KR100334695B1 - 표적화된 촉매 단백질에 의해 활성화되는 선구 약제 - Google Patents

표적화된 촉매 단백질에 의해 활성화되는 선구 약제 Download PDF

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켄튼존헨리
본보어스텔레이드
케서데이잔엠.
카미레디볼레디
마아틴마아크티.
마세이리차아드제이.
네퍼어앤드류디이.
심프슨데이빗엠.
스미스로저지이.
티트마스리차아드시이.
윌리엄즈리차아드오우.
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리차아드제이마세이
이겐인코포레이팃드
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Abstract

효소 및 촉매 항체와 같은 촉매 단백질에 의해 활성화되는 선구 약제가 기재되어 있고 특허 청구되어 있다. 본 발명은 선구 약제를 활성화시키기 위한 촉매 항체를 유도하기 위한 선구 약제, 및 합텐을 포함한다. 선구 약제는 세포독성 화학 용법제, 예컨대 항암제로서 유용하다.

Description

표적화된 촉매 단백질에 의해 활성화되는 선구 약제{PRODRUGS ACTIVATED BY TARGETED CATALYTIC PROTEINS}
관련 출원
본 출원은 1991. 10. 10. 에 출원된 미합중국 출원 일련 번호 제 07/773,042 호의 일부 계속 출원이다. 본 출원은 또한 1991. 8. 5. 에 출원된 미합중국 출원 일련 번호 제 740,501 호의 일부 계속 출원이다. 본 출원은 또한 1988. 5. 4에 출원된 미합중국 출원 일련 번호 제 190,271 호의 일부 계속 출원, 1989. 5. 4. 에 출원된 PCT/US 89/01951 호의 일부 계속 출원, 1991. 6. 12. 에 출원된 미합중국 출원 일련 번호 제 700,210 호의 일부 계속 출원, 1989. 5. 4. 에 출원된 PCT/US 89/01950 호의 일부 계속 출원, 1991. 11. 4. 에 출원된 미합중국 출원 일련 번호 제 07/761,868 호의 일부 계속 출원, 및 1990. 3. 23. 에 출원된 미합중국 출원 일련 번호 제 498,225 호의 일부 계속 출원이며; 이들 각각의 선행 출원은 본 명세서에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 효소 또는 촉매 항체에 의해 활성화되는 세포독성제의 적합한 선구 약제를 제공하기 위한 방법 및 화합물을 제공한다.
발명의 배경
항비루스성, 면역억제성 및 세포독성 암 화학 치료제와 같은 많은 제약학적 화합물은 일반적으로 보통 조직에 바람직하지 않은 독성 효과를 갖는다. 골수에 대한 손상(혈액 세포 생성에 나타나는 손상과 함께) 및 위장 점막에 대한 손상, 원형 탈모증, 및 오심을 포함하는 상기 효과는 안전하게 투여될 수 있는 제약학적 화합물의 투여량을 제한하여 가능한 효능을 감소시킨다.
항신생물제의 선구 약제
a. 누클레오시드 유사체
플루오로우라실, 플루오로데옥시우리딘, 플루오로우리딘, 아라비노실시토신, 메르캅토푸린 리보시드, 티오구아노신, 아라비노실 플루오로우라실, 아자우리딘, 아자시티딘, 플루오로시티딘, 플루오로아라빈을 포함하는 다수의 누클레오시드 유사체가 함암제로서 유용성을 갖는다. 상기 약제는 일반적으로 중요한 누클레오티드의 생합성을 저해하거나, 또는 핵산으로 혼입되어 결함 RNA 또는 DNA 를 결과시키는 누클레오티드 유사체로의 전환에 의해 작용한다.
5-플루오로우라실은 결장 및 직장, 머리 및 목, 간, 유방, 및 췌장의 암과 같은 다양한 충실성 종양에 이상학적 활성을 갖는 주요 항신생물제이다. 5-FU 는낮은 치료 지수를 갖는다. 투여되는 투여량 크기는 독성에 의해 제한되어 종양 세포 근처에서 보다 높은 농도에 이르면 얻어질 가능한 효능을 감소시킨다.
5-FU 는 이의 가능한 세포 독성을 나타내기 위해 누클레오티드(예, 플루오로우리딘 -또는 플루오로데옥시우라딘-5'-포스페이트) 수준으로 동화되어야 한다. 이들 누클레오티드(5-플루오로우리딘 및 5-플루오로-2'-데옥시우리딘)에 해당하는 누클레오시드 또한 활성 항신생물제이며, 몇몇 모델 시스템에서는 5-FU 보다 실질적으로 더 유효한데, 아마도 이들이 5-FU 보다 더 쉽게 누클레오티드로 전환되기 때문일 것이다.
아라비노실시토신, 1-β-D-아라비노 푸라노실시토신, 시타라빈, 시토신-β-D-아라비노푸라노시드 및 β-시토신 아라비노시드로도 칭하는 AraC 는 몇몇 주요 단점(하기 참조)에도 불구하고 항암제로 널리 사용된다. 현재 AraC 는 골수성 및 임파성 백혈병, 및 비-호치킨성 임파종 모두를 치료하기 위해 사용된다. 단독으로 사용되면 이는 급성 백혈병의 20-40% 차도를 나타냈고, 다른 화학요법제와 조합되면 50% 이상의 차도를 나타냈다(Calabresi 일동, "In The Pharmacological Basis of Therapeutics", Eds. Gilman, A. G. 일동, 뉴욕 : Macmillian Publishing Company, (1984) : 1272).
암 약품으로서의 AraC 의 단점 중 하나는 탈아미노효소에 의한 그 신속한 이화 작용이다. 사람의 간은 AraC 를 Ara-우라실인 불활성 대사물로 전환시키는 다량의 데옥시시티딘 탈아미노 효소를 함유한다. 이 신속한 이화 작용은 비경구 투여 후 사람에 있어서 3-9 분의 t1/2을 결과시킨다 (Baguley 일동, Cancer Chemoherapy Reports 55 (1971) : 291-298). 이 문제를 조합하면, DNA 합성을 겪는 세포만이 약물 효과에 영향을 받으므로, 비동시적으로 성장하는 종양의 모든 세포가 S-상을 통과할 때까지 독성 농도를 유지해야 한다. 불행하게도, 이는 AraC 의 최적 투여량 계획표가 5 일 마다 장시간에 걸쳐 느린 정맥내 주입을 포함하므로 병원 입원을 요함을 뜻한다. 연장된 적용은 신속히 분할하는 보통 세포들 간에 주요한 일반적 독성 문제를 결과시키며, 골수 억압, 감염, 및 출혈을 결과시킨다. 이 약제를 사용할 때 당면하는 다른 문제점은, 아마도 낮은 키나제 활성을 갖는 세포에 의한 채택 또는 데옥시 CTP 의 확대된 푸울(pool)로 인하여, 결국 세포에 의해 전개되는 AraC 에 대한 저항성이다.
AraC 의 선구약제 유도체는 : 1) 시티딘 탈아미노 효소에 의한 신속한 분해로 부터 AraC 를 보호하고; 2) AraC 의 분자 저장소로 작용하여 약제 투여량 계획을 간단하게 하고; 3) 혈청 단백질 상의 이동을 위한 운반 분자로 작용하고 세포 흡수를 용이하게 하고; 또는 4) 낮은 키나제 활성을 갖는 세포의 저항성을 극복하기 위해 합성되었다. 아라비노스의 5' 위치 또는 시티딘 고리의 N4-위치에 치환된 AraC 유도체는 시티딘 탈아미노 효소-저항성인 것으로 밝혀졌다. 시티딘 탈아미노효소에 의한 분해로 부터 AraC 를 보호하는 운반 분지를 작용하므로, AraC 친지방성 5'-에스테르 유도체 (Neil 일동, Biochem. Pharmacol. 21(1971) : 465-475; Gish 일동, J. Med. Chem. 14(1971) : 1159-1162) 및 N4-아실 유도체(Aoshima 일동, Cancer Res. 36(1976) : 2726-2732)는 백혈병 생쥐에 있어서 AraC 보다 높은 항암 활성을 갖는 것으로 나타났다.
상기 선구 약제 유도체 모두는 모 약제가 투여되는 것과 같이 전신으로 투여되도록 고안되어 있다. 비 종양-특이적 독성으로 부터 나오는 선구 약제의 부작용은 선구 약제 Ara-C 의 전신 투여의 경우와 동일하지는 않더라도 매우 유사하다. 이들 선구약제는 아마도 Ara-C 의 분자 저장소로 작용하므로써, 약제 적용 가능 시간을 연장시키는 것 같다.
다른 항신생물 누클레오시드 유사체의 몇몇 선구 약제가 또한 공지되어 있다. 상기 선구 약제는 일반적으로 누클레오시드 유사체의 아실 유도체이며; 아실기는 투여 후 내생 에스테라제 활성에 의해 제거된다. 이들 아라비노실 시토신{Neil 일동, Cancer Research 30(1970) : 1047-1054 : Neil 일동, biochem Parmacol. 20(1971) : 3295-3308; Gish 일동, J. Med. Chem. 14 (1971) : 1159-1162; Aoshima 일동, Cancer Research 36(1976) : 2762-2732} 또는 플루오로데옥시우리딘{Schwendener 일동, Biochem. Biophys. Res, comm. 126(1985) : 660-666}의 선구 약제 중 몇몇은 모 약제의 투여 후 일어나는 것 보다 장시간 동안 활성 약제를 제공한다.
그러나, 상기 선구 약제는 선택적으로 약제를 종양 조직으로 수송하지 않으며; 증가된 독성이 종종 증가된 항암 효능에 수반된다 (Schwendener 일동, Biochem. Biophy. Res. Comm. 126(1985) : 660-666).
5FU 및 Ara-C 와 같이, 투여되는 다른 항신생물 누클레오시드 유사체 (플루오로우라실 아라비노시드, 메르캅토푸린 리보시드, 아라비노실 아데닌, 또는 플루오로데옥시우리딘을 포함하나 이에 제한되지 않음) 또는 이들의 선구 약제의 투여량의 크기는 독성에 의해 제한되며, 암세포 근처에서 보다 고농도가 달성되는 경우 얻게될 가능한 효능을 감소시킨다.
항신생물 누클레오시드 유사체의 표적된 선구 약제에 대한 선행 제시들은 만족스럽지 않다. Bagshawe 일동, 특허 출원 WO 88/07378 은 항신생물 누클레오시드의 해당 누클레오티드는 적당한 효소에 의하여 누클레오시드로 다시 전환될 수 있음을 제안하였고; Senter 일동의 특허 출원 EP 88112645 은 유사하게 종양 세포 표면 항원에 결합하는 항체에 접합된 효소 알칼리성 포스파타제에 의해 활성화되는 플루오로우리딘 모노포스페이트의 사용을 제시하였다. 이들 제안은 혈액 및 조직에서 누클레오티드를 누클레오시드로 전환하는 효소(예, 5' 누클레오티다제)의 높은, 그리고 편재적인 활성을 고려하지 않았다. 그러므로 누클레오티드(누클레오시드 포스페이트)는 항신생물 누클레오시드 유사체의 표적 수송에 유용하지 않다.
b. 알킬화제
질소 머스타드 알킬화제는 항신생물 약제의 중요한 부류이다. 임상학적 유용성을 갖는 항신생물 알킬화제의 예는 시클로포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 또는 메클로레타민이다. 이들 약품은 일반적인 구조적 특징으로서 알킬화할 수 있는 질소 상의 비스-(2-클로로에틸) 기를 공유하여 핵산, 단백질, 또는 다른 중요한 세포 구조를 손상시킨다. 알킬화제의 세포 독성 활성은 핵산 합성에 영향을 미치는 항대사물의 경우보다 그 표적의 세포 주기 위상에 덜 좌우된다. 이러한 이유로, 알킬화제의 세포 독성은 보통 조직에 비해 신속히 분할되는 세포(예, 많은 암종양)에 대해 덜 선택적이나, 다른 한편 그 세포 주기에서 일치하지 않는 세포 집단에 대해 보다 철저히 효과적이다.
질소 머스타드 화합물의 표적 선구 약제를 고안하는 선행 시도는 성공적이지 않았다. Bagshawe 일동, 특허 출원 WO 88/078378 은 해당 활성화된 약제 보다 독성에 있어 단지 5-10 배 낮은 선구 약제로서 벤조산 질소 머스타드 글루타미드를 공개하였는데; 이들 저자 자신들은 임상학적 용도를 위해 선구 약제는 약제 보다 적어도 100 배 낮은 독성을 가져야 한다고 말한다.
Kerr 일동, Cancer Immunol. Immunother. 31(1990) : 202-206 은 효소 페니실린-V-아미다제(PVA)로써 활성화되는 가능한 선구 약제로서 멜팔란-N-P-히드록시페녹시아세트아미드(멜팔란의 아미드 유도체)를 공개하였다. 이 선구 약제는 배양 중인 특정 세포계에 대하여 멜팔란 보다 100 배 이상 덜 독성이나, PVA 가 선구 약제의 페녹시아세트아미드 결합을 너무 느리게 가수 분해하여 독성 수준의 약제를 생성할 수 없으므로, 세포를 항체-PVA 접합체로 예비처리하는 것은 선구 약제의 독성을 증가시키지 못했다.
c. 다른 항신생물제
안트라시클린, 다우노루비신, 및 독소루비신은 약제의 치료 및 독성 효과에 기여하는 많은 생화학적 효과를 행사하는 널리 사용되는 항암제이다. 약제의 주요 메카니즘 중 하나는 분할 세포에 DNA 를 삽입하여 유전자 복제를 파괴하는 것이다. 독소루비신은 급성 백혈병 및 악성 임파종에 효과적이다. 시클로포스파미드 및 시스플라틴과 함께, 독소루비신은 난소암에 대항하는 상당한 활성을 갖는다. 이는 골육종, 유방의 전이선암, 방광암, 신경아세포종 및 전이 갑상선암의 치료에 효과적으로 사용되었다. 독소루비신의 심근 독성은 환자가 수용할 수 있는 약제의 투여량을 제한한다.
촉매 단백질
a. 효소
선행 기술은 종양 부위에서 선구 약제를 선택적으로 활성화시키기 위해 표적 항체에 접합되는 비-포유동물 효소의 사용을 나타낸다 {예, Bagshawe 일동, 특허 출원 WO 88/078378에 기재된 카르복시펩타다제; Kerr 일동, Cancer Immunol. Immunother., 31(1990) : 202-6에 기재된 페니실린-V 아미다제; 및 Eaton 일동 특허 출원 EP 90303681. 2에 기재된 β-락타마제}. 비-포유동물 효소는 일반적으로 항원성일 것이며, 따라서 중화 항체의 형성 또는 바람직하지 않은 면역 반응의 유도로 인하여 단기간의 사용에만, 또는 아마도 일회의 사용에만 유용할 것이다.
포유 동물 효소, 예 알칼리성 포스파타제(Senter 일동, 특허 출원 EP 88112646)가 제안된 경우, 선구 약제를 활성화시키는 내생 사람 효소의 문제점을 제거하기 위한 아무런 제안이 이루어지지 않았다. 서로 다른 종의 포유 동물들로 부터의 효소는 또한 항원성으로 인한 문제점을 나타낼 것이다. 또한, 몇몇 선구 약제 활성화 효소, 예, 뉴라미니다제(Senter 일동, 특허 출원 EP 88/112646)는 이들이 투여되는 유기체에 심각한 손상을 유발할 수 있는데; 뉴라미니다제는 당단백질 상의 과당류 말단에 있는 시알산 잔기(예를 들어 적혈구막의 중요한 성분)를 제거하며 간에서 신속한 분해를 위해 상기 당단백질을 가로막는 갈락토스 잔기를 노출시킨다. 사람에게 사용하기에 적합한 구체예에서, 항신생물제의 선구 약제의 표적 활성화 계획의 실제적 이행을 위해 생체 내 상황의 당연한 고려가 필요하다.
b. 촉매 항체
촉매 항체가 기질(또는 항원) 상에서 화학 반응을 수행하는 방식은, 필수적으로 효소가 화학 반응을 어떻게 실시하는지를 설명하는 동일한 이론 규칙에 의해 통제된다. 항체에 의한 화학 반응의 촉매 작용을 기재하는 미합중국 특허 4,888,281 호 참조. 일어나는 대개의 화학적 전환에 대해, 반응물과 생성물 사이에 존재하는 에너지 장벽을 극복하기 위해 실질적인 활성화 에너지가 요구된다. 효소는 전이 상태로 알려져 있는 에너지 장벽의 정점에서 발견되는 일시적인 불안정한 화학종을 형성하기 위해 요구되는 활성화 에너지를 저하시키므로써 화학 반응을 촉진시킨다(Pauling, L., Am. Sci. 36(1948) : 51; Jencks, W. P., Adv. Enzymol. 43(1975) : 219). 전이 상태를 안정화시켜 활성화 자유 에너지를 감소시키는 효소 촉매 작용에는 네가지 기본적인 메카니즘이 적용된다. 첫째, 일반적인 산 및 염기의 잔기가 촉매 활성 부위 내 촉매 작용에 참여하기 위해 최적으로 위치하는 것으로 종종 발견된다. 둘재, 메카니즘은 고유 효소-기재 중간체의 형성을 포함한다. 셋째, 모델 시스템은 반응을 위한 적당한 배향에서, 결합 반응물들이 반응물들의 "효과적 농도"를 최소 7 등급 크기 만큼 증가시켜 (Fersht, A. R. 일동, Am. Chem. Soc. 90 (1968 : 5833) 화학 반응의 엔트로피를 크게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 마지막으로, 효소는 기질 결합시 얻은 에너지를 전환시켜 전이상태를 닮은 구조를 향해 반응을 변화시킬 수 있다.
효소 촉매 작용의 이러한 이해를 이끌어 내고자, 촉매 활성을 갖는 몇가지 항체를 면역화에 의해 유도하고 단리하였다 (Powell, M. J. 일동, Protein Engineering 3 (1989) : 69-75). 산 또는 염기 잔기를 항원 결합 부위에 도입하기 위한 한가지 접근은 이뮤노겐(Immunogen) 내에 반대 하전된 분자를 사용하는 것이다. 이 기술은 양 하전된 암모늄 이온을 함유하는 합텐으로 항체를 유도하는데 있어서 성공적인 것으로 나타났다(Shokat 일동, Chem. Int. Ed. Engl. 27(1988) : 269-271). 이들 모노클로날 항체 중 몇 가지는 제거 반응을 촉매하였다.
다른 접근에서, 항체는 원하는 반응의 전이 상태의 크기, 모양 및 하전을 닮은 안정한 화합물(즉, 전이 상태 유사체)로 유도된다. 동물을 면역화하기 위한 전이 상태 유사체의 사용 및 촉매 항체의 생성을 설명하는 미합중국 특허 4,792,446 및 미합중국 특허 4,963,355 참조.
전이 상태 구조를 안정화시키고/거나 반응물의 "효과적 농도"를 증가시키므로써 반응을 촉진시킬 수 있는 촉매 항체의 예가 하기에 논의된다.
1. 에스테라제
에스테르 가수분해의 메카니즘은 정전 및 모양 특성이 포스포네이트 구조에 의해 모방될 수 있는 하전된 전이 상태를 포함한다. 니트로페닐 포스포네이트 에스테르 합텐-단백질 접합체를 사용한 생쥐의 면역화는 메틸-p-니트로페닐 카르보네이트에 가수분해 활성을 갖는 모노클로날 항체의 단리를 결과시켰다 (Jacobs 일동, J. Am. Chem. Soc. 109(1987) : 2174-2176). 유사한 전이 상태의 유사체에 대한항체는 유기 매트릭스 내에서 이의 에스테르 기질을 가수 분해할 수 있었다 (Durfor 일동, J. Am. Chem. Soc. 110(1988) : 8713-8714). 촉매의 상당한 속도 증가가 디피콜린산 포스포네이트 에스테르를 사용한 면역화에 의해 증가된 항체에 대해 보고되었다 (Tramontano 일동, J. Am. Chem. Soc. 110(1988) : 2282). 항체는 Kcat 20S-1로 4-아세트아미도페닐 에스테르를 가수분해 하였으며, 이는 촉매화되지 않은 에스테르 분해에 대한 속도 상수 보다 6 백만배 더 신속하였다. 포스포네이트 에스테르에 대하여 증가된 모노클로날 항체에 의한 D-페닐알라닌 대 L-페닐알라닌을 함유하는 알킬 에스테르의 입체 특이적 분해에 대한 최근의 보고는, 촉매 에스테라제 모노클로날 항체를 유도하기 위한 포스포네이트 에스테르의 사용에 부가적 신뢰를 더하였다 (pollack 일동, J. Am. Chem. Soc. 111(1989) : 5961-5962).
2. 펩티다제/아미다제
펩티다제 또는 아미다제에 대한 전이 상태를 모방하기 위해 전이 상태 유사체를 고안하는 몇가지 방식이 기재되었다. 한 보고서는 아릴 카르복스아미드를 분해할 수 있는 항체를 생성하기 위한 아릴 포스폰아미데이트 전이 상태 유사체의 사용을 논하였다 (Janda 일동, Science 241(1988) : 1188-1191). 펩티다제의 생성을 위한 다른 도식은 펩티드에 연결된 금속 복합제 보조 인자를 사용하였다 (Iverso 일동, Science 243(1989) : 1184-1188). 이 방법으로 분해 부위가 예상되지 않았으나, 부가적인 연구는 부위-지향성 분해를 허용할 수 있을 것이다. 자연 발생적 단백질 분해 항체가 사람에서 발견되었다 (Paul 일동, Science 244(1989) : 1158-1162). 이 항체는 본래 천식 환자의 일부 집단에서 발견되었다. 한 항혈청 제제는 한 특이적 분열 부위에서 28 개 아미노산의 폴리펩티드인 혈관 활성 장 펩티드(VIP)를 분해하였다.
3. 다른 촉매 항체
모노클로날 항체가 촉매화한 다른 반응은 : 클라이센 재배열(Jackson 일동, J. Am. Chem. Soc. 110(1988) : 4841-4842 ; Hivert 일동, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988) : 4953-4955; Hilvert 일동, J. Am. Chem. Soc. 110(1988) : 5593-5594), 산화 환원 반응 (Shokat 일동, Argew. Chem. Int. Ed. Engl. 27(1989) : 269-271), 티미딘 이량체의 광화학적 분해 (Cochran 일동, J. Am. Chem. Soc. 110(1988) : 7888-7890), 입체특이적 트란스에스테르화의 재배열 (Napper 일동, Science 237(1987) : 1041-1043) 및 이분자 아미드 합성 (Benkovic 일동, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 85(1988) : 5355-5358 ; Janda 일동, Science 241 (1988) : 1188-1191 등이다.
본 발명의 목적은 신규한 세포독성 화학요법제의 선구 약제를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 종양 또는 종양 근처에 세포 독성 화학요법제의 국부적 형성 또는 수송을 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 실질적으로 내생 포유동물 효소에 안정하고 본 발명의 표적된 촉매 단백질에 의해 활성화된, 높은 약품/선구 약품 세포독성 비율을 갖는 선구 약제를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은, 1) 정상 조직에 대한 독성의 문제점, 및 2) 비-종양 부위에서의 약제의 이용 또는 불활성화에 기인한 감소된 항암 효능의 문제점을 극복하기 위해 종양에 또는 종양 근처에 세포독성 화학요법제의 형성 또는 수성을 국부화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 종양 세포에 대한 활성 알킬화 종의 선택적인 표적화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 종양-특이적 항체 결합 및 선구 약제 활성화를 사용하는 선구 약품의 특이적 종양 부위 활성화를 통한 전신의 약제 독성을 감소시키는 것이다.
본 발명의 목적은 포유동물 효소에 안정한 선구 약제를 제공하며, 표적된 종양 세포 밖에서의 최소의 약품 활성화 또는 분해를 보증하는 것이다.
도 1a (1/87 및 2/87 장)는 선형 트리메틸벤조일- 및 트리메톡시 벤조일-5-플루오로우리딘 선구 약제, 화합물 1a 및 1b 의 제조를 나타낸다.
도 1b (3/87, 4/87 및 5/87 장)는 실시예 1a 에서 선규 약제의 합텐, 트리메톡시벤조에이트-5-플루오로우리딘의 선형 포스포네이트, 화합물 4 의 제조를 나타낸다.
도 1c (6/87 장)는 선규 약제, 5'-O-(2,6-디메톡시벤조일)-5-플루오로우리딘, 화합물 1c 의 제조를 나타낸다.
도 1d (7/87 및 8/87 장)는 실시예 1a 에서 선구 약제의 합텐 : 트리메틸벤조에이트-5-플루오로우리딘의 선형 포스포네이트, 화합물 4a 의 제조를 나타낸다.
도 2a (9/87 및 10/87 장)는 선구 약제, 분자 내 트리메톡시벤조에이트-5-플루오로우리딘, 화합물 10 의 제조를 나타낸다.
도 2b (11/87 및 12/87 장)는 실시예 2a 의 선구 약제의 합텐 : 트리메톡시벤조에이트-5-플루오로우리딘, 화합물 15 의 제조를 나타낸다.
도 3 (13/87 및 14/87 장)는 실험 선구 약제, 갈락토실 시토신 β-D-아라비노푸라노시드, 화합물 19 의 제조를 나타낸다.
도 4 (15/87 및 16/87 장)는 실험 선구 약제, 갈락토실 5-플루오로우리딘, 화합물 24 의 제조를 나타낸다.
도 5a (17/87 및 18/87 장)는 실시예 3 및 4 에서 선구 약제의 합텐으로의 선구제, 화합물 25 의 제조를 나타낸다.
도 5b (19/87 장)는 실시예 3 및 4 에서 선규 약제의 합텐, 화합물 30a 및 30b 의 제조를 나타낸다.
도 5c (20/87 장)는 실시예 2 및 4 에서 신규 약제의 합텐, 화합물 30a 및 30b 의 대안적 제조를 나타낸다.
도 6 (21/87 장)는 실험 선구 약제, 지방족 디에틸 아세탈 보호된 알도포스파미드, 화합물 38 의 제조를 나타낸다.
도 7 (22/87 장)는 실험 선규 약제의 구아닐 합텐, 지방족 디에틸 아세탈 보호된 알도포스파미드, 화합물 43 의 제조를 나타낸다.
도 8a (23/87 및 24/87 장)는 분자 내 에놀 트리메톡시벤조에이트 포스파미드 선구 약제의 합성을 위한 무수물 중간체, 화합물 45 의 제조를 나타낸다.
도 8b (25/87 및 26/87 장)는 선구 약제, 분자 내 에놀 트리메톡시 벤조에이트 포스파미드, 화합물 50 의 제조를 나타낸다.
도 8c (27/87 및 28/87 장)는 분자 내 에놀트리메톡시벤조에이트 포스파미드 합텐, 화합물 57 의 제조를 나타낸다.
도 9 (29/87 장)는 Colo 세포에 대한 AraC 와 갈락토실-AraC 선구 약제의 비교를 나타낸다.
도 10 (30/87 장)는 Lovo 세포에 대한 AraC 와 갈락토실-AraC 선구약제의 비교를 나타낸다.
도 11 (31/87 장)는 CEA 항원 양성 세포에 대한 갈락토실-AraC 선구 약제의 부위 특이적 활성화를 나타낸다.
도 12 (32/87 장)는 CEA 항원 음성 세포에 대한 갈락토실-AraC 선구 약제의 활성을 나타낸다.
도 13 (33/87 장)는 약제 및 선구 약제에 대한 백혈구 반응을 나타낸다.
도 14 (34/87 장)는 약제 및 선구 약제에 대한 분할된 호중구 반응을 나타낸다.
도 15 (35/87 장)는 약제 및 선구 약제에 대한 혈소판 반응을 나타낸다.
도 16 (36/87 장)는 약제 및 선구 약제에 대한 임파구 반응을 나타낸다.
도 17 (37/87 장)는 약제 및 선구 약제에 대한 적혈구 반응을 나타낸다.
도 18 (38/87 장)는 CEA 항원 음성 Colo 세포에 대한 5' 플루오로우리딘과 갈락토실-5' 플루오로우리딘 선구 약제의 비교를 나타낸다.
도 19 (39/87 장)는 CEA 항원 양성 Lovo 세포에 대한 5' 플루오로우리딘 선구 약제의 부위 특이적 활성화를 나타낸다.
도 20 (40/87 장)는 CEA 항원 음성 Colo 세포에 대한 5' 플루오로우리딘의 활성을 나타낸다.
도 21 (41/87 장)는 생쥐 내 총 백혈구에 대한 5' 플루오로우리딘과 갈락토실-5' 플루오로우리딘 선구 약제의 비교를 나타낸다.
도 22 (42/87 장)는 생쥐의 적혈구에 대한 5' 플루오로우리딘과 갈락토실-5' 플루오로우리딘 선구 약제의 비교를 나타낸다.
도 23 (43/87 장)는 생쥐의 총 호중구에 대한 5'-플푸오로우리딘과 갈락토실-5' 플루오로우리딘 선구 약제의 비교를 나타낸다.
도 24 (44/87 장)는 생쥐의 총 임파구에 대한 5' 플루오로우리딘과 갈락토실-5' 플루오로우리딘 선구 약제의 비교를 나타낸다.
도 25 (45/87 장)는 생쥐의 총 골수 세포질에 대한 5' 플루오로우리딘과 갈락토실-5' 플루오로우리딘 선구 약제의 비교를 나타낸다.
도 26 (46/87 및 47/87 장)는 실시예 16 및 20 에서 선구 약제의 중간체 및 실시예 18 및 22 에서 선구 약제의 합텐, (티아조일)아미노아세트산 에스테르, 화합물 60 의 제조를 나타낸다.
도 27 (48/87 및 49/87 장)는 선구 약제, 5-플루오로우리딘 치환된 β-락탐, 화합물 68 의 제조를 나타낸다.
도 28 (50/87 및 51/87 장)는 실시예 16 에서 선구 약제의 합텐의 중간체, 5-알키닐화된 우리딘, 화합물 74 의 제조를 나타낸다.
도 29 (52/87 및 53/87 장)는 β-락탐 선구 약제의 합텐의 중간체, 화합물 79 의 제조를 나타낸다.
도 30 (54/87 및 55/87 장)는 실시예 16 에서 선구 약제의 합텐, 시클로부탄올 치환된 5-플루오로우리딘, 화합물 81 의 제조를 나타낸다.
도 31 (56/87 및 57/87 장)는 실시예 20 에서 선구 약제의 중간체, 5-플루오로우리딘 5'-O-아릴 에스테르, 화합물 85 의 제조를 나타낸다.
도 32 (58/87 및 59/87 장)는 선구 약제, 5'-O-아로일-5-플루오로우리딘에 의해 치환된 β-락탐, 화합물 90 의 제조를 나타낸다.
도 33 (60/87 장)는 실시예 22에서 합텐의 중간체, 5-알키닐화된 우리딘 5'-O-아릴 에스테르, 화합물 92 의 제조를 나타낸다.
도 34 (61/87 및 62/87 장)는 실시예 20 에서 선구 약제의 합텐, 5'-O-아로일 우리딘에 의해 치환된 시클로부탄올, 화합물 100 의 제조를 나타낸다.
도 35 (63/87 장)는 아드리아마이신 선구 약제, 아로일아미드, 화합물 103 의 제조를 나타낸다.
도 36 (64/87 장)는 실시예 23 에서 아드리아마이신 선구 약제의 합텐, 아드리아마이시니의 아로일아미드의 포스페이트, 화합물 104 의 제조를 나타낸다.
도 37 (65/87 장)는 실시예 23 에서 선구 약제의 합텐, 아드리아 마이신의 아로일 설폰아미드, 화합물 106 의 제조를 나타낸다.
도 38 (66/87 장)는 멜팔란 아로일아미드 선구 약제, 화합물 109 의 제조를 나타낸다.
도 39 (67/87 장)는 실시예 25 에서 선구 약제의 합텐, 멜팔란의 아로일아미드의 설폰아미드, 화합물 110 의 제조를 나타낸다.
도 40 (68/87 장)는 선구 약제, 테트라키스(2-클로로에틸)알도포스파미드 디에틸 아세탈, 화합물 112 의 제조를 나타낸다.
도 41 (69/87 및 70/87 장)는 실시예 31 에서 선구 약제의 합텐 : 테트라키스(2-클로로에틸) 알도포스파미드 디에틸 아세탈의 트리메틸 암모늄염 유사체, 화합물 119 의 제조를 나타낸다.
도 42 (71/87 장)는 실시예 31 에서 선구 약제의 합텐 : 테트라키스 (2-클로로에틸) 알도포스파미드 디에틸 아세탈의 디프로필메틸암모늄염 유사체, 화합물 121 의 제조를 나타낸다.
도 43 (72/87 및 73/87 장)는 선구 약제, 분자 내 비스(2-히드록시에톡시)벤조에이트-5-플루오로우리딘, 화합물 128 의 제조를 나타낸다.
도 44 (74/87 및 85/87 장)는 실시예 34 에서 선구 약제의 합텐; 비스(2-히드록시에톡시)벤조에이트-5-플루오로우리딘의 시클릭 포스포네이트 유사체, 화합물 137 의 제조를 나타낸다.
도 45 (76/87 장)는 선구 약제, 분자 내 비스(3-히드록시프로필옥시)벤조에이트-5-플루오로우리딘, 화합물 138 의 제조를 나타낸다.
도 46 (77/87 장)는 실시예 36 에서 선구 약제의 합텐 : 비스(3-히드록시프로필옥시)벤조에이트-5-플루오로우리딘의 시클릭 포스포네이트 유사체, 화합물 139 의 제조를 나타낸다.
도 47 (78/87 및 79/87 장)는 선규 약제 : 5'-O-(2,4,6-트리메톡시벤조일)-5-플루오로우리딘, 화합물 141 의 제조를 나타낸다.
도 48a (80/87 및 81/87 도)는 실시예 38 에서 선규 약제의 합텐 : 우리딘의 피리디늄 알콜-치환된 유사체, 화합물 149 의 제조를 나타낸다.
도 48b (82/87 및 83/87 장)는 실시예 38 에서 선구 약제의 합텐 : 우리딘의피리디늄 알콜-치환된 유사체, 화합물 149 의 제조를 나타낸다.
도 49 (84/87 및 85/87 장)는 실시예 38 에서 선규 약제의 합텐 : 5'-O-(2,4,6-트리메톡시벤조일-5-플루오로우리딘의 선형 포스포네이트, 화합물 152 의 제조를 나타낸다.
도 50 (86/87 및 87/87 장)는 실시예 1a 에서 선규 약제의 합텐 : 5'-O-(2,6-디메톡시벤조일)-5-플루오로우리딘의 선형 포스포네이트, 화합물 155 의 제조를 나타낸다.
발명의 요약
본 발명의 이들 및 다른 목적들은 선구 약제 화합물, 및 선구 약제로 부터 보호기를 분해시킬 수 있는 항체를 생성하기 위해 사용되는 합텐에 의해 달성된다. 선구 약제 화합물에서 보호 부분은 화합물에 안정성을 부여하며, 즉 본 발명의 화합물은 투여 후 활성 약제로의 전환에 저항성이며, 실질적으로 약제에 비해 선구 약제의 독성을 유리하게 적어도 백배 만큼 감소시킨다.
본 발명의 합텐은 합텐에 특이적인 것으로 밝혀진 항체의 단백질 가공에 의해, 즉, 예를 들어 무작위 또는 부위 특이적 (site-directed) 돌연변이에 의해, 또는 생쥐 또는 다른 숙주에서 면역 반응을 유도함에 따른 생체외 기술에 의해 촉매 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 원하는 안정성 및 독성 특성에 합당한 선구 약제 화합물이 확인되고, 선구 약제 화합물과 같은 일반식에 대해 구조적 유사성을 갖고 화합물 잔기로 부터 약제를 촉매적으로 분해시키는 항체를 생성할 수 있는 합텐이 확인된다.
본 발명의 한 구체예는 하기로 구성되는 특이적 세포 집단의 처리를 위한 면역 접합체를 포함한다 :
(a) 특이적 세포 집단의 에피토프에 결합할 수 있는 부분, 및
(b) 선구 약제를 활성화시킬 수 있는 촉매 항체 부분,
신규한 면역 접합체는 본 발명의 신규한 선구 약제 또는 선행 기술의 선구 약제를 활성화시키는 촉매 항체 부분을 포함한다.
면역 접합체에 대해 본 명세서에서 사용된 용어는 전체 항체, 효소 또는 표적화 단백질, 또는 그 활성 단편을 뜻한다.
본 발명은 또한 하기로 구성되는 치료 조합물을 포함한다 :
(a) 본 발명의 신규한 선구 약제, 및
(b) 하기로 구성되는 면역접합체 :
(i) 특이적 세포 집단의 에피토프에 결합할 수 있는 부분, 및
(ii) 본 발명의 상기 신규한 선구 약제를 활성화시킬 수 있는 촉매 항체 부분 또는 효소 부분.
본 발명은 또한 하기로 구성되는 치료 조합물을 포함한다 :
(a) 선행 기술의 선구 약제, 및
(b) 하기로 구성되는 면역 접합체 :
(i) 특이적 세포 집단의 에피토프에 결합할 수 있는 부분, 및
(ii) 선행 기술의 상기 선구약제를 활성화시킬 수 있는 촉매 항체 부분.
본 발명은 또한 종양과 같은 특이적 세포 집단에 약제를 수송하므로써 다양한 질병 상태를 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명의 촉매 항체 또는 그 단편이 접합되는 표적화 화합물, 예컨대 항체가 투여되어 상기 세포 집단에 국부화시킬 수 있다. 그리고 나서, 선구 약품이 투여되고 그 세포 집단에서 분해되어 (즉, 활성화되어) 약제가 수송된다. 따라서, 본 발명에 하기 단계들로 구성되는, 특이적 세포 집단(예, 암)의 상태를 치료하는 방법이 포함된다 :
(a) 하기로 구성되는 면역 접합체를 투여하고 :
(i) 특이적 세포 집단의 에피토프에 결합할 수 있는 부분, 및
(ii) 본 발명의 신규한 선구 약제를 활성화시킬 수 있는 촉매 항체 부분 또는 효소 부분 ;
(b) 상기 면역접합체가 상기 세포 집단에 국부화되도록 하고; 그리고
(c) 상기 면역접합체에 의해 활성되는 본 발명의 신규한 선규 약제를 투여한다.
하기 단계들로 구성되는, 특이적 세포 집단(예, 암)의 상태를 치료하는 방법이 또한 포함된다 :
(a) 하기로 구성되는 면역 접합체를 투여하고 :
(i) 특이적 세포 집단의 에피토프에 결합할 수 있는 부분, 및
(ii) 선행 기술의 선구 약제를 활성화시킬 수 있는 촉매 항체 부분 :
(b) 상기 면역접합체가 상기 세포 집단에 국부화되도록 하고; 그리고
(c) 상기 면역접합체에 의해 활성화되는 선행 기술의 선구 약제를 투여한다.
본 발명의 부가적 구체예는 하기 단계들로 구성되는, 본 선구 약제를 활성화시킬 수 있는 항체를 확인하는 방법이다 :
(i) 본 선구 약제를 활성화시킬 수 있고 또한 항생물을 불활성화시킬 수 있는 항체를 유도하기 위해 선택된 합텐으로 숙주를 면역화하고;
(ii) 상기 항체를 암호화하는 재조합 유전자를 단리하고;
(iii) 상기 항체를 암호화하는 유전자를 세균에 삽입하고;
(iv) 항생물을 함유하는 배지내에서 상기 세균을 배양하고;
(v) 생존하는 상기 세균을 선택하고;
(vi) 생존하는 세균으로부터 항체 유전자를 단리하고;
(vii) 항체 유전자를 발현시켜 항체를 특성화하기 충분한 양의 항체를 생성하고; 및
(viii) 본 선구 약제를 활성화시킬 수 있는 항체를 스크리닝한다.
본 발명의 부가적 구체예는 하기 단계들로 구성되는, 본 선구 약제를 활성화시킬 수 있는 항체를 확인하는 방법이다.
(i) 본 선구 약품을 활성화시킬 수 있는 항체를 유도하기 위해 선택된 합텐으로 숙주를 면역화하고;
(ii) 상기 항체를 암호화하는 재조합 유전자를 단리하고;
(iii) 상기 항체를 암호화하는 유전자를 세균에 삽입하고;
(iv) 본 선구 약제와 같은 선구 부분에 의해 유도된 티미딘을 함유하는 배지에서 상기 세균을 배양하고;
(v) 생존하는 세균을 선택하고;
(vi) 생존하는 세균으로부터 항체 유전자를 단리하고;
(vii) 항체 유전자를 발현시켜 항체를 특성화하기 충분한 양의 항체를 생성하고; 그리고
(viii) 본 선구 약제를 활성화시킬 수 있는 항체를 스크리닝한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 하기 단계들로 구성되는, 생성물로의 기질의 전환을 촉매화할 수 있는 항체를 스크리닝하는 방법이다 :
(i) 합텐에 대한 항체를 양성하고,
(ii) 상기 항체를 고정시키고,
(iii) 기질을 상기 항체에 첨가하고, 및
(iv) 생성물로의 기질의 전환을 촉매화할 수 있는 항체를 확인한다. 임의로, 단계 (i) 다음에 상기 합텐에 결합하는 항체를 선택하는 단계가 있다.
본 발명의 다른 구체예는 하기 단계들로 구성되는, 반응을 촉매화할 수 있는 항체를 발현하는 세포를 스크리닝하는 방법이다 :
(i) 화합물에 대해 옥소트로픽(auxotrophic)하며 항체 유전자를 함유하는 세포를 상기 화합물의 선구 형태를 함유하는 배양 배지 내에 플래이팅시키고 (plating out); 그리고
(ii) 생존하며 상기 선구 형태를 활성화시켜 상기 화합물을 방출할 수 있는 항체를 발현하는 상기 세포를 선택한다.
본 발명의 다른 구체예는 하기 단계들로 구성되는, 선구 약제를 활성화시킬 수 있는 항체를 발현하는 세포를 스크리닝하는 방법이다 :
(i) 티미딘 의존성 항체 유전자 함유 세포를 상기 약제가 티미딘인 선구 약제를 함유하는 배양 배지 내에 플래이팅시키고; 그리고
(ii) 생존하며 상기 선규약제를 활성화하여 티미딘을 형성할 수 있는 항체를 발현하는 상기 세포들을 선택한다.
본 발명의 다른 구체예는 하기 단계들로 구성되는, 반응을 촉매화 할 수 있는 항체를 발현하는 세포를 스크리닝하는 방법이다 :
(i) 항체 유전자를 함유하는 세포를 독소를 함유하는 배양 배지 내에 플래이팅시키고; 그리고
(ii) 생존하며 상기 독소를 활성화시킬 수 있는 항체를 발현하는 세포를 선택한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 하기 단계들로 구성되는 선구 약제를 활성화시킬 수 있는 항체를 발현하는 세포를 스크리닝하는 방법이다 :
(i) 항체 유전자를 함유하는 세균 세포를 항생물질을 함유하는 배양 배지 내에 플래이팅시키고; 그리고
(ii) 생존하며 상기 항생물질을 불활성화시킬 수 있는 항체를 발현하는 세균 세포를 선택한다.
본 발명의 다른 구체예는 하기 단계들로 구성되는 이특이적 항체를 합성하는 방법이다 :
(i) 하기로 구성되는 군으로 부터 선택된 서열을 갖는 유전자를 발현시키고 :
VH 항체 1-S-VL 항체 1-S-VL 항체 2-S-VH 항체 2 ;
VH 항체 1-S-VL 항체 1-S-VH 항체 2-S-VL 항체 2 ;
VL 항체 1-S-VH 항체 1-S-VL 항체 2-S-VH 항체 2 ;
VL 항체 1-S-VH 항체 1-S-VH 항체 2-S-VL 항체 2 ;
이때 -S- 는 연결자 서열이다; 그리고
(ii) 상기 이특이적 항체를 단리한다.
항체 1 은 특이 세포의 에피토프에 결합할 수 있는 항체이며 항체 2 는 촉매 항체이거나, 그 반대이다.
본 발명의 다른 구체예는 하기 단계들로 구성되는, 이특이적 항체를 합성하는 방법이다 :
(i) 서열 : VL 항체 1-S-VH 항체 2 를 갖는 유전자를 발현시키고, 또한
(ii) 서열 : VH 항체 1-S-VL 항체 2 를 갖는 유전자를 발현시키고,
(iii) 단계 (i) 및 (ii) 의 생성물을 조합하고, 그리고
(iv) 상기 이특이적 항체를 단리한다.
이때 -S- 는 연결자 서열이다.
본 발명의 또 다른 구체예는 하기 단계들로 구성되는, 이특이적 항체를 합성하는 방법이다 :
(i) 서열 : VL 항체 2-S-VH 항체 1 을 갖는 유전자를 발현시키고, 또한
(ii) 서열 : VH 항체 2-S-VL 항체 1 을 갖는 유전자를 발현시키고,
(iii) 단계 (i) 및 (ii) 의 생성물을 조합하고, 그리고
(iv) 상기 이특이적 항체를 단리한다.
이때 -S- 는 연결자 서열이다.
본 발명 및 이의 다른 목적, 특징 및 잇점은, 하기 실시예에서 논의된 실험 결과를 예시하는 첨부 도면을 참고로 할 때, 하기 상세한 설명으로 부터 보다 분명하고 충분하게 이해될 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 다양한 화학 요법제를, 내성 효소에는 안정하나 수용체-결합 리간드, 종양 결합 효소에 결합하는 유사체 및 선구 약제를 활성 세포독성제로 전환시키는 단백질 촉매에 접합되어 있거나 그렇지 않으면 물리적으로 연결되어 있는 항체와 같은 종양-선택성 약품의 선행 투여에 의해 종양 또는 종양 근처에서 활성화될 수 있는 비독성 선구 약제로 실질적으로 전환시키는 특별한 방법을 제공한다. 촉매 단백질은 1) 촉매 항체, 2) 외생 (또는 비-포유동물) 효소, 또는 3) 투여 후 선구 약제가 접근할 수 있는 구획 내에서 낮은 내생 활성을 갖는 내생 (또는 포유동물) 효소이다. 상기 시스템은 종양 부위(들)에 국부화시키면서 또한 약제에 대한 전신 노출을 감소시키는 비교적 고농도의 활성 약품의 형성을 허용한다.
본 발명은 내생 포유 동물 효소에 필수적으로 안정하며 본 발명의 표적된 촉매 단백질에 의해 활성화되는 높은 약제/선구 약제 세포독성 비율을 갖는 선구 약제를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 촉매 단백질에 의해 활성화되기 전까지는 실질적으로 비독성인 항신생물 누클레오시드 유사체의 적합한 선구 약제를 제조하기 위한 화합물 및 방법을 제공한다.
표적 활성화를 위한 세포독성제의 선구 약제를 고안하는데 있어서, 선구 약제 치환체는 약제의 하기 두가지 성질을 부여하는 것이 중요하다 : (1) 투여 후 비교적 안정하므로 비교적 비독성이며 : (2) 특이적으로 활성화될 수 있다. 또한, 선구 약제 치환체는 촉매 단백질에 의한 분해 후 유기체에 대해 독성이지 않아야 한다.
본 발명에서, 항신생물제의 선구 약제는 아래에서 기재되는 적당한 치환체를 항신생물 약제에 부착시키므로써 제조된다. 모 약제를 비교적 비독성이도록 하고, 내생 효소 활성에 의한 제거에는 비교적 저항성이나 본 발명의 촉매 단백질에 의해서는 제거되는 (활성 약제를 생성하는) 치환체가 선택된다.
선구 약제 및 선구 약제를 위한 합텐 상의 바람직한 치환체는 H, 1-10 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 탄소 원자를 갖는 알콕시, 1-10 탄소 원자를 갖는 모노시클릭 방향족 알켄, 히드록실, 히드록시알킬, 히드록시알콕시, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄 시클릭알킬, 치환된 시클릭알킬, 또는 고리가 적어도 하나의 헤테로원자로 치환된 시클릭알킬이다. 알킬, 알케닐, 알키닐, 치환된 알킬, 알케닐 및 알키닐, 히드록시알킬, 히드록시알콕시, 아미노알킬, 티오알킬, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄, 시클릭알킬, 치환된 시클릭알킬, 및 고리가 적어도 하나의 헤테로 원자로 치환된 시클릭 알킬로 구성되는 선구 약제 상의 치환체 및 선구 약제를 위한 합텐 상의 치환체는, 바람직하게 탄소쇄 또는 고리 내에 1-10 개의 탄소 원자를 갖는다.
선구 약제 및 선구 약제를 위한 합텐 상의 치환체가 치환될 때, 바람직한 치환체는 -OH, 알킬, 클로로, 플루오로, 브로모, 요오드, -SO3, 아릴, -SH, -(CO)H, -(CH)OH, 에스테르기, 에테르기, 알케닐, 알키닐, -CO-, -N2 +, 시아노, 에폭시드기 및 헤테로시클릭기이다.
선구 약제 및 선구 약제를 위한 합텐 내 바람직한 헤테로 원자는 인, 황, 질소, 및 산소이다. 헤테로 원자를 함유하는 선구 약제 상의 치환체 및 선구 약제를 위한 합텐 상의 치환체는 바람직하게 하나 이상의 헤테로 원자를 함유한다.
선구 약제 및 선구 약제를 위한 합텐 내 양하전된 사차 아민을 위한 바람직한 반대 이온(음이온)은 할로겐, 아세테이트, 메탄 설포네이트, 파라-톨루엔 설포네이트, 및 트리플루오로메탄 설포네이트이다.
촉매 단백질, 및 특히 촉매 항체는 대개 비교적 낮은 활성화 에너지로써 쉽게 반응을 촉매화한다. 항체에 의해 촉매되거나 촉진되는 것으로 알려져 있는 반응은 에스테르 분해, 클라이센 재배열, 산화환원 반응, 입체특이적 트란스에스테르화 재배열, 및 아미드 또는 펩티드 분해를 포함한다.
촉매 항체, 및 효소는 일시적인 불안정한 전이 상태를 형성하기 위해 요구되는 활성화 에너지를 저하시키므로써 화학 반응을 촉매화한다. 전이 상태의 형성을 안정화하거나 증가시키는 촉매 항체는 항체를 치환체-분해 반응의 전이 상태의 크기, 모양, 및 하전을 닮은 선구 약제의 안정한 유사체로 발생시키므로써 생성된다. 예를 들어, 에스테르-분해 반응의 전이 상태 유사체(합텐)는 보통의 카르보닐기를 안정한 포스포네이트 또는 설포네이트기로 치환하므로써 제조된다.
전이 상태 유사체는 본 발명의 선구 약제에 대해 촉매 활성을 갖는 항체를 유도하기 위한 합텐으로서 전형적으로 사용된다. 상기와 같이, 이들의 구조는 일반적으로 단백질 운반자에 대한 부착을 위한 연결자 아암을 포함한다. 따라서, 선구 약제 내 약제에 해당하는 합텐 부분은 전형적으로 본래 약제의 유사체이며 단백질에 부착될 수 있는 기에서 종결하는, 공유적으로 부착된 연결자 아암의 존재에 있어 다르다. 본 발명의 몇몇 구체예에서, 연결자 아암은 선구 약제의 선구 약제 치환체(예, 누클레오시드 유사체의 에스테르 선구 약제의 치환된 벤조에이트 부분)에 해당하는 합텐 부분에 부착된다.
몇몇 전이 상태 유사체에서, 합텐 내 약제-유사 부분은 또한 선구 약제-활성화 반응을 위한 전이 상태에 구조적 유사성을 제공하기 위해 임의로 변형된다. 예를 들어, 약제가 히드록실기를 통해 그 선구 약제 부분에 부착되는 약제에서, 부착산소(이는 일반적으로 약제 분자의 일부이다)는 해당 합텐에서 -NH-, -CH2-, 또는 -S- 에 의해 대체된다.
더욱이, 합텐 내 약제-유사 부분은 또한 해당 선구 약제를 향한 촉매 활성을 갖는 항체를 유도하기에 바람직한 형태에 있어 이에 구조적 엄중도를 부여하기 위해 임의로 변형된다. 그러나, 대개의 경우 선구 약제의 약제 부분에 해당하는 전이-상태 유사체의 부분은 본래 약제에 대해 실질적인 구조적 유사성을 갖는다. 이들 해당 선구 약제의 약제 부분 유사체로 부터 제조된 합텐의 예가 아래 제시된다.
합텐 내 바람직한 약제-유사 부분은 5-위치가 -C-C-(CH2)nNHCBz 또는 (CH2)nNH2로 구성되는 부분에 의해 치환되는 5-플루오로우리딘의 유사체이며, 식에서 n 은 1-10 의 정수이며 CBZ는 카르보벤질옥시이다.
합텐 내 다른 바람직한 약제-유사 부분은 포스포아미드 머스타드 [R'OP(O)(R")N(CH2CH2Cl)2]의 유사체이며, 이때 R' 및 R" 은 동일하거나 상이하며 서로 독립적으로 H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록실, 히드록시알킬, 히드록시알콕시, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄, 시클릭알킬, 치환된 시클릭알킬, 또는 고리가 적어도 하나의 헤테로원자로 치환된 시클릭알킬이다. 바람직한 구체예는 R' 은 알킬암모늄염이고; R" 은 시클릭알킬의 고리가 두개의 헤테로원자로 치환되는 치환된 시클릭알킬인 합텐 내약제-유사 부분이다.
상당한 에스테라제 활성이 포유 동물 조직에 존재하며 편재한다. 이 활성은 비교적 비특이적이며 광범위하게 다양한 화합물 내에서 에스테르 결합을 분해한다. 그러나, 본 발명의 선구 약제의 몇몇 부류, 예컨대, 누클레오시드 유사체의 치환된 방향족 에스테르는 내생 포유동물 에스테라제 활성에 비교적 저항성인 에스테르 치환체를 갖는다.
본 발명의 유사한 치환된 방향족 에스테르 및 다른 선구 약제 치환체는 누클레오시드 유사체 및 다른 항대사물을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 부류의 적당한 관능기를 갖는 항신생물제 시클로포스파미드 유도체와 같은 알킬화제, 독소루비신 또는 에토포시드와 같은 치윤제, 빈카 알칼로이드와 같은 스핀들 독소, 또는 다른 부류의 세포 독성 약제의 선구 약제를 제조하는데 유용하다.
내성 포유 동물 효소에 의한 활성화에 비교적 저항성인 본 발명의 선구 약제는 본 발명의 촉매 단백질, 예컨대 선구 약제 활성화 반응의 전이 상태 유사체에 대한 항체를 생성하여 제조된 촉매 항체(또는 그 활성 단편)에 의해 활성화된다.
본 발명의 촉매 단백질은 종양-선택성 항체, 항체 단편, 또는 종양-결합 단백질 또는 종양-선택성 수용체 리간드에 대해 결합하는 단백질 또는 유사체에 접합되거나, 그렇지 않으면 물리적으로 연결된다. 이 복합체는 전형적으로 선구 약제 이전에 투여되어 이것이 암 세포 내 또는 근처에 국부화되도록 한다. 그리고 나서 선구 약제가 투여되고 촉매 단백질에 의해 분해되어 종양 내 또는 근처에 활성 항신생물 약제를 형성한다.
본 발명의 다양한 선구 약제, 및 상기 선구 약제에 해당하는 전이 상태 유사체가 아래에 기재된다. 부가적으로 선구 약제로 부터 보호기를 분해할 수 있는 항체를 생성하는데 사용될 수 있는 합텐이 기재되어 있다.
발명의 신규한 선구 약제 및 합텐
선구 약제 치환체류 및 선구 약제 활성화 반응
광범위한 촉매 항체-매개 가수 분해 반응 범주에는 그 활성화에 영향을 미치기 위해 적당한 선구 약제로서 사용하기에 가장 적합한 몇몇 특이적 촉매 항체-매개 촉매 반응 부류가 있다. 하기 활성 유형을 갖는 촉매 항체가 제조되고 이용된다:
A. 에스테라제 - 약제에서 에스테르화된 아실 치환체를 분해한다.
B. 아미다제 - 아미노기에 부착된 아실 치환체를 분해한다.
C. 아세탈 가수분해 효소 - 아세탈(또는 오르토 에스테르)을 알데히드(또는 산)로 가수분해한다.
D. 글리코시다제 - 글리코시드 연결을 통해 약제에 부착된 당 치환체를 분해한다.
이러한 류의 활성을 갖는 촉매 항체는 전형적으로 선구 약제 활성화 반응의 전이 상태를 모방하는 합텐을 사용하여 동물을 면역화하므로써 유도된다. 포유 동물 효소 활성에 비교적 안정한 선구 약재 치환체는 전이 상태 유사체를 생성하는데 있어 고안되고 이용되어 차례로 선구 약제를 활성화시킬 수 있는 촉매 항체를 생성하기 위해 이용된다. 본 발명의 선구 약제를 활성화시킬 수 있는 효소가 존재하는경우, 이 목적을 위해 이들은 임의로 촉매 항체에 대한 대체물로서 사용된다.
촉매 활성을 갖는 항체를 유도하기 위해 선구 약제 자체가 또한 임의로 사용된다. 역으로, 선구 약제의 전이 상태 유사체가 또한 임의로 선구 약제로서 또는 약제로서 유용하다. 그러나, 전형적으로 선구 약제로 명명된 화합물은 상기와 같이 이용되며, 전이 상태 유사체로서 하기 명명된 화합물이 촉매 항체를 유도하기 위한 합텐으로서 이용된다.
포유 동물 효소 활성에 비교적 안정하며, 상기 나열된 항체-촉매화 반응에 의해 활성화되는 선구 약제 치환체는 아래 기재된 것들을 포함한다 :
A. 에스테라제 반응에 의한 선구 약제 활성화
벤조에이트 또는 아세테이트 부분 상의 치환체로 부터의 입체 장애는 내생 에스테라제 활성에 의한 이의 분해를 저해한다(실시예 27 참조). 이들의 예는 하기와 같다 :
1. 치환된 방향족 에스테르, 예컨대, 치환된 벤조에이트 에스테르;
2. 에스테르 카르보닐에 대한 분자 내 친핵 공격에 의해 활성화되는 치환된 방향족 에스테르 :
3. 이- 또는 삼-치환된 아세테이트 에스테르; 및
4. 에스테르 카르보닐 상의 분자 내 친핵 공격에 의해 활성화되는 이- 또는 삼-치환된 아세테이트 에스테르.
포유 동물 효소 활성에 안정하며 촉매 항체에 의해 분해되는 다른 에스테르 치환체는 본 발명의 범주 내에 있다.
에스테르 가수 분해 반응을 위한 전이 상태 유사체는 전형적으로, 하기에 보다 상세히 기재되는 바와 같이, 본래 카르보닐기 대신 포스포네이트 또는 설포네이트기를 갖는다.
B. 아미다제 반응에 의한 선구 약제 활성화
일반적인 아미드, 및 하기 나열되는 특별한 아미드는 포유 동물 효소 활성에 비교적 안정하다.
1. 방향족 또는 치환된 아미드, 예, 벤조에이트 또는 치환된 벤조에이트 아미드;
2. 아미드 카르보닐 상의 분자 내 친핵 공격에 의해 활성화되는 방향족 또는 치환된 방향족 아미드;
3. 포르밀아미드;
4. 아세틸아미드;
5. 아미드 카르보닐에 대한 분자 내 친핵 공격에 의해 활성화되는 아세틸아미드; 및
6. 모노락탐 가수분해.
아미드 가수분해 반응에 대한 전이 상태 유사체는 전형적으로, 하기에 보다 상세히 기재되는 바와 같이, 본래 카르보닐기 대신에 포스포네트 또는 설포네이트기를 갖는다.
C. 아세탈 가수분해 반응에 의한 선구 약제 활성화
항신생물제의 아세탈 선구 약제는 안정하며 비교적 비독성이다(실시예 29 참조). 이들 예는 하기와 같다 :
1. 디알킬 아세탈;
2. 오르토 에스테르;
3. 디올 아세탈, 예컨대, 당-치환된 아세탈; 및
4. 디올 오르토 에스테르.
아세탈 가수분해 반응에 대한 전이 상태 유사체는 전형적으로 본래 선구 약제 내 아세탈기를 대체하는 아미딘 또는 구아니딘기를 갖는다.
D. 글리코시다제 반응에 의한 선구 약제 활성화
본 발명의 글리코실 유도체는 안정하며 비교적 비독성이다(실시예 28 참조). 이들의 예는 하기와 같다 :
1. 당의 아노머 위치를 통해 약제 히드록실기에 접합된 헥소푸라노스 글리코시다제 반응에 대한 전이 상태 유사체는 전형적으로 당의 아노머 및 고리 산소 원자를 대체하는 아미노기를 갖는다.
본 발명에서 이용되고 유도되는 항신생물제는 히드록실기 또는 일차 아미노기를 함유하므로; 항신생물제는 화합물 표기에서, Q 가 -O- 또는 NH- 이고 화합물 표기에 사용된 X 가 본래 고리의 탈히드록시 또는 탈아미노 라디칼인 XQH 로 표현된다. 전이 상태 유사체에서 약제 라디칼 X 에 해당하는 부분은 X' 으로 표현된다. 상기된 바와 같이, X' 은 또한 약제 라디칼 X 와 동일할 수 있으나, X' 은 전형적으로 약제 X 의 유사체이다. X' 의 바람직한 특징은 전이-상태 유사체가 XQH 의 선구 약제에 대해 촉매 활성을 갖는 항체를 유도할 수 있도록 약제 라디칼 X 에충분한 구조적 유사성을 가져야 한다는 것이다. 촉매 작용에 대한 바람직한 부위는 실제로 선구 약제 치환 내에 있거나 치환체와 약제 사이의 접합점에 있으므로, X' 구조물 내에 범위가 있다. 그러나, 전형적으로 X' 은 X 와 매우 유사할 것이나, 일반적으로 항체를 촉매 활성을 갖는 전이상태-유사체로 유도하기 위해 동물을 면역화하기 위하여 소 혈청 알부민(BSA) 또는 키이호울 림펫 헤모시아닌(KLH)과 같은 운반 단백질에 전이-상태 유사체를 연결시키기 위해 연결자 아암을 함유한다는 데 있어 다르다.
에스테라제 촉매 작용
에스테라제 촉매 작용에 의해 활성화되는 본 발명에 따른 신규한 화합물은 하기 나열되는 구조식의 화합물을 포함한다.
A. 에스테라제 반응에 의한 선구 약제 활성화
1. 치환된 방향족 에스테르, 예컨대, 치환된 벤조에이트 에스테르
치환된 방향족 에스테르 선구 약제
하기 구조식을 갖는 치환된 방향족 에스테르 화합물 Ala 가 본 발명에 포함된다 :
식에서 X 는 약제 XOH 의 라디칼이다. XOH 는 유리하게 항신생물 누클레오시드 유사체(알도스 고리의 3' 및/또는 5' 위치의 카르복실 부분에 연결됨), 독소루비신, 또는 알도포스파미드의 에놀 형태와 같은 세포독성 약제이다.
R1, R2, R3, R4및 R5는 동일하거나 상이하며, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 모노비클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록실, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 또는 알킬암모늄이며, 단 R1-5중 적어도 하나는 H 가 아니며, 유리하게 R1또는 R5는 H 가 아니다.
이 화합물은 Ara-C-2,4,6-트리메틸 벤조에이트, Ara-C-3,4,5-트리메톡시벤조에이트 또는 Ara-C-2,6-디메틸 벤조에이트가 아니다. 그러나, Ara-C-2,4,6-트리메틸 벤조에이트, Ara-C-3,4,5-트리메톡시 벤조에이트 또는 Ara-C-2,6-디메틸 벤조에이트는 본 발명의 촉매 항체를 이용하는 치료 방법에 유용하다.
하기 구조식을 갖는 화합물 Alb 가 합텐 및 선구 약제로 유용하다 :
식에서 X' 은 화합물 Ala 의 X 의 유사체이며, X' 은 임의로 운반 단백질에 연결되고,
B 는 O, S, NH, 또는 CH2이고,
D는 P(O)OH, SO2, CHOH 또는 SO(임의의 입체화학을 가짐)이고, D 가 CHOH 이면 B 는 CH2이고, 및
R1', R2', R3', R4'및 R5'은 동일하거나 상이하며, 임의로 운반 단백질에 연결되며, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 모노시클릭 방향족, 1-10 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록실, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 또는 알킬암모늄이며, 단 R1'-5'중 적어도 하나는 H 가 아니다. 유리하게 R1'또는 R5'은 H 가 아니다.
합텐 2
하기 구조식을 갖는 치환된 방향족 화합물 Ala' 이 본 발명에 포함된다 :
식에서 X 는 약제 XOH 의 라디칼이다. XOH 는 유리하게 항신생물 누클레오시드 유사체(알도스 고리의 3' 및/또는 5' 위치의 원자 B에 연결됨), 독소루비신, 또는 알도포스파미드의 에놀 형태와 같은 세포 독성 약제이다 :
Z 는 C 또는 N 이고;
B 는 O, S, NH 또는 CH2이고;
D 는 HOP(O), SO2, CHOH 또는 SO(임의의 입체 화학을 가짐)이고;
R1, R2, R3, R4및 R5는 동일하거나 상이하며, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 모노시클릭 방향족, 1-10 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록실, 히드록시알킬, 히드록시알콕시, 할로알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 또는 알킬암모늄이며, 단 R1-5중 적어도 하나는 H 가 아니며, 유리하게 R1또는 R5는 H 가 아니다.
2. 에스테르 카르보닐 상의 분자 내 친핵 공격에 의해 활성화되는 치환된 방향족 에스테르
치환된 방향족 에스테르 선구약제
하기 구조식을 갖는 치환된 방향족 에스테르 화합물 A2a가 본 발명에 포함된다 :
식에서 X 는 약제 XOH 의 라디칼이며, XOH 는 항신생물 누클레오시드 유사체(알도스 고리의 3' 및/또는 5' 위치의 카르복실 부분에 연결됨), 독소루비신, 또는 알도포스파미드의 에놀 형태와 같은 세포독성제이다.
R6, R7, R8, R9은 동일하거나 상이하며, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록실, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 또는 알킬암모늄이다. 유리하게 R6-3중 적어도 하나는 H 가 아니다.
J 는 선형 배열의 1-9 개 원자를 갖는 알킬, 치환체가 페닐, 알킬, 또는 헤테로 원자를 갖는 알킬인 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 알킬이다.
Y 는 OH, NH2, NHR 또는 SH 이며, 이때 R 은 -OH 클로로, 플루오로, 브로모, 요오드, -SO3, 아릴, -SH, -(CO)H, -(CO)OH, 에스테르기, 헤테르기, -CO-, 시아노, 에폭시드기 및 헤테로원자로 구성되는 군으로 부터 선택된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐이다.
합텐
하기 구조식을 갖는 화합물 A2b 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 X' 은 화합물 A2a 의 X 의 유사체이며, X' 은 임의로 운반 단백질에 연결되고,
B 는 O, S, NH, 또는 CH2이고,
C' 은 P(O), COH(임의의 입체 화학을 가짐)이고, D' 이 COH 이면 B 및 Y' 은 CH2이고,
Y' 은 O, NH, NR, S 또는 CH2이며, 이때 R 은 -OH, 클로로, 플루오로, 브로모, 요오도, -SO3, 아릴, -SH, -(CO)H, -(CO)OH, 에스테르기, 에테르기, -CO-, 시아노, 에폭시드기 및 헤테로원자로 구성되는 군으로 부터 선택된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐이고,
R6', R7', R8'및 R9'은 동일하거나 상이하며 임의로 운반 단백질에 연결되며, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록실, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 또는 알킬암모늄이다. 유리하게 R6'-9'중 적어도 하나는 H 가 아니고,
J 는 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 알킬, 치환체가 페닐, 알킬, 또는 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 알킬인 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 알킬이다.
3. 이- 또는 삼-치환된 아세테이트 에스테르.
이- 또는 삼-치환된 아세테이트 에스테르 선구 약제
하기 구조식을 갖는 이 또는 삼-치환된 아세테이트 에스테르 화합물 A3a 가 본 발명에 포함된다 :
식에서 X 는 약제 XOH 의 라디칼이다. 유리하게, XOH 는 항신생물 누클레오시드 유사체(알도스 고리의 3' 및/또는 5' 위치의 카르복실 부분에 연결됨), 독소루비신, 또는 알도포스파미드의 에놀 형태와 같은 세포독성제이다.
R10, R11및 R12는 동일하거나 상이하며, 이들 중 적어도 둘은 H 가 아니며, H 또는 2-22 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 알킬, 시클로알킬디올, 모노시클릭 방향족, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄 또는 알켄이다.
이 화합물은 Ara-C-디에틸 아세테이트가 아니다. 그러나, Ara-C-디에틸 아세테이트는 본 발명의 촉매 항체를 이용하는 치료 방법에 유용하다.
합텐
하기 구조식을 갖는 화합물 A3b 가 합텐, 및 선구 약제로서 유용가능하다 :
식에서 X' 은 A3a 의 X 의 유사체이며, X' 은 임의로 운반 단백질에 연결되고,
B 는 O, S, NH 또는 CH2이고,
D 는 임의의 입체 화학을 갖는 P(O)OH, SO2, CHOH 또는 SO 이고, D 가 CHOH 이면 B 는 CH2이고, 및
운반 단백질에 임의로 연결되는 R10'-R12'은 동일하거나 상이하나 이들 중 적어도 둘은 H 가 아니며, H 또는 2-22 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 알킬, 시클로알킬디올, 모노시클릭방향족, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄 또는 알켄이다.
4. 에스테르 카르보닐 상의 분자 내 친핵 공격에 의해 활성화되는 이- 또는 삼- 치환된 아세테이트 에스테르
이- 또는 삼-치환된 아세테이트 에스테르 선구 약제
하기 구조식을 갖는 치환된 아세테이트 에스테르 화합물 A4a 가 본 발명에 포함된다 :
식에서 X 는 약제 XOH 의 라디칼이다. 유리하게, XOH 는 항신생물 누클레오시드 유사체, 독수루비신, 또는 알도포스파미드의 에놀 형테의 같은 세포독성제이고,
J 는 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 알킬; 치환체가 페닐, 알킬, 또는 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 알킬인 치환체를 갖는 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 알킬이고,
Y 는 OH, NH2, NHR, 또는 SH 이며, 이때 R 은 -OH, 클로로, 플루오로, 브로모, 요오드, -SO3, 아릴, -SH, -(CO)H, -(CO)OH, 에스테르기, 에테르기, -CO-, 시아노, 에폭시드기 및 하나 이상의 헤테로원자로 구성되는 군으로 부터 선택된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐이고,
R13-14는 동일하거나 상이하나 둘다 H 는 아니며, H, 또는 2-22 개 탄소 원자를 갖는 알킬, 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 알킬, 시클로 알킬디올, 모노시클릭 방향족, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬 카르복실레이트, 알킬암모늄 또는 알켄이다.
합텐
하기 구조식을 갖는 화합물 A4b 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 X' 은 화합물 A4a 화합물의 유사체이며, X' 은 임의로 연결 단백질에 연결되고,
B 는 O, S, NH, 또는 CH2이고,
D' 은 임의의 입체 화학을 갖는 P(O), COH 이며, D' 이 COH 이면, B 및 Y' 은 CH2이고,
Y' 은 O, NH, NR, S 또는 CH2이며, 이때 R 은 -OH, 클로로, 플루오로, 브로모, 요오도, -O3, 아릴, -SH, -(CO)H, -(CO)OH, 에스테르기, 에테르기, -CO-, 시아노, 에폭시드기 및 하나 이상의 헤테로원자로 구성되는 군으로 부터 선택된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환된 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고,
J 는 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 알킬, 치환체가 페닐, 알킬, 또는 헤테로원자인 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 알킬이고,
운반 단백질에 임의로 연결되는 R13'-14'은 동일하거나 상이하며 이들 중 적어도 둘 모두가 H 는 아니며, H, 또는 2-22 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 헤테로 원자를 갖는 알킬, 시클로알킬디올, 모노시클릭 방향족, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄 또는 알켄이다.
아미다제 촉매 작용
아미다제-유사 촉매 작용에 의해 활성화되는 본 발명에 따른 신규한 화합물은 하기 구조식의 화합물을 포함한다 :
B. 아미다제 반응에 의한 선규 약제 활성화
1. 방향족 또는 치환된 방향족 아미드, 예컨대, 벤조에이트 또는 치환된 벤조에이트 아미드
방향족 또는 치환된 방향족 아미드 선구약제
하기 구조식을 갖는 방향족 아미드 Bla 가 본 발명에 포함된다 :
식에서 X 는 약제 XNH2의 라디칼이다. 유리하게, XNH2는 독소루비신 또는 멜팔란과 같은 세포독성제이다.
R15, R16, R17, R18및 R19는 동일하거나 상이하며, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록시, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 또는 알킬암모늄이다.
합텐
하기 구조식을 갖는 화합물 B1b 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 X' 은 화합물 Bla 의 X 의 유사체이며, X' 은 임의로 운반 단백질에 연결되고,
B 는 O, S, NH, 또는 CH2, 이고,
D 는 임의의 입체화학을 갖는 P(O)OH, SO2, CHOH 또는 SO 이고, D 가 CHOH 이면 B 는 CH2이고, 및
R15', R16', R17', R18'및 R19'은 동일하거나 상이하며, 임의로 운반 단백질에 연결되고, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록시, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬 설포네이트, 알킬카르복실레이트, 또는 알킬암모늄이다.
2. 아미드 카르보닐상의 분자 내 친핵 공격에 의해 활성화되는 방향족 또는 치환된 방향족 아미드
방향족 또는 치환된 방향족 아미드 선구약제
하기 구조식을 갖는 방향족 아미드 화합물 B2a 가 본 발명에 포함된다 :
식에서 X 는 약제 XNH2의 라디칼이다. 유리하게, XNH2는 독소루비신 또는 멜팔란과 같은 세포독성약제이다.
J 는 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 알킬, 치환체가 페닐, 알킬, 또는 헤테로원자를 갖는 알킬인 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 헤테로원자를 갖는알킬이고,
Y 는 OH, NH2, NHR 또는 SH 이며, R 이 -OH, 클로로, 플루오로, 브로모, 요오도, -SO3, 아릴, -SH, -(CO)H, -(CO)OH, 에스테르기, 에테르기, -CO-, 시아노, 에폭시드기 및 헤테로원자로 구성되는 군으로 부터 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 그리고
R20, R21, R22및 R23는 동일하거나 상이하며, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록시, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 또는 알킬암모늄이다.
합텐
하기 구조식을 갖는 화합물 B2b 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 X' 은 화합물 B2a 의 약제 XNH2의 유사체이며, X' 은 운반 단백질에 임의로 연결되고,
B 는 O, S, NH 또는 CH2이고,
D' 은 임의의 입체 화학을 갖는 P(O), COH 이고, D' 이 COH 이면 B 및 Y' 은 CH2이고,
Y' 은 O, NH, NR, S 또는 CH2이며, 이때 R 은 -OH, 클로로, 플루오로, 브로모, 요오도, -SO3, 아릴, -SH, -(CO)H, -(CO)OH, 에스테르기, 에테르기, -CO-, 시아노, 에폭시드기 및 헤테로 원자로 구성되는 군으로 부터 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 그리고
J 는 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 알킬, 치환체가 페닐, 알킬, 또는 헤테로원자를 갖는 알킬인 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 헤테로원자를 갖는 알킬이고, 그리고;
R20', R21', R22'및 R23'은 동일하거나 상이하며, 임의로 운반 단백질에 연결되며, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록시, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 또는 알킬암모늄이다.
3. 포르밀아미드
포르밀아미드 선구 약제
하기 구조식을 갖는 포르밀아미드 화합물 B3a 가 본 발명에 포함된다 :
식에서 X 는 약제 XNH2의 라디칼이다. 유리하게, XNH2는 독소루비신 또는 멜팔란과 같은 세포독성 약제이다.
합텐
하기 구조식을 갖는 화합물 B3b 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 X' 은 화합물 B3a 의 X 의 유사체이며, X' 은 임의로 운반 단백질에 연결되고,
B 는 O, S, NH, 또는 CH2이고, 그리고
D" 은 HP(O)OH, CH2OH, P(O)(OH)2, 또는 SO3H 이며, D" 이 CH2OH 이면 B 는 CH2이다.
4. 아세틸아미드
아세틸아미드 선구약제
하기 구조식을 갖는 아세틸아미드 화합물 B4a 가 본 발명에 포함된다.
식에서 X 는 약제 XNH2의 라디칼이다. 유리하게, NH2는 독소루비신 또는 멜팔란과 같은 세포독성 약제이다.
R24, R25및 R26은 동일하거나 상이하며, H, 2-22 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 헤테로원자를 갖는 알킬, 시클로알킬디올, 모노시클릭지방족, 알킬 포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄 또는 알켄이다.
합텐
하기 구조식을 갖는 화합물 B4b 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 X' 은 화합물 B4a 의 X의 유사체이며, X' 은 임의로 운반 단백질에 연결되고,
B 는 O, S, NH, 또는 CH2이고,
D 는 임의의 입체 화학을 갖는 P(O)OH, SO2, CHOH 또는 SO 이며, D가 CHOH 이면 B 는 CH2이고, 그리고
운반 단백질에 임의로 연결되는 R24'-26'은 동일하거나 상이하며, H, 2-22 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 헤테로원자를 갖는 알킬, 시클로알킬디올, 모노시클릭 방향족, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄 또는 알켄이다.
5. 아미드 카르보닐상의 분자내 친핵 공격에 의해 활성화되는 아세틸아미드
아세틸아미드 선구약제
하기 구조식을 갖는 아세틸아미드 화합물 B5a 가 본 발명에 포함된다 :
식에서 X 는 약제 XNH2의 라디칼이다. 유리하게, XNH2는 독소루비신 또는 멜팔란과 같은 세포독성 약제이다.
J 는 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 알킬, 치환체가 페닐, 알킬 또는 헤테로원자를 갖는 알킬인 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 헤테로 원자를 갖는 알킬이고,
Y 는 OH, NH2, NHR 또는 SH 이며, 이때 R 은 -OH, 클로로, 플루오로, 브로모, 요오도, -SO3, 아릴, -SH, -(CO)H, -(CO)OH, 에스테르기, 에테르기, -CO-, 시아노, 에폭시드기 및 헤테로원자로 구성되는 군으로 부터 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고,
R27-28은 동일하거나 상이하며, H, 2-22 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 헤테로원자를 갖는 알킬, 시클로알킬디올, 모노시클릭 방향족, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄 또는 알켄이다.
합텐
하기 구조식을 갖는 화합물 B5b 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 X'은 화합물 B5a 의 X 의 유사체이며, X' 은 임의로 운반 단백질에 연결되고,
B 는 O, S, NH, 또는 CH2이고,
D' 은 임의의 입체 화학을 갖는 P(O), COH 이며, D' 이 COH 이면 B 및 Y' 은 CH2이고,
Y' 은 O, NH, NR, S 또는 CH 이며, 이때 R 은 -OH, 클로로, 플루오로, 브로모, 요오도, -SO3, 아릴, -SH, -(CO)H, -(CO)OH, 에스테르기, 에테르기, -CO-, 시아노, 에폭시드기 및 헤테로원자로 구성되는 군으로 부터 선택된 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고,
J 는 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 알킬, 치환체가 페닐, 알킬, 또는 헤테로원자를 갖는 알킬인 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 헤테로원자를 갖는 알킬이고, 및
운반 단백질에 임의로 연결되는 R27'-28'은 동일하거나 상이하며, H, 2-22 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 헤테로원자를 갖는 알킬, 시클로알킬디올, 모노시클릭 방향족, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄 또는 알켄이다.
6. 모노박탐 가수분해
β-락타마제 항체를 생성하기 위한 합텐 계획의 개관
모노시클릭 β-락탐("모노박탐") 가수분해가 가능한 항체를 유도하기 위해 면역화를 위한 계획을 고안하고 합텐을 제조하는 것이 필요하다. 몇가지 가능한 계획이 아래에 제시된다.
화합물 1 의 계획은 β-락탐 고리가 시클로부탄올로 대체되었다는데 있어서 (예, 이차 알콜이 β-락탐 카르보닐을 대체함) β-락탐 기질과 다르다. 알콜 전이 상태 유사체는 성공적으로 고안되었고 효소학에서 전이 상태 저해제로서 잘 알려져 있으며(Bollis, G. 일동, J. Med. Chem. 30 (1987) : 1729-37) 가수분해성 촉매 항체를 생성하는데 사용되었다 (Shokat, K. M. 일동, CHem. Int. Ed. Engl. 29*1990) : 1296-1303).
화합물 2 의 계획은 β-락탐 고리에 메틸렌기를 첨가하여 γ-락탐 고리를 형성함을 포함한다. 고리 크기의 차이(4- 내지 5-원) 때문에, 카르보닐의 결합각이그 각각의 고리에 대해 다를 것이다. γ-락탐의 카르보닐은 β-락탐 카르보닐 보다 고리 (사면체 이상) 평면에서 더 나와 있을 것이다 (Baldwin, J. E. 일동, Tetrahedron 42(1986) : 4879). 이 차이는 β-락탐의 γ-락탐-유도된 항체로의 기질 불안정화를 유발하여 촉매 작용에 기여할 것이다.
비 시클릭 합텐 3 은 γ 락타마제 활성을 갖는 항체를 유도하기 위해 기질 불안정화 및 전이 상태 상보성의 조합을 이용한다. 이 또는 유사한 화합물은 전단가능한 결합이 전이상태-유사 디알킬포스피네이트(여기 제시됨), 또는 유사한 인(phosphorous)-기재 기에 의해 대체되었다는데 있어서 γ-락탐의 선형 유사체일 것이다. 따라서, 이 계획에서는 전이상태 유사성 및 기저상태 불안정화의 조합이 있다.
모든 계획에서, 치환체의 구조는 KLH 또는 BSA 를 포함하나 이에 제한되지 않는 면역원성 운반 단백질에 대한 약제 (R" 가짐) 접합 (R, R', 또는 R" 을 통함) 및 스크리닝 돌연변이체에 사용된 항생제의 구조(R 및 R")에 좌우될 것이다.
모노락탐 선구약제
하기 구조식을 가지는 모노락탐 과합물 B6a 가 본 발명에 포함된다 :
식에서 R30및 R31중 적어도 하나는 OX 이며, 이때 X 는 약제 XOH 의 라디칼이다. 유리하게, XOH 는 항신생물 누클레오시드 유사체(알도스 고리의 3' 및/또는5' 산소의 β-락탐 부분에 연결됨), 독소루비신, 또는 알도포스파이드의 에놀 형태와 같은 세포독성 약제이다.
OX 가 아닌 R29-33은 동일하거나 상이하며, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알케닐, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체(헤테로시클릭 또는 페닐기에 임의로 치환됨)를 갖거나 갖지 않는 카르복시알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬아미노, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 아미노알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체(헤테로시클릭 또는 페닐기 상에 임의로 치환됨)를 갖거나 갖지 않는 아실옥시, 또는 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체(헤테로시클릭 또는 페닐기 상에 임의로 치환됨)를 갖거나 갖지 않는 아실아미노이고, 그리고
R29는 임의로 SO3H 또는 SO4H 이다.
합텐
하기 구조식을 갖는 화합물 B6b 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 R30'및 R31'중 적어도 하나는 화합물 B6a 의 X 의 유사체이며, 상기 유사체는 임의로 운반 단백질에 연결되고,
D??은 임의의 입체화학을 갖는 SO2, SO 또는 CHOH 이며, D?? 이 CHOH 이면 Z' 는 CH이고,
Z' 은 O, N, 또는 임의의 입체화학을 갖는 CH 이며; Z' 이 0 이면 R29'은 생략되고,
상기 유사체가 아닌 R29'-33'은 동일하거나 상이하며, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알케닐, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체(헤테로시클릭 또는 페닐기 상에 임의로 치환됨)를 갖거나 갖지 않는 카르복시알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬아미노, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 아미노알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체(헤테로시클릭 또는 페닐기 상에 임의로 치환됨)를 갖거나 갖지 않는 아실옥시, 또는 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체(헤테로시클릭 또는 페닐기 상에 임의로 치환됨)를 갖거나 갖지 않는 아실아미노이고, 그리고
R29'은 임의로 SO3H 또는 SO4H 이고, 그리고
R29'-33'은 임의로 운반 단백질에 연결된다.
모노락탐 선구 약제
하기 구조식을 갖는 모노락탐 화합물 B6c 가 본 발명에 포함된다.
식에서 X 는 약제 XOH 의 라디칼이다. 유리하게, XOH 는 항신생물 누클레오시드 유사체(알도스 고리의 3' 및/또는 5' 위치의 카르복실 부분에 결합됨), 독소루비신 또는 알도포스파미드의 에놀 형태와 같은 세포독성 약제이다.
R34, R35, R36, 및 R37은 동일하거나 상이하며, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 모노시클릭, 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록시, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 또는 알킬암모늄이고,
n 은 0 내지 3 의 정수이고,
E 는 임의로 존재하며 산소, 카르보닐옥시, 또는 옥시카르보닐이고,
A 는 라디칼 :
이며,
이때, R38, R39, R40, R41또는 R42는 E 에 대한 부착 부위이거나, E 가 존재하지 않으면 [CH2]n에 대한 부착 부위이거나, E 가 존재하지 않고 n=0 이면 페닐 고리에 대한 부착 부위이다.
R38, R39, R40, R41및 R42는 동일하거나 상이하며, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알케닐, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체(헤테로시클릭 또는 페닐기 상에 임의로 치환됨)를 갖거나 갖지 않는 카르복시알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬아미노, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 아미노알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체(헤테로시클릭 또는 페닐기 상에 임의로 치환됨)를 갖거나 갖지 않는 아실옥시, 또는 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체(헤테로시클릭 또는 페닐기 상에 임의로 치환됨)를 갖거나 갖지 않는 아실아미노이고, 그리고
R38은 임의로 SO3H 또는 SO4H 이다.
합텐
하기 구조식을 갖는 화합물 B6d 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 X' 은 화합물 B6c 의 X 의 유사체이며, 임의로 운반 단백질에 연결되고,
B 는 O, S, NH, 또는 CH2이고,
R34', R35', R36'및 R37'은 동일하거나 상이하며, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록시, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬 카르복실레이트, 또는 알킬암모늄이며, 단 R34'-37'중 적어도 하나는 H 가 아니고,
R34', R35', R36'또는 R37'은 임의로 운반 단백질에 대한 부착 부위이고,
n 은 0-3 의 정수이고,
E' 은 임의로 존재하며 CH2, O, 카르보닐옥시, 카르보닐 메틸렌, 옥시카르보닐, 또는 메틸카르보닐이고,
A' 은 하기 라디칼 :
이며,
이때 D?? 은 임의의 입체 화학을 갖는 SO2, SO 또는 CHOH 이며, D??이 CHOH 이면 Z' 은 CH 이고,
Z' 은 O, N, 또는 임의의 입체 화학을 갖는 CH 이고, Z' 이 O 이면 R38'은생략되고, 그리고
R38', R39', R40', R41'및 R42'은 동일하거나 상이하며, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알케닐, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체(헤테로시클릭 또는 페닐기 상에 임의로 치환됨)를 갖거나 갖지 않는 카르복시알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬아미노, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 아미노알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체(헤테로시클릭 또는 페닐기 상에 임의로 치환됨)를 갖거나 갖지 않는 아실옥시, 또는 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체(헤테로시클릭 또는 페닐기 상에 임의로 치환됨)를 갖거나 갖지 않는 아실아미노이고,
R38'은 임의로 SO3H 또는 SO4H 이다.
모노락탐 이 또는 삼-치환된 아세테이트 선구 약제
하기 구조식을 갖는 모노락탐 화합물 B6e 가 본 발명에 포함된다 :
X 는 약제 XOH 의 라디칼이다. 유리하게, XOH 는 항신생물 누클레오시드 유사체(알도스 고리의 3' 및/또는 5' 위치의 카르복실 부분에 연결됨), 독소루비신, 또는 알도포스파미드의 에놀 형태와 같은 세포독성 약제이고,
n 은 0 내지 4의 정수이고,
R43및 R44는 동일하거나 상이하나 둘다 H 는 아니며, 2 내지 22 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 헤테로원자를 갖는 알킬, 시클로알킬디올, 모노시클릭 방향족, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄 또는 알켄이고,
E 는 임의로 존재하며 산소, 카르보닐옥시, 또는 옥시카르보닐이고,
A 는 하기 라디칼 :
이며,
이때 R38, R39, R40, R41또는 R42는 E 에 대한 부착 부위이거나, E 가 존재하지 않으면 (CH2)n에 대한 부착 부위이거나, E 가 존재하지 않고 n=0 이면 R43및 R44가 부착되는 탄소 원자에 대한 부착 부위이고,
R38, R39, R40, R41및 R42는 동일하거나 상이하며 H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알케닐, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로 시클릭 또는 페닐 치환체(임의로 헤테로시클릭 또는 페닐기 상에 치환됨)를 갖거나 갖지 않는 카르복시알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬아미노, 1-10 개의 탄소 원자를 가지는아미노알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로시클릭 도는 페닐 치환체(헤테로시클릭 또는 페닐기 상에 임의로 치환됨)를 갖거나 갖지 않는 아실옥시, 또는 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 아실아미노(헤테로시클릭 또는 페닐기 상에 임의로 치환됨)이고, 그리고
R38은 임의로 SO3H 또는 SO4H 이다.
합텐
하기 구조식을 갖는 화합물 B6f 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 X' 은 화합물 B6e 의 X 의 유사체이며, X' 은 임의로 운반 단백질에 연결되고,
B 는 O, S, NH, 또는 CH2이고,
n 은 0 내지 4 의 정수이고,
R43'및 R44'은 동일하거나 상이하나 둘다 H 는 아니며, 2-22 개의 탄소 원자를 알킬, 헤테로원자를 갖는 알킬, 시클로알킬디올, 모노시클릭 방향족, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄 또는 알켄이고,
E' 은 임의로 존재하며 CH2, O, 카르보닐옥시, 카르보닐메틸렌, 옥시카르보닐, 또는 메틸렌카르보닐이고,
A' 은 하기 라디칼이다 :
식에서 D'''은 임의의 입체 화학을 갖는 SO2, SO 또는 CHOH 이며, D'''이 CHOH 이면 Z' 은 CH 이고,
Z' 은 O, N, 또는 임의의 입체 화학을 갖는 CH 이며, Z'이 O 이면 R38'은 생략되고,
R38', R39', R40', R41'또는 R42'은 E' 에 대한 부착 부위이거나 E' 이 존재하지 않으면 (CH2)n에 대한 부착 부위이거나, E' 이 존재하지 않고 n=0 이면 R34'및 R44'이 부착되는 탄소 원자에 대한 부착 부위이고,
R38', R39', R40', R41'및 R42'은 동일하거나 상이하며, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알케닐, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체(헤테로시클릭 또는 페닐기 상에 임의로 치환됨)를 갖거나 갖지 않는 카르복시알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬아미노, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 아미노알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체(헤테로시클릭 또는 페닐기 상에 임의로 치환됨)를 갖는 아실옥시, 또는 1-10 개의 탄소 원자를 가지며 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체(헤테로시클릭 또는 페닐기 상에 임의로 치환됨)를 갖거나 갖지 않는 아실아미노이고, 그리고
R38'은 임의로 SO3H 또는 SO4H 이다.
아세탈 가수분해 효소 촉매 작용
아세탈 가수분해 효소 또는 오르토-에스테르 가수분해 효소 촉매 작용에 의해 활성화되는 본 발명에 따른 신규한 화합물들은 하기 일반식의 화합물들을 포함한다 :
C. 아세탈 가수분해 반응에 의한 선구 약제 활성화
1. 디알킬 아세탈
디알킬 아세탈 선구 약제
하기 구조식을 갖는 알킬 아세탈 화합물 C1a 가 본 발명에 포함된다 :
식에서 X 는 약제 XQH 의 라디칼이다. 유리하게 XQH 는 누클레오시드 유사체 또는 포스포아미드 머스타드 [HOP(O)(NH2)N(CH2CH2Cl)2], 멜팔란 또는 독소루비신과 같은 세포독성 약제이다.
식에서 Q 는 O 또는 NH 이고, 그리고
R45및 R46은 동일하거나 상이하며, 치환되지 않은 알킬 ; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이다.
이 화합물은 알도포스파미드 디에틸아세탈이 아니다. 그러나 알도포스파미드 디에틸아세탈은 본 발명의 촉매 항체를 이용하는 치료 방법에 유용하다.
합텐 1
하기 구조식을 갖는 화합물 C1b 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 Q' 은 Q, S, NH, 또는 CH2이고,
X' 은 화합물 Cla 의 X 의 유사체이며, X' 은 임의로 운반 단백질에 연결되고,
B' 은 NH 또는 CH2이며, B' 이 NH 이면 Q' 은 CH2이고, 그리고
R45'및 R46'은 동일하거나 상이하며, H ; 치환되지 않은 알킬, 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
합텐 2
하기 구조식을 갖는 화합물 C1c 이 합텐 및 선구약제로서 유용하다 :
식에서 R45'및 R46'은 동일하거나 상이하며, H ; 치환되지 않은 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
합텐 3
하기 구조식을 갖는 화합물 C1d 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 Q' 은 O, S, NH, 또는 CH2이고,
X' 은 화합물 C1a 의 X 의 유사체이며, X' 은 임의로 운반 단백질에 연결되고,
R45'및 R46'은 동일하거나 상이하며, H ; 치환되지 않은 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
합텐 4
하기 구조식을 갖는 화합물 C1e 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 R45'및 R46'은 동일하거나 상이하며, H ; 치환되지 않은 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
합텐 5
하기 구조식을 갖는 화합물 C1f 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 X' 은 화합물 C1a 의 X 의 유사체이고;
식에서 E 및 E' 은 동일하거나 상이하며 N, C, O 또는 S 이다.
식에서 R45"은 H; 아미노카르복시; 치환되지 않은 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
R45"에 연결된 E 가 N 이면 E-R45"연결은 아민 부분으로 치환된 아미드를 형성하는 것이 바람직하다.
2. 오르토 에스테르
오르토 에스테르 선구 약제
하기 구조식을 갖는 오르토에스테르 화합물 C2a 가 본 발명에 포함된다 :
식에서 X 는 약제 XOH 의 라디칼이다. 유리하게, XOH 는 누클레오시드 유사체 또는 독소루비신 또는 알도포스파미드의 에놀 형태와 같은 세포독성 약제이다.
R47, R48, 및 R49는 동일하거나 상이하며, 치환되지 않은 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이고,
R49는 임의로 H 이다.
합텐 1
하기 구조식을 갖는 화합물 C2b 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 X' 은 화합물 C2a 의 X 의 유사체이며, 임의로 운반 단백질에 연결되고,
Q' 은 O, CH2, S, 또는 NH 이고,
R47'및 R48'은 동일하거나 상이하며, H; 치환되지 않을 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
합텐 2
하기 구조식을 갖는 화합물 C2c 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 R47', R48', 및 R49'은 동일하거나 상이하며, H; 치환되지 않은 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
합텐 3
하기 구조식을 갖는 화합물 C2d 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 X' 은 화합물 C2a 의 X 의 유사체이며, 임의로 운반 단백질에 연결되고,
Q' 은 CH2이고, 및
R47'및 R48'은 동일하거나 상이하며, H; 치환되지 않은 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
합텐 4
하기 구조식을 갖는 화합물 C2e 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 R47'및 R48'은 동일하거나 상이하며, H; 치환되지 않은 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
3. 디올 아세탈, 예컨대, 당-치환된 아세탈
디올 아세탈 선구 약제
하기 구조식을 갖는 디올 아세탈 화합물 C3a 가 본 발명에 포함된다 :
식에서 X 는 약제 XQH 의 라디칼이다. 유리하게, XQH 는 누클레오시드 유사체 또는 포스포아미드 머스타드 [HOP(O)(NH2)N(CH2CH2Cl)2], 멜팔란 또는 독소루비신과 같은 세포독성 약제이다.
Q 는 O 또는 NH 이고, 그리고
R50및 R51은 동일하거나 상이하며, H; 치환되지 않은 알킬; 할로겐, 헤테로 원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트 또는 알킬 에스테르 또는 알킬 아미드, 히드록실, 알킬암모늄, 아미노, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이다. 유리하게, R50및 R51은 시스이고 동일하여 분자의 아세탈 부분내에 대칭의 거울면이 있으며 이성질체의 수가 최소화된다.
합텐 1
하기 구조식을 갖는 화합물 C3b 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 R50'및 R51'은 동일하거나 상이하며, H; 치환되지 않은 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트 또는 알킬 에스테르 또는 알킬 아미드, 히드록실, 알킬암모늄, 아미노, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
합텐 2
하기 구조식을 갖는 화합물 C3c 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 Q' 은 O, S, NH 또는 CH2이고,
X' 은 화합물 C3a 의 X 의 유사체이며, X' 은 임의로 운반 단백질에 연결되고,
B' 은 NH 또는 CH2이며, B' 이 NH 이면 Q' 은 CH2이고,
R50'및 R51'은 동일하거나 상이하며, H; 치환되지 않은 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트 또는 알킬 에스테르 또는 알킬 아미드, 히드록실, 알킬암모늄, 아미노, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
합텐 3
하기 구조식을 갖는 화합물 C3d 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 Q' 은 O, S, NH 또는 CH2이고,
X' 은 화합물 C3a 의 X 의 유사체이며, X' 은 운반 단백질에 임의로 연결되고,
R50'및 R51'은 동일하거나 상이하며, H; 치환되지 않은 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트 또는 알킬 에스테르 또는 알킬 아미드, 히드록실, 알킬암모늄, 아미노, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
합텐 4
하기 구조식을 갖는 화합물 C3e 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 R50'및 R51'은 동일하거나 상이하며, H; 치환되지 않은 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트 또는 알킬 에스테르 또는 알킬 아미드, 히드록실, 알킬 암모늄, 아미노, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
당 아세탈 선구 약제
하기 구조식을 갖는 디올 아세탈 화합물 C3f 가 본 발명에 포함된다 :
식에서 X 는 약제 XQH 의 라디칼이다. 유리하게, XQH 는 누클레오시드 유사체 또는 포스포아미드 머스타제 [HOP(O)(NH2)N(CH2CH2Cl)2], 멜팔란 또는 독소루비신과 같은 세포독성 약제이다.
Q 는 O 또는 NH 이고,
G 는 디올 G(OH)2의 라디칼로서, 이때 G(OH)2는 당, 시클로 알킬디올 또는 오르토페닐디올이며, G 는 임의로 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된다.
상기의 예는 하기와 같다 :
염기 = 우라실, 5-플루오로우라실, 시토신, 아데닌, 구아닌
R = H, PO3H2
당 아세탈 합텐 1
하기 구조식을 화합물 C3g 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 Q' 은 O, S, NH 또는 CH2이고,
X' 은 화합물 C3f 의 X의 유사체이며, X' 은 임의로 운반 단백질에 연결되고,
B' 은 NH 또는 CH2이며, B' 이 NH 이면 Q' 은 CH2이고,
G' 은 디올 G(OH)2의 라디칼로서, 이때 G(OH)2는 당, 시클로알킬 디올 또는 오르토-페닐디올이며, G' 은 임의로 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환되며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
상기의 예는 하기와 같다 :
염기 = 우라실, 5-플루오로우라실, 시토신, 아데닌, 구아닌
R = H, PO3H2
당 아세탈 합텐 2
하기 구조식을 갖는 화합물 C3h 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
G' 은 디올 G(OH)2의 라디칼로서, 이때 G(O)H)2는 당, 시클로알킬디올 또는 오르토페닐디올이며, G' 은 임의로 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환되며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
상기의 예는 하기와 같다 :
염기 = 우라실, 5-플루오로우라실, 시토신, 아데닌, 구아닌
또는 이들의 유사체
R = H, PO3H2
당 아세탈 합텐 3
하기 구조식을 갖는 화합물 C3i 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 Q' 은 O, S, NH 또는 CH2이고,
X' 은 화합물 C3f 의 X 의 유사체이며, 임의로 운반 단백질에 연결되고,
G' 은 디올 G(OH)2의 라디칼로서, 이때, G(OH)2는 당, 시클로 알킬디올 또는 오르토페닐디올이며, G' 은 임의로 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환되며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
상기의 예는 하기와 같다 :
염기 = 우라실, 5-플루오로우라실, 시토신, 아데닌, 구아닌
또는 이들의 유사체
R = H, PO3H2
당 아세탈 합텐 4
하기 구조식을 갖는 화합물 C3j 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
G' 은 디올 G(OH)2의 라디칼로서, 이때, G(OH)2는 당, 시클로 알킬디올 또는 오르토페닐디올이며, G' 은 임의로 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환되며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
상기의 예는 하기와 같다 :
염기 = 우라실, 5-플루오로우라실, 시토신, 아데닌, 구아닌
또는 이들의 유사체
R = H, PO3H2
4. 디올 오르토 에스테르
디올 오르토에스테르 선구 약제
하기 구조식을 갖는 디올 오르토에스테르 화합물 C4a 가 본 발명에 포함된다 :
식에서 X 는 약제 XOH 의 라디칼이다. 유리하게, XOH 는 누클레오시드 유사체 또는 독소루비신 또는 알도포스파미드의 에놀 형태와 같은 세포독성 약제이다.
R52, R53및 R54는 동일하거나 상이하며, H; 치환된 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트 또는 알킬 에스테르 또는 알킬 아미드, 히드록실, 알킬암모늄, 아미노, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이다. 유리하게, R52및 R53은 시스이고 동일하여 분자의 시클릭 아세탈 부분 내에 대칭 거울면이 있으며 이성질체의 수가 최소화된다.
디올 오르토에스테르 합텐 1
하기 구조식을 갖는 화합물 C4b 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 R52', R53', R54'은 동일하거나 상이하며, H; 치환되지 않을 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트 또는 알킬 에스테르 또는 알킬 아미드, 히드록실, 알킬암모늄, 아미노, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
디올 오르토에스테르 합텐 2
하기 구조식을 갖는 화합물 C4c 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 X' 은 화합물 C4a 의 X 의 유사체이며, 임의로 운반 단백질에 연결되고,
Q' 은 CH2또는 NH 이고, 그리고
R52'및 R53'은 동일하거나 상이하며, H; 치환되지 않은 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트 또는 알킬 에스테르 또는 알킬 아미드, 히드록실, 알킬암모늄, 아미노, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치화나된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
디올 오르토에스테르 합텐 3
하기 구조식을 갖는 화합물 C4d 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 R52', R53'및 R54'은 동일하거나 상이하며, H; 치환되지 않을 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트 또는 알킬 에스테르 또는 알킬 아미드, 히드록실, 알킬암모늄, 아미노, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
디올 오르토에스테르 합텐 4
하기 구조식을 갖는 화합물 C4e 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서, X' 은 화합물 C4a 의 X 의 유사체이며, 임의로 운반 단백질에 연결되고,
Q' 은 CH2이고, 그리고
R52'및 R53'은 동일하거나 상이하며, H; 치환되지 않은 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트 또는 알킬 에스테르 또는 알킬 아미드, 히드록실, 알킬암모늄, 아미노, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
당 오르토에스테르 선구 약제
하기 구조식을 갖는 디올 오르토에스테르 화합물 C4f 가 본 발명에 포함된다 :
식에서 X 는 약제 XOH 의 라디칼이다. 유리하게, XOH 는 누클레오시드 유사체, 알도포스파미드의 예는 형태 또는 독소루비신이다.
G 는 디올 G(OH)2의 라디칼로서, 이때 G(OH)2는 당, 시클로알킬 디올 또는 오트로페닐디올이며, G 는 임의로 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환되고, 그리고
R59는 H; 치환되지 않은 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트 또는 알킬 에스테르 또는 알킬 아미드, 히드록실, 알킬암모늄, 아미노, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이다.
상기의 예는 하기와 같다 :
염기 = 우라실, 5-플루오로우라실, 시토신, 아데닌, 구아닌
또는 이들의 유사체
R = H, PO3H2
당 오르토에스테르 합텐 1
하기 구조식을 갖는 화합물 S4g 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 X' 은 화합물 C4f 의 X 의 유사체이며, 임의로 운반 단백질에 연결되고,
Q' 은 CH2또는 NH 이고,
G' 은 디올 G(OH)2의 라디칼로서, 이때 G(OH)2는 당, 시클로알킬 디올 또는 오르토페닐디올이며, G' 은 임의로 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환되며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
상기의 예는 하기와 같다 :
염기 = 우라실, 5-플루오로우라실, 시토신, 아데닌, 구아닌
또는 이들의 유사체
R = H, PO3R2
당 오르토에스테르 합텐 2
하기 구조식을 갖는 화합물 C4h 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
G' 은 디올 G(OR)2의 라디칼로서, 이때 G(OH)2는 당, 시클로알킬디올 또는 오르토페닐디올이며, G' 은 임의로 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카 르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환되며, 임의로 운반 단백질에 연결되고, 그리고
R59'은 H; 치환되지 않은 알킬; 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 또는 알킬 에스테르 또는 알킬아미드, 히드록실 알킬암모늄, 아미노, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환된 알킬이며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
상기의 예는 하기와 같다 :
염기 = 우라실, F-플루오로우라실, 시토신, 아데닌, 구아닌
또는 이들의 유사체
R = H, PO3H2
당 오르토에스테르 합텐 3
하기 구조식을 갖는 화합물 C4i 가 합텐 및 신구 약제로서 유용하다 :
식에서 X' 은 화합물 C4f 의 X 의 유사체이며, 임의로 운반 단백질에 연결되고,
Q' 은 CH2이고, 및
G' 은 G(OH)2의 라디칼로서, 이때 G(OH)2는 당, 시클로알킬디올 또는 오트로페닐 디올이며, G' 은 임의로 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환되며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
상기의 예는 하기와 같다 :
염기 = 우라실, 5-플루오로우라실, 시토신, 아레닌, 구아닌
또는 이들의 유사체
R = H, PO3H2
당 오르토에스테르 합텐 4
하기 구조식을 갖는 화합물 C4 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
G' 은 디올 G(OH)2의 라디칼로서, 이때 G(OH)2은 당, 시클로알킬 디올 또는 오르토페닐디올이며, G' 은 임의로 할로겐, 헤테로원자, 포스포네이트, 설포네이트, 카르복실레이트, 알킬암모늄, 알켄, 또는 모노시클릭 방향족으로 치환되며, 임의로 운반 단백질에 연결된다.
상기의 예는 하기와 같다 :
염기 = 우라실, F-플루오로우라실, 시토신, 아데닌, 구아닌
또는 이들의 유사체
R = H, PO3H2
글리코시다제 촉매 작용
본 발명에 따른 신규한 화합물은 누클레오티드 유사체의 3' 또는 5' 산소에 아미노 위치를 통해 공유적으로 부착된 단당류 헥소피라노스 또는 헥소푸라노스로 구성되는 항신생물 누클레오시드 유사체(또는 다른 항신생물 제)의 선구 약제로, 특히 상기 헥소피라노스 또는 헥소푸라노스가 글루코스, 글루코사민, D-퀴노브피라노스, 갈락토스, 갈락토사민, L-두코피라노스, L-람노피라노스, D-글루코피라누론산, D-갈락토피라누론산, D-만노피라누론산, 또는 D-요오도피라누론산으로 구성되는 군으로 부터 선택되는 선구 약제이다.
항신생물 누클레오시드 유사체의 글리코실 선구 약제를 위한 합텐은 부착 누클레오시드 산소가 NR1에 의해 대체되고 푸라노스 또는 피라노스 고리의 산소가 NR2에 의해 대체되는 단당류 헥소피라노스 또는 헥소푸라노스 아미딘 유사체로 구성된다. 상기 합텐은 글루코스, 글루코사민, D-퀴노보피라노스, 갈락토스, 갈락토사민, L-갈락토피라누론산, D-만노피라누론산, 또는 D-요오도피라누론산으로 구성되는 군으로 부터 선택되는 당의 구조적 유사체인 단당류 헥소피라노스 또는 헥소푸라노스의 아미딘 유사체를 포함한다.
본 화합물은 하기 구조식의 화합물을 포함한다 :
R2및 R3는 H 또는 OH 이나, 하나만이 OH 일 수 있으며; X, X1, Y, Y1, Z, Z1, R 및 R1은 하기 표에 규정되어 있다.
헥소피라노스 및 누클레오시드로 부터 본 발명의 β-글리코실화 누클레오시드를 제조하기 위한 신규한 커플링 반응은 용매 아세토니트릴 내에서 TMS 트리플레이트, BF3Et2O 등과 같은 루이스산의 존재 하에 과아세틸화 육탄당과 5' 히드록시 누클레오시드의 직접 반응이다. 이 방법은 해당 β-글리코실화된 누클레오시드를 제조하기 위해 하기 나열된 당으로까지 확대될 수 있다.
커플링 반응은 또한, 해당 글리코실화 누클레오시드를 제조하기 위해 SPh, F 또는 이미데이트 기로의 전환에 의한 아노머 위치의 활성화, 및 연속되는 5' 히드록시 누클레오시드와의 반응에 의해 이루어질 수 있다.
X, X1, Y, Y1, Z, Z1, R, R1및 A 는 하기 표에 규정되어 있는 바와 같다.
A = OAc, SPh, F, 이미데이트
당의 명칭 X1 X Y1 Y Z1 Z R R1
글루코스 H OH H OH H OH CH2OH H
글루코사민 H OH H OH H NH2 CH2OH H
D-퀴노보피라노스 H OH H OH H OH CH3 H
갈락토스 OH H H OH H OH CH2OH H
갈락토사민 OH H H OH H NH2 CH2OH H
L-푸코피라노스 OH H H OH H OH CH3 H
L-람노피라노스 H OH H OH H OH CH3 H
헥수론산 :
D 글루코피라누론산 H OH H OH H OH COOH H
D 갈락토피라누론산 OH H H OH H OH COOH H
D 만노피라누론산 H OH H OH OH H COOH H
D 요오도피라누론산 H OH H OH H OH H COOH
푸라노실화된 누클레오시드를 제조하기 위해 그 아노머 위치의 헥소푸라노스의 누클레오시드 5' 위치에 대한 커플링 반응은 상기된 방법에 의해 이루어질 수 있다.
식에서 R2=H 및 R3=OH, 또는 R2=OH 및 R3=H.
누클레오시드에 대한 헥소푸라노스의 커플링은 고리 크기로 인하여 아노머의 혼합물을 제조할 것이다.
D. 글리코시다제 반응에 의한 선구 약제의 활성화
1. 당의 아노머 위치를 통해 약제 히드록실기에 접합된 헥소피라노스 고리
2. 당의 아노미 위치를 통해 약제 히드록실기에 접합된 헥소푸라노스 고리
글리코시다제 선구 약제
하기 구조식을 갖는 화합물 D1a 가 본 발명에 포함된다 :
V-Q-X
식에서 X 는 약제 XQH 의 라디칼이다. 유리하게, XQH 는 누클레오시드 유사체 또는 포스포아미드 머스타드 [HOP(O)(NH2)N(CH2CH2Cl)2], 멜팔란 또는 독소루비신과 같은 세포독성 약제이다.
Q 는 O 또는 NH 이고, 그리고
V 는 임의의 알파 또는 베타 배열을 갖는 당의 아노머 위치를 통해 QX 에 접합된 헥소피라노스 또는 헥소푸라노스이다.
유리하게 V 는 글루코스, 글루코사민, D-퀴노보피라노스, 갈락토스, 갈락토사민, L-푸코피라노스, L-말로피라노스, D-글루코피라누론산, D-갈락토피라누론산, D-만노피라누론산, 또는 D-요오도피라누론산이다.
아미딘 합텐은 촉매 항체를 제조하기 위해 면역 반응을 유도하기 위한 전이-상태 유사체로서 제조된다. 아미딘 합텐은 글리코시드 결합의 가수분해를 위한 전이 상태를 모방한다. 합텐의 소파/의자 구조로 인하여, 이들 합텐에 대해 생성된 항체는 광범위하게 다양한 단당류 헥소피라노스를 분해할 수 있다.
식에서 R2=H 및 R3=OH, 또는 R2=OH 및 R3=H.
합텐의 합성은 용매로서 염화 메틸렌 내 트리에틸옥소늄 테트라플루오로보레이트의 존재 하에 적당한 락탐화 해당 5 아미노 누클레오시드의 커플링 반응에 의해 이루어진다.
글리코시드 결합을 분해하여 약제를 방출하기 위한 갈락토스 또는 동등한 당을 위한 합텐(아미딘 TS 유사체)은 하기 구조식을 갖는다 :
R = 누클레오시드, 당, 또는 임의의 동등한 약제
글리코시다제 합텐 1
하기 구조식을 갖는 화합물 D1b 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 X' 은 화합물 D1a 의 X 의 유사체이며, 임의로 운반 단백질에 연결되고,
Q' 은 NH 이고, 그리고
M' 은 n-펜탄의 1,4-라디칼이며, 이때 C1, C2, C3 및 C5 는 임의로 OH 로 치환되며 M' 은 임의로 운반 단백질에 연결된다.
글리코시다제 합텐 2
하기 구조식을 갖는 화합물 D1c 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
M' 은 n-펜탄의 1,4-라디칼이며, 이때 C1, C2, C3 및 C5 는 임의로 OH 로 치환되며, M' 은 임의로 운반 단백질에 연결된다.
글리코시다제 합텐 3
하기 구조식을 갖는 화합물 D1d 가 합텐 및 선구 약제로서 유용하다 :
식에서 X' 은 화합물 D1a 의 X 의 유사체이며, 임의로 운반 단백질에 연결되고,
Q' 은 CH2이고, 그리고
M' 은 n-펜탄의 1,4-라디칼이며, 이때 C1, C2, C3 및 C5 는 임의로 OH 로 치환되며, M' 은 임의로 운반 단백질에 연결된다.
누클레오시드 유사체의 선구 약제
다수의 세포독성 누클레오시드 유사체가 종종 낮은 안정성의 여지가 있으나 항암제로서의 유용성을 갖는다. 이들 약제의 효과적인 항신생물 약제는 일반적으로 골수 또는 위장 점막과 같은 정상 조직에 대한 이들 독성과 관련된 심각한 부작용을 가질 수 있다.
5-플루오로우라실(5-FU)은 결장 및 직장, 미리 및 목, 간, 유방, 및 췌장의 암과 같은 다양한 충실성 종양에 임상학적 활성을 갖는 주요한 항신생물 약제이다. 5-FU 는 낮은 치료 지수를 갖는다. 투여되는 투여량의 크기는 독성에 의해 제한되어 종양 세포 근처에서 보다 고농도에 이르면 얻어질 가능한 효능을 감소시킨다.
5-FU 는 이의 가능한 세포독성을 나타내기 위해 누클레오티드(예, 플루오로우리딘-또는 플루오로데옥시우리딘-5'-포스페이트) 수준으로 동화되어야 한다. 이들 누클레오티드(5-플루오로우리딘 및 5-플루오로-2'-데옥시우리딘)에 해당하는 누클레오시드 또한 활성 항신생물제이며, 몇몇 모델 시스템에서는 5-FU 보다 실질적으로 더 유효한데, 아마도 이들이 5-FU 보다 더 쉽게 누클레오티드로 전환되기 때문일 것이다.
본 발명의 종양 세포로의 플루오로우리딘의 국부 수송 방법은 최소 전신 노출로 종양 부위(들)에 고농도를 제공하는 잇점을 갖는다. 종양 세포에 의해 즉시 흡수되지 않는 플루오로우리딘의 신속한 이화작용(처음에는 덜 독성인 5-FU 를 형성하기 위하여)을 통해 또다른 정도의 종양 선택성이 얻어진다.
유사하게, 아라비노실시토신(Ara-C)은 백혈병 및 임파종을 치료하는데 광범위하게 사용된다. Ara-C 는 시토신 탈아미노 효소에 의해 신속히 분해되어 불활성 대사물 아라비노실우라실을 생성한다. Ara-C 의 치료적 사용은 골수 억압 또는 위장 점막에 대한 손상과 관련된 부작용을 결과시킨다. 예를 들어 임파종으로의 Ara-C 의 표적 수송은 최소화된 부작용으로 증가된 치료 효능을 결과시킨다.
유사한 논쟁 및 논리적 근거가 플루오로우라실, 아라비노시드, 메트캅토푸린 리보시드, 5-아자-2'-데옥시시리딘, 아라비노실 5-아자시토신, 6-아자우리딘, 아자미빈, 6-아자시미딘, 트리플루오로메틸-2'-데옥시우리딘, 티미딘, 디오구아노신, 3-데아자우리딘을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 항신생물 누클레오시드 유사체에 대해서도 잘 적용된다.
본 발명에서, 항신생물 누클레오시드 유사체의 선구 약제는 알도스 고리의 5' 위치에 적당한 치환체를 부착시키므로써 제조된다. 세포독성 누클레오시드 유사체는 전형적으로 이들의 독성을 나타내기 위해서 포스포릴화되어야 하므로(누클레오티드 유사체의 생성), 이 위치의 치환체는 약제의 독성을 감소시킨다. 5' 위치의 치환체는 또한 누클레오시드-분해 효소 우리딘 포스포릴라제 (우리딘 및 이의 유사체를 분해함) 및 시리딘 탈아미노 효소(시리딘 및 이의 유사체를 분해함)에 안정한 누클레오시드 유사체를 부여한다. 항신생물 누클레오시드 유사체의 알도스고리의 3' 위치 상에 치환체를 갖는 선구 약제는 또한 항신생물 누클레오시드 유사체의 표적 수송에 유용하다.
누클레오시드 유사체 선구 약제 및 합텐의 예는 하기와 같다 :
5-플루오로우리딘-5'-O-2,4,6 트리메틸벤조에이트
5-플루오로우리딘-5'-O-2,4,6 트리메틸벤조에이트에 대한 포스포네이트 합텐
5-플루오로우리딘-5'-O-2,4,6-트리메틸벤조에이트에 대한 설포네이트 합텐
5-플루오로우리딘-5'-O-2,4,6 트리메톡시벤조에이트
5-플루오로우리딘-5'-O-2,4,6 트리메톡시벤조에이트에 대한 포스포네이트 합텐
5-플루오로우리딘-5'-O-2,4,6 트리메톡시벤조에이트에 대한 설포네이트 합텐
2,6-디메톡시벤조에이트
5-플루오로우리딘-5'-O-2,6-디메톡시벤조에이트에 대한 포스포네이트 합텐
5-플루오로우리딘-5'-O-2,6-디메톡시벤조에이트에 대한 설포네이트 합텐
알킬화제의 선구 약제
본 발명은 또한 활성 알킬화제의 국부 수송 및 형성을 위한 신규한 방법 및 화합물을 제공한다.
특정 시클로포스파미드 대사물(예, 4-히드록시시클로포스파미드 또는 알도포스파미드)에 부착된 본 발명의 선구 약제 치환체는 세포독성 생성물로의 효소적 및 화학적 분해를 저해한다. 종양-선택성 시약에 접합된 적당한 단백질 촉매는 선구 약제 이전에 투여되며; 이때 촉매는 선구 약제의 후속 투여 후 종양 세포 부근에 활성 알킬화종을 생성한다.
본 발명은 유방, 자궁내막, 및 폐의 암을 치료하는데, 및 백혈병 및 임파선염을 치료하는데 있어 유용성을 갖는, 임상학적 실습에 가장 광범위하게 사용되는 알킬화제인 시클로포스파미드에 연결되는 선구 약제를 사용한다. 상기와 같은 시클로포스파미드는 불활성이며, 일차적으로 간에서 4-히드록시 시클로포스파미드로 전환된 후, 세포독성 대사물로 더 분해된다. 따라서, 시클로포스파미드 투여 후, 시클로포스파미드의 활성 대사물은 간으로 부터의 방출 후 순환을 통해 전신으로분산되며, 예를 들어 국부 주사에 의해 종양 세포 영역에 국부화될 수는 없다. 시클로포스파미드의 활성 세포독성 대사물은 불안정하거나 매우 독성이므로 직접 투여될 수 없다. 시클로포스파미드 치료의 부작용은 백혈구 감소증, 방광 손상, 및 원형 탈모증을 포함한다. 본 발명은 본 발명의 한 구체예에서 촉매 항체에 의해 활성화되는 세포독성 시클로포스파미드의 적합한 선구 약제를 제공하기 위한 방법 및 화합물을 제공한다.
다른 알킬화제와 연결된 유사한 선구 약제 및 합텐이 본 발명의 범주 내에 있다. 다른 항신생물 알킬화제는 부설판과 같은 알킬 설페이트, 벤조데파 또는 메투라데파와 같은 아지리딘, 카무스틴과 같은 니트로소우레아, 및 클로로암부실, 멜팔란, 이포스파미드 또는 메클로레아민과 같은 질소 머스타드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
알도포스파미드 선구 약제 및 합텐의 예는 하기와 같다 :
알도포스파미드-디에틸아세탈
알도포스파미드-디에틸아세탈에 대한 합텐
알도포스파미드-디에틸아세탈에 대한 합텐
알도포스파미드-디에틸아세탈에 대한 합텐
알도포스파미드의 에놀 형태의 2,4,6-트리메톡시벤조에이트 에스테르
알도포스파미드의 에놀 형태의 2,4,6-트리메톡시벤조에이트 에스테르에 대한 포스포네이트 합텐
멜팔란 선구 약제 및 합텐의 예는 하기와 같다 :
멜팔란-2-히드록시에틸 벤조산 아미드
멜팔란-2-히드록시에틸 벤조산 아미드에 대한 포스포네이트 합텐
다른 항신생물제의 선구 약제
광범위하게 다양한 항신생물제의 선구 약제는 본 발명의 선구 약제 치환체에 대한 이의 접합에 의해 제조된다. 본 발명의 에스테르 또는 글리코실 치환체는 히드록실기를 갖는 약제에 적당하고, 아미드 치환체는 아미노기(특히 일차 아미노기)를 함유하는 약제에 적당하며; 아세탈 치환체는 알데히드기를 함유하는 약제에 적당하다.
독소루비신, 및 다우노루비신 및 에피루비신과 같은 관련된 안트라시클린 항신생물제는 본 발명의 방법을 사용하는 표적 수송에 적합한 약제이다. 이 약제 부류 중 다우노사민 고리 상의 일차 아미노기는 본 발명의 아미드 치환체 중 하나의 부착을 위한 양호한 부위이며, 다우노사민 고리 또는 아글리콘 부분 상의 히드록실기는 본 발명의 에스테르 치환체의 부착에 적합하다. 상기 치환체는 안트라시클린 약제의 세포독성을 감소시키며; 세포독성은 적절히 표적된 촉매 단백질에 의해 종양 부위에서 회복된다.
유사하게, 본 발명의 방법을 사용하는 표적 수송에 적합한 다른 항신생물 약제로는 데모트렉세이트 또는 트리메트렉세이트와 같은 엽산염 길항질; 에토포시드 또는 테니포시드와 같은 포도필린 수지 화합물, 빙크리스틴, 빈블라스틴 또는 빈데신과 같은 빈카 알킬포이드; 탁솔과 같은 두블린 개질제, 닥미노마이신, 및 블레오마이신과 같은 항생물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또한, 정상 조직에 대한 지나친 독성으로 인하여 그 자체가 생체 내에서 항신생물제로 유용하지 않은 세포독성제는 본 발명의 방법 및 선구 약제 치환체를 사용하여 표적 항암제로서 사용할 수 있다. 상기 세포독성 물질은 트리코테신 독소를 포함한다.
독소루비신 선구 약제 및 합텐의 예는 하기와 같다 :
독소루비신-벤조산 아미드
독소루비신-벤조산 아미드에 대한 포스포네이트 합텐
선구 약제를 활성화하고 선구 약제를 표적화하기 위한 촉매 단백질
선구 약제를 활성화시키기 위한 촉매 단백질
적합한 선구 약제의 개발에 의해, 이들 선구 약제의 활성화(즉, 선구 약제의 잔기로 부터 약제의 분해 속도를 증가시킴)를 위한 적당한 촉매 단백질이 이 치료계획에서 선택되어야 한다.
a. 선구 약제를 활성화하기 위한 효소
적당한 촉매 활성을 갖는 효소가 존재하는 경우, 효소 또는 이의 활성 단편은 본 발명의 신규한 선구 약제와 함께 사용될 수 있다. 본 발명 구조 내에 사용된 효소 및 촉매 작용은 글리코시다제, 펩티다제, 리파제(또는 다른 가수분해 효소), 산화 환원 효소, 트랜스퍼라제, 이성화 효소, 라이아제 또는 리가제로 부터 선택된다.
본 발명의 신규한 선구 약제와 사용하기 위한 효소의 예는 하기되어 있다 :
A. 에스테라제 - 약제에 에스테르화된 아실 치환체를 분해한다.
카르복실에스테라제 (E.C. 3.1.1.1)
아릴에스테라제(E.C. 3.1.1.2)
트리아실글리세롤 미파제(E.C. 3.1.1.3)
아세틸 에스테라제(E.C. 3.1.1.6)
갈락토리파제(E.C. 3.1.1.26)
세팔로스포린-C 데아세틸라제(E.C. 3.1.1.41)
6-O-아세틸글루코스 데아세틸라제(E.C. 3.1.1.33)
리파제
B. 아미다제 - 아미노기에 부착된 아실 치환체를 분해한다.
펩티다제(엔도- 및 엑소펩티다제)
β-락타마제(A, B, 및 C 부류) 및 페니실린 아미다제
아세틸로니틴 데아세틸라제(E.C. 3.5.1.16)
아실-라이신데아실라제(E.C. 3.5.1.17)
C. 아세탈 가수분해효소 - 아세틸(또는 오르토에스테르)을 알데히드로 가수분해 한 다.
알케닐-글리세토포스포콜린 가수분해 효소(E.C. 3.3.2.2)
셀룰라제(E.C. 3.2.1.4)
올리고-1,6-글루코시다제(E.C. 3.2.1.10)
리소자임(E.C. 3.2.1.17)
β-D-글루쿠모니다제(E.C. 3.2.1.31)
D. 글리코시다제 - 에테르 연결을 통해 약제에 부착된 당 치환체를 분해한다. 예는 β-갈락토시다제, β-글루코시다제, 이눌라제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아가라제, 및 이성질화 효소를 포함한다. 특별한 예는 하기를 포함한다 :
β-D-글루코시다제(E.C. 3.2.1.21)
α-D-글루코시다제(E.C. 3.2.1.20)
β-D-갈락토시다제(E.C. 3.2.1.22)
α-D-갈락토시다제(E.C. 3.2.1.23)
β-D-프락토푸라노시다제(E.C. 3.2.1.26)
α,α-트레할라제(E.C. 3.2.1.28)
α-L-푸코시다제(E.C. 3.2.1.51)
글리코실세라미다제(E.C. 3.2.1.62)
리아제는 합텐으로도 작용하는 선구 약제와 함께 사용될 수 있다.
중요한 목적은 약제에 대해 노출되는 혈청 또는 다른 신체 부분에 보통 존재하지 않는, 선구 약제를 활성화할 수 있으며 통상의 생리학적 화합물 또는 기대 분자에 상당한 손상을 유발하지 않는 효소 활성을 선택하는 것이다. 선구 약제에 대해 사용하기 위한 효소는 촉매 항체에 대해 하기되는 바와 같은 스크리닝 기술을 사용하여 선택될 수 있다.
b. 선구 약제를 활성화하기 위한 항체
본 발명에 사용된 촉매 항체 또는 이의 활성 단면은 선행 기술의 항체(발명의 배경에서 촉매 항체에 대한 상기 단락 참조) 및 촉매 항체를 제조하기 위한 당 업자에게 알려진 기술로 본 명세서에서 기재된 신규한 합텐을 사용하여 제조된 항체(발명의 신규한 선구 약제 및 합텐으로 표제된 상기 단락 참조)이다. 본원의 참고 문헌으로 포함된 미합중국 특허 제 4,963,355, 4,888,281 및 4,792,446 호를 참조하라.
표적 시약
본 발명의 표적화 및 활성화 화합물의 표적과 성분은 특이적 세포 집단, 예를 들어 종양-관련 항원에 특이적으로 결합하는 임의의 항체 또는 다른 화합물(다른 예는 호르몬, 성장 인자, 기질, 또는 효소 유사체 등을 포함함)의 근처 또는 근처 내에 선택적으로 결합하거나 국부화되는 임의의 약품을 포함한다. 상기 항체의 예는 암종, 흑생종, 임파종, 및 뼈 및 연조직 육종 뿐 아니라 다른 종양에서 발견되는 항원에 특이적으로 결합하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 연장된 기간 동안 세포 표면에 결합되어 있고 매우 느리게 내부 이행되는 항체가 특히 유리하다. 이들 항체는 폴리클로날 또는 유리하게 모노클로날이며, 항체의 활성 결합 영역을 함유하는 항체 분자 또는 단면과 접촉한다.
치료가 요구되는 임의의 숙주 표적 부위로 약제를 수송하기 위해 본 발명에 따르는 시스템이 사용되며, 표적 부위는 하나 이상의 표적 가능 성분, 예를 들어 상기 부위에 대해 실질적으로 고유하며 면역 접합체에 의해 인지되고 결합되는 에피토프를 갖도록 되어 있다. 특별한 표적 부위는 예를 들어 종양, 세균, 진균 또는 바이러스에 의해 유도된 발병 상태로 부터 ; 또는 통상 숙주 시스템의 기능 장애의 결과로, 예를 들어 혈전의 형성과 같은 심장 혈관 질병, 염증성 질병, 및 중추 신경계 질병에서 생긴 균주 내의 상기 영역을 포함한다.
유전학적 클로닝 및 조작 방법의 사용은 효소 또는 촉매 항체를 표적화할 수 있는 시약을 생성하기 위한 가능성을 변혁시켰다. 이는 면역학 분야에서 발생된 방법에 의해 예시되었다.
a. 종양 세포에 결합하는 항체
유리하게, 종양 세포에서 고밀도로 발현되고 종양으로 부터 벗어나지 않는 항원에 결합하는 항체가 본 발명에 사용된다. 이들 필수 조건은 종양 모사(imaging)와 방사선 표지된 모노클로날 항체를 사용하는 처리의 관련 분야에서 사용되는 것과 동일하다.
125I, 131I, 111In, 99mTc, 186Re, 90Y를 포함하는 다양한 방사선 누클리드로표지된 다수의 모노클로날 항체가 종양을 가시화하기 위해 사용되었다. 이 작업은 다양한 종양들이 방사선-면역 섬광도 기술에 의해 성공적으로 가시화될 수 있음을 나타냈다. 성공적으로 표적되는 종양 유형이 하기 표에 나열된다. 나열된 항원에 대한 항체는 예를 들어 선구 약제 활성화를 표적화하는데 유용하다.
종양 유형 조 직 Mab 항 원 참고 문헌
암종 간 전이를갖는 위장 NR-LU-10 40 kD당단백질 Goldrosen, M., 일동,Cancer Research50(1990):7973-7978
선암 위장 및다른 조직 FO23C5 암-배 항원(CEA) Siccardi, A.,Cancer Research50(1990):899s-903s
암종 머리/목및 외음 E48 22 kD 표면항원 내 펩티드에피토프 Gerretsen, M., 일동,British Journal of Cancer63(1991):37-44
암종 후두, 인두및 이하선 CEA Kairemo, K., 일동,Acta Oncoloica29(1990):539-543
암종 간 NP-4 CEA Wang. Z., 일동,Cancer Research50(1990):869s-872s
암종 유방 CEA Kairemo, K., 일동,Acta Oncologica29(1990):533-538
암종 방광 BW 431/26 CEA Boekmann, W., 일동,British Journal of Cancer62(1990):81-84
암종 난소 HMFG1 우유 지방구당단백질(>200kD) Hird, V., 일동,British Journal of Cancer50(1990):48-51
암종 췌장 DU-PAN1 췌장암의50% 로 발현된당단백질 Worlook, A., 일동,Cancer Research50(1990):7246-7251
흑색종 털 없는생쥐 내이종 이식 G7A5 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA).콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸의 Gp 220핵 단백질(250-280 kD) Le Doussal, J. M.,일동,Cancer Research50(1990):3445-3452
흑색종 임파선 225.28S및763.24T HMW-MAA(상이한에피토프) Wahl, R., 일동,Cancer Research50(1990):941s-948s
신경교종 뇌 Williams, J., 일동,Cancer Research50(1990):974s-979s
신경교종 뇌 EGFR1 사람 및 생쥐표피 성장인자수용체의 외부영역 Kalofanos, H., 일동,J. Nuc Med30(1989):1636-1645
H17E2 태반 알칼리성포스파타제(67kD)
생식 세포(정상 피종및 비정상피종) 고환 H17E2 태반 알칼리성포스파타제(67 kD) Pectasides, D.,일동,British Journal of Cancer62 (1990):74-77
몇몇 경우, 항체의 소단편, 예컨대 F(ab')2 의 사용은 종양 부위에서 보다 낮은 실제 항원 농도를 나타낼 때, 종양 모사의 특이성을 증가시켰다 (Worlock, A. 일동,Cancer Research50 (1990):7246-7251; Gerretsen, M. 일동, British Joural of Cancer 63 (1991):37-44). 종양으로 부터 떨어져 나온 항원의 혈청 농도가 상당히 높은 환자에서도 성공적인 모사가 가능했다 (CEA, Boeckmann, W. 일동, Britich Journal of Cancer 62 (1990):81-84).
b. 다른 표적화 단백질
항체의 사용 외에, 촉매 단백질(이는 효소 또는 촉매 항체임)을 작용 부위에 결합시키기 위한 임의의 결합종이 유용하다. 성장 인자가 독소 분자를 수송하기 위해 사용되었다(Siegall 일동,Proc. Natl. Acad. Soi. USA85 (1985) :9738-9742; Chaudhary 일동,Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 (1987) : 4538-4542; Kondo J. 일동,Biol. Chem.263 (1988) : 9470-9473). 성장 인자 인터류킨 6, 인터류킨2, 형질 전환 성장 인자 α, 및 다른 것들을 사용하는 유사 융합물의 생성은 상기 참고 문허에 기재된 방법을 사용하여 효소 또는 에브자임(abzyme)을 연결시키므로써 제조된다. 이들로의 촉매 항체의 도입은 항체 단일 연쇄 유전자 구조물의 말단에 이들 성장 인자를 융합시킴을 통해 이루어지거나(특허 출원 WO 88/01649), 대안적으로는 성장 인자가 상기 유전자 구조물의 전방 말단(유전자의 5' 말단 또는 단백질의 아미노 말단)에 융합된다. 특허 출원 EP A 0,194,276 (Neuberger)에 기재된 바와 같은 구조물의 사용은 또한 촉매 항체 활성과 성장 인자의 결합 성질을 조합시키기 위해 유용하다.
사망 CD4-슈도모나스 외독소 융합체의 사용은 HIV 감염된 세포의 살생에 효과적인 것으로 증명되었다. 효소 또는 촉매 항체에 연결된 CD4 로 부터의 상기 결합 활성의 사용은 AIDS 치료에 대한 선구 약제 치료의 사용을 허용한다. CD4 는 HIV 1 감염된 세포 상에 발현된 gp 120 에 결합한다. 상기 구조물의 전환은 면역 억제 시약 시스템을 개발하기 위해 gp 120-효소(또는 촉매 항체) 융합물을 사용한다 (Moore 일동,Science, 250(1990) : 1139). 본 발명에서 사용 가능한 다른 결합종은 면역 시스템을 조절하기 위해 사용될 수 있는 인태그린족, 예컨대 IAF-1 (Inghirami 일동,Science, 250 (1990) : 682)), 및 종양 및 면역 세포를 표적하기 위해 사용될 수 있는 셀렉션 족, 예컨대 EIAM (Hale 일동,Science, 250 (1990) : 1132)) 등이 있다.
항체는 또한 본 발명의 선구 약제를 특정 혈액 세포 유형에 표적하여 자가 면역 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 더욱이 호르몬을 과생산하는 세포가표적될 수 있다.
이특이적 단백질의 생산
a. 효소 또는 촉매 항체의 표적 단백질에 대한 화학 연결에 의한 이특이적 단백질의 생산
본 발명의 효소는 헤테로이관능가 가교 시약 SPDF (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜티리오)프로프리오네이트) 또는 SMCC (숙신이미딜-4(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트)의 사용과 같은 당 분야에 잘 알려진 기술에 의해 본 발명의 표적 단백질에 공유적으로 결합될 수 있다 [예, Thorpe, P.E. 일동, "The Preparation and Cytotoric Properties of Antibody-Toxin Conjugates"Immunological Rev., 62 (1982): 119-58; Lambert, J.M. 일동, 상기 p. 12038 ; Rowland, C.F. 일동, 상기 pp. 183-84 및 Gallego, J. 일동, 상기 pp. 737-38 참조].
b.재조합 DNA 에 의한 이특이적 단백질의 생산
본 발명의 효소 또는 촉매 항체의 적어도 기능적으로 활성인 부분에 연결된 본 발명의 표적 단백질의 적어도 항원 결합 영역으로 구성되는 융합 단백질은 당 분야에 잘 알려진 재조합 DNA 기술을 사용하여 구조될 수 있다[예, Neuberger, M.S. 일동,Nature312(1984) :604-680 참조]. 이들 융합 단백질은 본 명세서에 기재된 항체-효소 접합체와 필수적으로 동일한 방법으로 적용한다.
재조합 DNA 방법은 포유 동물 개에서 항체 유전자들 발현시키기 위해 사용되어 왔다(Ci, V.T. 일동,Proc. Natl. Acad. Soi. USA80 (1983): 825-829 ;Neuberger, M.S.,EMBO2 (1983) : 1373-1378). 이.콜리로 부터의 생물학적 활성 면역 글로불린 단백질(사람 IgE Fc 단편)의 부가적 발현 및 회수가 입증되었으며(Kenten, J.H. 일동,Proc. Natl. Acad. Sci. USA81 (1984) : 2955-2960), 전체 활성 항체의 발현 및 회수가 입증되었다(Bose, M.A. 일동,Nucleic Acids Res.12 (1984):3791-3799). 이러한 연구는 다른 그룹들에 의하여, 이.콜리에서 면역 글로불린 결합 및 효과 인자 작용 활성 둘다를 생성하기 위한 가능성의 개략을 입증하는 것으로 이어졌다 (Gabilly, s. 일동,Proc. Natl. Acad. Sci. USA81(1984) :3273-3277 ; Skerra, A. 일동,Science240 (1988) : 1038-1040 ; Better, M. 일동,Science240 (1988) : 1041-1043). 이들 기술 및 성능은 또한 많은 다른 유전자의 증식에 적용되었다.
하기는 선구 약제 표적 시약의 예이다. 이들 대부분은 상기된 바와 같은 유전자를 클로닝하고 증식하며 발현시키기 위한 능력에 좌우된다.
상기 개략된 바와 같은 유전학적으로 조작된 항체의 사용은 다양한 선구 약제의 효율성의 신속한 분석을 허용하는 잘 규정되고 재생가능한 시약으로의 경로를 제공한다. 이러한 항체 조작 방법은 중쇄(heavy chain) 유전자가 CH2및 CH3도메인의 제거 후 다양한 유전자의 첨가에 의해 절단되는 유럽 특허 출원 EP A 0,194,276 (Neubergar)에서 예시되어 있다. 원하는 효소 활성의 도입은 이러한 기본 절차를 따른다. 효소 활성의 최적 수준을 이루기 위해, 항체와 효소 사이의 서열의 증식이 필요할 수 있다. 이 최적화를 위해 연결자 서열의 첨가 및/또는 융합부위의 변경이 필요할 수 있다. 또한, 규정된 항체-효소 시약의 잇점에 더하여, IgE 및 Igm 중쇄의 경우 CH2CH3, 및 CH4의 제거에 의해 가능한 감소된 크기가 가치 있을 수 있다.
이특이적인 항체의 생성이 당 분야에 잘 알려져 있다 (Shawler 일동,Immunol.135 (1985) : 1530-1535 ; Kurokawa, T. 일동,Bio/Tecinology7 (1989) : 1163-1167). 상기 이특이적 항체의 관능가의 예는 암 치료에 사용하기 위한 금속 킬레이트에 또한 결합하는 종양 특이적 항체, 및 또한 종양 세포 및 T 세포에 결합하는 이특이적 항체이다 (Johnson, M.J. 일동, 특허 출원 EP 369566A, 1990 ; 및 Cilliland L.K. 일동, 특허 출원 GB 2197323, 1986). 이특이적 항체의 생성 방법은 항체 사슬의 분리 및 재조합의 화학적 방법 또는 두 하이브리도마를 융합하여 소위 콰드로마(quadroma)를 생성하므로써 구성된다. 이러한 방법은 효율적이나 혼합종을 생성하는 경향이 있으며, 원하는 생성물을 단리하기 위해 정제를 요구한다.
보다 작은 결합종의 생성이 항체 조작에서 많은 연구의 목적이 되어 왔다. 이는 단일 사슬 항체의 개발을 결과시켰으며, 이때 두 항체 사슬의 가변(V) 영역은 연결자 서열을 사용하여 단일 분자로 조합된다 (특허 출원 WO 88/01649, Lander 및 Bird). V 영역들의 조합은 아미노 말단의 V 영역 중 하나, 그 아미노 말단으로의 연결자를 통해서 그 CCCH 말단에 부착된 다른 V 영역을 갖는 단백질의 발현을 결과시킨다. V 영역들의 이 머리-꼬리, 머리-꼬리 연결은 V 경쇄- V 중쇄 및 V 중쇄- V 경쇄 배향 둘다로 기재되었다. 이러한 시스템의 이용은 단일 연쇄 항체에 대한다른 단백질의 첨가로 개발되었다 (Vijay 일동,Nature339 (1989) : 394-397). 단일 사슬 항체의 말단에 대한 다른 단백질의 첨가를 위한 이 방식은 이들 구조물에 영향을 미치기 위해 원하는 효소 유전자를 사용하는 유사한 분자의 생성에 사용된다. 이는 치료에 이상적으로 적합한 작은 분자 내에 원하는 항체 결합 성질 및 효소 활성을 갖는 분자의 생성을 결과시킨다.
단일 사슬의 이특이적 분자 또는 동등한 작은 분자로의 두가지 항체 활성의 생성을 조작하기 위해, 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하는 하기 개관을 따른다.
이 구조물은 : 단일 사슬 항체에 대해 기재된 연결자를 통해 종양 세포 또는 항원에 특이적인 (Vijay 일동,Nature399 (1989) : 394-397 ; 특허 출원 WO 88/01649, Ladner 및 Bird ) V 경쇄 영역(VL)에 연결된 V 중쇄 영역(VH)으로 구성되며; 이들 서열은 촉매 항체 VL 에 직접 연결되고, 이는 차례로 연결자 서열을 통해 그 VH 짝에 연결될 것이다. V 영역 조합물은 또한 VL-VH-VH-VL 또는 VL-VH-VL-VH 또는 VH-VL-VH-VL 서열을 따를 수 있다. 이들 구조물에 사용되는 연결자 서열은 단일 연쇄 항체 구조물에 대해 상기된 것들이다. 이 조합은 미리 공지되어 있지 않은 단일 연쇄 이특이적 항체의 발현을 허용한다. 상기 분자는 다른 방법에 당면한 정제화 및 특성화 문제점 없이 다량의 상기 이특이적 활성의 생성을 허용한다. 이 분자는 또한 상기 시약에 대해 바람직한 저분자량을 갖는다. 유사한 구조물에 기초한 다른 종들은 하기되는 바와 같은 미리 공지되어 있지 않은 분자를 기제한다. 종양 또는 항원에 특이적인 VH 영역이 촉매 항체의 VL 영역에 직접 연결되며; 이 분자는 유리하게 따로 발현되거나, 촉매 항체의 VH 에 직접 연결된 종양 또는 항원에 특이적인 다른 VL 구조물과 함께 발현된다. 이들 두 분자의 발현 생성물은 함께, 또는 후 발현 혼합에 의해, 회합하여 이특이적 항체를 형성한다. V 영역들의 다른 조합이 유사한 분자를 결과시킨다. 이 분자종은 보다 저분자량을 가지므로 상기 분자 보다 유리하다. 단일 도메인 결합 단백질의 사용은 또한 효소 또는 촉매 항체에 대한 직접 융합물 형태로 조사하는데 있어 가치가 있다(특허 출원 WO 90/05144, 겨울).
항체의 인간화
항체 및 다른 시약의 인간화는 면역 반응을 감소시킨다. 시약 항원성은 생쥐 항체에 대해 유의한 항체 반응에 이른 환자에 대해 비효율적이 되었던 선행 생주 항체 치료에서 문제가 되었다 (특허 출원 EP A O 194 276, Neuberger ; 특허 출원 EP A 0 239 400 ; LoBuglio, A.F. 일동,Proc Netl Acad Sci USA86 (1989) : 4220-4224). 면역 반응은 항체의 불변 영역과 연관되어 있을 뿐 아니라 강한 항-유전형 반응을 유발하는 가변 영역 도메인과도 관련되어 있다 (Bruggemann, M. 일동,J. Exp. Med.170 (1989) :2153-2157 ; Shawler, D.L. 일동,Lmmunol, 135 (1985) : 1530-1535).
치료적으로 가치 있는 단백질의 생성을 위한 인간화 방법의 가치는 V-영역 골격의 대체에 의해 생쥐 항체를 인간화하므로써 입증되었다. 이 인간화 방법은 아주 잘 측정되는 항원-결합 루우프(loop)를 갖는 결합 부위의 기본 구조를 사용한다(Kabat, E.A. 일동, U.S. Dept. of Hoalth and Human Services, U.S. GovernmentPrinting Office, 1987). 본래 항체로 부터의 루우프를 보유하면서 사람 서열로 골격을 대체하는 것은 생쥐로 부터의 항원 결합을 사람의 구조적 전후 관계로 효율적으로 전이시킨다 (Riechmann, L. 일동,Nature332 (1988) : 323-327 ; Jones, P.T. 일동,Nature321 (1986) :522-524 ; Verhoeyen, M. 일동, Science 239 (1988) :1534-1536 ; Qeen, C. 일동,Proc Natl Acad Sci USA86 (1989) :10029-10033). 이 인간화 기술로써 A) 과가변 루우프의 결합에 대한 기여 ; B) 골격 구조의 보존, 및 C) 모두가 같은 방식으로 골격과 상호 작용하는 루우프라는 특정 가정들이 이루어졌다. 기본 분자 모델을 사용하여, 인간화는 최적화되어 성공도를 증진시킬 수 있다 (Riechmann, L. 일동,Nature322 (1988) : 323-327).
인간화를 목적으로 하는 이들 방법은 효소 활성에 적용 가능하다. 구조적 분석의 사용은 사람 단백질과 유사한 구조를 갖는 효소가 발견될 수 있다면 면역성을 위장하기 위해 상동 외부 루우프 영역의 그라프링을 허용한다. 항원성의 문제는 또한 공유 변형, 즉 단백질 표면의 폴리에틸렌 글리콜 변형을 사용하여 제거될 수 있다.
항체 발현 벡터
면역 글로불린 유전자의 PCR 클로닝의 적용에 있어 최근의 진전은 파지 λ(Huse, W.D. 일동,Science246 (1989) :1275-1281) 및 섬유질 파지 fd (Clarkson, T. 일동,Nature352, (1991) : 624-628)를 사용하여 이.콜리 내 항체 발현 라이브러리를 생성하는 능력을 결과시켰다. 파지 λ 기초 시스템은 Fab 를 방출하는 파지 반점 라이브러리를 생성하며, 그리고 나서 Fab 는 방사선 표지된 합텐을 사용하는 필터 결합 검정에 의해 스크리닝될 수 있다 (Caton, A.J. 일동,PNAS, USA 87 (1990) :6450-6454). 원하는 결합 활성을 갖는 반점을 단리하기 위해 잠정적으로 가치있을 수 있으나, 항체 중계 촉매 활성을 단리하고자 하면 각 클론은 개별적으로 스크리닝되어야 한다. 특허 출원 WO 92/01047 에 기재된 바와 같은 단일 사슬 FV 항체를 발현시키기 위한 파지 fb 시스템은 파지 유전자 III 단백질에 융합된 항체 FV 를 수반하는 파지 입자의 생성을 기재한다. 이 시스템은 파지, 및 항원 또는 합텐에 결합하는 항체를 사용하여 파지 입자 상에 발현되는 특이적 항체를 암호화하는 유전자의 직접 선택을 허용한다. 이 방법을 사용하여 조합 라이브러리로 부터 드문 항체가 단리되었다 (Marks, J.D. 일동, J. Mol. Biol. 222 (1991) : 581-597).
앞에서 기재되어 있지 않은 대안적 접근은, 항체 발현 라이브러리의 생성을 위해 파지 λ 기초 시스템 대신 플라스미드 기초 시스템을 사용하는 것이다. 이 시스템에서, VH 및 VL 유전자를 개별적인 전사 단위체로 갖기 보다는, 이들은 짧은 펩티드에 의해 공유적으로 연결되어 Bird, E. 일동, Science (1988) : 432-426 에 의해 규정된 바와 같이 단일 사슬 항체를 생성한다. 적당한 PCR 프라이머를 사용하여, 이미 기술된 일단계 PCR 방법론에 위해 필수적으로 무작위한 VH 와 VL 의 회합으로 구성되는 조합 단일 사슬 항체 라이브러리가 생성된다 (Davis, C.T. 일동, 출판된Bio/Technology(1991)) 단일-사슬 PCR 생성물은 Ptac 와 같은 유도 가능한 프로모터를 함유하는 적합한 이.콜리 발현 벡터로 클로닝된다. 클로닝된 단일-사슬의 5' 에 pel B 와 같은 신호 서열이 첨가되어 발현된 항체 단백질의 분비를 허용한다 (Better, M. 일동,Science240 (1988) : 1041-1043). 이.콜리가 분해되는 파지 λ 발현 시스템과 달리, 기재된 플라스미드 기초 발현 시스템은 직접 선택을 사용하는 촉매 항체를 위한 이.콜리 라이브러리를 직접 스크리닝하는 가능성을 허용한다. 한가지 가능한 선택 방법인 β-락탐 또는 β-락탐 유도체의 불활성화는 "촉매 항체를 위한 스크리닝" 단락에 기재되어 있다. 다른 가능한 선택 방법은 이.콜리의 성장에 필수적인 영양물인 비타민 또는 보조 인자의 항체 촉매 방출을 포함한다. 옥소트로프를 요구하는 티미딘을 이용하는 한 가지 상기 선택 절차는 본 명세서에서 단락 누클레오시드 유사체 선구 약제의 촉매 활성화를 위한 스크리닝에 기재되어 있다.
원하는 결합 또는 촉매 활성을 갖는 항체를 발현하는 이.콜리 클론으로 부터의 VH 및 VL 영역은 항체 기능을 변경하거나 증가시키기 위해 돌연변이될 수 있다. 돌연변이를 위해 표적되는 특이적 CDR 아미노산 잔기(들)은 항체 활성 부위의 분자 모델링에 의해 확인될 수 있다. 돌연변이는 돌연변이성 올리고 누클레오티드를 사용하는 이미 기재된 다양한 부위-지향성(site-directed) 돌연변이 절차 중 하나에 의해 이루어진다 (Maniatis, T. 일동, Moleculsr Cloning : A Laboratory Mannal, (1989) : 15.51-15.65, 뉴욕 : Cold Spring Harbor Laboratory).
원하는 결과를 생성하기 위해 선택적 돌연변이가 가능하지 않으면, 활성 부위의 보다 광범위한 변경이 이루어진다. 한 유용한 방법론은 하나의, 극소수의 또는 몇몇의 CDR 을 무작위 아미노산 세트 또는 부분 세트로 대체하는 것이다. 이 무작위 돌연변이 절차는 β-락타마제 효소 활성을 변경시키기 위해 성공적으로 사용되었다 (Dube, D.K. 일동,Bicchemistry28 (1989) : 5703-5707 ; Oliphant, A.R.일동,PNAS, USA 86 (1989) : 9094-9098). 기재된 방법은 활성 부위의 그 부분을 암호하는 DNA 서열을 무작위 올리고뉴클레오티드로 대체하므로써, 효소 활성 부위에 무작위 아미노산을 도입하는 것과 관련되었다.
항체 CDR 영역 내 무작위 돌연변이는 임의의 다수의 상이한 방법에 의해 이루어진다. 항-플루오세인 모노클로날 항체의 CDR1 VH(Mab 4-4-20, Bedayk, W.D. 일동,JBC264 (1989) : 1565-1569)를 무작위로 면역화하기 위해 사용되는 프로토콜의 한 예가 하기에 상세히 나타나 있다 :
1. 하기 제시된 서열의 올리고 누클레오티드가 자동 DNA 합성기에서 합성된다. 특정 누클레오티드 삼중항 위의 숫자는 Bedzyk 일동(1989)에 의해 지시된 바와 같이 4-4-20 VH 내 아미노산 위치에 해당한다.
상기 서열(SEQ ID NO : 1)에서, VH CDR1(아미노산 31-34)은 N 이 A, C, G, 또는 T (등몰)이고 K 가 G 또는 T (등몰)인 무작위 누클레오티드 서열로 대체된다. 각 삼중항 내 세번째 위치에서 A 또는 C 를 배제하는 것은 가능한 종결 코돈의 수를 Cwirla, S.E. 일동,PNAS, USA 87 (1990) : 6378-6382 에 의해 보고된 바와 같이 2/3 로 감소시킬 것이다.
2. 1 단계로 부터 올리고 누클레오티드의 3' 말단에 있는 최종 20 개 염기쌍에 상보적인 제 2 올리고 누클레오티드가 합성된다. T4 키나제로 포스포릴화한 후, 올리고 누클레오티드를 어니일링하여 데옥시 누클레오티드 및 Klenow 단편을 함유하는 프라이머 확장 반응에 첨가시킨다. 결과되는 총 길이 이중 가닥 무작위 올리고 누클레이티드를 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 또는 역상 HPLC 에 의해 정제한다.
3. 2 단계로 부터의 이중 가닥 무작위 올리고 누클레오티드는 Clackson, T. 일동,NAR17 (1989) : 10163-10170 에 의해 기재된 "정착 풋트(foot)" 돌연변이 절차에서 "점착 풋트" 프라이머로 작용할 수 있다. 이 절차는 주형 가닥에 존재하는 야생형 VH CDR1 을 단계 1 에서 기재된 무작위 올리고 누클레오티드에 의해 명시된 무작위 CDR1 서열로의 대체를 결과시킬 것이다.
4. 점착 풋트 돌연변이 후, 단계 3 으로 부터의 DNA 가 이.콜리를 형질 전환시키는데 사용되어 VH CDR1 이 무작위 서열로 대체되는 항체 라이브러리를 결과시킨다.
5. 결과 라이브러리는 본 특허의 상기 단락에서 기재한 바와 같이 적당한 합텐을 사용하는 결합 검정 또는 선택 검정에 의해 스크리닝될 수 있다.
VH 또는 VL 의 부가적인 CDR 영역은 유사한 방식으로 무작위로 돌연변이될 수 있다. 또한, VH 또는 VL 사슬 내 하나, 둘 또는 셋 모두의 CDR 영역이 동시에 돌연변이될 수 있다. 자동 기계에서 합성될 수 있는 올리고 누클레오티드 길이에 대한 제한으로 인하여, 3 CDR 영역 각각에 해당하는 3 개의 별개의 무작위 올리고 누클레오티드는 상기 단계 1 에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 올리고 누클레오티드 합성 중, 각각의 CDR 들의 측면에 있는 골격 영역 내 적당한 위치에 제한 부위가 혼합된다. 상기 단계 2 에서와 같이 이중 가닥 DNA 로의 전환 후, 각각의올리고 누클레오티드는 적당한 제한 효소에 의해 분해되고, 올리고 누클레오티드가 서로 점착하여 완전한 VL 또는 VH 를 생성시킨다. 그리고 나서, 최종 점착된 생성물은 상기 단계 3 에서 "점착 풋트" 로 사용된다.
상기된 방법에 대한 대안적 접근은 돌연변이될 CDR VH 또는 VL 의 각 측면에 있는 골격 영역에 제한 효소 부위를 처리하는 것이다. 상기 단계 1 에서와 같은 무작위 올리고 누클레이티드의 합성 도중에, 적합한 제한 부위가 이제 골격 측면 영역에 첨가된다. 제한 부위는 골격 영역 내에 야생형 암호화 서열을 가장 잘 보존하도록 선택된다. 그리고 나서 야생형 영역은 적당한 제한 효소로 분해되므로써 제거되며, 적합한 제한 효소로 분해된 이중가닥 무작위 올리고 누클레오티드로 대체된다.
섬유질 파지 내 돌연변이 및 선택을 사용하는 신규한 결합 활성의 선택
선택적 조건 하에서 성장에 대한 선택에 의한 돌연변이 항체의 선택이 예시되었다 ("이.콜리 내 돌연변이 촉매 항체의 스크리닝"으로 표제된 단락 참조). 이들 선택 및 돌연변이 방법과 함께, Cwirla S. 일동,PNAS, 87 (1990) : 6378-6382 ; 및 McCmfferty J. 일동,Nature, 348 (1991): 552-554 에 의해 기재된 방법의 사용은 선구 약제 활성화를 위한 촉매 항체를 생서하고/개선하는데 도움을 준다.
이들 방법은 상기 개략된 프로로콜에서 생성된 돌연변이 단일 사슬 항체를 취하고 섬유질 박테리오파지, fd 의 흡수 단백질(유전자 III)에 이들을 삽입하므로써, 결과 돌연변이의 결합을 통한 광대한 펩티드 라이브러리의 생성 및 스크리닝을 허용하였다. PCR 클론되고 돌연변이된 단일 사슬 항체의 도입을 위한 부위는 흡수단백질(유전자 III)의 N 말단으로 부터의 5-6 개의 아미노산이다. 이는 항원에 대한 결합을 위한 항체의 제조를 허용한다. 단일 사슬 항체 유전자의 삽입 후, 이제 벡터(fd-CAT1)가 이.콜리 TC1 {K12, (lac-pro), sup E, thi, had D5/F tra D 36, Pro A+B+lacIq, lac ZM15} 또는 유사 균주를 전자전환(electrotransform)시키기 위해 사용된다. 형질전환된 이.콜리는 그 후 벡터의 테트라시클린 저항성을 이용하여 선택된다. 이 파지 라이브러리는 그 증식 및 라이브러리 크기(1012의 라이브러리 크기는 항체 내 9 개 부위에서 무작위 돌연변이의 스크리닝을 허용한다)의 평가를 허용하는 플레이트 상에서 배양된다.
이 라이브러리는 그 후 액체 배양액에서 증식되며, 상층액 내 결과 파지는 폴리에틸렌 글리콜 침전을 사용하여 농축되고, 2% 탈지 분유 분말을 갖는 PBS 에 용해된다. 그리고 나서 이들 파지는, 원하는 결합 활성의 선택을 위해, 예컨대 적합한 항원과 반응한 에폭시 활성화된 세파로스 CL-6B (Sigma Ltd.)와 같은 100 ㎕ 의 고체상-항원과 혼합된다. 이 선택에서 사용하기 위한 지원자 화합물은 본 명세서에 기재된 합텐을 포함할 것이다. 항체의 생성을 위해 사용된 이들 항원은 또한 단백질 운반자에 대한 커플링을 통해 에폭시 활성화 세파로스 CL-6B 와 같은 고체상에 간접적으로 커플링될 수 있다. 운반 단백질의 선택은 면역화를 위해 사용되는 단백질이 사용되지 않도록 선택되며, 운반 단백질에 대한 비특이적 항체의 단리 가능성을 방지한다.
결합을 보증하기 위해, 흡수된 파지는 그 후 원심분리 후 비특이적 또는 약한 결합 활성을 제거하는 일련의 세척 단계에 의해 분리된다. 세척 단계의 성질은 선택 항원과의 상호 작용의 유형 및 성질을 선택하는 것이며, 즉 고염 세척의 선택은 이온 상호 작용으로 인하여 결합을 감소시키거나, 에틸렌 글리콜의 사용은 예를 들어 다른 결합 친화성을 나타내는 소수성 상호 작용의 감소를 가능하게 할 것이다. 이러한 세척 조건에 기초한 증가된 선택성은 이들 광범위한 기초 세척 조건에 제한되지는 않으나 원하는 반응을 위한 관련된 항원 또는 기질의 사용에 기초한 특별한 세척 프로로콜의 사용을 또한 포괄할 것이다. 파지 푸울의 용리는 또한 세척을 위해 사용된 바와 같은 동일한 표준 세트에 기초한다. 이들 접근의 조합 결과는 관련된 결합 활성의 광대한 매트릭스의 선택을 허용하였다.
그 후 원하는 결합 활성의 푸울(들)이 증식되고, 그 결합 및 촉매 성질에 대한 면밀한 분석을 받는다. 이들 유형의 선택적 세척 및 용리의 적용은 원하는 성질의 선택을 가능하게 한다. 이는 돌연변이 및 선택 방법의 최종 단계일 필요가 없으나, 촉매 활성을 갖는 원하는 구조에 대한 경로의 한 단계이다. 따라서, 이 프로토콜은 결합 부위를 성숙시키기 위해 선택의 연속 순회를 허용할 것이다.
그 후 촉매 활성을 갖거나 갖지 않는 단리된 가능한 지원자 항체는 항생제 또는 옥소트로픽 선택을 사용하여 직접적으로 촉매 활성을 위한 부가적 선택에 기초한 활성의 선택을 위해 상기 발현 시스템에 도입된다 (2부B단락 참조). 또한, 이들 지원자 분자들은 이 파지 시스템을 사용하는 부가적인 돌연변이 및 선택의 순회를 위해 선택된다. 이 파지 라이브러리 접근의 기술적 설명은 Cwirla, S. 일동,PNAS, 87(1990) : 6378-6387 ; 및 McCafferty, J. 일동,Nature, 348 (1991) : 552-554 에 의한 논문 및 특허 출원 WO 92/01047 에 기재되어 있다.
촉매 항체를 위한 스크리닝
A.β-락타마제 활성을 위한 항체의 선택
모노락탐-기초 선구 약제의 촉매 활성화의 선택은 존재하는 항체의 촉매 효능을 개선시키기 위해 하이브리도마에 의해 생성된 항체를 사용하거나 또는 이.콜리 내 항체를 돌연변이시키므로써 이루어질 수 있다.
1.β-락타마제 활성을 위한 하이브리도마-기초 항체 스크리닝
모노락탐 선구 약제에 대한 촉매적 가수분해의 감지는 플라스틱 96 웰 평탄에 고정된 하이브리도마 상층액 항체로써(하기된 방법에 의함) 또는 복수액으로 부터 정제된 항체를 갖는 용액 내에서 실시될 수 있다.
고정화 : ELISA 검정에서 합텐에 결합하는 항체를 생성하는 하이브리도마가 스크리닝을 위해 선택되었다. 배기딘 5 mL 배양물로 부터 상층액을 푸울링하고 pH 를 2N NaOH(20μl)로 7-7.5 로 조정하였다. 세포 파편을 30 분간 2700 rpm 에서 원심분리하여 제거하고, 상층액(4μl)을 깨끗한 폴리프로필렌 시험관에 기울여 따라냈다. 항 생쥐 면역글로불린 친화 겔(Calbiochem, 겔 mL 당 면역 글로불린 0.5-2 mg 의 결합 성능)을 PBS (겔 70μL 를 함유하는 140μL) 내에 50% 슬러리로서 첨가하고, 결과 현탁액을 16 시간 동안 25℃ 에서 온화하게 혼합하였다. 96 웰 Millititer GV 여과 평판(Millipore)을 예비-습윤 시키고, 0.05% Tween-20 을 함유하는 PBS 에서 세척하였다. 친화 겔 현탁액을 2500 rpm 의 원심분리로 15 분간 회전시키고, 대부분의 상층액을 제거하고 각각의 폴리프로필렌 시험관으로 부터 잔류 슬러리(250μL)를 각각 96 웰 필터 평판 내 별개의 웰들에 이동시켰다. 잔류 상층액을 흡입에 의해 필터 평판을 통해 제거하고, 고정된 항체를 4℃ 에서 PBS/Tween (5% 200μL), PBS(3% 200μL) 및 25 mM HEPES, pH 7.2 (3% 200μL)로 세척하였다.
선구 약제와 함께 항체를 적당히 항온 처리한 후, 표준 HPLC 절차에 의해 가수 분해되지 않은 선구 약제로 부터 약제의 분리가 이루어진다. 선구 약제의 가수분해는 흡광 분광학에 의해 쉽게 감지될 수 있는 방향족 약제의 방출을 결과시킬 것이다. 생성된 약제의 감지 및 정량은 오닐린 분광 감지기에 의해 정량될 수 있다.
2.β-락타마제 활성을 위한 이.콜리 내 항체의 스크리닝
촉매 항체의 효능은 천연 효소의 효능 보다 종종 실질적으로 낮다. 촉매 항체를 생성하기 위해 현재 기술들이 사용되면, 이중 다수는 화학적 또는 유전학적 변경에 의한 개선 없이는 효율적인 상업적 용도에 부적합할 것이다. β-락타마제 활성을 갖는 촉매 항체는 특히, 이들의 촉매 활성이 항체를 발현하는 이.콜리의 숙주 집단을 활성에 대해 스크리닝할 수 있는 신속하고 편리한 수단을 제공하므로, 유전학적 돌연변이에 의한 개선에 잘 맞을 것이다. 이.콜리{특히 특정 과민감성 균주 (Imada, A. 일동,Nature89 (1981) : 590-591 ; Dalbadie - MoFarland, G. 일동,Proc.Natl. Acad. Sci. USA79 (1982): 6409-6413}는 β-락탐 항생제에 의해 살생되므로, β-락타마제 활성을 갖는 방출된 항체는 β-락탐 독성에 저항성을 부여할 것이다. 돌연변이 항체가 촉매적으로 더욱 효율적이면, 숙주 이.콜리에 대한 항생제의 최소 저해 농도(MIC)가 더욱 높아진다. 온화한 촉매 항체를 위한 유전자의 무작위 돌연변이와 같은 방법은 다수의 이.콜리 집략을 결과시키며 다수의 고유한 항체를 생성할 것이다. 적절한 β-락탐 항생제에 대한 증가된 저항성은 막대한 수의 돌연변이체를 스크리닝하기 위한 성숙하고 효율적인 기반을 제공하며, 야생형 항체보다 높은 효능을 갖는 항체를 신호할 것이다.
선구 약제 계획 :β-락탐 고리로 부터 활성 약제의 제거
활성 약제는 치환된 모노시클릭 β-락탐 고리의 가수분해 결과로서 불활성 선구 약제로 부터 생성될 수 있다 :
치환체 (R 및 R')은 특히 살생 또는 손상된 성장을 유발하는 β-락타마제 효소-부족 이.콜리의 세포벽을 파괴하기 위한 효율적 약품 β-락탐을 제조하기 위해 요구되는 것들에 좌우될 것이다. 또한 이들 치환체는 임의로 면역화 도중 운반 단백질(KLH 또는 BSA)을 커플링하는데 사용된다.
촉매 활성을 개선시키기 위한 항체의 클로닝 및 돌연변이
촉매 항체를 생성하는 항체 유전자가 이.콜리 내에서 클로닝되고 발현될 것이다. 락탐-항생제에 과민감성인 이.콜리 균주(즉, β-락탐 항생제에 대해 자연적인 방어가 부족한 것)를 사용하는 것이 중요할 것이다. β-락타마제 효소 및/또는 페니실린 결합 단백질이 결여된 균주가 존재한다(Imada, A. 일동,Nature289 (1981) : 590-591 ; Dalbadie-McFarland, G. 일동,Proc. Natl. Acad. Sci. USA79(1982) : 6409-6413). 이.콜리 집락은 부위-지향성 또는 무작위 돌연변이에 의해 돌연변이되는 항체 유전자를 암호화하는 플라스미드 DNA 를 함유할 것이다. 유기체는 변경된 항체를 발현하고 방출할 것이다. 각각의 클론이 서로 다른 아미노산 서열의 항체를 방출하는 다수의 클론이 생성될 것이므로, 어떤 돌연변이가 촉매 활성을 증가시켰는지 결정하는 신속하고 노동 집약적이지 않은 방법을 사용할 것이다.
이. 콜리에서 돌연변이 촉매 항체의 스크리닝
β-락타마제 활성을 갖는 항체를 생성하는 이.콜리 돌연변이체를 스크리닝하는 간단하고 편리한 방법은 선구 약제를 닮은 β-락탐 항생제의 독성을 억제하는 변경된 돌연변이 능력을 감지하는 것이다. 이 방법의 바람직한 특징은 스크리닝에 사용되는 합텐, 선구 약제, 및 효율적 항생제의 구조가 모두 항체에 의해 인지될 만큼 유사하다는 것이다. 합텐은 선구 약제 뿐 아니라 숙주 유기체, 이.콜리를 공격하는데 사용되는 항생제(선구 약제에서 약제를 뺀 것)를 결합하고 가수 분해하는 항체를 유도해야 한다. 선구 약제의 고안에서 고려되어야 할 부가적인 특징은 가수 분해시 활성 약제를 축출해야 한다는 것이다. 이러한 기준에 기초하여, 다수의 상이한 구조물들이 본 명세서의 어느 곳에든 기재된 바와 같은 선구 약제를 위해 사용될 수 있다. 한가지 관심을 끄는 예는 모노박탐 항생제, 아즈트레오남(Koster, W. H. 일동,Frontiers of Antibictic Research,H. Umesawa 편집 (1987) : 211-226 Crlando, Academic Press)의 선구 약제 유도체를 갖는 것이다.
아즈트레오남
아즈트레오남은 이.콜리에 대한 효율적 항생제이며 (MIC = 0.1 mg/mL), 혈류에서 사람 효소에 의해 분해되지 않는다. 변형된 아즈트레오남의 β-락탐 고리를 가수분해하여 활성 약제의 제거를 제공하는 합텐이 고안되고 제조될 수 있다.
아즈트레오남-기초 선구 약제
효율적인 촉매 항체-생성 돌연변이체를 위한 스크리닝(이.콜리의 과민감성 균주)은 실제 선구 약제로써 보다 아즈트레오남 자체로써 숙주 항체-방출 집락을공격하므로써 이루어진다. 이는 약제(개질된 아즈트레오남)의 첨가가 아즈트레오남 항생제 성질에 어떤 영향을 미칠 수 있을지 항상 분명하지는 않으나, 아즈트레오남 (또는 유사 항생제) 자체가 이.콜리에 대항하는 효율적 항생제이기 때문에 가능하다. 약제 부분의 존재는 이.콜리에 대한 아즈트레오남의 항생제 작용을 정지시키거나 감소시킬 수 있다. 항체가 약제 또는 그 유사체를 함유한 합텐에 의해 생성되기 때문에, 보다 큰 아즈트레오남-약제 접합체 보다 아즈트레오남으로써의 스크리닝이 허용가능하며, 돌연변이 항체는 약제에 결합하는 능력을 보유할 것이다. 스크리닝은 한천 희석과 같은 표준 방법에 의해 {Sigal, I. S. 일동,Natl. Acad, Sci. USA79 (1982) : 7157-7160 ; Sowek, J. A. 일동Biochemistry30 (1991) :3179-88}, 또는 아즈트레오남의 농축 구배를 사용하여 {Schultz, S. C. 일동, J.Proteins2 (1987) : 290-297} 이루어 진다.
돌연변이체의 특성화
부가적 생체의 특성화를 위해 밀리그램의 항체가 발현되고 정제될 수 있도록, 아즈트레오남에 저항성인 것으로 밝혀진 이.콜리 집락을 보다 다량으로 배양시킨다. 이 단계에서, 항체는 완충 용액 내에서 정제되고 특성화될 것이다. 중요한 역학적 성질은 β-락탐 선구 약제를 효율적으로 가수분해하여 활성 약제 종들의 분리를 결과시키는 능력이다. 사람 혈청에서의 효율적인 가수분해 뿐만 아니라, 선구 약제(기질), 가수분해된 아즈트레오남, 또는 활성화 약제에 의한 강한 생성물 저해가 없어야 한다.
B. 누클레오시드 유사체 선구 약제를 활성화시키는 촉매 항체의 단리
누클레오시드 유사체 선구 약제를 활성화시키는 촉매 항체는 두 일반적 원칙 ; 즉, 생체 내에서 선택적 방법에 의해, 또는 물리화학적 방법에 의한 항체 또는 파지-발현 항체를 스크리닝하는 (스크니링 방법) 방법 중 하나에 의해 단리될 수 있다. 하기된 생체 내 단리 방법은 모든 누클레오시드 유사체 선구 약제를 위한 항체를 스크리닝하는데 적용될 수 있다. 스크리닝 방법은 특허 청구된 두 종류의 불활성화 기를 기초로 하는 두 유형으로 분류된다. 스크리닝 방법 중 한 유형은 에스테라제 활성을 감지하며 다른 유형은 글리코시다제 활성을 감지한다. 스크리닝은 생쥐 복수액으로 부터 정제된 항체에, 또는 선행 단계에서 하이브리도마 상층액에 존재하는 항체에 적용될 수 있다. 본 명세서에 나열된 방법은 특히 촉매 활성을 위한 하이브리도마 상층액의 선행 스크리닝을 위해 기재되나, 복수로 부터 정제된 모노글로날 항체의 스크리닝 및 검정을 위해 쉽게 적용될 수 있다.
1.누클레오시드 유사체 선구 약제의 촉매 활성화의 스크리닝
스크리닝은 전 단계에서 A 단락에 기재된 고정화 절차를 사용하여 하이브리도마 상층액 내에서, 또는 후단계에서 생쥐 복수로 부터 정제된 항체를 사용하여 실시된다.
갈락토시다제 촉매 활성을 위한 항체의 스크리닝 :항체가 없는 용액에, 또는 세척되고 고정된 항체에 적당한 검정 완충액 내 선구 약제 용액을 첨가한다. 촉매화되지 않은 선구 약제 활성화 속도에 따른 시간 동안 25℃ 에서 항온 처리 후, 활성화된 약제의 형성을 측정한다. 기질 용액을 웰로 부터 제거하여 생성물 형성 정도를 측정하거나 (고정 방법에서), 생성물을 현장에서 측정한다 (항체가 없는 용액의 경우에서와 같이).
선구 약제 활성화의 감지는 갈락토스 생성의 비색 분석 또는 형광 분석 측정에 의해 실시되며, 이는 선구 약제 활성화를 수반한다.
다수의 가능한 갈락토스 감지 방법 중 하나가 적용된다. 몇몇 민감하고 특이적인 감지 방법은 하기와 같다 :
1. 32 P -포스페이트를 사용한 유리 갈락토스의 방사선 표지
a) 갈락토키나제(E.C.2.7.1.6)는 구입 가능하며(Sigma Chemical Co., St Louis, USA) 하기 반응을 촉매화한다 ;
갈락토스 ＋ ATP → 갈락토스-1-인산염 ＋ ADP
사용된 ATP (아데노신 트리포스페이트)가 γ 인산염 위치에32P 를 가지면, 촉매 항체에 의해 생성된 유리 갈락토스가 방사선 활성 표지될 것이다. 표지된 갈락토스-1-포스페이트는 박막 크로마토그래피 (TLC) 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 반응 혼합물 내에서 다른 성분들로 부터 분리되며, 신틸레이션 계수에 의해 정량된다.
2.형광 또는 발색 알데히드-반응성 시약을 사용한 촉매 작용의 감지
이 유형의 감지 방법에서, 구입 가능한 (예컨대, Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) 알데히드-반응성 시약과 비촉매적으로 반응하여 착색 또는 형광 유도체를 생성한다. 갈락토스를 갖는 반응 생성물은 HPLC 또는 TLC 에 의해 단리되며, 표준 수단에 의해 흡광 또는 형광에 의해 감지된다.
한가지 가능한 시약은 단실 히드라진(Molecular Probes, Inc. )이다. 단실 히드라진은 온화한 조건 하에 알데히드와 반응하여 반응 혼합물의 TLC 또는 HPLC 에서 저농도로 감지될 수 있는 형광 생성물(Eggert, F. C. 일동, J.Chromatogr. 333 (1985) : 123 : Avigad, G., J.Chromatogr. 139 (1977) :343)을 제공한다. 가능한 보다 낮은 감지 한계, 보다 큰 반응 특이성, 또는 보다 온화한 반응 조건으로 인하여, 단실 히드라진 보다 유용한 다른 가능한 시약은 쿠마틴 히드라지드, 플루오레스세인 티오세미카바지드(Molecular Probes, Inc.)와 같이 구입 가능한 다른 형광 히드라지드들이 있다. 이들 시약은 어느 것이 특별한 요건에 가장 적합한가를 보기 위하여 비교된다.
3.색상-발생 특이적 효소를 사용한 갈락토스의 감지
a) 갈락토스를 감지하기 위해 사용될 수 있는 한 효소는 하기 산화-환원 반응을 촉매화하는 갈락토스 탈수소 효소(E.C.1.1.1.48)(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA)이다;
갈락토스 ＋ NAD ＋ (무색) → 갈락토네이트 ＋ HADH (색) ＋ H+
갈락토스의 산화는 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드(NAD+)의 환원이 수반된다. NAD+의 환원된 형태인 HADH 는 착색되어 있으며, 그 외형은 340 nm 에서 분광광도 측정법으로 모니터링된다.
b) 갈락토스를 감지하는데 유용한 대안적 효소는 과산화 효소와 o-톨리딘을 조합하여 사용하는 갈락토스 산화 효소(E.C. 1.1.3.9)이며, 촉매 항체에 의해 생성된 유리 갈락토스의 존재와 반응하여 색변화를 유발할 것이다. 커플링된 반응은 하기와 같다. 첫번째 반응은 갈락토스 산화 효소에 의한 것이며 두번째 반응을 퍼옥시다제에 의한 것으로, 둘다 Sigma Chem. Company 로 부터 구입 가능하다;
1. 갈락토스 ＋ O2 갈락토네이트 ＋ H2O2
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2. H2O2H2O ＋ "착색된 생성물"
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생성된 착색된 생성물은 분광 광도 측정법으로 측정될 수 있다.
에스테라제 촉매 활성을 위한 항체의 스크리닝: 고정된 세척된 항체 또는 항체가 없는 용액에, 적당한 검정 완충액 내 선구 약제 용액(달리 지시되지 않으면)을 첨가한다. 선구 약제 활성화의 비촉매화된 속도에 따른 시간 동안 25℃ 와 같은 적합한 온도에서 항온 처리 후, 활성화된 약제의 형성을 기재된 바와 같이 측정한다.
선구 약제 형성의 감지는 약하게 완충된 용액 내에서 에스테르 가수분해를 수반하는 pH 변화에 의해 감지될 수 있다. pH 변화는 pH 변화에 따라 색상이 변하는 페놀 레드(Benkovic, P.A. 일동,Biochemistry18 (1979): 830)와 같이, 용액 내에서 산-염기 지시자를 포함하므로써 감지될 수 있다. 대안적으로, 보다 민감한 방법은 웰(Lazar Research. Laboratories, Los Angeles, CA)에 삽입될 수 있는 끝이 가는 전극이 장치된 pH 조절기 또는 pH 계기를 사용하여 pH 변화를 측정하는 것이다. pH 변화를 측정하는 것을 포함하는 스크린을 위해, 항온 처리 도중 질소 또는 아르곤 기재 하에 웰을 유지하여 이산화 탄소 분위기로 부터의 pH 변화를 막는 것이 필요할 수 있다.
방향족 에스테르-보호된 선구 약제의 가수 분해는 HPLC (음이온 교환 또는 역상 칼럼) 상에서 통상적인 크로마토그래피 수단에 의해 쉽게 분리될 수 있는 산성 방향족기의 방출을 결과시킨다. 더욱이, HPLC 로 부터 용리되는 방향족 고리의 감지는 오닐린 UV 흡광 감지기를 사용하여 쉽게 이루어질 수 있다.
방향족 에스테르 누클레오시드 유사체의 가수분해의 생체 감지를 위한 세번째 방법은 효소-연결된 검정를 사용하는 것이다. 이 목적을 위해 사용될 수 있는 한가지 저렴하게 구입 가능한 효소(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)는 티리미딘 포스포릴라제(E.C.2.4.2.4)이다. 이 효소는 기질 티미딘 및 오르토포스페이트를 생성물 티미딘 및 2-데옥시-D-리보스-1-포스페이트로 전환시킨다. 본 명세서에서 스크리닝될 선구 약제 보다도, 불활성화 에스테르와 티미딘의 접합체가 사용될 것이다(옥소트로픽 세균 돌연변이체를 사용하는 생물학적 스크리닝에 사용될 같은 유형의 화합물). 이 효소는 방향족 에스테르 보호된 티미딘의 포스포릴화를 촉매하지 않고, 촉매 항체에 의해 생성된 유리 티미딘만의 포스포릴화를 촉매할 것이다. 웰에 티미딘 포스포릴라제, 선구 약제에 티미딘 버전(version), 및32P-표지된 오르토포스페이트가 첨가될 것이다. 완충된 성분을 면역화된 항체와 항온 처리한 후, 방사선 표지된 오르토포스페이트 및 2-데옥시-D-리보스-1-포스페이트를 분리하기 위해 분획들을 TLC 상에 시행한다. 그러면, 자동방사선 사진법에 의해32P 가 TLC 평판 상에서 감지될 수 있다.
2.누클레오시드 유사체 선구 약제를 위한 에스테라제 활성을 갖는 촉매 항체의 단리를 위한 티미딘 옥소트로픽 선택
항체의 세균 발현은 촉매 활성을 스크린하기 위한 다수의 서로 다른 항체를 제공할 것으로 기대된다. 그러나, 이 방법의 유용성은 활성 항체를 생성하는 상기 집락들을 선택하는 효율적 방법의 유효성에 좌우된다. 유력한 접근 방법은 생물학적 선택을 사용하는 것이며, 이때 촉매 항체를 생성하는 집락만이 생존할 수 있다. 이 선택이 실시될 수 있는 한가지 방식은 촉매 항체가 세균이 부족한 특별한 영양물을 공급하는 것이며; 생존은 원하는 영양물을 방출하는 기질을 분해하는 항체에 좌우된다. 선구 약제-분해 촉매 항체를 얻기 위한 이 선택 유형은 하기되어 있다.
선구 약제를 분해하여 누클레오시드 유사체(예, 플루오로우리딘, 플루오로데옥시우리딘, 플루오로우리딘 아라비노시드, 시로신 아라비노시드, 아데닌 아라비노시드, 구아닌 아라비노시드, 히포크산린 아라비노시드, 6-메르캅토푸린 리보시드, 테오구아노신 리보시드, 네불라린, 5-요오도우리딘, 5-요오도데옥시 우리딘, 5-브로모데옥시우리딘, 5-비닐데옥시우리딘, 9-[(2-히드록시)에톡시]메틸구아닌(아시클로비르(acyclovir)), 9-[(2-히드록시-1-히드록시메틸)에톡시] 메틸구아닌(DHPG), 아자우리디엔, 아자시리딘, 아지도티미딘, 디데옥시아데노신, 디데옥시시리딘, 디데옥시이노신, 디데옥시구아노신, 디데옥시티미딘, 3-데옥시아데노신, 3'-데옥시시리딘, 3'-데옥시아노신, 3'-데옥시구아노신, 3'-데옥시티미딘)를 방출할 수 있는 촉매 항체를 생성하기 위해, 선구 약제 활성화 항체가 세균 발현에 의해 생성되고, 그렇지 않으면 티미딘-부족 세균에 티미딘을 공급할 수 있는 것이 선택된다. 티미딘은 플루오로우리딘 및 상기 나열된 다른 누클레오시드 유사체에 가까운 구조적 유사성을 가지므로; 선구 약제로 부터 플루오로우리딘(또는 상기 나열된 임의의 다른 누클레오시드 유사체)을 방출할 수 있는 촉매 항체는 티미딘에 의해 플루오로우리딘(또는 주목되는 임의의 다른 누클레오시드)이 대체된 동등한 기질로 부터 티미딘을 방출할 수 있다. 이는 플루오로우리딘-기초 선구 약제에 대해 하기에 예시되어 있다. 티미딘-부족 세균에 플루오로 우리딘 선구 약제와 같은 선구 부분들에 의해 유도된 기질 티미딘이 가해져; 선구 영양물을 분해할 수 있는 촉매 항체를 생성하는 집락들이 방출된 티미딘을 이용할 수 있으므로 생존할 수 있다. 그리고 나서, 이들 생존하는 집락으로 부터의 항체는 선구 약제의 분해를 위해 스크리닝되어 플루오로 우리딘을 생성한다. 티미딘 생성을 막는 것은 세균 세포 성장을 정지시키는 유효한 방법이다. 티미딘은 DNA 합성에 필수적이며, 데옥시우리딘의 효소 메틸화에 의해서 얻어진다. RNA 에서는 염기 티미딘이 발견되지 않으므로, RNA 이 분해에 의해 티미딘 푸울을 공급할 가능성은 없으며, 티미딘으로의 데옥시우리딘의 전환을 막는 것은 DNA 합성을 신속히 저해한다. 그러므로, 티미딘 합성을 막는 한가지 방법은 효소 티미딜레이트 합성 효소 또는 디히드로플레이트 환원 효소(DHFR)를 방해하는 것이다. 플루오로데옥시우리딜레이트는 티미딜레이트 합성 효소의 비가역적인 저해제이나, 이는 또한 결합 RNA 의 합성을 유발하여 티미딘의 항체-중개 방출이 세포 살생을 예방하기에 충분하지 않을 수 있다. 메토트렉세이트는 DHFR 의 고특이적 저해제이나; 푸린 및 특정 아미노산의 생합성을 위해 효소 환원 생성물인 테트라히드로플레이트가 또한 요구된다. 그럼에도 불구하고, 푸린 푸울은 성장 배지에 히포크산틴을 공급하므로써 유지되어, 메토트렉세이트-처리된 세균이 그 후 티미딘에 대한 고유한 요건을 가질 것이다(다른 폴레이트 유사체, 트리메토프림은 메로트렉세이트 보다 훨씬 더 유효한 세균 DHFR 의 저해제이며, 필요할 때 사용된다; Gilman, A. G. 일동,The Pharmacological Basis of Therapeutios(1985) : 1263-1268).
티미딘-기초 선구 약제의 분해를 위한 대안적 선택 방법은 티미딜레이트 합성 효소가 부족한 이.콜리 균주를 사용하는 것이다(Neihardt, F. C.,Escherichia Coli and Salmonella typhimurium : Cellular and Molecular Biclogy(1987)). 효소와 발현이 온도에 민감한 균주의 사용은 모든 집락을 먼저 성장시켜 효소가 완전히 발현 되도록 한다. 그리고 나서, 온도를 올려 효소 발현을 지지하여, 티미딘-기초 선구 약제를 분해할 수 있는 항체를 생성하는 집락들만이 생존할 수 있다.
C.시클로포스파미드 선구 약제의 촉매 활성화의 스크리닝 촉매 모노클로날 항체의 고정화 및 스크리닝
고정화: 고정화는 A 단락에 기재된 바와 같이 실시한다. 대안적으로, 스크리닝은 항체가 없는 용액으로 실시한다.
촉매 활성을 위한 항체의 스크리닝: 용액 내 항체 또는 고정되고 세척된 항체에,적당한 검정 완충액 내 선구 약제 용액을 첨가한다. 선구 약제 활성화의 촉매화되지 않은 속도에 따른 시간 동안 25℃ 에서 항온 처리 후, 활성화된 약제의 형성을 관찰한다. 기질 용액은 용액으로 부터 제거하여 생성물 형성 정도를 측정하거나, 생성물을 현장에서 관찰한다.
선구 약제 활성화의 감지는 선구 약제 활성화를 수반하는 부산물-아크롤레인을 비색 분석 또는 형광 분석 측정에 의해 실시한다.
다수의 가능한 아크롤레인 감지 방법 중 하나를 사용한다.
몇몇 가능하게 민감성이고 특이적인 감지 방법이 기재된다 :
1. 아크롤레인의 반응을 촉매하는 효소를 사용한 아크롤레인의 감지
a) 아크롤레인 형성을 감지하기 위해 사용할 수 있는 한 효소는 알콜 탈수소 효소이다(E.C.1.1.1.1). 알콜 탈수소 효소는 구입 가능하며 (Sigma Chemical Company), 하기 반응(이때, 예를 들어 알데히드는 아세트알데히드이고 알콜은 에탄올 이다)을 촉매한다.
알데히드 ＋ NADH (착색됨) ＋ R+알콜 ＋ NAD ＋ (무색)
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NADH 의 NAD+로의 산화는 340 nm 에 집중된 색 변화가 수반된다. 색변화는 이 효소와 그 활성을 모니터링하기 위해 일반적으로 사용된다. 화합물 아크롤레인은 아세트알데히드와 거의 유사하므로, 알콜 탈수소 효소에 의해 알데히드 기질로 받아들여질 것이며, 효소는 그 기질의 정확한 구조에 특별히 제한되어 있지 않다. 서로 다른 종들(예컨대, 이스트 및 말(equine))로 부터 구입 가능한 서로 다른 종류의 알콜 탈수소 효소가 있으며, 서로 다른 종들로 부터의 효소는 그 기질 특이성이 다소 달라, 한 종으로 부터의 효소가 아크롤레인을 선화하지 못하더라도 다른 것이 할 수도 있다.
b) Sigma Chemical Company 로 부터 또는 구입 가능한, 알데히드 탈수소 효소(E.C.1.12.1.5)에 의해 촉매화되는 반응은 알데히드 기질을 받아들이고 반응과 함께 색상 변화가 일어난다는데 있어 유사하다. 이 반응에서, 알데히드 카르복실산으로 산화된다 (예를 들어 아세트알데히드는 아세트산으로) ;
알데히드 ＋ NAD+산 ＋ NADH (색) ＋ R+
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의 경우, 340 nm 에서의 색상의 사라짐은 NAD+가 NADH 로 전환되므로 알콜 탈수소 효소를 사용한 다른 방법에서 보다 기질의 형질 전환을 수반할 것이다.
c) 세번째 가능한 효소-커플링된 감지 방법은 알콜 산화 효소(E.C.1.1.3.13) 및 과산화 효소(E.C.1.11.1.7) 둘 다를 사용한다. 알콜 산화 효소는 분자 산소를 사용하여 알데히드를 카르복시산으로 전환할 수 있으며 과산화 수소를 생성한다;
알데히드 ＋ O2산 ＋ H2O2
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알콜 산화 효소는 상업적으로 구입가능하며 (Sigma Chemical Company), 발간된 문헌을 기초로 하여 아크롤레인을 기질로 받아들인다 (Guibault, G. C., Handbook of Ensymatic Methods of Analysis (1976) : 244-248, 뉴욕; Marcel Dekker). 알콜 산화 효소에 의한 과산화 수소의 형성은 과산화효소(Sigma Chemical Company)를 발색 과산화 효소 기질, O-디아니시딘과 함께 반응 혼합물에 첨가하므로써 모니터링한다;
H2O2H20 ＋ "착색된 생성물"
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착색된 생성물은 456 nm 에서 분광 광도 측정법으로 관측될 수 있다.
2.형광 또는 발색 알데히드-반응성 시약을 사용한 촉매 작용의 감지
이 감지 방법 유형에서, 아크롤레인은 구입 가능한 알데히드-반응성 시약(예를 들어 Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA 로 부터)과 비촉매적으로 반응하여 착색 또는 형광 유도체를 생성한다. 아크롤레인과의 반응 생성물은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 또는 박막 크로마토그래피(TLC)에 의해 단리되어 표준 수단에 의해 흡광 또는 형광으로써 감지된다.
한가지 가능한 시약은 단실 히드라진(Molecular Probes, Inc.)이다.
단실 히드라진은 온화한 조건 하에 알데히드와 반응하여 반응 혼합물이 TLC 또는 HPLC 상에서 저농도로 감지될 수 있는 형광 생성물(Eggert, F. M. 일동,J. Chromatogr.333 (1985) : 123 : Avigad, G.,J. Chromatogr.139 (1977) : 343)을 제공한다.
보다 낮은 감지 한계, 보다 높은 반응 특이성, 또는 보다 온화한 반응 조건을 위해 단실 히드라진 보다 더 유용한 다른 시약들은 쿠마린 히드라지드, 플루오레스세인 티오세미카바지드(Molecular Probes, Inc.)와 같은 구입 가능한 다른 형광 히드라지드이다. 이들 시약은 어느 것이 특별한 요건에 가장 적합한지를 나타내기 위해 비교된다.
D.선구 약제로 부터 독소루비신의 항체 촉매화된 방출을 위한 스크린
1.배경.독소루비신 선구 약제 활성화는 두 기본적 방법 중 하나로 감지될 수 있다 ; 약제를 활성화하기 위해 선구 약제의 화학적 형질 전환을 수반하는 고유의 물리적 변화를 관찰함에 의한 생체의 감지, 또는 활성화된 약제의 독성 효과를 위한 생물학적 스크리닝에 의한 생체 내 감지.
2.스크리닝.단락 A 에서 고정화 방법을 사용한 모노클로날 세포계 상층액 내 항체 또는 복수액으로 부터 정제된 항체의 스크리닝은 박막 크로마토그래피 (TLC)또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 중 어느 하나의 표준 방법에 의해 실시한다. 전형적으로, 반응 혼합물은 200 μmol 선구 약제, 대략 1 μmol 항체, 140 mM 염화나트륨을 함유하며, 10 mM HEPES 완충액 내에 pH 7.4 에서 완충시킨다. 성분 농도 및 pH 의 변화를 또한 시험한다. 온도는 전형적으로 25℃ 이나, 선구 약제의 배경 (촉매화되지 않은 것) 가수분해가 보다 고온에서 현저히 증가되지 않으면, 온도를 상승시킨다.
독소루비신, 그 선구 약제 형태, 및 분해된 불활성화 선구 부분은 모두 흡광 또는 형광에 의해 감지될 수 있다. 독소루비신, 및 유사하게 독소루비신 선구 약제 둘다를 자외선 및 가시광선(흡광 최대 (메탄올) : 233, 252, 288, 479, 496, 529 nm)에서 강하게 흡광시킨다. 방향족 불활성화의 선구 부분은 자외선에서 260-280 nm 뿐만 아니라 220 nm 에서 강하게 흡수한다.
항체-촉매화 선구 약제 활성화의 TLC 에 의한 관찰은, 정제된 항체로써 또는 여기 기재된 96-웰 평판 선형 스크리닝 감지 방법을 사용하여 세포 배양물 상층액 내 불순한 항체로써 실시된다. 독소루비신 선구 약제 활성화의 TLC 는 TLC 평판 상에서 약제 및 선구 약제의 분리에 기인한 표준 방법에 의해 실시된다. 독소루비신 선구 약제가 가수분해되어 유리 독소루비신을 형성하면, 일차 아미노기가 약제 상에서 노출된다. TLC 매트릭스 및 용매 시스템의 적당한 선택으로, 활성 약제로부터 선구 형태의 분리가 쉽게 이루어진다. TLC-분리된 약제 및 선구 약제의 감지는 오렌지빛-적색의 가시적 조사로, 또는 자외선-방출광을 사용하여 독소루비신의 자연 형광에 의한다. 또한, 선구 약제 활성화가 일어나면, 자유 카르복실기가 이탈되는 방향족 선구 부분 내에서 형성되는데, 상기 부분은 상기 새로이 형성된 화합물에 선구 약제 및 독소루비신 둘다로 부터의 TLC 에 의한 분리를 허용하는 성질을 부여한다.
활성 약제 형성의 스크리닝은 또한 표준 조건 하에 HPLC 에 의해 실시된다. 선구 약제의 고갈 또는 약제 또는 선구 부분 형성의 가시 광선 및 적외선 감지는 직결 흡광 또는 형광 감지기와 함께 사용된다. 선구 약제, 약제 및 방출된 선구 부분은 가장 우수한 분리를 위해 최적화되는 일반적 용매 시스템을 사용하는 액상 칼럼 상에서 분리된다. 최적화되어야 하는 조건들은: 역상 칼럼의 유형, 용매의 유량, 용매 혼합물의 성분, 및 용리 프로파일(이소크라틱(isocratic) 용리 또는 구배 용리) 등이다.
3.선택.독소루비신은 세균 및 포유 동물 세포 둘다에 독성인 일반적인 세포 독소이다. 항체-방출된 독소루비신의 생물학적 효과를 위한 스크리닝은 다량의 촉매적으로 활성인 선구 약제-활성화 항체를 생성하는 세포계(세균 또는 하이브리도마)의 확인을 허용한다. 선구 약제가 세포독성이 아니면, 선구 약제-활성화 항체를 생성하는 세포계만이 선구 약제에 의해 살생된다. 이 이론은 β-락탐 항생제에 대한 증가된 저항성을 위한 스크리닝에 의해, 그리고 선구 약제 분해에 의해 티미딘을 생성하기 위한 티미딘 합성 효소가 부족한 촉매 항체 세포계의 능력에 의해 세포계의 생물학적 선택을 위한 본 명세서에 설명된 이론과 유사하다. 독소루비신 선구 약제의 경우, 스크리닝은 그러한 선택이 선구 약제 활성화에 의해 유발된 자멸에 의한 세포 죽음을 위한 것(촉매 항체에 의하여 부여된 증가된 생존 능력을 위한 것이라기 보다는)이라는데 있어 다르다. 따라서, 독소루비신 생성을 위한 생물학적 스크리닝의 경우, 각각의 세포계의 분취량을 따로 두고 스크리닝에 사용하지 않아 항체 생성 세포계가 선택 도중 손실되지 않도록 해야 한다. 실제로, 항체를 생성시키는 일련의 모노클로날 세포 집락(하이브리도마 또는 세균)은 선구 약제에 대한 연속 희석을 받게 된다. 투여량-의존 방식으로 죽음에 증가된 민감성을 나타내는 세포계가 더 조사되며; 상기 항체들은 단리되고 순수 상태에서 더욱 특성화된다. 대안적으로는, 일련의 동일한 세포계 집락에 투여되는 선구 약제의 연속적 투여 대신에, 실험시 독자적으로 결정된 최소로 만족스러운 항체 촉매 작용의 역학적 속도에 의하여 죽음에 이르도록 계산된 농도로서 단일 투여량의 선구 약제를 투여한다.
E.멜팔란 선구 약제의 촉매 활성화를 위한 항체의 스크리닝
항체는 전 단계에서 96 웰 평판 고정화 기술(A 단락에 기재됨)에 의한 하이브리도마 상층액 내에서 또는 후단계에서 생쥐 복수액으로 부터 스크리닝된다. 어떤 경우든 촉매는 기질 및 생성물의 HPLC 분리의 일반적 방법에 의해 감지될 수 있다. 기질(선구 약제) 및 생성물(약제 및 선구 부분)은 모두 방향족이며 HPLC 기구와 직결된 UV 감지기를 사용하여 소량으로 감지될 수 있다. 선행 스크린의 경우, 항체와 적합한 항온 처리 시간 후 웰로 부터의 분취량을 덜어 내어 HPLC 에 주입한다. 복수액으로 부터의 항체와 같이, 반응 분취량이 HPLC 상에 주입되어, 기질 및 생성물의 분리 뿐 아니라 감지 및 정량이 실시된다.
배합 및 투여
본 발명은 또한 암 및 다른 종양을 치료하기 위한 제약학적 조성물, 조합물 및 방법을 포괄한다. 보다 특별히, 본 발명은 포유 동물 숙주가 제약학적으로 허용가능한 방법으로 제약학적으로 효과적인 양의 표적 단백질 촉매 단백질 접합체 또는 접합체들, 또는 이특이적 항체 또는 항체들, 및 제약학적으로 효과적인 양의 선구 약제 또는 선구 약제들로 치료되는 종양 치료 방법에 사용하기 위한, 면역 접합체 {표적 단백질 및 촉매 단백질, 또는 표적 항체 및 촉매 항체(이특이적 항체)} 및 해당 선구 약제 또는 선구 약제들로 구성되는 조합물을 포함한다. 본 발명의 조합물과 방법은 사람 및 동물을 치료하는데 유용하다.
유리한 구체예로, 면역접합체는 숙주로의 선구 약제 도입 이전에 투여된다. 그리고 나서, 면역접합체의 표적화 단백질이 종양 부위에 표적되고 국부화되도록 하기에 충분한 시간이 면역접합체와 선구 약제 투여 사이에 허용된다. 상기 충분한 시간은 사용된 접합체에 따라 4 일 내지 1 주일일 수 있다. 면역접합체 투여 말엽과 선구 약제 투여 초엽 사이의 시간은 표적되는 부위 및 면역접합체 및 선구 약제의 성질과 함께 환자의 연령 및 상태와 같은 다른 인자들에 따라 변화한다. 원하는 치료 효과를 얻기 위해 일회 이상의 선구 약제 투여가 필요할 수 있다. 따라서, 선구 약제가 투여되기 전에 환자의 표적 부위에서는 최대 농도의 면역접합체 및 다른 부위에서는 최소 농도의 면역접합체를 이룰 목적으로 대개 실험적으로 측정하기 위해 정확한 섭생법이 요구될 것이다. 이 방법으로 최적의 선택적 치료 효과가 얻어질 수 있다.
면역접합체는 임의의 적합한 경로에 의해, 바람직하게 비경구적으로, 예를들어 주사 또는 주입에 의해 투여된다. 이들 화합물은 정맥내, 복강내, 경구, 임파관내의 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는 투여 또는 종양으로의 직접적인 투여라는 통상적인 방식을 사용하여 투여된다. 정맥내 투여가 특히 유리하다. 면역접합체 또는 선구 약제로 구성되는 본 발명의 조성물은 액체 용액 또는 현탁액, 정제, 환제, 분말, 좌약, 중합체 미소 캡슐 또는 소포, 리포종, 및 주사가능 또는 주입가능 용액을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 투여 형태일 수 있다. 바람직한 형태는 투여 방식 및 치료 적용에 좌우된다. 예를 들어, 항체-효소 접합체 또는 이특이적 항체의 경구 투여는, 접합체 단백질이 예를 들어 정제 형태로 경구로 투여되면, 위장 내에서 분해되는 경향이 있으므로 바람직하지 않을 수 있다.
비경구적 투여를 위한 면역접합체 또는 선구 약제의 적합한 배합물은 각 성분이 유성 또는 수성 소포인 현탁액, 용액 또는 유탁액을 포함하며, 임의로 현탁제, 정착제 및/또는 분산제와 같은 배합체를 함유한다. 대안적으로, 면역접합체 또는 선구 약제는 사용 전에 적합한 부형액, 예컨대, 살균한 피로겐이 없는 물과의 재구성을 위한 분말 형태이다. 원한다면, 면역접합체 항체 및/또는 선구 약제는 단위 투여량 형태로 조제된다. 배합물은 편리하게 주사용으로 등장 염수 내에서 제조된다.
본 발명의 조성물에 대한 가장 효과적인 투여 및 투여량은, 질병의 심각성과 경로, 환자의 건강 및 치료에 대한 반응, 그리고 치료 의사의 판단에 좌우된다. 따라서, 면역접합체 및 선구 약제의 투여량은 개별적인 환자에 맞추어져야 한다.
그럼에도 불구하고, 본 발명의 효과적인 면역접합체 투여량은 약 1.0 내지약 100 mg/m2이다. 본 발명의 선구 약제의 효과적인 투여량은 사용된 특별한 선구 약제 및 이것이 유도되는 모(母) 약제에 좌우될 것이다. 면역접합체 및 선구 약제가 투여될 정확한 투여량은 투여 경로, 환자의 체중, 및 병의 경과, 선구 약제의 성질, 및 면역 접합체의 촉매적 성질에 좌우될 것이다. 선구 약제가 모 약제 보다 덜 세포독성이므로, 모약제에 대해 당 분야에서 알려된 것 보다 과량의 투여량이 사용될 수 있다.
선구 약제는 약제 자체의 투여를 위한 일반적 사용에서의 투여량으로 투여되나, 바람직하게 보다 낮은 투여량, 예컨대 일반적으로 투여되는 약제 단독의 투여량의 대략 0.001 내지 0.5 배로 투여될 것이다.
본 발명의 다른 구체예는 몇가지 선구 약제와 단일 항체-효소 접합체를 사용하는 조합 화학 요법의 방법을 제공한다. 이 구체예에 따라, 모두 면역접합체 내에서 동일한 효소 또는 촉매 항체를 위한 기질인 다수의 선구 약제가 사용된다. 따라서, 특별한 항체-효소 접합체 또는 이특이적 항체는 다수의 선구 약제를 세포독성 형태로 전환시켜 종양 부위에서 증가된 항암 활성을 결과시킨다.
본 발명의 또다른 구체예는 다수의 면역접합체의 사용을 포함하며, 이때 항체의 특이성이 다양하여, 즉 다수의 면역접합체가 사용될 때 각각 주목되는 종양 상의 서로 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 갖는다. 이들 면역접합체의 효소 성분은 동일하거나 상이할 수 있다. 이 구체예는 종양 표면 상의 다양한 항원의 양이 알려져 있지 않고 충분한 효소가 종양 부위에 표적되는지를 확실하게 하기 원하는 상황에서 특히 유용하다. 종양에 대해 서로 다른 항원 특이성을 갖는 다수의 접합체의 사용은 선구 약제 또는 일련의 선구 약제의 전환을 위한 종양 부위에서의 충분한 효소를 얻을 가능성을 증가시킨다. 또한, 이 구체예는 일반 조직이 동일한 종양-결합 항원들 모두를 가질 가능성이 작으므로, 종양에 대한 고도의 특이성을 얻기 위해 중요하다 {비교, I. Hellstrom 일동, "Monoclonal Antibodies to Two Determinants of Melanoma-Antigen p. 97, Act Synergistically In Complement-Dependent Cytotoxicity", J. Immunol. 127 (No. 1) (1981) : 157-160}.
다중 전이 병변을 갖는 몇몇 환자들에서, 세포의 약간만이 표적된 항원을 발현시키는 종양 세포의 이질성으로 인해, 종양 모사가 어려운 것으로 나타났다. 종양 내부 또는 종양간의 이질성이 존재하는 것으로 알려진 상기 종양에서 서로 다른 종양 항원을 인지하는 모노클로날 항체들의 혼합물이 선구 약제를 활성화하기 위해 사용된다. 이러한 접근은 항원 이질성이 존재하는 경우 종양 부위에서 보다 높은 총 약제 농도를 얻을 가능성을 부여한다 (Wahl, R.,Cancer Research, 증보판 (1990) : 941-948).
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 예시하는 것이지 제한하는 것은 아니다. 당업자에게 명백한 임상학적 치료에서 일반적으로 당면하는 다양한 조건 및 매개 변수의 다른 적합한 수정 및 적용은 본 발명의 정신 및 범주 안에 있다.
실 시 예
실시예 1a: 선구 약제, 선형 트리메틸벤조일, 트리메톡시벤조일-, 및 5'-O-(2,6-디메톡시벤조일)-5-플루오로우리딘, 화합물 1a, 1b, 및 1c 의 제조.
5'-O-(2,4,6-트리메틸벤조일)-5-플루오로우리딘 1a , 5'-O-(3,4,5-트리메톡시벤조일)-5-플루오로우리딘 1b 및 5'-O-(2,6-디메틸벤조일)-5-플루오로우리딘 1c .(각각의 참조에서, 하기 본문에서 진하게 쓰여진 화합물의 번호는 도면에 제시된 합성 도표에서 그 화합물들을 지칭한다.) 본 실시예에서 진하게 쓰인 번호의 화합물들은 제 1a 및 1c 도를 참고하시오.
5'-O-(2,4,6-트리메틸벤조일)-5-플루오로리딘1a및 5'-O-(3,4,5-트리메톡시벤조일)-5-플루오로우리딘1b의 제조는 2,4,6-트리메틸벤조일클로라이드 및 3,4,5-트리메톡시벤조일 클로라이드를 피리딘 내에서 2',3'-O-이소프로필리덴-5-플루오로우리딘65(실시예 16 에서 제조됨)과 반응시킨 후, 65℃ 에서 50% 포름산을 사용한 산 가수분해에 의해 달성되었다.
5'-O-(2,6-디메톡시벤조일)-5-플루오로우리딘1c은 피리딘 내에서 화합물65및 2,6-디메톡시벤조일 클로라이드의 반응에 뒤이어 65℃ 에서 50% 포름산을 사용한 산 가수분해에 의해 달성되었다.
상세하게, 합성은 하기와 같다 :
5'-O-(2,4,6-트리메틸벤조일)-5-플루오로우리딘 1a
2,4,6-트리메틸벤조산 328 mg 및 티오닐 클로라이드 3 mL 의 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 휘발성 성분을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 CH2Cl25mL 에 용해시키고, 다시 휘발성 성분을 진공에서 증발시켜 2,4,6-트리메틸벤조일 클로라이드를 생성시키켰다.
실시예 16 의 화합물65, 2,3'-O-이소프로필리덴-5-플루오로우리딘 151 mg 으로 부터 무수 피리딘(10 mL)을 3 회 증발시켰다. 피리딘(1 mL)을 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 얼음욕(ice bath)으로 냉각시키고, CH2Cl24 mL 내 2,4,6-트리메틸벤조일 클로라이드 456 mg 의 용액을 적가했다. 첨가 완결 1 시간 후에, MeOH 1mL 를 첨가했다. 16 시간 동안 방치한 후 휘발성 성분을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트(75 mL)에 용해시켜 포화 NaHCO3(2 x 50 mL) 및 물(25 mL)로 세척하고, 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시키고, 플레시크로마토그래피(50% 에틸아세테이트/헥산, R10.63)에 의해 정제하여 무색 고체로서 생성물 142 mg 을 생성시켰다.1H NMR (DMSO-d6)δ1.27(s,3), 1.48(s,3), 2.18(s,6), 2.22(s,3), 4.30(m,1), 4.45(m,2), 4.81(m,1), 5.10(dd,1), 5.78(d,1), 6.87(s,2), 8.05(d,1), 11.97(d,1).
50% 포름산 6 mL 내 상기 아세토니드 440 mg의 혼합물을 65℃에서 2 시간 동안 가열하였다. 휘발성 성분을 진공에서 증발시켰다. 잔류물(408 mg)은 하기 성질을 가졌다.1H NMR (DMSO-d6)δ2.13(s,6), 2.19(s,3), 3.92(m,1), 4.05(m,2), 4.44 (m,2), 5.72(d,1), 6.83(s,2), 7.81(d,1), 11.82(bs,1).
잔류물을 40% CH3CN/H2O 로 용리되는 Cl8 칼럼상 역상 HPLC 에 의해 정제하여화합물1a생성물 260 mg 을 무색 고체로 얻었다.
5'-O-(3,4,5-트리메톡시벤조일)-5-플루오로우리딘 1b
피리딘으로 부터 수분을 공비제거한 후, 건조 피리딘 4mL 에 실시예 16 의 화합물65, 2',3'-이소프로필리덴-5-플루오로우리딘 0.604 g 을 용해시키고, 0℃ 로 냉각시켰다. 디클로로메탄 4 mL 내 3,4,5-트리메톡시벤조일 클로라이드 0.92 g 의 용액을 0℃ 에서 1 시간 기간에 걸쳐 적가했다. 0℃ 에서 1 시간 더 교반한 후, 결과 혼합물을 메탄올 7.5 mL 를 첨가하여 ??칭시켰다. 혼합물을 시럽이 되도록 증발시킨 후 에틸 아세테이트(75 mL)에 재용해시키고, 포화 탄산수소 나트륨(2 x 75 mL) 및 물(50 mL)로 세척하였다. 그리고 나서, 조 혼합물을 에틸 아세테이트/헥산을 사용하여 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여, 5'-O-(3,4,5-트리메톡시벤조일)-2',3'-이소프로필리덴-5-플루오로우리딘 0.30 g 을 산출했다.1H NMR (DMSO-d6)δ1.32(s,3), 1.52(s,3), 3.73(s,3), 3.85(s,6), 4.40(m,1), 4.53(m,2), 4.94(m,1), 5.09(m,1), 5.77(d,1), 7.22(s,2), 8.01(d,1), 11.09(d,1).
5'-O-(3,4,5-트리메톡시벤조일)-2',3'-이소프로필리덴-5-플루오로우리딘 0.30 g 을 50% 수성 포름산 4.2 mL 에 용해시키고 65℃ 에서 교반하여 2 시간 동안 가열하였다. 혼합물을 진공에서 농축시킨 다음, 에틸 아세테이트를 사용하여 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여, 5'-O-(3,4,5-트리메톡시벤조일)-5-플루오로우리딘1b0.15 g 을 생산하였다 :1H NMR (CD3CN)δ3.81(s,3), 3.86(s,6), 4.15-4.28(m,3), 4.53(dd,1), 4.63(dd,1), 5.75(d,1), 7.30(s,2), 7.59(d,1).
5'-O-(2,6-디메톡시벤조일)-5-플루오로우리딘 1c : 0℃, 아르곤 분위기 하에서, 피리딘 (3 mL) 내 화합물65(0.45 g, 1.5 mmol)의 용액에 메틸렌 클로라이드(2 mL) 내 2,6-디메톡시벤조일클로라이드(0.4 g, 4 mmol)의 용액을 주사기를 통해 적가하고, 결과 혼합물을 상기 온도에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후, 메탄올(3 mL)을 반응 혼합물에 첨가하고 용매를 진공에서 제거하였다. 결과 물질을 에틸 아세테이트(75 mL)에 용해시키고 물(20 mL) 내 중탄산나트륨(2 x 20 mL)의 포화 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고, 농축시키고, 플래시 크로마토그래피하여 오염성 물질로서 커플링 화합물을 산출했다 (0.66 g, 95 %, Rf, 0.46, 실리카, 메틸렌클로라이드, 메탄올, 헥산, 80, 1, 19).
1 H NMR(DMSO-d6): 8.98(bs,1H), 7.56(d,1H), 7.32(m,1H), 6.56(d,2H), 5.92(m,1H), 4.82(m,2H), 4.72(m,1H), 4.62(m,2H), 4.40(m,1H), 3.80(s,6H), 1.61(s,3H), 1.40(s,3H).
포름산 (50 %, 6 mL) 내 상기 화합물(0.47 g, 1 mmol)의 용액을 65℃, 아르곤 분위기 하에서 2 시간 동안 교반하며 가열하였다. 반응의 완결 후, 용매를 진공에서 제거하고 결과 물질을 역상 HPLC 로 정제하여 화합물1c(0.27 g, 65 %)를 산출했다.
1 H NMR :7.82(d,1H), 7.38(1,1H), 6.62(d,2H), 5.80(d,1H), 4.52(dd,2H), 4.16(m,3H), 3.86(s,6H).
실시예 1b: 실시예 1a 의 선구 약제1b를 위한 합텐, 화합물4, 트리메톡시벤조에이트-5-플루오로우리딘의 선형 포스포네이트의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨의 화합물은 제 1b 도를 참고하시오.
우리딘을 5 위치에서 요오드화하여 요오디드3a를 얻었다 (Robins, J.M., 일동,Can. J. Chem.60 (1982) : 554-557). 히드록실기를 보호하여 요오디드3c를 얻었다. 3-부틴-1-올을 4 단계에 걸쳐 알킨3d로 변환시켰다. 알킨3d및 요오디드3c를 Pd(II) 촉매를 사용하여 커플링시켜 누클레오시드 유사체3e를 산출한다 (Robins, J. J., 일동,J. Org. Chem.48 (1983) : 1854-1862). 선택적인 보호 제거는 알콜3f를 생성시킨다.
디벤질 3,4,5-트리메톡시페닐포스포네이트2를J. Med. Chem.32 (1989) : 1580-1590 의 방법에 따라 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0), 트리에틸아민 및 톨루엔의 존재 하에 고온에서 3,4,5-트리메톡시브로모벤젠과 디벤질 포스파이트를 반응시켜 제조할 수 있다. 디에스테르2와 PCl51 당량의 반응은 알콜3f와 반응하여 디에스테르3g를 산출하는 모노클로리데이트2a를 생성한다. 환원 및 염기 가수분해는 1 차 아미노기를 통해 운반 단백질에 연결될 수 있는 합텐4를 산출한다.
상세하게, 합성은 다음과 같다 :
5-요오도우리딘 3a
5-요오드우리딘을 본원에 참고 문헌으로 포함된, Robin, M. J., 일동,Can J. Chem.60 (1980) : 554-557 의 방법에 따라 제조했다.
5'-O-t-부틸디메틸실릴-5-요오도우리딘 3b
이미다졸(216 mg)을 얼음욕으로 냉각시킨 DMF 1 mL 내 t-부틸디메틸클로로실란(239 mg) 및 트리올3a(490 mg)의 혼합물에 첨가했다. 혼합물을 실온으로 가열하였다. 16 시간 후 혼합물을 0.1 M HCl (25 mL)에 붓고, 에틸 아세테이트(3 x 50 mL)로 추출하고, 수성상을 물로 세척하고, 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피(7% MeOH/CH2Cl2)에 의한 정제는 생성물 460 mg 을 무색 고체로서 산출했다 :
1 H NMR(DMSO-d6) δ 0.08-0.12(m,6), 0.90(s,9), 3.72(dd,1), 3.80(dd,1), 3.90(bs,2), 4.02-3.98(m,1), 5.76(d,1), 7.93(s,1), 11.74(bs,1).
5'-O-t-부틸디메틸실릴-2',3'-O-3-N-트리스(4-메틸벤조일)-5-요오도우리딘 3c
디올3b450 mg 으로 부터 무수 피리딘(3 x 15 mL)을 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 피리딘 15 mL 에 용해시키고 트리에틸아민 650 mL 를 첨가한 다음, 4-플루오일 클로라이드 612 μL 를 첨가했다. 혼합물 50℃ 에서 5 시간 동안 가열했다. 혼합물을 실온으로 식히고, 부가의 트리에틸아민 410 μL 및 4-톨루오일 클로라이드 390 mL 를 첨가했다. 16 시간 동안 가열을 계속한 다음 휘발성 성분을 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 클로로포름(50 mL)에 용해시키고, 1M HCl (3 x 50mL) 및 물(2 x 50 mL)로 세척하고, 진공에서 농축시키고 플래시 크로마토그래피 (30 % 에틸 아세테이트/헥산)에 의해 정제하여 생성물 534 mg 을 무색 고체로 얻었다. 1 H NMR(CDCl3) δ 0.33(s,6), 1.07(s,9), 2.35(s,3), 2.38(s,3), 2.41(s,3), 4.06(bs,2), 4.47(bs,1), 5.58(dd,1), 5.73(d,1), 6.57(d,1), 7.13(d,2), 7.15-7.25(m,4), 7.79(d,4), 7.90(d,2), 8.34(s,1).
4-(4-톨루엔설포닐옥시)-1-부틴
트리에틸아민(12.2 mL)을 얼음욕으로 냉각시킨 CH2Cl250 mL 내 4-톨루엔 설포닐 클로라이드 (16.95 g) 및 3-부틴-1-올(5.09 g)의 혼합물에 적가했다. 혼합물을 실온으로 가열하였다. 21 시간 후, 혼합물을 에틸 아세테이트(150 mL)에 붓고 0.1 M HCl (75 mL), 포화 NaHCO3(75 mL) 및 염수(75 mL)로 세척하여, 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피 (10% 에틸 아세테이트/헥산)에 의한 정제로 생성물 16.57 g 을 무색 고체로 얻었다.
IR(순수) 3293, 3067, 2963, 2925, 2125, 1734, 1599, 1496, 1465, 1360, 1308, 1293, 1246, 1190, 1176, 1098, 1021, 982, 906, 817, 769, 665 cm-1, 1 H NMR(CDCl3) δ 1.93(t,1), 2.41(s,3), 2.52(dt,2), 4.06(t,2), 7.32-7.28(m,2), 7.79-7.75(m,2).
N-(3-부티닐)프탈이미드
칼륨 피탈이미드(2.56g)를 DMF 20 mL 내 상기 토실레이트(1.34 g)의 혼합물에 첨가했다. 혼합물을 50℃ 에서 6 시간 동안 가열하였다. 혼합물을 냉각시키고, 에틸아세테이트 (2 x 100 mL) 및 1 M HCl(25 mL) 사이에 분배하고, 나머지 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피(15 % 에틸 아세테이트/헥산)에 의한 정제로 생성물 1.1 g 을 무색 고체로 얻었다.
IR(KBr) 3459, 3253, 1767, 1703, 1469, 1429, 1402, 1371, 1337, 1249, 1210, 1191, 1116, 1088, 996, 868, 795, 726 cm-1; 1 H NMR(CDCl3) δ 1.96(t,1, J=2.7), 2.62(dt, 2, J=2.7, 7.1), 3.88(t, 2, J=7.0), 7.74-7.71(m, 2), 7.87-7.84(m, 2); 13 C NMR(CDCl3) 18.31, 36.49, 70.23, 80.23, 123.33, 131.94, 134.01, 167.98.
4-벤질옥시카르보닐아미노-1-부틴 3d
히드라진 수화물(268μL)을 에탄올 20 mL 내 상기 프탈이미드(1.1g)의 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 1.5 시간 동안 환류 하에 가열했다. 혼합물을 실온으로 식히고, 고무질의 침전물을 1 M 염산을 첨가하여 분산시킨 다음, 무색 고체 침전물이 형성되었다.
에탄올을 진공에서 증발시키고, 고체를 여과하고 물로 세척했다. 수성상을 동결 건조시켜 무색 고체 0.93 g 을 얻었다.
1 H NMR(CD3OD) δ 2.52(t,1, J=2.7), 2.59(dt,2, J=2.7, 6.8), 3.08(t,2, J=6.7);
13 C NMR(CD3OD) δ 17.99, 39.57, 73.11, 79.44.
고체를 50% MeOH/물 40 mL 에 용해시키고 트리에틸아민 766 μL 를 첨가했다. 그리고 나서, MeOH 10 mL 내 벤질옥시카르보닐 숙신이미드(1.82 g)의 용액을 첨가했다. 1.5 시간 후, 부가의 벤질옥시카르보닐 숙신이미드 1 g 을 첨가하고, 트리에틸아민을 첨가하여 pH 를 9 이상으로 유지하였다. 부가의 1.5 시간 후, 1 M HCl 을 첨가하여 pH 를 5 로 조정하였다. 휘발성 성분을 제거하고 잔류물을 통해 크로마토그래피(2.5% MeOH/CH2Cl2)에 의해 정제하여 생성물 0.82 g 을 얻었다.
IR(순수) 3416, 3299, 3066, 3034, 2949, 2119, 1703, 1526, 1455, 1367, 1333, 1251, 1216, 1141, 1073, 1021, 1001, 913, 824, 777, 753, 739, 698, 645 cm-1; 1 H NMR(CDCl3) δ 2.00(t, 1, J=2.5), 2.41(dt, 2, J=2.3, 6.2), 3.37(q, 2, J=6.3), 5.12(s, 2), 7.32-7.38(m, 5); 13 C NMR(CDCl3) δ 19.77, 39.61, 66.71, 70.00, 128.05, 128.38, 128.44, 136.33, 156.16.
5'-O-t-부틸디메틸실릴-2',3'-O-3-N-트리스(4-메틸벤조일)-5-(4-N-카르보벤조일옥시아미노부티닐)우리딘 3e :트리에틸아민 (60 mL, 탈산소됨) 내 CuI (200 mg),
(Ph3P)2PdCl2(200 g), 및 알킨3d(4.8 g, 2 당량), 및 요오도 화합물3c(10 g, 12 mmol)의 용액을 50℃ 에서 밤새 가열하였다. 반응 완결 후 용매를 진공에서 제거하고, 잔류물을 클로로포름에 용해시키고, 이나트륨 에틸아민테트라 아세트산(5%, 2 x 30 mL)으로 세척하고, 농축하여 생성물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제시켜 오일로서 화합물3e를 얻었다 (8 g, 79 %, Rf0.26, 에테르 및 메틸렌클로라이드 4 : 96).
1 H NMR: 8.20(s,1H), 7.90(d,2H), 7.80(t,4H), 7.38(m,5H), 7.22(t,4H), 7.12(d,2H), 6.60(d,1H), 5.72(d,1H), 5.69(t,1H), 5.40(t,1H,NH), 5.16(bs,2H), 4.42(s,1H), 4.06(s,3H), 3.41(m,2H), 2.62(t,2H), 2.42(s,3H), 2.40(s,3H), 2.36(s,3H), 1.02(s,9H), 0.62(s,6H).
히드록시 화합물 3f 의 제조: THF (5 mL) 내 실릴 화합물3e(0.91 g, 1 mmol)의 용액에 테트라부틸암모늄 플루오로라이드(1 M, 1.2 mL)를 아르곤 분위기하 0℃ 에서 첨가하고 2 시간 동안 교반했다. 반응 완결 후 용매를 진공에서 제거하고, 생성물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 히드록시 화합물3f를 얻었다 (0.64 g, 80 %, Rf, 0.41, 에틸아세테이트, 헥산 1 : 1)
1 H NMR: 8.46(s,1H), 7.92(m,6H), 7.32(m,6H), 6.40(d,1H), 5.82(m,2H), 5.32(bs, 1H), 5.16(bs, 2H), 4.42(s,1H), 3.98(AB, q, 2H), 3.42(m, 2H), 3.20(m, 2H), 2.60(m, 2H), 2.42(s, 3H), 2.40(s, 3H), 2.36(s, 3H).
디벤질 3,4,5-트리메톡시페닐포스포네이트 2
3,4,5-트리메톡시브로모벤젠을Tetrahedron Lett.26 (1985) : 5939-9942 의 방법에 따라 3,4,5-트리메톡시 벤조산으로 부터 제조한다. J. Med. Chem. 32(1989) : 1580-1590 의 방법에 따라 디벤질 포스파이트를 3,4,5-트리메톡시브로모벤젠과 함께 테트라키스(트리페닐포스핀) 팔라듐(0), 트리에틸아민 및 톨루엔 존재 하에 가열하여 디벤질 3,4,5-트리메톡시페닐포스포네이트2를 얻었다.
벤질 3,4,5-트리메톡시페닐포스포노클로리데이트 2a
오염화인(1.15 mmol)을 CHCl35 mL 내 디에스테르2(1 mmol)의 혼합물에 첨가한다.1H NMR 에 의해 한 분액에 출발 물질이 남아 있지 않음을 보일 때까지 혼합물을 60℃ 에서 가열한다 (대략 4 시간). 혼합물을 실온으로 식히고 휘발성 성분을 밤새 진공에서 제거한다.
포스포네이트 에스테르 3g
CH2Cl24 mL 내 클로리데이트2a(1 mmol)의 용액을 실온에서 CH2Cl24 mL 내 DMAP (1.5 mmol) 및 알콜3f(1 mmol) 용액에 첨가한다. TLC 에 의해 관찰하여 출발 물질이 소모되었을 때, 용매를 진공에서 증발시킨다. 생성물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제한다.
5-(4-아미노부틸)-5'-O-(3,4,5-트리메톡시페닐포스포닐)우리딘 4
메탄올 10 mL 내 5 % pd-C (10 중량%) 및 누클레오시드 유도체 3g (1 mmol)의 혼합물을 수소의 흡수가 완결될 때까지 실온에서 수소 분위기 하에서 교반한다. 촉매를 셀라이트 페드로 여과하여 제거하고, 메탄올로 세척한다. 여과물을 얼음욕으로 냉각시키고, 무수 암모니아를 용액 내로 20 분 동안 커플링시킨다. 휘발성 성분을 진공에서 제거하고 생성물을 역상 HPLC 로 정제한다.
실시예 1c: 실시예 1a 의 선구 약제1a에 대한 합텐, 트리메틸벤조에이트-5-플루오로우리딘의 선형 포스포네이트, 화합물4a의 제조
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제 1d 도를 참고하시오.
중간체 포스포클로리데이트2d를 4 단계로 브로모메시틸렌으로 부터 출발하여 제조하였다. 브로모메시틸렌을 THF 내 n-부틸리튬으로 처리하고, 뒤이어 디에틸포스포클로리데이트를 첨가하여 포스포네이트 화합물2b를 얻었다. 화합물2b를 트리메틸실릴 요오디드로 처리하고, 뒤이어 희석 염산으로 처리하여 상응하는 히드록시 화합물2c를 얻었다. 화합물2c를 50℃ 에서 클로로포름 내 PCl5로 처리하여 포스포클로리데이트2d를 얻었다. 화합물3f를 DMAP 존재 하에 메틸렌 클로라이드 내 포스포클로리데이트2d와 커플링시켜 커플링 화합물3h를 얻었다. 화합물3h를 에틸아세테이트 내 Pd-C 를 사용하여 수소화하여 수성 암모니아로 처리하여 합텐4a를 산출하는 벤질화 화합물을 얻었다.
상세하게,합성은 다음과 같다.
디에틸 2,4,6-트리메틸페닐 포스포네이트 2b : 건조 THF (100 mL) 내 2-브로모메시틸렌 (4 g, 20 mmol) 용액에 n-부틸리튬 (1.6 M, 16 mL) 용액을 -78℃, 아르곤 분위기 하에 주사기로 적가하고, 1 시간 동안 교반하였다. 1 시간 후, THF (10 mL) 내 포스포클로리데이트 (4.12 g, 1.2 당량) 용액을 첨가하고 1 시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후, 염화 암모늄 용액 (10 %, 20 mL)을 혼합물에 첨가하고 30 분 동안 교반하였다. 유기상을 분리하고, 건조시키고, 농축하고, 생성물을 플래시크로마토그래피에 의해 정제하여 포스페이트2b를 오일로 얻었다 (1.75 g, 34 %, Rf, 0.34, 에틸아세테이트, 헥산, 1 : 3).
1 H NMR: 7.42(m, 10H), 6.92(d,2H), 4.16(m,4H), 2.62(s,6H), 2.32(s,3H), 1.32(t,6H).
벤질 2,4,6-트리메틸페닐 히드록시포스포네이트 2c : 메틸렌 클로라이드 (15 mL) 내 트리메틸실릴 요오디드 (2.4 g 12 mmol) 및 디에틸포스페이트2b(1.5 g, 5.8 mmol) 용액을 0℃ 에서 1 시간 동안 교반했다. 반응 완결 후, 티오황산 나트륨 용액(5 %, 5 mL)을 첨가하고 15 분 동안 교반하였다. 유기상을 분리하고, 건조시키고, 농축하여 오일성 화합물을 얻었다. 얻어진 화합물을 THF(5 mL)에 용해시키고 1 시간 동안 묽은 염산(5 %, 5 mL)으로 교반하였다. 유기상을 분리하고, 건조시키고, 농축하여 히드록시 화합물을 오일로 얻었다 (1 g, 85 %).
1 H NMR: 11.00 (bs,2H), 7.62 (d,2H), 3.32 (s,6H), 2.96 (s,3H).
피리딘 (15 mL) 내 트리클로로아세토니트릴 (4.3 g, 6 당량), 벤질알콜 (1.6 g, 3 당량) 및 디히드록시 화합물(1 g, 5 mmol) 용액을 아르곤 분위기 하 75℃ 에서 밤새 가열하였다. 반응 완결 후 용매를 진공으로 제거하고, 생성물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 모노벤질화된 화합물2c를 오일로서 얻었다 (0.72 g, 50 %, Rf, 0.36, 메탄올, 메틸렌 클로라이드, 1 : 9).
1 H NMR: 12.20(bs,1H), 7.32(m,5H), 6.92(d,2H), 5.06(d,2H), 2.64(s,6H),2.32(s,3H).
벤질 2,4,6-트리메틸페닐 포스포노클로리데이트 2d : 클로로포름 (10 mL) 내 히드록시 화합물2c(0.58 g, 2 mmol) PCl5(0.56 g, 2 mmol)의 용액을 50℃ 에서 2 시간 동안 가열하였다. 반응 완결 후 용매를 제거하고, 화합물을 진공에서 건조시켰다.
1 H NMR: 7.42(m,5H), 6.92(d,2H), 5.42(m,2H), 2.72(s,6H), 2.42(s,3H).
화합물 3h : 메틸렌 클로라이드 (3 mL) 내 DMAP (61 mg, 0.5 mmol), 히드록시 화합물3f(300 mg, 0.38 mmol) 용액에 메틸렌 클로라이드 내 포스포클로리데이트2d(151 mg, 1.3 당량)의 용액을 아르곤 분위기 하에 주사기로 첨가했다. 반응 완결 후 용매를 진공에서 제거하고, 플래시 크로마토그래피에 의한 정제로3h를 얻었다 (138 mg, 33 %, Rf, 0.42, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 헥산 3,3,4).
1 H NMR: 7.82(m,4H), 7.20(18H), 6.42(t,2H), 6.18(t,1H,NH), 5.72(m,1H), 5.42(m,1H), 5.02(m,5H), 4.24(m,3H), 3.42(m,4H), 2.62-2.40(Me 의 단일선, 18H).
5-(4-아미노부틸)-5'-O-(2,4,6-트리메틸페닐포스포노일)우리딘 4a : 에틸 아세테이트 (2 mL) 내 화합물3h(156 mg, 0.14 mmol)의 현탁액을 수소 분위기 하에 2 시간 동안 Pd-C (10 %, 15 mg)의 존재 하에 교반했다. 반응 완결 후 촉매를 여과하여 제거하고, 용매의 제거로 수소화된 화합물(70 mg, 56 %)을 얻었다.
메탄올 (4 ml) 내 수산화암모늄 (5 mL), 본 수소화된 화합물(70 mg, 0.08 mmol)의 용액을 밀폐된 튜브 내에서 밤새 가열하였다. 반응 완결 후 용매를 진공에서 제거하고, 생성물을 역상 HPLC 아세토니트릴(1) 및 물(99) 에 의해 정제하여 순수한 화합물4a를 무색 고체로서 얻었다 (14 mg, 37 %).
1 H NMR: 7.92(s,1H), 6.92(d,2H), 6.02(d,1H), 4.32(t,1H), 4.18(m,1H), 4.08(m,1H), 3.92(m,1H), 3.53(m,1H), 3.00(m,2H), 2.62(s,6H), 2.22(s,3H), 2.42(m,2H).
실시예 2a: 선구 약제, 분자 내 트리메톡시벤조에이트-5-플루오로우리딘, 화합물10의 제조
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제2a도를 참고하시오.
제조법이 실시예 8a 에 서술된 브로모벤조산5를 리튬 할로겐 교환 반응시키고, 보호된 요오도에탄7(제 2a 도 참고)로 알킬화시킨다. 생성물8을 탈수시켜 대칭 무수물을 형성하고, 이를 5-플루오로우리딘과 반응시켜 안정한 선구 약제 선구물질,9를 형성한다. 선구 물질의 보호기는 용이하게 제거되어 선구 약제10을 얻을 수 있다.
상세하게, 합성은 다음과 같다.
2-브로모에틸 4,4'-디메톡시트리페닐메틸에틸 에테르 6
DMAP (100 mmol)을 실온에서 DMF (100 mL) 내 4,4'-디메톡시트리페닐메틸 클로라이드 (100 mmol) 및 2-브로모에탄올 (100 mmol) 용액에 첨가한다. 16 시간 후, 혼합물을 물(300 mL)에 붓고,에틸 아세테이트(3 x 100 mL)로 추출한다. 유기상을 물(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시킨다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 무색 고체로 얻었다.
4,4'-디메톡시트리페닐메틸 2-요오도에틸 에테르 7
아세톤 100 mL 내 NaI (10 mmol) 및 브로마이드6(10 mmol)의 용액을 빛을 차단하고 환류 하에 2 시간 동안 가열한다. 결과 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 고체를 여과하여 제거하고, 용매는 여과액으로 부터 진공에서 증발시킨다. 결과된 황색 오일을 부가의 정제 없이 사용한다.
2-[2-(4,4'-디메톡시트리페닐메톡시)에틸]-3,4,5-트리메톡시벤조산 8
t-부틸리튬(n-펜탄 내 1.7 M 용액, 15 mmol)을 THF 50 mL 내 브로마이드5(5 mmol)의 용액에 첨가하며, 이때 혼합물의 온도를 -95℃ 이하로 유지한다. 첨가가 완결된 후 혼합물을 -78℃ 로 가열한다. 30 분 후, 요오디드7을 일부 첨가하고, 혼합물을 0℃ 로 데운다. 물(50 mL)을 첨가한 다음, 혼합물의 pH 를 0.1 M HCl 을 사용하여 조심스럽게 3 으로 조정한다. 혼합물을 에틸 아세테이트(3 x 100 mL)로 추출한다. 유기상을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시킨다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물 무색 오일로 산출한다.
5'-O-{2-[2-(4,4'-디메톡시트리페닐메톡시)에틸]-3,4,5-트리메톡시벤조일}-5-플루오로우리딘 9
CH2Cl210 mL 내 DCC (2.5 mmol)의 용액을 실온에서 CH2Cl210 mL 내 산8(5 mmol)의 용액에 첨가한다. 1 시간 후 고체를 여과하여 혼합물로 부터 제거하고, 고체를 CH2Cl25 mL 로 세척하고, CH2Cl25 mL 내 1-히드록시벤조트리아졸(0.25 mmol) 및 5-플루오로우리딘(2.5 mmol)의 혼합물을 합쳐진 유기상에 첨가한다. TLC 로 관찰하여 반응이 완결되면 혼합물을 진공에서 농축시킨다. 플래시 크로마토그래피에 의한 혼합물의 정제로 생성물을 무색 고체로서 얻는다.
5'-O-[2-(2-히드록시에틸)-3,4,5-트리메톡시벤조일]-5-플루오로우리딘 10
에테르9(0.1 mmol)를 실온에서 80% 수성 아세트산 (10 mL)에 일부 첨가한다. 15 분 후, 혼합물을 포화 NaHCO3(100 mL)에 붓고 에테르(3 x 100 mL)로 추출한다. 합쳐진 유기상을 더 이상의 가스 방출이 식별되지 않을 때까지 5% NaHCO3100 mL 부로 세척한다. 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시킨다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 산출한다.
실시예 2b: 실시예 2a 의 선구 약제 합텐의 제조 : 트리메톡시벤조에이트-5-플루오로우리딘 고리 포스포네이트, 화합물15.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제 2b 도를 참고하라.
시클릭 포스포네이트13을 합성함에 있어, 대표적인 계획에 따라 아릴포스포네이트11의 브롬화, 리튬화, 히드록시알킬화, 및 고리화를 수행한다. 포스포네이트 에스테르의 비누화, 염소화, 및 2',3'-O-이소프로필리덴-5-플루오로우리딘65와의 반송에 뒤이어 65℃ 에서 50% 포름산으로 산 가수분해하여 합텐15을 산출한다.
상세하게, 합성은 다음과 같다.
디에틸 3,4,5-트리메톡시페닐포스포네이트 11
화합물11을 디에틸포스파이트를 사용하여 화합물2를 위한 방법에 따라 합성한다.
디에틸 2-브로모-3,4,5-트리메톡시페닐포스포네이트 12
아세트산 10 mL 내 브로민(10 mmol)의 용액을 얼음물 베드로 냉각된 아세트산 10 mL 내 에스테르11(10 mmol)의 용액에 적가한다. 결과 혼합물의 붉은색이 제거된 후, 혼합물을 포화 NaHCO3(100 mL)에 붓고, 에틸 아세테이트(3 x 100 mL)로 추출한다. 합쳐진 유기상을 더 이상의 가스 방출이 식별되지 않을 때까지 5% NaHCO3100 mL 부로 세척한다. 그리고 나서 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 NgSO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시킨다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 엷은 황색 고체로 산출한다.
에틸 2,3-(3,4,5-트리메톡시벤조)부틸포스포네이트 13
t-부틸리튬(n-펜탄 내 1.7 M 용액, 10 mmol)을 THF 50 mL 내 브로마이드12(5 mmol)의 용액에 첨가하며, 이때 혼합물의 온도를 -95℃ 이하로 유지한다. 첨가가 완결된 후 혼합물을 -78℃ 로 데운다. 30 분 후에 에틸렌 설포네이트(5 mmol)를 일부 첨가하고 혼합물을 실온으로 데운다. 1 시간 후, 1 M HCl (50 mL)을 첨가한다. 또다시 1 시간 후, 혼합물을 에틸아세테이트(3 x 100 mL)로 추출한다. 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시킨다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일로 얻는다.
2,3-(3,4,5-트리메톡시벤조)부틸포스톤산 14
실온에서 메탄올 50 mL 내 에스테르13(5 mmol)의 용액을 TLC 로 관찰하여 출발 물질이 소모될 때까지 1 M NaOH pH 12 로 유지한다. 그리고 나서, pH 를 1 M HCl 로 2 로 조정하고, 메탄올을 진공에서 증발시킨다. 수성 혼합물을 에틸 아세테이트(3 x 100 mL)로 추출하고, 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시킨다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일로 얻는다.
5'-O-[2,3-(3,4,5-트리메톡시벤조)부틸포스토닐]-5-플루우로우리딘 15
티오닐 클로마이드(5 mmol)를 얼음물 베드로 냉각된 CH2Cl250 mL 내 산14(5 mmol)의 용액에 첨가한다. 1 시간 후 휘발성 성분을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 CH2Cl210 mL 에 용해시키고, 얼음물 베드로 냉각된 CH2Cl225 mL 내 트리에틸아민(15 mmol), 및 2',3'-O-이소프로필리덴-5-플루오로우리딘65(5 mmol)의 용액에 첨가한다. 4 시간 후 혼합물을 0.1 M HCl (50 mL)에 붓고, 상들을 분리시켜 수성상은 에틸아세테이트(2 x 50 mL)로 추출한다. 합쳐진 유기상은 MgSO4상에서 건조시키고 진공에서 농축시킨다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고 65℃ 에서 2 시간 동안 50% 수성 포름산(10 mL)으로 처리하고 진공에서 농축하여 이소프로필리덴 보호된 중간체를 얻었으며, 이것은 5'-O-[2,3-(3,4,5-트리메톡시벤조)-부틸포스토닐]-5-플루오로우리딘15를 산출했다.
실시예 3: 선구 약제, 갈락토실 시토신 b-D-아라비노푸라노시드, 화합물19의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제 3 도를 참고하시오.
시토신 β-D-아라비노푸라노시드를 먼저 과벤조일화한 다음, 벤조일 클로라이드 및 수산화나트륨 각각으로 O-탈벤조일화하여 N4-벤조일 아라-C16을 산출했다. 뒤이어 아세토니트릴 내 트리메틸실릴트 리플루오로메탄설포네이트의 존재 하에 β-갈락토오즈와 커플링시켜 부분적으로 보호된 화합물17을 산출했다. 디클로로메탄 내 DMAP 및 아세트산 무수물로 아세틸화하여 완전히 보호된 화합물18을 얻었으며, 이것을 50℃ 에서 메탄올 내 암모니아로 완전히 탈보호하여 최종 생성물, β-ara-C19를 얻었다.
상세하게, 합성은 다음과 같다.
N 4 -벤조일시토신-β-D-아라비노푸라노시드 16
건조 피리딘 50 mL 내 시토신-β-D-아라비노푸라노시드 1.22 g(5.02 mmol)의 현탁액을 0℃ 로 냉각했다. 벤조일 클로라이드 10 mL 를 첨가하고, 혼합물을 16 시간 동안 실온에서 교반했다. 혼합물을 5% 중탄산 나트륨 수용액 75 mL 에 붓고, CH2Cl2(2 x 150 mL)로 추출한다. 유기상을 물(50 mL)로 세척하고, 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시켰다. 혼합물을 피리딘/메탄올/물(5 : 3 : 2 v/v) 50 mL 에 용해시키고, 얼음욕으로 냉각시켰다. 피리딘/메탄올/물 (5 : 3 : 2 v/v) 내 차가운 2M 수산화나트륨 50 mL 를 본 용액에 첨가했다. 반응 혼합물을 15 분동안 0℃ 에서 교반한 다음, pH 를 염화암모늄을 첨가하여 7 로 조정했다. 혼합물을 진공에서 농축시키고 메탄올 20 mL 를 첨가한다. 혼합물을 여과하고 고체를 더 많은 메탄올(3 x 20 mL)로 세척하였다. 모든 세척액과 여과액을 수집하고 합쳐 진공에서 농축시켰다. 메탄올/CH2Cl2(2 : 8 v/v) 50 mL 에 다시 용해시키고 혼합물을 메탄올/CH2Cl2(1 : 9 - 2 : 8 v/v)을 사용하여 플래시 크로마토그래피에 의해 정제했다. 상기 서술된 바와 같은 제 2 플래시 크로마토그래피를 사용하여 모든 불순물을 제거하여 N4-벤조일시토신-β-D-아라비노푸라노시드161.5 g(86 %)을 얻었다.
1 H NMR:(D2O+DMSO-d6, 2:8 v/v) d8.2(1H, d, J5,67Hz, H-6), 7.95(2H, d, J 7Hz, o-Ph proton x 2), 7.75-7.35(4H, m, H-5 및 Ph proton x 3), 6.1(1H, d, J1',2', 4Hz, B-1'), 4.2-3.9(3H, m, H-2', H-3' 및 H-4'), 및 3.68(2H, d, J4',5'4Hz, H-5').
커플링 반응 : 화합물 17 의 제조
건조 아세토니트릴(5 mL) 내 갈락토오스 펜타 아세테이트(1.17 g, 3 mmol) 및 화합물16(2 mmol)의 용액에 건조 아세토니트릴(2.5 mL) 내 트리메틸실릴 트리플루오로메탄 설포네이트(TMS tf, 354 mg, 1.5 mmol)의 용액을 2 분 동안 아르곤 분위기 하에서 주사기로 첨가했다. 그리고 나서 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였고, TLC 분석은 2 개의 새로운 화합물(TLC, 에틸아세테이트) 형성과함께 출발 물질의 소멸을 지시하였다. 그리고 나서 반응 혼합물을 중탄산 나트륨 수용액으로 ??칭하고, 에틸 아세테이트(50 mL)로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고, 농축하여 화합물 혼합물을 함유한 무색 고체를 산출했다 (0.8 g, 59 % 및 Rf, 0.36 클로로포름 내 10 % 메탄올).
1 H NMR:(CDCl3): 9.60 (bs, 1H, NH), 8.16(d, 1H), 7.86-7.42(m, 6H 방향족 1H 및 1H 이종 원자 고리), 6.20(d,1H), 5.32(m,3H, 아세테이트의 CHO), 4.62(d,1H,J=7.6Hz, 아노머), 4.20-3.78(m,8H), 3.20(bs,1H), 2.62(bs,1H,2 x OH,D2O로 교환됨), 2.18(s,3H), 2.04(s,6H), 2.01(s,3H, 아세테이트의 모든 CH3).
화합물17을 메틸렌 클로라이드 내 아세트산 무수물 DMAP 를 사용하므로써 과아세틸화하여 화합물18(Rf, 0.28, 에틸아세테이트로 2 회 실행, 86 %)을 산출했다. 생성물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
1 H NMR(CDCl3): 8.18(d,1H,J=7.5Hz), 7.82-7.42(m,6H, 방향족 1H 이종 원자 고리), 6.42(d,1H,J=5,1Hz), 5.62-5.08(m,5H, 아세테이트의 OCH), 4.60(d,1H,J=7.8Hz, 아노머), 4.28-3.82(m,6H,OCH), 2.18(s,3H), 2.14(s,3H), 2.10(s,6H), 2.06(s,3H), 2.00(s,3H, 모두 아세테이트의 CH3이다).
NH4OH 용액 (5 mL) 및 메탄올 (5 mL) 내 화합물18(0.5 g : 0.6 mmol)의 용액을 16 시간 동안 50℃ 에서 가열하였다. TLC 분석은 반응의 완결을 지시했다. 용해를 진공에서 제거하고, 조생성물을 용매로서 물 내 2% 메탄올을 사용하며 중간압력 역상 C 크로마토그래피에 적용시켜 β-gal-Ara-C 를 순수한 무색 고체로 얻었다 (0.22 g; 92 %).
1 H NMR:(D2O): 7.80(d,1H), 6.22(d,1H), 6.02(d,1H), 4.48(d,1H,J=8.1Hz, 아노머), 4.40(t,1H), 4.24(m,2H), 3.92(m,2H), 3.80-3.60(m,6H).
실시예 4: 선구 약제, 갈락토실 5-플루우로우리딘, 화합물24의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제 4 도를 참고하시오.
β-gal 5-플루오로우리딘24의 합성은 유사한 계획을 따른다. 5-플루오로우리딘을 0℃ 에서 을 DMF 내 이미다졸의 존재 하에 t-부틸 디메틸 클로로실란으로 처리하여 부분적으로 보호된 화합물20을 산출했다. DMAP 및 트리에틸아민의 존재 하에 아세트산 무수물과의 후속 반응은 완전히 보호된 누클레오시드21을 산출했다. 실릴기의 탈보호는 0℃ 에서 p-톨루엔 설폰산을 사용하여 달성하고, 결과 생성물22를 아세토니트릴 내 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트의 존재 하에 β-갈락토오스 펜바세테이트와 커플링시켜 완전히 보호된 화합물23을 산출했다. 50℃ 에서 메탄올 내 암모니아로 완전히 탈보호하여 최종 생성물, β-gal 5-플루우로우리딘24를 얻었다.
상세하게, 합성은 다음과 같다.
화합물21의 제조 : DMF 내 5-플루오로우리딘(1.31 g, 5 mmol)의 냉각된 용액에 이미다졸(0.816 g, 12 mmol) 및 t-부틸디메틸클로로실란(0.90 g, 6 mmol)을 연속적으로 첨가하고, 내용물을 0℃ 에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 (TLC,클로로포름 내 10% 메탄올) 내용물을 에틸 아세테이트(100 mL)를 함유한 분별 깔때기로 옮기고, 물(3 회, 각각 25 mL)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 농축시켜 모노실릴화된 생성물20을 오일성 화합물로 얻었(Rf, 0.44, 클로로포름 내 10 % 메탄올).
상기 얻어진 생성물20(1.80 g, 조생성물, 5 mmol)을 메틸렌 클로라이드(20 mL)에 용해시키고, DMAP (1.34 g, 11 mmol) 및 아세트산 무수물(1.22 g, 12 mmol)을 연속적으로 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 교반했다. TLC 분석(1 : 1 에틸아세테이트 : 헥산)이 반응의 완결을 지시했다. 그리고 나서 반응 혼합물을 분별 깔때기에 옮기고, 물로 세척하고, 건조시키고, 농축시키고, 생성물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 순수한 형태로 화합물21을 산출했다(Rf, 0.48, 1 : 1 EtOAc 및 헥산, 1.90 g, 83 %).
1 H NMR(CDCl3): 8.02(d,1H), 6.26(d,1H), 5.34(m,2H, 아세테이트의 CHO), 4.22(m,1H), 3.86(AB q, 2H), 2.08, 2.04(2 x s,3H, 각각, 아세테이트의 CH3), 0.92(s,9H, t-bu si), 0.12(a,6H, 실릴의 CH3).
13 C HNMR(CDCl3): 169.99, 169.72, 157.06, 156.71, 149.61, 142.51, 139.35, 85.46, 84.12, 73.25, 71.94, 63.28, 25.74, 20.70, 20.68, 20.37, 18.37, -5.70.
화합물22의 제조 : 메틸렌 클로라이드 (12 mL) 및 메탄올 (6 mL) 내 화합물21(1.69 g, 3.5 mmol)의 냉각된 용액(0℃)에 PTSA (100 mg)를 촉매량으로 첨가하고,반응 혼합물을 30 분 동안 0℃ 에서 교반했다. 반응 완결 후 트리에틸아민(0.5 mL)으로 ??칭시키고, 용매를 제거하여 조생성물22를 오일로 산출했다. 그리고 나서 크로마토그래피하여 순수한 형태로 화합물22를 산출했다(Rf, 0.22, 1 : 1 EtOAc 및 헥산, 920 mg 76 %).
1 H NMR(CDCl3): 8.09(d,1H,J=6.3Hz), 6.14(d,1H), 5.43(m,2H, 아세테이트의 CHO), 4.21(m,1H), 3.86(AB q,2H), 2.08, 2.04(2 x s, 3H 각각, 아세테이트의 CH3).
13 C HNMR(CDCl3): 170.34, 170.08, 157.56, 149.55, 139.17, 86.61, 83.72, 73.21, 71.48, 61.65, 20.65, 20.38.
커플링 화합물23의 제조 : 갈락토오스 펜타 아세테이트 및 화합물22간의 커플링 반응을 상기 언급된 바와 같은 방법에 의해 달성하여 커플링 화합물23을 산출했다 (Rf, 0.20, 1 : 1 EtOAc : 헥산, 59 %).
1 H NMR(CDCl3): 9.60(bs, 1H,NH), 8.18(d,1H,J=6.6Hz), 6.34(m,1H), 5.46-5.08(m,5H, 아세테이트의 OCH), 4.61(d,1H,J=8.1Hz, 아노머), 4.30-3.72(m,6H), 2.16, 2.13, 2.11, 209, 2.05, 2.01(6 x s, 각각 3H, 아세테이트의 CH3).
13 C HNMR: 170.37, 170.10, 169.34, 157.00, 156.64, 149.43, 142.52, 139.37, 100.44, 85.83, 82.35, 73.35, 71.63, 70.35, 70.34, 68.57, 68.11, 66.74, 61.13, 20.34, 20.07, 20.29.
선구 약제 β-D-Gal 플루오로우리딘24의 제조 : 화합물23을 상기 서술된 바와 유사한 방법(암모니아)을 통해 선구 약제, 화합물24로 전환(92 %)시켰다.
1 H NMR(D2O): 8.12(d,1H), 5.88(d,1H), 4.44(d,1H,J=7Hz 아노머), 4.36-3.62(m,11H).
실시예 5a: 실시예 3 및 4 의 선구 약제의 합텐에 대한 선구 물질, 화합물25의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제 5a 도를 참고하시오.
아미노누클레오시드를 제 5a 도의 개요도에 따라 5-플루오로우리딘으로 부터 제조하였다. 화합물22(제 4 도)를 트리페닐포스핀 및 카르보테트라브로미드로 활성화시킨 후, 뒤이어 나트륨 아지드로 처리하여 아지드 중간체를 형성했다. 그리고나서 상기 중간체를 10% Pd-C 를 사용하여 아민으로 수소화시키고, 메탄올 내 나트륨 메톡시드로 탈보호시켜 아미노누클레오시드25를 산출한다. 상기 아미노누클레오시드를 후속 커플링 반응에 사용하여 아미딘 화합물30b를 산출한다(R=5-플루오로우리딘).
상세하게, 합성은 하기와 같다 :
5'-아미노-5-플루오로우리딘 25 의 제조
메틸렌클로라이드(0.2 M) 내 5'-히드록시 2',3' 디아세톡시-5-플루오로우리딘22(1 당량)의 용액에 트리페닐 포스핀 (1.1 당량) 및 사염화탄소(1.2 당량)를 차례로 첨가하고, 혼합물을 0℃ 에서 교반한다. 반응 완결 후 생성물이 다음 단계를 위해 준비된다.
그 후 정제되지 않은 브로마이드 화합물(1 당량)을 DMF(0.2 M)에 용해시키고, 60℃ 에서 나트륨 아지드(3 당량)와 함께 가열한다. 반응 완결 후 반응 혼합물을 에틸 아세테이트를 함유한 분별 깔때기로 옮긴다. 용액을 물로 세척하고, 유기 층은 분리하여 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시킨다. 조생성물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물25의 선구 물질인 아지드 유도체를 얻는다.
아지드 유도체를 에틸 아세테이트에 용해시키고 활성 탄소상 10% 팔라듐 (0.05 당량)을 첨가한다. 상기 교반된 용액에 수소로 충전된 풍선을 사용하여 수소 분위기를 설치한다. 반응 완결 후, 촉매는 셀라이트페드를 통해 여과하여 제거하고, 여과액은 수집하고 농축하여 화합물25에 상응하는 아미노 선구 물질을 산출한다.
아미노 선구 물질은 메탄올 내에 용해시키고, 나트륨메톡시드(0.05 당량)를 첨가한다. 용액을 실온에서 교반하고, 반응 완결시 빙초산(0.05 당량)을 첨가하고 혼합물을 진공에서 농축시킨다. 화합물25를 용매로서 물 내 메탄올을 사용하여 중간 압력 역상 C18크로마토그래피에 의해 정제한다.
실시예 5b :실시예 3 및 4 의 선규 약제의 합텐, 화합물30a및30b의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제 5b 도 및 제 5c 도를 참고하라.
아미딘 화합물30a및/또는30b(R = 아라 C 또는 5-플루오로우리딘)의 제조는 2 가지 다른 합성 경로로 달성될 수 있다. 한 합성 경로는 상업적으로 구입가능한 디아세톤 D 글루코오스(제 5b 도, 실시예 5b 에서 서술됨)로 부터 출발하는 반면, 다른 경로는 글루코스피라노오스(제 5c 실시예 5c 에서 서술됨)로 부터 출발한다.
디아세톤 D 글루코오스로 출발하는 제 1 단계는, DMF 내 이미다졸의 존재 하에 t-부틸디메틸클로로실란으로 히드록시기를 실리화함을 포함한다. 수성 아세트산으로 후속 처리하여, t-부틸 디메틸클로로실란으로 1 차 히드록시 위치에서 후에 실릴화되는 5,6-디올을 생성시켜, 남아 있는 2 차 히드록시기는 트리에틸아민의 존재 하에 MsCl 로 처리할 때 메실레이트로 전환된다. 그리고 나서, 결과 메실레이트 화합물26을 아세톤 내 나트륨 요오디드와 먼저 반응시킨 다음, DMF 내 나트륨 아지드로 요오디드 유도체를 처리하여 아지드 화합물27로 전환시킨다. 아세토니드기의 가수분해는 60℃ 에서 수성 아세트산으로 화합물27을 처리하여 달성한다. 그 후 결과된 디올을 수성 디옥산 내 브로민으로 아노머 위치에서 산화시켜 t-부틸디메틸클로로실란으로 연이어 실릴화하여 락톤 화합물28을 산출하는 락톤 유도체를 산출한다. 화합물28의 아지드기는 탄소상 10% Pd 를 사용하여 수소화에 적용시킬 때 아미노기로 전환되고, 결과적으로, 글루코락탐29a유도체로 재배열한다. 미쯔노부(Mitsunobu) 반응 방법을 사용한 2 차 히드록시기의 전환은 갈락토락탐29b유도체를 생성한다. 미에르바인 시약에 의한 활성화에 뒤이어, 아미노 누클레오시드25(실시예 5a)에 의한 커플링 후 플루오라이드에 의한 탈실릴화는 최종 아미딘 화합물30b를 생성한다 (R = 5-플루오로우리딘).
상세하게, 합성은 하기와 같다.
화합물 26 의 제조
건조 DMF (50 mL) 내 디아세톤 D-글루코오스(5.2 g, 20 mmol)의 혼합물에 이미다졸(3.26 g, 48 mmol), t-부틸디메틸클로로실린(3.6 g, 24 mmol)을 연속적으로 첨가하고, 내용물을 4 시간 동안 실온에서 교반한다. 반응 완결 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(250 mL)를 함유한 분별 깔때기에 옮기고 물로 세척하고, 건조시키고, 농축시키고, 생성물은 플래시 크로마토그래피에 의해 정제한다. 얻어진 실릴화된 화합물(6.73 g, 17.9 mmol)을 THF (50 mL)에 용해시키고, 6 시간 동안 수성 아세트산(6 mL)과 함께 교반한다. 반응 완결 후 (TLC) 용매를 제거하고, 생성물은 플래시 크로마토그래피하여 정제한다.
상기 얻어진 디올(5.38 g, 16.1 mmol)을 건조 DMF(60 mL)에 용해시키고, 이미다졸(2.62 g, 2.4 당량) 및 t-부틸디메틸클로로실란 (1.2 당량)을 연속적으로 첨가하고, 0℃ 에서 2 시간 동안 교반한다. 반응 완결 후, 에틸 아세테이트(200 mL)에 상기를 용해시키고, 물로 세척하고 건조시키고 농축하고, 생성물은 크로마토그래피에 의해 정제한다.
모노실릴화된 히드록시 화합물(5.6 g, 12.5 mmol)을 메틸렌 클로마이드에 용해시키고, 0℃ 로 냉각하고, 트리에틸아민(2.7 mL) 및 MsCl(1.85 g, 1.3 당량)을 연속적으로 첨가하여 내용물을 0℃ 에서 3 시간 동안 교반한다. 반응 완결 후, 상기를 분별 깔때기에 옮기고, 물로 세척하고 건조시키고 농축하여 상응하는 메틸레이트 화합물26을 산출한다.
아지드27의 제조 : 아세톤 (50 mL) 내 나트륨 요오디드(1.93 g, 13 mmol), 메실레이트26(5.26 g, 10 mmol)의 혼합물을 4 시간 동안 환류 하에 가열한다. 반응 완결 후 용매는 제거하고, 결과 물질을 에틸 아세테이트(100 mL)에 용해시키고, 물로 세척하고 건조시키며, 생성물은 크로마토그래피로 정제한다.
건조 DMF 내 나트륨 아지드(1.30 g, 20 mmol), 요오디드(4.54 g, 8 mmol)의 혼합물을 6 시간 동안 60℃ 에서 가열하였다. 반응 완결 후, 상기를 에틸아세테이트로 희석하고, 물로 세척하고, 건조시키고 농축시킨다. 생성물을 크로마토그래피에 의해 정제하여 순수한 화합물로 아지드27을 얻는다.
락톤28의 제조 : 얻어진 아지드27(2.89 g, 6 mmol)을 THF (30 mL) 및 수성 아세트산(10 mL)에 용해시키고, 내용물을 60℃ 에서 6 시간 동안 가열한다. 반응 완결 후 용매를 제거하고, 결과 물질은 에틸아세테이트에 용해시키고, 건조시키고, 농축시켜 디올을 산출한다.
디옥산 내 브로민(1 당량) 용액을 수성 디옥신 (10 %, 20 mL) 내 상기 얻어진 디올(1.77 g, 4 mmol)에 첨가했고, 결과 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반한다. 반응 완결 후, 상기를 에틸 아세테이트(50 mL)로 희석하고, 수성 나트륨 티오설페이트로 세척하고, 건조시키고, 농축하여 히드록시 락톤을 산출한다.
상기 락톤 내 히드록실기를, 앞서 서술된 바대로 t-부틸디메틸실릴에테르로 보호하여 락톤28을 얻는다.
락탐29a의 제조 : Pd-c(10 %, 110 mg) 및 메탄올 (10 mL) 내 아지드28(1.10g,2mmol)의 현탁액을 수소 풍선을 사용하여 4 시간 동안 수소화한다. 반응 완결 후, 촉매는 셀라이드로 여과하고 용매는 제거하여 락탐29a를 생성시킨다.
갈락토 배열을 갖는 락탐29b의 제조 : 상기 얻어진 락탐29a를 아래 언급된 대로 갈락토 락탐29b로 전환시켰다. 메틸렌 클로라이드 (8 mL) 내 아세트산 (2 mL) 및 락탐29a의 용액에 트리페닐포스핀 (0.419 g, 1.6 mmol) 및 디에틸 아조디카르복실레이트(0.295 g, 1.7 mmol)를 연속적으로 0℃ 에서 첨가하고, 반응 혼합물을 2 시간 동안 교반한다. 반응 완결 후 용매를 제거하고, 생성물은 크로마토그래피로 단리한다. 얻어진 아세테이트를 나트륨 메톡시드로 가수분해하여 갈락토 락탐29b를 얻는다.
디클로로메탄 내 미에르비인 시약(디클로로메탄 내 1 M 용액 트리에틸옥소 테트라플루오로보레이트, 1.2 당량), 갈락토락탐29b(1 당량)의 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반한다. 그리고 나서 아미노누클레오시드25(1 당량)를 첨가하고, 반응이 완결되면 생성물을 플래시 크로마토그래피로 정제한다.
실시예 5c: 실시예 3 및 4 의 선구 약제의 합텐, 화합물30a및30b의 대안적 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제 5C 도를 참고하시오.
5-플루오로우리딘을 사용하는 갈락토오스-β-5-플루오로우리딘 아미딘의 제조는 상업적으로 구입가능한 글루코피라노오즈31로 부터 출발한다. 촉매량의 p-톨루엔설폰산 존재 하에 아세톤 내 2,2-디메톡시프로판으로 처리하여 보호된 화합물32를 얻는다. 남아 있는 히드록시기를 t-부틸 디메틸클로로실란으로 부가적으로 보호하여 완전히 보호된 화합물33을 얻는다. 벤질알콜과 함께 가열하여 락톤을 개방시키고, 결과 히드록시 화합물34를 MsCl 로 메실화한다. 뒤이어 아지드 화합물35로의 전환은 먼저 메실레이트기를 아세톤 내 나트륨 요오디드와 반응시킨 다음 DMF 내 나트륨 아지드를 사용하여 아지드기로써 요오디드기를 제거하는 2 단계로 달성한다. 탄소상 10% Pd 를 사용하는 수소화로 아지드기를 아미노로 전환시키며, 이는 후에 락탐으로 고리화된다. 트리플루오로아세트산으로 처리하여 아세토니드를 디올로 탈보호한 후, 1 차 알콜을 t-부틸 디메틸클로로실란으로 보호하여 글루코락탐 화합물29a를 얻는다. 2 차 히드록시기는 미쯔노부 반응 방법을 사용하여 전환시키고, 아미드의 후속 활성화 및 커플링은 각각 미에르바인 시약 및 아미노누클레오시드25(실시예5a)를 사용하여 달성한다. 플루오로라이드를 사용하는 최종 탈보호는 아미딘 화합물30b를 생성시킨다. (Rz = 5-플루오로우리딘)
상세하게,합성은 하기와 같다.
락톤32의 제조 : 아세톤 (100 mL) 및 메틸렌 클로라이드 (400 mL) 내 PTSA (0.5 g), 2,2-디메톡시프로판 (4 당량), 및 히드록시 화합물31(8.90 g, 50 mmol)의 혼합물을 4 시간 동안 교반한다. 반응 완결 후, 상기를 트리에틸아민(3 mL)으로 ??칭시키고, 용매를 제거한 후 결과 조화합물을 크로마토그래피로 정제하여 화합물32를 얻는다.
실릴 화합물33의 제조 : 건조 DMF 내 t-부틸-디메틸클로로실란(2.2 당량), 이미다졸(4.4 당량) 및 화합물32(8.72 g, 40 mmol)의 혼합물을 6 시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후 에틸아세테이트(500 mL)로 희석하고, 물(100 mL x 2)로 세척하고, 건조시키고, 농축시켜 생성물을 크로마토그래피로 단리하여 화합물33을 얻었다.
화합물34의 제조 : 벤질알콜 (100 mL) 및 클로로포름(300 mL)의 혼합물 내 화합물33(13.38 g, 30 mmol)의 용액을 반응이 완결 때까지 60℃ 에서 가열한다. 반응 완결 후, 용매는 제거하고 생성물은 크로마토그래피로 단리하여 화합물34를 얻는다. 메탄올이 사용될 때 상기는 상응하는 히드록시메틸 에스테르를 생성시킨다.
아지도에스테르35의 제조 : 히드록시 화합물34의 아지도 화합물35로의 전환은 화합물27에 대한 히드록시 화합물26을 제조하는데 사용된 것과 동일한 반응 순서로 달성될 수 있고, 화합물35를 생성시켰다.
락탐29a및 락탐29b의 제조 : 화합물35의 수소화 (앞서 서술된 조건 하에) 및 트리플루오로아세트산(위를 참조)을 사용하는 탈보호화 및 1 차 알콜의 보호는29a를 생성시킨다. 락탐29a는 미쯔노부 반응 조건(위를 참조)을 사용하여 갈락토 락탐으로 전환된다.
화합물29a의 아미딘 화합물30b로의 전환은 앞서 서술된 동일한 방법을 사용하여 달성될 수 있다.
실시예 6 :선구 약제, 지방족 디에틸 아세탈 보호된 알도포스파미드, 화합물38의 제조.
본 실시예에서 밑줄친 번호의 화합물은 제 6 도를 참고하시오.
비스(2-클로로에틸)아민 히드로클로라이드를 과량의 포스포러스 옥시클로라이드와 함께 가열했을 때, 디클로로포스파미드36을 증류 후 좋은 수득율로 결정성 고체로서 얻었다. 디클로로포스파미드36과 1 몰 당량의 3-히드록시프로피온알데히드 디에틸 아세탈의 반응은 모노클로로포스파미드37을 생성시켰으며, 이는 암모니아로 처리하여 3,3-디에톡시프로피오닐 N,N-비스(2-클로로에틸)포스포릭 디아미드38을 생성하였다.
상세하게, 합성은 하기와 같다.
N,N-비스(2-클로로에틸)포스포라미딕 디클로라이드 36
비스(2-클로로에틸)아민 히드로클로라이드 (5g) 및 POCl3(13 mL)의 혼합물을 12 시간 동안 환류 하에 가열하였으며, 상기 동안 혼합물은 균질 용액이 되었다. 과량의 POCl3를 증류시켜 (bp 105℃) 제거한 다음, 생성물 4.93 g 을 증류시켰다 (bp 110-114℃, 0.1 mmHg). 아세톤/헥산으로 재결정하여 생성물 4.5 g 을 무색 고체로 얻었다 : 융점 54.5-56 ℃ (lit. 54-56℃, Friedman, O. M. 일동,J. Am. Chem. Soc. 76(1954) : 655-658) : 1 H NMR(CDCl3) δ 3.62-3.68(m, 2), 3.71-3.77 (m, 6).
3,3-디에톡시프로피오닐 N,N-비스(2-클로로에틸)포스포라미딕 클로라이드 37
CH2Cl25 mL 내 디클로리데이트36(1.75 g)의 용액을 CH2Cl210 mL 내 DMAP (0.9 g) 및 3,3-디에톡시-1-프로판올(1.0 g)의 혼합물에 적가했다. 19 시간 후, 침전물이 형성되었다. 침전물을 여과시켜 제거하고, 휘발성 성분은 진공에서 제거하였다. 잔류물을 25% 에틸아세테이트/헥산으로 용리시킨 후, 30% 로 용리하는 실리카겔 짧은 칼럼으로 통과시켜 생성물 0.95 g 을 얻었다 : 1 H NMR(CDCl3) δ 1.23(t, 6), 2.06(q, 2), 3.40-3.60(m, 6), 3.62-3.75 (m, 6), 4.21-4.38 (m, 2), 4.62 (t, 1).
3,3-디에톡시프로피오닐 N,N-비스(2-클로로에틸)프로포릭 디아미드 38
무수 암모니아를 CH2Cl210 mL 내 클로리데이트37(0.95 g)의 용액으로 20 분 동안 커플링시키고, 침전물 형성을 결과시켰다. 고체를 여과시켜 제거하고, 휘발성 성분은 진공에서 제거하여, 오일 0.71 g 을 산출했다. 조생성물의 일부(100 mg)를 50% 에틸 아세테이트/헥산 내 3% Et3N 으로 용리하는 실리카겔 짧은 칼럼으로 통과시켜 생성물46을 무색 오일로 얻었다 : IR (CDCl3) 3600-3100, 2976, 2932, 2849, 1573, 1446, 1376, 1348, 1225, 1132, 1056, 985, 752, 657 cm-1;1H NMR (CDCl3) δ 1.20 (t, 6), 1.95 (q, 2), 3.34-3.75 (m, 12), 4.00-4.15 (m, 2), 4.63 (t, 1).
아세탈 38 의 안정도
아세탈38샘플을 실온에서 D2O 내 0.9 중량% NaCl 에 용해시켰다. 2 일 후,1H NMR 스펙트럼의 변화가 관찰되지 않았다.
실시예 7 :선구 약제, 지방족 디에틸 아세탈 보호된 알도포스파미드의 구아닐 합텐, 화합물43의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제 7 도를 참고하시오.
N-t-Boc-아미노에틸포스폰산39를 2-아미노포스폰산과 디-t-부틸 디카르보네이트의 반응에 의해 제조한다. 트리에틸아민, 4-디메틸아미노피리딘 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드의 존재 하에 비스 (2-클로로에틸)아민 히드로클로라이드와의 후속 반응은 포스포라미드산40을 생성시킨다. 포스포릭 디아미드41로의 전환은 먼저 1-(2-메시틸렌설포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸로 활성화시키고 난 다음 암모니아와 반응시켜 달성한다. 트리플루오로아세트산으로 탈보호시켜42를 얻고, 이는 N,N-디에틸-O-메틸이소우레아 테트라플루오로보레이트와 반응하여 최종 구아디늄 생성물43을 생성한다.
상세하게, 합성은 다음과 같다.
N-t-Boc-2-아미노에틸포스폰산 39
2-아미노에틸포스폰산 1.25 g 및 트리에틸아민 4.2 mL 을 물 10 mL 에 용해시키고 건조 아세토니트릴 10 mL 내 디-t-부틸 디카르보네이트 2.62 g 의 용액을 첨가한다. pH 는 트리에틸아민을 첨가하여 9 로 유지시킨다. 첨가가 완결된 후 혼합물을 2 시간 동안 교반한 다음, 진공에서 농축시킨다. 잔류물을 0.01 M NaHCO3(100 mL)에 용해시키고, 에틸아세테이트(2 x 50 mL)로 세척한다. 수성상을 0.1 M HCl 을 첨가하여 pH 1 로 조정하고, 에틸아세테이트(2 x 100 mL)로 추출한다. 유기상은 무수 MgSO4상에서 건조시키고 진공에서 농축시켜 N-t-Boc-2-아미노에틸포스폰산39를 얻는다.
N-N-비스(2-클로로에틸)-P-[N'-(t-Boc)-2-아미노에틸]포스폰아미드산 40
2.25 g 의 N-t-Boc-2-아미노에틸포스폰산39, 2.14 g 의 비스(2-클로로에틸)아민 히드로클로라이드, 4.2 mL 의 트리에틸아민 및 0.146 g 의 4-디메틸아미노피리딘의 혼합물을 DMF/CH2Cl220 mL 에 용해시킨다. 1-(3-디메틸아미노프로필) 3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 2.3 g 을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반한다. 혼합물을 1 M NaOAc, pH 5(75 mL)에 붓고, 에테르 (2 x 75 mL)로 세척한다. 수성상을 1 M HCl 로 pH 1 로 조정하고, 즉시 에틸아세테이트(2 x 100 mL)로 추출한다. 유기상을 물(20 mL)로 세척하고, 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시킨다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 N,N-비스(2-클로로에틸)-P-[N'-(t-Boc)-2-아미노에틸]포스폰아미드산40을 산출한다.
N,N-비스(2-클로로에틸)-P-[N'-(t-Boc)-2-아미노에틸]포스포닉 디아미드 41
1.75 g 의 N,N-비스(2-클로로에틸)-P-[N'-(t-Boc)-2-아미노에틸]포스폰아미드산40을 건조 피리딘(50 mL)에 용해시키고 진공에서 농축시킨다. 이 절차를 부가의 피리딘(50 mL)으로 한번 더 반복한다. 잔류물을 건조 피리딘(25 mL)에 용해시키고, 1-(2-메시틸렌설포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸 2.96 g 을 첨가한다. 암모니아 가스를 60 분 동안 버블링시킨다. 반응 혼합물을 진공에서 농축시키고, 에틸 아세테이트(100 mL)에 재용해시키고, 포화 NaHCO3(2 x 100 mL) 및 포화 NaCl(75 mL)로 세척한다. 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시키고, 플래시 크로마토그래피로 정제하여 N,N-비스(2-클로로에틸)-P-[N'-(t-Boc) -2-아미노에틸]포스포닉 디아미드41을 얻는다.
N,N-비스(2-클로로에틸)-P-[2-(2,3-디에틸구아니딜)에틸]포스포닉 디아미드 43
0.873 g 의 N,N-비스(2-클로로에틸)-P-[N'-(t-Boc)-2-아미노에틸]포스포닉디아미드41를 디클로로메탄 10 mL 에 용해시키고, 트리플루오로 아세트산 10 mL 를 첨가한다. 60 분 후, 반응 혼합물을 진공에서 농축시키고42를 산출한다. 잔류물을 트리에틸아민 1 mL 및 물 20 mL 의 혼합물에 재용해시킨다. 부가의 트리에틸아민으로 pH 를 8.5 로 조정하고, 트리에틸아민으로 pH 를 8.5 로 유지시키면서 N,N'-디메틸-O-메틸이소우레아테트라플루오로보레이트 0.872 g 을 첨가한다. 16 시간 후 반응 혼합물을 아세트산으로 pH 7 로 조정하고, 진공에서 농축시킨다. 잔류물을 물 5 mL 에 재용해시키고, 역상 ODS 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 N,N-비스(2-클로로에틸)-P-[2-(2,3-디에틸구아니딜)에틸]포스포닉 디아미드43을 생성시킨다.
실시예 8a :분자 내 이놀 트리메톡시벤조에이트 포스파미드 선구 약제의 합성을 위한 무수물 중간체, 화합물45의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제 8a 도를 참고하시오.
상업적으로 구입가능한 트리메톡시 벤조산을 브롬화하고, 생성물5를 저온 리튬-할로겐 교환시켜 아릴리튬 중간체를 생성한다. 활성 중간체를 보호된 요오도에탄올7로 알킬화하고, 생성물44를 탈수하여 대칭 무수물45를 생성한다.
상세하게, 합성은 하기와 같다.
2-브로모-3,4,5-트리메톡시벤조산 5
아세트산 100 mL 내 브로민(100 mmol)의 용액을 얼음물 베드로 냉각시킨 아세트산 100 mL 내 3,4,5-트리메톡시벤조산(100 mmol)의 용액에 적가한다. 결과된 혼합물의 붉은 색이 사라진 후, 혼합물을 분쇄된 얼음 500 g 에 붓는다. 결과된 고체를 여과하여 수집하고, 진공, P2O5상에서 건조시키고, Et2O 로 재결정화하여 생성물을 엷은 황색 고체로서 얻는다.
2-[2-(4,4'-디메톡시트리페닐메톡시)에틸]-3,4,5-트리메톡시벤조산 44
t-부틸리튬(n-펜탄 내 1.7 M 용액, 15 mmol)을 THF 50 mL 내 브로마이드5(5 mmol)에 첨가하며, 이때 혼합물 온도는 -95℃ 이하로 유지한다. 첨가가 완결된 후, 혼합물을 -78℃ 로 데운다. 30 분 후, 요오디드7(실시예 2a 에 합성이 서술됨)을 일부 첨가하고, 혼합물을 0℃ 로 데운다. 물(50 mL)을 첨가한 다음 혼합물의 pH 를 조심스럽게 0.1 M 염산을 사용하여 3 으로 조정한다. 혼합물을 에틸아세테이트(3 x 100 mL)로 추출한다. 유기상을 무수 Ma2SO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시킨다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일로서 얻는다.
2-[2-(4,4'-디메톡시트리페닐메톡시)에틸]-3,4,5-트리메톡시벤조의 무수물 45
CH2Cl210 mL 내 DCC (5.5 mmol) 용액을 실온에서 CH2Cl225 mL 내 산44(10mmol) 용액에 첨가한다. 1 시간 후, 결과된 고체를 여과하여 제거하고 CH2Cl225 mL 로 세척하고, 진공에서 여과액으로 부터 용매를 증발시킨다. 생성물은 부가의 정제 없이 사용된다. 본 무수물은 실시예 8b 에서 알도포스파미드 선구 약제 화합물50(제 8b 도)을 합성하는데 사용된다.
실시예 8b :선구 약제, 분자 내 이놀 트리메톡시벤조에이트 포스파미드, 화합물50의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제 8b 도를 참고하시오.
앞서 제조된 대칭 무수물45(실시예 8a)를 β-실록시 프로파날 이놀레이트와 반응시켜 이놀 벤조에이트48을 형성한다. 실릴 보호기를 제거하고, 그리하여 발생된 알콜을 포스포라미드 디클로리데이트로 반응시키고, 뒤이어 암모니아로 반응시켜 비교적 안정한 선구 약제 선구 물질49를 형성한다. 본 선구 물질49는 필요하다면 보다 활성인 선구 약제50로 즉시 전환된다.
상세하게, 합성은 하기와 같다.
3-(t-부틸디메틸실록시)-1-프로판올 46
DMF 5 mL 에 용해된 이미다졸 (22 mmol), t-부틸디메틸클로로실란 (11 mmol), 1,3-프로판디올(10 mmol)의 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 0.1 M 염산(100 mL)에 붓고, 에테르(3 x 100 mL)로 추출하였다. 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 MgSO4에서 건조시키고, 진공에서 농축시켰다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일로 얻었다.
3-(t-부틸디메틸실록시)프로파날 ( 47 )
DMSO(24 mmol)를 -78℃ 로 냉각된 CH2Cl240 mL 내 옥살릴 클로라이드 (11 mmol)에 첨가한다. 15 분 후, 알콜46(10 mmol)을 첨가한다. 부가의 15 분 후, 트리에틸아민(50 mmol)을 첨가한다. 혼합물을 0℃ 로 데운 다음, 0.1 M 염산(100 mL)에 붓는다. 상을 분리하여 수성상을 에틸아세테이트(2 x 100 mL)로 추출한다. 유기상은 물(100 mL)로 세척하고, 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시킨다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일로 얻는다.
3-t-부틸디메틸실록시프로-1-에닐 2-[2-(4,4'-디메톡시트리페닐메톡시)에틸]-3,4,5-트리메톡시벤조에이트 ( 48 )
NaH(광오일 내 60% 분산액, 11 mmol)를 헥산(2 x 10 mL)으로 세척한다. 에테르(20 mL)를 첨가하고 뒤이어 에테르 20 mL 내 알데히드47(10 mmol)의 용액을 적가한다. 첨가가 완결되고, 15 분 후 에테르 20 mL 내 무수물45(20 mmol)의 용액을 일부 첨가한다. 부가의 0.5 시간 후, 반응 혼합물을 포화 NH4Cl(20 mL)에 붓고 상을 분리한다. 수성상을 에테르(3 x 40 mL)로 추출한다. 합쳐진 유기상은 염수(40 mL)로 추출하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시킨다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일로 얻는다.
3-{2-[2-(4,4'-디메톡시트리페닐메톡시)에틸]-3,4,5-트리메톡시벤조일옥시}프롭-2-에닐 N,N-비스(2-클로로에틸)포스포릭 디아미드 ( 49 )
테트라부틸암모늄 플루오라이드(THF 내 1.0 M 용액, 2 mmol)를 -23℃ 로 냉각시킨 THF 50 mL 내 실릴에테르48(2 mmol) 용액에 첨가한다. 5 분 후, 트리에틸아민(2 mmol)을 첨가하고, 뒤이어36(2 mmol, 실시예 6 에서 합성이 서술됨)을 첨가한다. 부가의 3 시간 후, NH3를 첨가한다. 부가의 2 시간 후, 반응 혼합물을 얼음-냉각 염수에 붓고, 에테르(4 x 100 mL)로 추출한다. 합쳐진 유기상을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시킨다. 플래시크로마토그래피에 의한 정제로 생성물을 무색 오일로 얻는다.
3-[2-(2-히드록시에틸)-3,4,5-트리메톡시벤조일옥시]프롭-2-에닐 N,N-비스(2-클로로에틸)포스포릭 디아미드 ( 50 )
트리에테르49(0.1 mmol)를 실온에서 80% 수성 아세트산(10 mL)에 일부 첨가한다. 15 분 후 혼합물을 포화 NaHCO3(100 mL)에 붓고, 에테르(3 x 100 mL)로 추출한다. 그리고 나서 합쳐진 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시킨다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 고체로 얻는다.
실시예 8c :분자 내 이놀 트리메톡시벤조에이트 포스파미드 합텐, 화합물57의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제 8c 도를 참고하시오.
보호된 아릴 포스파이드51를 선행 문헌에 따라 합성한다. 방향족 고리를 브롬화하고, 브로미드52를 리튬-할로겐 교환시키고, 결과 생성된 아릴리튬을 히드록시에틸화하여53을 생성한다. 워크업(workup) 및 탈보호 후, 고리형 포스파이트54를 얻는다. 포스파이트54를 α-브로모 알데히드55로 퍼코우 반응(Perkow reaclion)시켜 이놀 포스포네이트56을 생성한다. 탈보호 및 포스포러스 옥시클로라이드, 연이어 N-트리플루오로 아세틸피페라진, 및 암모니아와 반응시켜 피페라진 고리에 의해 운반 단백질에 결합될 수 있는 합텐51을 얻는다.
상세하게, 합성은 하기와 같다.
에틸 P-(3,4,5-트리메톡시페닐)-P-(디에톡시메틸)포스피네이트 ( 51 )
3,4,5-트리메톡시브로모벤젠을 본원에 참고 문헌으로서 기재한Tetrahedron Lett.26 (1985) : 5939-5942 의 방법에 따라 제조한다. 에틸(디에톡시 메틸) 포스포네이트는 본원에 참고 문헌으로 포함된Tetrahedron45 (1989) : 3787-3808 의 방법에 따라 제조하고, 본원에 참고 문헌으로 포함된J. Med. Chem.32(1989) : 1580-1590 의 방법에 따라 3,4,5-트리메톡시브로모벤젠과 반응시킨다.
에틸 P-(2-브로모-3,4,5-트리메톡시페닐)-P-(디에톡시메틸)포스피네이트 ( 52 )
아세트산 10 mL 내 브로민(10 mmol)의 용액을 얼음물 베드로 냉각시킨 아세트산 10 mL 내 에스테르51(10 mmol)의 용액에 적가한다. 결과된 혼합물의 붉은색이 사라진 후, 혼합물을 포화 NaHCO3(100 mL)에 붓고 에틸아세테이트(3 x 100 mL)로 추출한다. 합쳐진 유기상을 가스 방출이 더 이상 식별되지 않을 때까지 5% NaHCO3100 mL 부로 세척한다. 그리고 나서 유기상을 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시킨다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 엷은 황색 고체로 얻는다.
P-디에톡시메틸-2,3-(3,4,5-트리메톡시벤조)부틸포스티네이트 ( 53 )
t-부틸리튬(n-펜탄 내 1.7 M 용액, 10 mmol)을 THF 50 mL 내 브로마이드52(5 mmol)의 용액에 첨가하며, 이때 혼합물의 온도를 -95℃ 이하로 유지한다. 첨가가 완결된 후 혼합물을 -78℃ 로 데운다. 30 분 후, 에틸렌 설포네이트(5 mmol)를 일부 첨가하고, 혼합물을 실온으로 데운다. 1 시간 후 1 M HCl(50 mL)을 첨가한다. 부가의 1 시간 후, 혼합물을 에틸아세테이트(3 x 100 mL)로 추출한다. 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고 진공에서 농축시킨다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일로 얻는다.
2,3-(3,4,5-트리메톡시벤조)부틸포스틴산 ( 54 )
36 % 수성 HCl 20 mL 내 화합물53(5 mmol)의 혼합물을 100℃ 에서 2 시간 동안 가열한다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 물 200 mL 로 희석하고 에틸아세테이트(4 x 100 mL)로 추출하고, 유기상은 무수 MgSO4상에서 건조시키고 진공에서 농축시킨다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일로 얻는다.
2-브로모-3-t-부틸디메틸실록시프로파날 ( 55 )
클로로포름 (50 mL) 및 에틸 아세테이트 (50 mL) 내 알데히드47(10 mmol) 및 CuBr2(10 mmol)의 혼합물을 빛을 차단하여 6 시간 동안 환류 하에 가열한다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 고체를 여과하여 제거하고 에틸 아세테이트 (50 mL)로 세척하고, 합쳐진 유기상을 MgSO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시킨다. 플래시 크로마토그래피에 의한 혼합물의 정제로 생성물을 엷은 황색 오일로 얻는다.
3-t-부틸디메틸실록시-1-프로페닐 2,3-(3,4,5-트리메톡시벤조)부틸포스토네이트 ( 56 )
산54(1 mmol)을 헥사메틸디실라잔(1 mL)에 용해시키고 3 시간 동안 환류하에 가열한다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 휘발성 성분을 진공에서 증발시킨다. 알데히드55(1 mmol)를 결과된 오일에 첨가하고, 혼합물을 질소 서류 하에 100 ℃ 에서 4 시간 동안 가열한다. 혼합물은 냉각시킨 후 플래시 크로마토그래피하여 정제한다.
3-[P-아미노-P-(N-피페라지노)포스포록시]-1-프로페닐-2,3-(3,4,5-트리메톡시벤조)-부틸포스토네이트 ( 57 )
테트라부틸암모늄 플루오라이드(THF 내 1.0 M 용액, 2 mml)를 -23℃ 로 냉각시킨 THF 50 mL 내 실릴에테르56(2 mmol) 용액에 첨가한다. 5 분 후 트리에틸아민(2 mmol)을 첨가하고, 뒤이어 POCl3(2 mmol)를 첨가한다. 4 시간 후, N-트리플루오로 아세틸피페라진 (2 mmol) 및 트리에틸아민(2 mmol)의 혼합물을 일부 첨가한다. 부가의 3 시간 후 NH3를 첨가한다. 부가의 2 시간 후, 반응 혼합물을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고 진공에서 농축시킨다. 플래시 크로마토그래피에 의한 정제는 생성물을 무색 오일로 산출한다.
실시예 9 :갈락토실-시토신 아라비노시드의 선구 약제 활성도.
선구 약제 갈락토실-시토신 아라비노시드(GalAraC)를 실시예 3 에 약술한바와 같이 제조하고, 박테리아 효소, β-갈락토시디아제로 독성 및 활성도에 대해 생체내 및 생체외에서 검사했다.
선구 약제 GalAraC 을 다른 농도로 2 개의 다른 조직 배양 세포주 ; Colo 320 DM 및 Lovo 에 첨가하였다. 세포를 4 일 동안 생장시키고, 그 후 배양액을 제거한 후 세포를 PBS 로 세척하였다. 세포를 짐사 염색액(Giemsa stain)으로 염색한 후, 배양 웰 표면에 가두어진 염색된 배양물의 광학 밀도를 600 nm 에서 측정하였다. 광학 밀도의 감소는 배양 웰에 부착된 세포 밀도의 감소를 지시한다. 동일한 방법을 사용하여 2 개 세포주 상 AraC 자체의 독성을 검사하였다. Colo 320 DM 세포주 상 약제 및 선구 약제간의 독성 비교를 제 9 도에 도시한다. OD(600) 0.5 를 산출하기 위해 사용된 농도에서 선구 약제 및 약제의 농도를 비교하므로써, GalAraC 가 AraC 보다 적어도 800 배 덜 독성인 것을 알 수 있었다. 즉, AraC 자체와 동등한 독성을 얻기 위해 800 배 더 높은 GalAraC 농도를 사용하여야 한다. 다시 선구 약제가 약제 AraC 보다 적어도 800 배 덜 독성인 세포주 Lovo 를 사용하는 제 10 도에서 동일한 결과가 제시될 수 있다. 제 9 도 및 10 도 모두는, 선구 약제가 효소 β-갈락토시다아제에 의해 활성화되었을 때, 독성이 같은 농도에 순수한 약제와 동등하다는 것을 제시한다.
선구 약제가 β-갈락토시다아제에 의해 활성화될 수 있는지를 검사하기 위해 효소를 Lovo 배양 세포의 표면 상 특정 종양 항원인 암 배자 항원(CEA : Carcino Embryonic Antigen)에 대항하도록 지정된 항체에 접합시켰다. Colo 320 DM 세포는 본 표면 항원이 부족하며 표준 대조군으로 사용되었다. 항체에 접합된 β-갈락토시다아제를 배양물에 첨가하고 항원과 결합하게 하였다. 그리고 나서 다른 농도의 선구 약제를 배양물에 첨가한 다음 3 일 동안 생장시켰다. 표준 대조군으로 효소 없이 BSA 를 배양물에 첨가하고, 같은 농도 범위의 선구 약제를 배양물에 첨가하였다. 제 11 도는 선구 약제가 항체-효소 접합체에 의해 활성화될 수 있음을 보여 주는 실험의 결과를 나타낸다. 제 11 도를 제 12 도와 비교하므로써, 선구 약제가 단지 접합된 항체에 의해서만 활성화되는 것이 아니라, CEA 종양 표지물을 운반하는 Lovo 세포도 선구 약제와 함께 BSA 가 첨가되는 배양액과 비교할 때 특히 죽게 된다는 것이 명백하다. 상기 결과는 선구 약제가 항원 국부 실험에서 약제 보다 대략 200 배 덜 독성이며, 세포 표면에서 항체에 의해 가두어졌을 때 특히 종양 세포의 표면에서 박테리아 효소에 의해 활성화 될 수 있다는 것을 보여 준다.
활성 약제의 세포독성 수준을 생성하는 표면 결합된 접합체의 능력을 평가하기 위해, 생성물 형성 속도를 지지재로서 ONPG 를 사용하여 측정하였다. 특히 LoVo 세포에 결합된 접합체는 생성물/분/세포 당 1.2 X 107분자를 생성하는 것으로 밝혀졌다. 본 구체적 분석 구조에서 상기 속도는 분당 1.6 mM 형성된 생성물과 동일하다. 1.5 mM AraC 가 세포 증식을 50% 억제하는 것이 보고되었으므로 (Gish, D. 일동 J. Med. Chem. 14 (1971) : 1159), 실험적으로 얻어진 속도는 생체외 분석에서 세포독성을 생성하는데 충분한 것으로 보인다.
AraC 및 GalArC 모두를 쥐에서 독성 활성에 대해 검사하였다. 분리 실험에서, 쥐에게 (100 mg/kg 의 농도로) AraC, GalAraC 및 GalAraC 에 뒤이은 β-갈락토시다아제를 주었다. 5 일 후, 모든 쥐에 대해 전체 혈구수 측정을 하였다. 약제를 선구 약제와 비교하므로써 (제 13 도의 막대 참조), 선구 약제가 실질적으로 생체 내에서 약제 보다 덜 독성이라는 것이 명백하다. 유사하게, 제 14 내지 17 도의 데이터는 (제 13 도의 요점이 제 14 내지 17 도에 대해 동일하다) β-갈락토시다아제 존재 하에서 선구 약제는 약제 자체와 훨씬 유사한 독성을 발생시키도록 활성화될 수 있음을 보여 준다. 이러한 효과는 분할된 호중구에서는 꽤 명백하지만, 아마도 다른 세포 합성의 역학을 반영하는 적혈구 세포에서는 덜 명백할 것이다.
요약하여, 상기 데이터는 선구 약제, GalAraC 가 생체내 및 생체외에서 상당히 감소된 독성을 가지며, 효소로 활성화될 때 활성된 선구 약제가 방출되어 생체 내 및 생체외에서 AraC 와 매우 유사한 독성을 발생시키는 것을 보여 준다.
실시예 10 :갈락토실-5-플루오로우리딘(24)의 선구 약제 활성.
유사한 실험 장치에서 선구 약제 갈락토실-5-플루오로우리딘(Gal5FU)을 실시예 4 에 서술된 바와 같이 합성하고, GalAraC 에 대해 상기 서술된 바대로 합성하고, GalAraC 에 대해 상기 서술된 바대로 검사하였다. 선구 약제 및 약제의 독성 연구 결과가 제 18 도에 제시된다. 약제 5-플루오로우리딘과 유사한 독성 정도를 유발하기 위해 요구되는 선구 약제 농도의 500 배 이상 증가가 있음을 알 수 있다. GalAraC 와 같이, 선구약제 gal5FU 는 생체외에서 활성화되어 순수한 약제 자체에 유사한 약제 수준을 생성할 수 있다. 그리하여, 약제에 갈락토오스 일부를 첨가하는 것이 실질적으로 및 선구 약제를 위한 훌륭한 후보가 되는 수준으로 독성을 감소시켰다.
갈락토실-5-플루오로우리딘을 galAraC 선구 약제에 대해 실행한 바와 같이 동일한 CEA 항원 종양 표면 지정도를 갖는 항체에 접합된 β-갈락토시다아제로 표제된 활성에 대해 검사했다. 항체를 항원-운반 세포(LoVo)와 CEA 항원 표시 없는 대조군 세포와 반응시켰다. 그리고 나서 선구 약제를 다른 농도로 다른 배양물에 첨가했다.
제 19 도는 LoVo 세포 표면 상에 위치한 항체가 대조군 Colo 세포에서 보다 20 내지 30 배 낮은 농도에서 선구 약제로 부터 5-FU 의 독성 양을 방출한다는 것을 보여주는 본 실험의 결과를 나타낸다 (제 20도 참조). 따라서 선구 약제의 지역 특정 활성이 명백히 낮은 농도에서 약제의 유효성을 증가시킨다.
gal 5FU 및 5FU 모두를 쥐에서 검사하고 비교했다. 생체내 연구는 생체 내 galAraC 실험에 대해 서술된 바와 같이 실행했다. 약제 및 선구 약제를 투여하고 총 골수 세포질과 함께 혈구 세포수가 주사 6 일 후 측정되었다. 실험의 결과가 제 21 도 내지 25 도에서 제시된다. 제 23 내지 24 에서 도면 주요부는 제 21 도에서와 동일하다.
galAraC 실험의 결과와 유사한 양식에서 선구 약제가 약제 자체와 비교되었을 때 감소된 특성을 보인다. 상기는 호중구 (제 23 도 참조) 및 임파구 (제 24 도 참조) 세포군에서 특히 명백하다. 이 6 일의 실험에서 적혈구 세포군이 심하게 고갈되지 않은 한편, 총 백혈구(제 21 도 참조)도 동일한 표지 효과를 보인다. 약제 및 덜 독성 성질의 선구 약제의 효과 간의 종합적인 차이는 총 골수 세포질의 측정에서 가장 명백히 알수 있다. 상기 결과가 제 25 도에 제시된다.
선구 약제가 아무런 효과를 가지지 않을 뿐만 아니라 β-갈락토시다아제에 의해 활성화될 수 있다는 것이 또한 명백하다. 따라서 선구 약제로서 사용되는 갈락토실-5-플루오로우라실 및 갈락토실-AraC 의 개념은 타당한 접근일 뿐만 아니라 상기 데이터로 부터 타당한 성공의 가능성이 있다.
실시예 15 :실시예 16 및 20 의 선구 약제의 중간체 및 실시예 18 및 22 의 선구 약제의 합텐인, (티아졸릴)이미노아세틱 에스테르, 화합물60의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제 26 도를 참조하시오.
Takasugi 일동,J. Antibiotics36 (1983) : 846-854 의 방법에 따라 브로마이드58의 N-알콕시프탈이미드를 제조한 다음, 히드라진 및 2-포름아미도-4-티아졸릴글리옥실산으로 처리하여 산59를 생성한다. N-히드록시 숙신이미드를 사용한 산 카르복실을 활성화하여 N-히드록시숙신이미딜 (Z)-2-(2-포름아미도-4-티아졸릴)-2-(1-t-부톡시카르보닐-1-메틸)에톡시이미노 아세테이트60을 생성시킨다.
상세하게, 합성은 하기와 같다.
t-부틸 2-브로모-2-메틸프로파노에이트 ( 58 )
이소부텐을, TLC 로 관찰하여 출발 물질이 소모될 때까지, CH2Cl2100 mL 내 트리플루오로메탄 설폰산 (0.1 mmol) 및 2-브로모-2-메틸프로판논산(100 mmol)의 용액으로 응축시킨다. 휘발성 성분을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 50% 에테르/헥산을 사용하여 중성 알루미나 패드로 여과시킨다. 여과액을 진공에서 농축시키고, 부가의 정제 없이 사용한다.
(Z)-2-(2-포름아미도-4-티아졸릴)-2-(1-t-부톡시카르보닐-1-메틸)에톡시이미노아세트산 ( 59 )
본원에 참고 문헌으로 포함된, Takasugi, H, 일동 J. Antibiotics 36 (1983) : 846-854 에 의해 주어진 방법을 따라 화합물59를 브로마이드58, N-히드록시프탈이미드 및 에틸 2-(포르밀아미노)-4-티아졸글리옥실레이트를 사용하여 합성한다.
N-히드록시 숙신이미딜 (Z)-2-(2-포름아미도-4-티아졸릴)-2-(1-t-부톡시카르보닐-1-메틸)에톡시이미노아세테이트 ( 60 )
CH2Cl210 mL 내 DCC (11 mmol)의 용액을 실온에서 CH2Cl290 mL 내 산59(10 mmol) 및 N-히드록시 숙신이미드 (10 mmol)의 용액에 첨가한다. 침전물이 재빨리 형성된다. 1 시간 후 용액을 여과시키고, 여과물을 물(40 mL)로 세척하고, 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축하여 생성물을 무색 고체로 얻는다.
실시예 16 :선구 약제, 5-플루오로우리딘 치환된 β-락탐, 화합물68의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제 27 도를 참고하시오.
여기에 참고 문헌으로 포함된 Evans, D. A. 일동, Tetrahedron Lett. (1985) : 3783-3786 의 방법에 따라 제조된, 3-(S)-아미노-4-(S)-히드록시메틸아제티디논 (61)을 에스테르60으로 아실화시켜 아미드62를 생성시키며, 이는 그 후 스웬(Swern) 산화 및 베이어-빌리저 (Baeyer-Villiger) 재배열시켜(여기에 참고 문헌으로 포함된, Bentley 일동의 "β-락탐 항생 물질 화학에의 최신 진보" 내 Afonso, A. 일동의 방법 및The Royal Society of ChmistrySpecial Publ. No. 70(1989) : 295-302 의 방법에 근거함) 에스테르64를 생성한다. 보호된 5-플루오로우리딘65를 제조하고 에스테르64와 반응시켜 아제티디논66을 생성하며 (Aoki 일동,Heterocycles15 (1981): 409-413 및Tetrahedron Lett(1979) : 4327-4330 의 방법에 근거함, 모두 여기에 참고 문헌으로 포함됨), 이때 알콜이 아실아미노기에 대해 트랜스에 선택적으로 아제티디논에 첨가된다. 아제티디논66을, 여기에 참고 문헌으로 포함시킨 Cimarusti, C. M. 일행의Tetrahedron39 (1983): 2577-2589 의 방법에 따라 설포닐화하고 탈보호화하여, 선구 약제68을 생성시킨다.
상세하게, 합성은 하기와 같다.
3-(S)-아미노-4-(S)-히드록시메틸아제티디논 ( 61 )
아민61은 여기에 참고 문헌으로 포함시킨 Evans, D. A. 일행,Tetrahedron Lett(1985) : 3783-3786 의 방법에 따라 제조할 수 있다.
3-(S)-[(Z)-2-(2-포름아미도-4-티아졸릴)-2-(1-t-부톡시카르보닐-1-메틸)에톡시이미노아세틸]아미노-4-(S)-히드록시메틸아제티디논 ( 62 )
아민61(1 mmol), 활성 에스테르60(1 mmol) 및 DMAP (1 mmol)를 DMF 10mL 에 용해시킨다. TLC 로 관찰하여 출발 물질이 소모된 후 혼합물을 물 (50 mL)에 붓고, 에틸 아세테이트(3 x 50 mL)로 추출하고, 유기층을 염수(50 mL)로 세척하고 무수 MgSO4상에서 건조시키고 용매를 진공에서 증발시킨다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일로서 얻는다.
4-(R,S)-카르보닐-3-(S)-[(Z)-2-(2-포름아미도-4-티아졸릴)-2-(1-t-부톡시카르보닐-1-메틸)에톡시이미노아세틸]아미노아제티디논 ( 63 )
CH2Cl210 mL 내 옥살릴 클로라이드(1.1 mmol)의 용액을 -78℃ 로 냉각시키고, CH2Cl21 mL 내 DMSO(1.1 mmol)의 용액을 적가한다. 15 분 후, CH2Cl21 mL 내 알콜62(1 mmol) 용액을 적가한다. 30 분 후, CH2Cl21 mL 내 트리에틸아민 (1.2 mmol) 용액을 일부 첨가하고 혼합물을 실온으로 데운다. 혼합물을 물(50 mL)에 붓고 CH2Cl2(3 x 50 mL)로 추출하고, 유기상을 물(50 mL)로 세척하고 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 용매는 진공에서 증발시킨다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일로서 얻는다.
4-(R,S)-카르보닐옥시-3-(S)-(3-[(Z)-2-(2-포름아미도-4-티아졸릴)-2-(1-t-부톡시카르보닐-1-메틸)에톡시이미노아세틸]아미노아제티디논 ( 64 )
m-CPBA(1.5 mmol)를 CH2Cl210 mL 내 알데히드63(1 mmol)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 TLC 로 관찰하여 출발 물질이 소모될 때까지 실온에 방치한다. 혼합물을 1 M NaHCO3(50 mL)에 붓고 에틸아세테이트(3 x 50 mL)로 추출하고, 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 용매는 진공에서 증발시킨다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일로서 얻는다.
2',3'-O-이소프로필리덴-5-플루오로우리딘 ( 65 )
2,2-디메톡시프로판(2 mL)을 DMF 5 mL 내 TsOH (20 mg) 및5-플루오로우리딘(1.05 g, 4 mmol)의 용액에 첨가하였다. TLC 로 관찰하여 출발 물질이 소모된 후, 메탄올 20 mL 를 첨가하고 반응을 밤새 유지되게 하였다. 그 후 용매를 진공에서 증발시켰다. 결과 고체를 뜨거운 메탄올로 재결정화하여 생성물 864 mg 을 무색 고체로서 얻었다.
1 H NMR(DMSO-d6) d 1.26 (s, 3), 1.45 (s, 3), 3.50-3.66 (m, 2), 4.04-4.14 (m, 1), 4.70-4.78 (m, 1), 4.82-4.91 (m, 1), 5.81 (bs, 1), 8.17 (d, 1, J=7 Hz), 11.86 (bs, 1)
선구 약제 선구 물질( 66 )의 제조
CH2Cl21 mL 내 BF3·OET2(0.1 mmol)의 용액을 CH2Cl250 mL 내 알콜65(1 mmol) 및 에스테르64(1 mmol)의 용액에 첨가한다. TLC 로 관찰하여 출발 물질이 소모된 후, 혼합물을 0.1 M NaHCO3(50 mL)에 붓고 에틸아세테이트(3 x 50 mL)로 추출하고, 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 용매를 진공에서 증발시킨다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일로서 얻었다.
선구 약제 선구 물질 67 의 제조
트리메틸실릴 클로로설포네이트(2 mmol)를 DMF(4 mL)에 첨가한다. 30 분 후, 휘발성 성분을 진공에서 제거한다. 잔류물을 얼음욕으로 냉각시킨 CH2Cl24 mL 내 아미드66(1 mmol)의 혼합물에 첨가한다. 30 분 후, 용액을 0.5 M KH2PO410mL 내에 붓는다. 유기상을 분리하고, 수성상을 CH2Cl2(4 mL)로 추출하고 건조될 때까지 증발시킨다. 고체 잔류물을 메탄올(40 mL)로 분쇄하고, 유기 세척액을 진공에서 농축시킨다. 잔류물을 부가의 정제 없이 사용한다.
5-플루오로우리딘-치환 β-락탐 선구 약제 ( 68 )의 제조
트리플루오로아세트산(1 mL)을 얼음욕으로 냉각시킨 CH2Cl24 mL 내 아니솔 (0.5 mL) 및 화합물61(1 mmol)의 혼합물에 첨가한다. 혼합물을 실온으로 데우고, 1 시간 후 휘발성 성분을 진공에서 증발시킨다. 잔류물을, 이동상으로서 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트 완충 용액 (pH 7) 및 아세토니트릴 혼합물을 사용하여, 역상 HPLC 에 의해 정제한다. 생성물을 함유한 획분을 합치고, 진공에서 건조시키고, 잔류물을 탈이온화된 물(2 X)로 부터 재건조시키고, 그리고 나서 잔류물을 -SP-세파덱스 이온 교환 칼럼, 칼륨 형태를 통과시켜 생성물을 디칼슘염 형태로 생성한다.
실시예 17 :실시예 16 의 선구 약제 합텐의 중간체, 5-알키닐화된 우리딘, 화합물74의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제 28 도를 참고하시오.
우리딘3a의 히드록실기를 보호화시켜 화합물70을 생성한다. 화합물70을 5 위치에서 요오드화시켜 요오디드71을 생성시킨다. 후속 팔라듐-촉매 알키닐화로 화합물73을 생성하고, 상기는 5' 히드록실에서 선택적으로 탈보호되어 중간체74를 생성한다.
상세하게, 합성은 하기와 같다.
5-요오도-2',3'-O-이소프로필리덴 우리딘 ( 69 )
CH2Cl210 mL 내 TsOH (1 mmol), 2,2-디메톡시프로판 (30 mmol) 및 트리올3a(10 mmol, 실시예 16 에서 합성이 서술됨)의 용액을 TLC 로 관찰하여 출발 물질이 소모될 때까지 실온에서 교반한다. 트리에틸아민(2 mmol)을 첨가하고, 휘발성 성분을 진공에서 증발시킨다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 생성물을 무색 고체로서 얻는다.
5-요오도-2',3'-O-이소프로필리덴-5'-O-(4-메틸벤조일)우리딘 ( 70 )
4-메틸벤조일 클로라이드(10 mmol)를 피리딘 20 mL 내 알콜69(10 mmol) 용액에 첨가한다. TLC 로 관찰하여 더 이상 진행이 발생하지 않은 후, 휘발성 성분을 진공에서 증발시킨다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 생성물을 무색 고체로서 얻는다.
4-t-부톡시카르보닐아미노-1-부틴 ( 72 )
실시예 1b 에서 서술한 바와 같은 히드라진 분해 후 얻어진 조아민71을, 디옥산 50 mL 및 트리에틸아민 2 mL 에 용해시키고, 디옥산 10 mL 내 디-t-부틸디카르보네이트(10 mmol)의 용액을 첨가한다. TLC 로 관찰하여 반응이 완결된 후 혼합물을 0.05 M HCl (50 mL) 및 에틸 아세테이트 (3 x 10 mL) 사이에 분배시키고, 유기상은 MgSO4상에서 건조시키고, 용매는 진공에서 증발시킨다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 생성물을 무색 오일로서 얻는다.
5-(4-t-부톡시카르보닐아미노-1-부틸닐)-2',3'-O-이소프로필리덴-5'-O-(4-메틸벤조일)우리딘 ( 73 )
트리에틸아민 150 mL 내 요오디드70(5 mmol)의 탈가스 용액에, 4-t-부톡시카르보닐아미노-1-부틴72(10 mmol), (Ph3P)2PdCl2(0.2 mmol), 및 CuI (0.3 mmol)를 첨가한다. 결과 현탁액을 출발 물질이 소모될 때까지 50℃ 에서 가열한다. 휘발성 성분을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 CHCl3(200 mL)에 용해시키고, 5% 이나트륨 EDTA (2x100 mL) 및 물(10 mL)로 세척하고, MgSO4상에서 건조시키고, 용매는 진공에서 증발시킨다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 고체로서 얻는다.
5-(4-t-부톡시카르보닐아미노-1-부티닐)-2',3'-O-이소프로필리덴우리딘 ( 74 )
농축 수산화 암모늄(7 mL)을, 메탄올 90 mL 내 에스테르73(5 mmol)의 용액에 첨가한다. TLC 로 관찰하여 출발 물질이 소모된 후 휘발성 성분을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일로서 얻는다.
실시예 18 :실시예 16 의 선구 약제의 합텐, 시클로부탄올 치환된 5-플루오로우리딘, 화합물81의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제 29 및 30 도를 참고하시오
알콜74를 에티닐설포네이트75에 접합 첨가시켜 이놀에테르76를 생성시킨다. 아지도케텐(azidoketene)을 이놀 에테르76에 [2+2] 고리첨가시켜 시클로부타논77을 생성시킨한다. 케토, 아지도, 및 알키닐기의 환원은 아미노 알콜79를 산출하며, 이는 아실화되고 탈보호되어 화합물81을 생성시키며, 이것은 1 차 지방족 아미노기에서 운반 단백질에 연결될 수 있다.
상세하게, 합성은 하기와 같다.
t-부틸-에틴설포네이트 ( 75 )
THF (0.5 M, 10 mmol) 내 에티닐 마그네슘 클로라이드의 용액을, -78℃ 로 냉각시킨 THF 100 mL 내 설퓨릴 클로라이드(20 mmol)의 용액에 첨가한다. 1 시간 후, THF 50 mL 내 트리에틸아민 (60 mmol) 및 t-부탄올 (60 mmol)의 용액을 적가한다. 용액을 실온으로 데우고, 휘발성 성분을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 에테르 (150 mL) 및 0.05 M HCl (50 mL) 간에 분배하고, 유기상을 염수(50 mL)로 세척한 후 MgSO4상에서 건조시키고, 휘발성 성분을 진공에서 증발시킨다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일로서 산출한다.
우리딘 5'-O-이놀 에테르 76 의 제조
나트륨 메톡시드(0.05 mmol)를 THF 100 mmol 내 알콜74(10 mmol) 및 알킨75(11 mmol)의 용액에 첨가한다. TLC 로 관찰하여 출발 물질이 소모된 후 아세트산(0.1 mmol)을 첨가하고, 휘발성 성분을 진공에서 증발시킨다. 잔류물을 5% NaHCO3(40 mL) 및 에틸아세테이트 (3x100 mL) 사이에 분배시키고, 유기상을 MgSO4상에서 건조시키고, 용매는 진공에서 증발시킨다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일로서 얻는다.
시클로부타논 77 의 제조
CH2Cl220 mL 내 아지도 아세틸 클로라이드(10 mmol)의 용액을, -78℃ 로 냉각시킨 CH2Cl250 mL 내 이놀 에테르76(5 mmol) 및 트리에틸아민 (11 mmol)의 용액에 적가한다. 혼합물을 밤새 실온으로 서서히 데운다. TLC 로 관찰하여 더이상의 반응의 진행이 관찰되지 않을 때, 메탄올 1 mL 를 첨가하고 휘발성 성분을 진공에서 증발시킨다. 잔류물을, 용매로서 에틸아세테이트를 사용하여 실리카겔 짧은 관을 통과시킨다.
시클로부탄올 78 의 제조
나트륨 보로히드라이드(10 mmol)를, 얼음욕으로 냉각시킨 메탄올 20 mmol 내 케톤77(2 mmol)의 용액에 첨가한다. 더이상 반응의 진행이 TLC 로 관찰되지 않을 때, 휘발성 성분을 진공에서 증발시킨다. 잔류물을 0.05 M HCl (40 mL) 및 에틸아세테이트 (3x10 mL) 사이에 분배시키고, 유기상은 MgSO4상에서 건조시키고 용매는 진공에서 증발시킨다. 그 후 잔류물을 용매로서 에틸아세테이트를 사용하여 실리카겔 짧은 관을 통과시키고, 진공에서 농축시켜 부가의 정제 없이 사용한다.
아미노 알콜 79 의 제조
아지드78(5mmol)을 메탄올(100 mL)에 용해시킨 후 5% Pd-C (10 중량%)를 첨가하고, 혼합물을 출발 물질이 소모될 때까지 수소 분위기 하에서 교반한다. 셀라이트 패드를 사용하여 촉매를 여과시킨 후, 그 촉매를 메탄올(100 mL)로 헹군다.용매를 진공에서 증발시키고, 생성물은 부가의 정제 없이 사용한다.
아미드 80 의 제조
아미드80을 아미드62에 대해 사용된 방법에 따라 아민79및 에스테르60으로 합성한다.
합텐 81 의 제조
화합물68에 대한 방법을 사용하여 화합물80을 탈보호시켜 화합물81을 얻는다. 그러나 운반 단백질에 대한 1 차 지방족 아미노기에서 화합물81을 연결하는 반응을 위해 트리플루오로아세테이트 염을 사용할 수 있다.
실시예 19 :실시예 20 의 선구 약제의 중간체, 5-플루오로우리딘 5'-O-아릴에스테르, 화합물85의 제조
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제 31 도를 참고하시오.
브로마이드5에 대한 리튬-할로겐 교환에 뒤이어 벤질 클로로포르메이트와의 반응은 모노에스테르82를 산출한다. 5-플루오로우리딘65로 에스테르화하여 디에스테르83을 얻으며, 이는 벤질에스테르기에서 선택적으로 탈보호되고 활성화되어 중간체85를 산출한다.
상세하게, 합성은 하기와 같다.
2-카르보벤질옥시-3,4,5-트리메톡시벤조산 ( 82 )
t-부틸리튬(n-펜탄 내 1.7 M 용액, 15 mmol)을 THF 50 mL 내 2-브로모-3,4,5-트리메톡시벤조산5(5 mmol, 합성은 실시예 12 에서 서술됨)의 용액에 첨가하며, 이때 혼합물의 온도를 -95℃ 로 유지한다. 첨가가 완결된 후, 혼합물을 -78℃로 데운다. 30 분 후, 벤질 클로로메이트(5 mmol)를 일부 첨가하고 혼합물을 0℃ 로 데운다. 물(50 mL)을 첨가한 다음 혼합물의 pH 를 0.1 M HCl 을 사용하여 조심스럽게 3 으로 조정한다. 혼합물을 에틸아세테이트(5×100 mL)로 추출한다. 유기상을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 진공에서 농축시킨다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피하여 생성물을 무색 오일로 산출한다.
디에스테르 83 의 제조
CH2Cl250 mL 내 EDC(6 mmol), 2', 3'-O-이소프로필리덴-5-플루오로우리딘65(5 mmol) 및 산82(5 mmol)의 혼합물을 출발 물질이 소모될 때까지 실온에서 교반한다. 용액을 물(2×30 mL)로 세척하고, 수성상은 CH2Cl2(2×50 mL)로 세척하고, 유기상은 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 용매는 진공에서 증발시킨다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일로서 얻는다.
모노산 84 의 제조
디에스테르83(2 mmol)을 에틸아세테이트(100 mL)에 용해시키고, 5% Pd-C (10 중량%)를 첨가하고, 혼합물을 출발 물질이 소모될 때까지 수소 분위기 하에 교반한다. 촉매를 셀라이트 패드를 사용하여 여과하고, 또한 그 촉매를 에틸아세테이트(100 mL)로 헹군다. 용매를 진공에서 증발시키고 생성물은 부가의 정제 없이 사용한다.
산염화물 85 의 제조
모노산84(1 mmol)를 CH2Cl2(20 mL)에 용해시키고, 티오닐 클로라이드(5 mmol)를 첨가한다. 반응의 진전은 분액의 메탄올 분해 및1H-NMR 분광 분석법으로 추적한다.
실시예 20 :5'-O-아로일-5-플루오로우리딘에 의해 치환된, 선구 약재 β-락탐, 화합물90의 제조.
본 실시예에 굵은 글씨로 된 번호의 화합물은 제 32 도를 참조하시오.
히드록실아민을 사용하여 트레오닌을 N-아실화 및 아미드화하므로써, 히드록삼산87을 생성한다. 염산85를 사용하여 보다 산성인 히드록삼산 히드록실에서 화합물87의 반응은 아미드88을 산출하며 (Miller. M. J. 일동,Tetrahedron39 (1983) : 2575), 이는 미쯔노부 반응에 의한 고리의 폐쇄를 거친다 (Miller, M. J. 일동,J. Am. Chem. Soc.102 (1980) : 7026-7032). 후속적인 탈보호는 β-락탐 선구 약제90을 생성한다.
상세하게, 합성은 하기와 같다.
N-[(Z)-2-(2-포름아미도-4-티아졸릴)-2-(1-t-부톡시카르보닐-1-메틸)에톡시아미노아세틸]트레오닌 86
30 mL 의 DMF 내 L-트레오닌 (5 mmol), 에스테르60(5 mmol) 및 DMAP (5 mmol)의 혼합물을 실온에서 교반했다. TLC 에 의해 출발 물질이 소비되었음이 관측된 후, 그 혼합물을 0.05 M HCl(50 mL)에 붓고 에틸 아세테이트(3×50 mL)로 추출한 후, 유기상을 염수(50 mL)로 세척하고 무수 MgSO4상에서 건조시킨 다음, 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 무색 오일의 생성물을 산출했다.
트레오닌 히드록삼산 87 의 제조
5 mL 의 CH2Cl2내 DCC (5.5 mmol) 용액을 실온에서 45 mL CH2Cl2내 히드록실아민 히드로클로라이드 (5 mmol), 트리에틸아민 (5 mmol) 및 산86(5 mmol)에 첨가했다. 침전물이 빠르게 형성되었다. 1 시간 후, 용액을 여과하고 여과액을 0.05 M 의 HCl(40 mL)로 추출하고, 유기상은 무수 MgSO4상에서 건조시킨 후 진공에서 농축시켜 무색 고체의 생성물을 얻었다.
O-벤조일-히드록삼산 88 의 제조
화합물85를 5 mL 의 CH2Cl2에 용해시키고, 얼음욕으로 냉각시킨 20 mL의 CH2Cl2내 히드록삼산87(1 mmol) 및 DMAP (2 mmol) 용액에 적가했다. 2 시간 후 혼합물을 물(50 mL)에 붓고 에틸 아세테이트(3×50 mL)로 추출시킨 후, 유기상을 염수(50 mL)로 세척하고 무수 MgSO4상에서 건조시킨 다음, 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일의 생성물을 얻었다.
β-락탐 89 의 제조
10 mL 의 THF 의 DEAD (1.1 mmol) 용액을 실온에서 20 mL 의 THF 내 화합물88(1 mmol) 및 트리페닐포스핀(1.1 mmol)의 용액에 적가했다. TLC 에 의해 반응이 완결되었음이 관측된 후, 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 무색 오일의 생성물을 얻었다.
β-락탐 선구 약제 90 의 제조
트리플루오로아세트산(2 mL)을 얼음욕으로 냉각시킨 10 mL 의 CH2Cl2내 화합물89(1 mmol) 및 아니솔(1 mL)의 혼합물에 첨가했다. 혼합물을 실온으로 가열하고, 1 시간 후 휘발성 성분을 진공에서 증발시켰다. 이동상으로서 0.1 M 의 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액 (pH 7) 및 아세토니트릴 혼합물을 사용하는 역상 HPLC 에 의해 잔류물을 정제했다. 생성물을 함유하는 분획들을 혼합하고 진공에서 건조시킨 후, 잔류물을 탈이온수(3×)로 재건조한 다음, 잔류물을 칼륨 형태의 SP-세파덱스 이온 교환 칼럼을 통해 통과시켜 칼륨염 형태의 생성물을 얻었다.
실시예 21 :실시예 22 의 합텐의 중간물, 즉, 5-알키닐화된 우리딘 5'-O-아릴 에스테르, 화합물92의 제조.
본 실시예는 제 33 도에 관한 것이다.
알콜74를 사용하여 산82를 에스테르화하여 디에스테르91을 제조한다. 벤질 에스테르 카르복실기의 선택적 탈보호에 의하여 모노산92를 생성시킨다.
상세한 합성 과정은 다음과 같다 :
우리딘 5'-O-아릴 에스테르 91 의 제조
50 mL 의 CH2Cl2내 산82(5 mmol), 알콜74(5 mmol), 및 EDC (6 mmol)의 혼합물을, 출발 물질이 모두 소모될 때까지 실온에서 교반했다. 용액을 물 (2×30 mL)로 세척한 후, 수성상은 CH2Cl2(2×50 mL)로 세척하고, 유기상은 무수 MgSO4상에서 건조시킨 다음 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 무색 오일의 생성물을 얻었다.
모노산 92 의 제조
디에스테르91(5 mmol)을 에틸 아세테이트(100 mL)에 용해시키고 5% Pd-C(10 중량%)를 첨가한 다음, 혼합물을 출발 물질이 다 소비될 때까지 수소 분위기 하에서 교반했다. 촉매를 셀라이트 패드를 사용하여 여과시킨 후 에틸 아세테이트(100 mL)로 세정했다. 용매를 진공에서 증발시킨 후, 생성물을 더 이상의 정제 없이 사용했다.
실시예 22 :실시예 20 의 선구 약제의 합텐, 5'-O-아로일 우리딘에 의해 치환된 시클로부탄올, 화합물100의 제조.
본 실시예는 제 34 도에 관한 것이다.
문헌에 기재된 바에 따라 제조된 시클로부텐디온93을, 여러 단계를 거쳐 아미노시클로부탄디올97로 전환시킨다. 선택된 N- 및 O-아실화 반응 및 탈보호 반응에 의해 시클로부탄올 합텐100을 얻는다.
상세한 합성 과정은 다음과 같다 :
3-히드록시-4-메틸-3-시클로부텐-1,2-디온 ( 93 )
본 명세서에 참고로 포함한 Bellus, D. 일행의Helv. Chim. Acta63 (1980) : 1130-1140 의 과정을 사용하여 화합물93을 합성했다.
3-t-부틸디메틸실록시-4-메틸시클로부텐-1,2-디온 ( 94 )
이미다졸(11 mmol)을, 얼음욕으로 냉각시킨 5 mL 의 DMF 내 화합물93(5mmol) 및 t-부틸디메틸클로로실란(5.5 mmol)의 용액에 첨가했다. 혼합물을 실온으로 가온했다. 16 시간 후 혼합물을 물(50 mL)에 붓고 에테르(3×50 mL)로 추출한 다음, 유기상을 염수(50 mL)로 세척하고 무수 MgSO4상에서 건조시킨 후, 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 플래시 프로마토그래피로 정제하여 무색 오일의 생성물을 얻었다.
시클로부텐디올 95 의 제조
나트륨 보로히드라이드(20 mmol)를, 얼음욕으로 냉각시킨 50 mL 의 에탄올 내 화합물94(5 mmol)의 용액에 첨가했다. TLC 에 의해 출발 물질이 다 소비되었음이 관측된 후, 혼합물을 물(100 mL)에 붓고 에테르(4×75 mL)로 추출한 다음, 유기상을 염수(50 mL)로 세척하고 무수 MgSO4상에서 건조시킨 후, 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 무색 오일의 생성물을 얻었다.
아미노시클로부탄디올 96 의 제조
테트라부틸아모늄 플루오라이드(THF 내 1.0 M 용액, 6 mmol)를 얼음욕으로 냉각시킨 50 mL 의 THF 내 화합물95(5 mmol) 용액에 첨가했다. 30 분 후 디벤질아민(20 mmol)을 첨가했다. 다시 15 분 후 나트륨 시아노보로히드라이드 (30 mmol)를 첨가했다. 또다시 2 시간 후, 혼합물을 물(100 mL)에 붓고, pH 를 10으로 조절한 후 혼합물을 에테르(4×75 mL)로 추출하고, 유기상을 염수(50 mL)로 세척한 다음 무수 Na2SO4상에서 건조하고, 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 플래시크로마토그래피에 의해 정제하여 무색 오일의 생성물을 얻었다.
아미노시클로부탄디올 97 의 제조
20 mL 의 메탄올 내 5% Pd-C (10 중량%) 및 아민96(5 mmol)의 혼합물을 실온 및 수소 분위기 하에서 출발 물질이 TLC 에 의해 다 소비됨이 관측될 때까지 교반했다. 셀라이트 패드를 통해 촉매를 여과한 후 150 mL 의 부가적 MeOH 로 세척했다. 용매를 진공에서 증발시키고, 잔류 오일을 더 이상의 정제 없이 사용했다.
아미드 98 의 제조
DMAP(6 mmol)를, 15 mL 의 CH2Cl2내 아민97(3 mmol) 및 티아졸 에스테르60(3 mmol) 용액에 첨가했다. TLC 에 의해 반응이 더 이상 진행되지 않음이 관측된 후, 혼합물을 물(50 mL)에 붓고 에틸 아세테이트(3×50 mL)로 추출한 다음, 유기상을 염수(50 mL)로 세정하고 무수 MgSO4상에서 건조시킨 다음, 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 무색 오일의 생성물을 얻었다.
에스테르 99 의 제조
10 mL 의 CH2Cl2내 산92(1 mmol), 알콜98(1 mmol) 및 EDC(1.2 mmol)의 혼합물을, 실온에서 출발 물질이 다 소비될 때까지 교반했다. 용액을 물(2×20 mL)로 세척한 후, 수성상은 CH2Cl2(2×20 mL)로 세척하고, 유기상은 무수 MgSO4상에서 건조시킨 후 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 프래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 무색 오일의 생성물을 얻었다.
시클로부탄올 합텐 100 의 제조
트리플루오로아세트산(2 mL)을, 얼음욕에 의해 냉각시킨 100 mL 의 CH2Cl2내 화합물99(1 mmol) 및 아니솔(1 mL)의 혼합물에 첨가했다. 혼합물을실온으로 가온시키고, 1 시간 후 휘발성 성분을 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 더 이상의 정제 없이 운반 단백질에 연결시키기 위해 사용했다.
아드리아마이신 및 멜팔란 선구 약제
아드리아마이신 및 디우노마이신은 삽입을 통해 DNA 합성을 억제하는 것으로 밝혀진 안트라시클린 항종양 항생물질이다 (Di marco, A. 등의Biochem. Pharmacol.20 (1971) : 1323-1328). 상기 화합물은 당 잔기(다우나사민)의 아미노기와 DNA 의 인산 염기 사이에서 색소포(chromophore)의 상호 작용과 정전기적 상호작용을 통해 염기쌍으로 삽입됨이 증명되었다 (Di marco. A. 등의Cancer Chemoth. Rep.Vol. 6, No. 2 (1975) : 91-106).
아미노산, 펩티드 또는 기타 카르복실산에 의한 아미드 결합 형성을 통해 아미노기를 유도체화시키면 (Candra, P.,Cancer Chemoth. Rep.(1975) : 115-122), 상기 화합물의 독성이 감소된다는 것이 증명되었다 (Levin. Y.,Febs Letters119-122).
실시예 23 :아드리아마이신 선구 약제인 아로일 아미드, 화합물103의 제조.
본 실시예는 제 35 도에 관한 것이다.
아드리아마이신 선구 약제103은 아드리아마이신101및 벤조산102(제 3도)로 부터 합성할 수 있다. 아드리아마이신101을 DMF 내의 1-히드록시벤조트리아졸(HOBT) 및 1-메틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)의 존재 하에 벤조산102로 처리한다. 상세한 합성 과정은 다음과 같다 :
아드리아마이신 선구 약제 103 의 벤조일아미드 합성의 일반 과정
DMF (0.015 M) 내의 아드리아마이신101(1 당량)의 용액에 벤조산102(1 당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC, 1.05 당량), 및 1-히드록시벤조트리아졸(HOBT 1 당량)을 차례로 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 교반했다. 반응을 완결한 후, 생성물103을 크로마토그래피에 의해 정제했다. 적절한 아로일 카르복실산을 치환하여, 동일 절차를 사용하여 기타 아로일아미드를 제조했다.
실시예 24 :실시예 23 의 선구 약제의 합텐, 즉 아드리아마이신 아로일아미드의 인산염, 화합물104의 제조.
본 실시예는 제 36 도에 관한 것이다.
아드리아마이신의 전이 상태 유사체(화합물104)의 합성은, 아드리아마이신101및 벤젠포스폰산105으로 부터 이루어진다. DMF 내 1-히드록시벤조트리아졸 및 EDC 의 존재 하에 벤젠포스폰산105로 아드리아마이신101을 처리한다.
상세한합성 과정은 다음과 같다 :
DMF 내 아드리아마이신101(1 당량)의 용액에 벤젠포스폰산105(1 당량), 1-에틸 3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC, 1 당량), 및 1-히드록시벤조트리아졸(1 당량)을 차례로 첨가하고, 실온에서 반응 혼합물을 교반했다. 반응완결 후, 생성물104는 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
실시예 24a :실시예 23 의 선구 약제의 합텐, 즉 아드리아마이신의 아로일 설폰아미드, 화합물106의 제조.
본 실시예는 제 37 도에 관한 것이다.
아로일 설폰아미드 합텐 화합물106은, 무수 DMF 내 트리에틸아민의 존재하에 아드리아마이신101을 벤젠설포닐 클로라이드107로 처리하므로써 제조될 수 있다. 상세한 합성 과정은 다음과 같다 :
TS 유사체 화합물 106 의 합성
아르곤 분위기 하에서, 트레에틸아민(1.5 당량)의 존재 하에 DMF 내 아드리아마이신101(1 당량)의 용액에 벤젠설포닐 클로라이드107(1.1 당량)을 0℃ 에서 천천히 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하고, 반응이 완결된 후 생성물106을 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
실시예 25 :멜팔란 아로일아미드 선구 약제109의 제조.
본 실시예는 제 38 도에 관한 것이다.
멜팔란 선구 약제109는, 멜팔란108및 벤조일 클로라이드로 부터 합성할 수 있다.
벤조일 클로라이드를 벤젠설포닐 클로라이드 대신 사용하는 것을 제외하고는, 화합물109에 대한 상세한 합성 과정은 화합물106의 제조에 기재된 바와 같은 절차를 따른다.
실시예 26a :실시예 25 의 선구 약제의 합텐, 즉 설폰아미드 화합물110의 제조.
본 실시예는 제 39 도에 관한 것이다.
멜팔란의 합텐(화합물110)은, 화합물106의 제조에서 기재된 바와 유사한 반응 조건을 사용하여 멜팔란108및 벤젠설포닐 클로라이드107로 부터 합성할 수 있다.
본 화합물의 상세한 합성 과정은 화합물106의 합성에서 기재된 바와 같은 절차에 따른다.
실시예 27 :5-플루오로우리딘 에스테르 선구 약제의 상대적 독성.
플루오로우리딘은 여러 조직에서 충실성 종양을 치료하는데 있어 임상적 용도를 지닌 세포독성 항신생물 뉴클레오시드 유사체이다. 그러나, 플루오로우리딘은 정상 조직, 특히 골수 및 위장관 상피에 대해 독성을 나타낸다. 종양 세포에 표적화된 촉매성 항체 또는 효소에 의해 활성화된 플루오로우리딘의 선구 약제는, 실질적으로 플루오로우리딘의 치료 지수를 향상시킨다. 선구 약재가 외생 효소에 의해 활성화되는 것이 아니라 촉매성 항체에 의해 용이하게 활성화되는 것이 바람직하다.
에스테르를 분할하는 촉매성 항체는 직송(straight-forward) 방법에 의해 제조된다. 플루오로우리딘의 5'-위치에 부착된 에스테르 치환체는 비독성을 제공하며, 또한 우리딘 포스포릴라아제에 의한 분해로 부터 보호된다. 플루오로우리딘의 5'-벤조에이트 부위 상의 치환체가 외생 효소에 의해 탈에스테르화 반응을 개질시켜 플루오로우리딘 그자체 보다 실질적으로 독성이 적은 선구 약제를 형성하는지의여부를 확인한다.
방법
플루오로우리딘(FUrd) 및 플루오로우리딘 선구 약제 20g 을 Balb/C 쥐(암컷) 군(n=7)에 하기 용량으로 피하 주사했다 :
1. 플루오로우리딘 10 mg/kg
2. 플루오로우리딘 50 mg/kg
3. 플루오로우리딘 100 mg/kg
4. 5'-벤조일플루오로우리딘 (BZ-FUrd) 139.7 mg/kg
5. 5'-(2,4,6-트리메틸벤조일)플루오로우리딘 (TMB-FUrd) 156.9 mg/kg
6. 5'-(3,4,5-트리메톡시벤조일)플루오로우리딘 (TMOX-FUrd) 175.2 mg/kg.
플루오로우리딘의 3 개의 방향족 에스테르의 용량은 몰 당량의 100 mg/kg 플루오로우리딘이다.
7 번째 군(대조)은 단지 주사 부형제(0.9 % 염수 내 10% DMSO 0.4 ml)을 투여받았다.
플루오로우리딘 또는 그 선구 약제의 투여 후 7 일이 경과한 다음, 혈액 샘플을 후동으로 부터 취해 감별 혈구를 측정하고, 각 쥐의 대퇴골로 부터 세포를 수취하여 총 골수 세포 충실성을 계산하고, 비장을 수취하여 무게를 단다. 또한 체중을 측정했다.
결과
플루오로우라실의 투여는 복용량에 의존하여 혈구 세포수 및 골수 세포수를감소시키는 결과를 낳았다.
100 mg/kg 플루오로우리딘은 체중 및 비자 중량의 명백한 감소를 낳았다. 쥐 에스테라아제 활성에 의해 분해되는 것으로 예상되는 5'-벤조일플루오로우리딘(139 mg/kg)은 모든 검사된 지표에서 반영되듯이, 단지 플루오로우리딘(100 mg/kg)만의 몰 당량에 대해 대략 동일한 독성을 가진다.
5'-(2,4,6-트리메틸벤조일)플루오로우리딘(TMB-FUrd)은 독성 증거를 거의 나타내지 않으며, 단지 적혈구 수만 대조 표준치 보다 훨씬 낮다. 이 화합물은 골수 세포수 및 호중구 수에 의해 결정되는 바와 같이, 플루오로우리딘의 1/10 몰 당량 보다 골수에 덜 손상을 입힌다.
5'-(3,4,5-트리메톡시벤조일)플루오로우리딘(TMOX-FUrd)은 플루오로우리딘 (FJ 50 mg/kg)의 1/2 몰 당량 보다 약간 덜 독성이다. 데이터를 표 1 및 2 에 재시한다.
표 1 :
세포질군 체중(grams) 비장 중량(mg) 골수(106세포/대퇴골)
대조군 20.1±0.5 89.9±3.4 8.28±0.69
FUrd 10 mg/kg 89.9±2.0 ns 5.83±0.77*
FUrd 50 mg/kg 69.6±2.4* 2.85±0.16*
FUrd 100 mg/kg 16.3±0.6* 57.7±2.5* 0.98±0.19*
BZ-FUrd 17.5±0.6* 61.8±1.2* 1.23±0.10*
TMB-FUrd 19.6±0.4 ns 99.2±4.4 ns 7.88±0.47 ns
TMOX-FUrd 20.0±0.5 ns 73.3±3.5* 3.42±0.29*
문자*는 대조군 표준치 보다 명백히 낮음을 나타낸다. P< .05 ;
ns 는 대조군(처리하지 않은 것)과 다르지 않음을 나타낸다.
표 2 :플루오로우리딘 및 플루오로우리딘 선구 약제의 상대적 독성-혈구 세포수
군 혈소판(K/ml) 보중구(K/ml) 적혈구(K/ml)
대조군 741±15 1.747±.737 9.01±0.09
FUrd 10 mg/kg 705±14 ns 607±.330 ns 8.33±0.09*
FUrd 50 mg/kg 433±39* .020±.036* 7.81±0.11*
FUrd 100 mg/kg 155±20* .010±.0.19* 7.59±0.25*
BZ-FUrd 209±31* .011±.030* 7.76±0.22*
TMB-FUrd 707±23 ns 1.30±.338 ns 8.69±0.07*
TMOX-FUrd 6.28±27* .093±.039* 7.65±0.11*
문자 * 는 대조군 표준치 보다 명백히 낮음을 나타낸다. P<.05 ;
ns 는 대조군(처리하지 않은 것)과 다르지 않음을 나타낸다.
실시예 27a :높은 투여량에서 5-플루오로우리딘 에스테르 선구 약제의 상대적 독성.
실시예 27 에 서술된 바와 유사한 실험에서, 최대 항독성의 투여량을 결정하기 위한 시도로서, 2,4,6-트리메톡시벤조일 5-플루오로우리딘 및 2,6-디메톡시벤조일 5-플루오로우리딘의 독성을 높은 투여량 수준에서 쥐로써 검사하였다.
1 부
2,4,6-트리메톡시벤조일 5-플루오로우리딘을 하기에 나열된 바와 같이 5-플루오로우리딘의 독성 및 Balb C 암컷 쥐 6 그룹의 대조군과 비교하였다.
1) 대조군-염수 0.2 ml i. p. 5 마리
2) FlUrd 10 mg/kg 5 마리
3) FlUrd 50 mg/kg 5 마리
4) 트리메톡시벤조일 FlUrd (TMOX FlUrd)(100 mg/kg 몰 당량의 FlUrd) 158 mg/kg 5 마리
5) TMOX FlUrd(200 mg/kg 몰 당량의 FlUrd) 316 mg/kg 5 마리
6) TMOX FlUrd(500 mg/kg 몰 당량의 FlUrd) 790 mg/kg 3 마리
약제 투여 7 일 후에 혈구 샘플을 다른 혈구수 결정을 위해 후 안외동으로 부터 취했다.
결과
하기 표 3 이 나타내는 바와 같이, 선구 약제는 높은 투여량에서만 500 mg/kg 의 약제에서와 동등하게 혈구 세포수를 변형시킨다. 본 투여량에 나타난 독성은 약제 50 : 1 의 독성율을 나타내는 FlUrd 약제 자체의 10 mg/kg 보다 약간 더 높은 투여량에서와 대략적으로 동등하였다. 상기 높은 투여량의 선구 약제는 동물을 죽이지 않았으며: FlUrd 약제와 비교할 때 그들의 독성에서 매우 실질적인 감소를 갖는 것을 증명하였다.
표 3 :FlUrd 대 2,4,6-트리메톡시벤조일 FlUrd 의 효과
군 WBC임파구K/㎕ 혈소판K/㎕ 호중구K/㎕ K/㎕
대조군 10.32±0.34 730.6±33.7 1.635±0.259 8.31±0.22
FlUrd 10 mg/kg 9.82±0.89 ns 683.8±25.6 ns 0.654±0.200* 8.79±0.76 ns
FlUrd 50 mg/kg 12.03±0.77 ns 312.3±45.3* 0.058±0.033* 11.90±0.76
TMOX FlUrd 100 mg/kg 10.22±0.80 ns 730.6±58.7 ns 1.674±0.212 ns 7.91±0.64 ns
TMOX FlUrd 200 mg/kg 9.28±0.32 ns 833.8±79.6 ns 0.985±0.167 ns 7.83±0.15 ns
TMOX FlUrd 500 mg/kg 7.23±0.24* 771.7±29.5 ns 0.513±0.231* 6.60±0.20
문자 * 는 대조군 표준치 보다 현저하게 낮음을 나타낸다. P<.05 ;
ns 는 대조군(처리하지 않은 것)과 다르지 않음을 나타낸다.
2부
하기에 나열된 바와 같이, Balb C 암컷 쥐 여덟(8)군 중에서, 높은 투여량의 2,6-디메톡시벤조일 5-플루오로우리딘의 독성을 대조군 및 5-플루오로우리딘의 독성과 비교하였다.
1) 대조군-염수 0.2 ml i. p. 7 마리
2) FlUrd 5 mg/kg 6 마리
3) FlUrd 10 mg/kg 6 마리
4) FlUrd 50 mg/kg 6 마리
5) FlUrd 100 mg/kg 6 마리
6) 2,6-디메톡시벤조일 FlUrd (DMOX FlUrd)100 mg/kg 몰 당량의 FlUrd 6 마리
7) DMOX FlUrd, 200 mg/kg 몰 당량의 FlUrd 6 마리
8) DMOX FlUrd, 500 mg/kg 몰 당량의 FlUrd 5 마리
선구 약제 투여 7 일 후에 혈구 샘플을 다른 혈구수 결정을 위해 후안 외동으로 부터 취했다.
결과
하기 표 4 에서 보여지는 바와 같이, 본 실험에 대량 사용된 투여량에서 2,6-디메틸벤조일 플루오로우리딘은 백혈구, 혈소판, 호중구 및 임파구로 부터 측정할 때 아무런 독성 증거를 나타내지 않는다. 본 선구 약제는 특히, 상기 높은 투여량에서 세포독성 화학 요법 약제에 가장 민감한 혈구 세포 유형인 백혈구에 대한 FlUrd 의 독성에 비해 50 : 1 이상의 상대적 독성 비율로서, 매우 비독성이다.
표 4 :혈구 계산치에 대한 FlUrd 대 2,6-디메톡시 FlUrd 의 효과
군 WBC임파구K/㎕ 혈소판K/㎕ 호중구K/㎕ K/㎕
대조군 7.34±0.46 769.1±26.4 0.971±0.141 6.02±0.33
FlUrd 5 mg/kg 7.43±0.55 ns 736.0±37.2 ns 1.473±0.386ns 5.58±0.38 ns
FlUrd 10 mg/kg 8.27±0.64 ns 820.5±34.6 ns 0.637±0.084 ns 7.16±0.59 ns
FlUrd 50 mg/kg 4.88±0.70* 489.0±72.3* 0.208±0.183* 4.62±0.51*
FlUrd 100 mg/kg 1.88±0.46* 178.3±14.8* 0.007±0.003* 1.87±0.46*
DMOX FlUrd 100 mg/kg 7.48±0.29 784.3±11.9 1.335±0.101 5.86±0.37
DMOX FlUrd 200 mg/kg 9.90±0.76 895.0±25.9 2.083±0.242 7.43±0.76
DMOX FlUrd 500 mg/kg 9.02±0.59 909.6±30.3 1.972±0.194 6.78±0.60
문자 * 는 대조군 표준치 보다 현저하게 낮음을 나타낸다. P<.05 ;
ns 는 대조군(처리하지 않은 것)과 다르지 않음을 나타낸다.
실시예 28 :5-플루오로우리딘 및 5'-β-갈락토실-플루오로우리딘의 상대적 독성.
5'-β-갈락톡실-플루오로우리딘(Gal-Furd)은 비포유류 효소 β-갈락토시다아제의 의하거나 또는 적합한 촉매성 항체에 의해 활성화될 수 있는 플루오로우리딘의 선구 약제이다. 결정적인 문제는 5' 위치에 공유 결합된 당이 플루오로우리딘의 독성을 감소시키는 정도에 관한 것이다. 종양 억제 플루오린화된 피리미딘 유사체에 대한 1 차적 투여량 제한 독성은 골수에 손상을 주는 것이다. Gal-Furd 에 대한 플루오로우리딘의 독성은 혈구 세포수 및 골수 세포수를 독성의 지표로 사용하여 쥐에서 평가되었다. 또한, Gal-Furd 를 효소 β-갈락토시다아제와 함께 투여하여 선구 약제가 생체 내에서 효소에 의해 활성화될 수 있는지를 판단하였다.
암컷 Balb/C 생쥐(20 g)를 각각 6 마리씩을 포함하는 6 군으로 나누었다 :
1) 대조군 - 염수 0.2 ml i. p.
2) 플루오로우리딘 - 10 mg/kg i. p.
3) 플루오로우리딘 - 100 mg/kg i. p.
4) Gal-Furd - 160 mg/kg i. p. (100 mg/kg 몰 당량의 플루오로우리딘)
5) β-갈락토시다제 - 5 mg/kg i. p.
6) Gal-Furd 160mg/kg + β-갈락토시다제 5 mg/kg i. p.
(Gal-Furd 는 각각의 주사에서 β-갈락토시다제 다음에 투여되었음).
플루오로우리딘 또는 Gal-Furd 의 투여 7 일 후에, 혈액 샘플을 차별적인 혈구수의 결정을 위해 후 안외동으로 부터 취하고, 총 골수 세포 충실성을 계산하기 위해 생쥐의 한 대퇴부로 부터의 세포를 수집하고; 그들의 중량을 결정하기 위해 비장을 또한 수집했다.
결과
플루오로우리딘 투여 7 일 후에, 테스트한 모든 혈액학 지수에서 유의한 감소를 초래했다. 반대로, Gal-Furd 의 투여 7 일 후 혈구 및 골수 세포의 수는 Balb/C 생쥐에 대한 표준치의 범위 내였다. Gal-Furd 및 β-갈락토시다제의 공투여(선구 약제 및 효소가 투여 전에 접촉되지 않도록 별도의 주사에 의해 각각 투여되는)는, 비교적 비독성인 선구 약제가 생체 내에서 효소 β-갈락토시다제에 의해 활성 세포독성 약제로 전환되는 것을 나타내는 혈액학적 독성을 초래한다. 결과를 표 5 및 6 과 제 25 도에 요약하였다.
표 5 :비장 중량 및 골수 세포 충실성에 대한 Furd 대 Gal-Furd 의 효과.
군 골수 세포 충실성비장 중량(mg) (10°/대퇴)
대조군 92.8±3.5 8.86±1.09
FUrd 10 mg/kg 100.5 ns
FUrd 100 mg/kg 53.5±2.1* 0.96±0.25*
Gal-Furd 160 mg/kg 89.9±3.4 ns 9.70±0.81 ns
갈락토시다제 91.3±1.9 ns
Gal-Furd+갈락토시다제 80.2±4.3* 4.04 ± 0.84*
문자 * 는 대조군 표준치 보다 현저하게 낮음을 나타낸다. P< .05 ;
ns 는 대조군(처리되지 않은 것)과 다르지 않음을 나타낸다.
표 6 :혈구수에 대한 Furd 대 Gal-Furd 의 효과
군 혈소판(k/ml) 호중구(k/ml) 임파구(M/ml)
대조군 833±30 2.25±.22 10.37±0.68
FUrd 10 mg/kg 809±28 ns 0.75±.15* 7.28±0.67*
FUrd 100 mg/kg 242±12* 0.08±.02* 3.07±0.23*
Gal-Furd 160 mg/kg 770±25 ns 1.90±22 ns 7.39±0.45*
Gal-Furd+갈락토시다제 572±39* 0.74±.07* 4.78±0.21*
문자 * 는 대조군 표준치 보다 현저하게 낮음을 나타내고, P< .05 ;
ns 는 대조군(처리되지 않은 것)과 다르지 않음을 나타낸다.
실시예 28a :높은 수준에서의 5-플루오로우리딘 및 5'-β-갈락토실 플루오로우리딘의 상대적 독성.
실시예 28 에서 서술한 것과 유사한 실험에서, 보다 큰 투여량의 5'-β-갈락토실 플루오로우리딘을 테스트하여 선구 약제의 독성 한계를 결정했다. 암컷 Balb C 생쥐를 나누고, 하기와 같이 단일 i. p. 투여량의 약제로 처리했다 :
1) FlUrd 150 mg/kg 5 마리
2) FlUrd 200 mg/kg 5 마리
3) FlUrd 250 mg/kg 5 마리
4) 갈락토실 FlUrd 750 mg/kg 3 마리
5) 갈락토실 FlUrd 1500 mg/kg 3 마리
생쥐를 사망률 및 독성의 표시에 대해 매일 체크했다. 플루오로우리딘 투여 7 일 후, 혈액 샘플을 각 군 내 2 마리씩으로 부터 취했다.
결과
이 실험의 결과를 하기 표 7 에 나타내었다. 약제 처리 약 5 일 후 부터, 플루오로우리딘을 투여 받은 모든 생쥐가 핼쭉해 보이기 시작하여 체중의 약 20% 가 감소되었다. 갈락토실 플루오로우리딘을 투여 받은 생쥐는 임의 시간에 독성의 명백한 표시를 나타내지 않았다.
호중구 수는 플루오로우리딘에 의해 발생될 골수 손상의 가장 민감한 지시자이다. 1,500 mg/kg 으로 Gal-FlUrd 는 100 mg/kg 의 투여량으로 플루오로우리딘이 변화시킨 것 보다 적게 호중구 수를 변화시켰다. 사실 1,500 mg/kg 의 Gal-FlUrd 투여 후 호중구 수는 표준 범위 (1-2.5K 세포/㎕) 내이다. 생체 내 골수에 대한 Gal-FlUrd 대 FlUrd 의 독성비는 100 : 1 이상이다. 즉, FlUrd 는, 골수에 대하여, Gal-FlUrd 의 독성의 100 배 이상의 독성을 가진다.
1,500 mg/kg 투여량에서의 Gal-FlUrd 는 Balb C 생쥐 내에서 본질적으로 비독성이다. 이 투여량은 안티-결합된 촉매 단백질에 의한 플루오로우리딘의 선구약제의 목표된 활성화를 포함하는 치료학적 계획에서 투여될 것 보다 훨씬 더 많다.
표 7 :사망률 및 혈구수에 대한 FlUrd 대 고투여량의 Gal-FlUrd 의 효과.
A. 사망률
군 사망율
FlUrd 150 mg/kg 2/5
FlUrd 200 mg/kg 5/5
FlUrd 250 mg/kg 5/5
Gal-FlUrd 750 mg/kg 0/3
Gal-FlUrd 1,500 mg/kg 0/3
플루오로우리딘 처리 10 일 후까지 어떤 동물도 죽지 않았다. 죽은 모든 동물은 약제 투여 10-15 일 후에 죽었다. 생쥐에서의 5-플루오로우리딘에 대한 발표된 LD50 은 160 mg/kg 이고, 이는 본 연구에서 플루오로우리딘의 투여량의 함수로써 얻은 사망률 결과에 잘 부합하였다.
B. 혈구수
군 WBCK/㎕ 호중구K/㎕ 혈소판K/㎕
FlUrd 150 mg/kg 1.0 0.015 145.5
FlUrd 200 mg/kg 0.8 0.02 115
FlUrd 250 mg/kg 0.75 0.01 98
Gal-FlUrd 750 mg/kg 7.25 1.705 862
Gal-FlUrd 1,500 mg/kg 6.6 1.315 835
각 군으로 부터 2 마리씩을 혈구수를 위해 샘플링했기 때문에, 평균치는 통계 없이 제공된다.
실시예 29 :시클로포스파미드 및 알도포스파미드 디에틸아세탈의 독성.
시클로포스파미드는 간에서 효소 전환을 진행하여 그의 활성 세포독성 이화대사 산물의 선구 물질을 형성해야 하는 항신생물 알킬화제이다. 이리하여, 비록 시클로포스파미드가 임상학적으로 중요한 약제이더라도, 그것은 그 자체로 표적화된 운반을 위한 적합한 후보자는 아니다. 그의 활성 세포독성 이화 선구 물질인 알도포스파미드는 불안정하다. 촉매 항체와 같은 적합한 촉매 단백질에 의한 단일 촉매 단계에서 활성화될 수 있는, 알도포스파미드의 선구 약제로서 알도포스파미드의 디에틸 아세탈을 제조했다. 이 실험에서, 시클로포스파미드 및 알도포스파미드 디에틸 아세탈을 생쥐에게 투여하여, 알도포스파미드 디에틸 아세탈이 실제로 비교적 비독성이므로 항체 촉매 접합체에 의해 목표된 활성화에 적합한가를 결정했다.
암컷 Balb/C 생쥐(20 g)를 각각 7 마리씩 포함하는 4 군으로 나누었다 :
1. 대조군 - 염수 0.2 ml i. p.
2. 시클로포스파미드 (CYP) - 30 mg/kg i. p.
3. 시클로포스파미드 - 150 mg/kg i. p.
4. 알도포스파미드 디에틸 아세탈(ALP-DEA)-188 mg/kg i. p.
(150 mg/kg 의 시클로포스파미드의 몰 당량)
약제 투여 4 일 후, 차별적인 혈구수의 측정을 위해 후-안외동으로 부터 혈액 샘플을 취하고, 총 골수 세포 충실성을 측정하기 위해 각 생쥐의 한 태퇴부로부터의 세포를 수집했다.
결과
시클로포스파미드(150 mg/kg) 투여 4 일 후, 테스트한 모든 혈액학 지수에서 유의한 감소가 있었다. 반대로, 알도포스파미드 디에틸 아세탈 투여 4 일 후, 백혈구 및 골수 세포 수는 Balb/C 생쥐에 대한 표준치의 범위 내였다. 실제로 알도포스파미드 디에틸 아세탈은, 시클로포스파미드가 보다 적은 투여량(30 mg/kg)으로써 유의하게 감소시키는 호중구 수를 감소시키지 않았다. 호중구 수는 아마도 시클로포스파미드의 활성 이화 대사 산물에 의해 발생되는 조혈 손상에 대해 가장 민감한 지수이다. 이리하여, 알도포스파미드 디에틸 아세탈은 시클로포스파미드에 비하여 조혈 세포에 대하여 비교적 비독성이다.
표 8 :골수 세포 충실성에 대한 시클로포스파미드 대 알도포스파미드 디에틸 아세탈의 효과.
군 골수 세포 충실성(10°세포/대퇴)
대조군 6.33±0.45
CYP 30 mg/kg 6.03±0.29 ns
CYP 150 mg/kg 2.09±0.14*
ALP-DEA 188 mg/kg 7.79±0.59 ns
문자 * 는 대조군 값 보다 유의하게 낮음을 나타내고, p＜.05 ;
ns 는 대조군(비처리된)과 다르지 않음을 나타낸다.
표 9 :혈구수에 대한 시클로포스파미드 대 알도포스파미드 디에틸 아세탈의 효과.
군 호중구(K/㎕) 인파구(M/㎕) 혈소판(K/㎕)
대조군 1.11±.10 5.59±0.44 775±25
CYP 30 mg/kg 0.47±.08 4.14±0.19* 796±20 ns
CYP 150 mg/kg 0.04±.01* 1.98±0.12* 591±14*
ALD-DEA 188 mg/kg 1.20±.18 ns 5.52±0.40 ns 743±12 ns
문자 * 는 대조군 값 보다 유의하게 낮음을 나타내고, p < .05 ;
ns 는 대조군(처리되지 않은 것)과 다르지 않다는 것을 가리킨다.
실시예 30 :멜팔란, 벤조일 멜팔란 및 3,4,5-트리메톡시벤조일 멜팔란의 상대 독성.
멜팔란은 또한 L-사르콜리신으로 알려된 질소 머스타드(mustard)의 페닐알라닌 유도체이다. 이 알킬화제는 다발성 골수종, 유방 및 난소암을 치료하는데 자주 사용되고, 악성 흑색종에 대해 몇몇 유익한 효과가 보고되었다. 멜팔란의 독성은 거의 혈액학적이고, 다른 알킬화제의 것과 유사하다.
활성 약제인 멜팔란의 방출을 위해 단일 단계 촉매 항체 분열에 의해 활성화되도록 고안된 멜팔란의 선구 약제로서, 벤조일 및 3,4,5-트리메톡시벤조일 멜파란을 제조했다.
이 실험에서, 선구 약제의 혈액학적 독성을 활성 약제와 비교했다. 선구 약제를 멜팔란의 5, 10 및 20 mg/kg 당량의 양으로 투여했다. Balb C 암컷들을 약제를 투여 받은 6 마리씩의 10 군으로 나누었으며, 투여량은 하기에 수록하였다 :
1) 대조군-염수 0.2 ml i. p.
2) 멜팔란 (Mel) 5 mg/kg i. p.
3) 멜팔란 10 mg/kg i. p.
4) 멜팔란 20 mg/kg i. p.
5) 벤조일 멜팔란(B Mel) (5 mg/kg 몰당량의 멜파란)
6) B Mel (10 mg/kg 몰당량의 mel)
7) B Mel (20 mg/kg 몰당량의 mel)
8) 3,4,5-트리메톡시벤조일 멜팔란(TMB) (5 mg/kg 몰당량의 mel)
9) TMB (10 mg/kg 몰당량의 mel)
10) TMB (20 mg/kg 몰당량의 mel)
약제 투여 4 일 후, 차별적인 혈구수의 결정을 위해 후-안외동으로 부터 혈액 샘플을 취했다.
결과
하기 표 10 에서 보이는 바와 같이, 멜팔란 투여 4 일 후에, 테스트한 모든 혈핵학적 지수에 유의한 감소가 있었다. 반대로, 선구 약제의 투여에 따라, 백혈구 수는 (약간 상승된 몇몇 경우에도) 크게 변하지 않았거나, 약간 하락했을 때에도 선구 약제의 최대 투여량은 멜팔란의 최저 투여량 부근 수준에까지 이르는 백혈구 수의 감소는 일으키지 않았다. 호중구 수는 어떤 투여량에서도, 어떤 선구 약제 표준으로 부터도 변하지 않았다. 이리하여, 두 선구 약제는 멜팔란에 비하여 그들의 독성에 있어서 큰 감소를 보였다.
표 10 :혈구수에 대한 멜팔란 대 벤조일 멜팔란 및 트리메톡시벤조일 멜팔란의
효과.
군 WBC임파구K/㎕ 혈소판K/㎕ 호중구K/㎕ K/㎕
대조군 7.34±0.46 769.1±26.4 0.971±0.141 6.02±0.33
Mel 5 mg/kg 2.66±0.21* 779.6±42.6 ns 0.354±0.036* 2.18±0.19*
Mel 10 mg/kg 1.28±0.09* 643.0±28.9* 0.078±0.011* 1.17±0.07*
Mel 20 mg/kg 0.06±0.08* 570.0±41.5* 0.026±0.007* 0.58±0.08*
B Mel 5 mg/kg 5.34±0.49* 746.3±17.5 ns 0.980±0.105 ns 4.09±0.48*
B Mel 10 mg/kg 5.34±0.31* 869.6±20.1 1.141±0.157 ns 3.98±0.26*
B Mel 20 mg/kg 5.49±0.37* 881.9±12.8 1.357±0.190 ns 3.76±0.20*
TMB me 5 mg/kg 6.88±0.36 ns 681.2±26.2* 1.126±0.178 ns 5.38±0.46ns
TMB mel 10 mg/kg 4.67±0.28* 723.2±23.0 ns 0.995±0.110 ns 3.45±0.18*
TMB 20 mg/kg 5.54±0.41* 755.4±26.4 ns 0.928±0.099 ns 4.44±0.48*
문자 * 는 대조군 값 보다 유의하게 낮음을 나타내고, p < .05 ;
ns 는 대조군(처리되지 않은 군)과 다르지 않다는 것을 나타낸다.
실시예 31 :선구 약제, 테트라키스(2-클로로에틸)알도포스파미드 디에틸 아세탈, 화합물112의 제조.
이 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물에 대해서는 제 40 도를 참고하라.
포스포라미드 디클로라이드36을 비스(2-클로로에틸)아민과 반응시켜 포스포라미드 클로라이드111을 형성하고 나서, 이를 3,3-디에톡시-1-프로판올의 리튬 알콕시드와 반응시켜 선구 약제112를 제조했다.
상세하게, 합성은 하기와 같다 :
N, N, N', N'-테트라키스(2-클로로에틸)포스포로디아미딕 클로라이드 111
실온에서 디클로리데이트36(1.0 g, 3.9 mmol), 비스(2-클로로에틸)아민 히드로클로라이드 (0.758 g, 4.2 mmol) 및 톨루엔 38 mL 의 혼합물에 트리에틸아민 (1.18 mL, 8.4 mmol)을 첨가했다. 그리고 나서, 혼합물을 16 시간 동안 환류시키면서 가열했다. 실온으로 냉각시킨 후 혼합물을 10% KH2PO4(2×20 mL)로 세척하고, 수성상을 에테르(2×10 mL)로 추출하고, 합친 유기상을 농축시켜 플래시 크로마토그래피(25% 에틸아세테이트/헥산, 30% 에틸아세테이트/헥산 내 생성물 Rf0.25)로 정제하여 오일 0.52 g(37 %)을 제공했다 : 1 H NMR(CDCl3) d 3.45-3.63 (m. 8), 3.65-3.78 (m, 8).
화합물 112 의 합성
실온에서 THF 6 mL 내 3,3-디에톡시-1-프로판올 (0.19 mL, 1.3 mmol)의 용액에 헥산 내 n-BuLi 의 2.5 M 용액(0.81 mL, 2.0 mmol)을 첨가했다. 30 분 후 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 클로리데이트111(0.47 g, 1.3 mmol)을 첨가했다. 혼합물을 실온으로 데웠다. 1 시간 후 10% NaH2PO4(8 mL) 용액을 첨가하고, 혼합물을 에테르(3×8 mL)로 추출하고, 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔여물을 플래시 크로마토그래피(25, 30, 40 및 50% 에틸 아세테이트/헥산으로 용리시켜 30% 에틸아세테이트/헥산 내 생성물 Rf0.22)로 정제하여 생성물 132 mg 을 오일로서 얻었다 (21%) ; IR (neat) 2975, 2932, 2899, 2879, 1455, 1375, 1347, 1306, 1225, 1132, 1088, 1056, 980, 921, 893, 760, 723, 658cm-1;1H NMR (CDCl3) d 1.22 (t, 6, J=7.0 Hz), 2.00 (q, 2, J=6, 1 Hz), 3.36-3.70 (m, 20), 4.11 (q, 2, J=6.4 Hz), 4.63 (t, 1, J=5.6 Hz);13C NMR (CDCl3) d 15.30, 34.72, 34.82, 42.31, 49.65, 49.71, 61.70, 62.20, 99.83.
실시예 32 :실시예 31 에서의 선구 약제의 합텐의 제조 : 테트라키스(2-클로로에틸)알도포스파미드 디에틸 아세탈의 트리에틸암모늄염 유사체, 화합물119.
이 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물에 대해 제 41 도를 참고하라.
연결자 부분을 먼저 제조하여 합텐의 인 부분에 부착했다. 글리신의 질소를 p-니트로벤질 우레탄으로서 보호하여 화합물113을 형성했다. 그 후 카르복실기를 N-히드록시숙신이미드 에스테르로서 활성화시켜 화합물114를 형성하고, 과량의 피페라진과 반응시켜 연결자 부분, 화합물115를 형성한다. 화합물115를 디클로리데이트36와 반응시켜 모노클로리데이트116을 형성했다. 화합물116을 2-(디메틸아미노)에탄올의 리튬알콕시드와 반응시켜 포스포로디아미드117을 제공했다. 화합물117의 3 차 아민을 MeI 를 사용하여 4 차화시켜 화합물118을 제공했다. 글리신이 덜 반응성인 벤질 우레탄으로서 보호된 화합물118의 유사체를 탈보호하려는 시도는 실패했으나; 보다 불안정한 p-니트로벤질 우레탄 보호기를 쉽게 제거하여 합텐119를 제공했다.
상세하게, 합성은 하기와 같다 :
화합물 113 의 합성
트리에틸아민을 사용하여 용액의 pH 를 9 로 유지하면서, 물 7 mL 내 글리신(1.0 g, 13.3 mmol)의 용액에 디옥산 15 mL 내 4-니트로벤질 클로로포르메이트 (3.16 g, 14.6 mmol)의 용액을 첨가했다. 혼합물을 65 시간 동안 교반시켰다. 그 후 혼합물을 에테르로 세척하고, 수성상의 pH 를 1 로 조절하고, 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 용매를 진공에서 증발시켜 생성물 3.9 g 을 오일로서 얻었다 :1H NMR (CDCl3) d 4.05 (d, 2, J=6 Hz), 5.23 (s, 2), 5.43 (d, 1), 7.52 (d, 2, J=8 Hz), 8.22 (d, 2, J=8 Hz).
화합물 114 의 합성
실온에서 아세토니트릴 76 mL 및 산 113(3.9 g, 15.3 mmol)의 혼합물에 피리딘 (1.24 mL, 15.4 mmol) 및 N, N'-디숙신이미딜 카르보네이트(3.93 g, 15.3 mmol)을 첨가했다. 16 시간 후 용매를 진공에서 증발시키고, 잔여물을 아세테이트에 용해시키고, 물로 세척하고, 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 용매를 진공에서 증발시켜 생성물 4.41 g 을 오일로서 얻었다 (82 %).
화합물 115 의 합성
CH2Cl2400 ml 내 화합물114(4.4 kg, 12 mmol)의 용액을 피페라진(5.4 g, 63 mmol)의 빠르게 교반시킨 혼합물에 적가하고, CH2Cl2100 mL 를 -78℃ 로 냉각시켰다. 혼합물을 실온으로 밤새 데웠다. 혼합물을 200 mL 의 부피로 농축시키고, 5% HCl 로 추출하고, 수성층의 pH 를 Na2CO3를 사용하여 9 로 조절했다. 수성층을에틸 아세테이트 및 CH2Cl2로 추출했다. 유기상을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 용매를 진공에서 증발시키고, 생성물을 플래시 크로마토그래피(10% 메탄올/CH2Cl2, 생성물 Rf0.19)로 정제하여 오일 1.50 g (37%)을 제공했다 :1H NMR (CDCl3) d 2.84 (bs, 4), 3.36 (bs, 2), 3.58 (bs, 2), 4.01 (bs, 2), 5.20 (bs, 2), 6.00 (bs, 1), 7.49 (d, 2, J=8 Hz), 8.17 (d, 2, J=8 Hz).
화합물 116 의 합성
트리에틸아민(0.24 mL, 1.7 mmol)을 아민115(0.55 g, 1.7 mmol) 및 톨루엔 9 mL 의 혼합물에 첨가하였다. 그 다음 디클로리데이트36(0.44 g, 1.7 mmol)을 첨가하고 혼합물을 14 시간 동안 환류시키면서 가열하였으며, 상기 시간 동안 거무스레한 불용성 물질이 형성되었다. 혼합물을 냉각시키고 포화 NaH2PO4내로 충전시켰으며, 에틸아세테이트 및 CH2Cl2로 추출하였다. 유기상을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고 용매를 진공 하에 증발시켰으며, 생성물을 플래시 크로마토그래피(90% 에틸아세테이트/헥산, 에틸 아세테이트 내 생성물 Rf0.65)로 정제하여 오일(22%) 0.2 g 을 얻었다 ;1H NMR(CDCl3) d 3.23-3.40 (m, 4), 3.40-3.63 (m, 6), 3.63-3.84 (m, 6), 4.00-4.07 (m, 2), 5.23 (s, 2), 5.87 (s, 1), 7.53 (d, 2, J=8 Hz), 8.22 (d, 2, J=8 Hz).
화합물 117 의 합성
헥산 (0.154 mL, 0.39 mmol) 내 n-BuLi 의 2.5 M 용액을 0℃ 에서 THF 1.5 mL 내 2-(디메틸아미노)에탄올 (37 mL, 0.37 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 1 시간 동안 실온에서 교반하였다. 용액을 다시 0℃ 로 냉각시키고, THF 2.5 mL 내 클로리데이트116(0.2 g, 0.37 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 교반시켰다. 그 다음 트리에틸아민 대략 100 mL 를 혼합물에 첨가하고 휘발성 성분들을 진공하에서 증발시켰으며, 생성물을 플래시 크로마토그래피(5% 메탄올/CH2Cl2, 10% 메탄올/CH2Cl2내 생성물 Rf0.44)로 정제하였다. 생성물을 에틸아세테이트 내에 용해시키고 5% NaHCO3로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시킨 후, 용매를 증발시켜 생성물 0.1 g 을 오일(46%)로서 얻었다 :1H NMR (CDCl3) d 2.25 (s, 6), 2.54 (t, 2, J=5 Hz), 3.08-3.23 (m, 4), 3.28-3.45 (m, 6), 3.52-3.69 (m, 6), 3.95-4.01 (m, 2), 4.01-4.14 (m, 2), 5.18 (s, 2), 5.95 (s, 1), 7.47 (d, 2, J=8 Hz), 8.16 (d, 2, J=8 Hz).
화합물 118 의 합성
요오드화메틸(30 mL, 0.48 mmol)을 실온에서 THF 2 mL 내 아민117(100 mg, 0.16 mmol) 용액에 첨가하였다. 황색의 불용성 오일이 24 시간 동안 형성되었다. 휘발성 성분들을 진공 하에서 증발시켜 황색 오일 125 mg 을 얻었다 : IR (CD3OD) 2952, 2855, 1709, 1651, 1607, 1522, 1453, 1412, 1372, 1350, 1277, 1235, 1220,753, 725 cm-1;1H NMR (CD3OD) d 3.27 (s, 9), 3.19-3.61 (m, 12), 3.71 (dd, 4, J=6.3, 6.3 Hz), 3.82 (bs, 2), 4,03 (s, 2), 4.50 (bs, 2), 5.23 (s, 2), 7.60 (d, 2, J=8.2 Hz), 8.21(d, 2, J=8.2 Hz).
화합물 119 의 합성
화합물118(124.6 mg, 0.17 mmol)을 1 : 1 메탄올 및 물의 6 mL 내에 용해시키고 10% Pd-C(112 mg)를 첨가하였으며, 혼합물을 18 시간 동안 수소 분위기 하에서 교반하였다. 혼합물을 1 : 1 메탄올 및 물로 세척하는 셀라이트 패드를 통해 여과시키고, 휘발성 성분을 진공 하에서 제거하여 황색 고체(94%) 89 mg 을 얻었다 :1H NMR (CD3OD) d 3.92 (s, 9), 3.16-3.30 (m, 4), 3.38-3.56 (m, 6), 3.56-3.68 (m, 4), 3.68-3.79 (m, 4), 3.82-3.90 (m, 2), 4.50 (bs, 2).
실시예 33 :실시예 31 의 선구약제의 합텐 : 테트라키스(2-클로로에틸)알도포스파미드 디에틸 아세탈의 디프로필메틸암모늄 염 유사체, 화합물121의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물에 대해 제 42 도를 참조하라.
2-(디-n-프로필아미노)에탄올, 화합물120을 참고 문헌으로서 본원에 첨부한유기 합성에서의 W. W. Hartmann 의 절차, Collective Vol. II ; Blatt, A. H., Ed : John Wiley Sons : New York, (1943) :183-184 에 따라 제조한다. 화합물120을 화합물116과 반응시키고, 생성물을 두가지의 부가적 단계들에서 변형시켜 합텐121을 얻는다.
상세하게, 합성은 하기와 같다 :
2-(디-n-프로필아미노)에탄올 120
화합물120을, 참고 문헌으로서 본원에 첨부한 Hartman, W. W. InOrganic Synthesls, Collective Vol. II ; Blatt, A. H., Ed ; John Wiley Sons : New York, (1943) : 183-184 의 절차를 따르되, 디프로필아민 및 2-클로로에탄올을 사용하여 합성한다.
화합물 121 의 합성
화합물121을, 화합물116및 2-(디에틸아미노)에탄올로 부터 화합물119의 합성을 위해 사용된 절차(실시예 32 참조)를 따라 화합물116및120으로 부터 합성한다.
실시예 34 :선구 약제, 분자 내 비스(2-히드록시에톡시)벤조에이트-5-플루오로우리딘, 화합물128의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물에 대해 제 43 도를 참조하라.
2-브로모에탄올을 p-메톡시벤질 에테르로써 보호하여 화합물122를 얻었다. 2,6-디히드록시벤조산 및 메탄올을 축합시켜 화합물123을 형성하였다. 화합물123을 브로마이드122를 사용하여 디알킬화하여 화합물124를 얻었다. 원하지 않는 무촉매 락톤화 및 약제 화합물124의 수반 방출에 대한 선구 약제128의 안정성을 확증하기 위해, 화합물124를 탈보호시켜 화합물125를 형성하였다. 화합물125를 D2O 내 0.9% NaCl 내에 용해시켰다. 96 시간 동안 실온에 방치한 후상기 샘플의1H NMR 스펙트럼에서는 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 화합물124를 비누화하여 산126을 얻었으며, 이를 화합물65와 함께 축합시켜 화합물127을 얻었다. 화합물127의 산성 탈보호는 선구 약제128을 산출한다.
상세하게,합성은 하기와 같다 :
2-(4-메톡시벤질옥시)브로모에탄 122
트리플루오로메탄설폰산(30 mL)을 실온에서 2-브로모에탄올 (0.5 mL, 6.7 mmol), 4-메톡시벤질 트리클로로 아세트이미데이트 (3.8 g, 13.4 mmol), 및 THF 15 mL 의 혼합물에 첨가하였다. 1 시간 후, 반응물을 5% NaHCO3의 첨가에 의해 중화시키고, 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 무수 MgSO4상에서 건조시키고 농축시켰으며, 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(0, 1, 및 2.5% 에틸 아세테이트/헥산으로 용리시킴, 10% 에틸아세테이트/헥산 내 생성물 Rf0.48)로 정제하여 오일 (79%) 1.3 g 을 얻었다 ;1H NMR (CDCl3) d 3.49 (t, 2, J=7 Hz), 3.79 (t, 2, J=7 Hz), 3.82 (s, 3), 4.55 (s, 2), 6.91 (d, 2, J=9 Hz), 7.21 (d, J=9 Hz).
메틸 2,6-디히드록시벤조에이트 123
DCC (26.3 g, 127 mmol)을 2,6-디히드록시벤조산 (10 g, 64 mmol) 및 메탄올 및 CH2Cl2의 1 : 1 혼합물 200 mL 의 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 64 시간 동안 교반하였다. 그 다음 불용성 물질을 여과에 의해 제거하고, 결과의 용액을 진공 하에 농축시켰으며, 잔류물을 에틸 아세테이트 내에 용해시켜 재여과하고,여과물을 물 및 염수로 세척하였으며, 무수 MgSO4상에서 건조시키고 농축시켰으며, 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(10% 에틸 아세테이트/헥산, 생성물 Rf0.29)로 정제하여 무색 고체 (76%) 8.14 g 을 얻었다 ;1H NMR (CDCl3) d 4.08 (s, 3), 6.48 (d, 2, J=8 Hz), 7.31 (dd, 1, J=8, 8 Hz).
메틸 2,6-비스[2-(4-메톡시벤질옥시)에톡시]벤조에이트 124
디페놀123(50 mg, 0.30 mmol), 브로마이드122(292 mg, 1.19 mmol), K2CO2(414 mg, 3.0 mmol), 및 DMF 6 mL 의 혼합물을 실온에서 6 시간 동안 교반하였다. 그 다음 K2CO3부가량을 첨가하였다. 부가의 17 시간 후, 혼합물을 1 시간 동안 80℃에서 가열하였다. 냉각시킨 후, 혼합물의 pH 를 1 M HCl 을 첨가하여 5 로 조정하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 및 물 사이에 분배시키고, 유기층을 무수 MgSO4상에서 건조시키고, 용매를 진공 하에 증발시켰으며, 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(30% 에틸 아세테이트/헥산, 50% 에틸 아세테이트/헥산 내 생성물 Rf0.58)로 정제하여 생성물 87 mg 을 오일(59%)로서 얻었다 ;1H NMR (CDCl3) d 3.79-3.90 (m, 4), 3.81 (s, 6), 3.85 (s, 3), 4.20 (dd, 4, J=5, 5 Hz), 4.59 (s, 4), 6.59 (d, 2, J=9 Hz), 6.93 (d, 4, J=9 Hz), 7.27 (dd, 1, J=9, 9 Hz), 7.31 (d, 4, J=9 Hz).
메틸 2,6-비스(2-히드록시에톡시)벤조에이트 125
메탄올 3 mL 내 화합물124(87 mg, 0.18 mmol)의 용액에 10% Pd-C 8.7 mg 을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 수소 분위기 하에서 교반하였다. 촉매를 셀라이트를 통해 여과에 의해 제거하고 메탄올로 세척하였다. 용매를 진공하에 증발시켰고, 잔류물 31 mg 을 오일(79%)로서 얻었다 ;1H NMR (CDCl3) d 3.82-3.96 (m, 4), 3.92 (s, 3), 4.08-4.20 (m, 4). 6.58 (d, 2, J=8 Hz), 7.29 (dd, 1, J=8, 8 Hz) ; (0.9% NaCl D2O) d 3.90 (dd, d, J=4, 4 Hz), 3.97 (s, 3), 4.17 (dd, 4, J=4, 4 Hz), 6.79 (d, 2, J=8 Hz), 7.45 (dd, 1, J=8, 8 Hz).
락톤화에 대한 디올 에스테르 125 의 안정성
디올 에스테르125의 샘플을 D2O 내 0.9% NaCl 내에 용해시켰다. 실온에서 96 시간 동안 방치한 후 상기 샘플에서1H NMR 스펙트럼에 대한 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
2,6-디[2-(4-메톡시벤질옥시)에톡시]벤조산 126
1 N NaOH (25 mL)를 화합물124(1.22 g, 2.46 mmol) 및 디옥산 30 mL 의 혼합물에 첨가한 다음, MeOH 10 mL 를 혼합물에 첨가하여 균질성 용액 유지를 도왔다. 혼합물을 24 시간 동안 100℃ 에서 오일욕에 의해 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 용액의 pH 를 1 N HCl 을 사용하여 5 로 조정하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 내에 충전시키고 물 및 염수로 세척하였으며, 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고 진공 하에 농축시켰다. 조생성물 1.1 g 을 부가의 정제 없이사용하였다 ; Rf0.40 (5% MeOH/CH2Cl2);1H NMR (CDCl3) d 3.76-3.89 (m, 10), 4.19 (dd, 4, J=9, 9Hz), 4.55 (s, 4), 6.59 (d, 2, J=8 Hz), 6.88 (d, 4, J=8 Hz), 7.24-7.37 (m, 5)
화합물 127 의 합성
화합물65(81 mg, 0.27 mmol)를 화합물126(516 mg, 1.07 mmol), 피리딘 864 mL, 및 CH2Cl21 mL 의 혼합물에 첨가한 다음, EDC (205 mg, 1.07 mmol) 및 DMAP (65 mg, 0.53 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 80℃ 에서 24 시간 동안 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, MeOH 10 mL 를 첨가하였다. 부가의 30 분 후 휘발성 성분을 진공 하에 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세트 내에서 취하여 포화 NaHCO3, 물, 포화 NH4Cl 및 물로써 세척하고, 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고 진공 하에 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그래피(20, 30, 40, 50, 및 60% 메틸 아세테이트/헥산으로 용리시킴)로써 잔류물을 정제하여 생성물 (75%) 154 mg을 얻었다 : Rf0.50 (헥산 내 60% 에틸 아세테이트) ;1H NMR (CDCl3) d 1.34 (s, 3), 1.57 (s, 3), 3.71-3.76 (m, 4), 3.79 (s, 6), 4.16 (dd, 4), 4.29 (dd, 1, J=2.5, 12.2 Hz), 4.46 (d, 1, J=3, 1 Hz), 4.46 (d, 2, J=12.6 Hz), 4.50 (d, 2, J=12.6 Hz), 4.66-4.74 (m, 2), 4.82 (dd, 1, J=3.2, 6.1 Hz), 5.90-5.91 (m, 1), 6.57 (d, 2, J=8.5 Hz), 6.86 (d, 4, J=8.6 Hz), 7.24 (d, 4, J=8.6 Hz), 7.28 (d, 1, J=8.5 Hz), 7.42 (d, 1, J=6.2 Hz), 9.11 (d, 1, J=4.2 Hz).
화합물 128 의 합성
화합물 1a 의 합성에 대한 절차를 따라 반응을 실행한다.
실시예 35 :실시예 34 의 선구 약제의 합텐 : 비스(2-히드록시에톡시)벤조에이트-5-플루오로우리딘의 시클릭 포스포네이트 유사체, 화합물137의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물에 대해서는 제 44 도를 참조하라.
브로마이드122를 사용하여 레조르시놀을 모노알킬화하여 화합물129를 생성시킨다. 페놀129의 포스포릴화는 포스페이트 트리에스테르130을 생성하는데, 이는 LDA 를 사용한 오르토-산화리튬화 후 인(phosphorous)의 이동에 의해 화합물131을 생성한다. 에틸렌 카보네이트 또는 글리콜 설파이트에 의한 화합물131의 히드록시에틸화는 화합물132를 생성하며, 이를 높은 희석 조건 하에서 고리화하여 화합물133을 얻는다. 비누화 반응은 산134를 산출하며, 이를 활성화시키고 화합물3f와 반응시켜 화합물135를 얻는다. 화합물135의 톨루오일기를 잘라 내어 화합물136을 생성시키며, 이를 탈보호하고 환원시켜 합텐137을 생성한다.
상세하게, 합성은 하기와 같다 :
화합물 129 의 합성
레조르시놀 (5 mmol), 화합물122(1 mmol), K2CO3(5 mmol), 및 25 mL 의DMF 의 혼합물을, TLC 에 의해 관찰하여 출발 물질이 소비될 때까지 실온에서 교반한다. 혼합물을 0.1 M HCl 로 중화하고 물로 희석시키며, 에틸 아세테이트로 추출시켰다. 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고 농축시키며, 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일로서 얻었다.
화합물 130 의 합성
디페닐 클로로포스페이트 (1.2 mmol) 및 5 mL 의 CH2Cl2혼합물을 0℃ 로 냉각시킨 화합물129(1 mmol) 및 5 mL 의 피리딘 혼합물에 첨가하였다. TLC 에 의해 관찰하여 출발 물질이 소비된 후, 휘발성 성분을 진공 하에 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트 및 0.1 M HCl 사이에 분배시키며, 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고 농축시키며, 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일로서 얻었다.
화합물 131 의 합성
THF (1.1 mmol) 내 LDA 의 1.5 M 용액을, -78℃ 로 냉각시킨 THF (20 mL) 내 화합물130(1 mmol)의 용액에 적가한다. TLC 에 의해 관찰하여 출발 물질이 소비된 후, 혼합물을 에틸 아세테이트 및 0.1 M HCl 사이에 분배시키고, 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고 농축시키며, 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일로서 얻었다.
화합물 132 의 합성
화합물131(1 mmol), 에틸렌 카보네이트 또는 글리콜 설파이트 (10 mmol),K2CO3(10 mmol), 및 50 mL 의 DMF 의 혼합물을, TLC 에 의해 관찰하여 출발 물질이 소비될 때까지, 100℃ 에서 가열한다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 0.1 M HCl 로 중화시키고 물로 희석한 후, 에틸 아세테이트로 추출한다. 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고 농축시키며, 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물을 무색 오일로서 얻는다.
화합물 133 의 합성
화합물132(1 mmol), 무수 KF (10 mmol), 18-크라운-6 (1 mmol) 및 THF 100 mL 의 혼합물을, TLC 에 의해 관찰하여 출발 물질이 소비될 때까지, 환류 하에 가열한다. 그 다음, 용매를 진공 하에 증발시키고, 잔류물을 플래쉬 크로마토 그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일로서 얻는다.
화합물 134 의 합성
0.2 M NaOH (5 mL)를, 실온에서 디옥산 5 mL 내 화합물133(1 mmol)의 용액에 첨가하였다. TLC 에 의해 관찰하여 출발 물질이 소비된 후, 혼합물의 pH 를 0.1 M HCl 로 2 로 조정하고, 혼합물을 에틸아세테이트로 추출한다. 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고 농축시키며, 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 고체로서 얻는다.
화합물 135 의 합성
화합물134(1.1 mmol) 및 염화 티오닐 10 mL 의 혼합물을, 메탄올로 냉각시킨 반응물의 부분 표본의1H NMR 에 의해 측정되는, 산 염화물로의 전환이 완결될때까지 실온에서 교반한다. 미반응 염화 티오닐을 진공 하에 증발시킨다. 잔류물을 CH2Cl25 mL 내에 취하고, 0℃ 로 냉각시킨 화합물3f(1 mmol) 및 피리딘 5 mL 의 혼합물에 서서히 첨가한다. TLC 에 의해 관찰하여 출발 물질이 소비된 후, 휘발성 성분을 진공 하에 증발시키고 잔류물을 에틸 아세테이트 내에 취하고, 유기상을 포화 NaHCO3, 0.1 M HCl, 및 염수로 세척하고, 무수 MgSO4상에서 건조시키고 진공 하에서 농축시킨다. 플래쉬 크로마토그래피에 의한 잔류물의 정제는 생성물을 무색 고체로서 산출한다.
화합물 136 의 합성
진한 수산화암모늄(1 mL)을 0℃ 에서 화합물135(1 mmol) 및 메탄올 20 mL 의 혼합물에 첨가한다. 용액을 실온으로 가온시킨다. TLC 에 의해 관찰하여 출발 물질이 소비된 후, 휘발성 성분을 진공 하에 증발시키고, 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 고체로서 산출한다.
화합물 137 의 합성
10% Pd-C (10 중량%)를 화합물136(1 mmol) 및 20% 수성 메탄올 (10 mL)의 혼합물에 첨가하고, 혼합물로 수소 분위기 하에서 교반한다. 반응이 완료되면, 촉매를 셀라이트 패드를 통과시켜 여과에 의해 분리하여 20% 수성 메탄올로 세척한다. 진공 하에서 휘발성 성분을 증발시키면, 생성물을 고체로서 얻을 수 있다.
실시예 36 :선구 약제, 분자 내 비스(3-히드록시프로필옥시)벤조에이트-5-플루오로우리딘, 화합물138의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물에 대해 제 45 도 참조.
선구 약제128의 제조 (실시예 34 참조)를 위해 사용된 반응과 동일한 반응을 사용하여 3-브로모-1-프로판올을 선구 약제138로 전환시킨다.상세하게, 합성은 하기와 같다 :
화합물 138 의 합성
화합물138을 화합물128의 합성을 위한 절차를 따르되, 2-브로모에탄올 대신에 3-브로모-1-프로판올로 출발하여 합성한다.
실시예 37 :실시예 36 의 선구 약제의 합텐 : 비스(3-히드록시프로필옥시)벤조에이트-5-플루오로우리딘의 시클릭 포스포네이트 유사체, 화합물139의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물에 대해 제 46 도 참조.
합텐137(실시예 35 참조)을 제조하기 위해 사용된 반응의 동일한 순서를 사용하고, 3-브로모프로필 4-메톡시벤질 에테르(실시예 36 에서 중간체로서 제조됨)를 사용하여 레조르시놀을 시클릭 포스포네이트 합텐139으로 전환시킨다.
상세하게, 합성은 하기와 같다 :
화합물 139 의 합성
화합물137의 합성을 위한 절차를 따르되, 2-브로모에탄올 대신 3-브르모-1-프로판올로 출발하여 화합물139을 합성한다.
실시예 38 :선구 약제 : 5'-O-(2,4,6-트리메톡시벤조일)-5-플루오로우리딘, 화합물 141의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물에 대해 제 47 도 참조.
2,4,6-트리메톡시벤조산을 EDC 를 사용하여 화합물65와 함께 축합시켜 에스테르140을 산출한다. 연속해서, 이소프로필리덴 보호기를 제거하여 선구 약제141을 산출한다.
상세하게,합성은 하기와 같다 :
2',3'-O-이소프로필리덴-5'-O-(2,4,6-트리메톡시벤조일)-5-플루오로우리딘 140.
2,4,6-트리메톡시벤조산(300 mg, 1.42 mmol)을 CH2Cl22 mL 내에 용해시zl고, 피리딘 1.15 mL 을 첨가하였다. 화합물65(106 mg, 0.35 mmol)를 첨가하고 나서 EDC (300 mg, 1.56 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 24 시간 동안 교반한 후 메탄올 10 mL 를 첨가하였다. 부가의 30 분 후, 휘발성 성분을 진공 하에 증발시키고 잔류물을 에틸 아세테이트 (75 mL) 내에서 취하였으며, 포화 NaHCO3(2×50 mL), 물 (15 mL), 포화 NH4Cl (2×30 mL), 및 물 (15 mL)로 세척하였다. 모든 수성상을 에틸 아세테이트(50 mL)로 추출하였고, 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 예비 TLC(10% 메탄올/CH2Cl2, 8% 메탄올/CH2Cl2내 Rf0.50)로 정제하여 생성물 100 mg 을 무색 고체(58%)로서 얻었다 ;1H NMR (CDCl3) d 1.38 (s, 3), 1.61 (s, 3), 3.81 (s, 6), 3.83 (s, 3), 4.33 (dd, 1, J=2.4, 12.3 Hz), 4.62 (dd, 1, J=small, 2.2 Hz), 4.72-4.77 (m, 2), 4.83 (dd, 1, J=2, 6.1 Hz), 5.92-5.93 (m, 1), 6.11 (s, 2), 7.58 (d, 1, J=6.3 Hz).
5'-O-(2,4,6-트리메톡시벤조일)-5-플루오로우리딘 141
화합물140(100 mg, 0.20 mmol) 및 50% 포름산 1.5 mL 의 혼합물을 2 시간 동안 65℃ 에서 가열하였다. 혼합물을 냉각시키고, 휘발성 성분을 진공 하에 증발시켰다. 잔류물을 예비 TLC(10% 메탄올/CH2Cl2, Rf0.52)로 정제하여 생성물 84 mg 을 무색 고체(92%)로서 얻었다 ;1H NMR (CD3OD) d 3.76 (s, 6), 3.80 (s, 3), 4.10-4.12 (m, 1), 4.18 (dd, 1, J=5.1, 5.1 Hz), 4.23-4.27 (m, 1), 4.34 (dd, 1, J=2,6 16 Hz), 4.62 (dd, 1, J=2.2, 16), 5.88 (dd, 1, J=1.6, 4.1 Hz), 6.21 (s, 2), 7.76 (d, 1, J=6.6 Hz).
실시예 39 :실시예 38 의 선구 약제의 합텐, 우리딘의 피리디늄 알콜-치환된 유사체, 화합물149의 제조.
본 실시예에서 굵은 글씨로 된 번호의 화합물에 대해서는 제 48a 도 및 48b 도를 참조하라.
화합물142,화합물65의 알데히드를 문헌 절차에 따라 합성한다.
알데히드기는 위티그(wittig) 반응을 받아 화합물143을 형성한다. 화합물144를 선행 문헌을 따라 합성하였고, 브롬화하여 모노브로마이드145를 생성하였다. 선택적 모노브롬화를 얻기 위하여, 반응은 저온에서 행해지고 화합물144는 과량으로 사용되어야만 하며, 그렇지 않으면 주 생성물은 2,6-디브로모-3,4-디메톡시피리딘으로 되는 것으로 알려져 있다. 화합물145는 리튬-할로겐 교환을 받고, 반응성 중간체를 화합물143과 반응시켜 피리디늄 알콜146을 생성한다. 아미노놀리시스에 의해 트리올147이 생성되며, 이는 더욱 친핵성인 피리딘 질소에서 선택적으로 메틸화되어 4 차 암모늄염148을 생성한다. 최종적으로, 환원은 합텐149를 생성한다.
상세하게, 합성은 하기와 같다 :
화합물 142 의 합성
화합물142를, 참고 문헌으로서 본원에 첨부된 Ranganathan, R. S. ; Jones, G. H. ; Moffat, J. G.J. Org. Chem.39 (1974) : 290-298 의 절차에 따라 화합물65로 부터 합성한다.
화합물 143 의 합성
CH2Cl25 mL 내 (트리페닐포스포르아닐리덴)아세트알데히드(1.1 mmol)의 용액을 실온에서 CH2Cl25 mL 내 화합물142(1 mmol)의 용액에 첨가한다. TLC 에 의해 관찰하여 출발 물질이 소비된 후 혼합물을 그의 부피의 반으로 농축시키고, 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 고체로서 얻는다.
2-브로모-3,5-디메톡시피리딘 145
CH2Cl266 mL 내 브롬(0.17 mL, 3.3 mmol) 용액을, -78℃ 로 냉각시킨 CH2Cl266 mL 내 3,5-디메톡시피리딘, 화합물144(1.83 g, 13.2 mmol, 참고 문헌으로서 본원에 첨부된 Johnson, C. D. ; Katritzky, A. R. ; Viney, M.J. Chem. Soc. (B), (1967) : 1211-1213 에 따라 제조됨)의 용액에 적가하였다. 1 시간 후, 혼합물을 16 시간 동안 실온으로 서서히 가온시켰다. 휘발성 성분을 진공 하에서 증발시키고, 1 M NaOH 를 사용하여 pH 10 으로 조정한 수성 나트륨 티오설페이트 및 에틸 아세테이트 사이에 잔류물을 분배시키고, 유기상을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 황색 오일을 플래쉬 크로마토그래피(20% 에틸 아세테이트/헥산)로 분리하여 생성물 (50% 에틸 아세테이트/헥산 내 Rf0.53) 1.0 g 및 회수된 출발 물질(50% 에틸 아세테이트/헥산 내 Rf0.28) 1.1 g 을 얻었다 ;1H NMR (CDCl3) d 3.91 (s, 3), 3.93 (s, 3), 6.77 (bs, 1), 7.73 (bs, 1).
화합물 146 의 합성
헥산 (0.4 mL, 1 mmol) 내 n-BuLi 의 2.5 M 용액을 0℃ 에서 THF 10 mL 내 화합물145(0.9 mmol)의 용액에 첨가한다. 1 시간 후, 혼합물을 -78℃ 로 냉각시키고, THF 1.5 mL 내 화합물146(0.9 mmol)의 용액을 한꺼번에 첨가한다. 1 시간 후 용액을 실온으로 가온시킨다. TLC 에 의해 관찰하여 출발 물질이 소비된 후, 물을 첨가하고 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기상을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고 진공 하에서 농축시키며, 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피로 정제시켜 생성물을 무색 고체로서 얻는다.
화합물 147 의 합성
진한 수산화암모늄(1 mL)을 0℃ 에서 메탄올 20 mL 및 화합물146(1 mmol)의 혼합물에 첨가한다. 용액을 실온으로 가온시켰다. TLC 에 의해 관찰하여 출발 물질이 소비된 후, 휘발성 성분은 진공하에 증발시키고, 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 고체로서 얻었다.
화합물 148 의 합성
밀봉된 관 내 화합물147(1 mmol), 요오드화메틸 (2 mmol), 및 THF 10 mL 의 혼합물을, TLC 에 의해 관찰하여 출발 물질이 소비될 때까지, 60℃ 에서 가열한다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척하여 생성물을 고체로서 산출한다.
화합물 149 의 합성
10% Pd-C(10 중량%)를 화합물148(1 mmol) 및 20% 수성 메탄올 (10 mL)의 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 수성 분위기 하에서 교반한다. 반응이 종결된후, 셀라이트 패드를 통과하는 여과에 의해 촉매를 분리하고 20% 수성 메탄올로 세척한다. 진공 하에서 휘발성 성분을 증발시키면, 생성물이 고체로서 얻어진다.
실시예 40 :시클로포스파미드 및 3,3-디에톡시프로필 N,N,N',N'- 테트라키스(2-클로로에틸)포스포로디아미드 (테트라키스)의 상대적 독성.
본 실시예에서, 시클로포스파미드 및 3,3-디에톡시프로필 N,N,N',N'-테트라키스(2-클로로에틸)포스포로디아미드를 생쥐에게 투여하여, 알도포스파미드 디에틸아세탈이 실제로 상대적으로 비독성인지, 따라서 항체-촉매 접합체에 의한 표적 활성화에 적당한지 여부를 결정하였다.
암컷 Balb/C 생쥐(20 g) 5 마리씩으로 각각 구성된 4 군으로 나누었다 :
1. 대조군 - 염수 0.2ml i. p.
2. 시클로포스파미드 (CYP) - 30 mg/kg i. p.
3. 시클로포스파미드 - 150 mg/kg i. p.
4. 테트라키스-248 mg/kg i. p. (시클로포스파미드 150 mg/kg 과 등몰 당량)
약제를 투여한지 5 일 후, 차별적인 혈구수 측정을 위해 혈액 샘플을 후-안외동으로 부터 취하였다.
결과
시클로포스파미드(150 mg/kg)를 투여한지 5 일 후, 시험된 모든 혈액학 지수 내에서 상당한 감소가 있었다. 반면, 테트라키스를 투여한지 5 일 후, 백혈구 및 골수 세포수는 Balb/C 생쥐에 대한 표준치의 범위 내에 있었다. 실제로, 테트라키스는, 보다 낮은 투여량의 시클로포스파미드(30 mg/kg)에 의해 상당히 감소되었던 호중구수를 감소시키지 않았다. 이미 호중구수는 시클로포스파미드의 활성 이화 대사 산물에 의해 야기된 조혈 손상에 대한 최대 민감성 지수이다. 그러므로, 테트라키스는 시클로포스파미드에 비해 조혈 세포에 대해 상대적으로 비독성이다.
표 11 :혈구 계산치에 대한 시클로포스파미드 대 테트라키스의 효과
군 호중구(K/_ l) 임파구(K/_l) 혈소판(K/_l)
대조군 0.82+.32 4.26+0.68 765+41
CYP 30 mg/kg 0.41+.23* 3.96+0.66 ns 776+37 ns
CYP 150 mg/kg 0.07+ .06* 2.53+0.26* 867+109 ns
테트라키스 248 mg/kg 0.075+.28 ns 3.45+0.88 ns 1000+177 ns
문자 * - 대조군 보다 현저하게 낮음을 나타낸다. P< .05 ;
ns - 대조군(처리하지 않은 군)과 다르지 않음을 나타낸다.
실시예 41 :화학적 개질에 의한 치료적 인간외 항체에 대한 면역 반응의 억제.
인간외 항체의 효과는 환자에 대해 효과적으로 유해한 면역 반응에 의해 제한된다. 혈청병, 아나필락시 증후군, 및 간내 독성 면역 복합체의 부착을 포함하는 심각한 합병증이 발생할 수 있다 (Abuchowski, A., "Effect of Covalently Attached Polyethylene Glycol on the Immunogenicity and Activity of Enzymes", Rutgers University, New Jersey, 1975 ; Sehon, A. H., "Suppression of Antibody Responses by Chemically Modified Antigens",Int. Arch. Allergy Appl. Immunol.94 (1991): 11-20). 면역원성을 방지하는 두가지 방법은, 인간 항체를 사용하는 것과, 유전적으로 "인간화된" 동물 항체를 사용하는 것으로서, 여기서, 예컨대 쥐의 항체로 부터의 CDR 을 사람 항체의 골격 상에 그라프팅시키는 것이다. 대안적으로는, 외래 단백질을 감추고, 그리하여 숙주의 면역 반응을 억제하는 비면역원성, 비알레르기성, 비항원성 분자들로 항체를 화학적으로 유도할 수 있다(Abuchowski, A., "Effect of Covalently Attached Polyethylene Glycol on the Immunogenicity and Activity of Enzymes", Rutgers University, New Jersey, 1975 ; Sehon, A. H., "Suppression of Antibody Responses by Chemically Modified Antigens",Int. Arch. Allergy Appl. Immunol.94 (1991): 11-20). 숙주 면역 반응은 예컨대 D-글루탐산 및 D-리신(D-GL)의 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 (mPEG), 또는 폴리비닐 알콜(PVA)에 대한 외래 단백질의 접합에 의해 상당히 감소될 수 있다 (Sehon, A. H., "Suppression of the IgE Antibody Responses with Tolerogenic Conjugates of Allergens andHaptens",In Progress In Allergy,Vol. 32 (1982): 161-202). 각 경우에, 항체(Ab)와 같은 단백질은 접합체의 다수 분자들(n), 즉 Ab(PEG)n 로써 개질된다. 면역 반응의 억제는 n 의 최적값에 좌우되며; n 이 지나치게 작거나 지나치게 크다면 효과는 실질적이지 않다 (Jackson, C. and J. C., Charlton, J. L., Kuzminski, K., Lang, G. M., Sehon, A. H., "Synthesis, Isolation, and Characterization of Conjugates of Ovalbumin with Monomethoxypolyethylene Glycol using Cyanuric Chloride as the Coupling Agent",Anal. Biochem. 165 (1987): 114-127). n 의 최적값은 상이한 값의 n 을 갖는 항체를 제조하고 숙주 동물에서 각 개질된 항체의 면역원성을 측정하므로써 당업자들에 의해 부당한 실험 없이 측정될 수 있다.
비항원 분자에 대한 촉매 항체 또는 촉매/암-결합 이특이적 항체의 접합은 하기와 같이 수행할 수 있다 (Jackson, C. and J. C., Charlton. J. L., Kuzminski, K., Lang, G. M., Sehon, A. H., "Synthesis, Isolation, and Characterization of Conjugates of Ovalbumin with Monomethoxypolyethylene Glycol using Cyanuric Chloride as the Coupling Agent",Anal Biochem.165(1987): 114-127). n 의 최적값(상기 참조)은 당업자에 의해 실험적으로 측정되고 절차는 이 정도의 접합을 성취하도록 다양할 수 있다. 바람직하게 항체는 mPEG 에 접합되며, 다른 접합체들도 또한 원하는 효과를 제공할 수 있다. mPEG 는 PEG 보다 바람직한데, 이는 PEG가 접합체의 원하지 않는 분자간 및 분자 내 가교에 참여할 수 있는 두개의 말단 히드록시기를 갖기 때문이다 (Sehon, A.H., "Suppression of Antibody Responses by Chemically Modified Antigens",Int.Arch. Allergy Appl. Immunol. 94(1991): 11-20). mPEG 의 유형, 예컨대 mPEG 6 (평균 분자량 = 6000) 또는 mPEG 20 (평균 분자량 = 20,000)은 부당한 실험 없이 선택될 수 있다. 게다가, 절차의 규모는 얼마나 많은 접합된 항체가 사용 가능하거나 필요한지에 따라 변경된다.
mPEG-접합된 항체의 제조는 다음의 두 주요 단계로 구성된다:
1. 활성 중간체, 2-O-mPEG-4,6-디클로로-s-트리아진 ("mPEG 중간체")의 제조.
2. mPEG 중간체를 항체와 정확한 비율로 반응시켜 원하는 값의 n 을 갖는 접합체를 형성한다.
염화시아누르 및 mPEG 중간체는 가수분해에 과도하게 민감하므로, 모든 시약은 완전히 무수이어야 하고 대기 중 수분으로 부터 보호되어야 한다. mPEG(20 g)를 80℃ 에서 무수 벤젠(320 mL)에 용해시킨다. mPEG 와 결합할 수 있는 임의 수분은 대략 160 mL 로 벤젠을 증류시켜 제거한다. 질소 분위기 하에서 과량의 염화시아누르(무수 벤젠으로 부터 재결정됨, 6.64 g)를 첨가하고, 이어서 탄산칼륨 (4.0 g, 무수, 분말)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15 시간 동안 교반한다. 이어서, 혼합물을 (질소 하에서) 탕화 유리 필터를 통해 여과시킨다. 여액을 무수 석유 에테르(200 mL)와 혼합하여 mPEG 중간체를 침전시키고, 이를 질소 하에서 탕화 유리 필터를 통한 여과에 의해 반응물들로 부터 분리시킨다. 이를 7 회 반복하여 모든 잔여 염화시아누르를 제거한다. 그 후 mPEG 중간체를 -78℃ 로 동결시킨 벤젠에 용해시킨다. 벤젠을 고진공 하에 승화시켜 흰색 분말(mPEG 중간체)을 남긴다. mPEG 중간체는 -60℃ 에서 밀봉 병 (병당 1 g 또는 미만) 내 질소 하에 저장할 수 있다.
다양한 n 의 항체-mPEG 접합체(Ab(mPEG))를 얻기 위해, 삼붕소화나트륨 (4 ml, 0.1 M, pH 9.2)에 용해시킨 40 mg Ab 에 상이한 양의 mPEG 중간체를 첨가한다. 혼합물을 4℃ 에서 30 분 동안 및 실온에서 30 분 동안 교반한다. 접합에 이어, 혼합물을 25 mM 트리스 완충액, pH 8.0 으로 평형을 맞춘 세파텍스 G-25 칼럼(2.5 x 40 cm)을 통과시킨다. 마지막으로 접합체를 25mM 트리스, pH 8.0 에서 미리-평행을 맞춘 DEAE-트리아실 칼럼 (5×40 cm) 상에서 정제한다. 단백질을 상기 출발 완충액에서 칼럼에 결합시키고, 이어 동일한 트리스 완충액으로 세척한다. 단백질은 50 mM NaCl, 25 mM 트리스, pH 8.0 으로 끝나는 선형 염 구배를 사용하여 용리시킨다.
실시예 42 :종양 항원을 표적으로 하고, 그 종양에서 선구 약제를 활성 항암제로 활성화시키는 이특이적 항체의 생성 및 적용.
실시예 1a 에서의 화합물 1c, 선구 약제 5'-O-(2,6-디메톡시벤조일-5-플루오로리딘)을 실시예 1a 에 서술된 바와 같이 제조하고 생쥐에서 독성을 시험했다. 분할된 호중구 계수치에 대한 효과로써 측정된 바에 따르면, 선구 약제의 생체내 독성은 약제 5-플루오로우리딘 보다 적은 독성으로 실질적으로 50 배 더 우수하다. 전이 상태 유사체인 디메톡시 벤조일 플루오로리딘 화합물의 포스포네이트 에스테르를 실시예 44 에 기술된 바대로 제조했다. 운반 단백질, 키호울 림피트(keyhole limpet) 헤모시아닌에 대한 포스포네이트 유사체의 접합 후에, 그것을 사용하여 생쥐를 면역화하고 전통적인 절차에 따라 모노클로날 항체를 생성했다. 또한, 고역가 항혈청을 갖는 생쥐로 부터의 비장을 폴리아데닐화 RNA 원으로서 사용했다. RNA 는 PCR 증폭 프로토콜로 생쥐 면역글로블린 족에 대해 상보적인 올리고누클레오티드 프라이머로써 프라임했다. PCR 생성물을, 참고로 포함한 특허 출원 WO 92/01047 에서 기술한 바와 같은 fd 파지 벡터 내로 클로닝했다. 결과의 파지 라이브러리 및 전통적인 방식으로 생성된 모노클로날 항체를 문헌에 서술된 절차에 따라 전이 상태 유사체로의 결합에 대해 스크리닝했다. 촉매성의 효능을 갖는 후보 항체를, 상술한 제목 "에스테라제 촉매 활성에 대한 항체 스크리닝" 부분에서 서술한 바와 같이 촉매도에 대해 스크리닝??다.
이특이적 단일 사슬 항체를 하기 방법을 사용하여 생성했다. 관심사가 되는 암에 대해 특이적인 모노클로날, 예컨대 B72.3, 또는 당업계에 널리 공지된 다른 종양 특이적 항체를 이미 서술한 방법을 사용하여 클로닝했다. 항체를 단일 사슬의 형태로 클로닝하고, 당업계에 공지된 백터에서의 발현에 의해 특성화했다. 그 다음 상기 단일 사슬 항체 유전자를 상기 서술한 바와 같이 분리된 유전자의 촉매 항체에 대한 단일 사슬 유전자와 조합했다. 상기 두 단일 사슬 유전자의 연결은 단일 사슬들의 조합 또는 항체 영역의 연결에 관련된 것으로 알려진 다른 서열: 특히 (ser-lys-ser-thr-ser)3또는 다른 결정적 영역을 암호화하는 서열들의 조합에 대해 이미 서술한 링커들의 형태로이다. 그 다음, 상기 연결된 유전자를 발현 벡터; 예컨대, Vitrogen Inc. 로 부터의 벡터 pRC/CMS 또는 당업계에 공지된 다른 유사한 발현 벡터 내로 위치시킨다. 발현 벡터 내로의 이특이적 단일 사슬 유전자의도입에 이어, 발현 벡터에 대한 숙주 내로 조합된 벡터를 도입하는데, 상기 pRC/CMS 벡터의 경우 포유 동물 세포가 숙주이다. 많은 숙주 벡터 시스템이 존재하며 당업계에 잘 알려진 특정 장점들을 가짐이 알려져 있다. 상기 시스템들의 실례로서, E. 콜리, 효모 및 곤충 세포는 상기 서술된 시스템의 당업계에 널리 공지된 확장 시스템이다.
발현된 이특이적 단일 사슬의 회수는 당업계에 공지된 단백질 정제 방법에 의해 수행되며, 회수된 단백질은, 동물 및 사람 모두에게서 암을 치료하기 위한 물질로서의 순도를 결정하기 위하여, 촉매적 활성 및 촉매적 활성과 조합된 결합 활성의 특이적 활성을 측정하므로써 특성화된다. 정제된 이특이적 단일 사슬 (이가) 항체와 마찬가지로, 전통적인 모노클로날 방법에 의해, 그리고 파지 라이브러리 기술에 의해 유도된 항체는 화합물 1c 에 결합하고 그 화합물을 절단하였다.
부문 제목 "배합 및 투여"에서 상기 기술한 바와 같이, 이가 항체 및 선구 약제를 배합하고 투여했다.
실시예 43 :실시예 38 에서의 선구 약제141의 합텐, 5'-O-(2,4,6-트리메톡시벤조일)-5-플루오로우리딘의 선형 포스포네이트, 화합물152의 제조.
본 실시예에서, 굵은 글씨로 된 번호의 화합물들에 대해서는 제 49 도를 참조하라.
1,3,5-트리메톡시벤젠은 n-부틸리튬으로써 리튬화된 후 N,N-디이소프로필메틸 포스포아미드산 클로라이드와 반응하여 화합물150을 산출했다. 테트라졸의 존재 하에 화합물3f와의 후속적인 축합, 및 현장에서 mCPBA 에 의한 산화로, 화합물151을 생성했다. 티오페놀, 촉매성 수소화 및 암모늄을 사용하여 모든 보호기를 제거하므로써, 선구 약제 합텐152를 얻었다.
상세하게, 합성은 하기와 같다:
화합물 150
혼합물의 온도를 0℃ 미만으로 유지시키면서, n-부틸리튬(2-5 M 은 헥산임, 1 mmol)을 2 mL 의 THF 내 1,3,5-트리메톡시벤젠(1 mmol)의 용액에 첨가했다. 첨가가 완료된 후, 혼합물을 0℃ 에서 부가적인 2 시간 동안 교반했다. 그 다음, 그것을 -78℃ 로 냉각시키고, N,N-디이소프로필 메틸 포스폰아미드산 클로라이드(1 mmol)를 첨가했다. 첨가를 완료한 후에, 혼합물을 -78℃ 에서 부가적인 2 시간 동안 교반했다. EtOAc (45 ml) 내 트리에틸아민(5 ml)을 첨가하고, 혼합물을 포화 중탄산나트륨 (75 ml) 내로 부었다. 유기상을 포화 중탄산나트륨 (75 ml) 및 염수 (50 ml)로 더 처리하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시키고, 헥산 (2.7 ml) 내 트리에틸아민(0.3 ml)에 재용해시키고, 헥산 내 10% 트리에틸아민을 사용하는 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 무색 고체로서 생성물(화합물150)을 얻었다.
화합물 151
화합물150(1 mmol)을 3 mL 의 CH2Cl2에 용해시키고, 화합물3f(0.20 mmol) 및 이어서 테트라졸(2.5 mmol)을 첨가했다. 1 시간 후, mCPBA(1.25 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 15 분 동안 더 교반한 후 포화 NH4Cl (30 mL) 내로 붓고,EtOAc(2×50 mL)로써 추출했다. 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고 진공 하에 농축시켰다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물인 화합물151을 얻었다.
화합물 152
화합물151( 1 mmol)을 1 mL 의 디옥산에 용해시키고, 디옥산 (5 ml) 내 트리에틸아민 (10 mmol) 및 티오페놀(10 mmol)의 용액을 첨가했다. 혼합물을 16 시간 동안 교반했다. 그 후 그것을 진공 하에 농축시키고 2 mL 의 CH2Cl2에 재용해시킨 후, 교반하면서 300 mL 의 석유 에테르 내로 그것을 적가하였다. 따라 버린 후 침전물을 수집하고, 2 mL 의 CH2Cl2에 재용해시키고, 교반하면서 또다른 300 mL 의 석유 에테르에 다시 적가했다. 따라 버린 후 침전물을 다시 수집하고, 20 mL 의 EtOAc 에 재용해시키고, 5% Pd-C(10 중량%)를 첨가하고, 혼합물을 수소 흡수가 완료될 때까지 수소 분위기 하에서 실온에서 교반했다. 촉매를 셀라이트 패드를 통해 여과에 의해 분리하고 메탄올로 세척했다. 여액을 수집하여 진공 하에 농축시키고, 이리하여 수소화된 화합물 (1 mmol) 및 메탄올 (10 mL) 내 수산화암모늄 (10 mL)의 용액을 밀봉 튜브 내에서 밤새 가열했다. 반응 완료 후 반응 용매를 진공 하에 제거하고, 생성물을 역상 HPLC 에 의해 정제하여 화합물152를 얻었다.
실시예 44 :실시예 1a 에서의 선구 약제 1c 에 대한 합텐, 5'-O-(2,6-디메톡시벤조일)-5-플루오로우리딘의 선형 포스포네이트, 화합물155의 제조.
본 실시예에서, 굵은 글씨로 된 번호의 화합물들에 관해서는, 제 50 도를 참조하라.
1,5-디메톡시벤젠을 n-부틸리튬으로써 리듐화하고 N,N'-디이소프로필 메틸 포스포아미드산 클로라이드와 반응시켜 화합물150을 얻었다. 상기 화합물150을 테트라졸의 존재 하에 화합물3f와 후속적인 축합 및 현장에서 mCPBA 로써 산화시키므로써, 화합물 151 을 얻었다. 티오페놀, 촉매성 수소화 및 수산화 암모늄을 사용하여 모든 보호기를 제거하므로써, 선구 약제 합텐, 화합물152를 생성했다.
상세히,합성은 하기와 같다:
화합물 153
혼합물의 온도를 0℃ 미만으로 유지시키면서, n-부틸리튬(2-5M 은 헥산임, 1 mmol)을 2 mL 의 THF 내 1,5-디메톡시벤젠(1 mmol)의 용액에 첨가했다. 첨가가 완료된 후, 혼합물을 0℃ 에서 2 시간 동안 더 교반했다. 그 후, 그것을 -78℃ 로 냉각시키고 N,N-디이소프로필 메틸 포스폰아미드산 클로라이드(1 mmol)를 첨가했다. 첨가를 완료한 후에, 혼합물을 -78℃ 에서 2 시간 동안 더 교반했다. EtOAc (45 ml) 내 트리에틸아민(5 ml)을 첨가하고, 혼합물을 포화 중탄산나트륨 (75 ml) 내로 부었다. 유기상을 포화 중탄산나트륨 (75 ml) 및 염수(50 ml)로써 더 처리하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시키고, 헥산 (2.7 ml) 내 트리에틸아민(0.3 ml)에 재용해시키고, 헥산 내 10% 트리에틸아민을 사용하는 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 무색 고체로서 생성물(화합물153)을 얻었했다.
화합물 154
화합물153(1 mmol)을 3 mL 의 CH2Cl2에 용해시키고, 화합물3f(0.20 mmol) 및 이어서 테트라졸(2.5 mmol)을 첨가했다. 1 시간 후, mCPBA(1.25 mmol)를 첨가하고 혼합물을 15 분 동안 더 교반하고, 포화 NH4Cl (30 mL) 내로 붓고 EtOAc(2×50 mL)로써 추출했다. 유기상을 무수 MgSO4상에서 건조시키고 진공 하에 농축시켰다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 생성물인 화합물154를 산출했다.
화합물 155
화합물154(1 mmol)를 1 mL 의 디옥산에 용해시키고, 디옥산 (5 ml) 내 트리에틸아민 (10 mmol) 및 티오페놀(10 mmol)의 용액을 첨가했다. 혼합물을 16 시간 동안 교반했다. 그 후 그것을 진공 하에 농축시키고 2 mL 의 CH2Cl2에 재용해시킨 후, 교반하면서 300 mL 의 석유 에테르에 적가시켰다. 따라 버린 후 침전물을 수집하고 2 mL 의 CH2Cl2에 재용해시킨 후, 교반하면서 또다른 300 mL 의 석유 에테르에 다시 적가했다. 따라 버린 후 침전물을 다시 수집하고, 20 mL 의 EtOAc 에 재용해시키고, 5% Pd-C(10 중량%)를 첨가하고 혼합물을 수소 흡수가 완료될 때까지 수소 분위기 하에서 실온에서 교반했다. 촉매를 셀라이트 패드를 통한 여과에 의해 분리하여 메탄올로 세척했다. 여액을 수집하여 진공 하에 농축시킨 후, 이리하여 수소화된 화합물 (1 mmol) 및 메탄올 (10 mL) 내 수산화암모늄(10 mL)의 용액을밀봉 튜브 내에서 밤새 가열했다. 반응 완료 후 반응 용매를 진공 하에 제거하고, 생성물을 역상 HPLC 에 의해 정제하여 화합물155를 얻었다.
상기는 제한이 아니라 본 발명의 예시이다. 무수한 변형 및 개질이 본 발명의 취지 및 영역을 벗어나지 않고 수행될 수 있다.
상기 실시예들로 부터 입증되는 바와 같이, 본원 발명에 따라 제조되는 선구약제와 또한 이를 활성화시키기 위한 면역 접합체는, 기존의 세포독성 약제에 비하여 보통 세포 조직에 대하여 덜 독성이지만 표적화된 종양 세포에서는 특이적으로 그의 세포독성 활성을 나타낼 수 있는 유용한 제약학적 효과를 가짐을 알 수 있다.

Claims (19)

  1. 하기 식을 갖는 방향족 아미드 화합물:
    {식에서 X 는 누클레오시드 유사체, 시클로포스파미드, 클로람부실, 메클로레타민 또는 멜팔란과 같은 질소 머스타드 알킬화제 또는 이들의 아미드 유도체인 세포독성 약제 XNH2의 라디칼이고, 그리고
    R15, R16, R17, R18및 R19는 동일하거나 상이하며 H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 모노시클릭 방향족, 2-10 개의 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록시, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 또는 알킬암모늄이다}.
  2. 하기 식을 갖는 화합물 :
    {식에서 X'은 제 1 항의 X 의 유사체이며, X' 은 운반 단백질에 연결되거나 연결되지 않고,
    B 는 O, S, NH, 또는 CH2이고,
    D' 은 P(O)OH, SO2, CHOH 또는 SO 로서, 다만 D 가 CHOH 이면 B 는 CH2이고, 그리고
    R15', R16', R17', R18'및 R19'은 동일하거나 상이하며 운반 단백질에 연결되거나 연결되어 있지 않고, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록시, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 또는 알킬암모늄이다}.
  3. 하기 식을 갖는 방향족 아미드 화합물:
    {식에서 X 는 누클레오시드 유사체, 시클로포스파미드, 클로람부실, 메클로레타민 또는 멜팔란과 같은 질소 머스타드 알킬화제 또는 이들의 아미드 유도체인 세포독성 약제 XNH2의 라디칼이고,
    J 는 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 알킬, 치환체가 페닐, 알킬 또는 헤테로 원자를 갖는 알킬인 선형 배열의 1-9 원자를 갖는 헤테로 원자를 갖는 알킬이고,
    Y 는 OH, NH2, NHR 또는 SH 로서, 이때 R 은 -OH, 클로로, 플루오로, 브로모, 요오도, -SO3, 아릴, -SH, -(CO)H, -(CO)OH, 에스테르기, 에테르기, -CO-, 시아노, 에폭시드기 및 헤테로 원자들로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체에 의해 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고,
    R20, R21, R22, 및 R23은 동일하거나 상이하며 H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 모노시클릭 방향족, 2-10 개의 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록시, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 또는 알킬암모늄이다}.
  4. 하기 식을 갖는 화합물 ;
    {식에서 X' 은 제 3 항의 약제 XNH2의 유사체이며, X' 은 운반 단백질에 연결되거나 연결되지 않고,
    B 는 O, S, NH, 또는 CH2이고,
    D' 은 P(O), COH 로서, 단 D' 이 COH 이면 B 및 Y' 은 CH2이고,
    Y' 은 O, NH, NR, S 또는 CH2로서, 이때 R 은 -OH, 클로로, 플루오로, 브로모, 요오도, -SO3, 아릴, -SH, -(CO)H, -(CO)OH, 에스테르기, 에테르기, -CO-, 시아노, 에폭시드기 및 헤테로 원자들로 구성되는 군으로 부터 선택되는 하나 이상의 치환체에 의해 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고,
    J 는 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 알킬, 치환체가 페닐, 알킬 또는 헤테로 원자를 갖는 알킬인 선형 배열의 1-9 원자를 갖는 헤테로 원자를 갖는 알킬이고,
    R20', R21', R22', 및 R23'은 동일하거나 상이하며 운반 단백질에 연결되거나 연결되지 않고, H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 모노시클릭 방향족, 2-10 개의 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록시, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 또는 알킬암모늄이다}.
  5. 하기 일반식을 갖는 포르밀아미드 화합물:
    {식에서 X 는 누클레오시드 유사체, 시클로포스파미드, 클로람부실, 메클로레타민 또는 멜팔란과 같은 질소 머스타드 알킬화제 또는 이들의 아미드 유도체인 세포독성 약제 XNH2의 라디칼이다}.
  6. 하기 식을 갖는 화합물 :
    {식에서 X' 은 제 5 항의 X 의 유사체이며, X' 은 운반 단백질에 연결되거나 연결되지 않고,
    B 는 O, S, NH, 또는 CH2이며, 그리고
    D" 은 HP(O)OH, CH2OH, P(O)(OH)2, 또는 SO3H 로서, 단 D" 이 CH2OH 이면 B 는 CH2이다}.
  7. 하기 식을 갖는 아세틸아미드 화합물:
    {식에서 X 는 누클레오시드 유사체, 시클로포스파미드, 클로람부실, 메클로레타민 또는 멜팔란과 같은 질소 머스타드 알킬화제 또는 이들의 아미드 유도체인 세포독성 약제 XNH2의 라디칼이고, 그리고
    R24, R25및 R26은 동일하거나 상이하며 H, 2-22 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 헤테로 원자를 갖는 알킬, 시클로알킬디올, 모노시클릭 방향족, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄 또는 알켄이다}.
  8. 하기 식을 갖는 화합물 :
    {식에서 X' 은 제 7 항의 X 의 유사체이며, X' 은 운반 단백질에 연결되거나 연결되지 않고,
    B 는 O, S, NH, 또는 CH2이며,
    D 는 P(O)OH, SO2, CHOH 또는 SO 로서, 단 D 가 CHOH 이면 B 는 CH2이고, 그리고
    운반 단백질에 연결되거나 연결되지 않는 R24'-26'은 동일하거나 상이하며, H, 2-22 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 헤테로 원자를 갖는 알킬, 시클로알킬디올, 모노시클릭 방향족, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄 또는 알켄이다}.
  9. 하기 식을 갖는 아세틸아미드 화합물:
    {식에서 X 는 누클레오시드 유사체, 시클로포스파미드, 클로람부실, 메클로레타민 또는 멜팔란과 같은 질소 머스타드 알킬화제 또는 이들의 아미드 유도체인 세포독성 약제 XNH2의 라디칼이고,
    J 는 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 알킬, 치환체가 페닐, 알킬, 또는 헤테로 원자를 갖는 알킬인, 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 헤테로 원자를 갖는 알킬이고,
    Y 는 OH, NH2, NHR 또는 SH 로서, 이때 R 은 -OH, 클로로, 플루오로, 브로모, 요오도, -SO3, 아릴, -SH, -(CO)H, -(CO)OH, 에스테르기, 에테르기 -CO-, 시아노, 에폭시드기 및 헤테로 원자들로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체에 의해 치환된 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 그리고
    R27-28은 동일하거나 상이하며 H, 2-22 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 헤테로 원자를 갖는 알킬, 시클로알킬디올, 모노시클릭 방향족, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄 또는 알켄이다}.
  10. 하기 식을 갖는 화합물 :
    {식에서 X' 은 제 9 항의 X 의 유사체이며, X' 은 운반 단백질에 연결되거나 연결되지 않고,
    B 는 O, S, NH 또는 CH2이며,
    D' 은 P(O) 또는 COH 로서, 단 D' 이 COH 이면 B 및 Y' 은 CH2이고,
    Y' 은 O, NH, NR, S 또는 CH2로서, 이때 R 은 -OH, 클로로, 플루오로, 브로모, 요오도, -SO3, 아릴, -SH, -(CO)H, -(CO)OH, 에스테르기, 에테르기, -CO-, 시아노, 에폭시드기 및 헤테로 원자들로 구성되는 군으로 부터 선택되는 하나 이상의 치환체에 의해 치환되거나 치환되지 않는 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고,
    J 는 선형 배열의 1-9 개의 원자를 갖는 알킬, 치환체가 페닐, 알킬 또는 헤테로 원자를 갖는 알킬인 선형 배열의 1-9 원자를 갖는 헤테로 원자를 갖는 알킬이고, 그리고
    운반 단백질에 연결되거나 연결되지 않는 R27'-28'은 동일하거나 상이하며, H, 2-22 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 헤테로 원자를 갖는 알킬, 시클로알킬디올, 모노시클릭 방향족, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄 또는 알켄이다}.
  11. 하기 식을 갖는 모노락탐 화합물 :
    {식에서 R30및 R31중 하나 이상은 X 가 약제 XOH 의 라디칼인 OX 로서,
    XOH 는 항신생물 누클레오시드 유사체, 독소루비신, 또는 알도포스파미드의 에놀 형태이고,
    OX 가 아닌 R29-33은 동일하거나 상이하며 H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 2-10 개의 탄소 원자를 갖는 알케닐, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 카르복시알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬아미노, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 아미노알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 아실옥시, 또는 1-10 개의 탄소 원자를 갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 아실아미노이고, 그리고
    R29는 SO3H 또는 SO4H 이다}.
  12. 하기 식을 갖는 화합물 :
    {식에서 R30'및 R31'중 하나 이상은 제 11 항의 X 의 유사체이며, 상기 유사체는 운반 단백질에 연결되거나 연결되지 않고,
    D'''은 SO2, SO 또는 CHOH 로서, 다만 D'''이 CHOH 이면 Z' 은 CH 이고,
    Z' 은 O, N, 또는 CH 이되, 단, Z' 이 O 이면 R29'는 생략되고,
    상기 유사체가 아닌 R29'-33'은 동일하거나 상이하며 H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 2-10 개의 탄소 원자를 갖는 알케닐, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의탄소 원자를 갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 카르복시알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬아미노, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 아미노알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 아실옥시, 또는 1-10 개의 탄소 원자를 갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 아실아미노이고,
    R29'은 SO3H 또는 SO4H 이며, 그리고
    R29'-33'은 운반 단백질에 연결되거나 연결되지 않는다}.
  13. 하기 식을 갖는 모노락탐 화합물 :
    {식에서 X 는 약제 XOH 의 라디칼로서,
    XOH 는 항신생물 누클레오시드 유사체, 독소루비신 또는 알도포스파미드의 에놀 형태이고,
    R34, R35, R36, 및 R37은 동일하거나 상이하며 H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 모노시클릭 방향족, 2-10 개의 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록시, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 또는 알킬암모늄이며, 단 R34-37중 하나 이상은 H 가 아니고,
    n 은 0 내지 3 의 정수이며,
    E 는 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며 산소, 카르보닐옥시, 또는 옥시카르보닐이고, 단 E 가 존재하지 않으면 n 은 0 이 아니고,
    A 는 하기 라디칼 :
    이며,
    여기서 R38, R39, R40, R41또는 R42는 E 에 대한 부착 부위이거나, E 가 존재하지 않으면 [CH2]n에 대한 부착 부위이거나, 또는 E 가 존재하지 않고 n=0 이면 페닐 고리에 대한 부착 부위이고,
    R38, R39, R40, R41및 R42는 동일하거나 상이하며 H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 2-10 개의 탄소 원자를 갖는 알케닐, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소원자를 갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 카르복시알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬아미노, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 아미노알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 아실옥시, 또는 1-10 개의 탄소 원자를 갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 아실아미노이고, 그리고
    R38은 SO3H 또는 SO4H 이다}.
  14. 하기 식을 갖는 화합물 :
    {식에서 X' 은 제 13 항의 X 의 유사체이며, 운반 단백질에 연결되거나 연결되지 않고,
    B 는 O, S, NH, 또는 CH2이며,
    R34', R35', R36', 및 R37'은 동일하거나 상이하고 H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 모노시클릭 방향족, 2-10 개의 탄소 원자를 갖는 알켄, 히드록시, 히드록시알킬, 아미노알킬, 티오알킬, 아미노, 알킬아미노, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 또는 알킬암모늄이며, 단 R34'-37'중 하나 이상은 H 가 아니고,
    R34', R35', R36', 또는 R37'은 운반 단백질에 대한 부착 부위이거나 부착 부위가 아닐 수 있고,
    n 은 0 내지 3 의 정수이고,
    E' 은 존재하거나 존재하지 않으며 CH2, O, 카르보닐옥시, 카르보닐 메틸렌, 옥시카르보닐, 또는 메틸렌카르보닐이고,
    A' 은 하기 라디칼 :
    이며,
    이때 D'''은 SO2, SO 또는 CHOH 로서, 단 D'''이 CHOH 이면 Z' 은 CH 이고, Z' 은 임의의 입체 화학을 갖는 O, N, 또는 CH 이되, 단 Z' 이 O 이면 R38'은 생략되고,
    R36', R39', R40', R41'또는 R42'은 E' 에 대한 부착 부위이거나, E' 이 존재하지 않으면 (CH2)n에 대한 부착 부위이거나, 또는 E 가 존재하지 않고 n=0 이면 페닐 고리에 대한 부착 부위이고,
    R38', R39', R40', R41'및 R42'은 동일하거나 상이하며 H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알케닐, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 카르복시알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬아미노, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 아미노알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 아실옥시, 또는 1-10 개의 탄소 원자를갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 아실아미노이고, 그리고
    R38'은 SO3H 또는 SO4H 이다}.
  15. 하기 식을 갖는 모노락탐 화합물 :
    {식에서, X 는 약제 XOH 의 라디칼로서,
    XOH 는 항신생물 누클레오시드 유사체, 독소루비신, 또는 알도포스파미드의 에놀 형태이고,
    n 은 0 내지 4 의 정수이고,
    R43및 R44는 동일하거나 상이하나 둘다 H 는 아니며, 2-22 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 헤테로 원자를 갖는 알킬, 시클로알킬디올, 모노시클릭 방향족, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄 또는 알켄이고,
    E 는 존재하거나 존재하지 않으며 산소, 카르보닐옥시, 또는 옥시카르보닐이고,
    A 는 하기 라디칼 :
    이며,
    이때 R38, R39, R40, R41또는 R42는 E 에 대한 부착 부위이거나, E 가 존재하지 않으면 (CH2)n에 대한 부착 부위이거나, 또는 E 가 존재하지 않고 n=0 이면 R43및 R44가 부착되는 탄소 원자에 대한 부착 부위이고,
    R38, R39, R40, R41및 R42는 동일하거나 상이하며 H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알케닐, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 카르복시알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬아미노, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 아미노알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 아실옥시, 및 1-10 개의 탄소 원자를 갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖는 아실아미노이고, 그리고
    R36은 SO3H 또는 SO4H 이다}.
  16. 하기 식을 갖는 화합물 :
    {식에서, X' 은 제 15 항의 X 의 유사체이며, X' 은 운반 단백질에 연결되거나 연결되지 않고,
    B 는 O, S, NH, 또는 CH2이며,
    n 은 0 내지 4 의 정수이고,
    R43'및 R44'은 동일하거나 상이하나 둘다 H 는 아니며, 2-22 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 헤테로 원자를 갖는 알킬, 시클로알킬디올, 모노시클릭 방향족, 알킬포스포네이트, 알킬설포네이트, 알킬카르복실레이트, 알킬암모늄 또는 알켄이고,
    E' 은 존재하거나 존재하지 않으며 CH2, O, 카르보닐옥시, 카르보닐 메틸렌, 옥시카르보닐, 또는 메틸렌카르보닐이고,
    A' 은 하기 라디칼 :
    이며,
    이때, D'''은 SO2, SO 또는 CHOH 로서, 단 D''' 이 CHOH 이면 Z' 은 CH 이고,
    Z' 은 O, N, 또는 CH 이되, 단 Z' 이 O 이면 R38'은 생략되고,
    R38', R39', R40', R41'또는 R42'은 E' 에 대한 부착 부위이거나, E' 이 존재하지 않으면 (CH2)n에 대한 부착 부위이거나, 또는 E' 이 존재하지 않고 n=0 이면R43'및 R44'이 부착되는 탄소 원자에 대한 부착 부위이고,
    R38', R39', R40', R41'및 R42'은 동일하거나 상이하며 H, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알케닐, 모노시클릭 방향족, 1-10 개의 탄소 원자를 갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 카르복시알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알콕시, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 알킬아미노, 1-10 개의 탄소 원자를 갖는 아미노알킬, 1-10 개의 탄소 원자를 갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 아실옥시, 또는 1-10 개의 탄소 원자를 갖고 헤테로시클릭 또는 페닐 치환체를 갖거나 갖지 않는 아실아미노이고, 그리고
    R38'은 SO3H 또는 SO4H 이다}.
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