JPS58201985A - グルコ−ス脱水素酵素の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３−デヒドロカルニチンの非対称還元によるし一力ルニ
ヂンの生産方法はフランス特許第２３９８０４６号に記
載されている。この１５ＦＰｉは、例えばＡｕｒｉｃｈ
および　ｃｏｌｌ、　Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｋｅｒ　−ｓ
　　Ｚ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅａ＋　、第３４９
巻、１３１０頁（１９６８年）にその化学合成法が記載
されている３−デヒドロカルニチンまたはそれらの塩の
１つを、下記の成分の水性培地において同時作用に付す
ことより成る。すなわｌ５ａ）カルニチン脱水素酵素 ｂ）デヒドロカルニチンの還元用カルニチン脱水素酵素
により用いられる助酵素。この助酵素はニコチンアミド
アデニンジヌクレオヂドであり、これは酸化形ｆｉｌ（
ＮＡＤＨ）で存在しても還元形態（ＮＨＤ）−１）ｔ’
存在してもよい。

Ｃ）ニコチンアミドアデニトｔクレオチドの酸化形態の
還元の化学系（または化学養剤）または酵素系（または
酵素剤）。この系はあらゆる場合に還元剤（Ｒ）を含み
、その他に酵素還元の系の場合ＷＩＩ素（Ｅ）を含む。

し−力ルニチンの調整反応の使用条件は前記フランス特
許に記載されている。

ＮＡＤＨの種々の還元系＜ＮＡＤＨの再生系とも呼ばれ
る）は特に酵素系について（この場合還元剤Ｒと酵素Ｅ
の化合物）の既に引用したフランス特許に記載されてい
る。最良の結果は還元剤がグルコースであり、酵素がグ
ルコース脱水素酵素（Ｅ、Ｃ，１，１，［，４７）であ
る系を用いて得られた。

ＮＡＤ４の還元反応はしたがって次のように表わすこと
ができる。

グルコース脱水素酵素 グルコース→−ＮＡＤ＋ （Ｒ）　　　　　　　　　　　（Ｅ） グルカノラクトン　＋　ＮＡＤＨ十　Ｈ＋しかしながら
この系を利用しく良好な成輪を得るには、精製グルコー
ス脱水素酵素の使用が必要であった。この条件は１業的
には使用しえない。酵素すなわちこの場合グル：１−ス
脱水素酵素の精製の費用は一般に非常に＾い。粗抽出物
の使用（づなわち求める酵素活性を有する微生物の懸濁
液の破壊および例えば遠心分離による細菌細胞破片の除
去の後で得られるｗ４製物の使用）またはグルコース脱
水素酵素の酵素活性を有するほとんど精製されていない
抽出物の使用は、従ってかなりこの費用を減じることが
できる。不都合なことに、あまりに大量な粗抽出物の使
用が要求されているにしてはあまりに粗抽出物の活性が
低いという事実によっ°【、またそれ自体酵素であって
もよくかつ当該合成に対して不１１な作用をあれこれと
及ぼす種々の化合物がこれらの抽出物に存在するという
事実によって、この使用は多くの場合不可能であること
が証明されている。

この不利な作用の原因は様々であるがしばしば併合的な
ものであって、必ずしも知られているわけではない。例
えば粗抽出物の存在の結果おこる反応において用いられ
る酵素および助酵素の非常に急速な不活性化、存在する
基質からの種々の生成物の合成、抽出物中に含まれる生
成物によるし一カルニチンの合成の阻害などを挙げるこ
とができる。

粗酵素抽出物の使用のもう１つの不都合は、使用される
粗抽出物中に含まれる不純物の存在の結果り一力ルニチ
ンの精製が困難であることである。

本出願人はグルコース脱水素酵素の安定か）活性内相抽
出物の調製と、し−力ルニブンの合成用としてのその利
用を可能にする条例を発見した。

本発明のｈ法の発見に導く実験を以トに飲約した。

グルコース脱水素酵素の活性をバシルス・サブチリス（
Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）種に属する
種々の細菌株に由来する酵素抽出物において測定した。

ある種の胞子形成突然変異体（生育終ｒ時に不完全な発
達をした胞子を形成する突然変異体）は、野生株（ｓｏ
、ｕｃｈＯｄａ　　ｓａｕｖａｇｅ　）の活性よりはる
かに高いグルコース脱水素酵素活性を１ｉすることが認
められた。類似の結果が、バシルス・セレウス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　　ｃｅｒｅｕｓ）のような他のバシルス秤
に属する菌株を用いた場合でも認められる。しかしなが
ら多くの場合酵素抽出物の安定性は悪く、グルコース脱
水素酵素は数時間でその活性の大部分を失うが、一方精
製後の同じ酵素の安定性ははるかに良好であった。′こ
の不安定性の理由は明らかにされなかったが、これはグ
ルコース脱水素酵素のようなＷＩ素をこれら酵素のペプ
チド結合のあるものを加水分解することによって不活性
化するプロテアーゼの存在に少なくとも１部基づいてい
る司異体の場合、粗抽出物におけるグルコース脱水素酵
素は高い活性と前２の場合より良好な安定性とを有する
ことが今や発見された。この突然変異体は実験室の保存
菌株であるバシルス・メガテリウムＩ　ＦＰｌ　８０か
ら得られた。この菌株は’　Ｂ　ｅｒｇｅｙ　′ｓ　　
ｍａｎｕａｌ　　ｏｆ　　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
　　ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”第８版（１９７４１、
ｌ　ｈｅ　　ＶＪ　ｉｌｌｉａｍｓ　　＆　　Ｗ　１ｌ
ｋｉｎｓ　　Ｃｏｍｐａｎｙ。

Ｉ３ａｌｔｉｍｏｒｅ、第５２９頁に記載されているよ
うなバシルス・メガテリウム種に対応づる特徴を有する
温度耐性の内生胞子を形成する稈薗形の好気性細菌であ
る。生育を終えその胞子形成を行なったバシルス・メガ
テリウムＩ　Ｆ　Ｐ　１８０の培養を新しいグルコース
培地上に連続的に植菌した。数回の連続的な植菌を受け
た培養物から彎た酵素抽出物のグルコース脱水素酵素活
性がかなり増加したことが、認められた。従って例えば
１２回の連続的植菌固体培地上への拡散後、］ロニーの
分離によって培養物を精製した。得られた新しい菌株を
バシルス・メガテリウムＩＦ　Ｐ　１８８と名付ける。

これは母菌株のバシルス・メガテリウムｌ　Ｆ　ｒ’　
１８０と似ている特徴を示（が、はるかに低い胞子形成
率と明らかに＾いグルコース脱水素酵素活性によりこれ
とは異なる。これにより、無胞子性の突然変異体の選別
を有利にするために知られ１ｉ４（Ｊ、ｒ）。

△ｕｂｅｒｔ　、　Ｊ、　Ｍｉｌｌｅｌ　、　Ｅ、Ｐｉ
ｎｅａｕおよびＧ、Ｍｉｌｈａｕｄ、Ｂ　１ｏｃｈｉ（
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ａｃｔａ　　。

５１巻、（１９６１年）第５２９〜５３７頁）かつ上記
のように行なわれた植菌が、その他に高いグルコース脱
水素酵素活性を有するという特性を示すような突然変異
体を得ることに効果的に導かれたと結論できた。ＩＦＰ
１８８株はＡＴＣＣ寄託番号第３９１１８号である。

従って本発明の方法は、生育を終えかつイの胞子形成を
行なったバシルス・メガテリウム株のグルコース培地上
の連続的植菌により得られたバシルス・メガツリウムの
突然変異体１１”　ｌ’１８８（ＡＴＣＣ寄託番号第３
９１１８号）の培養によるグルコース脱水素酵素のＩＩ
Ｊ３ｆｉから成る。

バシルス菌株の培養のために用いられ／ｊ栄拾培地の組
成が、これらの培養から得られた酵素調製物のグルコー
ス脱水素活性に対してかなり影響を及ぼすこともまた認
められた。グルコースが１〜４０Ｑ／１の濃廉ぐ培地中
に存在することがグルコース脱水素ｌｆｙ索の良好な活
性を得るために不可欠であることが確かめられた。一般
的には例えば大豆のペプトン、カゼインの氷解物、とう
もろこしの浸漬液（コーンスミイーブリカー”ｃｏｒｎ
　　５ｔｅｅｐ　１ｉｑｕｏｒ　”　）　、肉のにｔス
などのようなアミノ酸源の添加を行なうと、良好な成育
および高い酵素活性を得るのに有利である。Ｃｈａｔｅ
ｌａｉｎおよびＦ　ａｒｇｅｔｔ、　Ｃ、Ｒ。

＋ｌ０ｂｄ　、３ｅａｎｃｅｓ　　Δｃａｄ　、　３ｃ
ｉ、　、　ｌ）シリーズ１９７６年、２８３鵞（１３）
、第１５６３〜１５６６真に記載されているバシルス・
メガミリラム突然変異体ＫＭ５９、これは燐酸塩の欠乏
という条件Ｆでしかグルコース脱水素Ｍｌを生じないも
のであるが、これとは逆にＩＦＰＩ８８株は過剰な燐酸
塩の存在トで培養された時て゛さえ、高いグルコース脱
水素酵素活性を有りる。

培地中へのグルコース添加は培養の初めにただ１度で行
なうことができる。ある場合には最高の酵素活性は発酵
の間グルコースの漸次添加により得られた。

培養におけるグルコースの割合は好ましくは１〜４０ａ
／ｄである。好ましい培地は少なくとも１ｇ／ｌのグル
コースと少なくとｂｌ。

ｌのとうもろこしの浸漬液とを含む。

バシルス・メガテリウムＩ　Ｆ　Ｐ　１８８の培養から
、遠心分離によって細菌を採集しついでこれらの細菌の
Ｉｌ衝液中懸濁液を、超合波処理、ガラス球を用いての
粉砕などのような既知の技術によっＣ破壊することによ
り、＾いグルコース脱水素酵素活性を右づる粗酵素抽出
物を調製する。細胞破片を除去するために、破壊された
細胞懸濁液の遠心分子ｌｕ、Ｌ−カルニチンの合成のた
めに用いられるグルコース脱水素酵素の粗酵素抽出物を
得る。

１ＦＰ１８Ｂ菌株から冑た粗抽出物中のグルコース脱水
素酵素の安定性を調べた結束、安定性は良好であり、前
に調べたバシルス菌種から得た抽出物の安定性より明ら
かに良いことが認められた。さらに、この安定性は０．
１〜１ＭのＳ度のグル」−スの存在によって明らかに改
善されていることが認められた。サッカ［１−ス、フル
クトース、マンニｔ＝−ルあるいｔよグリセロールのよ
うなぞの他の糖や多価アルコールは安定化効果が非常に
劣る。結局酵素の安定性はｐＨ６〜７で良好であるがｐ
Ｈ７，５では劣る。

ｐ１１８かそれ以、１のようなよりアルカリ竹のｐＦ（
では安定性は悪い。上に記載した安定性の条件は有利に
は１−−カルニチンの合成に用いられる。

本発明はグルコ−ス脱水素酵素の粗酵素抽出物の使用に
制限されるものではない。所望であマＶ れば硫酸アン七ニウム、神々の型のり［１市）グラノィ
ー（イオン交換、ゲル上透過、親和力）などを用いての
選択的沈澱のような酵素の精製の既知方法の使用によっ
て、上に記載した粗抽出物から冑たグルコース脱水素酵
素のＦ８製抽出物をもし一カルニチンのこの合成用に使
用ηることができるからである。

実施例１ バシルス・メガテリウム株（Ｉ　ＦＦ）１　Ｂ　０菌株
）を１１につきグルアｌ−ス２．５ｏ　、Ｋ２１−ＩＰ
Ｏ４２，５ａ　、塩化ナトリウム５ｇ、カゼインの三重
（ｔｒｙｐｔ　１ｑｕｅ　）氷解物１７ｇ、人〜ンのパ
パイン・ペプトン３ｇを含有する培地上で培養し、１１
５℃で３０分間の滅Ｓ後Ｄ１１７．０に調整する。これ
らの条件は行なわれる培養の燐Ｆｌｌ塩に制限を加える
ようなものではな（１゜３０℃で２４時間の培養後細胞
を採集し、燐酸カリウム緩衝液１００１１１　Ｍ　（１
）ｈ７．５＞中に懸濁させ、ついで細胞懸濁液の冷間（
Ｏへ一１０℃）超音波処理（１０回１５秒）ついで遠心
分頗による細胞破片の除去によって酵素抽出物をｗ４賀
した。グルコース脱水素酵素の酵素活性をこのようにし
て得られた抽出物において測定すると抽出物のプロフィ
ン１ｍＯにつき０．０８５１１位であつＩこ。酵素単位
（（〕）は実験条ｆｌ　Ｔ−において１分につき１マイ
クロモルのグルコースの変換を可能にする酵素の量とし
て定義する。

ＩＦＰ１８０菌株から天然の胞子形成突然変異体を、土
に記載した培地上への連続的植菌によって選別した。５
回の植菌後、培養物のグルー１−ス脱水素酵素活性が改
善されたことが認められた。植菌を２０回まで続行して
行なわれた異なる連続培養の固体培地上への拡散によっ
て単離された二１［］ニーを轡た。ついでこれらの］Ｌ
に一を培養し、当初の菌株Ｉ　Ｆ　Ｐ　１８０と同じ条
件下で処理し、グルコース脱水素酵素の酵素活性を、得
られた抽出物においＣ測定した。

Ｉこん白質１ｍｏにつき０．５０１１である最良の酵素
活性を、ＩＦＰ１８８Ｍ株と名付けたこれら］Ｏニーの
１つの培養物から得た。さらに１１’　ｌ）　１８８菌
株は非常に低い胞ｒ形成率（０゜４％以下）を有し、従
って胞子形成突然変異体を成すことが認められた。巨大
菌突然変異体ＩＦＰ　１８８を後の実験におけるグル：
１−ス脱水素酵素の製造用に取っておいた。

グルコース脱水素酵素の安定性をこの菌株ＩＦＰ１８８
の酵素抽出物において測定した。これらの実験において
抽出物を濾過により滅菌し、ｐＨ７，０の燐酸カリウム
緩衝液中に３０℃に保持した。これらの条件下に保持し
た抽出物のグルコース脱水素酵素活性を周期的に測定し
たが、約１５時間の半減期（Ｍ素活性の半分を失うのに
要する時間）という結果が得られた。

グルコース０．６Ｍの添加は粗抽出物中の酵素の安定性
をかなり増す。己れは上記の条Ｒ’Ｆにおいて２１日間
で活性の損失は全く電、められなかったからである。グ
ルコースの安定化効果はグルコースの濃度による。０．
２Ｍの濃度においで半減期は４０〜５０時間である。０
．４Ｍにおいては約１２日である。

比較としてはバシルス・サブチリスを用いて得られたグ
ルコース脱水素酵素の抽出物は０゜０４５単位／抽出物
のたん白質ｍｇの活性しかなかった。

バシルス・勺ブチリスの最良の突然変異体の活性は０．
０８５ｕ／たん白質ｍｇ以上ではなかった。バシルス・
サブチリスの野生菌株およびそれらの突然変異体はすべ
て２へ・６時間のＹ減期を有していた。

実施例２ 大豆のパパイン・ペプトン３０１Ｊｚ＃を含杓する培地
を含む２０／の発酵装置内でバシルス初の滅菌を実施例
１のように行なった。ｐ　１］を１ＯＮアンモニアの添
加によってｔｌｌ１７．３に緒持した。培地１１につき
空気０．５／／分の注入により培地の通気を行なった。

２０時時間軸胞を採集し、酵素抽出物を実施例１のよう
に調製した。たん白質１１１１［Ｊにつき０．００２ｕ
のグル」−ス脱水素酵素活性が、このような抽出物にお
いて測定された。

培地が大豆のパパイン・ペプトンの他に１００　／Ｉの
グＪレニ］−スを含むということを除いてした酵素抽出
物は、たん白質１１１ｇにつき０゜４２ｕのグル」−ス
脱水素酵素活性を有していた。

実施例３ １６／の容積の培養培地が都市水道から成り、ぞの中に
培養の間ずっと１０００　／　ｋｇのトウモロコシの浸
漬液（コーンステーブリカー”ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ　　
ｌ　１ｑｕｏｒ”　）　４００　Ｑ　／　ｋｇのグル］
−スを注入したことを除いて実施例２と同様に、ＩＦＰ
１８８＃ｉ株のもう１つの培養を行なった。

この混合物の注入速度は５０１１１１／時であった。。

２０時間の生育後採集して得られた細胞を用い（ｍ製し
た酵素抽出物はたん白質１１１１Ｊにつき０．６０ｕの
グルニ］−ス脱水ＪＰ！酵素活性をｌｊ　Ｌ／でいた。

実施例４ 実施例３において調製したグルー１〜ス脱水素酵素の酵
素抽出物をＦ記の条何下でＬ−力ルニブンの合成を行な
うために用いた。１／につさミリモル（ｍＭ）で示した
濃度の上記の成分ηなわら燐酸アンモニウム５０ｍＭ（
ｐＨ７，０）、ＮＡＤ”　１ｍ　Ｍ、グルコース６００
ｍ　Ｍ、力ルニヂン脱水素酵素（フランス特許第２３９
８０４６号の実施例１に記載されたようにして調製した
もの）４５０甲位（すなわら酵素抽出物１０１１／）お
よびグルコース脱水素酵素１５０単位（すなわち粗酵素
抽出物１０１／）を含有づる培地５００１Ｉを含む、サ
ーモスタットで２５℃に保たれている２１反応器を用い
た。ついぐデヒドロカルニチン・臭化水素塩（８！縮塩
酸の添加によりＤＨｏ、５にしであるもの）を１１につ
き８００１Ｍ含む溶液を注入した。注入速度は５ｍ／／
時であった。Ｉ）Ｈは２Ｎアン１−７の添加により１１
Ｍ７．０に維持した。この７ン七ニア添加は自ａｐｔ＋
メーター滴定器を用いて管埋された。ＷＩ素的方法によ
り支吊された形成［−一力ルニチンの鰻は、４８時間後
３０　。

５ｇであった。

以上 特許出願人　アンスティｉユ・７ランセ・アコ外４名 第１頁の続き ０発　明　者　ヤン・ル・パンリュ フランス国イブリーヌ県シャド ウ（７８４００）アレ・アンビル・ トラン８番地

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）バシルス（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　）菌株を培地中
   で培養しかつ得られた酵素を抽出することより成るグル
   コース脱水素酵素の生産方法において、バシルス菌株が
   、生育を終えかつ胞子形成をへの連続的植菌により得ら
   れた突然変位体１ＦＰ１８Ｂ　（ＡＴＣＣ寄託番号第３
   ９１１８号）であることを特徴とする方法。
2. （２）培養が１〜４０ａ／ｌの濃度のグルコースの存在
   下において行なわれる、特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
3. （３）培養が少なくとも１ｇ／ｌのグルコースと少なく
   とも１Ｑ／ｌのとうもろこしの浸漬液とを同時に含む培
   地において′行なわれる、特許請求の範囲第１または２
   項記載の方法。
4. （４）培養の間にグルコースが漸次導入される、′特許
   請求の範囲第１〜３項のうちのいずれが１項記載の方法
   。
5. （５）３−デヒドロカルニチンを水性培地において下記
   の成分すなわち ａ）カルニチン脱水素酵素 ｂ）ニコヂンアミドアデニンジヌクレオヂドおよび Ｃ）グルコースおよびグルコース脱水素酵素 の同時作用に付４ととより成る、［−カルニチンの酵素
   合成反応に使用するために１．特許請求の範囲第１〜４
   項のうちのいずれか１項記載の方法によってグルコース
   脱水素酵素を得る方法。
6. （６）グルコース脱水素酵素が粗抽出物の形で使用され
   る、特許請求の範囲第５項記載の方法。