JP2021536246A - How to evaluate the function of CAR - Google Patents
How to evaluate the function of CAR Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021536246A JP2021536246A JP2021512207A JP2021512207A JP2021536246A JP 2021536246 A JP2021536246 A JP 2021536246A JP 2021512207 A JP2021512207 A JP 2021512207A JP 2021512207 A JP2021512207 A JP 2021512207A JP 2021536246 A JP2021536246 A JP 2021536246A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- car
- cell
- antigen
- expressing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 549
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 315
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 171
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 170
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 169
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 93
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 91
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims abstract description 46
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 claims description 137
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 54
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 50
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 claims description 46
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 claims description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 27
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 20
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 11
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 6
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000011467 adoptive cell therapy Methods 0.000 claims description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 claims description 2
- 230000005883 trogocytosis Effects 0.000 abstract description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 14
- 238000012546 transfer Methods 0.000 abstract description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 48
- 230000006870 function Effects 0.000 description 35
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 33
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 24
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 23
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 17
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 16
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 15
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 14
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 9
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 7
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 4
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 4
- 108091012583 BCL2 Proteins 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- SAZUGELZHZOXHB-UHFFFAOYSA-N acecarbromal Chemical compound CCC(Br)(CC)C(=O)NC(=O)NC(C)=O SAZUGELZHZOXHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 3
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 3
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 3
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000000981 bystander Effects 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 2
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 2
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000009109 curative therapy Methods 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002861 immature t-cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000003125 jurkat cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- -1 temperature Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101500002116 Agrotis ipsilon Tachykinin-related peptide 6 Proteins 0.000 description 1
- 102000016605 B-Cell Activating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010028006 B-Cell Activating Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 208000006332 Choriocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 101000691214 Haloarcula marismortui (strain ATCC 43049 / DSM 3752 / JCM 8966 / VKM B-1809) 50S ribosomal protein L44e Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001023379 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000057613 Mucosa-Associated Lymphoid Tissue Lymphoma Translocation 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700026676 Mucosa-Associated Lymphoid Tissue Lymphoma Translocation 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000020385 T cell costimulation Effects 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 208000031673 T-Cell Cutaneous Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009831 antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 239000013626 chemical specie Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 201000007241 cutaneous T cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007822 cytometric assay Methods 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007898 magnetic cell sorting Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000005962 mycosis fungoides Diseases 0.000 description 1
- 230000004719 natural immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002352 nonmutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 208000025638 primary cutaneous T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 102220192602 rs145106685 Human genes 0.000 description 1
- 102200033501 rs387907005 Human genes 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- ZWCXYZRRTRDGQE-LUPIJMBPSA-N valyl gramicidin a Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC=O)C(C)C)CC(C)C)C(=O)NCCO)=CNC2=C1 ZWCXYZRRTRDGQE-LUPIJMBPSA-N 0.000 description 1
- OPUPHQHVRPYOTC-UHFFFAOYSA-N vgf3hm1rrf Chemical compound C1=NC(C(=O)C=2C3=CC=CN=2)=C2C3=NC=CC2=C1 OPUPHQHVRPYOTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Ecology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【課題】ＣＡＲの機能を評価する方法に関する。【解決手段】本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞の機能を評価するための方法に関する。より具体的には、この方法は、抗原発現標的細胞と抗原特異的免疫細胞との間の膜転移を伴うトロゴサイトーシスプロセスに基づいている。【選択図】図２PROBLEM TO BE SOLVED: To evaluate a function of CAR. The present invention relates to a method for evaluating the function of a chimeric antigen receptor (CAR) expressing cell. More specifically, this method is based on a trogocytosis process with membrane transfer between antigen expression target cells and antigen-specific immune cells. [Selection diagram] Fig. 2
Description
本発明は、免疫学、細胞生物学、及び分子生物学の分野に関する。特定の態様では、本発明の分野は免疫療法に関する。より具体的には、本発明は、特異性、機能、及び感度などのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）特性を決定するための方法に関する。 The present invention relates to the fields of immunology, cell biology, and molecular biology. In certain aspects, the field of the invention relates to immunotherapy. More specifically, the invention relates to methods for determining chimeric antigen receptor (CAR) properties such as specificity, function, and sensitivity.
何年もの間、癌処置の基礎は、手術、化学療法、及び放射線療法であった。しかしながら、過去数年間で、免疫療法が、癌処置の効果的なツールとして浮上してきた。 For many years, the basis of cancer treatment has been surgery, chemotherapy, and radiation therapy. However, in the last few years, immunotherapy has emerged as an effective tool for treating cancer.
遺伝子工学の進歩が、Ｔ細胞などのヒト免疫細胞に導入して、抗原特異性をリダイレクトし、エフェクター免疫細胞の機能を強化することができる、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれる合成腫瘍標的受容体の設計につながった。ＣＡＲは、１９８０年代半ばに最初に開発され、それ以来、これらの受容体への関心が高まっている。これらの受容体は、ＨＬＡ−ペプチド複合体とは独立に特定の抗原認識を提供することによって、Ｔ細胞を発現する固有のＴＣＲ特異性をバイパスするために最初に作製された。プロトタイプの一本鎖ＣＡＲは、１９９３年にEshharらによる研究で最初に説明され、この一本鎖ＣＡＲでは、Ｔ細胞の特異的活性化及び標的化は、標的抗原特異的抗体ドメインと、Ｆｃイプシロン受容体のγシグナル伝達サブユニット又はＴ細胞受容体ＣＤ３複合体のζシグナル伝達サブユニットとからなる分子を介して媒介された（Eshhar et al., 1993, Proc Natl Acad Sci., 90, 720-4）。それ以来、多くのグループが、単一の腫瘍に対する特異性及び強化されたシグナル伝達エンドドメイン（endodomain）を備えたＣＡＲ分子を考案してきた。今日、ＣＡＲの結合ドメインは、典型的には、ライブラリーから選択され、柔軟なリンカーによって結合されたモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の軽鎖及び重鎖可変断片を含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメイン又は抗体結合断片（Ｆａｂ）からなる。ｓｃＦｖは、それが由来する完全な抗体と同じ特異性及び同様の親和性を保持し、目的の標的抗原に特異的に結合することができる。従って、ＣＡＲは、単一の融合分子内で抗原特異性とＴ細胞活性化特性を組み合わせている。実際、ｓｃＦｖは、ＣＤ３ζを含む細胞内シグナル伝達モジュールに連結され、抗原結合時にＴ細胞の活性化を誘導する。モジュール構造は、共刺激を模倣しようとして、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのみを備えた第１世代のＣＡＲから、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０などのシグナル伝達エンドドメインをＣＤ３ζに連結する第２世代及び第３世代ＣＡＲに拡張されている。 Advances in genetic engineering can be introduced into human immune cells such as T cells to redirect antigen specificity and enhance the function of effector immune cells, a synthetic tumor target receptor called a chimeric antigen receptor (CAR). It led to the design of the body. CAR was first developed in the mid-1980s, and since then there has been increasing interest in these receptors. These receptors were first created to bypass the inherent TCR specificity of expressing T cells by providing specific antigen recognition independently of the HLA-peptide complex. The prototype single-stranded CAR was first described in a study by Eshhar et al. In 1993, in which T cell-specific activation and targeting are targeted antigen-specific antibody domains and Fc epsilon. It was mediated via a molecule consisting of the γ signaling subunit of the receptor or the ζ signaling subunit of the T cell receptor CD3 complex (Eshhar et al., 1993, Proc Natl Acad Sci., 90, 720- Four). Since then, many groups have devised CAR molecules with specificity for a single tumor and enhanced signaling endodomains. Today, the binding domain of CAR is typically a single-chain antibody (scFv) antigen, including light and heavy variable fragments of a monoclonal antibody (Mab) selected from a library and bound by a flexible linker. It consists of a binding domain or antibody binding fragment (Fab). scFv retains the same specificity and affinity as the complete antibody from which it is derived and is capable of specifically binding to the target antigen of interest. Therefore, CAR combines antigen specificity and T cell activation properties within a single fusion molecule. In fact, scFv is linked to an intracellular signaling module containing CD3ζ and induces T cell activation during antigen binding. The modular structure attempts to mimic co-stimulation from the first generation CAR with only the CD3ζ signaling domain to the second and third generations linking signaling end domains such as CD28, 4-1BB, OX40 to CD3ζ. It has been extended to generation CAR.
ＣＡＲは、ＭＨＣに依存しないメカニズムでＴ細胞を癌の標的にすることを可能にした。ＣＡＲのリガンド結合は、受容体親和性、抗原密度、及び空間特性において、ペプチド／ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）に結合するＴＣＲのリガンド結合とは異なり；特定の標的分子に最適なＣＡＲを設計するための実験的アプローチは、インビトロ又はヒト腫瘍異種移植モデルにおける形質導入Ｔ細胞の機能アッセイに依存している。ＴＣＲ／ｐＭＨＣ認識で観察されるように、ＣＡＲが標的分子と連続的に結合し、組織化されたシナプスにクラスター化する可能性が低いため、ＣＡＲ認識にはＴＣＲよりも高いリガンド密度が必要であると考えられる。これらの受容体の最適な構成及び適用は、親和性と特異性に加えて、コンストラクトの設計、シグナル伝達ドメイン、ベクター送達システム、レシピエントの免疫細胞集団、及び製造に依存している。 CAR has made it possible to target T cells for cancer by an MHC-independent mechanism. Ligand binding of CAR differs from ligand binding of TCRs that bind to peptide / MHC (pMHC) in receptor affinity, antigen density, and spatial properties; experiments to design optimal CAR for a particular target molecule. The approach relies on a functional assay of transfected T cells in an in vitro or human tumor heterologous transplant model. CAR recognition requires a higher ligand density than TCR, as CAR recognition is unlikely to bind continuously to the target molecule and cluster into organized synapses, as observed in TCR / pMHC recognition. It is believed that there is. Optimal composition and application of these receptors depends on the design of the construct, signaling domain, vector delivery system, recipient immune cell population, and production, in addition to affinity and specificity.
特に、ＣＡＲの有効性は、１つにはＣＡＲ自体の親和性に依存し、もう１つはエクトドメイン（ectodomain）の構成要素に依存する。ｓｃＦｖ内の柔軟なリンカー配列の存在、及びエクトドメインとエンドドメイン（ヒンジ領域と膜貫通領域）との間の連結のタイプは、（ｉ）結果として得られるＣＡＲの長さと柔軟性、（ｉｉ）その細胞表面密度、（ｉｉｉ）持続性シグナル伝達によって自己凝集してＴ細胞枯渇を引き起こす傾向、及び（ｉｖ）意図された標的抗原以外の分子への潜在的な結合を変更することによってＣＡＲ機能を大幅に変更することができる。 In particular, the effectiveness of CAR depends in part on the affinity of the CAR itself and on the components of the ectodomain. The presence of flexible linker sequences within scFv, and the type of linkage between the ect domain and the end domain (hinge and transmembrane regions), are (i) the length and flexibility of the resulting CAR, (ii). CAR function by altering its cell surface density, (iii) a tendency to self-aggregate by sustained signaling to cause T cell depletion, and (iv) potential binding to molecules other than the intended target antigen. It can be changed significantly.
従って、ＣＡＲの特異性及び機能は、その構造（ＣＡＲの長さとエピトープの距離、スペーサー、膜貫通領域、及びエンドドメイン領域）及びその感受性（抗体親和性、抗原密度／親和性、信号閾値）の影響を受け得る。しかしながら、この問題に対処するために設計された研究及びアッセイは限られていてほとんどなく、最適な抗体又はＣＡＲコンストラクトの選択は、未だ証明されておらず、これは一般に、部分的にＣＡＲ機能の評価につながるが、これらの特性は、ＣＡＲベースの治療法を改善するために非常に興味深いものである。 Therefore, the specificity and function of CAR is its structure (CAR length and epitope distance, spacer, transmembrane region, and end domain region) and its sensitivity (antibody affinity, antigen density / affinity, signal threshold). Can be affected. However, few studies and assays have been designed to address this problem, and the selection of the optimal antibody or CAR construct has not yet been proven, which is generally partly of the CAR function. Although leading to evaluation, these properties are of great interest for improving CAR-based therapies.
例えば、サイトカインの放出を測定することによる（Clay et al, J. Immunol., 163 : 507-513 (1999)）又は細胞傷害性を測定することによる（Zhao et al, J. Immunol., 174: 4415-4423 (2005)）、標的細胞を認識する能力及び抗原特異性についてＣＡＲを試験する方法は当技術分野で公知である。しかしながら、これらの方法は、時間がかかり、実施が困難であり得る。従って、ＣＡＲ発現細胞の機能を評価するための単純で迅速且つ効果的な方法を開発する必要がある。 For example, by measuring the release of cytokines (Clay et al, J. Immunol., 163: 507-513 (1999)) or by measuring cytotoxicity (Zhao et al, J. Immunol., 174:). 4415-4423 (2005)), methods of testing CAR for ability to recognize target cells and antigen specificity are known in the art. However, these methods are time consuming and can be difficult to implement. Therefore, there is a need to develop simple, rapid and effective methods for assessing the function of CAR-expressing cells.
発明の概要
この問題を克服するために、本発明者らは、ＣＡＲ発現細胞の機能を評価する方法を開発した。この方法は、抗原発現標的細胞とＣＡＲ発現細胞との間の膜転移を伴うトロゴサイトーシス（trogocytosis）に基づいている。このアッセイでは、組換えＣＡＲ構造の構造と感度の両方に応じて、ＣＡＲエフェクター細胞の活性化を独自の迅速な方法で評価することができる。
Outline of the Invention In order to overcome this problem, the present inventors have developed a method for evaluating the function of CAR-expressing cells. This method is based on trogocytosis with membrane metastasis between antigen-expressing target cells and CAR-expressing cells. In this assay, activation of CAR effector cells can be assessed in a unique and rapid manner, depending on both the structure and sensitivity of the recombinant CAR structure.
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞の機能を評価するためのインビトロ方法に関し、この方法は：
−同じ細胞株から調製された標的抗原発現細胞及びＣＡＲ発現細胞を異なる標識で標識すること；
−標識された標的細胞と標識されたＣＡＲ発現細胞を共培養すること、
−標的抗原発現細胞からのＣＡＲ発現細胞による膜獲得を評価するために細胞を分析することであって、この膜獲得が、標的抗原へのＣＡＲ発現細胞の結合及び／又は活性化能力の指標であり、それによりＣＡＲ発現細胞の機能を評価することを含み、
好ましくは、ＣＡＲ発現細胞は免疫細胞である。
The present invention relates to an in vitro method for assessing the function of chimeric antigen receptor (CAR) -expressing cells.
-Label target antigen-expressing cells and CAR-expressing cells prepared from the same cell line with different labels;
-Co-culturing labeled target cells with labeled CAR-expressing cells,
-Analysis of cells to assess membrane acquisition by CAR-expressing cells from target antigen-expressing cells, which is an indicator of the ability of CAR-expressing cells to bind and / or activate to the target antigen. Yes, thereby including assessing the function of CAR-expressing cells,
Preferably, the CAR expressing cell is an immune cell.
好ましくは、共培養は、少なくとも１時間、好ましくは１〜５時間、さらにより好ましくは１〜３時間行われる。特に、共培養は、１：０．５〜１：１０の標的抗原発現細胞対ＣＡＲ発現細胞の比率で行われる。 Preferably, the co-culture is carried out for at least 1 hour, preferably 1-5 hours, and even more preferably 1-3 hours. In particular, co-culture is performed at a ratio of target antigen-expressing cells to CAR-expressing cells of 1: 0.5 to 1:10.
細胞分析は、細胞選別分析、好ましくはフローサイトメトリー分析によって行われる。 Cell analysis is performed by cell selection analysis, preferably flow cytometric analysis.
好ましくは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞の機能を評価するためのインビトロ方法は、標識された標的抗原細胞と標識されたＣＡＲ発現細胞を共培養する前に、ＣＡＲが由来する抗体と比較して同じ又は重複するエピトープを認識する抗体と共に標的抗原発現細胞を培養する工程をさらに含む。このような抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であり、好ましくは、ＣＡＲが由来するモノクローナル抗体のＣＤＲを含むモノクローナル抗体である。 Preferably, an in vitro method for assessing the function of chimeric antigen receptor (CAR) -expressing cells is compared to the CAR-derived antibody prior to co-culturing the labeled target antigen cells with the labeled CAR-expressing cells. Further comprising culturing target antigen expressing cells with an antibody that recognizes the same or overlapping epitopes. Such an antibody is preferably a monoclonal antibody, preferably a monoclonal antibody containing the CDR of the monoclonal antibody from which CAR is derived.
好ましくは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞の機能を評価するためのインビトロ方法は、標的抗原を発現しない対照細胞を試験することをさらに含む。そのような方法は、標的抗原を認識しない対照ＣＡＲ発現細胞を試験することをさらに含み得る。そのような方法はまた、機能的なＣＡＲ発現細胞及び／又はＣＡＲコンストラクトの選択をさらに含み得る。 Preferably, an in vitro method for assessing the function of chimeric antigen receptor (CAR) expressing cells further comprises testing control cells that do not express the target antigen. Such methods may further comprise testing control CAR expressing cells that do not recognize the target antigen. Such methods may further include selection of functional CAR-expressing cells and / or CAR constructs.
標識は、膜マーカー、好ましくは親油性トレーサー又は色素であり、さらにより好ましくは、ＭＩＮＩ２６、ＰＫＨ２６−ＰＣＬ、ＰＫＨ６７、ＭＩＮＩ６７、ＰＫＨ６７−ＰＣＬ、ＰＫＨ２６、ＰＫＨ２６−ＰＣＬ、Ｖｙｂｒａｎｔ ＣＭ−ＤｉＩ、ＤｉＩ、及びＤｉＯからなる群から選択される。 The label is a membrane marker, preferably a lipophilic tracer or dye, and even more preferably MINI26, PKH26-PCL, PKH67, MINI67, PKH67-PCL, PKH26, PKH26-PCL, Vybrant CM-DiI, DiI, and DiO. It is selected from the group consisting of.
好ましくは、細胞は、免疫細胞であり、好ましくはＴリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、単球、及び抗原提示細胞から選択される。 Preferably, the cell is an immune cell, preferably selected from T lymphocytes, B lymphocytes, natural killer cells, natural killer T cells, monospheres, and antigen presenting cells.
本発明はまた、養子細胞療法のために機能的ＣＡＲ発現細胞を選択するためのインビトロ方法に関し、この方法は：
（ｉ）免疫細胞の集団、好ましくは処置される対象からの生物学的サンプルから単離された免疫細胞の集団にＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入すること、
（ｉｉ）ＣＡＲを発現する前記単離された細胞の亜集団を選択すること、及び、
（ｉｉｉ）好ましくはＣＡＲが作製された抗原を発現する標的抗原発現細胞について、前記請求項のいずれかに記載の方法によってそれらの機能を評価すること、
（ｉｖ）任意選択により、抗原発現細胞からの膜獲得を経験したＣＡＲ発現細胞から機能的ＣＡＲ発現細胞及び／又はＣＡＲ核酸コンストラクトを選択することを含む。
The invention also relates to an in vitro method for selecting functional CAR-expressing cells for adoptive cell therapy.
(I) Transducing a nucleic acid sequence encoding CAR into a population of immune cells, preferably a population of immune cells isolated from a biological sample from a subject to be treated.
(Ii) Selecting a subpopulation of the isolated cells expressing CAR, and
(Iii) For target antigen-expressing cells that express the antigen for which CAR has been produced, the function thereof is evaluated by the method according to any one of the above claims.
(Iv) Arbitrarily comprising selecting functional CAR-expressing cells and / or CAR nucleic acid constructs from CAR-expressing cells that have experienced membrane acquisition from antigen-expressing cells.
好ましくは、抗原はＨＬＡ−Ｇであり、さらにより好ましくはＨＬＡ−Ｇ１である。 Preferably, the antigen is HLA-G, and even more preferably HLA-G1.
本発明はまた、本明細書に開示される任意のインビトロ方法によって選択される機能的ＣＡＲコンストラクトを含む細胞、好ましくは免疫細胞に関する。 The invention also relates to cells, preferably immune cells, comprising a functional CAR construct selected by any in vitro method disclosed herein.
発明の詳細な説明
序論
本発明者らは、特異性、機能、及び感受性などのＣＡＲ特性を決定するための、新規な独自の容易且つ迅速な方法を開発した。この方法は、抗原発現標的細胞と抗原特異的免疫細胞との間での膜転移を伴うトロゴサイトーシスプロセスに基づいている。この方法では、実験室で容易に行うことができる工程を使用することによって、これらの特性を１日かからずに決定することができる。この方法の有効性と単純さの重要な側面は、ＣＡＲ発現細胞及び標的抗原発現細胞を調製するために同じ細胞株を使用することである。
Detailed Description of the Invention Introduction We have developed a novel, unique, easy and rapid method for determining CAR properties such as specificity, function, and susceptibility. This method is based on a trogocytosis process with membrane transfer between antigen expression target cells and antigen-specific immune cells. In this method, these properties can be determined in less than a day by using steps that can be easily performed in the laboratory. An important aspect of the effectiveness and simplicity of this method is the use of the same cell line to prepare CAR-expressing cells and target antigen-expressing cells.
従って、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞の機能を評価するためのインビトロ方法に関し、この方法は、同じ細胞株に属する標的抗原発現細胞及びＣＡＲ発現細胞を異なる標識で標識すること、標識された標的細胞と標識されたＣＡＲ発現細胞を共培養すること、並びに標的抗原発現細胞からのＣＡＲ発現細胞による膜獲得を評価するために細胞を分析することを含み、この膜獲得は、標的抗原へのＣＡＲ発現細胞の結合及び／又は活性化能力の指標である。 Accordingly, the present invention relates to an in vitro method for assessing the function of chimeric antigen receptor (CAR) -expressing cells, wherein the target antigen-expressing cells and CAR-expressing cells belonging to the same cell line are labeled with different labels. The membrane acquisition comprises co-culturing the labeled target cells with the labeled CAR-expressing cells and analyzing the cells to evaluate the membrane acquisition by the CAR-expressing cells from the target antigen-expressing cells. It is an index of the ability of CAR-expressing cells to bind and / or activate to a target antigen.
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
Definitions To facilitate understanding of the invention, some terms are defined below.
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）、「エンジニアリングされた細胞受容体」、「キメラ細胞受容体」、又は「キメラ免疫受容体」（ＩＣＲ）という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に抗原結合特異性を移植するエンジニアリングされた受容体を指し、従って、抗原結合ドメインの抗原結合特性を、Ｔ細胞の溶解能力及び自己複製などの免疫細胞の免疫原性活性と組み合わせる。特に、ＣＡＲは、抗原に結合することができる細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、任意選択によるヒンジドメイン、及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質を指す。「抗原に結合できる細胞外ドメイン」、「外部ドメイン」、「エクトドメイン」、及び「抗原結合ドメイン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、標的抗原に結合できる任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。特に、本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」又は「抗原特異的標的ドメイン」という用語は、特定の抗原を標的とし、それに結合するＣＡＲの領域を指す。ＣＡＲが宿主細胞で発現されると、このドメインは、受容体の細胞外ドメイン（エクトドメイン）を形成する。ＣＡＲの抗原結合ドメインは、典型的には抗体に由来し、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメイン又は抗原結合断片（Ｆａｂ）からなり得る。「細胞内ドメイン」、「内部ドメイン」、「細胞質ドメイン」、及び「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、本明細書で互換的に使用され、細胞内の生物学的プロセスの活性化又は阻害を引き起こすシグナルを伝達するドメインとして機能することが知られている任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを含む核酸配列が形質導入された細胞の免疫エフェクター機能、例えばサイトカインの分泌を含む細胞溶解活性及びヘルパー活性を促進するシグナルを生成することができる。「膜貫通ドメイン」という用語は、細胞膜にまたがることが知られており、細胞外ドメインとシグナル伝達ドメインを連結するように機能し得る任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。これは、単一のアルファヘリックス、膜貫通ベータバレル、グラミシジンＡのベータ−ヘリックス、又はその他の構造であり得る。典型的には、膜貫通ドメインは、内在性タンパク質としても知られる膜貫通タンパク質の単一の膜貫通アルファヘリックスを示す。キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間のリンカーとして機能する「ヒンジドメイン」を任意選択により含み得る。本明細書で使用される「ヒンジ」、「スペーサー」、又は「リンカー」という用語は、例えば、柔軟性、改善された空間構成、及び／又は近接性を与えるために、ポリペプチドコンストラクトの２つ以上のドメイン間で典型的にコードされる可変長のアミノ酸配列を指す。ｓｃＦｖに関連して使用される「リンカー」という用語は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を１つに連結するために、単独で又は組み合わせて使用されるグリシン及び／又はセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。キメラ抗原受容体は、任意選択によりシグナルペプチドを含み得る。「シグナルペプチド」、「標的シグナル」、「局在化シグナル」、「輸送ペプチド」、又は「リーダー配列」という用語は、分泌経路に向かう、新しく合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短いペプチドを指す。シグナルペプチドのコアは、疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。シグナルペプチドは、成熟ポリペプチドから切断されてもよいし、切断されなくてもよい。 As used herein, the terms "chimeric antigen receptor" (CAR), "engineered cell receptor", "chimera cell receptor", or "chimera immunoreceptor" (ICR) are used in immune cells (ICR). For example, it refers to an engineered receptor that transplants antigen-binding specificity into (T cells or NK cells), thus the antigen-binding properties of the antigen-binding domain, the lytic ability of T cells and the immunogen of immune cells such as self-renewal. Combine with sexual activity. In particular, CAR refers to a fusion protein comprising an extracellular domain capable of binding an antigen, a transmembrane domain, an optional hinge domain, and at least one intracellular domain. The terms "extracellular domain capable of binding an antigen", "external domain", "ect domain", and "antigen binding domain" are used interchangeably herein or any oligopeptide capable of binding a target antigen. Means a polypeptide. In particular, the terms "antigen binding domain" or "antigen-specific target domain" as used herein refer to a region of CAR that targets and binds to a particular antigen. When CAR is expressed in the host cell, this domain forms the extracellular domain (ect domain) of the receptor. The antigen-binding domain of a CAR is typically derived from an antibody and can consist of an antigen-binding domain of a single-chain antibody (scFv) or an antigen-binding fragment (Fab). The terms "intracellular domain," "internal domain," "cytoplasmic domain," and "intracellular signaling domain" are used interchangeably herein to activate or inhibit intracellular biological processes. Means any oligopeptide or polypeptide known to function as a domain that transmits a signal that causes. The intracellular signaling domain can generate signals that promote the immune effector function of cells transduced with a nucleic acid sequence containing CAR, such as cytolytic activity and helper activity, including the secretion of cytokines. The term "transmembrane domain" means any oligopeptide or polypeptide that is known to span the cell membrane and can function to link the extracellular domain to the signaling domain. It can be a single alpha helix, a transmembrane beta barrel, a beta-helix of gramicidin A, or other structure. Typically, the transmembrane domain represents a single transmembrane alpha helix of the transmembrane protein, also known as an endogenous protein. The chimeric antigen receptor may optionally include a "hinge domain" that acts as a linker between the extracellular domain and the transmembrane domain. As used herein, the terms "hinge," "spacer," or "linker" are two of the polypeptide constructs, eg, to provide flexibility, improved spatial composition, and / or accessibility. Refers to a variable-length amino acid sequence typically encoded between the above domains. The term "linker" used in connection with scFv, such as glycine and / or serine residues, used alone or in combination to link variable heavy chain regions and variable light chain regions together. Refers to a peptide linker consisting of amino acids. The chimeric antigen receptor may optionally contain a signal peptide. The terms "signal peptide," "target signal," "localized signal," "transport peptide," or "leader sequence" are present at the N-terminus of most of the newly synthesized proteins towards the secretory pathway. Refers to a short peptide. The core of the signal peptide may contain a long stretch of hydrophobic amino acids. The signal peptide may or may not be cleaved from the mature polypeptide.
本明細書で使用される「抗体（antibody）」及び「抗体（antibodies）」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、抗原結合断片（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合可変断片（ｓｄＦｖ）、イントラボディ、ナノボディ、及びこれらのいずれかのエピトープ結合断片を指す。特に、抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、即ち、抗原結合部位を含む分子が含まれる。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧｉ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｉ、及びＩｇＡ２）、又はサブクラスであり得る。特段の記載がない限り、「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン、及び他の分子への結合を実質的に排除して目的の抗原に特異的に結合する「抗体断片」又は「抗原結合断片」を含む。「抗体」という用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ複合体抗体（例えば、二重特異性抗体）などの遺伝子操作された形態を含む。好ましくは、抗体という用語は、モノクローナル抗体を指し、さらにより好ましくは、モノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖを指す。 As used herein, the terms "antibody" and "antibodies" are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, camel antibodies, chimeric antibodies, one. Variable chain fragment (scFv), single chain antibody, single domain antibody, antigen binding fragment (Fab), F (ab') fragment, disulfide binding variable fragment (sdFv), intrabody, nanobody, and any of these. Refers to an epitope binding fragment. In particular, the antibody includes an immunoglobulin molecule and an immunologically active fragment of the immunoglobulin molecule, i.e., a molecule containing an antigen binding site. Immunoglobulin molecules can be of any type (eg, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY), classes (eg, IgGi, IgG 2 , IgG 3 , IgG 4 , IgAi, and IgA 2 ), or subclasses. possible. Unless otherwise stated, the term "antibody" refers to an "antibody fragment" or "antigen binding" that substantially eliminates binding to intact immunoglobulins and other molecules and specifically binds to the antigen of interest. Includes "fragments". The term "antibody" also includes genetically engineered forms such as chimeric antibodies (eg, humanized mouse antibodies), heterocomplex antibodies (eg, bispecific antibodies). Preferably, the term antibody refers to a monoclonal antibody, and even more preferably scFv derived from a monoclonal antibody.
構造に関しては、抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）を有し得る。軽鎖には、ラムダ（λ）及びカッパ（κ）の２種類がある。各重鎖及び軽鎖には、定常領域及び可変領域（又は「ドメイン」）が含まれる。軽鎖及び重鎖可変領域には、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域が含まれる。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲が定義されている（参照により本明細書に組み込まれる、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991を参照されたい）。フレームワーク領域は、鎖内の非共有相互作用によってＣＤＲを正しい向きに配置するための足場を形成するように機能する。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から順番に数字が付されている。本発明による抗体のＶＬ及びＶＨドメインは、４つのフレームワーク領域又は「ＦＲ」を含み得、これらは、当技術分野及び本明細書では、それぞれ「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」；及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」と呼ばれる。これらのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域又は「ＣＤＲ」によって中断され、これらは、当技術分野では、それぞれ「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」；及び「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ３」と呼ばれる。これらのフレームワーク領域及び相補性決定領域は、好ましくは、以下の順序で作動可能に連結されている：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（アミノ末端からカルボキシ末端へ）。
In terms of structure, the antibody may have heavy chains (H) and light chains (L) interconnected by disulfide bonds. There are two types of light chains, lambda (λ) and kappa (κ). Each heavy and light chain contains a constant region and a variable region (or "domain"). The light and heavy chain variable regions include "framework" regions interrupted by three hypervariable regions, also called "complementarity determining regions" or "CDRs". Framework areas and scopes of CDRs are defined (see Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991, incorporated herein by reference). The framework region functions to form a scaffold for orienting the CDRs by non-shared interactions within the chain. CDRs are primarily involved in the binding of antigens to epitopes. The CDRs of each chain are typically referred to as CDR1, CDR2, and CDR3 and are numbered sequentially from the N-terminus. The VL and VH domains of an antibody according to the invention may comprise four framework regions or "FRs", which are "
本明細書で使用される「抗体重鎖」は、抗体の立体構造に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうちの大きい方を指す。 As used herein, "antibody heavy chain" refers to the larger of the two types of polypeptide chains present in the conformation of an antibody.
本明細書で使用される「抗体軽鎖」は、抗体の立体構造に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうちの小さい方を指し、κ軽鎖及びλ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。 As used herein, "antibody light chain" refers to the smaller of the two types of polypeptide chains present in the conformation of an antibody, where the κ and λ light chains are the two major antibodies. Refers to the light chain isotype.
「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片及び重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片を含むタンパク質を指し、これらの軽鎖及び重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば、短い柔軟なポリペプチドリンカーを介して隣接して連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現することができ、ｓｃＦｖは、それが由来する無傷の抗体の特異性を保持する。特段の記載がない限り、本明細書で使用されるｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、ＶＬ及びＶＨ可変領域をいずれかの順序で有し得、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでもよいし、又はＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでもよい。リンカーは、フレームワーク配列の一部を含み得る。 The term "scFv" refers to a protein comprising at least one antibody fragment comprising a light chain variable region and at least one antibody fragment comprising a heavy chain variable region, wherein these light chain and heavy chain variable regions are eg, for example. Can be expressed as a single chain polypeptide, flanked by a synthetic linker, eg, a short flexible polypeptide linker, and scFv retains the specificity of the intact antibody from which it is derived. Unless otherwise stated, scFv as used herein can have VL and VH variable regions in any order with respect to the N-terminus and C-terminus of the polypeptide, eg, VL-linker-VH. It may be included or may contain VH-linker-VL. The linker may include part of a framework sequence.
本明細書で使用される「由来する（derive from）」又は「由来する（derived from）」という用語は、親化合物又はタンパク質の構造に由来する構造を有し、その構造が本明細書に開示されるものと十分に類似し、その類似性に基づき、特許請求される化合物と同じ又は類似の特性、活性、及び有用性を示すことが当業者によって恐らく期待される化合物又はタンパク質を指す。例えば、モノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖは、モノクローナル抗体と同じ特性を共有する、例えば、同一又は類似のＶＨ及びＶＬ又はＣＤＲを共有し、及び／又は同じエピトープを認識する抗体断片を指す。 As used herein, the term "derive from" or "derived from" has a structure derived from the structure of the parent compound or protein, the structure of which is disclosed herein. Refers to a compound or protein that is sufficiently similar to that of a compound or protein that is probably expected by one of ordinary skill in the art to exhibit the same or similar properties, activities, and usefulness as the claimed compound based on the similarity. For example, scFv derived from a monoclonal antibody refers to an antibody fragment that shares the same properties as a monoclonal antibody, eg, shares the same or similar VH and VL or CDR, and / or recognizes the same epitope.
細胞の文脈において、本明細書で使用される「由来する（derive from）」又は「由来する（derived from）」という用語は、例えば感染又は形質転換などの遺伝子操作によって、同じ細胞株の細胞から調製される１つ又はいくつかの細胞を指す。特に、標的抗原発現細胞は、発現される抗原をコードする核酸を細胞株の細胞に導入することによって調製することができる。 In the context of cells, the terms "derive from" or "derived from" as used herein are from cells of the same cell line, for example by genetic engineering such as infection or transformation. Refers to one or several cells prepared. In particular, target antigen-expressing cells can be prepared by introducing a nucleic acid encoding the expressed antigen into the cells of the cell line.
同様に、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲをコードする核酸を細胞株の細胞に導入することによって調製することができる。 Similarly, CAR-expressing cells can be prepared by introducing a nucleic acid encoding CAR into cells of a cell line.
本明細書で使用される「競合抗体」という用語は、別の抗体によって認識される同じ又は重複するエピトープを認識する抗体を指す。ＣＡＲに関連する場合、競合抗体は、ＣＡＲが由来する抗体又は抗体断片、或いはＣＡＲが認識する同じ又は重複するエピトープを認識する任意の抗体であり得る。 As used herein, the term "competitive antibody" refers to an antibody that recognizes the same or overlapping epitopes recognized by another antibody. When associated with CAR, the competing antibody can be an antibody or antibody fragment from which CAR is derived, or any antibody that recognizes the same or overlapping epitopes that CAR recognizes.
本明細書で使用される「抗原」又は「標的抗原」という用語は、抗体分子、Ｔ細胞受容体、又はＣＡＲなどの特定の体液性又は細胞性免疫の産物によって特異的に結合され得る化合物、組成物、又は物質を指す。本発明が無傷の抗原及びその抗原断片を含むことは容易に明らかである。抗原は、作製する、合成する、又は生物学的サンプルに由来することができる。そのような生物学的サンプルには、限定されるものではないが、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞、又は生体液が含まれ得る。 As used herein, the term "antigen" or "target antigen" is a compound that can be specifically bound by a particular humoral or cell-mediated immunity product, such as an antibody molecule, T cell receptor, or CAR. Refers to a composition or substance. It is readily apparent that the present invention comprises an intact antigen and a fragment thereof. The antigen can be made, synthesized, or derived from a biological sample. Such biological samples can include, but are not limited to, tissue samples, tumor samples, cells, or biological fluids.
本明細書で使用される「ＨＬＡ−Ｇ」及び「ヒト白血球抗原Ｇ」という用語は、限定されるものではないが膜結合アイソフォーム（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４）、可溶性アイソフォーム（例えば、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６、ＨＬＡ−Ｇ７）、及び膜結合アイソフォームのタンパク質分解切断によって生成される可溶型（例えば：ｓＨＬＡ−Ｇｌ）を含む、そのいくつかのアイソフォームのいずれか１つを含むがこれに限定されない、この名称に関連する特定の分子を指す。 As used herein, the terms "HLA-G" and "human leukocyte antigen G" are, but are not limited to, membrane-bound isoforms (eg, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA). -G4), soluble isoforms (eg, HLA-G5, HLA-G6, HLA-G7), and soluble forms produced by proteolytic cleavage of membrane-bound isoforms (eg: sHLA-Gl). Refers to a specific molecule associated with this name, including but not limited to any one of several isoforms.
本明細書で使用される「結合する」又は「結合」は、抗原を認識して接触するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、及び抗体（抗体断片を含む）を指す。好ましくは、「結合する」又は「結合」は、抗原−抗体タイプの相互作用を指す。「特異的に結合する」又は「免疫特異的に結合する」は、抗体が特定の抗原を認識するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識しないか、これに結合もしないことを意味する。場合によっては、「特異的結合」又は「特異的に結合する」という用語は、抗体、タンパク質、又はペプチドと第２の化学種との相互作用に関して使用することができ、相互作用が特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味する。本明細書で使用される「特異的結合」という用語は、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性での抗体と抗原との間の接触を意味する。 As used herein, "binding" or "binding" refers to peptides, polypeptides, proteins, fusion proteins, and antibodies (including antibody fragments) that recognize and contact an antigen. Preferably, "binding" or "binding" refers to an antigen-antibody type interaction. "Specifically binds" or "immune-specifically binds" means that an antibody recognizes a particular antigen, but does not substantially recognize or bind to other molecules in the sample. do. In some cases, the term "specific binding" or "specific binding" can be used with respect to the interaction of an antibody, protein, or peptide with a second chemical species, where the interaction is a particular structure. It means that it depends on the presence of (eg, antigenic determinant or epitope). As used herein, the term "specific binding" means contact between an antibody and an antigen with a binding affinity of at least 10-6 M.
抗体の親和性は、単一の抗原−抗体部位での特定の抗原との結合の尺度であり得、本質的に、抗体の抗原結合部位と特定のエピトープとの間の相互作用に存在するすべての吸引力及び反発力の合計である。特定の抗原に対する抗体の親和性は、抗体結合部位の親和性である、式Ｋ＝［ＡｇＡｂ］／［Ａｇ］［Ａｂ］によって定義される平衡定数Ｋで表すことができ、式中、［Ａｇ］は遊離抗原の濃度であり、［Ａｂ］は遊離抗体の濃度であり、［ＡｇＡｂ］は抗原−抗体複合体の濃度である。抗原と抗体が共に強く反応する場合、遊離抗原も遊離抗体もほとんど存在しないため、抗体の平衡定数又は親和性は高くなる。特に、高い親和性は、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性である。結合親和性は、当業者に利用可能な任意の方法によって、特に表面プラズモン共鳴によって測定することができる。 Antibody affinity can be a measure of binding of a particular antigen at a single antigen-antibody site, essentially everything that is present in the interaction between the antigen binding site of an antibody and a particular epitope. It is the total of the suction force and the repulsive force of. The affinity of an antibody for a particular antigen can be expressed by the equilibrium constant K defined by the formula K = [AgAb] / [Ag] [Ab], which is the affinity of the antibody binding site. ] Is the concentration of the free antigen, [Ab] is the concentration of the free antibody, and [AgAb] is the concentration of the antigen-antibody complex. When both the antigen and the antibody react strongly, the equilibrium constant or affinity of the antibody becomes high because there is almost no free antigen or free antibody. In particular, the high affinity is the binding affinity of at least 10-6 M. Binding affinity can be measured by any method available to those of skill in the art, especially by surface plasmon resonance.
本明細書で使用される「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、及びＢ細胞など）上に存在する場合、Ｔ細胞上の同族の結合パートナー（「刺激分子」とも呼ばれる）と特異的に結合し、それによって、限定されるものではないが活性化、免疫応答の開始、及び増殖などを含むＴ細胞による一次応答を媒介することができるリガンドを意味する。 As used herein, a "stimulatory ligand" is also referred to as a cognate binding partner on a T cell (also referred to as a "stimulatory molecule") when present on antigen presenting cells (eg, APCs, dendritic cells, and B cells). It means a ligand that can specifically bind to (called) and thereby mediate a primary response by T cells, including, but not limited to, activation, initiation of an immune response, and proliferation.
本明細書で使用される「共刺激リガンド」という用語は、Ｔ細胞上の同族の結合パートナー（本明細書では「刺激分子」と呼ばれる）と特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドがロードされたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、限定されるものではないが増殖、活性化、及び分化などを含むＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、及びＢ細胞など）上の分子を含む。 As used herein, the term "costimulatory ligand" specifically binds to a cognate binding partner on a T cell (referred to herein as a "stimulatory molecule"), whereby, for example, a peptide. In addition to the primary signals provided by binding of the TCR / CD3 complex to loaded MHC molecules, it provides signals that mediate T cell responses, including but not limited to proliferation, activation, and differentiation. Contains molecules on antigen-presenting cells such as APCs, dendritic cells, and B cells.
本明細書で使用される「共刺激分子」は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの側面のために刺激的に免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）の活性化を調節する細胞質シグナル伝達配列を提供する免疫細胞によって発現される分子を指す。一態様では、シグナルは、例えば、ペプチドがロードされたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって開始される一次シグナルであり、これは、限定されるものではないが増殖、活性化、及び分化などを含むＴ細胞応答の媒介をもたらす。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。特に、この用語は、抗原提示細胞上に存在する共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、限定されるものではないが増殖活性化及び分化などのＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。 As used herein, "costimulatory molecules" regulate the activation of immune cells (eg, T cells, NK cells, B cells) stimulatingly for at least some aspect of the immune cell signaling pathway. Refers to a molecule expressed by an immune cell that provides a cytoplasmic signaling sequence. In one aspect, the signal is, for example, a primary signal initiated by binding of the TCR / CD3 complex to the peptide-loaded MHC molecule, which is, but is not limited to, proliferation, activation, and. It mediates T cell responses, including differentiation. The stimulating primary cytoplasmic signaling sequence (also referred to as the "primary signaling domain") may include an immunoreceptor tyrosine-based activation motif or a signaling motif known as ITAM. In particular, the term specifically binds to co-stimulatory ligands present on antigen-presenting cells, thereby mediating, but not limited to, T cell co-stimulation responses such as proliferation activation and differentiation. Refers to a cognate binding partner on a T cell.
本明細書で使用される「刺激分子」は、抗原提示細胞上に存在する同族の刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味する。 As used herein, "stimulatory molecule" means a molecule on a T cell that specifically binds to a cognate stimulatory ligand present on an antigen presenting cell.
本明細書で使用される「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞増殖の活性化及び分化など、及び／又は重要な分子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションをもたらすシグナルを指す。 As used herein, the "co-stimulation signal", in combination with a primary signal such as TCR / CD3 ligation, results in activation and differentiation of T cell proliferation and / or upregulation or downregulation of important molecules. Point to a signal.
「刺激」又は「刺激性の」という用語は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドとが結合し、それによって、限定されるものではないがＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達などのシグナル伝達事象を媒介することによって誘導される一次応答を意味する。刺激は、ＴＧＦ−βのダウンレギュレーション及び／又は細胞骨格構造の再構成などの、特定の分子の発現の変化を媒介することができる。 The term "stimulating" or "stimulating" refers to the binding of a stimulating molecule (eg, a TCR / CD3 complex) to its cognate ligand, thereby, but not exclusively, via the TCR / CD3 complex. It means a primary response induced by mediating a signal transduction event such as a signal transduction. Stimulation can mediate changes in the expression of specific molecules, such as downregulation of TGF-β and / or reconstruction of cytoskeletal structure.
本明細書で使用される「免疫細胞」は、例えば、骨髄で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球（white blood cell）（白血球（leukocyte））、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）、及び骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）などの、自然免疫及び獲得免疫に関与する細胞を指す。特に、免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、特にＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＡＰＣ細胞、樹状細胞、及び単球を含む包括的ではないリストから選択することができる。 As used herein, "immune cells" are, for example, white blood cells (leukocytes) derived from hematopoietic stem cells (HSCs) produced in the bone marrow, lymphocytes (T cells, B cells, etc.). Natural killer (NK) cells) and bone marrow-derived cells (neutrophils, eosinophils, basal spheres, monospheres, macrophages, dendritic cells) and other cells involved in natural immunity and acquired immunity. In particular, immune cells should be selected from a non-comprehensive list that includes B cells, T cells, in particular CD4 + T cells and CD8 + T cells, NK cells, NKT cells, APC cells, dendritic cells, and monocytes. Can be done.
「ＣＡＲ発現細胞」又は「ＣＡＲ細胞」という用語は、細胞、特にその表面にＣＡＲを産生するように遺伝子操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を指す。ＣＡＲ細胞は一般に、癌細胞に発現する特定の抗原を標的とするために作製される。ＣＡＲ抗原結合によって腫瘍細胞が認識されると、ＣＡＲ細胞は、活性化されて癌細胞を殺す。 The term "CAR-expressing cell" or "CAR cell" refers to a cell, particularly an immune cell genetically engineered to produce CAR on its surface (eg, a T cell). CAR cells are generally made to target specific antigens expressed on cancer cells. When a tumor cell is recognized by CAR antigen binding, the CAR cell is activated and kills the cancer cell.
本明細書で使用される「標的抗原発現細胞」又は「抗原発現細胞」という用語は、細胞、特にその表面に目的の抗原、特に、例えば腫瘍細胞で発現するとして同定された抗原を提示する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を指す。これらの細胞は、抗原を産生するように遺伝子操作することもできるし、或いはその表面に自然に抗原を産生することもできる。 As used herein, the term "target antigen-expressing cell" or "antigen-expressing cell" refers to an immunity that presents on a cell, in particular the surface thereof, an antigen of interest, in particular an antigen identified as being expressed in a tumor cell, eg. Refers to cells (eg, T cells). These cells can be genetically engineered to produce antigen, or they can spontaneously produce antigen on their surface.
「対照細胞」という用語は、ＣＡＲ（以降、「対照ＣＡＲ細胞」）も目的の抗原も発現しないために対照として使用することができる細胞（以降、「対照細胞」）、好ましくは免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を指す。好ましくは、それらは、ＣＡＲ発現細胞及び／又は標的抗原発現細胞に使用される細胞株と同じ細胞株に属するか、又はそれらから調製／誘導される。 The term "control cell" is a cell that can be used as a control because it does not express CAR (hereinafter "control CAR cell") or the antigen of interest (hereinafter "control cell"), preferably an immune cell (eg, "control cell"). , T cells). Preferably, they belong to or are prepared / derived from the same cell line as the cell line used for CAR-expressing cells and / or target antigen-expressing cells.
本明細書で使用される「細胞株」という用語は、同じ遺伝的特性を共有する細胞の均質な集団を指す。 As used herein, the term "cell line" refers to a homogeneous population of cells that share the same genetic characteristics.
「標識」又は「マーカー」という用語は、放射性標識及び非放射性標識を含む、細胞、特に免疫細胞において検出可能な任意の標識を指す。非放射性標識には、例えば、蛍光、発光、又はリン光色素の標識又は色素などの光学的に検出可能な標識が含まれる。標識には、直接検出可能な標識及び間接的に検出可能な標識が含まれる。本明細書で使用される「蛍光標識」という用語は、標識の蛍光発光を介して、例えば蛍光分光法を介して検出可能な任意の標識を指す。標識又はマーカーは、脂質色素などの細胞膜を標識する色素である。 The term "label" or "marker" refers to any label detectable in cells, particularly immune cells, including radioactive and non-radioactive labels. Non-radioactive labels include optically detectable labels such as, for example, fluorescent, luminescent, or phosphorescent dye labels or dyes. Labels include those that are directly detectable and those that are indirectly detectable. As used herein, the term "fluorescent label" refers to any label that can be detected via fluorescence emission of the label, eg, via fluorescence spectroscopy. The label or marker is a dye that labels the cell membrane, such as a lipid dye.
「細胞選別」という用語は、それらのタイプ及び／又は特性に従って細胞を分けるために使用される方法を指す。細胞は、ほとんどの場合、通常は細胞のサイズ、形状（形態）、及び／又は表面タンパク質又はマーカーの発現の違いに依存して分けられる。この方法は、細胞の均質な集団の獲得につながり得る。細胞選別は、単一細胞選別、蛍光細胞選別、磁気細胞選別、又は浮力活性化細胞選別などの当業者に公知の様々な戦略に依存し得る。好ましくは、この用語は、フローサイトメトリーを利用して、細胞集団を選別するための、蛍光標識の発現などの細胞内及び細胞外特性の迅速で客観的且つ定量的な測定を提供する蛍光活性化細胞選別、ＦＡＣＳを指す。 The term "cell sorting" refers to the method used to separate cells according to their type and / or properties. Cells are most often divided depending on cell size, shape (morphology), and / or differences in expression of surface proteins or markers. This method can lead to the acquisition of a homogeneous population of cells. Cell sorting may rely on various strategies known to those of skill in the art, such as single cell sorting, fluorescent cell sorting, magnetic cell sorting, or buoyancy-activated cell sorting. Preferably, the term is fluorescent activity that utilizes flow cytometry to provide a rapid, objective and quantitative measurement of intracellular and extracellular properties such as expression of fluorescent labels for sorting cell populations. Refers to cell selection and FACS.
本明細書で使用される「ＣＡＲ発現細胞の機能」という用語は、その生物学的機能を果たすための、細胞、好ましくは免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の能力を指す。ＣＡＲ細胞に関連する場合、この機能は、抗原（即ち、ＣＡＲ細胞が作製された抗原）に結合することによって標的細胞を認識する能力、及びＣＡＲ発現細胞の活性化能力（例えば、抗原を発現する標的細胞の死滅をもたらすシグナル伝達経路を（例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性及びヘルパー活性を介して））活性化する能力を指す。従って、本明細書で使用される「機能的ＣＡＲ細胞」という用語は、標的抗原に結合することができ、この時にシグナル伝達経路の活性化を効果的に誘導し得るＣＡＲ発現細胞を指す。 As used herein, the term "function of CAR-expressing cells" refers to the ability of cells, preferably immune cells (eg, T cells), to perform their biological function. When associated with CAR cells, this function is capable of recognizing target cells by binding to an antigen (ie, the antigen from which the CAR cells were made), and the ability to activate CAR-expressing cells (eg, expressing the antigen). Refers to the ability to activate signaling pathways that result in the death of target cells (eg, via cytolytic and helper activity, including the secretion of cytokines). Thus, as used herein, the term "functional CAR cell" refers to a CAR-expressing cell that is capable of binding to a target antigen and at this time effectively inducing activation of signaling pathways.
本明細書で使用される「共培養」という用語は、少なくとも２つの分子又は細胞、好ましくは免疫細胞を培養する行為又はプロセスを指す。本発明の文脈において、細胞の共培養は、細胞、特に、ＣＡＲ細胞及び抗原発現細胞並びに任意選択による対照細胞などの細胞の２つ以上の集団の接触をもたらし得る。 As used herein, the term "co-culture" refers to the act or process of culturing at least two molecules or cells, preferably immune cells. In the context of the present invention, co-culture of cells can result in contact of two or more populations of cells, particularly CAR cells and antigen-expressing cells and optionally control cells.
「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」という用語は、本明細書で互換的に使用され、キメラ抗原受容体細胞の作製に適用され、特に、外来又は外因性ヌクレオチド配列が細胞に導入されるプロセスを指す。外因性核酸は、安定的又は一過性に宿主細胞に導入され得る。「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクトされた、形質転換された、又は形質導入された細胞である。いくつかの実施形態では、この形質導入は、ベクター、好ましくはレンチウイルスベクターを介して行われる。 The terms "transfected" or "transformed" or "transduced" are used interchangeably herein and apply to the production of chimeric antigen receptor cells, particularly exogenous or exogenous. Refers to the process by which a sex nucleotide sequence is introduced into a cell. The exogenous nucleic acid can be stably or transiently introduced into the host cell. A "transfected" or "transformed" or "transduced" cell is a cell transfected, transformed or transduced with an exogenous nucleic acid. In some embodiments, this transduction is done via a vector, preferably a lentiviral vector.
本明細書で使用される「養子細胞療法」又は「養子Ｔ細胞療法」又は「ＡＣＴ」という用語は、患者への細胞の移入を意味し、細胞は、対象に移入する前にエンジニアリングされるか、又は他の方法で変更される。ＡＣＴの例は、対象の血液又は腫瘍、Ｔ細胞などの免疫細胞からの収集である。次いで、これらの免疫細胞は、培養中、エクスビボで刺激され、増殖される。次いで、細胞は、細胞がＣＡＲなどの新しい分子を発現することを可能にする１つ又は複数の核酸コンストラクトが形質導入され、エンジニアリングされた免疫細胞に、疾患、例えば癌と戦うための新しいメカニズムを提供する。場合によっては、ＣＡＲは、ＨＬＡ−Ｇなどの、腫瘍又は癌によって発現される抗原を特異的に認識する抗原結合ドメインを含む。ＡＣＴ手順で利用される典型的な免疫細胞には、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）又はＴ細胞が含まれる。ＡＣＴで使用される免疫細胞は、患者／対象自身、又は万能ドナーに由来し得る。ＡＣＴはまた、対象に注入されて戻された組換え細胞と競合し得る対象自身のリンパ球のリンパ球枯渇の任意選択の工程を伴い得る。 As used herein, the terms "adopted cell therapy" or "adopted T cell therapy" or "ACT" refer to the transfer of cells into a patient, whether the cells are engineered prior to transfer into the subject. , Or otherwise modified. An example of ACT is collection from a subject's blood or tumor, immune cells such as T cells. These immune cells are then stimulated and proliferated with Exvivo during culture. The cell is then transduced with one or more nucleic acid constructs that allow the cell to express new molecules such as CAR, and engineered immune cells with new mechanisms for combating diseases such as cancer. offer. In some cases, CAR comprises an antigen binding domain, such as HLA-G, that specifically recognizes an antigen expressed by a tumor or cancer. Typical immune cells utilized in the ACT procedure include tumor infiltrating lymphocytes (TILs) or T cells. The immune cells used in ACT can be derived from the patient / subject itself or a universal donor. ACT may also involve an optional step of lymphocyte depletion of the subject's own lymphocytes that may compete with the recombinant cells injected and returned to the subject.
本明細書で使用される「対象」、「宿主」、「個体」、又は「患者」という用語は、ヒト及び獣医学的対象を指し、特に動物、好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくは成人及び子供を含むヒトを指す。しかしながら、「対象」という用語はまた、非ヒト動物、特に、中でもイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、及び非ヒト霊長類などの哺乳動物を包含する。 As used herein, the terms "subject," "host," "individual," or "patient" refer to human and veterinary subjects, particularly animals, preferably mammals, and even more preferably adults and. Refers to humans, including children. However, the term "subject" also includes non-human animals, especially mammals such as dogs, cats, horses, cows, pigs, sheep, and non-human primates.
「処置」という用語は、疾患又は疾患の症状の治療、防止、予防、及び遅延などの患者の健康状態を改善することを目的としたあらゆる行為を指す。処置は、疾患の治癒的処置及び／又は予防的処置の両方を指す。治癒的処置は、治癒をもたらす処置、又は疾患若しくは疾患の症状若しくはそれが直接的又は間接的に引き起こす苦痛を軽減する、改善する、及び／又は排除する、軽減する、及び／又は安定化させる処置として定義される。予防的処置は、疾患の予防をもたらす処置、並びに疾患の進行及び／又は発生率又はその発生リスクを低減及び／又は遅延させる処置の両方を含む。特定の実施形態では、そのような用語は、疾患、障害、感染症、又は感染症に関連する症状の改善又は根絶を指す。他の実施形態では、この用語は、癌の広がり又は悪化を最小限に抑えることを指す。本発明による処置は、必ずしも１００％又は完全な処置を意味するわけではない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する様々な程度の処置である。 The term "treatment" refers to any action aimed at improving a patient's health, such as treating, preventing, preventing, and delaying a disease or symptoms of the disease. Treatment refers to both curative and / or prophylactic treatment of the disease. A curative treatment is a treatment that results in a cure, or a treatment that reduces, ameliorates, and / or eliminates, reduces, and / or stabilizes the disease or symptoms of the disease or the pain it directly or indirectly causes. Is defined as. Prophylactic treatment includes both treatment that results in the prevention of the disease and treatment that reduces and / or delays the progression and / or incidence of the disease or the risk of its development. In certain embodiments, such terms refer to a disease, disorder, infection, or improvement or eradication of symptoms associated with the infection. In other embodiments, the term refers to minimizing the spread or exacerbation of cancer. Treatment according to the invention does not necessarily mean 100% or complete treatment. Rather, it is a procedure of varying degrees that one of ordinary skill in the art recognizes as having potential benefits or therapeutic effects.
本明細書で使用される「核酸コンストラクト」、「プラスミド」、及び「ベクター」という用語は同等であり、ＤＮＡ又はＲＮＡなどのパッセンジャー核酸配列を宿主細胞に移入するのに役立つ核酸分子を指す。ベクターは、複製起点、選択可能なマーカー、及び任意選択による配列又は遺伝子の挿入に適した部位を含み得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクター又は宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。ベクターはまた、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位などの正しい翻訳開始配列、及び開始コドン、終止コドン、及び転写終止配列を含む発現要素を含み得る。核酸コンストラクトはまた、所与の遺伝子の転写レベルを指示するために、エンハンサー、サイレンサー、及び境界要素／インスレーターなどの他の調節領域を含み得る。作動可能に連結された遺伝子及び／又は核酸配列の発現を誘導することができるベクターはまた、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれることがある。核酸コンストラクト、細菌ウイルスゲノム、ファージミド、ウイルスゲノム、コスミド、及び人工染色体を含むいくつかの一般的なタイプのベクターが存在する。核酸コンストラクトは、遺伝子又は配列の安定的又は一過性の発現のためのベクターであり得る。核酸コンストラクトは、核酸コンストラクトの複製起点（ｏｒｉ）を含み得る。特に、核酸コンストラクトは、限定されるものではないが、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣを含め、異なる宿主間の遺伝子導入のために設計することができる。好ましくは、核酸コンストラクトはＣＡＲをコードする。 As used herein, the terms "nucleic acid construct," "plasmid," and "vector" are equivalent and refer to nucleic acid molecules that help transfer a passenger nucleic acid sequence, such as DNA or RNA, into a host cell. The vector may contain an origin of replication, a selectable marker, and a site suitable for insertion of an optional sequence or gene. The vector can be either a self-replicating extrachromosomal vector or a vector integrated into the host genome. The vector may also contain, for example, the correct translation initiation sequence such as a promoter, ribosome binding site, and expression elements including initiation codons, stop codons, and transcription termination sequences. Nucleic acid constructs may also include enhancers, silencers, and other regulatory regions such as boundary elements / insulators to indicate the transcriptional level of a given gene. A vector capable of inducing expression of an operably linked gene and / or nucleic acid sequence may also be referred to herein as an "expression vector". There are several common types of vectors including nucleic acid constructs, bacterial viral genomes, phagemids, viral genomes, cosmids, and artificial chromosomes. Nucleic acid constructs can be vectors for stable or transient expression of genes or sequences. The nucleic acid construct may include an origin of replication (ori) of the nucleic acid construct. In particular, nucleic acid constructs can be designed for gene transfer between different hosts, including, but not limited to, plasmids, viruses, cosmids, phages, BACs, YACs. Preferably, the nucleic acid construct encodes CAR.
ＣＡＲ発現細胞の機能を評価するための方法
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞の機能を評価するためのインビトロ方法に関し、この方法は、（ｉ）同じ細胞株から調製した標的抗原発現細胞及びＣＡＲ発現細胞を異なる標識で標識すること、（ｉｉ）標識した標的細胞と標識したＣＡＲ発現細胞を共培養すること、（ｉｉｉ）標的抗原発現細胞からのＣＡＲ発現細胞による膜獲得を評価するために細胞を分析することであって、膜獲得がＣＡＲ発現細胞の標的抗原への結合能力の指標であり、それによって、ＣＡＲ発現細胞の機能を評価する、細胞を分析すること、並びに（ｉｖ）任意選択により、機能的ＣＡＲ発現細胞及び／又は機能的ＣＡＲコンストラクトを選択することを含む。これらの工程については、以下でより具体的に説明する。
Methods for Evaluating the Function of CAR-Expressing Cells The present invention relates to in vitro methods for evaluating the function of chimeric antigen receptor (CAR) -expressing cells, wherein the method is (i) a target antigen prepared from the same cell line. Labeling expressing cells and CAR-expressing cells with different labels, (ii) co-culturing labeled CAR-expressing cells with labeled target cells, (iii) evaluating membrane acquisition by CAR-expressing cells from target antigen-expressing cells. In order to analyze cells, membrane acquisition is an indicator of the ability of CAR-expressing cells to bind to target antigens, thereby assessing the function of CAR-expressing cells, analyzing cells, and ( iv) Includes optional selection of functional CAR-expressing cells and / or functional CAR constructs. These steps will be described in more detail below.
細胞
本発明による細胞は、哺乳動物細胞などの真核細胞であり、典型的には、ヒト、ネコ、又はイヌの細胞、より典型的にはヒト細胞、好ましくは初代ヒト細胞である。さらにより好ましくは、細胞は免疫細胞である。細胞は、対象から、又は市販の培養物から得ることができる。細胞は、自己細胞、同系細胞、同種異系細胞、場合によっては異種細胞でさえあり得る。
Cells The cells according to the invention are eukaryotic cells such as mammalian cells, typically human, cat or dog cells, more typically human cells, preferably primary human cells. Even more preferably, the cells are immune cells. Cells can be obtained from the subject or from commercially available cultures. The cell can be an autologous cell, an allogeneic cell, an allogeneic cell, or even a heterologous cell.
一実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含むＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、顆粒球、例えば、骨髄細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、及び樹状細胞からなる群から選択することができ、好ましくは、細胞は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球、及び樹状細胞などの抗原提示細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞又は他の細胞型、例えば、全Ｔ細胞集団、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びそれらの亜集団、例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化の可能性、増殖、再循環、局在化、及び／又は持続能力、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の器官又は区画における存在、マーカー又はサイトカイン分泌プロファイル、及び／又は分化の程度によって定義されるものの１つ又は複数のサブセットを含む。好ましくは、細胞は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球、及び抗原提示細胞から選択される免疫細胞である。 In one embodiment, the cells are T cells, including CD4 + T cells and CD8 + T cells, B cells, NK cells, NKT cells, monospheres, granulocytes, such as bone marrow cells, macrophages, neutrophils, dendritic cells. It can be selected from the group consisting of cells, mast cells, eosinophils, basal spheres, and dendritic cells, preferably the cells are T lymphocytes, B lymphocytes, natural killer cells, monospheres, and trees. It is an antigen-presenting cell such as a dendritic cell. In some embodiments, the cells are T cells or other cell types, eg, whole T cell population, CD4 + cells, CD8 + cells, and their subpopulations, eg, function, activation state, maturity, differentiation. Defined by potential, proliferation, recirculation, localization, and / or sustainability, antigen specificity, type of antigen receptor, presence in a particular organ or compartment, marker or cytokine secretion profile, and / or degree of differentiation. Includes one or more subsets of what is to be done. Preferably, the cell is an immune cell selected from T lymphocytes, B lymphocytes, natural killer cells, monocytes, and antigen presenting cells.
特定の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、例えば、動物Ｔ細胞、哺乳動物Ｔ細胞、特にヒトＴ細胞である。Ｔ細胞及び／又はＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞のサブタイプ及び亜集団には、ナイーブＴ（ＴＮ）細胞、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、メモリーＴ細胞、及びそれらのサブタイプ、例えば、幹細胞メモリーＴ（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）、又は最終分化エフェクターメモリーＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、未成熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、自然発生及び適応調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞、例えば、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、α／βＴ細胞、及びδ／γＴ細胞がある。市販のＴ細胞株の非限定的な例には、系統ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０２（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９００（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０１（商標））、ＢＣＬ２ Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９９（商標））、Ｎｅｏ Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９８（商標））、ＴＡＬＬ−１０４細胞毒性ヒトＴ細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１１３８６）が含まれる。さらなる例には、限定されるものではないが、成熟Ｔ細胞株、例えば、Deglis、ＥＢＴ−８、ＨＰＢ−ＭＬｐ−Ｗ、ＨＵＴ７８、ＨＵＴ１０２、Karpas３８４、Ｋｉ２２５、Ｍｙ−Ｌａ、Ｓｅ−Ａｘ、ＳＫＷ−３、ＳＭＺ−１、及びＴ３４など；並びに未成熟Ｔ細胞株、例えば、ＡＬＬ−ＳＩＬ、Ｂｅｌ３、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＣＭＬ−Ｔ１、ＤＮＤ−４１、ＤＵ．５２８、ＥＵ−９、ＨＤ−Ｍａｒ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｈ−ＳＢ２、ＨＴ−１、ＪＫ−Ｔ１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋａｒｐａｓ４５、ＫＥ−３７、ＫＯＰＴ−Ｋ１、Ｋ−Ｔｌ、Ｌ−ＫＡＷ、Loucy、ＭＡＴ、ＭＯＬＴ−１、ＭＯＬＴ３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ１３、ＭＯＬＴ−１６、ＭＴ−１、ＭＴ−ＡＬＬ、Ｐ１２／Ichikawa、Peer、ＰＥＲ０１１７、ＰＥＲ−２５５、ＰＦ−３８２、ＰＦＩ−２８５、ＲＰＭＩ−８４０２、ＳＴ−４、ＳＵＰ−Ｔ１〜Ｔ１４、ＴＡＬＬ−１、ＴＡＬＬ−１０１、ＴＡＬＬ−１０３／２、ＴＡＬＬ−１０４、ＴＡＬＬ−１０５、ＴＡＬＬ−１０６、ＴＡＬＬ−１０７、ＴＡＬＬ−１９７、ＴＫ−６、ＴＬＢＲ−１、−２、−３、及び−４、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２（ＣＣＬ−１２０．１）、Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５３）、Ｊ４５．０１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９９０）、Ｊ．ＣａＭ１．６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０６３）、ＲＳ４；１１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１８７３）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣ ＣＲＭ−ＣＣＬ−１１９）など；並びに皮膚Ｔ細胞リンパ腫株、例えば、ＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ ＣＲＭ−ＴＩＢ−１６１）、ＭＪ［Ｇ１１］（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８２９４）、ＨｕＴ１０２（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１６２）が含まれる。 In certain embodiments, the immune cell is a T cell, such as an animal T cell, a mammalian T cell, particularly a human T cell. Subtypes and subpopulations of T cells and / or CD4 + and / or CD8 + T cells include naive T (TN) cells, effector T cells (TEFF), memory T cells, and their subtypes, such as stem cell memory T (stem cell memory T). TSCM), Central Memory T (TCM), Effector Memory T (TEM), or Final Differentiation Effector Memory T Cell, Tumor Infiltrating Lymphocyte (TIL), Immature T Cell, Mature T Cell, Helper T Cell, Cytotoxic T Cell , Mucosa-related invariant T (MATI) cells, spontaneous and adaptive regulatory T (Treg) cells, helper T cells such as TH1 cells, TH2 cells, TH3 cells, TH17 cells, TH9 cells, TH22 cells, follicular helper T There are cells, α / βT cells, and δ / γT cells. Non-limiting examples of commercially available T cell lines include strain BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902 ™), BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900 ™). )), BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL-2901 ™), BCL2 Jurkat (ATCC® CRL-2899 ™), Neo Jurkat (ATCC® CRL-2988 (ATCC®) Trademark)), TALL-104 cytotoxic human T cell line (ATCC # CRL-11386). Further examples include, but are not limited to, mature T cell lines such as Deglis, EBT-8, HPB-MLp-W, HUT78, HUT102, Karpas384, Ki225, My-La, Se-Ax, SKW-. 3, SMZ-1, T34, etc .; and immature T cell lines such as ALL-SIL, Bel3, CCRF-CEM, CML-T1, DND-41, DU. 528, EU-9, HD-Mar, HPB-ALL, H-SB2, HT-1, JK-T1, Jurkat, Karpas45, KE-37, KOPT-K1, K-Tl, L-KAW, Loucy, MAT, MALT-1, MALT3, MALT-4, MALT13, MALT-16, MT-1, MT-ALL, P12 / Ichikawa, Peer, PER0117, PER-255, PF-382, PFI-285, RPMI-8402, ST- 4, SUP-T1-T14, TALL-1, TALL-101, TALL-103 / 2, TALL-104, TALL-105, TALL-106, TALL-107, TALL-197, TK-6, TLBR-1, -2, -3, and -4, CCRF-HSB-2 (CCL-120.1), J. Mol. RT3-T3.5 (ATCC TIB-153), J45.01 (ATCC CRL-1990), J. Mol. CaM1.6 (ATCC CRL-2063), RS4; 11 (ATCC CRL-1873), CCRF-CEM (ATCC CRM-CCL-119), etc .; and cutaneous T cell lymphoma strains such as HuT78 (ATCC CRM-TIB-161). ), MJ [G11] (ATCC CRL-8294), HuT102 (ATCC TIB-162).
例えば、本発明に使用できる適切な免疫細胞には、自己Ｔリンパ球細胞、同種Ｔ細胞、異種Ｔ細胞、これらのいずれかの前駆細胞、形質転換腫瘍又は異種免疫エフェクター細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、細胞毒性リンパ球、又は活性化されたときに標的細胞を殺すことができる他の細胞が含まれる。 For example, suitable immune cells that can be used in the present invention include autologous T lymphocytes, allogeneic T cells, heterologous T cells, precursor cells of any of these, transformed tumor or heterologous immune effector cells, tumor infiltrating lymphocytes ( Includes TIL), cytotoxic lymphocytes, or other cells capable of killing target cells when activated.
他のいくつかの実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞などである。ＮＫ細胞は、単離されるか、又は市販の供給源から得ることができる。市販のＮＫ細胞株の非限定的な例には、系統ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０７（商標））、ＮＫ−９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０８（商標））が含まれる。さらなる例には、限定されるものではないが、ＮＫ系統ＨＡＮＫ１、ＫＨＹＧ−１、ＮＫＬ、ＮＫ−ＹＳ、ＮＯＩ−９０、及びＹＴが含まれる。 In some other embodiments, the cells are natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, cytokine-induced killer (CIK) cells, tumor infiltrating lymphocytes (TIL), lymphokine-activated killer (LAK). Such as cells. NK cells can be isolated or obtained from commercially available sources. Non-limiting examples of commercially available NK cell lines include lineage NK-92 (ATCC® CRL-2407 ™), NK-92MI (ATCC® CRL-2408 ™). Is done. Further examples include, but are not limited to, the NK strains HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90, and YT.
そのような市販の細胞株の非限定的で例示的な供給源には、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション又はＡＴＣＣ（http://www.atcc.org/）及びドイツ微生物細胞培養物コレクション（https://www.dsmz.de/）も含まれる。 Non-limiting and exemplary sources of such commercially available cell lines include the American Type Culture Collection or ATCC (http://www.atcc.org/) and the German Microbial Cell Culture Collection (https). //www.dsmz.de/) is also included.
特に、本発明による方法で使用される細胞は、以下の通りである：
−目的の抗原を表面で発現する標的抗原発現細胞、
−ＣＡＲ、好ましくは目的の抗原に特異的に結合するように生成されたＣＡＲを発現するＣＡＲ発現細胞、
−目的の抗原又はこの抗原に結合するために生成されたＣＡＲのいずれか又は両方を発現しない任意選択による制御細胞。
In particular, the cells used in the method according to the invention are:
-Target antigen-expressing cells that express the target antigen on the surface,
-CAR, preferably CAR-expressing cells expressing CAR generated to specifically bind to the antigen of interest.
-Optional control cells that do not express either or both of the antigen of interest or the CAR produced to bind to this antigen.
特に、標的抗原発現細胞及びＣＡＲ発現細胞は同じ細胞株から調製される。 In particular, target antigen-expressing cells and CAR-expressing cells are prepared from the same cell line.
一実施形態では、この方法は、標的抗原を発現しない対照細胞をさらに含む。特に、対照細胞は、ＣＡＲ発現細胞によって認識される目的の抗原を発現しないか、又はＣＡＲ発現細胞によって認識されない抗原を発現する細胞である。この対照細胞は陰性対照である。 In one embodiment, the method further comprises control cells that do not express the target antigen. In particular, control cells are cells that do not express the antigen of interest recognized by CAR-expressing cells or express antigens that are not recognized by CAR-expressing cells. This control cell is a negative control.
別の実施形態では、この方法は、標的抗原を認識しない対照ＣＡＲ細胞をさらに含む。特に、対照ＣＡＲ細胞は、標的抗原を認識しないＣＡＲを発現する細胞である。この対照ＣＡＲ細胞は陰性対照である。 In another embodiment, the method further comprises control CAR cells that do not recognize the target antigen. In particular, control CAR cells are cells that express CAR that does not recognize the target antigen. This control CAR cell is a negative control.
特に、対照細胞及び／又は対照ＣＡＲ細胞は、ＣＡＲ発現細胞及び標的抗原発現細胞と同じ細胞株から調製される。 In particular, control cells and / or control CAR cells are prepared from the same cell line as CAR-expressing cells and target antigen-expressing cells.
一実施形態では、標的抗原発現細胞によって発現される抗原はＨＬＡ−Ｇである。「ＨＬＡ−Ｇ」は、少なくとも７つのアイソフォームを含むヒト白血球抗原Ｇを表す。好ましくは、標的抗原発現細胞によって発現される抗原は、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６、及びＨＬＡ−Ｇ７から選択されるＨＬＡ−Ｇアイソフォームである。 In one embodiment, the antigen expressed by the target antigen expressing cell is HLA-G. "HLA-G" represents human leukocyte antigen G containing at least 7 isoforms. Preferably, the antigen expressed by the target antigen-expressing cell is an HLA-G iso selected from HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, and HLA-G7. It is a form.
ＨＬＡ−Ｇの一次転写産物は、選択的スプライシングされ、７つのアイソフォームが発現することになり、そのうちの４つは、膜結合型（ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、及びＨＬＡ−Ｇ４）であり、３つは、可溶性（ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６、及びＨＬＡ−Ｇ７）である。ＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５は、最も豊富なアイソフォームであり、古典的なＨＬＡクラスＩ分子の典型的な構造；β２−ミクログロブリン（β２Ｍ）及びペプチドに非共有結合した３つの球状ドメインで構成される重鎖を示し、他のアイソフォームは、より短く、重鎖の１つ又は２つのドメインを欠き、β２Ｍに結合しないはずである。ＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームは、β２−ミクログロブリンに会合したαｌ、α２、及びα３ドメインを有する完全なアイソフォームである。ＨＬＡ−Ｇ２アイソフォームが、α２ドメインを有していないのに対して、ＨＬＡ−Ｇ３は、α２及びα３ドメインを有しておらず、ＨＬＡ−Ｇ４はα３ドメインを有していない。アイソフォームＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、及びＨＬＡ−Ｇ４はいずれもβ２Ｍに結合しない。可溶性ＨＬＡ−Ｇ５及びＨＬＡ−Ｇ６アイソフォームはそれぞれ、ＨＬＡ−Ｇ１と同じ余分な球状ドメイン及びＨＬＡ−Ｇ２と同じ余分な球状ドメインを含む。ＨＬＡ−Ｇ７アイソフォームは、イントロン２によってコードされる２つのアミノ酸に連結されたαｌドメインのみを有する。ＨＬＡ−Ｇ５アイソフォームはβ２Ｍに結合するが、アイソフォームＨＬＡ−Ｇ６及びＨＬＡ−Ｇ７はβ２Ｍに結合しない。
The HLA-G primary transcript will be selectively spliced to express seven isoforms, four of which are membrane-bound (HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, and HLA-). G4) and three are soluble (HLA-G5, HLA-G6, and HLA-G7). HLA-G1 and HLA-G5 are the most abundant isoforms and are typical of the classic HLA class I molecule; composed of β2-microglobulin (β2M) and three non-covalently bound spherical domains to the peptide. The other isoform is shorter, lacks one or two domains of the heavy chain, and should not bind to β2M. The HLA-G1 isoform is a complete isoform with αl, α2, and α3 domains associated with β2-microglobulin. The HLA-G2 isoform does not have the α2 domain, whereas the HLA-G3 does not have the α2 and α3 domains and the HLA-G4 does not have the α3 domain. Isoforms HLA-G2, HLA-G3, and HLA-G4 do not bind to β2M. Soluble HLA-G5 and HLA-G6 isoforms contain the same extra globular domain as HLA-G1 and the same extra globular domain as HLA-G2, respectively. The HLA-G7 isoform has only the αl domain linked to the two amino acids encoded by
特定の実施形態では、標的抗原発現細胞によって発現される目的の抗原は、β２Ｍを含まないＨＬＡ−Ｇアイソフォームである。 In certain embodiments, the antigen of interest expressed by the target antigen-expressing cells is a β2M-free HLA-G isoform.
一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞によって発現されるＣＡＲは、いくつかのＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、好ましくは２〜５、より好ましくはＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ５、及びＨＬＡ−Ｇ６から選択されるＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合するＣＡＲである。好ましくは、ＣＡＲ発現細胞によって発現されるＣＡＲは、ＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５の両方、又はＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方に特異的に結合するＣＡＲである。或いは、ＣＡＲ発現細胞によって発現されるＣＡＲは、ＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方に特異的に結合するＣＡＲである。任意選択により、ＣＡＲ発現細胞によって発現されるＣＡＲは、β２Ｍを含まないＨＬＡ−Ｇ又はβ２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇのいずれかに特異的に結合するＣＡＲである。 In one embodiment, CAR expressed by CAR-expressing cells is from several HLA-G isoforms, preferably 2-5, more preferably HLA-G1, HLA-G2, HLA-G5, and HLA-G6. A CAR that specifically binds to the HLA-G isoform of choice. Preferably, the CAR expressed by CAR-expressing cells is a CAR that specifically binds to both HLA-G1 and HLA-G5, or both HLA-G2 and HLA-G6. Alternatively, the CAR expressed by CAR-expressing cells is a CAR that specifically binds to both HLA-G2 and HLA-G6. The CAR expressed by CAR-expressing cells, optionally, is a CAR that specifically binds to either β2M-free HLA-G or β2M-associated HLA-G.
細胞標識
本発明の方法によると、標的抗原発現細胞及びＣＡＲ発現細胞は、異なる標識で標識される。この方法では１つの標識しか使用できないにもかかわらず、標的抗原発現細胞とＣＡＲ発現細胞に異なる標識を使用することで、この方法の効率が向上する。
Cell Labeling According to the method of the invention, target antigen-expressing cells and CAR-expressing cells are labeled with different labels. Although only one label can be used in this method, the use of different labels for target antigen-expressing cells and CAR-expressing cells improves the efficiency of this method.
次いで、好ましくは、標的抗原発現細胞及び／又は対照細胞は、ＣＡＲ発現及び／又は対照ＣＡＲ細胞を標識するために使用されるマーカーと区別できるマーカーで標識される。 The target antigen-expressing cells and / or control cells are then preferably labeled with a marker distinct from the markers used to label CAR expression and / or control CAR cells.
本発明によると、マーカーの量は、細胞を標識してそれを検出可能及び／又は追跡可能にするのに十分な量である。そのような量は、当業者に公知であり、適切な検出システムの選択、並びに十分に当業者の技術の範囲内である適切な量のマーカーの選択によって決まる。 According to the present invention, the amount of marker is sufficient to label the cell and make it detectable and / or traceable. Such quantities are known to those of skill in the art and are determined by the selection of the appropriate detection system, as well as the selection of the appropriate amount of markers well within the skill of those of skill in the art.
好ましくは、標識は、非毒性及び／又は非変異原性であり、生細胞で検出することができる。しかしながら、本発明の利点は、標識がインビトロで行われるため、変異原性及び／又はわずかに毒性のマーカーも使用できることである。本発明に従って使用することができる標識には、放射性標識及び非放射性標識が含まれる。非放射性標識には、例えば、蛍光、発光、及びリン光標識又は色素、好ましくは蛍光標識又は色素などの光学的に検出可能な標識が含まれる。標識には、直接検出可能な標識及び間接的に検出可能な標識が含まれる。一実施形態では、標識は、蛍光標識、好ましくはフローサイトメトリー分析に適した標識である。 Preferably, the label is non-toxic and / or non-mutagenic and can be detected in living cells. However, the advantage of the present invention is that mutagenic and / or slightly toxic markers can also be used because the labeling is done in vitro. Labels that can be used in accordance with the present invention include radioactive and non-radioactive labels. Non-radioactive labels include, for example, fluorescent, luminescent, and phosphorescent labels or dyes, preferably optically detectable labels such as fluorescent labels or dyes. Labels include those that are directly detectable and those that are indirectly detectable. In one embodiment, the label is a fluorescent label, preferably a label suitable for flow cytometric analysis.
特に、本発明の標識は、脂質マーカー又は色素などの細胞膜に組み込むことができる膜マーカーである。細胞膜に組み込まれるように選択される好ましい蛍光分子は、ＭＩＮＩ２６、ＰＫＨ２６−ＰＣＬ、ＰＫＨ６７、ＭＩＮＩ６７、ＰＫＨ６７−ＰＣＬ、ＰＫＨ２６、ＰＫＨ２６−ＰＣＬ、Ｖｙｂｒａｎｔ ＣＭ−ＤｉＩ、ＤｉＩ、及びＤｉＯである。一実施形態では、細胞を標識するために使用されるマーカーは、ＰＫＨ６７及びＰＫＨ２６からなる群から選択される。 In particular, the label of the present invention is a membrane marker that can be incorporated into a cell membrane such as a lipid marker or a dye. Preferred fluorescent molecules selected to integrate into the cell membrane are MINI26, PKH26-PCL, PKH67, MINI67, PKH67-PCL, PKH26, PKH26-PCL, Vybrant CM-DiI, DiI, and DiO. In one embodiment, the marker used to label the cells is selected from the group consisting of PKH67 and PKH26.
対照細胞が使用される場合、標的抗原を発現しない対照細胞は、標的抗原発現細胞と同じ標識又は異なる標識で標識することができる。同様に、対照ＣＡＲ細胞が使用される場合、標的抗原を認識しない対照ＣＡＲ細胞は、ＣＡＲ発現細胞と同じマーカー又は異なる標識で標識することができる。 When control cells are used, control cells that do not express the target antigen can be labeled with the same or different labels as the target antigen expressing cells. Similarly, when control CAR cells are used, control CAR cells that do not recognize the target antigen can be labeled with the same marker or a different label as the CAR expressing cells.
一実施形態では、抗原発現細胞及び／又は対照細胞は、ＰＫＨ６７で標識され、ＣＡＲ発現細胞及び／又は対照ＣＡＲ細胞は、ＰＫＨ２６で標識される、又はその逆もある。 In one embodiment, antigen-expressing cells and / or control cells are labeled with PKH67, CAR-expressing cells and / or control CAR cells are labeled with PKH26, and vice versa.
細胞の標識により、ＣＡＲ発現細胞の機能を調べ、任意選択により機能的なＣＡＲ発現細胞を（例えば、蛍光活性化セルソーティング、ＦＡＣＳによって）単離することができる。 Cell labeling allows the function of CAR-expressing cells to be investigated and optionally functional CAR-expressing cells isolated (eg, by fluorescence activated cell sorting, FACS).
当業者に公知の任意の方法を使用して細胞を標識することができ、特に当技術分野で公知の任意の方法を使用して細胞膜を標識することができる。 The cells can be labeled using any method known to those of skill in the art, and in particular any method known in the art can be used to label the cell membrane.
特に、標的抗原発現細胞及びＣＡＲ発現細胞及び／又は対照細胞の異なる標識での標識は：
（ａ）細胞又は細胞培養物、特に標的抗原発現細胞培養物及び／又はＣＡＲ発現細胞培養物及び／又は対照細胞及び／又は対照ＣＡＲ細胞を提供すること、
（ｂ）培養物又は細胞を、標識、特に、好ましくはＭＩＮＩ２６、ＰＫＨ２６−ＰＣＬ、ＰＫＨ６７、ＭＩＮＩ６７、ＰＫＨ６７−ＰＣＬ、ＰＫＨ２６、及びＰＫＨ２６−ＰＣＬから選択される膜マーカーと接触させること、
（ｃ）任意選択により、過剰な標識を除去するために培養物を洗浄すること、
（ｄ）任意選択により、工程（ｂ）と（ｃ）を繰り返すこと、
（ｅ）任意選択により、細胞又は培養物を、好ましくは少なくとも１日、少なくとも２日、より好ましくは少なくとも４日、さらにより好ましくは少なくとも１週間又は少なくとも２週間さらに培養すること、
（ｇ）任意選択により、標識された細胞を選択及び／又は収集することを含む。
In particular, labeling of target antigen-expressing cells and CAR-expressing cells and / or control cells with different labels is:
(A) To provide cells or cell cultures, particularly target antigen-expressing cell cultures and / or CAR-expressing cell cultures and / or control cells and / or control CAR cells.
(B) Contacting the culture or cell with a label, particularly preferably a membrane marker selected from MINI26, PKH26-PCL, PKH67, MINI67, PKH67-PCL, PKH26, and PKH26-PCL.
(C) Optional washing of the culture to remove excess labeling,
(D) Repeating steps (b) and (c) by arbitrary selection,
(E) By option, the cells or cultures are further cultured, preferably at least 1 day, at least 2 days, more preferably at least 4 days, even more preferably at least 1 week or at least 2 weeks.
(G) Includes optional selection and / or collection of labeled cells.
従って、いくつかの実施形態では、細胞集団は、共培養の前に培養組成物中で培養することができる。 Thus, in some embodiments, the cell population can be cultured in the culture composition prior to co-culture.
共培養
標識後、標的抗原発現細胞、ＣＡＲ発現細胞、及び任意選択による対照細胞を共培養する。
Co-culture After labeling, target antigen-expressing cells, CAR-expressing cells, and optionally control cells are co-cultured.
一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、抗原発現細胞及び／又は対照細胞と共培養される。共培養が、ＣＡＲ発現細胞と抗原発現細胞、又はＣＡＲ発現細胞と対照細胞のいずれかを別々に含む場合、対照細胞と抗原発現細胞を同じマーカーで標識することができる。共培養がＣＡＲ発現細胞と抗原発現細胞及び対照細胞を含む場合、これらの３つの集団のそれぞれは異なるマーカーで標識される。 In one embodiment, CAR-expressing cells are co-cultured with antigen-expressing cells and / or control cells. If the co-culture contains either CAR-expressing cells and antigen-expressing cells, or CAR-expressing cells and control cells separately, the control cells and antigen-expressing cells can be labeled with the same marker. If the co-culture comprises CAR-expressing cells and antigen-expressing cells and control cells, each of these three populations is labeled with a different marker.
別の実施形態では、抗原発現細胞は、ＣＡＲ発現細胞及び／又は対照ＣＡＲ細胞と共培養される。共培養が、抗原発現細胞とＣＡＲ発現細胞、又は抗原発現細胞と対照ＣＡＲ細胞のいずれかを別々に含む場合、対照ＣＡＲ細胞とＣＡＲ発現細胞を同じマーカーで標識することができる。共培養が、抗原発現細胞とＣＡＲ発現細胞及び対照ＣＡＲ細胞を含む場合、これらの３つの集団のそれぞれは異なるマーカーで標識される。 In another embodiment, the antigen-expressing cells are co-cultured with CAR-expressing cells and / or control CAR cells. If the co-culture contains either antigen-expressing cells and CAR-expressing cells, or antigen-expressing cells and control CAR cells separately, control CAR cells and CAR-expressing cells can be labeled with the same marker. If the co-culture comprises antigen-expressing cells and CAR-expressing cells and control CAR cells, each of these three populations is labeled with a different marker.
共培養がＣＡＲ発現細胞、対照ＣＡＲ細胞、抗原発現細胞、及び対照細胞を含む場合、これらの４つの集団のそれぞれは異なるマーカーで標識される。 If the co-culture comprises CAR-expressing cells, control CAR cells, antigen-expressing cells, and control cells, each of these four populations is labeled with a different marker.
細胞は、本発明の細胞によって必要とされる特定の条件に応じて、当業者に公知の任意の方法によって培養することができる。この条件は、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、薬剤、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、及び／又はイオンのうちの１つ又は複数を含み得る。 The cells can be cultured by any method known to those of skill in the art, depending on the specific conditions required by the cells of the invention. This condition may include one or more of a particular medium, temperature, oxygen content, carbon dioxide content, time, drug, eg nutrients, amino acids, antibiotics, and / or ions.
いくつかの実施形態では、培養条件は、ヒト免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の増殖に適した温度、例えば、少なくとも約２５℃、一般的には少なくとも約３０℃、及び一般的には３７℃又は約３７℃を含む。 In some embodiments, the culture conditions are at a temperature suitable for the growth of human immune cells (eg, T cells), such as at least about 25 ° C, generally at least about 30 ° C, and generally 37 ° C. Or it contains about 37 ° C.
培養は、ユニット、チャンバー、ウェル、カラム、チューブ、チューブセット、バルブ、バイアル、培養皿、バッグ、又は培養物若しくは細胞を培養するための他の容器などの培養容器内で行うことができる。 Culturing can be performed in culture vessels such as units, chambers, wells, columns, tubes, tube sets, valves, vials, culture dishes, bags, or other containers for culturing cultures or cells.
好ましくは、共培養は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、又は少なくとも５時間、好ましくは１〜５時間、さらにより好ましくは１〜３時間行われる。 Preferably, the co-culture is carried out for at least 1 hour, at least 2 hours, at least 3 hours, at least 4 hours, or at least 5 hours, preferably 1-5 hours, even more preferably 1-3 hours.
一実施形態では、共培養は、１：０．５〜１：１０の標的抗原発現細胞とＣＡＲ発現細胞の比率、好ましくは１：１〜１：１０の標的抗原発現細胞とＣＡＲ発現細胞の比率で行われる。好ましくは、培養前の細胞濃度は、少なくとも１０４細胞／ｍＬ、少なくとも１０５細胞／ｍＬ、又は少なくとも１０６細胞／ｍＬ、好ましくは少なくとも１０６細胞／ｍＬ、さらにより好ましくは２×１０６細胞／ｍＬである。 In one embodiment, the co-culture is a ratio of target antigen-expressing cells to CAR-expressing cells of 1: 0.5 to 1:10, preferably a ratio of target antigen-expressing cells to CAR-expressing cells of 1: 1 to 1:10. It is done in. Preferably, the cell concentration before the culture is at least 10 4 cells / mL, at least 10 5 cells / mL, or at least 10 6 cells / mL, preferably at least 10 6 cells / mL, still more preferably 2 × 10 6 cells / ML.
本発明の文脈において、細胞の共培養は、細胞、特に、対照細胞及び／又は対照ＣＡＲ細胞の有無にかかわらず、ＣＡＲ細胞及び抗原発現細胞などの細胞の２つ以上の細胞集団の接触をもたらす。 In the context of the present invention, co-culture of cells results in contact of two or more cell populations of cells, in particular with or without control cells and / or control CAR cells, such as CAR cells and antigen-expressing cells. ..
特定の態様では、この方法は、標的抗原発現細胞をＣＡＲ発現細胞と共培養する前に、この標的抗原発現細胞を抗体、好ましくは、ＣＡＲが由来する抗体と同じ又は重複するエピトープを認識する抗体と共に培養する工程をさらに含む。好ましくは、抗体は、ＣＡＲが由来するモノクローナル抗体のＣＤＲの少なくとも１つ、好ましくは、ＣＡＲが由来するモノクローナル抗体の２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含むモノクローナル抗体である。この特定の態様は、ＣＡＲ特異性、即ち、ＣＡＴ活性化が、ＣＡＲ発現細胞のＣＡＲによる標的抗原細胞の抗原の結合を介して行われるかどうかを試験することを可能にする。実際、抗体の存在下でＣＡＲ活性化（及びその後の膜転移）が阻害又は減少する場合、効果が、抗原に対するＣＡＲ効果に特異的であること、及びＣＡＲ発現細胞が標的抗原に特異的であると結論付けることができる。陰性対照は、同じ試験であるが、抗原に結合できない抗体を用いる試験を行うことによって加えることができる。 In certain embodiments, the method recognizes an epitope of the target antigen-expressing cell as an antibody, preferably the same or overlapping epitope as the antibody from which the CAR is derived, prior to co-culturing the target antigen-expressing cell with the CAR-expressing cell. Further includes the step of culturing with. Preferably, the antibody is a monoclonal antibody comprising at least one of the CDRs of a CAR-derived monoclonal antibody, preferably two, three, four, five, or six CDRs of a CAR-derived monoclonal antibody. be. This particular aspect makes it possible to test whether CAR specificity, ie, CAT activation, is mediated by the binding of the antigen of the target antigen cell by the CAR of the CAR expressing cell. In fact, if CAR activation (and subsequent membrane metastasis) is inhibited or diminished in the presence of the antibody, the effect is specific for the CAR effect on the antigen, and the CAR-expressing cells are specific for the target antigen. Can be concluded. Negative controls can be added by performing the same test, but with a test using an antibody that cannot bind to the antigen.
膜獲得の分析及び細胞選別
トロゴサイトーシスは、ＡＰＣ又は腫瘍細胞のいずれかからエフェクター免疫細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）への原形質膜及びアンカータンパク質の転移を伴う。トロゴサイトーシスは、細胞間の接触に依存している。実際、トロゴサイトーシスは、エフェクター細胞の抗原特異的活性化を広く反映する能動的プロセスである。この結合(conjugation)中、膜転移は、獲得側細胞の活性化状態に依存し；トロゴサイトーシスは、特異的に認識する抗原を含む細胞の存在下でのＣＡＲ発現細胞の活性化を必要とする。従って、トロゴサイトーシスの程度は、Ｔ細胞及びＢ細胞での抗原受容体シグナル伝達によって、ＮＫ細胞におけるキラー阻害及びキラー活性化受容体によって引き起こされる、Ｂ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞、及びＮＫエフェクター細胞などの機能的免疫細胞の活性化に関連している。しかしながら、膜転移は、トロゴサイトーシスを行うＴ細胞がその表面に細胞毒性機能のマーカー：ＣＤ１０７ａも露出させるため、活性化状態だけでなく機能にも関係している。従って、トロゴサイトーシスに基づく方法は、特にＣＡＲ発現細胞に適用される場合に、膜転移を独自の高速な方法にして、エフェクター細胞の特異性と機能を調べることができる。
Analysis of Membrane Acquisition and Cell Selection Trogocytosis involves the transfer of plasma membranes and anchor proteins from either APCs or tumor cells to effector immune cells (eg, CAR-expressing cells). Trogocytosis relies on cell-cell contact. In fact, trogocytosis is an active process that broadly reflects antigen-specific activation of effector cells. During this conjugation, membrane metastasis depends on the activation state of the acquiring cells; trogocytosis requires activation of CAR-expressing cells in the presence of cells containing specifically recognized antigens. And. Therefore, the degree of trologcytosis is caused by antigen receptor signaling in T and B cells, killer inhibition and killer activation receptors in NK cells, B cells, αβT cells, γδT cells, and NK. It is associated with the activation of functional immune cells such as effector cells. However, membrane metastasis is related not only to the activated state but also to the function because the T cells performing trogocytosis also expose the marker of cytotoxic function: CD107a on the surface thereof. Therefore, trogocytosis-based methods can be used to examine the specificity and function of effector cells, making membrane metastasis a unique and rapid method, especially when applied to CAR-expressing cells.
本発明による方法は、標的抗原発現細胞からのＣＡＲ発現細胞による膜獲得を評価するために細胞を分析する工程を含み、膜獲得は、標的抗原に対するＣＡＲ発現細胞の結合能力及び／又は活性化能力の指標であり、それによってＣＡＲ発現細胞の機能を評価する。 The method according to the invention comprises analyzing cells to evaluate membrane acquisition by CAR-expressing cells from target antigen-expressing cells, the membrane acquisition being the ability of CAR-expressing cells to bind and / or activate to the target antigen. It is an index of, and thereby evaluates the function of CAR-expressing cells.
この膜転移は、細胞標識に使用された標識に従って、当業者に公知の任意の方法によって細胞が以前に標識された異なるマーカーによりモニタリングすることができる。 This membrane metastasis can be monitored by different markers previously labeled cells by any method known to those of skill in the art, according to the labeling used for cell labeling.
特に、標識が蛍光標識である場合、膜転移は、蛍光顕微鏡法（優れた解像度と正確な定量測定を提供することに加えてデジタル画像を使用できる）又は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって分析することができる。 Especially when the label is a fluorescent label, the membrane transition is analyzed by fluorescence microscopy (digital images can be used in addition to providing excellent resolution and accurate quantitative measurements) or fluorescence activated cell sorting (FACS). can do.
フローサイトメトリーに基づくＦＡＣＳシステムは、当技術分野で周知であり、標的抗原発現細胞から膜を獲得したＣＡＲ発現細胞などの所望の細胞集団をサンプルから分離及び単離することができる。実際、そのような膜転移が起こるときに、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲ発現細胞及び抗原発現細胞を標識した２つの標識を含む。 FACS systems based on flow cytometry are well known in the art and can separate and isolate desired cell populations, such as CAR-expressing cells that have acquired membranes from target antigen-expressing cells, from the sample. In fact, when such membrane metastases occur, CAR-expressing cells contain two labels labeled CAR-expressing cells and antigen-expressing cells.
フローサイトメトリーは、流体の流れを利用して粒子を線形に分離し、粒子が単一ファイルを検出装置に通過させることができるようにする。個々の細胞は、流体の流れの中のそれらの位置及び検出可能なマーカーの存在に従って区別することができる。従って、フローサイトメトリーを使用して、細胞集団の診断プロファイルを作成することができ、異なるカテゴリーの細胞、例えば、抗原発現細胞（例えば、標識１によって）、標的細胞膜を獲得しなかったＣＡＲ発現細胞（例えば、標識２によって）、標的細胞膜を獲得した機能的ＣＡＲ発現細胞（例えば、標識１及び標識２の両方によって）、任意選択による対照細胞（例えば、標識１、２、又は３によって）、及びどの標識も発現しない細胞の区別が可能になる。
Flow cytometry utilizes the flow of fluid to linearly separate particles, allowing a single file to pass through a detector. Individual cells can be distinguished according to their position in the fluid flow and the presence of detectable markers. Thus, flow cytometry can be used to create diagnostic profiles of cell populations of different categories of cells, such as antigen-expressing cells (eg, by Label 1), CAR-expressing cells that did not acquire the target cell membrane. Functional CAR-expressing cells that have acquired the target cell membrane (eg, by both
一実施形態では、フローサイトメーターでの細胞の検出は、フローサイトメーターの調査点（interrogation point）で１つ又は複数のレーザーで蛍光色素を励起し、続いて１つ又は複数の光学検出器を使用して色素からの蛍光発光を検出することを含み得る。粒子を検出することに加えて、選別又は分離された粒子（例えば、細胞）の数を決定することが望ましい場合がある。従って、いくつかの実施形態では、方法は、標識された粒子（例えば、抗原発現細胞から膜を獲得したＣＡＲ発現細胞）をカウント及び／又は選別することをさらに含む。粒子の検出、カウント、及び／又は選別では、粒子を含む液体培地が、最初にフローサイトメーターの流路に導入される。流路内にある場合、粒子は、１つ又は複数の検出領域（例えば、調査点）を実質的に一度に１つずつ通過し、各細胞は、単一波長の光源に個々に曝露され、光散乱パラメーター及び／又は蛍光発光の測定値（例えば、２つ以上の光散乱パラメーター及び１つ又は複数の蛍光発光の測定値）が、必要に応じて粒子ごとに個別に記録される。各粒子の記録されたデータは、必要に応じて、リアルタイムで分析されるか、又はコンピュータなどのデータ記憶装置及び分析手段に保存される。米国特許第４，２８４，４１２号に、単一の光源を備えた対象となるフローサイトメーターの構成及び使用が記載され、米国特許第４，７２７，０２０号には、２つの光源を備えたフローサイトメーターの構成及び使用が記載されている。３つ以上の光源を有するフローサイトメーターも使用することができる。例えば、４８８ｎｍの光は、単一の検出領域を有するフローサイトメーターにおける発光の波長として使用することができる。２つの異なる波長で光を放出するフローサイトメーターでは、追加の波長の放出光を使用することができ、対象となる特定の波長は、限定されるものではないが：５３５ｎｍ及び６３５ｎｍなどを含む。従って、細胞のフローサイトメトリーによるアッセイでは、必要に応じて、細胞を励起光に曝露し、１つ又は複数の検出チャネルで各粒子の蛍光を測定することによって、細胞を検出し、一意に識別することができる。励起光は、１つ又は複数の光源からのものであり得、狭帯域又は広帯域のいずれかであり得る。 In one embodiment, detection of cells on a flow cytometer excites a fluorescent dye with one or more lasers at the interrogation point of the flow cytometer, followed by one or more optical detectors. It may include detecting fluorescent emission from the dye in use. In addition to detecting particles, it may be desirable to determine the number of particles (eg, cells) sorted or separated. Thus, in some embodiments, the method further comprises counting and / or sorting labeled particles (eg, CAR-expressing cells that have acquired membranes from antigen-expressing cells). For particle detection, counting, and / or sorting, a liquid medium containing the particles is first introduced into the flow cytometer channel. When in the channel, the particles pass through one or more detection areas (eg, survey points) substantially one at a time, and each cell is individually exposed to a single wavelength light source. Light scattering parameters and / or fluorescence measurements (eg, two or more light scattering parameters and one or more fluorescence measurements) are recorded individually for each particle as needed. The recorded data of each particle is analyzed in real time, if necessary, or stored in a data storage device such as a computer and analytical means. U.S. Pat. No. 4,284,412 describes the configuration and use of a subject flow cytometer with a single light source, and U.S. Pat. No. 4,727,020 has two light sources. The configuration and use of the flow cytometer is described. A flow cytometer with three or more light sources can also be used. For example, light at 488 nm can be used as the wavelength of emission in a flow cytometer with a single detection region. Flow cytometers that emit light at two different wavelengths can use emitted light of additional wavelengths, and the particular wavelength of interest includes, but is not limited to: 535 nm, 635 nm, and the like. Therefore, cell flow cytometric assays detect and uniquely identify cells by exposing them to excitation light and measuring the fluorescence of each particle on one or more detection channels, as needed. can do. The excitation light can be from one or more light sources and can be either narrowband or wideband.
検出領域と直列に、検出器、例えば、光増倍管（又は「ＰＭＴ」）などの集光器が使用されて、各粒子を通過する光（場合によっては、前方光散乱と呼ばれる）、検出領域を通る細胞の流れの方向に直交して反射される光（場合によっては、直交光散乱（orthogonal light scatter）又は側方光散乱と呼ばれる）、及び蛍光マーカーで標識されている場合は、粒子が検知領域を通過してエネルギー源によって照明されて細胞から放出される蛍光が記録される。前方光散乱（又はＦＳＣ）、直交光散乱（ＳＳＣ）、及び蛍光発光（ＦＬ１、ＦＬ２など）のそれぞれには、各粒子（又は各「事象」）の個別のパラメーターが含まれる。 In series with the detection area, a detector, eg, a concentrator such as a photomultiplier tube (or "PMT"), is used to detect the light passing through each particle (sometimes referred to as forward light scattering). Light reflected perpendicular to the direction of cell flow through the region (sometimes called orthogonal light scatter or lateral light scattering), and particles if labeled with a fluorescent marker. The fluorescence emitted from the cells is recorded as it passes through the detection area and is illuminated by an energy source. Each of forward light scattering (or FSC), orthogonal light scattering (SSC), and fluorescence emission (FL1, FL2, etc.) contains individual parameters for each particle (or each "event").
本発明の目的に使用できる対象となるフローサイトメーターには、BD Biosciences FACSCanto（商標）フローサイトメーター、BD Biosciences FACSVantage（商標）、BD Biosciences FACSort（商標）、BD Biosciences FACSCount（商標）、BD Biosciences FACScan（商標）、BD Accuri C6 Plus（商標）、又はMiltenyi MacsQuant（商標）などが含まれ得る。 Target flow cytometers that can be used for the purposes of the present invention include BD Biosciences FACSCanto ™ Flow Cytometer, BD Biosciences FACSVantage ™, BD Biosciences FACSort ™, BD Biosciences FACSCount ™, BD Biosciences FACScan. ™, BD Accuri C6 Plus ™, or Miltenyi MacsQuant ™, etc. may be included.
一実施形態では、膜転移は、ＰＫＨ６７及びＰＫＨ２６標識の使用に従ってフローサイトメトリー分析によってモニタリングされる。 In one embodiment, membrane metastases are monitored by flow cytometric analysis according to the use of PKH67 and PKH26 labels.
抗原発現細胞がＰＫＨ６７で標識され、ＣＡＲ発現細胞がＰＫＨ２６で標識される、又はその逆である実施形態では、膜転移分析はＦＡＣＳによって行われる。この実施形態では、細胞が少なくとも３つのカテゴリー：（ｉ）ＰＫＨ６７のみを発現する細胞、（ｉｉ）ＰＫＨ２６のみを発現する細胞、（ｉｉｉ）ＰＫＨ６７及びＰＫＨ２６の両方を発現する細胞、並びに（ｉｖ）最終的にＰＫＨ２６もＰＫＨ６７も発現しない細胞に分類できるように膜転移が起こることが期待される。従って、ＰＫＨ２６及びＰＫＨ６７標識の両方を発現する細胞のパーセンテージを決定して、抗原発現細胞から細胞膜を効果的に獲得するＣＡＲ発現細胞のパーセンテージをモニタリングすることができ、それによって、抗原−ＣＡＲ相互作用及びＣＡＲ発現細胞の機能をモニタリングする。 In embodiments where antigen-expressing cells are labeled with PKH67, CAR-expressing cells are labeled with PKH26, or vice versa, membrane transference analysis is performed by FACS. In this embodiment, the cells are in at least three categories: (i) cells expressing only PKH67, (ii) cells expressing only PKH26, (iii) cells expressing both PKH67 and PKH26, and (iv) final. It is expected that membrane metastasis will occur so that cells can be classified into cells that do not express PKH26 or PKH67. Thus, the percentage of cells expressing both PKH26 and PKH67 labels can be determined and the percentage of CAR-expressing cells that effectively acquire cell membranes from antigen-expressing cells can be monitored, thereby antigen-CAR interaction. And the function of CAR-expressing cells is monitored.
方法が対照細胞又は対照ＣＡＲ細胞をさらに含む実施形態では、対照細胞又は対照ＣＡＲ細胞を、標識ＰＫＨ６７、ＰＫＨ２６、ＤｉＩ、Ｖｙｂｒａｎｔ ＣＭ−ＤｉＩ、ＤｉＯ、又は他の親油性色素、又は市販の親油性色素を介したフローサイトメトリーによって分類することができる。 In embodiments where the method further comprises control cells or control CAR cells, the control cells or control CAR cells are labeled with PKH67, PKH26, DiI, Vybrant CM-DiI, DiO, or other lipophilic dyes, or commercially available lipophilic dyes. It can be classified by flow cytometry via.
特に、対照細胞がＰＫＨ６７で標識され、ＣＡＲ発現細胞がＰＫＨ２６で標識される、又はその逆である対照細胞を含む実施形態では、膜転移分析はＦＡＣＳによって行われる。この実施形態では、細胞が少なくとも２つのカテゴリー：（ｉ）ＰＫＨ６７のみを発現する細胞、（ｉｉ）ＰＫＨ２６のみを発現する細胞、（ｉｉｉ）最終的にＰＫＨ２６もＰＫＨ６７も発現しない細胞に分類できるように膜転移が起こらないことが期待される。 In particular, in embodiments comprising control cells in which control cells are labeled with PKH67 and CAR expressing cells are labeled with PKH26 and vice versa, membrane transference analysis is performed by FACS. In this embodiment, the cells can be classified into at least two categories: (i) cells expressing only PKH67, (ii) cells expressing only PKH26, and (iii) finally cells expressing neither PKH26 nor PKH67. It is expected that membrane metastasis will not occur.
対照ＣＡＲ細胞がＰＫＨ６７で標識され、抗原発現細胞がＰＫＨ２６で標識される、又はその逆である対照ＣＡＲ細胞を含む実施形態では、膜転移分析はＦＡＣＳによって行われる。この実施形態では、細胞が少なくとも２つのカテゴリー：（ｉ）ＰＫＨ６７のみを発現する細胞、（ｉｉ）ＰＫＨ２６のみを発現する細胞、（ｉｉｉ）最終的にＰＫＨ２６もＰＫＨ６７も発現しない細胞、に分類できるように膜転移が起こらないことが期待される。 In embodiments comprising control CAR cells labeled with PKH67 and antigen-expressing cells labeled with PKH26 and vice versa, membrane transference analysis is performed by FACS. In this embodiment, the cells can be classified into at least two categories: (i) cells expressing only PKH67, (ii) cells expressing only PKH26, and (iii) cells finally expressing neither PKH26 nor PKH67. It is expected that no membrane metastasis will occur.
特定の実施形態では、この方法は、機能的ＣＡＲ発現細胞及び／又は機能的ＣＡＲコンストラクトの選択をさらに含む。実際、この方法により、目的の抗原に対して機能的であることが試験された特定のＣＡＲコンストラクトを発現する細胞の選択が可能になる。この方法は、例えば膜転移が起こるパーセンテージのデータ分析によって、目的の抗原に対して最も適切なＣＡＲ発現細胞及び／又はＣＡＲコンストラクトの選択を可能にする。従って、この方法は、ＣＡＲ発現細胞の機能に影響を与えることが知られている最も適切なＣＡＲ成分（例えば、膜貫通ドメイン、ヒンジ、細胞内ドメイン）の選択も可能にする。機能的ＣＡＲ発現細胞及び／又は機能的ＣＡＲコンストラクトのこの特定の選択は、ＣＡＲベースの治療を改善するために非常に興味深い。 In certain embodiments, the method further comprises the selection of functional CAR expressing cells and / or functional CAR constructs. In fact, this method allows the selection of cells expressing a particular CAR construct that has been tested to be functional against the antigen of interest. This method allows selection of the most appropriate CAR-expressing cells and / or CAR constructs for the antigen of interest, for example by data analysis of the percentage of membrane metastases. Thus, this method also allows for the selection of the most appropriate CAR components known to affect the function of CAR-expressing cells (eg, transmembrane domains, hinges, intracellular domains). This particular selection of functional CAR-expressing cells and / or functional CAR constructs is of great interest for improving CAR-based therapy.
養子細胞療法用の機能的ＣＡＲ発現細胞を調製するための方法
遺伝子を細胞に導入して細胞内で遺伝子を発現させる方法は当技術分野で公知である。
Methods for Preparing Functional CAR-Expressing Cells for Adoptive Cell Therapy Methods of introducing a gene into a cell and expressing the gene intracellularly are known in the art.
特に、ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を作製するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)を参照されたい。発現ベクターの文脈では、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫細胞に当技術分野の任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、以下でより具体的に説明される物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞に導入することができる。 In particular, methods for making cells containing vectors and / or exogenous nucleic acids are well known in the art. See, for example, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). In the context of expression vectors, the vector can be readily introduced into host cells, such as mammalian, bacterial, yeast, or insect cells, by any method in the art. For example, the expression vector can be introduced into a host cell by physical, chemical, or biological means described more specifically below.
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載されるように、対象から細胞を単離すること、それらを調製すること、処理すること、培養すること、及び／又はエンジニアリングすること、及び凍結保存の前又は後にそれらを同じ患者に再導入することを含む。 In some embodiments, the method is to isolate cells from a subject, prepare them, treat them, culture them, and / or engineer them, as described herein. And reintroducing them into the same patient before or after cryopreservation.
本明細書では特に、ＣＡＲ発現細胞を作製する方法が提供され、この方法は：（ｉ）ＣＡＲをコードする核酸配列を、単離された細胞の集団に形質導入する工程、（ｉｉ）工程（ｉ）の前記核酸配列の形質導入に成功した前記単離された細胞の亜集団を選択し、それによってＣＡＲ発現細胞を作製する工程を含むか、或いは本質的にそれからなるか、又はなおさらにそれからなる。一態様では、単離された細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞からなる群から選択される。 In particular, a method of making CAR-expressing cells is provided herein: (i) transducing a nucleic acid sequence encoding CAR into a population of isolated cells, (ii) step (ii). i) Select a subpopulation of the isolated cells that has been successfully transduced with the nucleic acid sequence, thereby including, or essentially consisting of, or even from it, to produce CAR-expressing cells. Become. In one aspect, the isolated cells are selected from the group consisting of T cells and NK cells.
本明細書では、ＣＡＲ発現細胞を作製する方法がさらにより具体的に提供され、この方法は：
（ｉ）ＣＡＲをコードする核酸配列を免疫細胞の集団に形質導入する工程であって、好ましくは、免疫細胞の集団が、処置される対象からの生物学的サンプルから単離されたものである、工程、
（ｉｉ）ＣＡＲを発現する前記単離された細胞の亜集団を選択する工程、及び、
（ｉｉｉ）前記請求項のいずれかに記載の方法によってそれらの機能を評価する工程であって、好ましくは、ＣＡＲが生成された抗原を発現する標的抗原発現細胞についてである、工程、
（ｉｖ）任意選択による、抗原発現細胞からの膜獲得を経験したＣＡＲ発現細胞から機能的ＣＡＲ発現細胞及び／又はＣＡＲ核酸コンストラクトを選択する工程を含むか、或いは本質的にそれからなるか、又はなおさらにそれからなる。
In the present specification, a method for producing CAR-expressing cells is provided more specifically, and this method is:
(I) The step of transducing a nucleic acid sequence encoding CAR into a population of immune cells, preferably the population of immune cells isolated from a biological sample from the subject to be treated. , Process,
(Ii) A step of selecting a subpopulation of the isolated cells expressing CAR, and
(Iii) A step of evaluating their function by the method according to any one of the above claims, preferably for a target antigen-expressing cell expressing a CAR-generated antigen.
(Iv) Including, or essentially consisting of, the step of selecting functional CAR-expressing cells and / or CAR nucleic acid constructs from CAR-expressing cells that have experienced membrane acquisition from antigen-expressing cells by arbitrary choice, or even more. It consists of it.
特定の実施形態では、この方法は：
（ｉ）免疫細胞集団を、好ましくは処置される対象からの生物学的サンプル（例えば、血球）から提供すること、
（ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸配列を免疫細胞の集団に形質導入する前に、特定の免疫細胞集団（例えば、Ｔ細胞、Ｂリンパ球、単球、及び抗原提示細胞、及び／又はＮＫ細胞）を単離することをさらに含む。
In certain embodiments, this method is:
(I) The immune cell population is preferably provided from a biological sample (eg, blood cell) from the subject to be treated.
(Ii) Specific immune cell populations (eg, T cells, B lymphocytes, monocytes, and antigen presenting cells, and / or NK cells) prior to transfecting the CAR-encoding nucleic acid sequence into the immune cell population. Further comprises isolating.
別の実施形態では、この方法は、抗原発現細胞からの膜獲得を経験したＣＡＲ発現細胞からＣＡＲ発現細胞及び／又はＣＡＲコンストラクトを選択することをさらに含む。続いて、抗原発現細胞からの膜獲得を経験したＣＡＲ発現細胞に対応する形質導入された免疫細胞コンストラクトをさらに再導入するか、又は対象に投与することができる。この方法は、そのようなエンジニアリングされた細胞のそれを必要とする対象へのあらゆる導入の前にその機能を評価することによって、目的の抗原を標的とするのに最も適切なＣＡＲ発現細胞の選択を可能にする。 In another embodiment, the method further comprises selecting CAR-expressing cells and / or CAR constructs from CAR-expressing cells that have experienced membrane acquisition from antigen-expressing cells. Subsequently, the transduced immune cell construct corresponding to the CAR-expressing cells that have experienced membrane acquisition from the antigen-expressing cells can be further reintroduced or administered to the subject. This method selects the most suitable CAR-expressing cells to target the antigen of interest by assessing its function prior to any introduction of such engineered cells into the subject in need of it. Enables.
投与を容易にするために、本発明による形質導入細胞は、対象への投与に適していることが当技術分野で公知である任意の方法によって薬学的に許容される担体又は希釈剤を用いて医薬組成物にするか、又はインビボでの投与に適したインプラントにすることができる。 To facilitate administration, transduced cells according to the invention are pharmaceutically acceptable by any method known in the art to be suitable for administration to a subject using a carrier or diluent. It can be a pharmaceutical composition or an implant suitable for in vivo administration.
本発明による方法から選択されたＣＡＲコンストラクトを発現する細胞が対象に投与されると、いくつかの態様におけるエンジニアリングされた細胞集団及び／又は抗体の生物学的活性が、いくつかの既知の方法のいずれかによって測定される。特定の実施形態では、標的細胞を破壊するエンジニアリングされた細胞の能力は、例えば、Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), and Herman et al. J. Immunological Methods , 285(1): 25-40 (2004)に記載されている細胞毒性アッセイなどの当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて測定することができる。特定の実施形態では、細胞の生物学的活性はまた、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＭＩＰ−１ａ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−２などの特定のサイトカインの発現及び／又は分泌をアッセイすることによって測定することができる。 When cells expressing a CAR construct selected from the methods according to the invention are administered to a subject, the biological activity of the engineered cell population and / or antibody in some embodiments will be exhibited in some known methods. Measured by either. In certain embodiments, the ability of engineered cells to destroy target cells is, for example, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 (7): 689-702 (2009), and Herman et al. J. Immunological. Measurements can be made using any suitable method known in the art, such as the cytotoxicity assay described in Methods, 285 (1): 25-40 (2004). In certain embodiments, the biological activity of the cell is also specified such as GM-CSF, IL-3, MIP-1a, TNF-α, IL-10, IL-13, IFN-γ, or IL-2. It can be measured by assaying the expression and / or secretion of the cytokine of.
いくつかの態様では、生物学的活性は、無増悪生存率、又は全生存率、腫瘍の量又は負荷の減少、腫瘍の安定化などの臨床転帰を評価することによって測定される。 In some embodiments, biological activity is measured by assessing clinical outcomes such as progression-free survival, or overall survival, reduced tumor volume or load, and tumor stabilization.
実施例−結果
ＣＡＲ／ＨＬＡ−Ｇ１相互作用による膜獲得
免疫細胞は、ＡＰＣ又は腫瘍細胞抗原−提示細胞などの標的細胞から細胞表面膜パッチを獲得することが以前に実証された（Caumartin et al., EMBO J, 2007. 26(5): p. 1423-33）。エフェクター細胞による標的細胞からの膜獲得は、（ｉ）細胞間接触を必要とし、（ｉｉ）迅速であり、且つ（ｉｉｉ）獲得側細胞の活性化状態に依存する能動的プロセスであり、獲得側細胞の活性化状態は、（ｉｖ）エフェクター細胞の抗原特異的活性化を反映する。従って、膜転移は、機能的に成熟した免疫細胞の活性化に関連している。
Examples-Results Membrane acquisition by CAR / HLA-G1 interaction It was previously demonstrated that immune cells acquire cell surface membrane patches from target cells such as APC or tumor cell antigen-presenting cells (Caumartin et al. , EMBO J, 2007. 26 (5): p. 1423-33). Membrane acquisition from target cells by effector cells is an active process that requires (i) cell-cell contact, (ii) rapid, and (iii) depends on the activation state of the acquiring cell, and is the acquiring side. The cell activation state reflects (iv) antigen-specific activation of effector cells. Therefore, membrane metastasis is associated with activation of functionally mature immune cells.
ＣＡＲの結合後に、エフェクター細胞を活性化して、標的細胞から膜パッチを獲得できるかどうかを調べた。この目的のために、ＨＬＡ−Ｇ／ＣＡＲ相互作用ではないその他のバイスタンダーのタンパク質間相互作用を回避するために、エフェクター細胞及び標的細胞としてＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株を使用して実験を設定した。これは、細胞間の接触がＣＡＲ−抗原相互作用によってのみ媒介／駆動されることを意味する。 After binding of CAR, effector cells were activated to see if membrane patches could be obtained from target cells. For this purpose, experiments were set up using Jurkat T cell lines as effector cells and target cells to avoid other bystander protein-protein interactions that are not HLA-G / CAR interactions. This means that cell-cell contact is mediated / driven only by CAR-antigen interactions.
図１に示されているように、Ｊｕｒｋａｔ標的細胞の膜を、ＰＫＨ６７蛍光色素を使用して緑色で標識し、ＪｕｒｋａｔエフェクターＣＡＲ細胞膜を、ＰＫＨ２６蛍光色素を使用して赤色で標識した。膜転移がＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ相互作用に関連しているかどうかを判断するために、まずＨＬＡ−Ｇ発現標的細胞とＣＡＲエフェクター細胞との間の膜転移の程度を比較した。この目的のために、２つの異なるＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲコンストラクトを、ＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームへの結合に応じて作製し：ＬＦＴＴ−１抗体パラトープに基づくＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲは、β２Ｍに会合したＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームに特異的であるが、１５Ｅ７抗体パラトープに基づく「対照ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ」は、β２Ｍに会合していないＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームにのみ特異的である。Ｊｕｒｋａｔ ＨＬＡ−Ｇ１細胞株は、１５Ｅ７ではなくＬＦＴＴ−１抗体によってのみ認識されるβ２Ｍアイソフォームに会合したＨＬＡ−Ｇ１のみを発現した。図２Ａに示されているように、標的細胞でのＨＬＡ−Ｇ発現の非存在下では、エフェクターＣＡＲ細胞による標的細胞からの膜獲得は期待されない。しかしながら、図２Ｂでは、ＨＬＡ−Ｇ発現標的細胞の存在下で、特定のＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞は、ＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ会合標的細胞から膜パッチを獲得する必要があるが、対照ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞は獲得する必要がない。 As shown in FIG. 1, the membranes of Jurkat target cells were labeled green with PKH67 fluorescent dye and the Jurkat effector CAR cell membranes were labeled red with PKH26 fluorescent dye. To determine if membrane metastases are associated with CAR-HLA-G interactions, the extent of membrane metastases between HLA-G expression target cells and CAR effector cells was first compared. For this purpose, two different HLA-G CAR constructs were made in response to binding to the HLA-G1 isoform: an HLA-G CAR based on the LFTT-1 antibody paratope was associated with β2M HLA-G1. Although specific to the isoform, the "control HLA-G CAR" based on the 15E7 antibody paratope is specific only to the HLA-G1 isoform that is not associated with β2M. The Jurkat HLA-G1 cell line expressed only HLA-G1 associated with the β2M isoform recognized only by the LFTT-1 antibody, not 15E7. As shown in FIG. 2A, membrane acquisition from target cells by effector CAR cells is not expected in the absence of HLA-G expression in target cells. However, in FIG. 2B, in the presence of HLA-G expression target cells, Jurkat cells expressing a particular HLA-G-LFTT-1 CAR need to acquire membrane patches from HLA-G1 / β2M associated target cells. However, Jurkat cells expressing the control HLA-G-15E7 CAR do not need to be acquired.
標的細胞及びエフェクター細胞を１時間及び３時間共培養し、フローサイトメトリーで膜転移を分析した。図３Ａ及び図３Ｂに示されているように、共培養の前は、ＣＡＲエフェクター細胞は、ＨＬＡ−Ｇを発現しているかどうかにかかわらず腫瘍標的細胞から膜を獲得しなかった。１時間の共培養後、ＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍタンパク質に特異的でないＣＡＲエフェクター細胞は、ＨＬＡ−Ｇ１形質導入細胞からもＨＬＡ−Ｇ１陰性腫瘍細胞からも膜パッチを獲得しなかった。しかしながら、ＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ特異的ＣＡＲ細胞の１５．９％は、ＨＬＡ−Ｇ１腫瘍細胞から既に膜パッチを獲得しているが、ＨＬＡ−Ｇ１陰性の対応物からは獲得していない。 Target cells and effector cells were co-cultured for 1 hour and 3 hours, and membrane metastasis was analyzed by flow cytometry. As shown in FIGS. 3A and 3B, prior to co-culture, CAR effector cells did not acquire membranes from tumor target cells regardless of whether they were expressing HLA-G. After 1 hour of co-culture, CAR effector cells that were not specific for the HLA-G1 / β2M protein did not acquire membrane patches from HLA-G1 transduced cells or HLA-G1-negative tumor cells. However, 15.9% of HLA-G1 / β2M-specific CAR cells have already acquired membrane patches from HLA-G1 tumor cells, but not from HLA-G1-negative counterparts.
要するに、ＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ発現腫瘍細胞とＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ抗原に特異的なＣＡＲエフェクター細胞との間での膜転移が実証された。 In short, membrane metastasis between HLA-G1 / β2M expressing tumor cells and HLA-G1 / β2M antigen-specific CAR effector cells was demonstrated.
膜獲得は迅速なプロセスである
ＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ腫瘍細胞とＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲエフェクター細胞との間の膜転移は、ＬＦＴＴ−１ ＣＡＲエフェクター細胞のほぼ２２％がトロゴサイトーシスを行うことができる３時間の共培養後に確認された。それでも、１５Ｅ７ ＣＡＲ細胞は、３時間の共培養後でも、ＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ標的細胞から膜を獲得できなかった。図４に示されているように、膜転移は１時間の共培養後にＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ ＣＡＲエフェクター細胞の＋／−３２％に関係し、３時間の共培養後にトロゴサイトーシスの可能なエフェクター細胞の割合が＋／−４０％までわずかに増加したため、膜獲得の速度は迅速である。
Membrane acquisition is a rapid process Membrane metastasis between HLA-G1 / β2M tumor cells and HLA-G CAR effector cells can cause almost 22% of LFTT-1 CAR effector cells to undergo trogocytosis. It was confirmed after 3 hours of co-culture. Nevertheless, 15E7 CAR cells failed to acquire membranes from HLA-G1 / β2M target cells even after 3 hours of co-culture. As shown in FIG. 4, membrane metastasis is associated with +/- 32% of HLA-G-LFTT-1 CAR effector cells after 1 hour of co-culture and after 3 hours of co-culture of trologcytosis. The rate of membrane acquisition is rapid because the proportion of possible effector cells has increased slightly to +/- 40%.
これらの結果は、ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ ＣＡＲエフェクター細胞がＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ陽性腫瘍細胞からのみ膜断片を獲得したのに対して、ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ ＣＡＲエフェクター細胞はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ陽性腫瘍細胞から膜パッチを獲得しなかったため、膜転移は迅速であり、抗原／ＣＡＲ特異的相互作用にのみ関連することを示した。 These results show that HLA-G-LFTT-1 CAR effector cells acquired membrane fragments only from HLA-G1 / β2M positive tumor cells, whereas HLA-G-15E7 CAR effector cells acquired HLA-G1 / β2M. Since no membrane patch was obtained from positive tumor cells, membrane metastasis was shown to be rapid and associated only with antigen / CAR-specific interactions.
膜獲得はＣＡＲの特異性に依存する
次いで、トロゴサイトーシスとＣＡＲの特異性との間の関係を評価した。評価するために、図５に図式化されているように、トロゴサイトーシス実験の前に、ＨＬＡ−Ｇ１形質導入腫瘍細胞を、ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ ＣＡＲコンストラクトを作製するためにそのパラトープを使用したＬＦＴＴ−１抗体、又はそのアイソタイプ対照抗体のいずれかと培養した。次いで、ＨＬＡ−Ｇ１ ＣＡＲエフェクター細胞をこれらの腫瘍細胞と１時間培養し、膜獲得をフローサイトメトリーで調べた（図６Ａ）。アイソタイプ対照抗体との前培養は、ＨＬＡ−Ｇ１ ＣＡＲエフェクター細胞がトロゴサイトーシスを行うのを阻害しなかった（図６Ｂ）。それでも、ＬＦＴＴ−１の前培養は、トロゴサイトーシスプロセスをほぼ完全に無効にした。
Membrane acquisition depends on CAR specificity The relationship between trogocytosis and CAR specificity was then evaluated. To evaluate, HLA-G1 transduced tumor cells are paratoped to generate the HLA-G-LFTT-1 CAR construct prior to the trologcytosis experiment, as schematized in FIG. Was cultured with either the LFTT-1 antibody used or an isotype control antibody thereof. HLA-G1 CAR effector cells were then cultured with these tumor cells for 1 hour and membrane acquisition was examined by flow cytometry (FIG. 6A). Preculture with an isotype control antibody did not inhibit HLA-G1 CAR effector cells from performing trogocytosis (FIG. 6B). Nevertheless, preculture of LFTT-1 almost completely abolished the trogocytosis process.
トロゴサイトーシスは、抗原とＣＡＲの相互作用によって媒介される標的細胞とエフェクター細胞との間の細胞間接触に依存している。この目的のために、ＬＦＴＴ−１抗体との前培養が、ＨＬＡ−Ｇ１腫瘍細胞とＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ ＣＡＲ細胞との間での複合体形成を阻害できるかどうかを調べた（図７Ａ）。ＬＦＴＴ−１抗体との前培養が標的細胞とＣＡＲエフェクター細胞との間の相互作用をブロックしたため、トロゴサイトーシスが阻害されたと判断した。実際、ＨＬＡ−Ｇ１ ＣＡＲエフェクター細胞は、ＨＬＡ−Ｇ１腫瘍細胞との細胞間接触を確立することができなくなり、膜を獲得することができなくなった（図７Ｂ）。 Trogocytosis relies on cell-cell contact between target and effector cells mediated by antigen-CAR interactions. To this end, it was investigated whether preculture with LFTT-1 antibody could inhibit complex formation between HLA-G1 tumor cells and HLA-G-LFTT-1 CAR cells (FIG. 7A). ). It was determined that trogocytosis was inhibited because preculture with LFTT-1 antibody blocked the interaction between target cells and CAR effector cells. In fact, HLA-G1 CAR effector cells were unable to establish cell-cell contact with HLA-G1 tumor cells and were unable to acquire membranes (FIG. 7B).
要するに、トロゴサイトーシスは、膜転移が、（ｉ）特異的であり、（ｉｉ）ＣＡＲ／抗原相互作用によって媒介され、細胞間接触に依存し、且つ（ｉｖ）迅速であるため、ＣＡＲ特性を決定するための強力な方法である。ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ ＣＡＲエフェクター細胞ではなく、ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１のみによるＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ発現標的細胞からのトロゴサイトーシスは、トロゴサイトーシスがＣＡＲ特異性の決定に特に関連することを実証した。 In short, trogocytosis is a CAR property because membrane metastases are (i) specific, (ii) mediated by CAR / antigen interactions, dependent on cell-cell contact, and (iv) rapid. It is a powerful way to determine. Trogocytosis from HLA-G1 / β2M expression target cells solely by HLA-G-LFTT-1, not HLA-G-15E7 CAR effector cells, is particularly associated with trogocytosis in determining CAR specificity. Demonstrated that.
膜転移はＣＡＲ相互作用細胞に特異的である
ＣＡＲ刺激に続いて、ＣＡＲ活性化エフェクター細胞が抗原特異的発現腫瘍細胞とのみ相互作用するかどうか、又はそれらがバイスタンダー効果を有し得るかどうかをさらに調べた。そのために、赤色で標識されたＨＬＡ−Ｇ１陰性腫瘍細胞と緑色で標識されたＨＬＡ−Ｇ１陽性腫瘍細胞及び青色で標識されたＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ ＣＡＲエフェクター細胞（図８）を１時間共培養した。次いで、ＣＡＲエフェクター細胞による膜獲得をフローサイトメトリーによって分析した。図９に示されているように、共培養後、ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ ＣＡＲエフェクター細胞は緑色の膜パッチのみを獲得し、活性化されたＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ ＣＡＲエフェクター細胞はＨＬＡ−Ｇ１発現腫瘍細胞とのみ相互作用し、バイスタンダー細胞とは相互作用しないことを実証している。
Membrane metastases are CAR-interacting cell-specific Following CAR stimulation, whether CAR-activated effector cells interact only with antigen-specific expressing tumor cells, or whether they can have a bystander effect. Was further investigated. To that end, red-labeled HLA-G1-negative tumor cells, green-labeled HLA-G1-positive tumor cells, and blue-labeled HLA-G-LFTT-1 CAR effector cells (FIG. 8) were co-cultured for 1 hour. It was cultured. Membrane acquisition by CAR effector cells was then analyzed by flow cytometry. As shown in FIG. 9, after co-culture, the HLA-G-LFTT-1 CAR effector cells acquired only the green membrane patch and the activated HLA-G-LFTT-1 CAR effector cells were HLA. It has been demonstrated that it interacts only with -G1-expressing tumor cells and not with bystander cells.
観察された膜転移は、標的細胞を同定するために使用された色素による影響を受けなかった。図１０、図１１Ａ、及び図１１Ｂに示されているように、ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ ＣＡＲエフェクター細胞は、ＨＬＡ−Ｇ１発現腫瘍細胞から同程度に赤色又は緑色の膜色素を獲得し、トロゴサイトーシスが使用した膜色素に依存しなかったことを示している。 The observed membrane metastases were unaffected by the dye used to identify the target cells. As shown in FIGS. 10, 11A, and 11B, HLA-G-LFTT-1 CAR effector cells acquire comparable red or green membrane pigment from HLA-G1-expressing tumor cells. It shows that the logocytosis did not depend on the membrane dye used.
材料及び方法
細胞株
Ｊｕｒｋａｔ細胞株は、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションＴＩＢ−１５２）から購入したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞である。Ｊｕｒｋａｔ細胞株に、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１、又はＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ ＣＡＲレンチウイルスそれぞれを形質導入した。Ｊｕｒｋａｔ ｗｔ及びＪｕｒｋａｔ形質導入細胞株を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍｇ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン（Ｘ）、並びに１０％熱不活化ＦＣＳ（Invitrogen）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Invitrogen）で培養した。
Materials and Methods Cell Lines Jurkat cell lines are human CD4 + T cells purchased from ATCC (American Type Culture Collection TIB-152). HLA-G1, HLA-G-LFTT-1, or HLA-G-15E7 CAR lentivirus was transduced into the Jurkat cell line, respectively. Jurkat wt and Jurkat transduced cell lines were cultured in RPMI1640 (Invitrogen) supplemented with 2 mM L-glutamine, 1 mg / ml penicillin and streptomycin (X), and 10% heat-inactivated FCS (Invitrogen).
Ｊｅｇ−３細胞株は、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションＨＴＢ−３６）から購入したヒト絨毛癌細胞である。これらを、１ｍｇ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン（Ｘ）、並びに１０％熱不活化ＦＣＳ（Invitrogen）を添加したＭＥＭ（Ｘ）で培養した。 The Jeg-3 cell line is a human choriocarcinoma cell purchased from ATCC (American Type Culture Collection HTB-36). These were cultured in MEM (X) supplemented with 1 mg / ml penicillin and streptomycin (X), and 10% heat-inactivated FCS (Invitrogen).
ＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ Ｊｕｒｋａｔ細胞
ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１及びＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ ＣＡＲコンストラクトを、既に説明したように作製した［７］。簡単に説明すると、抗ＨＬＡ−Ｇ認識ドメインは、ＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ会合特異的抗体ＬＦＴＴ１（引用特許ＣＡＲ ＨＬＡ−Ｇ）又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍを含まない特異的抗体１５Ｅ７（引用特許）に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ＩｇＧ１ヒンジ領域に由来する短いスペーサーを使用して、このｓｃＦｖを膜貫通ドメインに連結させた。ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ内部ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、及びＣＤ３ｚ活性化分子の融合によって構成されていた。ＣＡＲコンストラクトを、ＣＭＶ前初期プロモーター下で、特定のプライマーを用いたＰＣＲによる抽出後、消化／ライゲーションによってｐＴｒｉｐプラスミドベクターにクローン化した。
CAR-HLA-G Jurkat cells HLA-G-LFTT-1 and HLA-G-15E7 CAR constructs were made as previously described [7]. Briefly, the anti-HLA-G recognition domain is derived from the HLA-G1 / β2M association-specific antibody LFTT1 (cited patent CAR HLA-G) or the HLA-G1 / β2M-free specific antibody 15E7 (cited patent). It is a single chain variable fragment (scFv). A short spacer from the IgG1 hinge region was used to link this scFv to the transmembrane domain. The HLA-G CAR internal domain was composed of fusions of CD28, OX40, and CD3z activating molecules. The CAR construct was cloned into a pTrip plasmid vector by digestion / ligation after extraction by PCR with specific primers under the pre-CMV early promoter.
ＨＬＡ−Ｇ Ｊｕｒｋａｔ細胞
ＨＬＡ−Ｇを発現する安定したＪｕｒｋａｔ細胞株を、形質導入によって作製し、レンチウイルス粒子を次のように作製した：Longmei Zhao et al.［３８］に従ってネイティブＨＬＡ−Ｇ１ ｃＤＮＡ（ＮＭ＿００２１２７．５）修飾Ｋ３３４Ａ及びＫ３３５Ａに対応する特定の配列を、ＣＭＶ前初期プロモーター下で、特定のプライマーを用いたＰＣＲによる抽出後、消化／ライゲーションによってｐＴｒｉｐプラスミドベクターに個別にクローン化した。
HLA-G Jurkat Cell A stable Jurkat cell line expressing HLA-G was generated by transduction and lentiviral particles were prepared as follows: Native HLA-G1 cDNA according to Longmei Zhao et al. [38] ( NM_002127.5) Specific sequences corresponding to modified K334A and K335A were individually cloned into pTrip plasmid vectors by digestion / ligation after extraction by PCR with specific primers under the pre-CMV initial promoter.
レンチウイルスベクター
ＨＩＶ−１由来のベクター粒子を、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）と組換えプラスミドｐＴＲＩＰ、ＶＳＶ由来の糖タンパク質をコードするエンベロープ発現プラスミド、Indiana血清型糖タンパク質、及びｐ８．７４キャプシド形成プラスミドのリン酸カルシウム共トランスフェクションによって作製した。ウイルスストックを、形質導入ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物のリアルタイムＰＣＲによって漸増し、１ｍｌ当たりの形質導入単位（ＴＵ）として表した。
Lentiviral vector HIV-1 -derived vector particles were used with HEK-293T cells (ATCC) and recombinant plasmid pTRIP, an envelope expression plasmid encoding a VSV-derived glycoprotein, an Indiana serum-type glycoprotein, and a p8.74 capsid-forming plasmid. It was prepared by co-transfection with calcium phosphate. Virus stock was incrementally increased by real-time PCR of cell lysates from transduced HEK-293T cells and expressed as transduction units (TU) per ml.
Ｊｕｒｋａｔ ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１、ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ ＣＡＲ細胞、及びＪｕｒｋａｔ ＨＬＡ−Ｇを作製するために、１×１０５のＪｕｒｋａｔ細胞を、５００μｌのｃＲＰＭＩ培地及び１０６ＴＵ（２９３Ｔ）のＴｒｉｐ ＣＭＶ−ＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１、Ｔｒｉｐ ＣＭＶ−ＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７、又はＴｒｉｐ ＣＭＶ−ＨＬＡ−Ｇベクターそれぞれを含む１２ウェルプレートに播種した。細胞を３７℃で１時間培養し、次いで、３７℃、１２００ｇで１時間遠心分離した。その後、１ｍｌのｃＲＰＭＩ培地を添加し、３７℃で培養した。２週間後、陽性細胞を抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を使用したフローサイトメトリーで選別した。ＨＬＡ−Ｇの発現を、Ｊｕｒｋａｔ ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲ活性化アッセイの前にフローサイトメトリーによって評価した。 To make Jurkat HLA-G-LFTT-1, HLA-G-15E7 CAR cells, and Jurkat HLA-G, 1 × 10 5 Jurkat cells, 500 μl cRPMI medium and 10 6 TU (293T) trips. Seeded in 12-well plates containing CMV-CAR-HLA-G-LFTT-1, Trip CMV-CAR-HLA-G-15E7, or Trip CMV-HLA-G vector, respectively. The cells were cultured at 37 ° C. for 1 hour and then centrifuged at 37 ° C. and 1200 g for 1 hour. Then, 1 ml of cRPMI medium was added and cultured at 37 ° C. After 2 weeks, positive cells were sorted by flow cytometry using anti-HLA-G antibody. Expression of HLA-G was evaluated by flow cytometry prior to the Jurkat HLA-G CAR activation assay.
トロゴサイトーシス実験
Ｊｕｒｋａｔ ＨＬＡ−Ｇ ＣＡＲエフェクター細胞及びＪｕｒｋａｔ又はＪｕｒｋａｔ ＨＬＡ−Ｇ１腫瘍細胞のいずれかをそれぞれ、製造元の仕様書に従って、ＰＫＨ２６及びＰＫＨ６７蛍光色素（Sigma）で標識した。
Trogocytosis Experiments Jurkat HLA-G CAR effector cells and either Jurkat or Jurkat HLA-G1 tumor cells were labeled with PKH26 and PKH67 fluorescent dyes (Sigma), respectively, according to the manufacturer's specifications.
トロゴサイトーシスアッセイでは、Ｊｕｒｋａｔ ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１又はＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ ＣＡＲ（「獲得側」細胞）をＪｕｒｋａｔ又はＪｕｒｋａｔ ＨＬＡ−Ｇ１細胞（「ドナー」細胞）のいずれかと、１時間、１：１のエフェクター−腫瘍比、総濃度２×１０６細胞／ｍＬ、３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター（Lemaoult et al. 2007 Blood J; Caumartin et al. 2007 EMBO J）で共培養した。共培養の最後に、細胞を氷上に置き、すべてのさらなる工程を４℃未満で行った。ＣＡＲエフェクター細胞による腫瘍細胞膜の獲得をフローサイトメトリーによって調べた。言及されている場合、結合細胞は、ＦＡＣＳ獲得の前にボルテックスによって解離された。
In the trologcytosis assay, Jurkat HLA-G-LFTT-1 or HLA-G-15E7 CAR (“acquiring” cells) with either Jurkat or Jurkat HLA-G1 cells (“donor” cells) for 1 hour, They were co-cultured in a 1: 1 effector-tumor ratio,
フローサイトメトリー分析
Divaソフトウェア（BD Bioscience）を搭載したBD LSR FORTESSAを使用して、次の実験条件で分析を行った：ｐＨ７．４のＰＢＳ等張緩衝液に懸濁した細胞、３２０〜３３０ ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧、分析した細胞数は１０，０００。
Flow cytometry analysis
Analysis was performed using BD LSR FORTESSA with Diva software (BD Bioscience) under the following experimental conditions: cells suspended in PBS isotonic buffer at pH 7.4, permeation of 320-330 mOsmol / kg. The pressure and the number of cells analyzed were 10,000.
ＣＡＲブロッキング手順
ＨＬＡ−Ｇ／ＣＡＲ相互作用をブロックするために、Ｊｕｒｋａｔ ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ ＣＡＲエフェクター細胞との共培養実験の前に、Ｊｕｒｋａｔ ＨＬＡ−Ｇ腫瘍細胞を５μｇ／ｍｌのブロッキングＬＦＴＴ−１抗体又はそのＩｇＧ１アイソタイプ対照と前培養した。
CAR blocking procedure To block HLA-G / CAR interactions, 5 μg / ml blocking LFTT-Jurkat HLA-G tumor cells prior to co-culture experiments with Jurkat HLA-G-LFTT-1 CAR effector cells. Precultured with 1 antibody or its IgG1 isotype control.
統計分析
データは平均値＋／−標準偏差（ＳＤ）として表す。スチューデントのｔ検定を使用して、０．０５未満のＰ値が有意であると見なした。代表的な実験を示す図では、エラーバーは３連のＳＤを表す。
Statistical analysis data is expressed as mean +/- standard deviation (SD). Using Student's t-test, P-values less than 0.05 were considered significant. In the figure showing a typical experiment, error bars represent triple SD.
結論
本明細書では、ＣＡＲ機能を決定するための標的細胞と活性化エフェクター細胞との間の膜転移に基づく新しい方法を報告している。さらに、膜獲得の程度は、エフェクター細胞の活性化状態と直接相関している。
CONCLUSIONS Here we report a new method based on membrane transfer between target cells and activated effector cells to determine CAR function. Furthermore, the degree of membrane acquisition is directly correlated with the activation state of effector cells.
この方法は、トロゴサイトーシスパラメーターに基づいて、ＣＡＲの特異性、機能、及び感度を迅速に決定及び評価するための独自のアッセイである。 This method is a unique assay for rapidly determining and assessing the specificity, function, and sensitivity of CAR based on trogocytosis parameters.
Claims (13)
−同じ細胞株から調製された標的抗原発現細胞及びＣＡＲ発現細胞を異なる標識で標識すること；
−標識された標的細胞と標識されたＣＡＲ発現細胞を共培養すること、
−前記標的抗原発現細胞からの前記ＣＡＲ発現細胞による膜獲得を評価するために細胞を分析することであって、前記膜獲得が、標的抗原への前記ＣＡＲ発現細胞の結合及び／又は活性化能力の指標であり、それにより前記ＣＡＲ発現細胞の機能を評価することを含み；且つ
前記細胞が免疫細胞である、方法。 An in vitro method for assessing the function of chimeric antigen receptor (CAR) -expressing cells:
-Label target antigen-expressing cells and CAR-expressing cells prepared from the same cell line with different labels;
-Co-culturing labeled target cells with labeled CAR-expressing cells,
-Analysis of cells to assess membrane acquisition by said CAR-expressing cells from said target antigen-expressing cells, wherein the membrane acquisition is capable of binding and / or activating the CAR-expressing cells to the target antigen. The method comprising assessing the function of the CAR-expressing cell by the index of the cell; and the cell being an immune cell.
（ｉ）免疫細胞の集団、好ましくは処置される対象からの生物学的サンプルから単離された免疫細胞の集団にＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入すること、
（ｉｉ）ＣＡＲを発現する前記単離された細胞の亜集団を選択すること、及び、
（ｉｉｉ）好ましくは、ＣＡＲが作製された抗原を発現する標的抗原発現細胞について、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によってそれらの機能を評価すること、
（ｉｖ）任意選択により、前記抗原発現細胞からの膜獲得を経験したＣＡＲ発現細胞から機能的ＣＡＲ発現細胞及び／又はＣＡＲ核酸コンストラクトを選択することを含む、方法。 An in vitro method for selecting functional CAR-expressing cells for adoptive cell therapy:
(I) Transducing a nucleic acid sequence encoding CAR into a population of immune cells, preferably a population of immune cells isolated from a biological sample from a subject to be treated.
(Ii) Selecting a subpopulation of the isolated cells expressing CAR, and
(Iii) Preferably, for the target antigen-expressing cells expressing the antigen for which CAR has been produced, the function thereof is evaluated by the method according to any one of claims 1 to 11.
(Iv) A method comprising, optionally, selecting functional CAR-expressing cells and / or CAR nucleic acid constructs from CAR-expressing cells that have experienced membrane acquisition from said antigen-expressing cells.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP18306152 | 2018-08-31 | ||
| EP18306152.2 | 2018-08-31 | ||
| PCT/EP2019/073262 WO2020043903A1 (en) | 2018-08-31 | 2019-08-30 | Method to assess car functionality |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021536246A true JP2021536246A (en) | 2021-12-27 |
| JPWO2020043903A5 JPWO2020043903A5 (en) | 2022-09-07 |
| JP7429222B2 JP7429222B2 (en) | 2024-02-07 |
Family
ID=63637823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021512207A Active JP7429222B2 (en) | 2018-08-31 | 2019-08-30 | How to evaluate the functionality of CAR |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210325372A1 (en) |
| EP (1) | EP3844499A1 (en) |
| JP (1) | JP7429222B2 (en) |
| KR (1) | KR20210111745A (en) |
| CN (1) | CN112912727A (en) |
| AU (1) | AU2019331670A1 (en) |
| BR (1) | BR112021003799A2 (en) |
| CA (1) | CA3110946A1 (en) |
| EA (1) | EA202190424A1 (en) |
| IL (1) | IL281130A (en) |
| MX (1) | MX2021002317A (en) |
| SG (1) | SG11202101851WA (en) |
| WO (1) | WO2020043903A1 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113252894B (en) * | 2021-07-07 | 2021-11-09 | 北京艺妙神州医药科技有限公司 | Method for detecting scFv affinity of CAR-T cell |
| CN113789349A (en) * | 2021-09-30 | 2021-12-14 | 深圳市北科生物科技有限公司 | Method for rapidly screening chimeric antigen receptor by using alpaca phage natural library and human T cell strain |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018511319A (en) * | 2015-03-27 | 2018-04-26 | ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア | HLA-G as a novel target for CAR T cell immunotherapy |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4284412A (en) | 1979-07-13 | 1981-08-18 | Ortho Diagnostics, Inc. | Method and apparatus for automated identification and enumeration of specified blood cell subclasses |
| US4727020A (en) | 1985-02-25 | 1988-02-23 | Becton, Dickinson And Company | Method for analysis of subpopulations of blood cells |
| EP1640717A1 (en) * | 2004-09-28 | 2006-03-29 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Method and kits for in vitro identification of cells, particularly lymphoid cells, capable of establishing interactions with target cells and biological applications thereof |
| EP2706357A1 (en) * | 2012-09-07 | 2014-03-12 | Andreas-Claudius Hoffmann | Method for identifying subgroups of circulating tumor cells (CTCs) in a CTC population or a sample |
| WO2014153114A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Compositions and methods to modify cells for therapeutic objectives |
| US10239948B2 (en) * | 2013-12-20 | 2019-03-26 | Cellectis | Method of engineering multi-input signal sensitive T cell for immunotherapy |
| GB201501175D0 (en) * | 2015-01-23 | 2015-03-11 | Univ Oslo Hf | A universal T-cell for personalised medicine |
| WO2016180468A1 (en) * | 2015-05-11 | 2016-11-17 | Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh | Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes |
| WO2016180467A1 (en) * | 2015-05-11 | 2016-11-17 | Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh | Enhancing the effect of car-engineered t cells by means of nucleic acid vaccination |
| KR20180133442A (en) * | 2016-04-13 | 2018-12-14 | 비비아 바이오테크 에스.엘. | In vitro BITE activated T cells |
| WO2017191504A1 (en) * | 2016-05-03 | 2017-11-09 | Oslo University Hospital Hf | Validation of therapeutic t-cells |
| US20190262399A1 (en) * | 2016-09-07 | 2019-08-29 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses |
| GB201700553D0 (en) * | 2017-01-12 | 2017-03-01 | Genagon Therapeutics Ab | Therapeutic agents |
| CN108373504B (en) * | 2017-01-30 | 2022-06-28 | 亘喜生物科技（上海）有限公司 | CD 24-specific antibodies and anti-CD 24-CAR-T cells |
-
2019
- 2019-08-30 KR KR1020217009087A patent/KR20210111745A/en active Search and Examination
- 2019-08-30 EP EP19759007.8A patent/EP3844499A1/en active Pending
- 2019-08-30 JP JP2021512207A patent/JP7429222B2/en active Active
- 2019-08-30 CN CN201980066209.9A patent/CN112912727A/en active Pending
- 2019-08-30 WO PCT/EP2019/073262 patent/WO2020043903A1/en active Application Filing
- 2019-08-30 AU AU2019331670A patent/AU2019331670A1/en active Pending
- 2019-08-30 EA EA202190424A patent/EA202190424A1/en unknown
- 2019-08-30 CA CA3110946A patent/CA3110946A1/en active Pending
- 2019-08-30 SG SG11202101851WA patent/SG11202101851WA/en unknown
- 2019-08-30 US US17/271,767 patent/US20210325372A1/en active Pending
- 2019-08-30 BR BR112021003799-3A patent/BR112021003799A2/en unknown
- 2019-08-30 MX MX2021002317A patent/MX2021002317A/en unknown
-
2021
- 2021-02-25 IL IL281130A patent/IL281130A/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018511319A (en) * | 2015-03-27 | 2018-04-26 | ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア | HLA-G as a novel target for CAR T cell immunotherapy |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ONCOSCIENCE, vol. 2, no. 5, JPN6023030295, 2015, pages 476 - 482, ISSN: 0005111783 * |
| THE EMBO JOURNAL, vol. 26, no. 5, JPN6023030297, 2007, pages 1423 - 1433, ISSN: 0005111785 * |
| THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 174, no. 3, JPN6023030296, 2005, pages 1717 - 1722, ISSN: 0005111784 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20210325372A1 (en) | 2021-10-21 |
| EA202190424A1 (en) | 2021-07-08 |
| MX2021002317A (en) | 2021-07-15 |
| SG11202101851WA (en) | 2021-03-30 |
| IL281130A (en) | 2021-04-29 |
| AU2019331670A1 (en) | 2021-04-01 |
| CN112912727A (en) | 2021-06-04 |
| KR20210111745A (en) | 2021-09-13 |
| WO2020043903A1 (en) | 2020-03-05 |
| CA3110946A1 (en) | 2020-03-05 |
| EP3844499A1 (en) | 2021-07-07 |
| JP7429222B2 (en) | 2024-02-07 |
| BR112021003799A2 (en) | 2021-05-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7047172B2 (en) | Compositions and Methods for Reprogramming TCRs Using Fusion Proteins | |
| Li et al. | KIR-based inhibitory CARs overcome CAR-NK cell trogocytosis-mediated fratricide and tumor escape | |
| CN109715668A (en) | For using fusion protein to carry out the composition and method of TCR reprogramming | |
| CN109328074A (en) | Chimeric antigen and T cell receptor and the method used | |
| CN110177803A (en) | For using fusion protein to carry out the composition and method that TCR is reprogramed | |
| CN109689686A (en) | The composition and method of T cell receptor reprogramming are carried out using fusion protein | |
| CN110225756A (en) | Composition relevant to the cell system for penetrating solid tumor and method | |
| KR20200015713A (en) | Anti-TRBC1 antigen binding domain | |
| US20230190796A1 (en) | Engineered cells expressing prostate-specific membrane antigen (psma) or a modified form thereof and related methods | |
| CN110234343A (en) | Engineered T cell for treating cancer | |
| CN110062768A (en) | Express the immunocyte of antigen-binding receptors and chimeric costimulation receptor | |
| CN107106670A (en) | Method and composition for the T cell of modification | |
| KR20160101947A (en) | Tagged chimeric effector molecules and receptors thereof | |
| JP2021512635A (en) | Chimeric antigen receptor targeting the tumor microenvironment | |
| CN115052902A (en) | Lymphocyte-antigen presenting cell co-stimulating factor and application thereof | |
| KR20190130024A (en) | Treatment with chimeric receptor T cells containing optimized multifunctional T cells | |
| CN107847585A (en) | For obtaining internal stand-up and the NKT cell subsets of therapeutic activity and its breeding | |
| US20210023138A1 (en) | Methods of treating egfrviii expressing glioblastomas | |
| JP7429222B2 (en) | How to evaluate the functionality of CAR | |
| CN111826398A (en) | Engineering plasmid system for displaying and detecting interaction of membrane protein between living cells | |
| US20220378832A1 (en) | Use of mog for priming a treatment for glioblastoma | |
| CN111954527A (en) | Methods and materials for treating graft versus host disease | |
| US20230407252A1 (en) | Methods for donor cell analysis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220830 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220830 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230724 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20230728 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231019 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240105 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240126 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7429222 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |