다. 각각의 생성물의 동일성을 고속 원자 충격 질량 스펙트로스코피(FABMS)에 의해 확인하였다.

실시예 2

Tc-99m으로 방사성표지시키는 일반적 방법

실시예 1에서 제조한 펩티드(0.1mg)을 표 1에 대한 각주에 기술한 바 이 용매 0.1ml 중에 용해시켰다. 글루코스칸(Glucoscan) 바이알(E.I. DuPont de Nemours, Inc)을 200mCi 이하를 함유하는 Tc-99m 나트륨 퍼테크네테이트 1.Oml로 재구성시킴으로써 Tc-99m 글루셉테이트(gluceptate)를 제조하고, 실온에서 15분간 방치시켰다. 그 다음, Tc-99m 글루셉테이트 25㎕를 펩티드 시약에 첨가시키고, 100℃ 또는 실온에서 30분간 반응시킨 후, 0.2㎛ 필터를 통해 여과시켰다.

Tc-99m 표지된 펩티드 시약의 순도를 바이닥(Vydak) 218TP54 분석 칼럼(RP-18, 5 미크론, 200 × 4.6mm) 또는 워터스 델타 팩 분석 칼럼(Cl8, 5 미크론, 39mm × 50mm)를 사용하여 HPLC에 의해 측정하고, 표 1의 각주에 기출된 바와 같이 용리시켰다. 방사능 성분물 적분 레코더(integration recorder)에 연결된 인라인(in-line) 방사능측정용 검출기에 의해 검출시켰다. Tc-99m 글루셉테이트 및 Tc-99m 나트륨 퍼테크네테이트는 이러한 조건하에서 1 내지 4분 사이에 용리된 반면, Tc-99m 표지된 펩티드는 훨씬 더 긴 시간 후에 용리되었다.

하기의 표는 본원에 설명된 방법을 사용하여 실시예 1에 따라 제조한 펩티드의 성공적인 Tc-99m 표지화를 예시하는 것이다.

아미노산에 대한 단일 문자 약어는 문헌[G. Zubay, Biochemistry (2d.ed),1988 (MacMillen Publishing : Y)]에서 찾아볼 수 있으며; Orn = 오르니틴; Ac = 아세틸; Pic = 피콜리노일 (피리딘-2-카르보닐); Acm = 아세트아미도메틸; Mob=4-메톡시베(Methoxybe); [DTPA] = 디에틸렌트리아민펜타아세트산; BSME = 비스-숙신 이미딜메틸 에테르; ε-K = 펩티드 결합 중의 펩티드 중의 리신 잔기가 α-아미노기가 아닌 리신 결사슬 상에 ε-아미노기를 포함한다.

* 하기 표지화 조건이 적당한 펩티드와 함께 사용되었다 :

1. 펩티드를 물에 용해시키고 100℃에서 표지화시켰다.

2. 펩티드를 물에 용해시키고 실온에서 표지화시켰다.

3. 펩티드를 에탄올:물의 1:1 혼합물에 용해시키고 100℃에서 표지화시켰다.

4. 펩티드를 에탄올:물의 혼합물에 용해시키고 실온에서 표지화시켰다.

HPLC 방법 ;

일반적 사항 : 용매 A = 0.1% CH₃COOH/H₂0

용매 B₉₀= 0.1% CH₃COOH/90% CH₃CN/H₂0

용매 유속 = 1ml/분

바이닥 칼럼 = 바이닥 218TP54 RP-18, 5μ, 가아드(guard) 칼럼이 구비된 220mm × 4.6mm 분석 칼럼

워터스 칼럼 = 워터스 델타팩 C18, 5μ, 39mm × 150mm

방법: 바이닥 또는 워터스 칼럼

10 내지 20분에서 100% A 내지 100% B₉₀

실시예 3

Tc-99m 표지된 펩티드의 신티그래피 영상하 및 생체 분포

상기 제공된 바와 같이 Tc-99m 표지된 펩티드 시약의 효능을 입증하기 위해, 뉴질랜드산 흰토끼를 강력한 대장균 스트레인으로 좌측 종아리에 근내 접종시켰다. 24시간 후, 동물을 케타민 및 크실라진의 근내 주입에 의해 진정시킨 후, TC-99m 표지된 펩티드(≤150μg, 2-10mCi)를 정맥내 주입하였다. 동물을 감마 카메라(LEAP 시준기/Tc-99m에 대해 포토피킹(photopeaking)됨)의 시야 영역내에 반듯이 위치시키고, 주입후 첫 번째 1시간에 걸쳐 영상화시킨 후, 주입 후 그 다음 3시간에 걸쳐 약 1시간 간격으로 영상화시켰다. 동물을 영상 획득 사이에서 회복시키고, 필요에 따라 재마취시켰다.

최종 영상화를 완결하였을 때, 각각의 동물을 페노바비탈의 정맥내 과다 투여에 의해 희생시키고, 해부하여 혈액 샘플과 감염된 근육조직 샘플 및 대조 근육조직 샘플을 얻었다. 조직 샘플을 칭량하고, 표준량의 주입용량과 함께 감마 계수기를 사용하여 계수하고, 조직 내에 잔류하는 주입된 용량의 퍼센트(조직 1 그램에 대해)를 측정하였다. 감염된 근육조직 대 감염되지 않은 근육조직, 및 감염된 근육조직 대 혈액의 그램당 주입된 용량의 퍼센트의 비를 각각의 펩티드에 대해 계산하였다. 결과를 하기에 표에 기재하였다. 식 아세틸/KKKKKC_AcmGC_AcmGGPLYKKIIKKLLES를 갖는 본 발명의 Tc-99m 표지된 시약을 주입한 토끼의 전체 몸체 및 다리 영상의 신티포토를 제1도에 도시하였다.

표에 나타난 감염된 근육/대조 근육의 비는 정상 조직과 비교하여 감염 부위에서의 본 발명의 방사성표지된 펩티드의 특이적이고 우선적인 국부화를 명백히 나타낸다. 또한, 제1도에 도시된 영상은 감염되지 않은 대측성 다리와 비교하여 실험적으로 감염시킨 부위를 갖는 다리에서 훨씬 더 높은 정도의 방사능 국부화를 명백히 나타낸다.

실시예 4

Tc-99m 표지된 화합물 혈전 신티그래피 영상화제를 사용하는 개과동물 모델에서의 심부 정맥 혈전증의 생체내 영상화

잡종개(25-31lb, 밤새 절식시킴)를 케타민과 아세프로자민의 배합물로 근내 주입시켜서 진정시킨 후, 나트륨 펜타바비탈을 정맥내 주입하여 마취시켰다. 18 게이지(gauge)의 안지오캐트(angiocath)를 우측 대퇴부 정맥의 원위 절반부 내에 삽입하고, 각각의 동물에서 대략 중간 대퇴골에 있는 대퇴부 정맥내에 8mm Dacton?이 감겨진 스레인레스강 엠볼리제이션 코일(Cook Co,, Bloomington IN)을 정위시켰다. 카테테르를 제거하고, 상처를 봉합하고 코일의 정위를 X-레이에 의해 분석하였다. 그 후, 동물을 밤새 회복시졌다.

코일을 정위시킨지 1일째에, 각각의 동물을 다시 마취시키고, 정맥내 식염 점적장치를 각각의 앞다리에 정위시키고, 방광 카테테르를 삽입하여 소변을 모았다. 동물을 저에너지 다목적 시준기가 장착된 감마 카메라 아래에 반듯이 정위시키고, Tc-99m에 대해 포토피킹시켰다. 핵의학 컴퓨터 시스템으로 영상을 얻었다.

Tc-99m 표지된 시약[185-370mBp(5-10mCi) Tc-99m 및 0.2 내지 0.4mg의 시약]을 이것의 삽입 지점에서 한쪽 앞다리 정맥 내에 주입하였다. 제 2 라인을 혈액 수집을 위해 유지시켰다. 다리에 대한 전방 영상을 주입한 지 약 10 내지 20분, 및 약 1,2,3 및 4시간째에 500,000 카운트 또는 20분(어느쪽이 든 더 짧은 것) 동안 얻었다. 최종 영상을 수집한 후, 각각의 동물을 펜토바비탈로 깊이 마취시켰다. 2가지 혈액 샘플을 헤파린이 첨가된 주사기를 사용하여 심장 천자 상에서 모은 후, 안락사 용량의 포화 염화칼륨 용액을 심장내 또는 보루스(bolus) 정맥내 주입에 의해 투여하였다. 혈전을 함유하는 대퇴부 정맥 및 넓적다리 근육 샘플을 신중히 절개하였다. 그 후, 혈전을 혈관으로부터 절개하고, 사전에 칭량된 시험관에 넣었다. 그 후, 혈전 샘플을 칭량하고, Tc-99m 채널 내에서 감마 웰 계수기로 계수하였다. 주입된 용량의 공지된 분획을 또한 계수하였다.

안락사시키기 직전에 얻은 혈전 및 혈액 중의 새로운 혈전 중량 (퍼센트 주입 용량(%ID)/g) 및 혈전/혈액 및 혈전/근육 비를 측정하였다. 컴퓨터 저장된 영상로부터 혈전 및 인접 근육에 대해 유도된 관심있는 영역(region-of-interest, ROI)에서 측정한 카운트/픽셀의 분석에 의해 혈전/백그라운드 비를 측정하였다. 이들결과를 사용하여, 방사능의 혈전 특이적 국부화, 및 생체내 혈전 형성 부위를 국부화시키기 위한 신티그래피 영상화의 효율을 측정하였다.

실시예 5

과콜레스테롤 토끼 모델을 사용하는 동맥경화성 플라크의 국부화 및 생체내 영상화

체중이 2 내지 3kg인 암컷과 수컷으로 구성된 뉴질랜드산 흰토끼(NZW)를 2개의 군으로 나누었다. 대조군을 우리에 넣고, 시판용 토끼 먹이(Purina)를 섭식시켰다. HC 군을 생후 7주에서 28주까지 규정화된 콜레스테롤이 풍부한 규정식(토끼 먹이를 1 중량/중량% 정도의 콜레스테롤과 혼합시킴)를 섭식시켰다. 모든 동물에게 임의로 물을 공급하였다.

상기 기술된 바와 같은 펩티드 약 250 내지 400μg을 140 내지 16OmCi의 Tc-99m으로 표지시키고, 0.2mL 부피 용량에서 7 내지 8mCi(12.5-20.0μg/토끼;6-7μg/kg)의 단위 용량으로 제조하였다. 성숙한 토끼의 측면 귀 정맥에, Tc-99m 표지된 펩티드를 느린 보루스 주입(대략 0.1mL/분)에 의해 정맥내 주입시킴으로씨 투여하였다. 핀-홀(Pin-hole) 시준기(5mm 구경), 및 Tc-99m에 대해 설정되고 원하는 시간동안 500,000 카운트 또는 스캔이 축적되도록 프로그래밍된 에너지 윈도우가 갖춰진 감마 카메라를 사용하였다. 영상화 직전에, 동물을 케타민 및 크실아진의 혼합물(5:1, 1㎖/kg 근육내)로 마취시켰다.

감마 카메라 영상을 심장 바로 위 40˚ -45˚(왼쪽 전방 사설[LAO]으로 관찰)에 모아서, 대동맥 아치의 윤관을 관찰하고, 하행 대동맥을 관찰하였다. 주입한지 1 및 2시간째, 및 경우에 따라 3 및 5시간째에 영상을 얻었다. 각각의 영상을 수집하기 전에 필요에 따라 보충 마취제를 주입하였다.

2.5시간째(2시간 스캔 후)에, 동물을 나트륨 펜토바비탈의 정맥내 투여로 희생시켰다. 부검시, 대동맥을 분리하여, 분지 혈관을 대동맥 판에서 중간 복부 영역까지 절개하였다. 평행한 구경의 시준기를 사용하여, 대동맥을 체외에서 영상화시켰다. 그 다음, 대동맥을 종방향으로 개복하고, 수단(Sudan) Ⅳ로 염색시켜서, 동맥경화성 플라크를 진한 붉은 벽돌색으로 바꾸었다. 지질이 없고 손상되지 않은 대동맥 내피는 정상 상태로 유지되어, 이러한 조건하에서 백색-분홍색 외관을 나타내었다.

대동맥에 대한 염색에 의해 관찰되는 플라크의 국부화와 일치하는 체내 및 체외 영상에서 나타나는 플라크된 대동맥 영역 대 플라크되지 않은 대동맥의 흡수율을 사용하여, 동맥경화증의 영상을 제공하는 본 발명의 방사성표지된 펩티드의 유용성을 입증하였다.

전술한 설명은 본 발명의 특정 구체예를 강조한 것이며, 첨부된 청구의 범위에 기술된 본 발명의 사상 및 범위 내에서 모든 변형 또는 대안적 균등물이 존재하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims

(a) 혈소판 인자 4 펩티드 또는 혈소판 인자 4 펩티드 단편; (b) 펩티드 또는 이것의 단편에 공유결합된 방사성표지 결합 부분; 및 (c) 1 내지 5개의 염기성 아미노산 잔기를 포함하여, 염증 또는 감염 부위와 결합되는 방사성진단 시약.
제1항에 있어서, 방사성표지 결합 부분이 하기 일반식 (Ⅰ), (Ⅱ), (Ⅲ), (Ⅳ), (Ⅴ) 및 (Ⅵ)으로 구성된 군으로부터 선택된 일반식을 갖는 시약 :

상기 식(Ⅰ)에서,

Cp는 보호된 시스테인이고,

(an)는 α-아미노산 또는 β-아미노산이고;

상기 식 (Ⅱ)에서,

A는 H, HOOC, H₂NOC, (펩티드)-NHOC, (펩티드)-OOC 똔는 R⁴이고,

B는 H, SH, -NHR³, -N(R³)-(펩티드) 또는 R⁴이고,

X는 H, SH, -NHR³, -N(R³)-(펩티드) 또는 R⁴이고,

Z는 H 또는 R⁴이고,

R¹, R², R³및 R⁴는 각각 H, 또는 선형, 분지형 또는 고리형 저급 알킬이고,

n은 0, 1 또는 2 이며,

B가 -NHR³또는 -N(R³)-(펩티드)인 경우, X는 SH이고, n은 1 또는 2이고,

X가 =NHR³또는 -N(R³)-(펩티드)인 경우, B는 SH이고, n은 1 또는 2이고,

B가 H 또는 R⁴인 경우, A는 HOOC, H₂NOC, (펩티드)-NHOC 또는 (펩티드)-OOC이고, X는 SH이고, n은 0 또는 1 이고,

A가 H 또는 R⁴이고 B가 SH인 경우, X는 -NHR³또는 -N(R³)-(펩티드)이며, X가 SH인 경우, B는 -NHR³또는 -N(R³)-(펩티드)이고,

X가 H 또는 R⁴인 경우, A는 HOOC, H₂NOC, (펩티드)-NHOC 또는 (펩티드)-OOC이고, B는 SH이고,

Z가 메틸인 경우, X는 메틸이고, A는 HOOC, H₂NOC, (펩티드)-NHOC 또는 (펩티드)-OOC이고, B는 SH이고, n은 0이며,

티올 부분은 환원된 형태이고;

상기 식(Ⅲ) 및 (Ⅳ)에서,

X는 H 또는 보호기이고,

(아미노산)은 임의의 아미노산이고;

상기 식(Ⅴ)에서,

각각의 R⁵는 독립적으로 H, CH₃또는 C₂H₅이고,

각각의 (pgp)^S는 독립적으로 티올 보호기 또는 H이고,

m, n 및 p는 독립적으로 2 또는 3이고,

A는 선형 또는 고리형 저급 알킬, 아릴, 헤테로사이클릴 또는 이들의 조합체 또는 치환된 유도체이고,

상기 식 (Ⅵ)에서,

각각의 R⁵는 독립적으로 H, 탄소수 1 내지 6개의 저급 알킬, 페닐, 또는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로 치환된 페닐이고,

m, n 및 p는 독립적으로 1 또는 2이고,

A는 선형 또는 고리형 저급 알킬, 아릴, 헤테로사이클릴 또는 이들의 조합체 또는 치환된 유도체이고,

V는 H 또는 -C0-펩티드이고,

R⁶는 H 또는 펩티드이며,

V가 H인 경우, R⁶는 펩티드이고, R⁶가 H인 경우, V는 -C0-펩티드이다.
제2항에 있어서, 펩티드 또는 이것의 단편과 방사성표지 결합 부분이 1 내지 20개의 아미노산을 통해 공유결합되는 시약.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 PLYKKIIKKLLES, PLY.Orn.Orn.II.Orn.Orn.LLES, QAPLYKKIIKKLLES 및 KKIIKKLLES로 구성된 군으로부터 선택되는 시약.
제1항 또는 제2항에 있어서, 테크네튬-99m을 추가로 포함하는 시약.
2개 이상의 혈소판 인자 4 펩티드 또는 혈소판 인자 4 펩티드 단편에 공유결합된 다가 링커를 포함하는, 분자량이 20,000 달톤 미만인 다가의 멀티머성 신티그래피 영상화제.
제6항에 있어서, 링커가 비스-숙신이미틸메틸에테르, 4-(2,2-디메틸아세틸)벤조산, 디에틸렌트리아민펜타아세트산, 트리스(숙신이미딜에틸)아민, 트리스-아세트아미도에틸아민, 1,10-비스아세트아미도-4,7-디옥사-데칸, 비스-숙신이미딜메틸에테르의 유도체, 4-(2,2-디메틸아세틸)벤조산의 유도체, 디에틸렌트리아민펜타아세트산의 유도체, 트리스(숙신이미딜에틸)아민의 유도체, 트리스-아세트아미도에틸아민의 유도체 및 1,10-비스아세트아미도-4,7-디옥사-데칸의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화제.
소정량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 시약과 시약을 테크네튬-99m으로 표지화시키기에 충분한 양의 환원제가 함유된 밀봉된 바이알을 포함하는,방사성 약물 제형을 제조하기 위한 킷.
포유동물 체내의 부위를 영상화시키기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 시약을 포함하는 약제 조성물.
포유동물 체내의 부위를 영상화시키기 위한, 하기 일반식으로 구성된 군으로부터 선택된 일반식을 갖는 물질의 조성물: