KR0173124B1

KR0173124B1 - 7-아미노 세팔로스포란산의 효소적 제조방법

Info

Publication number: KR0173124B1
Application number: KR1019910701280A
Authority: KR
Inventors: 엘. 웡 빙; 쉔 용-퀴앙
Original assignee: 카알 더블유. 라우쉬; 바이오퓨어 코포레이션
Priority date: 1989-04-04
Filing date: 1990-03-30
Publication date: 1999-02-01
Also published as: CA2049958A1; JPH04504362A; ATE123533T1; HK36997A; EP0465600B1; US5618687A; DE69019967T2; KR920701468A; DE69019967D1; WO1990012110A1; EP0465600A1

Abstract

본 발명은 세팔로스포란 C로부터 7-아미노 세팔로스포란산을 제조하는 효소적 방법에 관한 것이다. 이 방법은 2단계 효소반응으로, 동일한 반응기 안에서 수행될 수 있다. 본 발명은 또한 증가된 양의 D-아미노산 산화효소를 생성하는 트리고노프시스 바리아빌리스의 돌연변이 균주와, 아실이탈효소의 양을 증가시키는 아시네토박터 종의 돌연변이 균주를 포함하며, 상기 효소들은 본 발명 방법에 필수적인 효소들이다.

Description

[발명의 명칭]

7-아미노 세팔로스포란산의 효소적 제조방법

[배경]

많은 유기물들은 다른 유기물에 대해 독성을 나타내는 화학물질을 생성한다. 상기 화합물 중 중요한 부류는 효모, 균류 및 박테리아에 의해 생성된 의료용 항생 물질, 예컨대 페니실린 및 스트렙토마이신이다.

항생물질중 주된 부류는 세팔로스포린이다. 7-아미노 세팔로스포란산을 포함하는 세팔로스포린, 예컨대 세팔로스포린 C 및 그의 유도체는 중요한 항생 물질이다. 세팔로스포린 C 및 그의 유도체를 제조하는 방법은 예를들면, 미국 특허 제3,821,209호; 미국 특허 제3,658,649 호; 미국 특허 제4,113,941호; 미국 특허 제3,776,815호; 미국 특허 제3,725,400호; 미국 특허 제4,145,539호 및 미국 특허 제3,960,662호에 기재되어 있다. 그러나, 세팔로스포린을 제조하기 위한 보다 우수하며 좀더 효과적인 방법이 요구되고 있다.

[발명의 개요]

본 발명은 세팔로스포린 C, 및 관련된 화합물로부터 7-아미노 세팔로스포란산을 효소적으로 제조하는 완전히 통합된 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 2단계 효소 반응을 포함한다. 제 1단계는 세팔로스포린 C를 과산화수소 분해 효소 및 D-아미노산 산화효소(DAO)를 포함하는 효소 혼합물과 접촉시켜 중간물, 글루타릴 7-아미노산 세팔로스포란산을 생성하는 것을 포함한다. 제2단계는 아실화된 생성물을 아실이탈 효소(Deacylating enzyme, deacylase)와 접촉시켜 7-아미노세팔로스포란산을 고수율로 생성하는 것을 포함한다. 반응은 가압시킨 산소하에서 수행하여 반응의 상기 두 단계 모두가 단일 반응 용기 중에서 수행되는 것을 가능케 한다.

또한, 본 발명은 다량의 D-아미노산 산화 효소를 생성하는 효모의 돌연변이 균주, 및 다량의 아실이탈 효소를 생성하는 박테리아의 돌연변이 균주에 관한 것이다. 바람직한 돌연변이는 트리고노프시스 바리아빌리스(Irigonopsis variabilis)의 균주로서, 이는 야생형 균주에 비해 약 160배 더 우수한 수준으로 D-아미노산 산화 효소를 발현시킨다. 돌연변이 효모 세포는 7-아미노 세팔로스포란산의 생성을 위한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

바람직한 돌연변이 박테리아는 아시네토박터 종(Acinetobacter spp.)의 균주로서, 이는 야생형 균주에 비해 상당히 더 높은 수준으로 아실이탈 효소를 발현시킨다.

본 발명의 방법은 세팔로스포린 C를 7-아미노 세팔로스포란산으로 전환시키는데에 효과적인 단일-용기 시스템을 제공한다.

[도면의 간단한 설명]

도면은 트리고노프시스 바리아빌리스의 개선된 균주의 제조 순서를 나타내는 흐름도를 도시한 것이다.

[발명의 상세한 설명]

세팔로스포린 C로부터의 7-아미노 세팔로스포란산의 생성은 2-단계 효소 반응이다 : (1) 제 1단계는 세팔로스포린 C를 과산화수소 분해 효소와 DAO의 혼합물과 접촉시켜 글루타릴 7-아미노세팔로스포란산(글루타릴-7ACA)를 생성하는 것을 포함하고, (2) 제2단계는 글루타릴-7ACA를 아실 이탈 효소와 접촉시켜 7-ACA를 생성하는 것을 포함한다.

통상적으로, 종래 방법에서 제1 효소 단계는 글루타릴 7ACA와 δ-케토산 중간물의 반응 혼합물을 생성하는데, 주 생성물은 글루타릴 7ACA이다. 그러나, δ-케토산 중간물은 아실이탈 효소와 거의 반응하지 않는다.

반응성을 개선시키기 위해, 미량의 과산화수소를 제1 효소 반응 혼합물에 주입하고, 과산화수소는 δ-케토산 생성물과 산화 카르복실이탈 반응으로 비효소적으로 반응하는 추가 화학 반응을 이용한다. 그 결과로서, 글루타릴 7-ACA가 형성되고, 전체 반응이 일어나며 완결 반응으로 유도된다.

이어서, 반응 용액은 아실이탈 효소를 포함하는 제2 효소 반응기로 주입되어 7-ACA를 형성한다. 그러나, 제2 단계를 수행하기 전에 과산화수소를 제거해야 한다. 반응 용액은 과산화수소 분해 효소에 노출시켜 과산화수소를 제거해야 한다.

본 발명의 방법은 과산화수소에 대한 요구를 제거시키므로 전체 반응은 단일 반응 용기 중에서 수행할 수 있다. 이는, 본 발명의 시스템에서, 제1 효소 반응기가 약 50psig, 또는 그 이상의 산소 대기 하에서 작업되며, 글루타릴 7-ACA가 주 생성물이 되기 때문에 가능하게 된다. 따라서, 과산화수소를 반응기 유출물에 부가하는 단계, 이어서 과산화수소 분해 효소 반응기를 사용하여 초과량의 과산화수소를 제거하는 단계들이 제거될 수 있다.

두가지 효소에 대해 최적 작업조건(예컨대, 25℃, pH 8.0 및 50 psig 압력하에서) 및 D-아미노산 산화효소에 의해 요구되는 적당히 용해된 산소하에서, 본 발명의 방법은 상기 2개의 효소 반응기가 단일 장치로 상호 작용하는 것을 가능하게 하고, 따라서 7-ACA로의 세팔로스포린 C의 단일 단계 전환을 달성시킨다 (참조, 실시예 8).

[효소]

본 발명의 방법에서 사용된 효소는 DAO, 과산화수소 분해 효소, 및 글루타르산에 대해 특이적인 아실이탈 효소이다.

DAO는 여러 공급원, 예컨대 곰팡이 [예를 들어, 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 페니실리움 로쿠에포르티(Penicillium roqueforti), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus liger), 뉴로스포라 크라사(Neurospora massa)]; 박테리아 [예를 들어, 아에로박터 종(Aerobacter spp.), 바실루스 프로테우스(Bacillus proteus), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas eruginosa)]; 효모 [예를 들어, 트리고노프시스 바리아빌리스(Trigonopsis ariabilis), 켄디다 트로피카리스(Candida tropicalis), 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)]; 포유류 기관 [예를 들어, 돼지의 신장, 돼지의 간, 쥐의 간] 및 방울뱀의 독에서 발견할 수 있다.

본 발명의 다배수체 돌연변이체(참조, 실시예 1) 및 트리고노프시스 바리아빌리스(ATCC 기탁번호 #10679)와 같은 효모 세포가 효모의 특히 유용한 공급원이다. DAO 는 세팔로스포린 C의 아미노 그룹을 분해시킨다.

DAO는 효모 트리고노프시스 바리아빌리스의 미소체 및 세포질 중에 위치하고 있다. 상기 효소는 하기의 방법에 의해 효모 세포로부터 추출할 수 있다 : 효모 세포벽을 고압 균질화기로 파괴 개방하고, 정제시킨 세포 유리 추출물을 무기염(황산 암모늄)으로 처리한다. 황산 황모늄 처리된 상청액을 페닐 세파로스를 함유하는 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 분별시킨다. 상기 미정제 효소를 온건한 산 침전 반응을 사용하여 추가로 정제시킨다. 이러한 단계에서, 특정 효소 활성은 단백질 1㎎당 대략 30유닛이다.

만일 추가의 정제가 필요하다면, DEAE 를 함유하는 부가 크로마토그래피 컬럼 분별법을 적용시킬 수 있다. 이어서, 상기 효소는 기질, 예컨대 미세다 공성 막 시이트 스톡(sheet stock) 상에 고정시켜 효소 반응기를 형성할 수 있다.

과산화 수소 분해 효소는 과산화수소를 산소 및 물로 분해시키는 것을 촉진시킨다. 그러나, 본 발명의 방법에서와 같이 높은 산소압 및 DAO와 더불어 수반된 방법 하에서는, 과산화수소 분해 효소는 글루타릴 7-ACA로의 세팔로스포린 C의 산화성 탈아민화 반응에 대한 촉진제일 수도 있다.

과산화수소 분해 효소는 많은 동물 세포 중에 존재하는 효소이다. 유리 용액 중에서, DAO/과산화수소 분해 효소 혼합물의 반응성은 DAO 단독의 반응성에 비해 상당히 (최소한 180%) 증가하게 된다. 고정화시킨 효소(즉, 효소 반응기)를 사용함으로써, 그리고 높은 산소압(즉 50 psig) 하에서, 반응성은 최소한 10 내지 15배까지 증가하게 된다.

놀랍게도, 과산화수소 분해 효소 및 D-아미노산 산화 효소의 배합물을 포함하는 반응기가, 반응 용기속으로 확산되는 외인성 산소 없이 대기압 하에서 그리고 높은 세팔로스포린 C 농도와 더불어 작업되는 경우에는 산소는 제한 인자가 된다. 이러한 조건하에서, 반응은 가역적이며 어떠한 생성물도 생성되지 않는다. 그러나, 상기와 같은 반응기가, 반응 용기속으로 확산된 외인성 산소와 더불어 대기압 하에서 작업되는 경우에는, 반응성이 개선되며 소량의 생성물이 생성된다. 반응에 이용할 수 있는 용해된 산소의 제한을 제거하기 위해, 본 발명의 방법에서는 가압시킨 반응 시스템이 사용된다. 상기 작업 조건하에서, 용해된 산소는 더이상 제한 인자가 아니며, 반응은 세팔로스포린 C인 기질의 농도에 따라 좌우된다. 즉, 반응은 일차 반응이 된다. 대기압 조건하에서의 반응성에 비해, 약 50 psig 압력 하에서 반응 시스템의 반응성은 개시 반응 속도에 있어서 8 내지 10배, 그리고 전체 반응속도에 있어서 4 내지 5배 증가된다.

본 발명의 방법의 제2단계에서 효소로서 사용된 아실이탈 효소는 박테리아, 아시네토박터 종에서 발현된다. 상기 박테리아는 크기가 약 0.1×0.3μ인 그람 네거티브 스몰 간상체이다. 아실이탈 효소는 중간 화합물, 글루타릴-7 아미노-세팔로스 포란산(글루타릴 7-ACA)의 글루타릴 측쇄를 분해시킨다.

아실이탈 효소는 아시네토박터 종 그람 네거티브 박테리아의 세포질 중에 위치하고 있다. 아실이탈 효소는 하기의 방법에 의해 박테리아로부터 추출할 수 있다 : 배지로부터 제조한 세포 페이스트는 pH 8.0의 0.05M 인산 나트륨염을 포함하는 완충액 중에 현탁시킨다. 세포벽은 고압 균질화기에 의해 파괴 개방시키고, 정제시킨 세포 유리 추출물은 분별하고, 황산 암모늄 처리로 농축시킨다. 단백질 농축물은 DEAE를 함유하는 액체 크로마토그래피를 사용하여 정제시킨다. 상기 효소는 냉동 상태에서 최소한 6달 동안 안정하다. 상기 효소 용액은 기질, 예컨대 실리카 침투된 미세다공성 플라스틱 시이트(MPS) 스톡 상에 고정화시켜 효소 반응기를 생성할 수 있다.

반응은 약 7.5 내지 약 8.5의 pH에서 수행할 수 있다. 전환을 위한 최적 pH 값은 약 8.5 이다. 그러나, 글루타릴 7ACA 및 세팔로스포린 C의 생물학적 활성은 pH 8.0 이하에서 좀 더 안정하다. 따라서, 본 발명의 방법에서는 작업 pH 값으로서 PH 8.0을 사용한다.

[효소 생성 돌연변이 세포]

상술한 바와 같이, DAO 및 아실이탈 효소는 많은 상이한 공급원으로부터의 많은 세포에 의해 발현된다. 그러나, 대부분의 경우, 세포에 의해 생성되는 효소의 양은 실제로 이용하기에는 너무 적다.

본 발명은 야생형 세포와 비교하여 DAO 및 아실 이탈 효소의 발현을 매우 증가시킬 수 있는 돌연변이 세포주를 포함한다. 이러한 돌연변이 세포는 야생형 세포를 선택된 조건하에서 하나 이상의 돌연변이 유발제에 노출시키고, 효소의 증가된 생성을 나타낸 살아있는 세포를 선택함으로써 제조한다.

효모 세포, 즉 트리고노프시스 바리아빌리스 다배수 돌연변이체의 배양물은 니트로스아민 화합물로 처리한다. 그 결과 생성된 돌연변이 효모세포는 야생형 세포보다 상당히 더 많은 양의 DAO를 생성한다.

아실 이탈 효소를 생성하는 아시네토박터 종 세포의 배양물은 니트로스아민으로 처리하여 돌연변이시킨다. 아시네토박터 종의 돌연변이 균주는 상기 방법으로, 야생형 아시네토박터 종 보다 상당히 더 많은 양으로 발현된 아실이탈 효소를 생성한다.

[효소 반응기]

본 발명의 방법은 고정된 효소, 또는 효소 반응기를 사용하여 수행한다. 효소는 일반적으로 플라스틱 또는 직물 지지체와 같은 기질 상에 고정되거나 또는 어떤 조건하에서는, 반응 용액에 유리될 수 있다. 미세다공성 플라스틱 시이트(MPS)가 특히 유용한 지지체이다. 그러나, 무명 직물과 같은 다른 지지 재료가 또한 사용될 수 있다.

미세다공성 플라스틱 시이트(MPS)는 상이한 직경의 카트리지로 성형될 수 있는 시이트 형태의 실리카-폴리비닐클로라이드 복합체이다. MPS는 폴리에틸렌이민 및 글루타르알데히드를 이용하여 유도될 수 있다. 유도체 MPS(PEIGLUT)는 단백질의 아미노기와 반응할 수 있다, 이것은 단위 중량당 표면적이 크고 그 자체 중량의 10%까지의 단백질과 반응할 수 있다.

폴리에텐이민 글루타르알데히드 유도된 MPS 카트리지(Amerace)는 본 방법에서 효소의 고정을 위해 사용된다. 효소, 또는 효소를 생성하는 전체 세포는 지지체 상에 고정될 수 있다. 예를 들어, DAO가 지지체 상에 고정될 수 있거나, 또는 상기 기술된 트리고노프시스 바리아빌리스의 돌연변이 균주와 같이, 반응기에서 DAO를 생성할 수 있는 DAO-생성 세포가 고정될 수 있다. 약 7g의 단백질이 100g의 활성화된 MPS 상에 고정된다. 효소 또는 세포를 고정시키기 위해, 중성 pH(예: pH 6.0)의 0,05M 인산나트륨염과 같은 완충액, 및 특이 효소 또는 세포 현탁액을 함유하는 용액을 25℃에서 2시간 동안, 또는 단백질이 모두 MPS에 결합될 때까지 둘 중의 선행되는 시간에 따라 활성화된 MPS를 통해 통과시킨다. 그 다음에, MPS를 완충액으로 세척한다. 그 다음에 반응된 MPS를 0.5M 글리신 용액으로 세척하여 비반응된 알데히드 부위를 모두 덮는다. 인산나트륨 완충액으로 더 세척한 후, 반응된 MPS는 효소 반응에 사용된다.

[방법 단계]

본 발명의 방법은 단일 반응 용기에서 수행된다. 효소는 적합한 지지체 상에 고정되고, 출발 물질, 즉 세팔로스포린 C와 접촉한다.

바람직한 경우에, 약 1.0g/ℓ의 농도 및 약 6.0 내지 8.5의 pH를 갖는 세팔로스포린 C의 용액을 사용한다. 특히 바람직한 pH는 약 8.0 이다.

세팔로스포린 C는 TRIS 완충액과 같은 완충액에 용해시킨다. 세괄로스포린 C 용액은 먼저 고정된 DAO/과산화수소 분해 효소와 접촉하며, 여기에서 세팔로스포린 C는 산화되고 탈아민화되어, 글루타릴-7-ACA를 형성한다. 제1단계의 글루타릴 7-ACA 생성물은, 바람직한 생성물 7-ASA로의 전환을 촉매하는 제2 고정된 효소인 아실 이탈 효소와 접촉한다. 반응 생성물은 7-ASA, 글루타르산 및 암모니아이다.

반응은 약 20℃ 내지 약 50℃, 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 35℃에서 수행한다. 반응의 pH 범위는 약 6,5 내지 약 9.0, 바람직하게는 약 8.0일 수 있다. 반응을 가압 산소 대기하에서 수행되어 산소가 반응매질에 용해되게 하고, 이것에 의해 세팔로스포린 C의 산화에 이용될 수 있게 한다.

약 50 psig의 압력, 또는 산소압이 본 반응에서 특히 효과적이다.

본 발명의 또 하나의 구체예에서, 수소화붕소나트륨을 반응 혼합물에 첨가된다. 수소화붕소나트륨(NaBH₄)은 반응에서 고정된 DAO 효소의 반감기를 증가시킨다.

본 발명의 방법은 고수율로 7-아미노 세팔로스포란산을 효과적으로 생성시킨다.

세팔로스포린은 페니실린과 밀접한 관계가 있다. 이러한 화합물은 약제학적 또는 의료학적 사용을 위한 항균제로서 유용하다. 본 발명 방법은 고수율로, 새로운 계열의 유효 약제에 대한 기초가 될 수 있는 세팔로스포린 유도체인 7-ACA를 생성시킬 수 있다.

7-ACA 는 세팔렉신, 세팔로글리신, 세팔로리딘, 세팔로틴, 세파클로르 및 세파만돌을 포함하는 제3 및 제4 세팔로스포린 군의 항생 물질 모두에 대한 주성분, 또는 중간 물질이다. 과거에 대부분의 7-ACA 생성은 엄격한 방법 조건하에서 몇몇 독성 화학 약품을 사용하는 화학적 방법을 이용하거나 사용하였다. 환경 및 경제적인 면에 있어서, 생물학적 촉매를 이용하여 기존의 화학적 방법을 대치하려는 경향이 있다. 7-ACA를 생성하기 위해, 알파 아미노 아디프산 측쇄는 세팔로스포린 C 분자로부터 분리되어야 한다. 이러한 측쇄는 대부분의 효소가 반응하기에는 너무 길다. 본 방법은 2단계 효소 반응 방법을 이용하지만, 공정의 조건이 두 효소 모두에 대해 매우 유사하기 때문에, 두 단계는 하나로 조합되어 단일 단계 공정이 될 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의해 예시되며, 이 실시 예들은 본 발명을 이로 한정하는 것이 아니다.

[실시예]

[실시예 1 : 트리고노프시스 바리아빌리스에 대한 다배수체 돌연변이]

트리고노프시스 바리아빌리스 다배수체 돌연변이체를, 도면에 나타내고 하기에 기술한 바와 같이, 야생형 트르고노프시스 바리아빌리스로부터 유도한다. 야생형 세포를 48시간 동안 0.02% 캠퍼 및/또는 캠퍼 유사체(캠퍼 카르복실산 및 캠퍼 술폰산)로 3회 처리한다. 처리된 미생물을 30℃에서 3일 동안 YM 한천 평탄에서 배양한다. 일군의 빠른 성장, 및 또한 가장 큰 크기의 단일 콜로니를 발견하였다. 그 다음에, 이러한 콜로니를 각각 후속의 돌연변이를 위해 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)로 처리한다. 0.25㎎의 NTG/㎖ 배양물을 40 내지 60분 동안 0℃에서 첨가한다.

일련의 트리고노프시스 바리아빌리스 다배수체 돌연변이된 단일 콜로니를 분리하고 배양한다. 변형된 배양 배지와 발효 조건의 조합으로, 돌연변이 트리고노프시스 바리아빌리스에서 발현된 D-아미노산 산화 효소 활성은 0.1 국제 유닛/㎖(야생형)로부터 15 국제 유닛/㎖까지 증가되었다.

트리고노프시스 바리아빌리스 33187로 나타낸 트리고노프시스 바리아빌리스의 개선된 균주는 ATCC No. 20931로서 아메리칸 타입 컬치 콜렉션에 기탁하였다.

[트르고노프시스 바리아빌리스의 배양방법(D-아미노산 산화효소]

트리고노프시스 바리아빌리스의 효모 1 루우프를 5g/ℓ의 효모 추출물, 5g/ℓ의 맥아 추출물, 5g/ℓ의 펩톤 및 10g/ℓ의 글루코오스를 함유하는 배양 브로스 100㎖에 (YM 배지) 옮긴다. 혼합물을 24시간 동안 30℃에서 배양하고, 500㎎의 배양 플라스크로 옮긴다. 제2단계로, 상기 언급한 바와 같은 똑같은 작업 조건하에서 24시간 동안 배양한다. 이러한 새롭게 성장한 접종물을 솔룰리즈, 비오틴, DL 메티오닌, 티아민, 우레아 및 특정 무기염을 함유하는 발효배지에 옮긴다. 배지 제법을 하기에 기재한다. 발효기를 완만하게 교반시키고(150-300rpm) 적당하게 통기시키면서(대기에서 0.3ℓ/ℓ/min)로, 30℃에서 24 내지 48시간 동안 유지시킨다. 용해된 산소를 처음 12시간동안 50% 이상으로 유지시키고, 그 다음에 10% 이하로 유지시킨다. 성장이 정지기에 도달하면(OD₆₆₀은 35에 도달하고, 배양 배지의 pH 값은 5.0 이하이고 세포는 암갈색이 됨), 효소 발현은 접종 후 36시간에서 최고에 달한다. 이러한 60ℓ의 발효는 대략적으로 900,000 IUs의 D-아미노산 산화 효소 및 1730g의 팩킹된 습윤 세포를 생성시켰다.

[트리고노프시스 바리아빌리스에 대한 발효 배지]

[실시예 2 : D-아미노산 산화 효소의 분리와 정제]

실시예 1에 기술한 바와 같이 제조한 1730g의 세포를 pH 8.0에서 0.01 EDTA를 갖는 0.01M의 피로인산염 7.7ℓ에 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 고압 균질화기(만톤-가울린(manton-Gaulin) 균질화기; @ 11,000 psi)를 통해 3회 통과시킨다. 이 단계에서, 260,000 유닛의 D-아미노산 산화 효소를 회수하였다. 그 다음에 정화된 상청액(9.3ℓ)를 약 60 내지 90분 동안 1553g의 황산 암모늄과 혼합한다. 샤플레스(Sharples) 원심 분리기로 침전물과 상청액을 분리한다. 정화된 상청액(9.3ℓ)을, 1.2M 황산암모늄과 평형을 이룬 페닐 세파로오스 액체 크로마토그래피 컬럼 상에 붓는다. 효소를 pH 8.3에서 0.001M EDPA가 포함된 0.01M 피로인산염 완충액으로 용리시킨다. 그 결과 58,5%의 효소 활성이 회수되었다. 그 다음, 푸울된 분획을 pH 5.2까지 아세트산으로 처리한다. 회수된 효소는 단백질 1㎎당 30 유닛의 특이적 활성을 갖는다. 대략적으로 95,000 IU의 D-아미노산 산화 효소가 회수되었다. 효소를 DTT(5㎎/㎖)와 함께 4℃에서 저장하면 고정될 때까지 2주 동안 안정하다.

[실시예 3 : 아시네토박터 조의 돌연변이]

야생형 그람 네거티브 박테리아, 아시네토박터 종은 유일한 탄소원으로서 글루타르산을 사용하고, 그리고 ㎖당 0.005 내지 0.01 국제 유닛의 아실이탈 효소를 생성한다.

박테리아를 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 및 에틸메탄술포네이트로 처리하였다. 이 처리 조건은 10 내지 50분 동안 0℃에서 0.2 내지 0,5㎎/㎖였다. 아실이탈 효소 활성은 0.005-0.01IUS/㎖(야생형)에서 0.4IUS/㎖로 증가하였다.

아시네토박터 종 YS 114로 표시된, 아시네토박터 종의 개량 균주는 ATCC No. 53891로서 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션에 기탁하였다.

[아실이탈 효소 생성 박테리아의 배양]

YS 114 균주의 단일 콜로니를 24시간 동안 25℃에서 100㎖의 배양 배지에 옮겼다. 접종물 배지 제형은 다음과 같다 :

YS l14를 위한 접종물 배양 배지의 제형(YM 배지)

발효 배지 제형은 다음과 같다 :

550ℓ 발효기를 효소 생성시키는데 사용하였다. 10ℓ 접종물을 사용하였고, 적절한 공기(2ℓ/ℓ/m)와 함께 결렬하게 교반하면서 (40 0-600rpm) 25℃에서 발효시켰다. 용해된 산소 수준은 50% 이상의 포화 상태로 유지하였고, pH는 작업 내내 조절하지 않았으며, pH 값은 궁극적으로 8.5로 상승하였다. 배양물을 30시간 동안 발효시킨 후, 효소발현은 브로스 1ℓ당 400 국제 유닛으로 달성되었다. 대략 2527 국제 유닛의 효소, 그리고 5500g의 세포 페이스트를 샤플레스 원심 분리기로부터 회수하였다.

* 국제 유닛(IU) - PH 8.0 및 37℃에서 분당 생성된 7 ACA의 1μmol.

[실시예 4 : 아실이탈효소의 분리 및 정제]

실시예 3에서 기재된 바와 같이 제조한 2.6㎏의 팩킹된 아시네토박터 종 세포를 실온에서 밤새 해동시킨 다음 2.6ℓ의 0.1M 인산 나트륨 완충액(pH 8,0)에서 현탁시켰다. 이 현탁액을 추가 6ℓ의 완충액과 혼합하고, 고압 균질기에 3회 통과시키고, 정화된 상청액을 회수하였다. 이 단계에서, 11.5ℓ, 1132 IUs의 활성을 가지는 아실 이탈효소를 회수하였다. 1171g의 황산 암모늄을 이 용액에 부가하였고, 60분간 혼합한 후, 샤플레스 원심분리기로 원심분리하였다. 상청액에 추가로 2021g의 황산 암모늄을 부가하였다.

원심분리 후, 522 유닛 효소를 회수하였다. 이 단백질 침전물을 pH 8.0의 0.05M 인산나트륨 완충액중에 용해시켰고, 밤새 동일한 완층액으로 투석하였다. 계속해서 이 효소 용액을 DEAE 액체 크로마토그래피 컬럼으로 분별하였고, 0 내지 0.3M NaCl 선형 농도 구배로 용출하였다. 효소의 피이크(peak)는 0.1M NaCl 염에서 용출되었다. 이 단계에서, 4.7g 및 426 국제 유닛(0.089 IUs/㎎ 단백질)의 아실이탈 효소를 회수하였다. 이 효소는 -20℃에서 냉동 저장하여 고정화를 위해 준비하였다. 이런 상태로 6개월 동안 안정하였다.

[실시예 5 : 효소 고정화]

[D-아미노산 산화 효소에 대한 고정화 방법]

300㎖의 D-아미노산 산화 효소(DAO) 용액 (7140 IU, 900㎎)를, 0.5인치 두께(23 시이트, 직경 @ 47㎜)의 활성화된 MPS를 통해 통과시켰다. DAO 용액을 2시간 동안 6㎖/min에서 재순환시켰다. 90%의 효소를 MPS에 부착시켰다. 반응기의 과량의 알데히드 부위를 0.05M TRIS 완충액(pH=8.0) 중의 0.5M 글리신으로 팍칭(quenching)시킨 후, 4℃에서 0.05M TRIS 완충액에 저장하였다. 계속해서 이 반응기를 ceph C/글루타릴-7-ACA 전환 연구를 위해 사용하였다.

[D-아미노산 산화 효소 및 과산화수소 분해 효소에 대한 고정화 방법]

770㎎의 DAO (ex 1481로부터의 30 IU/㎎ 및 5㎎/㎖ DTT) 및 10.2㎎의 과산화수소 분해 효소(시그마 C30, 22,800 IU/㎎)를 9600㎎의 PEI/GLU 활성화된 MPS(0.5인치 두께, 직경 @ 47㎜의 24 시이트 상에서 고정화하였다. 이 효소 용액을 6㎖/min에서 반응기를 통해 3회 통과시켰다.

반응기의 과량의 알데히드 부위를 0.05M TRIS, pH 8.0 완충액 중의 300㎖의 0.5M 글리신으로 퀀칭시켰다. 계속해서 이 반응기를 pH 8.0의 0.05M TRIS 완충액으로 세척하였고, 10㎍/㎖의 겐타마이신을 포함하는 20㎎의 동일한 완충액에 저장하였다. 이 고정화 효율은 대략 89%였고, 이것은 반응기에 고정된 전체 20670 유닛의 D-아미노산 산화 효소였다 (MPS의 시이트당 860 유닛의 D-아미노산 산화효소).

[2-아실이탈 효소의 고정화 방법]

12 시이트의 MPS(47㎜의 직경 및 4800㎎)을 갖는 PEI/GLU 활성화된 모듈을 사용하였다. 110㎖의 효소 Ⅱ용액(0.2 국제 유닛/㎖, 22.2유닛 및 392㎎ 단백질)을 6㎖/min에서 반응기를 통해 3회 통과시켰다. 반응기를 pH 8.0의 0.05M TRIS 완충액 중의 200㎖의 0.5M 글리신으로 세척한 후, 100㎖의 0.05M TRIS 완충액으로 플러쉬하였다. 세척 후, 반응기를 10㎍/㎖ 겐타마이신이 포함된 pH 8,0의 0.05M TRIS 완충액에 저장하였다. 결과적으로, 전체 331㎎의 단백질 및 19 국제 유닛을 반응기상에 부착하였다.

84.5%의 2-아실이탈 효소를 부착하였다 (MPS 시이트당 1.56 IUs).

[실시예 6 : 효소 활성에 대한 pH, 온도 및 압력의 효과]

[고정화된 D-아미노산 산화효소/과산화수소 분해 효소의 반응성에 대한 세팔로스포린 C의 pH의 효과]

D-아미노산 산화효소/과산화수소 분해 효소 혼합물에 대한 pH의 효과를 1.0g/ℓ의 농도를 갖는 세팔로스포린 C 용액을 사용하여 고찰하였다.

원액을 만들어 100㎖ 부분 표본으로 나누고, pH를 6.0, 7.0 및 8.0으로 조정하였다. 각각의 부분표본의 세팔로스포린 C 용액을 2㎖/min의 속도에서 단일 통과 방식으로 고정화된 효소를 함유하는 반응기를 통해 통과시켰다.

반응기를 실험하기 전에 적당한 완충액으로 세척하였다. 이들 실험을 실온 및 대기압에서 수행하였다. 최적의 pH는 8.0이다.

[고정화된 D-아미노산 산화 효소의 작업 온도에 대한 반응성의 효과]

D-아미노산 산화효소에 대한 온도 효과를 여러 작업 온도 조건에서 고찰하였다. 반응기를 20, 25, 30, 35, 40, 45 및 50℃에 설정된 수욕 중에서 작업시켰다. 작업 매개변수는 1g/ℓ 농도의 세팔로스포린 C로 2㎖/분, pH 8.0에서 수행하였다. 반응성은 45℃에서 최대에 도달하지만, 반응기는 30 및 45℃ 사이에서 최대에 가까운 성능을 갖는다. 온도 고찰로부터의 결과를 표2에 나타내었다.

[고정화된 아실이탈 효소의 반응성에 대한 기질 pH의 효과]

아실이탈 효소에 대한 pH 효과를 희석한 기질, 단일 통과 방식을 사용하여 고찰하였다. 5,55g/ℓ의 글루타릴 7-ACA의 원액을 만들어 100㎖ 부분 표본으로 나누었고, 1N NaOH를 사용하여 pH를 5,0, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 및 9.0으로 조정하였다. 계속해서 각 부분 표본의 기질을 2㎖/분의 속도에서 단일 통과 방식으로 효소 Ⅱ 반응기를 통해 연동식 펌프로 펌핑하였다.

이 실험은 실온 및 대기압에서 수행하였다.

나타낸 바와같이, 효소 Ⅱ를 사용함에 의한 글루타릴 7ACA에서 7ACA으로의 전환을 위한 최적의 pH는 8.5 이다. 다양한 pH 수준에서 상대적 반응성을 표3에 나타내었다 :

[고정화된 D-아미노산 산화 효소의 작업온도에 대한 반응성의 효과]

반응기 Ⅱ에 미치는 온도의 효과를 여러 작업 온도 조건에서 고찰하였다. 반응기를 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 및 60℃로 설정된 수욕에서 작업시켰다. 이 작업 매개변수를 0.45g/ℓ의 글루타릴 7ACA의 농도로 2㎖/분, pH 8.0으로 설정하였다. 반응성은 45℃에서 최대치에 도달하였지만, 반응기는 35 내지 45℃ 사이에서 최적의 성능을 갖는다. 이 온도 고찰로부터의 결과를 표4에 나타내었다.

[효소 반응기 둘 모두의 산소압 대 반응성]

이 실험에서는 글루타릴 7-ACA로의 세팔로스포린 C의 아민기 제거반응에서 용해된 산소의 효능성을 입증한다. 반응기는 반응 용기 내로 확산된 순소 산소와 더불어 50 psig 압력하에서 작업시켰다. 세팔로스포린 C용액(농도 51.3 내지 64.5g/ℓ, pH 8.0)을 재순환법으로 반응기를 통해 펌핑하였다. 상기 반응기는 글루타릴 7-ACA 19.6g/분/반응기 시이트의 높은 개시 반응 속도, 및 8.4의 전체 반응 속도를 입증한다. 반응기 내로 확산된 순수한 산소와 함께 대기압 하에서 작업된 반응에 비해, 상기 반응 속도는 글루타릴 7-ACA 1.7 내지 2.3g/분/반응기 시이트로까지 감소된다. 반응성은 개시 반응 속도에서 전체 반응 속도에 이르기까지 유사하다. 상기 연구에 대한 비교는 하기에 나타낸 표에 나타냈다. 더우기, 표5에 나타낸 바와 같이 반응성이 상당히 개선되고, 반응 생성물은 글루타릴 7-ACA가 주 생성물이되는 정도로까지 개선된다.

1. 50 psig, pH 8.0 및 6㎖/분의 유속에서 작업

24개 시이트 반응기.

2. 대기압, pH 8.0 및 6㎖/분의 유속에서 작업.

1개 시이트 반응기.

3. 대기압, pH 8.0 및 14㎖/분의 유속에서 작업.

4개 시이트 반응기.

[실시예 7 : 50 psig 산소압하에서 D-아미노산 산화효소/과산화수소 분해 효소의 효소 반응기의 조건 및 결과]

정제된 세팔로스포린 C (Lot no. 234 CX6) 19.35g을 300㎖의 0.15M Tris 완충액에 녹인 후, 0.1N NaOH를 사용하여 pH를 8.0으로 조정하였다.

세포로스포린 C 용액을, 효소 반응기 I(DAO/과산화수소 분해 효소)을 통하여 펌프시키고, 분당 6.0㎖로 재순환시켰다. 전체 시스템은 50psig 압력의 순수 산소 농후 환경하에 있었다. 80분 이내에 모든 세팔로스포린 C는 δ-7-ACA의 분당 생성률은 197㎎이었고(8.2㎎/분/반응기 시이트), 생성물 회수(몰비)는 90.6% 이었다. 산소 농후 환경 하에서, 산소는 풍부해지고 이 반응은 일차 반응이다. 그 결과를 하기 표6에 나타낸다 :

[대기 산소압하에서의 D-아미노산 산화 효소의 효소 반응기의 조건 및 결과]

정제된 세팔로스포린 C(Lot no. 234 CX6) 2.04g을 50㎖의 0.15M Tris완충액(pH=8.0)에 용해시켰다. 0.1N NaOH를 사용하여 용해된 세팔로스포린 C 용액의 pH를 6.7로 조정하였다. 산소 반응기 1을 통하여 분당 10.0㎖로 세팔로스포린 C 용액을 펌프시키면서, 순수 산소를 스파저(Sparger)를 통하여 반응기안으로 기포화시킨다. 이러한 낮은 산소압하에서 반응기의 반응도는, 실시예 7에 나타낸 바와 같은, 50psig의 고산소압 하에서의 반응도의 약 1/5 이었다. 이 실험의 생성률은 하기표 Ⅶ에 나타낸 바와 같이, 분당 대략 6.4㎖의 글루타릴 7ACA (1.6㎎/분/반응기 시이트)이었고 생성물 회수율은 78.0%였다.

[글루타릴 7-ACA에 대한 화학 반응의 조건]

6.0㎖의 3.0% 과산화수소 용액을, 앞의 실험으로부터 얻은 생성물 용액(δ-케토 중간체와 글루타릴 7ACA의 혼합물)에, 2시간에 걸쳐 25℃에서 첨가하였다. 모든 δ-케토산이 글루타릴 7ACA로 전환되었다. 최종 글루타릴 7ACA농도는 1ℓ당 25.9g인 것으로 분석되었다.

[이실이탈 효소에 대한 효소 반응의 조건 및 결과]

115㎖의 글루타릴 7ACA용액(25.9g/ℓ, 3g)을, 효소 반응기 Ⅱ(직경이 @ 47㎜인 아실이탈 효소 고정화 시이트 MPS를 35개 포함)를 통하여, 분당 6㎖의 유속으로 통과시켰다. 기질의 pH를 8.0으로 조정하였다. 반응을 4시간 동안 지속시켰고, 생성률은 분당 7-ACA 5.8㎎이었다. 반응 종료 후 1.4g의 7-ACA를 회수하였다. 이 반응기의 몰 생성 회수율은 75 내지 83% 였다.

[실시예 8 : 세팔로스포린 C의 7ACA로의 단일 단계 전환]

7ACA로의 세팔로스포린 C의 단일 단계 전환은 하기의 효소 반응기 배열을 이용하여 달성하였다. 효소 제1 반응기(총 3450 유닛의 D-아미노산 산화효소를 함유하고 있는 47㎜ 직경의 시이트 5개 포함) 바로 아래쪽에 효소 제2 반응기 복합체(총 31 국제 유닛의 아실이탈 효소를 함유하고 있는 47㎜ 직경의 시이트 24개 포함)를 배열하였다. pH 8.0의 0.1M Tris 중의 6.6g/ℓ 세팔로스포린 C 용액 300㎖을, 상기 시스템을 통하여 분당 4.4㎖의 속도로 재순환시켰다. 전체 시스템은 50psig 산소 압력 하에서 가압시켰다.

그 결과를 하기 표8에 나타낸다.

기질을 7.75 시간 동안 재순환된 후, 기질을 제거하였다. 95㎖의 0.05M Tris 완충액(pH=8.0)을 사용하여 반응기를 플러쉬하였다. 총 10.45mg의 세팔로스포린 C, 30.4mg의 글루타릴 7-ACA, 및 123.5㎎의 7-ACA를 회수 하였다. 7-ACA의 전체 생성율은 1.49㎎/분 이었고, 전체 회수율은 62.9%였다. 알파-게토 중간체는 검출되지 않았다.

[실시예 9 : D-아미노산 산화효소의 반응기 수명에 미치는 수소화 붕소나트륨의 효과]

효소와 지지체 사이의 결합 안정화는 글루타르알데히드 처리 및 이어서 수소화붕소나트륨 처리를 이용함으로써 시도하였다. 글루타르알데히드는 모든 가능한 펜던트 PEI 기에 효소를 부착하기 위해 사용하였고, 수소화붕소나트륨은 알데하이드-아미노 결합에 의해 형성된 시이트 염기를 감소시킴으로써, 결합을 포화시키고 공격으로부터 보호하기 위해 사용하였다.

[실시예 10 : 아실이탈 효소 글루타르알데히드 고정된 세포]

아시네토박터 종 세포 페이스트 10g(20시간 수확으로 얻어짐)에, 80㎖의 염수(pH=8.6)를 첨가한 후, 그 용액에 25%의 글루타르알데히드를 첨가하여 그것의 최종 농도를 1%로 만들었다. pH를 6.5로 조정하고, 그 혼합물을 1시간 동안 실온에서 방치하거나 서서히 교반하였다. 세포를 회전시켜 바닥에 모이면 0.1M 인산염 완층액으로 2회 세척한 후, 동일한 완충액에 재현탁시켰다. 고정화 전의 효소 활성은 726.5 IU/㎖ 이었고, 고정화 후의 활성은 704.5 IU/㎖ 이었으며, 이것은 활성의 3% 손실을 나타낸다.

세포를 80㎖의 글루타릴-7ACA 용액(35g/ℓ, pH 8.0)에 현탁시키고, 10N NaOH를 사용하여 pH를 8.0으로 조정하였다.

계획된 반감기는 170시간이다(세포의 측정된 활성을 토대로 함).

반응기의 제1 반감기 동안 만들어진 총 7ACA는 5.95g이었다.

평균 속도는 0.516㎎/hr IU 이다.

제1 반감기 동안 만들어진 ㎎/IU의 7ACA는 104㎎/IU와 같다.

[실시예 11 : 면섬유상에 고정된 트리고노프시스 바리아빌리스 세포]

트리고노프시스 바리아빌리스 33187의 2 샘플을 다음과 같이 처리하였다 : 25g의 세포 페이스트를 3%의 아세트산 에틸로 20분 동안 처리한 후, 이 세포 혼합물을 회전시켜서 상청액을 제거하였다. 2 샘플을 100㎖씩의 0.05M 인산염 완충액, pH 8.0에 재현탁시켰다. 반응기 카트리지 쉘 안에 47㎜×1/2 두께로 팩킹된 4.9g의 폴리에틸렌이민 글루타르알데히드 유도 된 플란넬을 통하여 샘플을 1회 통과시키고, 2시간 동안 2% 글루타르알데히드로 고정시켰다. 그런 다음 샘플을 상기와 동일한 완충액으로 플러쉬하였다. 결합 용량은 4.5g의 전체 세포와 10g의 마이너스-추출 세포였다. 시험 조건은 50psig 02, 22㎖/분의 유속 및 40g/ℓ의 세팔로스포린 C 였고, 결과는 다음과 같다 :

수명 연구는 50psig O₂및 22㎖/분의 유속에서, 40g/ℓ세팔로스포린 C에서의 한쌍의 D-아미노산 산화효소 반응기를 이용하여 수행하였다. 반응기는 배치식 재순환 모드로 밤새 작업시켰고, 매 24시간마다 FAD-메르캅토에탄올 환원 칵테일로 세척하였다.

[균등 물질 및 공정]

당해 기술분야에 숙련된 사람들은 기본적인 실험을 더이상 수행하지 않더라도 본원에 기재된 특정물질 및 공정과 동등한 많은 균등 물질 및 방법이 있음을 인정하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 균등 물질 및 방법들은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려되며 첨부되는 청구범위 내에 속한다.

[미생물]

A. 기탁의 확인

기탁기관명 : 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션

기탁기관주소 : 미합중국 20852 메릴랜드 록빌 파크로온 드라이브 12301

기탁일 : 1989년 4월 4일

기탁번호 : ATCC 20931

B. 추가의 표시

유럽특허가 관련된 상기 표시건에 관해서, 출원인은 유럽규칙 제28조 제4항에 따라, 유럽 특허권이 공고될 때까지, 또는 유럽출원이 거절이유 통지되거나 또는 취하되거나 또는 취하되는 것으로 간주되는 날까지, 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션에 기탁번호 제20931호로 기탁된 생물학적 물질이, 단지 유럽 규칙 28조 5항에 따라 분양 신청자에 의해 임명된 전문가에게 샘플이 분양될 때만 활용될 것 임을 유럽 특허청에 통지합니다.

이 문서는 본 국제출원이 출원된 당시에 수령됨.

나다니엘 알. 헤이든

PCT 국제 서비스 담당관

국제 사무국에서의 수령일 : 1990년 5월 3일