JPWO2020043903A5

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Publication number: JPWO2020043903A5
Application number: JP2021512207A
Authority: JP
Publication date: 2022-09-07
Anticipated expiration: 2039-08-30

Claims

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞の機能を評価するためのインビトロ方法であって：
（ｉ）同じ細胞株から調製された標的抗原発現細胞及びＣＡＲ発現細胞を異なる標識で標識すること；
（ｉｉ）標識された標的細胞と標識されたＣＡＲ発現細胞を共培養すること、及び、
（ｉｉｉ）前記標的抗原発現細胞からの前記ＣＡＲ発現細胞による膜獲得を評価するために細胞を分析することであって、前記膜獲得が、標的抗原への前記ＣＡＲ発現細胞の結合及び／又は活性化能力の指標であり、それにより前記ＣＡＲ発現細胞の機能を評価することを含み；且つ
前記細胞が免疫細胞である、方法。 An in vitro method for assessing the function of chimeric antigen receptor (CAR)-expressing cells comprising:
(i) labeling target antigen-expressing cells and CAR-expressing cells prepared from the same cell line with different labels;
(ii) co-culturing the labeled target cells and the labeled CAR-expressing cells, and
(iii) analyzing cells to assess membrane acquisition by said CAR-expressing cells from said target antigen-expressing cells, wherein said membrane acquisition comprises binding and/or activity of said CAR-expressing cells to target antigen; and wherein said cells are immune cells.

前記共培養が、少なくとも１時間の間行われる、請求項１に記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein said co-cultivation is performed for at least 1 hour .

前記共培養が、１～５時間の間行われる、請求項１に記載の方法。The method of claim 1, wherein said co-cultivation is performed for 1-5 hours.

前記共培養が、１～３時間の間行われる、請求項１に記載の方法。The method of claim 1, wherein said co-cultivation is performed for 1-3 hours.

前記共培養が、１：０．５～１：１０の標的抗原発現細胞対ＣＡＲ発現細胞の比率で行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。 A method according to any one of claims 1 to 4, wherein said co-culturing is performed at a ratio of target antigen-expressing cells to CAR-expressing cells of 1:0.5 to 1:10.

前記細胞分析が、細胞選別分析によって行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。 A method according to any one of claims 1 to 5 , wherein said cell analysis is performed by cell sorting analysis .

前記細胞選別分析が、フローサイトメトリー分析である、請求項６に記載の方法。7. The method of claim 6, wherein said cell sorting analysis is flow cytometry analysis.

前記標識された標的抗原細胞と前記標識されたＣＡＲ発現細胞を共培養する前に、前記ＣＡＲが由来する抗体と比較して同じ又は重複するエピトープを認識する抗体と共に前記標的抗原発現細胞を培養する工程をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。 Prior to co-culturing the labeled target antigen cells and the labeled CAR-expressing cells, the target antigen-expressing cells are cultured with an antibody that recognizes the same or overlapping epitope as compared to the antibody from which the CAR is derived. A method according to any one of claims 1 to 7 , further comprising steps.

前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。 The method of any one of claims 1-8 , wherein said antibody is a monoclonal antibody.

前記モノクローナル抗体が、前記ＣＡＲが由来するモノクローナル抗体のＣＤＲを含むモノクローナル抗体である、請求項９に記載の方法。10. The method of claim 9, wherein said monoclonal antibody is a monoclonal antibody comprising the CDRs of the monoclonal antibody from which said CAR was derived.

前記標的抗原を発現しない対照細胞を試験することをさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。 The method of any one of claims 1-10 , further comprising testing control cells that do not express the target antigen.

前記標的抗原を認識しない対照ＣＡＲ発現細胞を試験することをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。 The method of any one of claims 1-11 , further comprising testing control CAR-expressing cells that do not recognize said target antigen.

機能的なＣＡＲ発現細胞及び／又はＣＡＲコンストラクトの選択をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。 A method according to any one of claims 1 to 12 , further comprising selecting functional CAR-expressing cells and/or CAR constructs.

前記標識が、膜マーカーである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。 A method according to any one of claims 1 to 13 , wherein said label is a membrane marker.

前記膜マーカーが、親油性トレーサー又は色素であり、さらにより好ましくは、ＭＩＮＩ２６、ＰＫＨ２６－ＰＣＬ、ＰＫＨ６７、ＭＩＮＩ６７、ＰＫＨ６７－ＰＣＬ、ＰＫＨ２６、ＰＫＨ２６－ＰＣＬ、ＶｙｂｒａｎｔＣＭ－ＤｉＩ、ＤｉＩ、及びＤｉＯからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。Said membrane marker is a lipophilic tracer or dye, even more preferably the group consisting of MINI26, PKH26-PCL, PKH67, MINI67, PKH67-PCL, PKH26, PKH26-PCL, Vybrant CM-DiI, DiI and DiO 15. The method of claim 14, selected from:

前記免疫細胞が、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、単球、及び抗原提示細胞からなる群から選択される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。 16. The immune cell of any one of claims 1-15 , wherein said immune cells are selected from the group consisting of T lymphocytes, B lymphocytes, natural killer cells, natural killer T cells, monocytes, and antigen presenting cells. Method.

養子細胞療法のために機能的ＣＡＲ発現細胞を選択するためのインビトロ方法であって：
（ｉ）免疫細胞の集団にＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入すること、
（ｉｉ）ＣＡＲを発現する前記単離された細胞の亜集団を選択すること、及び、
（ｉｉｉ）請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法によってそれらの機能を評価すること、
（ｉｖ）任意選択により、前記抗原発現細胞からの膜獲得を経験したＣＡＲ発現細胞から機能的ＣＡＲ発現細胞及び／又はＣＡＲ核酸コンストラクトを選択することを含む、方法。 An in vitro method for selecting functional CAR-expressing cells for adoptive cell therapy comprising:
(i) transducing a population of immune cells with a nucleic acid sequence encoding a CAR;
(ii) selecting a subpopulation of said isolated cells that express CAR; and
(iii ) assessing their function by a method according to any one of claims 1-11;
(iv) optionally, selecting functional CAR-expressing cells and/or CAR nucleic acid constructs from CAR-expressing cells that have undergone membrane acquisition from said antigen-expressing cells.

前記免疫細胞の集団が、処置される対象からの生物学的サンプルから単離された免疫細胞の集団である、請求項１７に記載の方法。18. The method of claim 17, wherein said population of immune cells is a population of immune cells isolated from a biological sample from the subject to be treated.

前記標的抗原発現細胞が、ＣＡＲが作製された抗原を発現する、請求項１７に記載の方法。18. The method of claim 17, wherein said target antigen-expressing cells express the antigen for which the CAR was generated.

前記抗原が、ＨＬＡ－Ｇである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。 A method according to any one of claims 1 to 19 , wherein said antigen is HLA- G .

前記ＨＬＡ－Ｇが、ＨＬＡ－Ｇ１である、請求項２０に記載の方法。21. The method of claim 20, wherein said HLA-G is HLA-G1.