KR100336139B1 - 신규의펩티드활성물질및그의제조방법 - Google Patents

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Abstract

화합물 Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl·HCl이 개시된다. 이는 Z-Val-Val-MeVal-Pro-OR1(여기서, Z 및 R1은 명세서에 정의된 바와 동일하다)로부터 제조된다. 화합물은 항종양 활성을 나타낸다.

Description

신규의 펩티드 활성 물질 및 그의 제조 방법
본 발명은 신규의 활성 펩티드 및 그의 제조 방법 및 그를 위한 적당한 출발 물질에 관한 것이다.
문헌 (PCT 출원 국제 공개 제 93/23424호)에 흥미로운 항종양 활성을 갖는 펩티드 기재 활성 물질이 개시되어 있다. 하기 화학식을 갖는, 상기 출원의 실시예 234의 펩타펩티드가 특히 우수한 효과를 나타낸다.
상기 식에서,
Me2Val은 N,N-디메틸-L-발린이고,
MeVal은 N-메틸-L-발린이며,
Bzl은 벤질이다.
상기 PCT 출원에 따른 펩티드는 프롤린을 출발 물질로 하는 고상(solid-phase)법에 의해 제조될 수 있다. 이는 불순한 활성 물질을 낮은 수율로 제공한다. 정교한 크로마토그래피 정제가 필수적이다. 더우기, 고상법은 소량의 물질을 제조하는 경우에만 적당하다. 상기 문헌의 실시예 234의 물질을 결정 형태로 제조할 수 있는 지의 여부는 아직까지 입증되지 않았다. 활성 물질은 수지의 형태이다. 이는 잔류 용매의 완전한 제거를 곤란하게 한다. 고가의 정제 단계 (분무 건조, 동결 건조)가 필수적이다. 물질의 제약학적 공정의 방해가 된다. 물질을 시험하고 생산을 착수하는 데 대량의 물질이 필수적이다. 산업적으로 수행될 수 있는 방법에는 활성 물질을 가능하다면 결정 형태로 제조하는 것이 요구된다.
본 발명자들은 고순도로 라세미화 없이 활성 물질을 제공하여 물질을 결정성 염, 염산염으로 어려움없이 전환시킬 수 있는 방법을 알아내었다.
본 발명은 하기 화학식 II의 화합물에서
A a) N 말단상의 보호기 Z를 제거시키고, 수득된 화합물에서 1) N 말단 상의 유리 아미노기를 디메틸화시키고, 2) C 말단상의 알콕시기 -OR1를 가수분해시키고, b) 수득된 하기 화학식 V의 화합물을 화학식 XII의 프롤린 벤질아미드와 결합시키거나, 또는
B a) C 말단에서 알콕시기 -OR1을 제거시키고, b) 수득된 하기 화학식 IX의 화합물을 화학식 XII의 프롤린 벤질아미드와 결합시키고, 수득된 하기 화학식 XI의 화합물에서 1) N 말단상의 보호기 Z를 제거시키고, 2) N 말단상의 유리 아미노기를 디메틸화시키고,
수득된 화합물을 그의 염산염으로 전환시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 하기 화학식 I의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl·HCl
Z-Val-Val-MeVal-Pro-OR1
상기 식에서,
R1은 C1-5-알킬이고,
Z는 페닐 고리 상에 치환될 수 있는 벤질옥시카르보닐 보호기이다.
Me2Val-Val-MeVal-Pro-OH
Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH
Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl
A 방법은 하기 반응식에 따라 수행된다.
상기 반응식에서 치환기의 의미는 별도의 언급이 없는 한 하기와 같다:
R1: 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, 펜틸 및 바람직하게는 메틸 및 에틸과 같은 C1-5-알킬,
R2: t-부틸, 2-에틸헥실, 예를 들면, 메톡시, 에톡시, 이소부톡시와 같은 C1-4-알콕시,
Z: 할로겐, C1-4-알킬, C1-4-알콕시, C1-4-아실옥시 또는 니트로에 의해, 특히2-Cl, 3-Cl, 4-Cl, 4-Br, 4-CH3O-, 4-CH3COO-, 2-NO2및 4-NO2에 의해 페닐 고리에 치환 또는 비치환된 벤질옥시카르보닐,
M+: K+, Na+, Li+또는+NH(C2H5)3와 같은 암모늄 이온,
Bzl: 벤질,
Me: 메틸.
화학식 II의 테트라펩티드 에스테르를 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올과 같은 알콜, THF, 디옥산, MTBE와 같은 에테르, 에틸 아세테이트, 빙초산과 같은 에스테르와 같은 적당한 용매 중에 용해시킨다. 적당한 촉매, 예를 들면, Pd/C 또는 Pt/C를 첨가한 후, 0 내지 50 ℃에서, 바람직하게는 10 내지 30 ℃에서 수소를 통과시킨다. 수소의 도입을 대기압하 또는 10 바 이하에서 수행할 수 있다. 일정량의 기체를 배출시킴으로써 반응 속도를 증가시킬 수 있다. 수소 흡수를 종료한 후, 2 내지 5 당량의 포름알데히드를 수용액의 형태, 기체 또는 파라포름알데히드의 형태로 가한다. 이어서, 상기한 조건하에 수소를 통과시킨다. 이어서, 촉매를 여과 제거시킨다. 적당한 용매 또는 용매의 혼합물로부터 염산염으로서 결정화시켜 화학식 IV의 화합물을 정제시킬 수 있으며, 이 용매로는 이소프로판올/메틸 t-부틸 에테르가 적당한 것으로 밝혀졌다. 화학식 IV의 화합물중의 화학식 II의 Z-테트라펩티드 에스테르의 미량을 추출법에 의해 제거시킬 수 있다.
화학식 IV의 에스테르를, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올과 같은 알콜, MTBE, THF, 디옥산과 같은 에테르, 톨루엔, 크실렌과 같은 탄화수소, 또는1,2-디클로로에탄, 염화메틸렌, 클로로포름과 같은 염소화 탄화수소와 같은 적당한 용매 중에서 물을 첨가하거나 첨가하지 않고, NaOH, KOH, LiOH와 같은 적당한 염기를 사용하여 가수분해시킨다. 에스테르 이탈은 산을 사용하여 수행할 수 있다. R1이 t-부틸인 경우, CF3CO2H 및 디옥산 중의 HCl 용액이 특히 적당하다.
이어서, 화학식 I의 펜타펩티드를 제공하기 위하여, 수득된 화학식 V의 테트라펩티드 산을 반드시 화학식 XII의 프롤린 벤질아미드와 결합시켜야 한다. 라세미화는 이와 같은 결합 반응 중에서 용이하게 일어난다. 화학식 V의 테트라펩티드 산을 사용하는 유사한 결합 반응의 경우에 문헌 (G. Pettit 등, J. Am. Chem. Soc. 113, 제6692-6693면, 1991)에서는 결합제로서 DEPC [(OEt)2POCN]을 사용한다. DEPC는 대량으로 사용할 수 없다. 따라서, 이 방법은 독성이 있는 인 및 시안화물 시약을 사용한 추가의 단계를 필요로 한다.
시안화물 함유 페기물은 처리 문제를 야기시킨다. 따라서, 이 방법은 산업적인 용도로 적당하지 않다. 특히 산업적인 규모로 간단하게 수행할 수 있는 펩티드 결합 방법은 혼합 무수물법 (예를 들면, J. Meienhofer, The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Volume 1, Academic Press, Orlando, 1979, 제264-314면을 참조). 이는 예를 들면, 트리에틸아민, N-메틸모르폴린, 디시클로헥실에틸아민, 디이소프로필에틸아민과 같은 3급 아민의 적당한 염기를 사용하여 화학식 V의 산을 화학식 VI로 탈양성자화시킨다. 화학식 IV의 에스테르를 NaOH, KOH, LiOH와 같은 염기를 사용하여 화학식 VI의 염으로 직접 전환시킬 수 있다. 화학식 VI의 화합물을산 염화물 ClCOR2와 반응시켜 화학식 VII의 혼합 무수물을 제공한다. 피발로일 클로라이드 이외에 2-에틸헥산노일 클로라이드, 에틸 클로로포르메이트, 메틸 클로로포르메이트 및 이소부틸 클로로포르메이트와 같은 그 이외의 산 염화물을 사용할 수 있다. 혼합 무수물은 라세미화되기 쉽다 (예를 들면, J. Meienhofer, The Peptides, Volume 1, Academic Press, Orlando, 1979, 제276면 이하 참조).
놀랍게도, 혼합 무수물법에 의해 완전히 라세미화 없이 화학식 V의 트리펩티드 산 V을 반응시킬 수 있었다. 화학식 V의 화합물 및 피발로일 클로라이드로부터 제조된 혼합 무수물을 사용하여 특히 우수한 결과가 수득되었다. 최근에 공개된 결과 (N.L. Benoiton 등, Can. J. Chem. 65, 619-625 (1987))와는 대조적으로 피발로일 클로라이드를 사용한 반응은 클로로포름산 에스테르를 사용한 반응 보다 선택성 및 수율의 면에서 보다 우수한 결과를 제공한다. 화학식 VII의 혼합 무수물의 제조 및 그에 이은 프롤린 벤질아미드의 커플링을 디옥산, NMP, THF, 톨루엔, 염화메틸렌, 디메틸포름아미드와 같은 적당한 용매 중에서 -20 내지 5 ℃에서 수행한다. 화학식 XII의 프롤린 벤질아미드 대신에, 예를 들면, 비술페이트, 메틸술포네이트, 염산염 또는 브롬화수소 산염과 같은 상기 화합물의 적당한 염을 사용할 수도 있다. 이 경우, 예를 들면, 트리메틸아민과 같은 그 이외의 염기 동등물을 가하는 것이 필수적이다. 펩티드 결합 및 추출에 의한 통상적인 조작 후에, 조생성물을 예를 들면, 톨루엔, 크실렌과 같은 탄화수소 또는 디에틸 에테르, THF, 디옥산, 메틸 t-부틸 에테르와 같은 에테르, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 디에틸 케톤, 시클로헥산온과 같은 케톤, 염화메틸렌, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄과 같은 염소화된 용매 중에 용해시킨다. 화학식 I의 염산염을 기체상 HCl을 도입하거나 적당한 용매, 예를 들면, THF, 메탄올, 이소프로판올, n-펜탄올, 디이소프로필 에테르와 같은 적당한 용매 중에서 HCl의 용액으로 계량하여 침전시킨다. 특히 적당한 방법은 펜타펩티드의 유리 염기를 초기에 메틸 에틸 케톤 중에 용해시키고, 이어서, 이소프로판올 중의 HCl 용액을 가한다.
B 방법은 하기 반응식에 따라 수행한다.
화학식 II의 에스테르의 가수분해, 화학식 X의 혼합 무수물과 펩티드 결합으로 화학식 XI의 화합물을 제공하는 방법은 화학식 IV→화학식 V→화학식 VI→화학식 VII→화학식 I의 순서로 수행된다. Z 보호기를 제거시키고, 디메틸화시켜 화학식 I의 화합물을 제공하는 것은 화학식 II→화학식 III→화학식 IV의 전환으로서 수행된다.
혼합 무수물법은 또한 놀랍게도 B 방법에서 라세미화 없이 수행된다. 베노이톤 (Benoiton)에 의해 개시된 결과와는 대조적으로, 화학식 IX의 산 및 피발로일클로라이드로부터 제조된 혼합 무수물을 사용하여 최적 결과가 수득된다.
펩티드 I을 제조하기 위해 요구되는 화학식 II의 출발 물질은 하기 화학식 XIII의 화합물 및 하기 화학식 XIV의 화합물로부터 제조할 수 있다.
Z-Val-O-CO-R2
Val-MeVal-Pro-OR1
신규 방법은 결정 형태로 화학식 I의 활성 물질을 제공한다. 펩티드는 재결정화에 의해 추가로 간단히 정제할 수 있다. 정교한 크로마토그래피 정제 단계는 필요하지 않다.
본 발명은 또한 화학식 I의 화합물을 제조하기 위한 하기 화학식 II, 화학식 III, 화학식 VII, 화학식 IX의 전구체에 관한 것이다.
〈화학식 II〉
Z-Val-Val-MeVal-Pro-OR1
Val-Val-MeVal-Pro-OR1
Me2Val-Val-MeVal-Pro-O-CO-R2
〈화학식 IX〉
Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH
Z-Val-Val-MeVal-Pro-O-CO-R2
〈화학식 XI〉
Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl
상기 식에서,
R1및 Z는 제3항에 정의된 바와 동일한 의미를 갖고,
R2는 t-부틸, 2-에틸헥실, C1-4-알콕시, 메톡시, 에톡시 및 이소부톡시이다.
화학식 I의 화합물은 솔리드 종양 (폐, 유방, 장관, 방광, 직장, 자궁, 전립선의 종양), 백혈병, 림프종 및 그밖의 종양성 장애에 대한 활성을 갖는다.
하기 실시예는 본 발명을 예시한다.
〈실시예 1〉 (방법A)
A. 출발 물질의 제조
a. Z-Val-Val-MeVal-Pro-OMe (화학식 II, R1=Me)
메탄올 320ℓ중의 하기 화학식 VIII의 화합물 39.6 kg (83.8몰)을 5% 팔라듐/탄소 4 kg과 함께 400ℓ 수소화 용기에 도입하였다.
Z-Val-MeVal-Pro-OMe
이어서, 20 내지 30 ℃로 냉각시키면서, 전구체가 반응 용액에서 검출되지 않을 때까지 수소를 통과시켰다. 용기의 내용물을 방출하면서 촉매를 여과시켰다. 여과액을 수펌프 진공하에서 400ℓ의 에나멜을 입힌 용기에서 50ℓ로 농축하여 처리하였다. 이어서, 톨루엔 50ℓ을 부가하고, 혼합물을 2N HCl 40ℓ로 추출하였다. 톨루엔 상을 1N 염산 40ℓ로 1 회 이상 추출한 후, 방출하였다. 수집된 산성 수용액 상을 용기로 회수하고, 염화메틸렌 40ℓ를 첨가한 후 격렬하게 교반하고 냉각시키면서 50% 농도의 수산화나트륨 용액에서 처리하여 pH 9로 조정하였다. 상 분리후, 염화메틸렌 상을 방출하고 수용액 상을 매회 40ℓ 염화메틸렌으로 2회 추출하였다. 생성물의 수집된 염화메틸렌 용액을 중성이 될 때까지 수세하였다. 이어서, 염화메틸렌 상을 90ℓ로 농축하여 Val-MeVal-Pro-OMe (화학식 XIV, R1은 CH3임)을 수득하였다.
수율: 24.2 kg = 85.2 %
Z-발린 17.84 kg (70.88몰) 및 트리에틸아민 4.59 kg (74.42몰)을 400ℓ 용기에서 염화메틸렌 170ℓ에 용해시켰다. 피발로일 클로라이드 8.58 kg (70.88몰)을 -5 내지 -10 ℃에서 상기 용액에 계량하여 첨가하였다. -5 ℃에서 2시간의 반응 시간 경과 후 염화메틸렌 86ℓ중의 Val-MeVal-Pro-OMe 24.2 kg 용액을 -5 ℃에서 부가하였다. -5 ℃에서 2시간 경과후, 혼합물을 20 ℃로 가열하고, 동온에서 12 시간 동안 교반하였다. 처리 후, 물 50ℓ을 첨가하고, 수용액 상을 제거한 후, 유기 상을 매회 2N 염산 40ℓ로 1회, 2N 수산화나트륨 40ℓ로 2회 추출하였다. 유기 상을 수세하여 중화시키고, 염화메틸렌 용매를 증류시켜 제거하고 디이소프로필 에테르 300ℓ로 대체하였다. 유성 생성물의 에멀젼을 60 ℃로 가열하고, 종자 결정을 첨가하고, 60 ℃에서 7시간 동안 유지시켜 생성물을 결정화하였다. 50 ℃에서 5시간 동안, 이어서, 40 ℃에서 5시간 동안 연속 교반한 후, 20 ℃로 냉각시켜 결정화를 완료하였다. 120ℓ 압력 필터를 통과시켜 결정을 여과하고, 질소 기류 중에서 건조시켰다.
수율: 32.2 kg = 79 %
융점: 134 내지 135 ℃
b. 프롤린 벤질아미드 히드로클로라이드 (XII x HCl)
피발로일 클로라이드 48.2 g을 -10 내지 -15 ℃에서 CH2Cl21ℓ중의 Z-프롤린 99.7 g 및 트리에틸아민 58 ml의 용액에 적가하였다. 혼합물을 -10 ℃에서 45분간 교반하고, 이어서 0.5시간에 걸쳐 CH2Cl2500 ml 중의 벤질아민 42.8 g을 -10 ℃에서 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 이어서, CH2Cl2용액을 물 500 ml으로 2회, 10% 농도의 NaHCO3수용액 500 ml으로 2회, 물 500 ml으로 2회, 5% 농도의 시트르산 수용액 500 ml으로 2회, 물 500 ml으로 2회 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 증발시켰다. 잔류물 120 g을 에틸 아세테이트 200 ml에 흡수시켰다. n-헵탄 1.2ℓ을 용액에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 생성물을 흡인 여과시키고, 50 ℃, 감압하에서 건조시켰다.
수율: 110 g, 81.3%
융점: 93 내지 94 ℃
이와 같이 수득된 Z-프롤린 벤질아미드 110 g을 메탄올 1.5ℓ에 용해시켰다. Pd/C (10%) 0.5 g을 첨가한 후 수소를 통과시켰다. 용액은 1.5 시간 동안 상온에서 H20.5ℓ를 흡수하였다. 여과 및 증발시켜 촉매를 제거한 후, 황색 오일 4.6 g이 잔류하였다.
이와 같이 수득된 프롤린 벤질아미드 413 g을 이소프로판올 400 ml에 용해시켰다. 이소프로판올 중의 HCl 포화 용액 630 ml을 첨가하고, 수득된 현탁액을 0 내지 5 ℃에서 2시간 동안 교반하고, 고체를 흡인 여과하고, 이소프로판올 250 ml으로 2회 세척하였다. 잔류물을 50 ℃, 감압하에서 건조하여 프롤린 벤질아미드 히드로클로라이드 (αD 20:-45 °) 401 g을 수득하였다.
B. 최종 생성물의 제조
a. 1
Me2Val-Val-MeVal-Pro-OMe x HCl (하기 화학식 IV의 화합물 x HCl, R1=Me)
Me2Val-Val-MeVal-Pro-OMe
Z-Val-Val-MeVal-Pro-OMe (화학식 II, R1=Me) 20 kg (34.8몰)을 메탄올 200ℓ중의 5% 팔라듐/탄소 2 kg과 함께 400ℓ 수소화 용기에 도입하였다. 냉각시키면서, 전구체가 반응 용액에서 검출되지 않을 때까지 20 ℃에서 수소를 통과시켰다. 이어서, 37% 농도의 포름알데히드 수용액 8.46 kg (104몰)을 첨가하고, 수소 흡수가 종료될 때까지 20 ℃에서 계속 수소화시켰다. 용기의 내용물을 방출하면서 촉매를 여과시켰다. 여과액을 처리하여 수펌프 진공하에서 400ℓ에나멜을 입힌 용기에서 50ℓ로 농축하여 처리하였다. 이어서, 이소프로판올 200ℓ을 부가하고 혼합물을 50ℓ가 되도록 다시 농축하였다. 잔류물을 메틸 t-부틸 에테르 135ℓ에 용해시키고, 20 ℃로 냉각시키면서 이소프로판올산 HCl 1당량을 첨가하였다. 수득된 현탁액을 20 ℃에서 3 내지 4시간, 0 내지 5 ℃에서 2시간 더 교반하고, 120ℓ 압력 필터를 통해 여과시켰다. 필터 케이크를 신선한 메틸 t-부틸 에테르 50ℓ로 1회 세척하였다.
수율: 16.2 kg = 92.3 %
융점: 224 ℃(분해)
a.2
제 1 수소화 단계 후 하기와 같이 처리하여 중간체 Val-Val-MeVal-Pro-OMe (화학식 III, R1= CH3)를 분리할 수 있었다:
반응 용액을 촉매로부터 분리하고 농축하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트에 흡수시켰다. 에틸 아세테이트 용액을 2N 염산으로 2회 추출하였다. 산성 수용액 상을 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH 9로 조절하고, 염화메틸렌으로 2회 추출하였다. 염화메틸렌 상을 중성이 될 때까지 세척하고 증발시켰다.
HPLC 96.8%
1H-NMR (400 MHz, CDCl3/TMSint.):
δ(ppm) : 0.84 - 1.08 (m, 18H); 1.45 - 1.6 (S, 넓음, NH2); 1.85 - 2.15 (m, 4H); 2.18 - 2.38 (m, 3H); 3.15 (s , N-CH3); 3.25 (d, 1H); 3.65 - 3.75 (m, 1H); 3.73 (s, O-CH3); 3.9 - 4.05 (m, 1H); 4.38 - 4.45(m, 1H); 4.73 - 4.83 (m, 1H); 5.12 (d, 1H); 7.9 (d, NH)
a.3
Me2Val-Val-MeVal-Pro-OMe x HCl (화학식 IV x HCl, R1=Me)를 중간체 Z-Val-Val-MeVal-Pro-OMe(화학식 II, R1=Me)의 분리 및 정제 없이 하기 방법으로 제조할 수 있다:
Z-발린 128 g (0.51몰) 및 트리에틸아민 55.1 g (0.54몰)을 4ℓ 플라스크에서 염화메틸렌 1.2ℓ에 용해시켰다. 피발로일 클로라이드 62.1 g(0.51몰)을 -5 내지 -10 ℃에서 상기 용액에 첨가하였다. -5 ℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 염화메틸렌 0.8ℓ 중의 Val-MeVal-Pro-OMe 174.6 g(0.51몰) 용액을 부가하고, 혼합물을 -5 ℃에서 2시간 동안 더 교반하고, 이어서, 20 ℃로 가온한 후, 12시간 동안 더 교반하였다. 이어서, 물 370 ml를 혼합물에 첨가하였다. 상 분리후, 염화메틸렌 상을 2N 염산 290 ml으로 1회, 2N 수산화 나트륨 용액 매회 290 ml으로 2회, 물 370 ml으로 3회 세척하였다. 이어서, 염화메틸렌 용매를 증발시키고 메탄올 3ℓ로 대체하였다. 상기 용액에 물 110 ml 중의 5% 팔라듐/탄소 30 g의 현탁액을 첨가하고, 기체-도입 교반기 및 수소 뷰렛을 사용하여 25 ℃에서 수소 1 당량이 흡수될 때까지 수소화하였다. 이어서, 37% 농도의 포름알데히드 수용액 123 g(1.53몰)을 첨가하고, 수소 2당량이 더 흡수될 때까지 계속 수소화하였다. 이어서, 촉매를 제거하고 회전 증발기에서 용액을 증발시켰다. 잔류 오일을 이소프로판올 670 ml 및 메틸 t-부틸 에테르 2.6ℓ에 용해시켰다. 이소프로판올산 HCl 1당량을 상기 용액에 첨가하였다. 수득된 현탁액을 20 ℃에서 12시간 동안 교반하고 흡인 여과시켰다. 필터 케이크를 메틸 t-부틸 에테르 소량으로 세척하고, 이어서, 진공 오븐에서 40 ℃로 건조하였다.
수율: 182.8 g = 71%
융점: 224 ℃ (분해)
b. Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl x HCl (화학식 I)
Me2Val-Val-MeVal-Pro-OMe x HCl (화학식 IV x HCl, R1=CH3) 15.9 kg (31.5몰)을 톨루엔 140ℓ 및 메탄올 15ℓ와 함께 400ℓ 용기에 도입하였다. 여기에, 수산화 나트륨 펠렛 3.15 kg(76.38몰)을 첨가하였다. 가수분해가 완료된 후, 즉 20 ℃에서 3시간 후 이소프로판올산 HCl을 첨가하여 혼합물을 중화시켰다. 알코올과 물이 없어질 때까지 수득물을 100mbar에서 톨루엔으로 공비 증류시켰다. 증류된 용매를 계속 톨루엔으로 교체하였다. 이어서, 염화메틸렌 80ℓ 및 트리에틸아민(순도 99%) 6.44 kg (63.0몰)을 첨가하고, 혼합물을 -5 ℃로 냉각시키고, 동온에서 피발로일 클로라이드 3.84 kg (31.5몰)을 계량하여 첨가하였다. 2시간 동안 반응시킨 후, Pro- NHBzl x HCl 7.6 kg (31.5몰)을 한번에 소량씩 -5 내지 0 ℃에서 첨가하였다. 혼합물을 -5 ℃에서 2시간 동안 정치시킨 후, 20 ℃로 가온하고 6시간 동안 더 반응하도록 방치시켰다. 이어서, 첨가된 염화메틸렌을 500 mbar하에서 증류시켜 제거하고, 톨루엔 80ℓ을 첨가하였다. 물 50ℓ을 첨가하고 수용액 상의 pH를 9로 조정하였다. 격렬히 교반한 후, 수용액 상을 분리하고, 유기 상을 물 25ℓ로 1회 세척하였다. 유기 상을 매회 2N 염산 50ℓ로 2회 추출하였다. 매회 염화메틸렌 50ℓ로 3회 추출하여 pH를 9로 조정한 후 생성물을 산성 수용액 상으로부터 역추출하였다. 염화메틸렌 상을 물로 세척하여 중화시킨 후, 염화메틸렌을 증류시켜 제거하고 메틸 에틸 케톤 180ℓ로 대체하였다. 용액을 40 ℃로 가온하고, 이소프로판올산 HCl 1당량(31.5몰)을 첨가하였다. 수득된 현탁액을 60 ℃로 가온하고, 더 이상의 가열 없이 12시간 동안 교반하였다. 이어서, 20 ℃로 냉각시키고 5시간 동안 더 교반하였다. 이어서, 5 ℃로 냉각시키고 120ℓ 압력 필터를 통해 여과시켰다. 필터 케이크를 5 ℃에서 순수한 메틸 에틸 케톤 60ℓ로 세척하였다. 필터 상에서 초기 건조 후, 생성물을 40 ℃ 진공 오븐에서 일정 중량으로 건조시킨다.
수율: 14.36 kg = 67%
융점: 214 ℃ (분해)
〈실시예 2〉 (방법B)
a. Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH(화학식 IX)
Z-Val-Val-Meval-Pro-OMe(화학식 II, R1=Me, 실시예 1Aa) 117g(0.2몰)을 2ℓ 플라스크에서 메탄올 900 ml 및 물 47.5 ml에 용해시킨다. 이어서, 수산화 나트륨 펠렛 18 g(0.45몰)을 첨가하고, 혼합물을 12시간 동안 20 ℃에서 교반하였다. 처리를 위해, 물 250 ml을 첨가하고 메탄올을 증류하였다. 이어서, 충분한 에틸 아세테이트를 첨가하여 투명상 (약 500 ml)을 분리하였다. 에틸 아세테이트 상을 분리하였다. 수용액 상을 염산을 이용하여 pH 1로 산성화시키고, 염화메틸렌 500 ml으로 2회 추출하였다. 이어서, 유기 상을 증발시켜 건조시켰다.
수율: 105 g = 96.4 %
1H-NMR (200MHz, CDCl3/TMSint.)
δ (ppm): 0.6 - 1.2 (m, 18H); 1.7 - 2.45 (m, 7H); 3.2(s, N-CH3); 3.55 - 3.95 (m, 2H); 4.05 - 4.2 (m, 1H); 4.35 - 4.5(m, 1H); 4.68 - 4.85 (m, 1H); 4.98 - 5.2 (m, 3H); 5.93(d, Val-1NH); 7.2 - 7.4 (m, 5H); 7.53 - 7.68(Val-2NH); 9.6 - 10.2 (s, 넓음, COOH)
b. Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl (화학식 XI)
Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH (화학식 IX) 5 g (8.75밀리몰)을 CH2Cl250 ml에 용해시키고, 트리에틸아민 1.79 g (17.5밀리몰)을 적가하고, 혼합물을 10 ℃로 냉각시키고, 동온에서 피발로일 클로라이드 1.08 g (8.75밀리몰)을 적가하였다. 10 ℃에서 2시간 교반한 후, 메탄올 10 ml중의 Pro-NHBzl x HCl 2.11 g (8.75밀리몰) 용액을 동온에서 적가하고, 혼합물을 10 ℃에서 2시간 교반하고, 상온에서 밤새 교반하였다.
반응 혼합물을 매회 물 50 ml으로 3회, pH 9에서 물 50 ml으로 1회, 매회 물 50 ml으로 2회 세척하였다. 염화메틸렌 용액을 회전 증발기에서 증발시켜 백색 결정질 생성물 5.3 g (81.4%) (순도: 88.7%)을 수득하였다.
융점: 118 내지 122 ℃
c. Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl x HCl (화학식 I)
Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl (화학식 XI) 12 g을 메탄올 200 ml에 용해시켰다. 이 용액에 5% 팔라듐/탄소(물 200 ml에 현탁됨) 2 g을 첨가하고, 수소 흡수가 중지될 때까지 20 ℃에서 수소화시켰다. 이어서, 37% 농도의 포름알데히드 수용액 6.5 g을 첨가하고, 수소 흡수가 중지될 때까지 계속 수소화시켰다. 이어서, 촉매를 분리하고, 반응 용액을 증발시켰다. 잔류물을 톨루엔에 흡수시키고, 재농축시키고, 톨루엔 200 ml를 더 첨가하고 혼합물을 여과시켰다. 이어서, 톨루엔 용액을 2N 염산 50 ml으로 2회 추출하였다. 산성 수용액 상을 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH 9로 조절하고 염화메틸렌 50 ml으로 3회 추출하였다. 염화메틸렌 상을 중성이 될 때까지 물로 세척하고 농축하였다. 조 염기를 메틸 에틸 케톤 150 ml 및 이소프로판올 7.5 ml 용액에 흡수시켰다. 40 ℃에서 25% 농도의 이소프로판올산 HCl 4 g을 첨가하여 생성물 염을 상기 용액으로부터 침전시켰다. 현탁액을 20 ℃에서 3시간 동안, 0 내지 5 ℃에서 1시간 동안 교반한 후, 흡인 여과시켰다.
수율: 7.1 g
순도: 99.1 % (HPLC 백분율 면적)
융점: 214 ℃ (분해)

Claims (5)

  1. 하기 화학식 I의 화합물.
    〈화학식 I〉
    Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl·HCl
  2. 결정 형태의 하기 화학식 I의 화합물.
    〈화학식 I〉
    Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl·HCl
  3. 하기 화학식 II의 화합물에서
    A a) N 말단상의 보호기 Z를 제거시키고, 수득된 화합물에서 1) N 말단 상의 유리 아미노기를 디메틸화시키고, 2) C 말단상의 알콕시기 -OR1를 가수분해시키고, b) 수득된 하기 화학식 V의 화합물을 프롤린 벤질아미드와 결합시키거나, 또는
    B a) C 말단상의 알콕시기 -OR1을 제거시키고, b) 수득된 하기 화학식 IX의 화합물을 프롤린 벤질아미드와 결합시키고, 수득된 하기 화학식 XI의 화합물에서 1) N 말단상의 보호기 Z를 제거시키고, 2) N 말단상의 유리 아미노기를 디메틸화시키고,
    수득된 화합물을 그의 염산염으로 전환시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 하기 화학식 I의 화합물의 제조 방법.
    〈화학식 I〉
    Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl·HCl
    〈화학식 II〉
    Z-Val-Val-MeVal-Pro-OR1
    〈화학식 V〉
    Me2Val-Val-MeVal-Pro-OH
    〈화학식 IX〉
    Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH
    〈화학식 XI〉
    Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl
    상기 식에서,
    R1은 C1-5-알킬이고,
    Z는 페닐 고리 상에 치환될 수 있는 벤질옥시카르보닐 보호기이다.
  4. 제3항에 있어서, 화학식 V 및 화학식 IX의 테트라펩티드카르복실산을, 프롤린 벤질아미드와 결합시키기 위하여 초기에 피발산과의 혼합 무수물로 전환시키는방법.
  5. 제1항에 정의된 화학식 I의 화합물을 제조하기 위한 하기 화학식 II, 화학식 III, 화학식 VII, 화학식 IX, 화학식 X, 화학식 XI의 전구체.
    〈화학식 II〉
    Z-Val-Val-MeVal-Pro-OR1
    〈화학식 III〉
    Val-Val-MeVal-Pro-OR1
    〈화학식 VII〉
    Me2Val-Val-MeVal-Pro-O-CO-R2
    〈화학식 IX〉
    Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH
    〈화학식 X〉
    Z-Val-Val-MeVal-Pro-O-CO-R2
    〈화학식 XI〉
    Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl
    상기 식에서,
    R1및 Z는 제3항에 정의된 바와 동일한 의미이고,
    R2는 t-부틸, 2-에틸헥실, C1-4-알콕시, 메톡시, 에톡시 또는 이소부톡시이다.
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