KR0163793B1 - 과산화 활성물질 분석용 조성물, 분석장치 및 방법 - Google Patents

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Abstract

시험 샘플 중의 헤모글로빈과 같은 과산화 활성물질의 존재 또는 농도를 측정하기 위한 새롭고 개선된 시험 장치 및 방법이 포함된다. 시험 장치는 검출가능하거나 측정가능한 반응을 생성하기 위해 과산화 활성물질과 상호작용할 수 있는 지시제 조성물을 혼입시킨 적당한 담체 매트릭스를 포함한 시험 패드를 함유한다. 특히, 벤지딘 지시제 같은 지시 염료(예: 산화-환원 지시제); 히드로과산화물; 금속 이온 착물; 글리세릴-2-포스페이트 또는 페닐 디하이드로겐 포스페이트와 같은 하기 일반식을 갖는 포스포러스 화합물을 포함하는 신규의 개선된 지시제 조성물은 담체 매트릭스 속에 혼입시키고 습윤 상 분석에 사용하여 과산화 활성물질에 대한 시험 샘플의 더욱 정밀하고 정확한 분석을 제공한다.
Figure kpo00001
또는
Figure kpo00002
상기식에서, R1또는 R2는 수소, 탄소수 1 내지 12개를 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬 잔기, 치환되거나 비치환된 방향족 잔기 및 지방족 또는 방향족 다가 화합물의 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, X는 O, S 또는 NH이다.
개선된 방법 및 조성물은 특히 잠복혈에 대한 뇨 분석에 유용하다.

Description

과산화 활성물질 분석용 조성물, 분석장치 및 방법
본 발명은 시험 샘플 속의 과산화 활성물질의 존재를 입증하거나 농도를 측정하기 위한 조성물, 장치 및 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 산화방지 지시제 조성물을 사용하여 잠복혈 같은 과산화 활성물질에 대한 액체 시험 샘플(예: 뇨)을 분석하기 위한 신규한 개선된 방법에 관한 것이다. 습윤 상 분석 또는 무수상 분석에 있어서, 지시제 조성물은 과산화 활성물질을 함유하는 시험 샘플과의 접촉시 반응을 측정하거나 검출할 수 있다. 본 발명의 지시제 조성물은 지시제 조성물과 시험 샘플 사이에서 접촉하기 전에 지시제 조성물내에 존재하는 지시 염료의 효과적으로 방지시켜 과산화 활성물질에 대해 더욱 정확하고 민감한 분석을 제공한다. 따라서, 본 발명의 지시제 조성물에 의해 이루어진 개선된 민감성을 잠복혈에 대한 뇨 분석과 같은 저농도의 과산화 활성물질에 대한 시험 샘플을 분석하는 개선된 방법을 제공한다.
퍼옥시다아제는 과산화물에 의해 페놀 및 아민과 같은 각종 화합물의 산화를 촉매화하는 효소이다. 또한, 특정 화합물은 이들 화합물이 퍼옥시다아제 효소와 유사한 방법으로 작용하기 때문에 슈도퍼옥시다아제(pseudoperoxidases)라고 한다. 따라서, 슈도퍼옥시다아제는 하이드로퍼옥사이드로부터 산소를 유리시키고 산소를 특정 수용체 화합물로 이동시킨다. 따라서, 일반적으로, 슈도퍼옥시다아제는 과산화물과 산화가능한 화합물 사이의 반응을 촉매화하거나 참여하는 효소와 같이 작용한다. 슈도퍼옥시다아제는 또한 과산화 활성물질로 약칭되고 헤모글로빈 및 이의 유도체를 포함한다.
예를 들면, 산소 존재하의 글루코즈, 글루코즈 옥시다아제에 대한 뇨 분석에 있어서, 우선 뇨속의 글루코즈를 글루콘산 및 과산화수소로 전환시킨다. 그 다음, 분석물속에 존재하는 퍼옥시다아제 효소는 과산화수소와 o-톨리딘 같은 산화가능한 염료 화합물 사이의 상호작용을 촉매화한다. 환원된 상태에서 보통 필수적으로 무색인 염료 화합물이 과산화수소와 함께 퍼옥시다아제 촉매화된 상호작용으로 o-톨리딘에 대해 푸른색으로 되는 것처럼 산화반응시 색전이가 일어난다. 색전이의 정도 및 강도는 글루코즈 전환에 의해 생성된 과산화수소의 양에 비례한다. 따라서, 글루코즈 전환에 의해 생성된 과산화수소의 양은 뇨 샘플중의 최초 글루코즈 농도와 관계가 있다.
유사하게는, 헤모글로빈 및 이의 유도체와 같은 과산화 활성물질은 하이드로포옥사이드와 산화가능한 염료사이의 상호작용을 촉매화한다. 이 상호작용에서, 과산화 활성물질은 퍼옥시다아제 효소와 유사한 작용을 하며 산화가능한 염료와 하이드로퍼옥사이드 사이의 상호작용에 참여하거나 이를 촉매화한다. 과산화 활성물질에 의해 하이드로퍼옥사이드로부터 유리된 산소는 산화가능한 염료로 전이된다. 상호작용은 색전이와 같은 검출가능한 반응을 제공하고, 여기서 반응의 강도가 과산화 활성물질의 존재 또는 농도를 나타낸다.
과산화 활성물질에 대한 분석은 위에 언급된 크로모겐 상호작용을 기초로 하고, 여기서, 지시염료 색전이의 정도 및 강도는 시험 샘플 분석에 있어 과산화 활성물질의 농도와 상관관계가 있다. 과산화 활성물질에 대한 분석은 뇨, 분변 또는 위장분비물과 같은 체액샘플중의 종종 잠복혈로 칭해지는 저농도 혈액의 검출 및 측정에 특히 유용하다. 일반적으로 뇨, 분변 또는 구토물속의 잠복혈이 육안으로 볼 수 없을지라도 잠복혈의 검출은 위, 장 및 요도의 출혈진단에 중요하다. 출혈은 예를 들면, 종양, 궤양 또는 기관의 염증에 기인된다. 현재, 시험샘플 중에 잠복혈의 출현을 측정하는 방법은 헤모글로빈 또는 마이오글로빈의 슈도퍼옥시다아제 활성을 기초로 한다.
뇨속의 단백질이 신장기능 장애를 나타내는데 가장 중요한 인자일지라도 뇨속의 혈액의 출현은 또한 신장 또는 요도의 손상을 의미한다. 보통, 검출가능한 잠복혈의 양은 매우 민감한 화학적 방법으로조차 뇨속에 나타나지 않는다. 뇨속의 혈액은 손상되지 않은 적혈구 또는 유리 헤모글로빈으로서 출현될 수 있다. 일반적으로 유리 헤모글로빈의 존재는 혈구가 신장 및 요도를 통해 방광으로 통하는 통로의 외상에 의해, 또는 세포를 용혈시키는 방광중의 뇨를 희석시키기 위한 혈구의 노출에 의해 파열된 것을 의미한다.
더욱 특히, 분뇨속의 혈액의 존재는 암을 포함하는 각종 이상 증세의 징후이다. 잠복혈에 대한 양성 시험에 의해 지적된 것처럼 뇨속의 혈액의 존재는 요도내의 출혈을 가리킨다. 유리 헤모글로빈은 신장장애, 감염성 질병, 신생물 또는 요도의 외상 때문에 뇨속에 나타난다. 뇨속의 유리 헤모글로빈은 또한 수혈반응, 용혈성 빈혈 또는 발작성 혈색소뇨증을 나타낼 수 있고, 또는 각종 중독 및 심한 화상으로 나타날 수 있다. 특히, 적혈구가 존재하지 않는 헤모글로빈에 대한 양성 화학 시험은 외적 근육손상의 결과로서 마이오글로빈뇨증을 나타낼 수 있다.
혈색소뇨증은 적혈구가 없는 뇨속의 유리 헤모글로빈의 존재로서 규정된다. 대조적으로, 혈뇨는 뇨속의 손상되지 않은 적혈구의 존재로서 규정된다. 혈뇨는 신장의 미시적 작용 단위(네프론)내의 특정 결함을 나타내거나 신장, 요관, 방광 또는 요도내의 출혈을 의미한다. 혈장속의 유리 헤모글로빈은 신장에 의해 뇨로 배설된다. 몇몇 상황에서, 적혈구의 용혈반응은 혈구가 뇨에 들어간 후 발생한다. 적혈구를 함유하는 대부분의 뇨 샘플은 약간의 용혈된 잠복혈을 함유한다. 현실적으로, 유리 헤모글로빈에 대한 혈구로서의 혈액의 미량의 차이는 중요하지 않다.
근육조직의 적색 호흡 색소인 마이오글로빈은 또다른 과산화 활성물질이다. 마이오글로빈은 이의 조성 및 화학적 반응이 헤모글로빈과 매우 유사하다. 마이오글로빈은 특정 형태의 부상에 의해 근육세포로부터 유리될 수 있고, 이러한 경우 마이오글로빈은 혈장내에서 순환된 다음 뇨로 배설된다. 또한, 특정한 유전적 근육장애도 마이오글로빈의 손실을 야기시켜 뇨속에 연속적으로 나타날 수 있다. 또한, 마이오글로빈은 심근경색 후 뇨속에서 발견된다.
혈뇨, 혈색소뇨증 또는 마이오글로빈뇨증은 임상적 및 병리학적 질환의 정확한 특성에 좌우되고 특이성 질환 또는 부상의 중증도에 좌우된다. 특히, 다른 과산화 활성물질은 류코사이트 및 박테리아내에 존재한다. 전반적으로, 과산화 활성물질의 검출은 신장 및 요도의 염증 및 감염의 진단에 특히 중요하다.
따라서, 과산화 활성물질에 대한 뇨 및 다른 시험 샘플의 정밀하고 완벽한 분석은 실험실 및 가정에서 이용할 수 있다. 분석은 정확한 진단을 할 수 있고, 정확한 의학적 치료를 수행하고, 탐지하며 유지할 수 있도록 과산화 활성물질의 검출 및 측정이 허용되어야 한다. 또한, 분석 방법이 침적-및-판독 형태로 쉽고 경제적으로 사용되는 경우, 뇨 및 다른 시험 샘플속의 과산화 활성물질의 정성적 또는 정량적 측정에 유리하다.
또한, 뇨 또는 다른 시험 샘플속의 과산화 활성물질에 대한 다른 분석방법은 과산화 활성물질과의 상호작용의 결과로서 색전이가 나타나는 지시제 조성물을 활용하여 정밀하고, 확실하며 재현가능한 결과를 수득해야 하고, 과산화 활성물질보다 시험 샘플 성분과의 상호작용이 우선되거나 지시제 조성물의 불용성 때문에 발생하는 색전이와 같은 경쟁적인 화학적 또는 물리적 상호작용의 결과로서는 나타나지 않는다. 더우기, 과산화 활성물질에 대한 분석방법이 뇨 또는 다른 시험 샘플속의 과산화 활성물질의 신속하고, 경제적이며 정밀한 측정을 위해 습윤 상 분석 및 무수 상 시약 스트립(strip) 둘다에 사용하기에 적당한 경우 유리하다. 부가적으로, 과산화 활성물질 분석에 사용되는 방법 및 조성물은 다결정적인 시약 스트립에 존재하는 다른 시험 시약 패드에 악영향을 끼치거나 간섭하지 않는다.
따라서, 개인이 과산화 활성물질을 분비하는지를 측정하고 치료효과를 측정하기 위한 의학적 치료과정을 탐지하기 위하여, 잠복혈 같은 과산화 활성물질에 대한 단순하고, 정확하며 저렴한 검출분석이 개발되었다. 더우기, 뇨속의 잠복혈의 검출 또는 측정을 위해 개발된 몇몇 상이한 분석방법중에 침적-및-판독 무수 상 시험 스트립을 토대로 한 방법은 무수 상 시험 스트립 방법이 쉽게 자동화되고, 재현되며 정밀한 결과를 제공하기 때문에 특히 유용한 것으로 입증된다.
과산화 활성물질 분석에 사용된 어떤 시험 스트립은 벤지딘 염료; 하이드로퍼옥사이드 및 완충액과 같은 지시염료를 함유하는 지시제 조성물을 침윤시킨 적당한 담체 매트릭스(matrix)의 작은 정사각형 패드로 구성된 단일 시험 영역을 갖는다. 기타 시험 스트립은 위에 기술된 것처럼 과산화 활성물질의 분석을 위한 하나의 시험 영역을 포함하고, 다른 뇨 구성성분의 동시분석을 위해 동일한 스트립 상에 몇몇 시험영역을 추가로 포함하는 다결정적인 시약 스트립이다. 두 종류의 비색 시험 스트립에 대해, 뇨속의 과산화 활성물질의 분석은 잘 혼합된 원심분리되지 않은 뇨 샘플에 비색 시험 스트립을 침지시켜, 생성된 시험 스트립의 시험 영역 색을 비색 시험 스트립 병에 제공된 표준색 도표와 비교한다. 일반적으로 잠복혈 시험에서는 초기에 출혈 상태를 검출하는 것이 중요하기 때문에 일상의 물리적 시험 동안에 뇨 샘플을 선별하기 위해 다결정적인 시약 스트립을 대상으로 하는 것이 포함된다.
시험 스트립 방법은 뇨속의 혈액의 존재에 대한 가장 간단하고 직접적인 분석이다. 시험 영역은 테트라메틸벤지딘 같은 산화가능 지시염료 및 완충된 하이드로퍼옥사이드로 함침시킨다. 시험영역은 뇨 샘플속에 존재하는 헤모글로빈이 하이드로퍼옥사이드에 의해 테트라메틸벤지딘의 산화반응을 촉진시키는 경우 초록색이 암청색으로 된다. 시험영역 상에 초록색 점이 확산되면, 이는 손상되지 않고 용혈되지 않은 적혈구를 나타낸다. 위의 방법에 따라, 뇨 샘플속의 과산화 활성물질의 농도는 가시적으로 각각 쉽게 결정된다. 시험 스트립의 색은 시험 스트립을 뇨에 침지시키고 대략 1분 후에 색 도표와 비교한다. 색 도표 상의 색 블록은 혈액의 부재, 용혈되지 않은 미량의 혈액, 용혈된 미량의 혈액, 소량(1+)의 혈액, 적절한 양(2+)의 혈액 및 다량(3+)의 혈액을 나타낸다. 색 도표 범위는 오렌지색에서 초록색을 거쳐 청색까지이다. 일반적으로 분석은 유리 헤모글로빈이 약 0.015 내지 약 0.06㎎/dL 또는 손상되지 않은 적혈구 약 5 내지 약 20개/μl를 검출할 수 있다.
또한, 아스코르베이트 이온이 존재하는 경우, 상기한 과산화 활성 화합물 분석방법에 심각하게 간섭한다. 지시제 조성물 중에 특정 금속 이온 착물이 함유되면 아스코르베이트 간섭 문제가 제거된다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 일반적으로, 금속 이온 착물은 퍼옥시다아제 활성이 입증되고 하이드로퍼옥사이드와 산화가능한 염료 사이의 색 형성 반응을 촉매화하기 위하여 퍼옥시다아제 또는 슈도퍼옥시다아제와 유사하게 작용한다. 따라서, 금속 이온 착물이 아스코르베이트 간섭을 제거할지라도, 금속 이온 착물은 금속 이온 착물이 하이드로퍼옥사이드에 의해 산화가능한 염료의 산화반응을 촉매화할 수 있기 때문에 적절하지 않은 포지티브(positive) 분석을 제공할 수 있고, 이로 인해 과산화 활성물질이 시험 샘플속에 존재하지 않을때조차도 장치내의 색 변화가 발생한다. 더구나, 과산화 활성물질이 시험 샘플 중에 존재할 경우, 잘못된 분석결과가 금속 이온 착물에 의해 조정된 추가의 염료 산화반응 때문에 발생할 수 있다.
이후 더욱 충분히 논의되는 바와 같이, 연구자들은 특정 제2철 이온 착물이 본질적으로 적절치 않은 포지티브 분석을 감소시키고 잘못된 분석결과는 아스코르베이트 간섭을 방지하는데 사용된 대부분의 금속 이온 착물 때문인 것으로 밝혀냈다. 그러나, 제2철 이온 착물이 효과적으로 아스코르베이트 간섭을 방지하고 본질적으로 감소된 과산화 활성을 입증할지라도, 산화가능 지시염료의 조기 산화의 문제점은 완전히 제거하지 못한다. 예를 들면, 제2철 이온 착물, 하이드로퍼옥사이드 및 산화가능 지시염료를 함유하는 무수 상 시험 스트립을 장시간 저장한 후에도 여전히 색 전이가 나타나고, 또는 과산화 활성물질이 없는 시험 샘플에 대한 적절치 않은 포지티브 분석 결과를 가져온다.
따라서, 저농도의 과산화 활성물질에 대해 간단하고, 정밀하며 확실한 뇨 분석방법을 갖는 것이 매우 유리하다. 현재, 과산화 활성물질에 대한 시험 스트립은 적절치 않은 포지티브 분석을 제공하는 것으로 인하여 지시염료가 조기산화되는 단점을 갖는다. 놀랍게도 예기치않게, 본 발명의 조성물 및 방법은 지시염료의 조기산화를 방지하고, 따라서 적절치 않은 포지티브 분석의 문제가 해결되며, 아스코르베이트 간섭을 방지하기 위한 금속 이온 착물 같은 화합물의 존재가 여전히 허용된다. 뇨속의 과산화 활성물질 농도의 더욱 정밀한 측정방법을 제공함으로써, 침적-및-판독 시험 스트립과 같이 사용하기 쉬운 형태의 뇨 분석을 실험자가 수행하여 중간체 및 확실한 시험결과를 수득할 수 있다. 또한, 시험 스트립 방법은 뇨속의 과산화 활성 화합물 농도를 더욱 정확히 탐지하고/하거나 환자를 성공적으로 치료할 수 있도록 집에서 환자가 수행할 수 있다.
이후 더욱 충분히 논의되는 바와 같이, 본 발명의 방법은 본 발명의 지시제 조성물을 함침시킨 적절한 담체 매트릭스를 포함하는 시험 패드를 함유한 시험 스트립을 사용하여 과산화 활성물질에 대한 신속하고, 정밀하며 확실한 분석이 이루어진다. 지시제 조성물은 지시염료, 하이드로퍼옥사이드, 금속 이온 착물 및 2개 이상의 유리산 작용기를 포함하는 인 화합물을 함유한다. 지시제 조성물은 과산화 활성물질의 저 농도에 민감하고, 분석시 아스코르브산 간섭을 방지하며, 놀랍게도, 적절치 않은 포지티브 분석을 이끄는 금속 이온 착물 및 하이드로퍼옥사이드에 의해 지시염료의 조기산화를 필수적으로 방지한다. 따라서, 분석의 민감성이 향상되어 지시제 조성물의 안정성이 증가되고, 이로 인하여 과산화 활성물질에 대한 더욱 정밀하고 확실한 분석이 제공된다.
본 발명 이전에, 지시 염료, 하이드로퍼옥사이드, 아스코르베이트 간섭을 방지하는 금속 이온 착물 및 지시제 조성물을 안정화시키고 필수적으로 금속 이온 착물 및 하이드로퍼옥사이드에 의해 지시염료의 조기산화를 방지하는 2개 이상의 유리산 작용기를 포함하는 인 화합물을 포함하는 지시제 조성물이 함유된 과산화 활성물질에 대한 뇨 또는 다른 시험 샘플의 분석방법이 공지되어 있지 못했다. 결국, 과산화 활성 화합물에 대해 정밀하고 확실하게 분석할 수 있도록 분석의 민감성이 증가되어 지시제 조성물의 안정성이 향상된다. 무수 상 시험 스트립이 o-톨리딘 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, 제2철 이온 착물 및 이미 사용된 하이드로퍼옥사이드와 같은 산화가능 지시염료를 포함할지라도, 무수 상 시험 스트립에는 지시염료의 산화 때문에 조기에 색전이가 나타나는 경향이 입증된 이들 3개 화합물을 혼입시킨다. 따라서, 적절치 않은 포지티브 분석은 시험 샘플속의 과산화 활성물질에 대한 시험 스트립의 유용성 및 민감성을 감소시킨다.
선행기술에는 과산화 활성물질에 대한 뇨 분석에 사용된 습윤 상 화학작용 및 무수 상 화학작용에 관련된 다수의 참조문헌이 있다. 예를 들면, 연구자들은 지시염료의 과산화 산화반응의 효소형 촉매작용에 좌우되는 과산화 활성물질에 대한 습윤 화학적 분석방법 및 무수 상 시험 스트립 장치를 개발하였다. 과산화 활성물질에 대한 습윤 화학적 분석의 예는 문헌[참조: R.M. Henry, et al., Clinical Chemistry Principles and Techniques, 2nd ed., Harper and Row, pp.1124-1125 (1974)]에 나타나 있다. 당해 습윤 상 분석방법은 완충제로서의 빙초산, 지시염료로서의 디페닐아민 및 과산화수소를 사용한다. 이런 습윤상 분석이 분석적으로 유용할지라도, 이들은 시약 안정성이 불량하고 및 분석 민감성이 불완전하다는 단점이 있다. 예를 들면, 습윤 상 분석에서 사용된 시약 용액은 안정성 및 민감성이 빠르게 감소한다. 그런 까닭에, 새로운 시약 용액은 며칠동안 저장한 후 제조해야 한다. 새로운 시약 용액의 연속제조는 값이 비싼 시약이 낭비되기 때문에 비경제적이고 시간적으로 손해이다.
과산화 활성물질에 대한 바람직한 분석방법은 무수 상 시험 스트립 장치를 사용하는 것이다. 전형적인 무수 상 시험 스트립은 헤마스틱스(HEMASTIX
Figure kpo00003
)라는 상표로, 마일즈 인코포레이티드(Miles, Inc., Diagnostics Division)에서 시판된다. 시험 스트립은 페이퍼 매트릭스와 같은 다공성 담체 매트릭스를 포함하는 시험 패드를 함유하고, 유기 하이드로퍼옥사이드와 지시염료의 완충된 혼합물을 함침시켜 플라스틱 스트립 또는 핸들에 부착시킨다. 시험 패드를 헤모글로빈, 마이오글로빈, 적혈구 또는 다른 과산화 활성물질을 함유하는 시험 샘플속에 침지시키고, 시험 패드를 청색으로 현색시킨다. 청색의 명암도는 시험 샘플속의 과산화 활성물질 농도에 비례한다. 시험 패드에 현색된 색을 표준색 도표와 비교하여, 분석 전문가가 정량적으로 시험 샘플속에 존재하는 과산화 활성물질의 양을 결정한다.
일반적으로, 무수 상 시험 스트립은 시약의 연속제조 장치와 부수 장치가 필요치 않은 시험 스트립 형태를 사용하기가 쉽기 때문에 습윤 상 분석보다 더욱 유리하다. 특히, 정밀하고, 민감하며 경제적인 개선된 분석의 결과에 의한 시약 안정화가 시험 스트립에서 우수하다. 현재 과산화 활성물질 측정을 위한 무수 시험 스트립이 실질적으로 습윤 상 분석보다 더욱 안정하고 민감함에도 불구하고, 현재 시험 스트립은 안정화 및 민감성의 개선이 필요하다. 따라서, 시험 스트립이 과산화 활성물질에 더욱 민감하고 저장하는 동안 더욱 안정된 경우 진단분석기술이 현저히 개선될 것이다. 본 발명의 조성물, 장치 및 방법으로 이들에 대한 개선을 이루었다.
안정성 및 민감성을 증가시키기 위한 목적을 달성하기 위해 선행기술에서 몇번 시도한 것으로 알려졌다. 예를 들면, 문헌[참조: Chemical Abstracts, Vol. 85, p.186 (1976)]에 o-톨리딘 및 페닐이소프로필 하이드로퍼옥사이드를 함유하는 무수 상 시험 스트립을 제조하는 2침적 방법이 기술되었다. 이 방법에서, 에틸 셀룰로즈로 함침시킨 여과지 스트립을 지시제, o-톨리딘 하이드로클로라이드, 폴리비닐피롤리돈, 계면활성제 및 pH 3.7을 제공하는데 충분한 시트레이트 완충액을 함유하는 에탄올성 용액에 침적시킨다. 함침된 여과지를 건조시키고, 계속해서, 1,4-디아조비사이클로[2.2.2]옥탄, 페닐이소프로필 하이드로퍼옥사이드 및 에탄올-톨루엔 혼합물에 용해된 폴리비닐피롤리돈을 함유하는 두번째 용액에 침적시킨다. 연구자들은 비사이클로옥탄 화합물 및 폴리비닐피롤리돈을 사용하여 하이드로퍼옥사이드 및 지시제를 안정화시키고자 한다.
또다른 시험 스트립 및 방법은 리터스도르프(Rittersdorf) 등의 미합중국 특허 제3,853,471호에 기술되어 있다. 리터스도르프는 과산화 활성물질에 대한 분석에 사용된 시험 스트립의 안정화에 대한 인산 아미드 또는 포스폰산 아미드의 용도를 기술하였다. 리터스도르프에 의해 기술된 인산 아미드 및 포스폰산 아미드는 트리아미드 및 디아미드이고, 여기서 치환체 아미도 그룹은 우선적으로 N-모폴린 잔기이며, 인산 또는 포스폰산 아미드상에 남아있는 유리산 작용기는 없다.
아담스(Adams)등의 미합중국 특허 제3,252,762호에는 시험 스트립 안정화를 위해 젤라틴과 같은 콜로이드 상 물질속에 유기 하이드로퍼옥사이드를 물리적으로 캡슐화하는 것이 기술되어 있다. 따라서, 수성 시험 샘플을 시험 스트립과 접촉시키는 경우, 젤라틴 캡슐이 용해되고, 이로 인해 지시염료와의 과산화 활성물질 매개된 상호작용을 위해 하이드로퍼옥사이드가 유리된다. 그러나, 아담스의 캡슐화 공정은 시간이 허비되고 비교적 고가의 장치 및 과도한 다수처리 단계가 요구된다. 각각의 공개된 이들 선행기술은 잠재적으로 상반되는 시약 성분(즉, 하이드로퍼옥사이드 및 지시염료)이 초기에 영향을 미치지 않도록 시험 스트립의 시험 패드에 안정화제를 혼입시키고, 이로 인해 적절치 않은 포지티브 시험을 제공하거나 과산화 활성물질에 덜 민감한 시험 스트립을 제공한다.
미합중국 특허 제3,975,161호에는 유기 하이드로퍼옥사이드, 산 완충제, 크로모겐, 습윤제, 고체 필름 형성 천연 또는 합성 중합체성 물질 및 촉진제를 함유하는 조성물로 함침시킨 흡수성 담체를 포함하는 시험 스트립이 기술되어 있다. 촉진제는 이소퀴놀린 또는 이소퀴놀린 유도체이다. 산염 또는 퀴놀린 및 퀴놀린 유도체의 첨가물은 과산화 활성물질 검출에 대해 시약 조성물 중의 상승제로서 미합중국 특허원 제3,986,833호에 기술되어 있다.
쿠(Ku)의 미합중국 특허 제3,411,887호에는 글루코즈 산화효소와 같은 효소적 산화물질에 좌우되는 시약 조성물로 아스코르베이트 트래핑 시스템(trapping system)을 사용하여 아스코르베이트 간섭을 방지하는 것이 기술되어 있다. 트래핑 시스템은 산화환원 지시염료와 아스코르베이트 사이의 산화-환원 반응 포텐셜이 감소하는 중금속 이온을 사용한다. 예로서 인용되는 적당한 중금속 화합물에는 코발트, 철, 수은 및 니켈이 포함된다.
쿠의 기술 외에, 선행기술에는 Co (Ⅲ)와 같은 금속 이온이 실제적으로 슈도퍼옥시다아제인 것으로 기술되어 있다. 예를 들면, 문헌[참조: The Merck Index, 9th ed., p.311 (1976)]에는 Co (Ⅲ) 아세테이트를 사용하여 큐멘 하이드로퍼옥사이드를 촉매분해시킨 것이 기술되어 있다. 또한, 퍼옥사이드를 촉매 분해시키기 위한 Co (Ⅲ) 착물 계열이 문헌[참조: K. Lohs, Monatsber. Deut. Akad. Wiss. Berlin, 8, pp.657-659 (1966)]에 보고되었다. 따라서, 선행분야에는 적절치 않은 포지티브 결과를 생성하거나 잠복혈과 같은 과산화 활성물질에 관계는 비반응성 조성물로 여겨지는 지시제와 하이드로퍼옥사이드 사이에 유익하지 못한 상호작용이 기인되는 과산화 활성물질 측정을 위해 전형적인 지시제 조성물에 이런 금속 이온 착물을 사용하는 것이 교시되어 있다. 사실, 실패한 잠복혈 시험 중에는 수은 사르코신에이트와 같은 수은 착물을 사용하여야 한다.
마얌발라-마니카(Mayambala-Mwanika) 등의 미합중국 특허 제4,587,220호에는 과산화 활성물질 분석에 아스코르브산 및 아스코르베이트 이온의 간섭을 방지하기 위해 킬레이트된 제2철 이온을 사용하는 것이 기술되어 있다. 당해 특허에는 N-(2-하이드록시에틸)에틸렌디아민트리아세트산(Fe-HEDTA)의 제2철 킬레이트 같은 제2철 킬레이트가 아스코르베이트 간섭을 방지하고 과산화 활성 화합물에 대한 적절치 않은 포지티브 시험을 진행시키지 못하게 하는 것으로 기술되어 있다. 당해 방법에 따라서, 과산화 활성물질의 시험장치는 시험 패드의 담체 혼합물에 제2철 킬레이트 및 하이드로퍼옥사이드를 먼저 혼입시켜 제조한다. 그리고나서, 건조시킨 후, 지시 염료를 담체 매트릭스에 혼입시킨다. 시험장치를 제조하는 이 2단계 방법은 보관하는 동안 적절치 않은 포지티브 분석 결과를 방지하여 안정화가 충분히 입증된 아스코르베이트 저항시험 패드를 제공한다.
이스마일(Ismail) 등의 미합중국 특허 제4,755,472호에는 지시제에 대한 하이드로퍼옥사이드의 몰비가 약 0.9 내지 3.0인 1,4-디이소프로필벤젠 디하이드로퍼옥사이드 및 벤지딘 지시제로 함침시킨 담체 매트릭스를 포함한 과산화 활성물질 분석에 적당한 시험 패드가 기술되어 있다. 또한, 제2철 킬레이트는 아스코르베이트 저항을 조건으로 포함시킬 수 있다. 시험 패드는 저장하는 동안 안정하고 퍼옥시다아제/칼륨 요오다이드 지시제를 기초로 하는 글루코즈 시험 패드와 같은 다측정 시험 스트립에 존재하는 다른 시험 패드에 대해 적절치않은 포지티브 시험이 유도되지 않는다.
램(Lam)의 미합중국 특허 제4,071,318호에는 하이드로퍼옥사이드, 지시염료 및 비사이클릭 붕산염 에스테르를 함유하는 과산화 활성물질 측정용 조성물이 기술되어 있다. 당해 특허에는 비사이클릭 붕산염 에스테르가 하이드로퍼옥사이드로 착화되고, 이로 인해 보관하는 동안 하이드로퍼옥사이드가 지시염료와의 상호작용에서 배제되는 것으로 이론화되어 있다. 안정화가 향상된 조성물은 지시염료의 조기산화를 감소시켜 과산화 활성물질에 대한 더욱 정밀한 분석을 제공한다.
본 발명의 조성물은 선행기술 및 현재 시판되는 시험 스트립과 대조적으로 시험 스트립에 증가된 안정성을 부여하므로 시험 샘플속의 과산화 활성물질의 검출 및 측정시 시험 스트립의 민감성이 증가된다. 본 발명의 방법은 지시염료를 과산화 활성물질을 함유하는 시험 샘플과 접촉시킬때까지 지시 염료의 산화를 효과적으로 방지하는 지시제 조성물을 사용한다. 놀랍게도, 본 발명의 방법 및 조성물은 필수적으로 색을 형성시키지 않거나 금속 이온 착물 및 하이드로퍼옥사이드에 의한 지시 염료의 조기산화에 기인하는 기타 검출가능 반응을 방지한다. 그러므로, 본 발명의 방법에 따라서, 산화방지 지시제 조성물을 사용하여 과산화 활성물질에 대한 뇨 및 다른 시험 샘플의 무수 상 시험 스트립분석 및 습윤 상 분석에 의해 새롭고 기대하지 않은 결과가 나온다.
요컨대, 본 발명은 시험 샘플 중의 성분의 존재를 입증하거나 농도를 측정하기 위한 신규한 개선된 조성물, 시험장치 및 방법에 관한 것이다. 장치에는 검출가능 반응을 일으키는 시험 샘플 성분과 상호작용이 가능한 지시제 조성물을 혼입시킨 적당한 담체 매트릭스를 포함한 시험 패드가 장착된다. 가정용으로, 지시제 조성물은 가시적 검출가능 반응을 일으킨다. 실험실용으로, 지시제 조성물은 가시적 검출가능 반응 또는 기기에 의한 검출가능 반응을 일으킨다. 시험 패드의 담체 매트릭스는 여과지와 같은 흡수성 물질; 스트립, 중합체 물질의 층 또는 막과 같은 비흡수성 물질 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 지시제 조성물을 담체 매트릭스에 균질하게 혼입시키고, 담체 매트릭스는 예비측정한 시험 샘플 성분으로 담체 매트릭스 침투성을 유지시키는 동안 담체 매트릭스 전체에 걸쳐 지시제 조성물을 균질하게 유지시킨다.
특히, 본 발명은 신규한 개선된 지시제 조성물을 사용하여 과산화 활성물질에 대한 뇨 또는 다른 시험 샘플을 분석하는 방법에 관한 것이다. 지시제 조성물이 과산화 활성물질에 대하여 색전이가 가능한 산화환원 지시제와 같은 지시 염료(a), 하이드로퍼옥사이드(b), 제2철 이온 착물과 같은 금속 이온 착물(c) 및 글리세릴-2-포스페이트 또는 페닐디하이드로겐 포스페이트와 같은 하기 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물(d)을 함유하는 것으로 입증되었고; 안정성의 향상이 입증되며, 따라서 과산화 활성물질에 대한 민감성이 증가된다.
Figure kpo00004
Figure kpo00005
상기식에서, R1및 R2는 각각 수소, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 1 내지 12의 알킬 잔기, 치환되거나 치환되지 않은 방향족 잔기 및 지방족 또는 방향족 다가 화합물 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, X는 O, S 또는 NH이다.
본 발명의 중요한 특징에 따라서, 시험 샘플 중의 과산화 활성물질의 더욱 정밀하고 정확한 정량적 또는 정성적 측정은 지시제 조성물과 과산화 활성물질을 포함하는 시험 샘플 사이에 접촉시키기 전에 지시염료의 산화로 색형성을 효과적으로 방지하는 지시제 조성물때문에 수행된다. 임상시험 방법중 본 발명의 지시제 조성물을 활용하여, 뇨 또는 다른 시험물질내의 헤모글로빈과 같은 과산화 활성물질에 대한 정량 또는 정성 분석은 지시염료의 조기산화 때문에 지시제 조성물이 적절치 않은 포지티브 분석치를 수득할 수 없으므로 더욱 정밀하다.
따라서, 액체 시험 샘플속의 화학적 화합물의 상대농도를 측정하기 위한 신규한 개선된 방법 및 시험장치를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명의 또다른 목적은 과산화 활성물질에 대한 뇨 및 다른 시험 샘플을 분석하는 간단하고, 정확하며, 정밀하고 재현가능한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 과산화 활성물질에 대한 증가된 민감성을 제공하는 안정하고, 산화를 방지하는 지시제 조성물을 사용하여 과산화 활성물질에 대한 뇨 또는 다른 액체 시험 샘플의 분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 저농도의 과산화 활성물질에 민감하고 실질적으로 적절치 않은 포지티브 분석을 방지하는 생리학적 시험 샘플의 분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 시험 샘플 1조(one trillion parts)당 잠복혈 약 1부 정도로 낮은 농도에서 잠복혈 검출이 매우 민감한 뇨 또는 다른 액체 시험 샘플속의 잠복혈 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 금속 이온 착물, 하이드로퍼옥사이드, 지시 염료 및 지시제 조성물에 존재하는 조기산화 지시염료를 필수적으로 방지하는, 2개 이상의 유리산 작용기를 함유하는 인 화합물을 포함하는 지시제 조성물을 사용하여 과산화 활성물질에 대한 뇨 또는 다른 시험 액체의 분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 시험 샘플과 접촉시키기전에 지시염료의 산화를 효과적으로 방지하고, 시험 샘플속의 과산화 활성물질과 상호작용할 수 있고, 시험 샘플속의 과산화 활성물질의 존재 또는 농도를 입증하기 위해 검출가능하고 측정가능한 색전이를 나타내는 안정한 지시제 조성물을 사용하여 뇨 또는 다른 시험 샘플의 분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 시험 샘플속의 과산화 활성물질과 상호작용을 위해 시험 샘플속의 과산화 활성물질의 농도를 나타내는 시험장치의 색변화와 같은 가시적인 변화를 나타내는 신규한 개선된 시험장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 저농도의 과산화 활성물질에 민감하고, 아스코르베이트 간섭 방지에 우수한 것으로 입증되며, 우수한 저장성을 갖고 과산화 활성물질에 대한 적절치 않은 포지티브 분석 결과를 필수적으로 제거하는 조성물 및 시험장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 과산화 활성물질과 접촉하여 색전이가 가능한 안정한 산화방지 지시제 조성물을 제공하는 것이고, 여기서, 지시제 조성물은 산화가능 지시 염료, 하이드로퍼옥사이드, 금속 이온 착물 및 하기 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물을 함유한다.
Figure kpo00006
Figure kpo00007
상기식에서, R1및 R2는 각각 수소, 치환되지 않거나 치환된 탄소수 1 내지 12의 지방족 잔기, 치환되지 않거나 치환된 방향족 잔기 및 지방족 또는 방향족 다가 화합물 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, X는 O, S 또는 NH이다.
본 발명의 위와 동일하거나 다른 목적 및 이점 및 신규한 특색은 지시제 조성물, 시험장치, 및 과산화 활성물질에 대한 액체 시험 샘플의 습윤 상 및 무수 상 분석을 설명하는 본 발명의 바람직한 양태에 대한 다음의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.
본 발명의 방법에 따라서, 뇨 및 다른 시험 샘플속의 헤모글로빈 및 마이오글로빈과 같은 과산화 활성물질에 대한 정량 또는 정성 분석은 지시 염료, 금속 이온 착물, 하이드로퍼옥사이드 및 2개 이상의 유리산 작용기를 함유하는 인 화합물을 포함하는 산화 방지 지시제 조성물을 사용하여 수행한다. 본 발명의 지시제 조성물을 사용함으로써, 지시제 조성물과 시험 샘플 사이에 접촉하기 전에 금속 이온 착물 및 하이드로퍼옥사이드에 의한 지시염료의 조기 산화를 반드시 제거한다. 지시염료를 과산화 활성물질을 함유하는 시험 샘플과 접촉시킨 후, 시험 샘플 중의 과산화 활성물질에 의해 전달된 하이드로퍼옥사이드와의 상호작용에 대한 반응으로 색전이가 쉽게 나타난다.
또한, 지시제 조성물속에 포함된 금속 이온 착물은 분석에서 아스코르베이트 간섭을 제거하고, 놀랍게도, 금속 이온 착물은 시험 샘플속의 과산화 활성물질로 제공된 색전이 반응에 기여하지 못한다. 따라서, 저농도의 과산화 활성물질에 대한 분석의 정밀도 및 민감성은 증가된다. 본 발명의 방법으로 수득된 저농도의 과산화 활성물질에 대한 개선된 정밀도 및 증가된 민감성은 잠복혈에 대한 뇨 분석에 특히 유용하다.
잠복혈에 대한 상업적으로 유용한 뇨 분석은 안정하고, 민감하여 아스코르브산 간섭을 방지한다. 유용한 잠복혈 분석을 위해 안정성 및 민감성 필요치가 규정된다. 예를 들면, 뇨 샘플 1조부당 잠복혈 1부 이상, 또는, 동등하게는, 뇨 1㎗당 헤모글로빈 0.015㎎, 또는 뇨 1ℓ당 헤모글로빈 2×10-9몰의 민감성이 필요하다. 또한, 앞에서 논의된 것처럼, 아스코르브산 및 아스코르베이트 이온은 산화환원 지시염료를 기초로 한 진단시험에 일반적으로 간섭한다. 잠복혈에 대한 뇨의 분석에서 아스코르브산 간섭은 방지기술이 잘 공지되어 있어 제거할 수 있다. 아스코르브산은 지시염료의 산화반응을 간섭하므로 시험 샘플 중의 아스코르브산은 과산화 활성물질에 대한 뚜렷한 네가티브(negative) 음성결과를 나타낸다. 따라서, 아스코르베이트 방지는 뇨 샘플이 샘플 1dl당 대략 50㎎의 아스코르브산을 함유하는 경우 지시염료의 색전이가 사소한 간섭으로서 정의된다.
아스코르베이트 방지는 지시제 조성물에 금속 이온 착물을 가하여 본 발명의 시험장치에 전달된다. 그러나, 제2철 착물 및 코발트(Ⅲ) 착물과 같은 금속 이온 착물은 고유의 과산화 활성을 갖는다. 따라서, 금속 이온 착물은 헤모글로빈과 같은 과산화 활성물질 및 촉매에 동일한 방법으로 작용되거나, 지시염료의 색형성 하이드로퍼옥사이드 산화반응에 관여할 수 있다. 따라서, 지시염료는 저장하는 동안 조기산화할 수 있거나, 지시 염료의 일부가 분석되는 동안에 금속 이온에 의해 산화되어 적절치 않은 포지티브 또는 잘못된 고분석 결과를 얻는다. 마얌발라-마니카 등의 미합중국 특허 제4,587,220호에 적절치 않은 포지티브 또는 잘못된 고분석 결과로 지시염료 안정화가 감소된 문제점을 실질적으로 완화시키기 위해 코발트(Ⅲ)와 같은 다른 금속 이온의 착물에 상반된 것으로서 특정한 제2철 이온 착물의 사용이 기술되어 있다. 그러나, 그럼에도 불구하고 이들 문제점은 과산화 활성물질 분석을 위한 현재의 방법 및 장치에 여전히 존재한다. 놀랍게도, 본 발명의 조성물 및 방법은 제2철 이온 또는 코발트(Ⅲ) 이온 착물과 같은 금속 이온 착물, 및 하이드로퍼옥사이드에 의해 지시염료의 조기산화 문제점을 제거하여 시험 샘플 중의 과산화 활성물질에 대한 정밀하고 민감한 분석을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
잠복혈과 같은 과산화 활성물질에 대한 요즈음의 통상적인 분석은 뇨 중 헤모글로빈 농도를 약 0.015㎎/dl로 검출할 수 있다. 건강한 개인의 뇨에는 헤모글로빈이 없다. 그러므로, 뇨 중의 저농도 헤모글로빈의 검출은 뇨 중의 헤모글로빈이 추가로 연구해야할 질병 또는 손상된 상태를 의미하기 때문에 임상학적으로 중요하다. 따라서, 하기에 충분히 토의될 것인 바, 본 발명의 방법 및 장치는 뇨속의 저농도 과산화 활성물질을 정밀하게 분석한다. 본 발명의 방법 및 장치하에 사용된 조성물은 안정하고 아스코르베이트 간섭을 방지하고, 시험 샘플속의 과산화 활성물질 농도에 대한 색전이를 나타내고, 이로 인해 과산화 활성물질에 대한 민감하고 확실한 분석을 제공한다.
더구나, 뇨 분석에 추가로, 본 발명의 방법 및 장치는 혈액혈장 또는 혈청, 분변, 및 위장 내용물중의 과산화 활성물질의 존재 또는 정량적 농도 측정을 위해 사용할 수 있고; 보다 일반적으로 많은 기타 생물학적 체액 및 반고체의 과산화 활성물질 농도의 측정을 위해 사용할 수 있다. 일반적으로, 어떠한 수성 시험샘플, 또는 수성 용매 중에 용해되는 시험 샘플이라도 분석할 수 있다. 본 발명의 또다른 중요한 특색에 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 수성, 액체상 분석과 뇨 또는 다른 시험 샘플속의 과산화 활성물질의 존재를 입증하거나 농도를 측정하기 위한 무수 상 시험 스트립 분석에 본 발명의 장점을 수득하기 위해 사용할 수 있다.
놀랍게도, 금속 이온 착물, 지시염료 및 하이드로퍼옥사이드를 함유하는 지시제 조성물에도, 지시제 조성물의 안정성을 실질적으로 증가시키고, 오늘날 과산화 활성물질에 대한 적절치 않은 포지티브 분석 및 잘못된 고분석 결과의 문제를 필수적으로 제거하는 2개 이상의 유리산 작용기를 함유하는 적당한 인 화합물이 포함되는 것으로 밝혀졌다.
하기에 보다 상세히 기술하는 바와 같이, 조성물의 안정성을 증가시키고, 헤모글로빈과 같은 과산화 활성물질에 대한 분석의 정밀도, 민감성 및 정확성을 증가시키는 것으로 알려진 인 화합물을 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)로 나타낸다.
Figure kpo00008
Figure kpo00009
상기식에서, R1및 R2는 각각 수소, 치환되지 않거나 치환된 탄소수 1 내지 12의 지방족 잔기, 치환되지 않거나 치환된 방향족 잔기 및 지방족 또는 방향족 다가 화합물의 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, X는 O, S 또는 NH이다.
본 발명의 조성물을 사용하는 방법 및 시험장치는 지시염료가 시험 샘플내에 존재하는 과산화 활성물질의 양에 대응하여 색전이를 나타내고, 아스코르베이트 방지를 위해 조성물중에 포함된 금속 이온 착물이 없기 때문에 과산화 활성물질에 대한 더욱 정밀하고, 확실하며 임상학적으로 충분한 분석을 제공한다. 더구나, 과산화 활성물질에 대한 신속하고, 정밀하며, 재현가능하고 확실한 분석방법을 집 또는 실험실에서 수행하여 반드시 즉각적인 분석결과를 얻을 수 있다.
본 발명의 방법은 과산화 활성물질의 촉매화 능력을 활용하거나, 하이드로퍼옥사이드가 산소를 방출시키고, 지시염료를 산화시키기 위해 산소를 옮기는 반응에 관여시킨다. 지시염료의 산화는 지시제 조성물의 색전이로 나타나고, 색전이 정도 및 강도는 시험 샘플속의 과산화 활성물질의 농도에 직접 비례한다. 따라서, 본 발명의 지시제 조성물은 하이드로퍼옥사이드 및 지시염료를 포함하고, 여기서, 지시염료는 시험 샘플내에 존재하는 하이드로퍼옥사이드 및 과산화 활성물질의 조절로 인해 이의 산화된 형태로의 전환시 색전이를 나타낸다.
지시제 조성물은 과산화 활성물질 분석에 아스코르베이트 간섭을 제거하기 위한 성분을 포함한다. 본 발명에 따라서, 아스코르베이트 간섭 제거를 위해 포함된 성분은 금속 이온 착물이다. 그러나, 금속 이온 착물은 지시제 조성물의 안정성을 감소시킬 수 있거나, 적절치 않은 포지티브 또는 잘못된 고분석 결과를 나타낼 수 있는 과산화 활성 정도를 갖는다. 따라서, 본 발명의 중요한 특색에 따라서, 지시제 조성물은 과산화 활성물질에 대한 정밀하고 확실한 분석을 얻는 적당한 지시제 조성물을 제공하기 위해 금속 이온 착물의 과산화 활성을 효과적으로 저해하는 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물을 함유한다.
지시제 조성물에 포함된 지시염료는 검출가능반응, 바람직하게는 하이드로퍼옥사이드 및 과산화 활성물질의 존재하에 크로모겐성 반응을 나타낼 수 있는 지시 염료만을 한정한다. 따라서, 지시 염료는 과산화 활성물질에 의해 하이드로퍼옥사이드에서 유리된 산소 때문에 이의 환원상태로부터의 전환시 색전이를 나타내는 산화환원 지시염료가 바람직하다. 지시 염료는 색전이가 발생하기 전에 하이드로퍼옥사이드 및 과산화 활성물질이 모두 존재하므로 충분히 안정화될 것이다. 본 발명의 장점을 달성하기 위해, 지시 염료는 색전이의 정도 및 강도가 시험 샘플내의 과산화 활성물질의 농도에 관계될 수 있으므로 각종 검출가능하고 측정가능한 색의 정도 및 강도를 통해서 색전이를 나타낼 수 있다.
몇몇 지시염료는 본 발명의 조성물에 사용하기에 적당하고, 일반적으로 비교적 쉽게 산화되어 짙게 착색된 산화 생성물을 제공하는 화합물을 포함한다. 적당한 부류의 지시염료에는 벤지딘형 지시 화합물 및 헤테로사이클릭 아진 지시 화합물이 포함되나, 이에 한정하는 것은 아니다. 헤테로사이클릭 아진 지시 화합물의 예에는 비스-(N-에틸퀴놀-2-온)-아진 및 (N-메틸벤즈티아졸-2-온)-(1-에틸-3-페닐-5-메틸트리아졸-2-온)-아진이 포함되나, 이에 한정하는 것은 아니다. 벤지딘형 지시 화합물에는 예를 들면, 벤지딘; o-톨리딘; 3,3',5,5'-테트라(저급 알킬)벤지딘; o-디아니시딘; 2,7-디아미노플루오렌 및 이들의 혼합물 및 기타 적당한 지시염료가 포함되나, 이에 한정하는 것은 아니다. 상기에 사용된 용어 저급 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 및 각종 부틸, 펜틸 및 헥실 이성체를 포함하는 탄소수 1 내지 약 6개의 알킬 잔기로 정의된다. 본 발명의 장점을 달성하기 위해, 산화환원 지시제, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)이 지시제 조성물에 포함된다.
일반적으로 지시 염료는 지시제 조성물 중에 약 5mM(지시제 조성물 1ℓ당 지시 염료 mmol) 내지 약 60mM의 농도, 바람직하게는 약 20mM 내지 약 40mM의 농도로 존재한다. 특히 지시 염료가 산화반응으로 나타나는 색전이의 강도에 좌우되어, 지시제 조성물속의 지시염료의 양이 5mM이하, 또는 60mM 이상일 수 있다는 것이 이해될 것이다. 일반적으로, 지시제 조성물에 포함된 지시 염료의 양은 정성분석에 대해 검출가능한 색전이를 나타내거나, 정량분석에 대해 시험 샘플 중의 과산화 활성물질의 양에 비례하여 측정가능한 색전이를 나타내는 지시염료만을 한정한다.
본 발명의 또다른 중요한 특색에 따라서, 지시제 조성물은 또한 하이드로퍼옥사이드를 포함하고, 하이드로퍼옥사이드는 산소를 유리시킬 수 있는 화합물이다. 유리 산소는 지시제 조성물의 색전이를 일으키기 위해 지시염료를 산화시킨다. 시험 샘플 중에 존재하는 과산화 활성물질을 촉매로 하여 하이드로퍼옥사이드로부터 유리 산소를 유리시켜 지시염료에 유리 산소를 전이시키므로써 지시염료의 색전이가 개시된다.
따라서, 본 발명의 지시제 조성물에 포함된 하이드로퍼옥사이드는 과산화 활성물질의 부재하에서는 유리 산소가 유리되지 않으므로 충분히 안정화될 것이다. 특히, 하이드로퍼옥사이드는 무수 상 시험 스트립의 시험 패드 담체 매트릭스에 지시제 조성물을 혼입시킨 후, 보관하는 동안 하이드로퍼옥사이드가 지시제 조성물로부터 증발되거나 승화되지 않으므로 매우 낮은 증기압을 갖게 될 것이다. 더구나, 하이드로퍼옥사이드는 잠복혈에 대한 뇨 분석에서 시험 샘플의 1조부중의 헤모글로빈 1부 검출로 충분히 민감성이 입증될 것이다.
따라서, 본 발명의 지시제 조성물중의 유용한 하이드로퍼옥사이드는 공지된 다수의 하이드로퍼옥사이드중에서 선택된다. 그러나, 하이드로퍼옥사이드는 적당한 지시염료가 존재하는 과산화 활성물질과 상호작용할 수 있는 능력에 따라 시험 샘플에 의해 흡수되거나 반사되는 빛의 양에 따라서 색전이 또는 변화와 같은 검출가능한 반응을 나타낸다. 유기 하이드로퍼옥사이드가 바람직하다. 특히 적합한 하이드로퍼옥사이드의 예에는 큐멘 하이드로퍼옥사이드, t-부틸 하이드로퍼옥사이드, 디이소프로필벤젠 하이드로퍼옥사이드, 1-하이드록시사이클로헥산-1-하이드로퍼옥사이드, 2,5-디메틸헥산-2,5-디하이드로퍼옥사이드, 파라메탄 하이드로퍼옥사이드, 1,4-디이소프로필벤젠 모노하이드로퍼옥사이드, p-t-부틸이소프로필벤젠 하이드로퍼옥사이드, 2-(α-하이드로퍼옥시이소프로필)-6-이소프로필나프탈렌, 테트랄린 하이드로퍼옥사이드 및 이들의 혼합물이 포함되나, 이에 한정하는 것은 아니다. 잠복혈에 대한 뇨 분석에 있어서, 1,4-디이소프로필벤젠 디하이드로퍼옥사이드(DBDH)가 DBDH의 안정성, 민감성 및 비휘발성 때문에 하이드로퍼옥사이드로서 바람직하다.
지시제 조성물에 포함된 하이드로퍼옥사이드의 농도는 약 5mM 내지 약 100mM, 바람직하게는 약 25mM 내지 약 75mM 범위이다. 특히 지시제 조성물에 포함된 특정한 하이드로퍼옥사이드의 양은 안정성, 과산화 활성물질에 대한 민감성 및 휘발성과 같은 특정한 하이드로퍼옥사이드의 물리적 및 화학적 성질에 좌우된다.
더구나, 지시 염료 및 하이드로퍼옥사이드외에, 지시제 조성물은 분석시의 아스코르베이트 방지를 부여하는 금속 이온 착물을 포함한다. 일반적으로, 금속 이온 착물은 시험 샘플에 존재하는 아스코르베이트 이온의 산화를 촉진시켜 아스코르베이트 간섭을 제거한다. 금속 이온은 고유의 과산화 활성을 갖고, 혼합되지 않는한, 지시 염료의 색변화를 일으키는 지시제 조성물에 존재하는 하이드로퍼옥사이드와 상호작용할 것이다. 특히 착화 제2철 이온이외의 착화 금속 이온이 색변화를 일으키는 하이드로퍼옥사이드 및 지시염료와 상호작용하는 것이 선행기술에 교시되어 있다.
본 발명의 중요한 특색에 따라서, 반드시 아스코르베이트 간섭을 제거할 수 있는 금속 이온을 혼합시킬 경우, 지시염료의 조기산화를 반드시 제거하기 위해 본 발명의 지시제 조성물에 포함시킬 수 있다. 따라서, 지시제 조성물에 포함된 금속 이온 착물로서 유용한 금속 이온은 제2철 이온, 코발트(Ⅲ) 이온, 구리 이온, 수은 이온, 주석 이온, 니켈(Ⅱ) 이온, 납(Ⅱ) 이온, 마그네슘(Ⅲ) 이온, 카드뮴(Ⅱ) 이온, 아연(Ⅱ) 이온, 몰리브덴(Ⅴ) 이온, 크롬(Ⅳ) 이온 및 바나듐(Ⅲ) 이온, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 특히, 3가 이상의 원자가 상태를 갖는 금속 이온도 지시 염료의 조기산화를 방지하기 위해 금속이온을 착화시키는 동안, 금속이온으로서 사용할 수 있다. 본 발명의 장점을 달성시키기 위해, 금속 이온 착물에 존재하는 금속 이온은 제2철 이온이다.
상기에 언급된 것처럼, 지시 염료의 조기산화를 방지하기 위해 금속 이온을 틀림없이 착화시킨다. 그러나, 착화제는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 에틸렌디아민테트라아세트산 또는 니트릴로트리아세트산과 같은 폴리카복시알킬아민; 시트르산, 옥살산, 타타르산 또는 글루콘산과 같은 폴리카복실산 또는 염; 솔비톨과 같은 폴리하이드록시 화합물; 리그노설페이트; 글루코헵토네이트; 비스(디메틸글리옥시메이토); 비스살리실알데히드에틸렌디이미네이토와 같은 살리실에이트 착물; 디티오에이트 유도체; 트리에틸렌아민과 같은 폴리에틸렌아민; (2-디메틸아미노에틸)아민-코발트(Ⅱ); 2,4-펜탄디온 유도체; 디피리딘 유도체; 트리에틸렌피리딘 아민; 시스테인, 글리신 또는 히스티딘을 함유하는 폴리펩타이드; 프롤린 유도체; 1,4,8,11,22,25-옥타티아사이클로옥타산과 같은 티오크라운 에테르; 트리페닐포스포핀 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
특히, 지시제 조성물에 유용한 제2철 착물에는 N-(2-하이드록시에틸)에틸렌디아민트리아세트산(Fe-HEDTA), 에틸렌디아민테트라아세트산(Fe-EDTA), 사이클로헥실렌디아민테트라아세트산(Fe-CDTA), 니트릴로트리아세트산(Fe-NTA), 이미노디아세트산(Fe-IMDA), 에틸렌디아민디아세틱 디프로피온산(Fe-EDDP의 α 및 β형), 하이드록시에틸이미노디아세트산(Fe-HIMDA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(Fe-ETPA), 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)테트라아세트산(Fe-EGTA), N-(2-아세트아미도)이미노디아세트산(Fe-ADA) 또는 이들의 폴리카복시알킬아민 착물이 포함되나, 이에 한정하는 것은 아니다. 제2철 이온 폴리카복시알킬아민 착물은 참조문헌으로 도입된 미합중국 특허 제4,587,220호에 보다 상세히 기술되어 있다. 다른 적합한 제2철 이온 착물은 제2철 시트레이트, 제2철 글루코네이트, 제2철 글루코헵토네이트, 제2철 비스살리실알데히드에틸렌디이미네이토 및 제2철 트리에틸렌피리딘 아민을 포함한다. 바람직한 제2철 이온 착물은 Fe-HEDTA 및 Fe-EDTA이다. 본 발명의 장점을 달성하기 위해, 제2철 이온 착물 Fe-HEDTA는 본 발명의 지시제 조성물에 포함된다.
금속 이온 착물은 지시제 조성물 중에 약 0.5mM 내지 약 50mM, 바람직하게는 약 1mM 내지 약 25mM 범위의 양이 포함된다. 이 양이 존재하는 경우, 금속 이온 착물은 약 아스코르베이트 50㎎/dL를 함유하는 시험 샘플의 분석에서 아스코르베이트 간섭을 필수적으로 제거한다. 특히, Fe-HEDTA 같은 적합한 금속 이온 착물은 시판될 수 있으므로 지시제 조성물에 직접적으로 혼입시킬 수 있다. 또는, 금속 이온 착물은 지시제 조성물에 제2철 클로라이드 헥사하이드레이트(FeCl3.6H2O)와 같은 금속 이온 염과 N-(2-하이드록시에틸)에틸렌디아민트리아세트산(HEDTA)과 같은 적절한 동몰양의 착화제를 혼입시켜 Fe-HEDTA 제2철 이온 착물을 형성시키는 것처럼 지시제 조성물을 제조하는 동안 동일 반응계내에서 제조할 수 있다. 동일반응계내에서 금속 이온 착물을 생성시키는 경우, 금속 이온 착물은 착화되지 않은 금속 이온을 하이드로퍼옥사이드 및 지시염료와 접촉 및 상호작용시키기전에 생성시킨다.
조성물이 단지 금속 이온 착물만을 포함하는 경우, 하이드로퍼옥사이드 및 지시염료는 뚜렷한 단점을 나타내는 과산화 활성물질에 대한 시험 샘플의 분석방법에 사용한다. 앞에서 언급된 것처럼, 금속 이온 착물은 금속 이온 착물 및 하이드로퍼옥사이드의 혼합작용을 통해서 아스코르베이트 간섭을 제거하기 위해 조성물에 포함시킨다. 그러나, 금속 이온 착물과 하이드로퍼옥사이드를 혼합하면 산화환원 지시염료의 산화반응 때문에 과산화 활성물질에 대한 적절치 않은 포지티브 분석이 발생한다. 예를 들면, 제2철 착물, 하이드로퍼옥사이드 및 테트라메틸벤지딘(TMB) 염료를 함유하는 수용액은 TMB의 산화때문에 청색을 나타낸다.
따라서, 금속 이온 착물과 하이드로퍼옥사이드에 의한 지시염료 산화는 무수 상 시험 스트립의 안정화 및 무수 상 시험 스트립 제조에 사용된 공정 상에 엄격한 제한을 가할 수 있다. 예를 들면, 조성물 성분을 2단계로 담체 매트릭스에 혼입시켜야 하는데, 여기서 제1단계는 금속 이온 착물을 혼입시키고 제2단계는 하이드로퍼옥사이드 및 지시염료를 혼입시키는 것이 포함된다. 특히, 제2철 착물을 사용하는 경우, 시험 스트립을 pH 6.6 이상으로 완충시켜 제2철 이온 착물이 지시염료와 직접 반응하지 않도록 하여 적절치 않은 포지티브 분석, 또는 블랭크(blank) 반응을 나타내지 않도록 한다. 결국, 본 발명의 조성물 및 방법 이전에는 산화환원 지시염료, 금속 이온 착물 및 하이드로퍼옥사이드를 사용하는 과산화 활성물질에 대한 습윤상 분석은 지시염료의 큰 산화 배경 때문에 이용할 수 없었다. 이와 유사하게, 산화환원 지시염료, 하이드로퍼옥사이드 및 금속 이온 착물이 혼입된 무수 상 시험 스트립은 적절치 않은 포지티브 분석결과 또는 잘못된 고분석결과를 제공했다.
놀랍게도, 지시제 조성물을 과산화 활성물질에 대한 시험 샘플의 습윤 상 분석, 또는 무수 상 시험 스트립 분석에 사용할 수 있으므로 지시제 조성물의 안정화를 위해 지시염료, 하이드로퍼옥사이드 및 금속 이온 착물을 추가로 포함하는 지시제 조성물에는 2개 이상의 유리산 작용기를 갖는 인 화합물이 함유되는 것으로 밝혀졌다. 일반적으로, 본 발명의 조성물에 유용한 인 화합물은 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)로 나타낸다.
Figure kpo00010
Figure kpo00011
상기식에서, R1및 R2는 각각 수소, 치환되지 않거나 치환된 탄소수 1 내지 12의 지방족 잔기, 치환되거나 치환되지 않은 방향족 잔기 및 지방족 또는 방향족 다가 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, X는 O, S 또는 NH이다.
일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인화합물은 본 발명의 조성물에 약 50mM 내지 약 500mM, 바람직하게는 약 100mM 내지 약 400mM 범위의 농도로 함유된다. 본 발명의 장점을 달성하기 위해 적합한 인 화합물은 약 150mM 내지 약 300mM 범위의 농도로 존재한다. 50mM 이상의 농도로 존재하는 경우, 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물은 지시제 조성물의 안정성을 향상시킨다. 또한, 적합한 인 화합물은 지시제 조성물 중에 본 발명의 지시제 조성물 또는 방법에 불리한 영향을 미치지 않는 약 500mM 이상의 농도로 함유될 수 있다. 그러나, 추가로 지시제 조성물의 안정성의 개선이 입증되지 않으므로 적합한 인 화합물의 증가된 농도가 낭비된다.
보다 상세히 하기에 기술하는 바와 같이, 일반식(Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 인 화합물은 과산화 활성물질에 대한 시험 샘플 분석에 사용된 지시제 조성물의 안정성을 향상시킨다. 일반식(Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 인 화합물의 상응하는 디에스테르 및 트리에스테르는 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 모노에스테르 또는 산 인 화합물로서 입증된 장점 및 이점을 제공하지 못하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물의 티오(X=S) 또는 이미노(X=NH) 유도체는 본 발명의 지시제 조성물에 유용할 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 중요한 특색에 따라서, 안정한 지시제 조성물을 제공하는 적당한 인 화합물은 2개 이상의 유리산 작용기를 갖는 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물이다. 따라서, R1이 수소인 일반식(Ⅰ)의 화합물 즉, 인산은 3개의 유리산 작용기를 갖고 또한 본 발명의 조성물에 유용하다. 반면에, R2가 수소인 일반식(Ⅱ)의 화합물 즉, 포스폰산은 2개의 유리산 작용기를 갖고, 본 발명의 조성물로서 유용하다.
일반식(Ⅰ)의 인 화합물 상의 치환체 R1또는 일반식(Ⅱ)의 인 화합물 상의 치환체 R2는 탄소수 1 내지 12의 지방족 잔기일 수 있다는 것이 밝혀졌다. 추가로, 지방족 잔기에 포함된 탄소원자의 수가 증가함에 따라, 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물이 본 발명의 지시제 조성물을 더욱 효과적으로 안정화시킨다. 따라서, 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물(여기서, R1또는 R2는 탄소수 5 내지 10의 지방족 잔기이다)이 바람직하다. 지방족 쇄에 증가된 다수의 탄소원자를 갖는 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물에 의해 부여되는 개선된 안정성에 의해 인 화합물의 수용해도가 감소되는 것으로 알려져 있다. 감소된 수용해도로 인 화합물은 시험 스트립의 제조공정 동안에 역오염 효과를 방지하는 2차 에탄올성 침지액에 잘 용해되기 때문에 지시제 조성물에 안정성이 부여된다. 인 화합물은 금속 이온 착물로부터 지시 염료를 보호하기 위해 사용한다. 따라서, 지방족 인 화합물은 지시 염료의 산화된 착색 형태를 안정화시키는 음이온성 습윤제로서 제공될 것이다.
일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)(여기서, R1또는 R2는 방향족 잔기이다)의 인 화합물은 지시제 조성물에 개선된 안정성을 부여한다. 방향족 잔기는 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 방향족 잔기, 및 융합 환을 갖는 방향족 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들면, 방향족 잔기는 벤젠, 나프탈렌, 피롤, 푸란, 피리미딘, 티오펜, 피리딘, 피라진, 인돌, 퀴놀린, 카바졸, 퓨린, 이소퀴놀린, 이소티아졸, 이소옥사졸 및 기타 유사한 카보사이클릭 및 헤테로사이클릭 방향족 화합물로부터 유도할 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다. 보다, 구체적으로, 본 발명에 유용한 인 화합물을 하기 일반식(Ⅲ), (Ⅳ), (Ⅴ) 및 (Ⅵ)으로 나타낸다.
Figure kpo00012
Figure kpo00013
Figure kpo00014
Figure kpo00015
상기식에서, Y는 CH 또는 N이고, Z는 NH, O 또는 S이다.
각각 R1또는 R2인 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물의 지방족 잔기 또는 방향족 잔기는 본 발명의 지시제 조성물 안정화를 위해 인 화합물 작용에 불리한 영향을 끼치지 않는 치환체 그룹(들)을 포함할 수 있다. 치환체 그룹(들)은 지방족 잔기의 어떠한 탄소상이라도, 또는 과산화 활성물질에 대한 분석시 지시제 조성물의 불리한 영향을 끼치지 않는 방향족 잔기의 어떠한 위치라도 위치할 수 있다. 일반식(Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 인 화합물의 지방족 잔기 또는 방향족 잔기에는 니트로(-NO2); 시아노(-CN); 할로(-Cl, -Br); 아미노(-NH2); 치환된 아미노(-NHR3, -NR4R5, 여기서 R3, R4및 R5는 탄소수 약 1 내지 10의 치환되거나 치환되지 않은 방향족 또는 알킬 잔기이다); 하이드록시(-OH); 알콕시(-OR6, 여기서 R6은 탄소수 약 1 내지 10의 치환되거나 치환되지 않은 알킬 그룹이다); 아릴옥시(-OR7, 여기서 R7은 치환되거나 치환되지 않은 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 방향족 환 시스템이다); 설폰에이트(-SO3H); 카보닐(-CO-R8, 여기서 R8은 수소, 하이드록실, 알킬 그룹, 아릴 그룹, 알콕시 그룹, 아릴옥시 그룹 또는 아미노 그룹이다) 또는 이들의 혼합물이 포함되지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 중요한 특색에 따라서, 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물은 지방족 또는 방향족 다가 화합물의 잔기인 치환체 R1또는 R2를 포함한다. 다가 화합물은 2개 이상의 하이드록시 작용기를 갖고 글리콜, 트리올, 폴리올, 사카라이드 및 하이드록시페놀과 같은 화합물을 포함한다. 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물 상의 치환체로서 유용한 폴리하이드록시 화합물 잔기의 예에는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 헥산디올, 글리세롤, 네오펜틸 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 사이클로펜탄디올, 사이클로헥산디올, 하이드로벤조인, 푸럭토즈, 솔비탈, 카테콜, 레조르시놀 및 하이드로퀴논이 포함되지만, 이에 한정하는 것은 아니다. 특히, 다가 화합물의 잔기를 포함하는 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물의 예는 하기 구조식(Ⅶ) 내지 (Ⅹ)로 나타낸다.
Figure kpo00016
Figure kpo00017
Figure kpo00018
Figure kpo00019
특히, 구조식(Ⅶ)의 화합물이 사이클로헥산디올의 잔기를 포함하고, 이에 반하여, 구조식(Ⅷ)의 화합물은 에틸렌 글리콜의 잔기를 포함하고 구조식(Ⅹ)의 화합물은 글루코즈같은 모노사카라이드의 잔기를 함유한다. 본 발명의 장점을 달성하기 위해, 구조식(Ⅸ)로서 나타낸 인 화합물은 글리세롤 잔기를 함유하고 정의된 글리세릴-2-포스페이트는 본 발명의 지시제 조성물에 인 화합물로서 사용한다.
글리세릴-2-포스페이트(Ⅸ)는 공지 화합물이다. 놀랍게도, 글리세릴-2-포스페이트를 본 발명의 조성물에 포함시키면 조성물의 안정성이 향상된다. 또한, 단독으로 또는 다른 완충제와 함께 본 발명의 조성물에 포함되는 경우, 글리세릴-2-포스페이트의 완충능력이 입증된다. 하기에 보다 상세히 설명하는 바와 같이, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다른 완충제는 이들의 완충작용을 위해 지시제 조성물에 포함될 수 있지만, 이들 완충제는 지시제 조성물을 안정화시키지 못한다.
그러므로, 지시염료, 하이드로퍼옥사이드, 금속 이온 착물 및 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물을 포함하는 본 발명의 지시제 조성물을 액체 시험 샘플속의 과산화 활성물질의 존재를 입증하거나 농도를 측정하기 위한 개선된 방법에 활용한다. 지시제 조성물은 과산화 활성물질과 상호작용하여 가시적으로 또는 기계적으로 구별가능하고 측정가능한 색전이를 나타내는 것이 입증되었다. 또한, 상기에 기술된 필수성분이외에, 본 발명의 지시제 조성물은 지시염료가 과산화 활성물질에 의해 하이드로퍼옥사이드로부터 촉매적으로 방출된 산소와 접촉하고 상호작용할때 색 변화를 나타내므로 완충제와 같은 임의 성분을 충분한 양으로 포함할 수 있다. 따라서, 색 변화로 시험 샘플중의 과산화 활성물질의 존재 또는 농도가 정밀하게 확인된다.
예를 들면, 시험 샘플의 pH는 종종 관계된 분석에 바람직한 pH 범위를 초과하기 때문에 완충제를 시험 조성물에 가한다. 따라서, 필요한 경우, 본 발명의 지시제 조성물에는 공지된 다양한 유형의 완충제가 포함될 수 있는 것으로 입증되었다. 완충제는 뇨 pH 및 뇨 비중의 효과를 저해하는 시판용 무수 상 시험 스트립에 특히 중요하다. 완충제의 작용은 지시제 조성물의 안정성을 유지하기 위해 지시제 조성물을 충분한 pH로 유지시키고 분석하는 동안 지시염료내의 요구된 색 전이를 나타낸다.
완충제는 일반적으로 약 100mM 내지 약 500mM의 농도로 본 발명의 지시제 조성물에 포함되고, 특별한 상황에서는 완충제의 농도가 이 범위 이상 또는 미만일 수 있다. 최적분석결과에 대해, 일반적으로 지시제 조성물의 pH는 약산성 내지 중성의 pH로 유지되는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 약 5 내지 약 7, 바람직하게는 약 6 내지 약 7의 pH는 과산화 활성물질에 대한 분석에서 더욱 극적이고 더욱 쉽게 구별가능한 색 전이를 제공한다. 그러나, 요즈음 과산화 활성물질에 대한 분석방법은 지시염료, 하이드로퍼옥사이드 및 제2철 이온 착물의 혼합물이 산성 pH에서 조기 상호작용으로 적절치 않은 포지티브 분석을 제공하기 때문에 약알칼리 pH에서 수행시킨다. 놀랍게도, 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물을 함유하는 본 발명의 지시제 조성물을 활용하여 조성물을 산성 내지 중성 pH로 완충시킬 수 있으므로 충분한 안정성이 입증된다.
예를 들면, Fe-HEDTA와 같은 제2철 이온 착물을 사용하여 요구된 아스코르베이트 방지를 제공하는 경우, 지시제 조성물을 pH 6.7 내지 7.1의 범위에서처럼, pH 6.5이상에서 완충시키는 것이 선행기술에 교시되어 있다. 더욱 바람직하게는, pH를 6.80 내지 6.82에서 완충시킨다. 이 pH 범위는 매우 다양한 pH 및 비중을 나타내는 뇨 샘플 분석의 경우 민감성, 안정성 및 아스코르베이트 방지의 최상의 균형을 제공한다.
본 발명의 중요한 특색에 따라서, 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물을 지시제 조성물을 안정화시키는 이의 능력이외에도 완충제로서 사용할 수 있는 것이 밝혀졌다. 인 화합물은 단독으로 사용하거나, 다른 공지된 완충제[예: 아세테이트, 프탈레이트, 보레이트, 트리클로르아세테이트, 설포살리실레이트, 포스페이트, 타타르에이트, 시트레이트, 석시네이트, 4-모폴리노에탄설폰산, 말레산, 2,2-비스(하이드록시메틸)-2,2',2-니트릴로트리에탄올, 1,4-피페라진비스(에탄설폰산), 3,3-디메틸글루타르산, 3-N-모폴리노프로판설폰산(MOPS), 말론산, 1,3-비스[트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]프로판(비스-트리스), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄-말레산(트리스-말레에이트), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄-말론산(트리스-말로네이트), 3-N-(트리스하이드록시메틸)메틸아미노-2-하이드록시프로판설폰산(TAPSO), 2-([트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노)에탄설폰산(TES), 1,4-피페라진비스(에탄설폰산)(PIPES), 4-모폴리노에탄설폰산(MES), N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산(HEPES)] 및 선행기술에 공지된 것과 같은 기타 적당한 완충제와 혼합하여 사용하거나, 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.
지시염료, 하이드로퍼옥사이드, 금속 이온 착물 및 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물이외에, 4개의 필수성분의 성질 및 기능을 실질적으로 변경하지 않고 과산화 활성물질에 대한 분석에 간섭하지 않는 완충제이외의 기타 임의성분을 지시제 조성물에 포함시킬 수 있다. 예를 들면, 지시제 조성물에 시험 샘플에 의해 시험장치의 시험 패드의 습윤성을 개선시키고, 산화된 지시 염료를 안정시키는 화합물을 임의적으로 포함시킬 수 있다. 당해 화합물은 일반적으로 음이온성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제이다. 장쇄 탄소 설페이트 또는 설포네이트(예: 나트륨 도데실 설페이트, 디옥틸 나트륨 설포석시네이트 및 나트륨 도데실벤젠 설포네이트)와 같은 음이온 계면활성제가 바람직한 계면활성제이다. 옥트옥시놀, 논옥시놀 또는 에톡시화지방 알코올과 같은 비이온성 계면활성제를 또한 본 발명의 지시제 조성물에 포함시킬 수 있다. 계면활성제는 지시제 조성물에 0mM 내지 약 200mM의 농도, 바람직하게는 약 50mM 내지 약 20mM의 농도로 함유된다.
계면 활성제 이외에, 부가적으로 본 발명의 지시제 조성물에 안정화제를 포함시킬 수 있다. 예를 들면, 참조문헌으로 도입된 램의 미합중국 특허 제4,071,318호에 기술된 보레이트 에스테르는 지시제 조성물에 존재하는 지시염료에 증가된 안정성을 제공한다. 적당한 보레이트 에스테르에는 트리메탄올아민 보레이트, 트리에탄올아민 보레이트, 트리(n-프로판올)아민 보레이트 및 트리(n-부탄올)아민 보레이트 또는 이들의 혼합물이 포함되지만, 이에 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 장점을 달성하기 위해, 트리이소프로판올아민 보레이트를 지시염료 안정화를 위해 지시제 조성물에 포함시킨다. 안정화제는 지시제 조성물에 0mM 내지 약 300mM 범위의 농도, 바람직하게는 약 25mM 내지 약 200mM 범위의 농도로 포함된다.
지시제 조성물은 시험장치의 색 전이의 안정성 및 균일성을 개선시키는 중합체성 물질을 포함한다. 또한, 무수 상 시험 스트립에서, 지시제 조성물을 2개의 별도용액으로부터 시험 패드에 혼입시킬 경우, 중합체성 물질은 1차 함침용액에 존재하는 성분을 2차 함침 용액에 존재하는 성분과 상호작용시켜 분리를 촉진시킨다. 따라서 시험 스트립은 증가된 안정성이 입증된다. 적당한 중합체성 물질에는 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 아라비아 고무, 젤라틴, 알긴, 카라게난, 카세인, 알부민, 메틸셀룰로스 및 유사한 천연 및 합성 중합체성 물질이 포함되지만, 이에 한정하는 것은 아니다. 바람직한 중합체성 물질은 폴리비닐피롤리돈(예: 분자량이 40,000이고 뉴욕주 뉴욕 소재의 GAF 코포레이션에서 시판되는 폴리비닐피롤리돈인 PVP k-30)이다. 일반적으로 중합체성 물질은 지시제 조성물에 지시제 조성물의 총 중량의 0% 내지 약 5%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 4% 범위의 양으로 포함된다.
특히, 과산화 활성물질에 대한 크로모겐 분석시 색전이의 색 분해 및 구분을 개선시키기 위해, 불활성 바탕 염료를 지시제 조성물에 포함시킬 수 있다. 적당한 바탕 염료에는 에틸 오렌지(4-(4-디에틸아미노페닐아조)벤젠설폰산); 오렌지 G(4-(2-하이드록시-(7,9-나트륨디설포네이트)-1-나프틸아조)벤젠); 오렌지 분산염료 11, 13 또는 25호; 칼코민 오렌지; 메틸 오렌지; 메틸 오렌지 Ⅱ (4-(2-하이드록시-1-나프틸아조)벤젠설폰산), 또는 이들의 혼합물이 포함되지만, 이에 한정하는 것은 아니다. 바탕염료는 본 발명의 지시제 조성물에 0mM 내지 약 2mM 범위의 농도, 바람직하게는 약 0.1mM 내지 약 1.2mM 범위의 농도로 포함된다.
지시제 조성물은 시험 샘플 중의 과산화 활성물질을 더욱 민감하게 분석하기 위해 촉진제를 포함할 수 있다. 촉진제는 과산화 활성물질에 대한 분석 기술에 공지되어 있고 퀴놀린 및 이소퀴놀린, 및 이들의 유도체를 포함한다. 미합중국 특허 제3,853,472호에는 촉진제로서 유용한 퀴놀린 및 이소퀴놀린이 기술되어 있고 이는 참조문헌으로 도입된다. 이소퀴놀린, 4-브로모이소퀴놀린, 4-메틸퀴놀린, 6-메톡시퀴놀린, 3-아미노퀴놀린 또는 5,6-벤조퀴놀린이 바람직한 촉진제이다. 본 발명의 장점을 달성하기 위해, 위스콘신주, 밀워키 소재의 알드리히 케미칼 캄파니(Aldrich Chemical Company)에서 상품명 LEPIDINE
Figure kpo00020
으로 시판되는 4-메틸퀴놀린, 또는 6-메톡시퀴놀린이 반응 촉진제로서 사용된다. 일반적으로 촉진제는 지시제 조성물에 0mM 내지 약 125mM 범위의 농도, 바람직하게는 약 25mM 내지 약 100mM 범위의 농도로 포함된다. 특징적인 분석 분야의 숙련가에게 널리 공지된 바와 같이 다른 임의 성분들을 또한 지시제 조성물에 포함시킬 수 있는 것으로 이해된다.
지시제 조성물에 포함된 성분에 대한 담체 비히클은 물을 포함한다. 그러나, 지시제 조성물에 포함된 특정 성분의 수용해도가 한정되기 때문에, 유기 용매(예: 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알코올, 아세톤, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 아세토니트릴, 에틸 아세테이트) 및 유사한 용매를 담체 비히클에 포함시킬 수 있다. 물 이외에 지시제 조성물의 담체 비히클에 함유되는 적당한 유기 용매(들)는 계획된 특징적인 분석 기술내에서 숙련가에 의해 선택된다.
지시제 조성물에 존재하는 유기 용매의 양은 일반적으로 담체 비히클의 0중량% 내지 약 90중량% 범위, 바람직하게는 약 10중량% 내지 약 70중량% 범위이다. 물 및 에탄올 또는 아세토니트릴 같은 유기 용매를 함유하는 담체 용매는 지시제 조성물에 포함된 담체 매트릭스를 수분 이내에 건조시킬 수 있기 때문에 더욱 바람직하다.
앞에서 기술된 것처럼, 지시제 조성물이 시험 샘플과 접촉하여 색 전이를 나타내는 것으로 과산화 활성물질의 존재가 입증된다. 또한, 색 전이의 강도 및 정조는 공지된 과산화 활성물질 농도를 갖는 용액에 의해 나타난 색과 시험 샘플에 의해 나타난 색을 비교하거나 상관관련시켜 시험 샘플 중의 과산화 활성물질의 정량적 농도를 측정하는데 사용한다. 본 발명의 중요한 특색에 따라, 시험 샘플 중의 과산화 활성물질의 양을 측정할 수 있고 분광광도계 또는 비색계와 같은 색상측정장치를 사용하지 않고 정밀하게 측정할 수 있도록 본 발명의 지시제 조성물은 충분히 분석되고 구별된 색 전이를 제공한다. 그러나, 경우에 따라서, 이런 색상측정 장치를 시험 샘플과 공지된 과산화 활성물질 농도를 갖는 용액사이의 색 정도 및 강도의 차이를 측정하는데 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 지시제 조성물을 활용하는 과산화 활성물질에 대한 분석은 분석의 정밀성 및 확실성을 향상시키고 또한 분석으로 의사의 신뢰성을 증가시킨다. 부가적으로, 숙련된 의사 또는 실험실의 기술자에 반하여, 과산화 활성물질에 대한 다수의 뇨 분석을 숙련되지 않은 환자가 집에서 수행할 수 있기 때문에 뇨 중의 과산화 활성물질 함량에 대한 정밀하고 확실한 정량 분석 방법을 제공하는 것이 긴급하다.
본 발명의 방법에 의해 성취되는 새롭고 의외인 경과를 입증하기 위해, 우선 본 발명의 각종 지시제 조성물을 제조하고, 시험 샘플 중의 과산화 활성물질의 함량에 대한 수성, 습윤 상 분석에 이들을 사용한다. 실시예 1 내지 10의 각각의 조성물에서, 지시 염료, 하이드로퍼옥사이드 및 제2철 이온 착물의 동정 및 양은 일정하다. 특히, 비교실험(실시예 1)을 제외하면, 조성물중에 포함된 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물의 양은 일정하지만, 각 실시예에 존재하는 특정 인 화합물의 동정은 변한다. 따라서, 실시예 1 내지 10에 사용된 지시제 조성물은 실시예 1에서 사용된 지시제 조성물이 0mM 농도의 인 화합물을 함유하는 것을 제외하고는 하기 농도의 성분을 포함하도록 제조한다. 실시예 9 및 10에 사용된 지시제 조성물은 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)가 아닌 인 화합물을 포함한다.
Figure kpo00021
실시예 1 내지 10에 사용한 지시제 조성물은 남아있는 조성물 성분을 함유하는 아세토니트릴:물 90:10(중량) 용액 2부와 pH 5.8에서 완충된 인 화합물의 수용액 1부를 완전하게 혼합시켜 제조한다. 결국, 실시예 1 내지 10에 사용한 지시제 조성물은 아세토니트릴:물 60:40(중량) 담체 비히클을 함유하고 용액 1ℓ당 밀리몰(mM)중의 제형1에 열거된 성분들의 농도를 추가로 함유한다. 표 1에 열거된 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 특정 인 화합물은 실시예 1 내지 10에 활용된 지시제 조성물에 포함된다.
Figure kpo00022
표 2에는 과산화 활성물질을 포함하지 않는 수성 시험 샘플의 습윤 상 분석의 결과를 설명하고 요약한다. 따라서, 과산화 활성물질이 존재하지 않기 때문에, 과산화 활성물질을 검출하기 위해 습윤 상 분석에 사용된 지시제 조성물은 색 전이를 나타내지 못할 것이다. 따라서, 실시예 1 내지 10 각각에 있어서, 앞에서 기술된 지시제 조성물을 과산화 활성물질이 부족한 시험 샘플에 가하고 시간에 따른 분석의 색 변화를 탐지한다. 특히, 실시예 1 내지 10에서, 우선 지시제 조성물을 UV-VIS(자외선-가시광선) 큐벳에 가하고, 과산화 활성물질이 부재하는 시험 샘플을 큐벳에 가한다. UV-VIS 큐벳중의 분석 용액의 색 전이를 660 나노미터(㎚)에서 시간에 따라 탐지하고, 색 전이의 속도(즉, 분당 흡수율 변화)를 당해 분야의 숙련가에게 공지된 표준 방법으로 계산한다.
Figure kpo00023
표 2로부터 실시예 1의 분석에 일반식(Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 인 화합물이 부재하는 지시제 조성물을 사용하고, 이경우 과산화 활성물질이 존재하지 않는 때조차 커다란 색 전이가 나타나는 것이 관찰된다. 가시광선 영역에서, 분석 용액은 청색으로 변하는데, 이는 과산화 활성물질의 존재를 나타낸다. 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물을 실시예 1에서 사용된 지시제 조성물은 매우 큰 색 전이를 나타내어 측정장치의 검출 한계에 접근한다. 따라서, 과산화 활성물질을 함유하는 시험 샘플을 실시예 1에 활용된 조성물을 사용하여 분석하는 경우, 과산화 활성물질은 바탕 흡수가 크기 때문에 습윤 상 분석으로 검출할 수 없었다. 이 결과는 지시염료(TMB)와 하이드로퍼옥사이드(DBDH) 사이의 반응은 수용액중의 제2철 이온 착물(Fe-HEDTA)에 의해 촉매화되기 때문에 습윤 상 분석이 불가능한 것으로 고려되어진 선행기술에 나타난 관찰 결과에 따른 것이다.
그러나, 놀랍게도, 지시 염료, 하이드로퍼옥사이드, 금속 이온 착물 및 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물을 함유하는 본 발명의 지시제 조성물이 과산화 활성물질에 대한 습윤 상 분석에 사용되는 경우, 지시제 조성물은 수용액내에 시험 샘플속의 과산화 활성물질을 검출하고 측정할 수 있도록 지시제 조성물에 충분한 안정성을 부여한다. 따라서, 실시예 2 내지 8에서, 본 발명의 지시제 조성물은 과산화 활성물질에 대한 습윤 상 분석에 사용된다. 실시예 2 내지 8의 분석에 활용된 지시제 조성물은 실질적으로 매우 적거나 사소한 바탕색 형성으로 인해 습윤 상 검정방법에 의해 시험 샘플 중의 과산화 활성물질을 검출할 수 있음을 나타낸다. 예를 들면, 실시예 8에서, 분당 흡수율 변화는 실시예 1의 분석에 사용된 조성물에 대한 4.50에 비교되는 1.98이다. 더욱 놀랍게도, 실시예 2 내지 실시예 3은 분당 흡수율 변화가 0.06 및 0.08로 매우 사소한 것으로 입증된다. 본 발명의 지시제 조성물의 안정성 때문에 습윤 상 분석시 낮은 바탕색을 충분히 발색시켜서 헤모글로빈 농도가 0.010㎎/dL인 지시제 조성물은 시험 샘플이 검출가능하고 측정가능한 색 전이를 나타내게 하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 습윤 상 분석방법으로 시험 샘플중의 과산화 활성물질에 대한 정성 또는 정량 분석을 이룰 수 있다. 또한, 실시예 2 내지 8에 사용된 지시제 조성물의 경우, 과산화 활성물질을 함유하는 시험 샘플에 대해 수행한 분석에서, 흡수율 변화는 시험 샘플내의 헤모글로빈양에 직접 비례하여 증가된 것으로 밝혀졌다. 또한, 실시예 2 내지 8에 활용된 본 발명의 지시제 조성물은 충분한 아스코르베이트 방지를 나타내어 109mM의 아스코르브산을 함유하는 시험 샘플의 경우 헤모글로빈 0.045㎎/dL을 함유하는 시험 샘플의 흡수율 측정이 반드시 효과적이지 않다.
표 2로부터, 실시예 2 내지 5에 활용된 지시제 조성물이 바탕 염료의 조기 산화를 방지하여서 바탕색의 현색이 반드시 제거되는 예외적 능력이 입증된다. 그러나, 실시예 6 내지 8에 활용된 본 발명의 지시제 조성물은 지시염료의 조기 산화를 방지하는 능력이 향상되므로 적절치 않은 포지티브 분석의 제거가 입증된다. 실시예 6 내지 8에서 입증된 결과가 실시예 2 내지 5에 의해 입증된 결과처럼 인상적이진 못할지라도, 실시예 6 내지 8에 활용된 지시제 조성물은 본 발명의 습윤 상 분석, 특히 시험 샘플중의 과산화 활성물질에 대한 정량분석에 유용하다.
또한, 실시예 2 내지 8에 사용된 지시제 조성물에 의해 제공된 분석결과는 실시예 9 및 10의 분석 결과와 비교될 수 있다. 실시예 9 및 10에서, 습윤 상 분석은 유리산 작용기 2개 미만을 갖는 인 화합물을 포함하는 지시제 조성물을 사용한다. 표 2로부터, 이러한 인 화합물은 지시제 조성물에 대한 불안정화 효과를 나타내고, 이것으로 인해 지시제 조성물은 인 화합물이 부재하는 지시제 조성물(실시예 1)보다 더욱 빠르고, 더욱 진한 바탕색을 현색시키는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물에는 2개 이상의 유리산 작용기를 갖는 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물을 함유하는 지시제 조성물이 요구된다. 또한, 지시제 조성물 중에 포함된 인 화합물이 화합물(Ⅰ) 또는 화합물(Ⅱ)의 치환체 R또는 치환체 R가 수소(실시예 2 및 7), 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 아릴 잔기(실시예 3, 4, 6 및 8) 또는 다가 화합물의 잔기(실시예 5)인 경우 과산화 활성물질에 대한 정밀하고 정확한 습윤 상 분석이 제공되는 것이 표 2에 나타나 있다.
그러므로, 본 발명의 지시제 조성물은 과산화 활성물질에 대한 습윤 상 분석을 제공한다. 그러나, 과산화 활성물질에 대한 습윤 상 분석이외에, 지시제 조성물은 과산화 활성물질에 대한 무수 상 시험 스트립 분석에도 사용할 수 있다. 본 발명의 지시제 조성물을 활용하는 과산화 활성물질에 대한 무수 상 시험 스트립 분석은 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따라 수행된다. 일반적으로, 과산화 활성물질에 대한 분석은 지시제 조성물을 포함하는 분석물 검출 장치에서 뇨 또는 다른 시험 샘플을 접촉시켜 수행한다. 분석물 검출 장치로 시험 샘플을 적실 수 있고, 또는 시험 샘플을 분석 검출 장치에 적가하여 사용할 수 있다. 분석물 검출 장치의 생성된 색 변화로서 과산화 활성물질의 존재가 입증되고, 계획적인 경우, 생성된 색 전이를 표준 색 도표와 비교하여 뇨 또는 시험 샘플 중의 과산화 활성물질 농도의 정량 측정을 제공할 수 있다.
전형적으로, 분석물 검출 장치는 단일 패드 시험 스트립(단지 단일 분석물을 분석하기 위한 것) 또는 다중 패드 시험 스트립(몇개의 분석물을 동시에 분석하기 위한 것)으로 계획된 시약 함침된 시험 스트립이다. 시약 함침된 시험 스트립의 유형에 대해, 소수성 플라스틱으로 구성된 시험 스트립은 지지체 스트립 또는 핸들을 포함하고, 시약 시험 패드는 지시제 조성물을 혼입시킨 흡수성 또는 비흡수성 담체 매트릭스를 포함한다. 일반적으로, 담체 매트릭스는 시험 샘플을 모세관 작용에 의해 담체 매트릭스를 통해 이동시켜 지시제 조성물과 접촉시키고 검출가능하거나 측정가능한 색 전이를 나타내는 흡수성 물질이다.
담체 매트릭스는 담체 매트릭스가 실질적으로 화학 시약에 대해 불활성이고 액체 시험 샘플에 대해 다공성 및/또는 흡수성으로 인한 관련 분석을 수행하는데 필요한 화학 시약을 혼입시킬 수 있는 물질이다. 표현 담체 매트릭스는 물과 다른 생리학적 유동체에 불용성이고 물과 다른 생리학적 유체에 노출시킨 경우 이들의 구조가 완전하게 유지되고 물과 다른 생리학적 유체에 불용성인 흡수성이거나 비흡수성인 매트릭스를 지칭한다. 적당한 흡수성 매트릭스에는 여과지, 스폰지 물질, 셀룰로스, 나무, 직물, 부직포 등이 포함된다. 비흡수성 매트릭스에는 유리섬유, 중합체성 필름, 및 예비성형되거나 미세다공성인 막이 포함된다. 다른 적당한 담체 매트릭스에는 친수성 무기 분말(예: 실리카 겔, 알루미나, 규조토 등); 점토 물질; 직물; 친수성 천연 중합체성 물질, 특히 셀룰로스 물질(예: 셀룰로스 비드), 및 여과지 또는 크로마토그라피 용지와 같은 섬유 함유 종이; 합성 또는 개질된 천연 중합체(예: 셀룰로스 아세테이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리우레탄, 가교결합된 덱스트란, 이가로스), 및 기타 가교결합되고 가교결합되지 않은 수불용성 친수성 중합체가 포함된다. 소수성 비흡수성 물질은 본 발명의 담체 매트릭스로서 사용하기에 적당하지 않다. 담체 매트릭스는 상이한 화학적 조성물 또는 화학적 조성물들의 혼합물일 수 있다. 또한, 매트릭스는 경도 및 연화도가 겸비된 평활도 및 조도에 관해 다양할 수 있다. 그러나, 모든 경우에 있어서, 담체 매트릭스는 친수성 또는 흡수성 물질을 포함한다. 핸들은 일반적으로 소수성 물질(예: 셀룰로스, 아세테이트, 폴리에틸렌, 테레프탈레이트, 폴리카보네이트 또는 폴리스티렌)로 형성되고, 담체 매트릭스는 흡수성 여과지 또는 비흡수성 중합체 필름으로 구성되는 것이 가장 유리하다.
시험 스트립의 목적이 시험 샘플 중의 과산화 활성물질에 대한 분석인 경우, 담체 매트릭스는 지시제 조성물을 함침시킨 시험 스트립의 시험 패드에 시험 샘플을 침투시켜 포화시키는 흡수성 또는 비흡수성 물질일 수 있다. 본 발명의 장점을 얻기 위해, 과산화 활성물질에 대한 분석에서, 담체 매트릭스는 종이, 바람직하게는 여과지와 같은 셀룰로스 물질을 함유하는 친수성, 흡수성 매트릭스이다. 여과지는 풍부한 공급, 유리한 경제성 및 다양하고 적당한 변화의 등급이라는 잇점을 더해서, 본 발명의 흡수성 매트릭스의 필요한 모든 양을 점유한다. 여과지는 지시제 조성물에 포함된 필수 성분과 임의 성분 둘다를 현탁시키고 함유하기 위한 매트릭스 물질로서 사용하기에 매우 만족스런 것으로 알려졌다.
본 발명의 장점을 얻기 위해, 지시제 조성물은 적당한 담체 매트릭스에 함침되고 시험 샘플속의 과산화 활성물질의 분석을 위한 무수 상 시험 스트립에 활용된다. 가정 또는 실험실에서 수행할 수 있는 본 발명의 방법은 시험 샘플속의 과산화 활성물질의 존재를 입증하거나 농도를 분석하기 위해 경제적이고, 정밀하며 정확한 분석을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 시험 샘플속의 저농도의 과산화 활성물질의 검출, 구별 및 측정을 가능하게 하여 임상학적 분석에 보다 유용하다.
본 발명의 방법에 따라, 과산화 활성물질에 대한 무수 상 시험 스트립 분석을 수행하기 위해, 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물 약 50mM 내지 약 500mM; 금속 이온 착물 약 0.5mM 내지 약 50mM; 완충액 약 100mM 내지 약 500mM; 안정화제 0mM 내지 300mM; 계면활성제 0mM 내지 약 200mM 및 기타 필요한 임의 성분 또는 용매를 포함하는 수용액을 먼저 제조한다. 이어서, 이 수용액을 1N 염산과 같은 적당한 유기산 또는 무기산을 사용하여 pH를 약 6 내지 약 7로 조절한다. 여과지와 같은 흡수성 매트릭스를, 여과지 시트 또는 예비절단된 스트립을 수용액으로 침수시키거나 또는 수용액을 분무하여 수용액으로 포화시키고 함침시킨다.
이어서, 약 40℃ 내지 100℃ 온도의 공기 오븐내에서 약 20분 동안 건조시켜 수성 용매를 제거한 후, 여과지를 삼투시키고 지시 염료 약 5mM 내지 약 60mM; 하이드로퍼옥사이드 약 5mM 내지 약 100mM; 중합체성 물질 0% 내지 약 5%; 촉진제 0mM 내지 약 125mM 및 바탕 염료와 같은 기타의 필요한 임의 성분 또는 용매를 함유하는 2차 에탄올성 용액으로 침수시키거나 분무하여 포화시키고 함침시킨다. 약 40℃ 내지 약 100℃의 오븐에서 대략 20분 동안 2차 건조시킨 후, 2회 함침된 여과지를 치수가 약 0.25㎝×약 0.5㎝ 내지 약 0.5㎝× 약 1.0㎝인 패드와 같은 적절한 크기로 절단한다. 건조시키고 2회 함침시킨 여과지는 양면 접착 테이프를 사용하여 불투명하거나 투명한 소수성 플라스틱 핸들로 잡아맨다. 이어서, 생성된 시험 스트립을 신선하고 원심분리시키지 않은 뇨 샘플에 충분한 시간 동안 적시어 샘플로 시험 패드를 포화시킨다. 약 15초 내지 약 60초 정도의 예정된 시간동안 대기한 후, 시험 스트립을 반응하는 동안 가시적으로 또는 기기에 의해 검정한다. 어떤 경우에 있어서, 시험 패드의 색 전이는 뇨 샘플 중의 과산화 활성물질의 존재 또는 농도를 나타낸다.
상기 기술된 과산화 활성물질에 대한 습윤 상분석과 유사하게, 본 발명의 방법 및 조성물을 활용하여 과산화 활성물질에 대한 정량분석의 목적을 위해서, 시약 패드의 크기, 시약 함침 용액의 농도, 시험 샘플의 양과 시험 스트립에 시험 샘플을 적시는 것보다 오히려 피펫에 의해 가하는 방법 사이의 적당한 조화를 이루기 위한 시험 장치 제조기술은 실험 기술내에 잘 알려져 있다.
많은 경우에서, 시험 스트립의 간단한 가시적인 관찰은 바람직한 정보를 제공해 준다. 더욱 정밀한 정보가 필요한 경우, 과산화 활성물질의 각종 공지된 농도에 상응하는 색 도표에 관계되는 색 점을 시험 스트립에 사용되는 특정지시제 조성물에 대해 만들 수 있다. 뇨 샘플과 접촉시킨 후 생성된 시험 스트립의 색을 도표 상의 색점과 비교하여 시험 샘플속의 과산화 활성물질의 농도를 측정한다.
더욱 정밀한 측정이 필요한 경우, 분광광도계 또는 비색계를 사용하여 더욱 정확한 색 전이의 정도를 측정한다. 또한, 습윤 상 분석 및 무수 상 시험 스트립 분석 둘 다 색 전이의 정도를 더욱 정확하고 정밀하게 측정하여 시험 샘플속의 과산화 활성물질의 농도, 특히 0.010㎎/dL 미만과 같은 저농도의 단백질을 더욱 정밀하게 측정하기 위해서, 가시적 기술에 상반된 분광광도계 또는 비색계 기술을 정량분석에 사용할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 중요한 특색에 따라, 본 발명의 지시제 조성물을 적당한 담체 매트릭스에 함침시킴으로서 시험 샘플속의 과산화 활성물질의 존재 또는 농도를 무수 상 시험 스트립을 사용하여 나타낼 수 있다. 앞서 논의한 것처럼, 시험 샘플속의 과산화 활성물질의 분석에 사용된 무수 상 시험 스트립은 일반적으로 지시제 조성물로 처리하여 침윤시킬 수 있고; 비교적 신속하고 정확한 분석을 수득하기 위해 뇨 또는 다른 시험 샘플을 담체 매트릭스에 신속하게 침투시킬 수 있고; 담체 매트릭스를 포함하는 성분을 시험 샘플에 의해 추출하거나 미확정적이고, 정밀하지 않거나 모호한 연속적인 분석을 할 방법으로 뇨 또는 시험 샘플을 약간 변경하여 뇨 또는 다른 시험 샘플을 오염시키지 않는 어떠한 흡수성 매트릭스라도 포함하는 담체 매트릭스를 함유한다.
본 발명의 한 양태에 따라, 하기의 무수 상 시험 스트립을 제조하여 과산화 활성물질에 대한 무수 상 분석을 수행한다. 여과지(예: WHATMAN CCP 500, Whatman Inc., Maidenhead, Kent, U.K.)와 같은 담체 매트릭스 스트립 또는 시트를 우선 하기 조성물을 함유하는 수성 용액속에 침지시킨다:
Figure kpo00024
1회 함침시킨 여과지 매트릭스를 약 45℃ 내지 약 60℃ 온도 범위의 오븐에서 건조시킨다. 건조 후, 1회 함침시킨 여과지를 하기 성분을 함유하는 에탄올성 용액에 침지시킨다:
Figure kpo00025
2회 함침시킨 여과지 매트릭스를 약 40℃ 내지 약 60℃ 온도 범위의 오븐에서 건조시킨다. 2회 함침시키고 건조시킨 여과지를 본 발명의 지시제 조성물로 함침시킨 담체 매트릭스를 포함하는 시험 패드를 제공하기 위해 치수가 약 0.5㎝×약 0.5㎝인 패드로 절단한다. 또한, 담체 매트릭스를 지시제 조성물의 필수성분 및 임의성분 모두를 포함하는 수용액 속에 침지시켜 담체 매트릭스를 함침시킬 수 있으므로 본 발명의 지시제 조성물의 충분한 안정성이 입증됨을 알 수 있다. 그러나, 2회 침지시키는 2단계 방법은 지시 염료와 금속 이온 착물 사이의 접촉이 최소화되기 때문에 바람직하고, 그런 까닭에 조기 상호작용이 배제된다.
본 발명의 방법에 의해 성취되는 새롭고 의외인 결과를 입증하기 위해, 본 발명의 지시제 조성물을 혼입시키는 무수 상 스트립을 과산화 활성물질에 대한 무수 상 분석에 사용한다. 무수 상 시험 스트립을 위에 기술한 것처럼 제조하고, 시험 샘플에 적신다. 개개의 시험 샘플은 과산화 활성물질 즉, 헤모글로빈을 포함하거나 이것이 부족하다. 시험 샘플을 접촉시킨 후, 시험 스트립의 시험 패드의 반사율은 인디애나주 엘크하트 소재의 마일즈 인코포레이티드의 진보된 신속한 연구 스캐너 반사율 분광계(Advanced Research Rapid Scanner reflectance spectrometer)로 660㎚에서 측정한다. 블랭크 대조분석으로서 공급하기 위해, 시험 스트립을 물 속에 적시고, 반사율은 물속에 시험 스트립을 적신지 대략 10분후 660㎚에서 측정한다. 이 반사율 측정은 블랭크 반응의 정도 및 강도를 나타낸다. 유사하게, 헤모글로빈 0.045㎎/dL을 함유하는 뇨 샘플속에 적신 시험 스트립의 반사율은 뇨 샘플속에 시험 스트립을 적신지 대략 1분 후 660㎚에서 측정한다. 측정된 이 반사율은 과산화 활성물질 존재하의 시험 스트립의 반응성을 나타낸다.
본 발명의 지시제 조성물을 함유하는 시험 패드는 예를 들면, 약 50℃에서 28일 이상 동안 보관한 후 색 전이를 나타내지 않고; 과산화 활성물질이 부재하는 시험 샘플을 접촉시켜 적절치 않은 포지티브 분석을 제공하지 않아 우수한 안정성을 갖고, 본 발명의 조성물은 시험 샘플속의 헤모글로빈 0.045㎎/dL을 정밀하게 검출하여 약 50℃에서 8주 동안 보관한 후, 장시간에 걸쳐 이의 반응성 및 민감성이 유지되는 것이 입증되었다. 예를 들면, 인 화합물로서 글리세릴-2-포스페이트를 함유하는 위에 기술된 본 발명의 조성물을 포함하는 시험 패드의 반사율은 물 샘플 속에 시험 패드를 적신 후 10분 동안 일정하게 남아있다. 따라서, 본 발명의 지시제 조성물은 과산화 활성물질이 부재하는 시험 샘플과 접촉시켜 색 전이를 나타내지 않는다. 동일한 시험 스트립을 과산화 활성물질을 함유하는 시험 샘플 속에 적시고 시험 샘플 속에 시험 패드를 적신 후 1분 동안 반사율의 변화에 의해 입증되는 것처럼 검출가능하고 측정가능한 색 전이를 나타낸다.
대조적으로, 지시제 조성물을 혼입시킨 시험 패드를 포함하는 시험 스트립은 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물을 포함하지 않지만, 200mM의 4-모폴리노에탄설폰산, 말레산, 2,2-비스(하이드록시메틸)-2,2',2-니트릴로트리에탄올, 1,4-피페라진비스(에탄설폰산) 또는 3,3-디메틸글루타르산을 대신 함유하고, 물 샘플 속에 시험 스트립을 적신지 10분 후 반사율이 대략 15% 내지 대략 20% 변화한 것이 입증된다. 가시적으로, 반사율의 이러한 큰 변화율은 과산화 활성물질에 대한 적절치 않은 포지티브 분석 또는 잘못된 고분석이 제공된 충분한 색 전이에 상응한다. 또한, 상기 분석의 각각의 pH는 글리세릴-2-포스페이트가 지시제 조성물에 포함되는 분석의 pH인 약 0.05 이내에 유지시킨다. 결국, pH 차이는 색 전이에 대해 원인으로서 제거된다. 그러므로, 지시제 조성물에 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물이 부족한 경우, 생성된 시험 스트립은 허용되지 않는 반사율의 큰 변화를 나타내고 이는 과산화 활성물질을 포함하지 않는 시험 샘플의 적절치 않은 포지티브 분석을 유도한다.
상기 기술된 시험 결과는 표 3에 요약되어 있고, 여기서 각종 지시제 조성물은 무수 상 시험 스트립속에 혼입시키고 과산화 활성물질에 대한 시험 샘플 분석에 사용한다. 특별하게, 표 3에 요약된 데이터에 나타낸 것처럼 본 발명의 지시제 조성물을 사용하는 경우, 헤모글로빈 0㎎/dL을 함유하는 시험 샘플 및 헤모글로빈 0.015㎎/dL을 함유하는 시험 샘플을 접촉시킨 지 1분 후 반사율 차이는 약 30 내지 약 35 유니트 즉, 29.6%에 비교해 65.5%, 또는 34.8%에 비교해 68.5%이다. 반사율의 이러한 큰 변화는 시험 샘플이 헤모글로빈을 포함하지 않는지(네가티브 분석) 또는 미량의 헤모글로빈(0.015㎎/dL)을 포함하는지 분석자에 따라 측정된다. 그러나, 지시제 조성물 D를 사용하는 경우, 반사율 차이는 단지 변동되는 약 5 내지 15유니트이고, 이로 인해 시험 샘플이 헤모글로빈을 함유하지 않는지 0.015㎎/dL을 포함하는지를 측정하기가 어렵다. 따라서, 과산화 활성물질에 대한 분석의 정밀성 및 민감성은 실질적으로 지시제 조성물내에 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물을 포함시켜 향상된다.
Figure kpo00026
일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물을 포함하는 본 발명의 지시제 조성물이 증가된 안정성을 갖고 적절치 않은 포지티브 분석의 문제점을 반드시 제거함을 입증하기 위해, 지시제 조성물내의 글리세릴-2-포스페이트를 인 화합물에 의해 제공된 안정화 효과를 검증하기 위해 다른 공지된 완충제로 대체시킨다. 따라서, 글리세릴-2-포스페이트 또는 또다른 공지된 완충제를 함유하는 시험 스트립을 시험 샘플에 접촉시키고 시험 스트립의 반사율 변화를 시간에 따라 탐지한다. 결과를 표 4에 요약하였고 여기서 제형 2의 지시제 조성물을 활용하지만, 지시제 조성물을 안정화시키고 완충제로서 제공되는 글리세릴-2-포스페이트를 또다른 완충제로 대체시킨다. 시험 스트립을 과산화 활성물질(물)을 포함하지 않는 시험 샘플에 적시고, 반사율은 시험 스트립과 시험 샘플을 접촉시킨지 대략 10분후 660㎚에서 측정한다.
Figure kpo00027
표 4에 요약된 데이터는 본 발명의 지시제 조성물을 혼입시키고, 글리세릴-1-포스페이트와 같은 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물을 혼입시킨 시험 스트립은 시간에 따라 바탕색을 발색시키지 않고(예: 반사율 변화는 -0.03이다), 반면 다른 완충제는 과산화 활성물질에 대한 정량분석에 간섭하여 충분한 바탕색(예: 반사율 변화는 1.44 내지 2.92이다)을 생성시킨다. 결국, 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물이 부족한 지시제 조성물을 포함하는 시험 패드는 과산화 활성물질이 부재하는 시험 샘플에 대한 적절치 않은 포지티브 분석, 또는 과산화 활성물질을 포함하는 시험 샘플에 대한 잘못된 고분석을 제공할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 충분한 장점을 얻기 위해, 과산화 활성물질에 대한 시험 샘플의 분석은 하기 성분을 포함하는 지시제 조성물로 함침시킨 적당한 담체 매트릭스를 포함하는 시험 패드를 함유한 무수 상 시험 스트립을 사용하여 수행한다:
Figure kpo00028
1N HCL을 사용하여 pH 6.3으로 조절.
완충제로서 또는 다른 완충제와의 혼합물로서 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물을 함유하는 본 발명의 지시제 조성물을 무수 상 시험 스트립 분석에 사용하는 경우, 과산화 활성물질에 대한 분석결과는 놀랍고 기대치 않은 결과이다. 과산화 활성물질에 무수 상 시험 스트립을 사용하는 블랭크 색상 발색은 아스코르베이트 간섭을 제공하는 잠복혈에 대한 분석방법과 같은 선행기술의 분석 방법하에 연속적이고 실질적인 문제점이 필수적으로 제거된다. 블랭크 색상 발색이 제거되고 그로 인해 적절치 않은 정량 분석의 문제점이 제거되는 지시제 조성물의 발견은 과산화 활성물질에 대한 습윤 상 및 무수 상 시험 스트립 분석기술의 기대치 않은 발전을 가져왔다. 지시제 조성물은 적절치 않은 포지티브 분석을 반드시 제거하므로 특히 저농도 과산화 활성물질에 대한 분석 민감성이 향상된다. 그러므로, 본 발명의 중요한 특색에 따라, 뇨 및 다른 시험 샘플 중의 과산화 활성물질에 대한 더욱 정밀하고 정확한 분석은 본 발명의 지시제 조성물을 활용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물은 금속 이온 착물 및 하이드로퍼옥사이드가 방지하고, 지시 염료를 조기 산화시키지 못하게 하므로써 이로 인해 시험 샘플 중의 과산화 활성물질의 농도에 대한 반응으로 색 전이를 나타내는 더욱 안정한 지시제 조성물이 제공된다. 일반적으로, 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물을 함유하는 본 발명의 지시제 조성물은 금속 이온 착물, 하이드로퍼옥사이드 및 지시 염료 사이의 상호작용으로 인한 바탕색의 조기 발색을 방지하고; 지시 염료, 금속 이온 착물 및 하이드로퍼옥사이드를 사용하는 습윤 상 및 무수 상 시험 스트립에서의 지시 염료의 조기 산화를 방지하며; 산성 pH에서 습윤 상 및 무수 상 분석을 완충시켜 더욱 가시적인 색상 발색을 제공하고; 지시 염료, 금속 이온 착물 및 하이드로퍼옥사이드를 활용하는 과산화 활성물질에 대한 습윤상 분석을 제공하며; 과산화 활성물질 및 하이드로퍼옥사이드에 의해 지시 염료 산화를 간섭하지 않고; 금속 이온 킬레이트 및 하이드로퍼옥사이드에 의해 제공된 아스코르베이트 방지를 간섭하지 않는다.
명백하게, 앞에서 설명된 것처럼 본 발명의 취지 및 범주에서 벗어나지 않는 다양한 개선 및 변형이 가능하므로, 첨부된 특허청구의 범위이외의 것으로는 제한되지 않는다.

Claims (10)

  1. 지시 염료(a), 하이드로퍼옥사이드(b), 금속 이온 착물(c), 하기 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물(d) 및 적당한 담체 비히클(e)을 포함하는, 시험 샘플 속의 과산화 활성물질의 존재를 입증하거나 농도를 측정하기 위해 시험 샘플과 접촉시킬 때 충분한 색 전이를 나타낼 수 있는 조성물.
    Figure kpo00029
    상기식에서, R1및 R2는 각각 수소, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 1 내지 12의 알킬 잔기, 치환되거나 치환되지 않은 방향족 잔기 및 지방족 또는 방향족 다가 화합물 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, X는 O, S 또는 NH이다.
  2. 제1항에 있어서, 시험 샘플 1조부(one trillion parts)속의 과산화 활성물질 1부의 존재를 입증하거나 농도를 측정하기에 충분한 색 전이를 나타낼 수 있는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 지시 염료가 조성물 1ℓ당 5밀리몰 내지 50밀리몰 범위의 양으로 존재하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 지시 염료가 산화-환원(redox) 지시제인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 산화-환원 지시제가 벤지딘, o-톨리딘, 3,3',5,5'-테트라알킬벤지딘(여기서, 알킬그룹의 탄소수는 1 내지 6이다), o-디아니시딘, 2,7-디아미노플루오렌, 비스-(N-에틸-퀴놀-2-온)-아진, (N-메틸벤즈티아졸-2-온)-(1-에틸-3-페닐-5-메틸트리아졸-2-온)-아진 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 지시 염료가 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 하이드로퍼옥사이드가 조성물 1ℓ당 5밀리몰 내지 100밀리몰 범위의 양으로 존재하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 하이드로퍼옥사이드가 유기 하이드로퍼옥사이드인 조성물.
  9. 시험 샘플을 지시 염료, 하이드로퍼옥사이드, 금속 이온 착물, 하기 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물 및 적절한 담체 비히클을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계(a) 및 조성물의 색 변화 강도 또는 정도로부터 시험 샘플 속의 과산화 활성물질의 존재를 입증하거나 농도를 측정하는 단계(b)를 포함하여, 시험 샘플 속의 과산화 활성물질의 존재를 입증하거나 농도를 측정하는 방법.
    Figure kpo00030
    상기식에서, R1및 R2는 각각 수소, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 1 내지 12의 알킬 잔기, 치환되거나 치환되지 않은 방향족 잔기 및 지방족 또는 방향족 다가 화합물의 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, X는 O, S 또는 NH이다.
  10. 액체 샘플을 지시 염료, 하이드로퍼옥사이드, 금속 이온 착물, 하기 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 인 화합물 및 적당한 담체 비히클을 포함하는 조성물을 포함하는 시약 시험 패드를 포함하는 분석물 검출장치와 접촉시키는 단계(a) 및 액체 샘플 속에 함유되어 있는 과산화 활성물질에 반응하는 분석물 검출장치를 색 전이에 대해 시험하는 단계(b)를 포함하여, 액체 샘플 속의 과산화 활성물질의 존재를 입증하거나 농도를 측정하는 방법.
    Figure kpo00031
    상기식에서, R1및 R2는 각각 수소, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 1 내지 12의 알킬 잔기, 치환되거나 치환되지 않은 방향족 잔기 및 지방족 또는 방향족 다가 화합물 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, X는 O, S 또는 NH이다.
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