JPWO2019098361A1 - 多能性幹細胞を用いた自殺遺伝子脳腫瘍治療薬 - Google Patents

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Abstract

新たな脳腫瘍の治療手段の確立を目的として、シトシンデアミナーゼによって5-フルオロウラシルに変換されるプロドラッグとともに使用される脳腫瘍治療用細胞製剤であって、シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する多能性幹細胞由来の神経幹細胞を含むことを特徴とする脳腫瘍治療用細胞製剤を提供する。

Description

本発明は、脳腫瘍治療用細胞製剤、及びその細胞製剤に用いる神経幹細胞の作製方法に関する。
悪性神経膠腫は、脳実質に広く浸潤する脳腫瘍幹細胞(brain tumor stem cell, BTSC)による治療抵抗性のため、現在の治療法では極めて治療困難である。ウイルスベクターを用いた自殺遺伝子療法は、バイスタンダー効果を発揮することから有効性が期待されたが、浸潤した腫瘍細胞への拡散が不十分であったため、臨床試験の結果は限定的であった。最近、神経幹細胞（neural stem cell, NSC）が脳腫瘍幹細胞に遊走・集積する性質を有することが明らかとなり、神経幹細胞を細胞vehicle として自殺遺伝子治療へ応用する試みが注目されている。また、神経幹細胞に似た性質を有する間葉系幹細胞を利用した自殺遺伝子治療に関する技術も開発されている（特許文献１）。
特開2006-345726号公報
上記のように、神経幹細胞や間葉系幹細胞を利用した自殺遺伝子治療には大きな期待が寄せられているが、臨床でヒト投与可能かつ充分量の神経幹細胞を入手することは、倫理的な問題を含め困難である。間葉系幹細胞についても、神経幹細胞よりは入手が容易であるが、生体から採取する以上、その採取量には限度がある。
また、自殺遺伝子としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（HSVtk）が一般的に用いられているが（例えば、特許文献１の実施例では、この遺伝子が使用されている。）、これ以外にも、シトシンデアミナーゼ（CD）遺伝子やウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（UPRT）遺伝子が知られている。CD遺伝子とUPRT遺伝子は、それぞれ単独でも抗腫瘍効果を有するが、両者を組み合わせること（以下、この二つの遺伝子を組み合わせた遺伝子を「CD-UPRT遺伝子」という場合がある。）により、抗腫瘍効果が相乗的に向上することが知られている。
本発明は、以上のような背景の下、神経幹細胞や間葉系幹細胞における入手困難性の問題を解決し、高い抗腫瘍効果を有するCD-UPRT遺伝子を用いた新たな脳腫瘍の治療手段を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、iPS細胞から神経幹細胞を分化誘導することにより、自殺遺伝子治療法に用いるための充分量の神経幹細胞を得られることを見出した。また、ゲノム編集により、CD-UPRT遺伝子をiPS細胞のハウスキーピング遺伝子の領域に挿入することにより、安全性、品質管理、安定供給性の面で優れたCD-UPRT遺伝子発現神経幹細胞を得られることを見出した。更に、このCD-UPRT遺伝子発現神経幹細胞は、脳腫瘍細胞だけでなく、脳腫瘍幹細胞に対しても抗腫瘍効果を示すことを見出した。
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１７〕を提供するものである。
〔１〕シトシンデアミナーゼによって5-フルオロウラシルに変換されるプロドラッグとともに使用される脳腫瘍治療用細胞製剤であって、シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する多能性幹細胞由来の神経幹細胞を含むことを特徴とする脳腫瘍治療用細胞製剤。
〔２〕シトシンデアミナーゼによって5-フルオロウラシルに変換されるプロドラッグが、5-フルオロシトシンであることを特徴とする〔１〕に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
〔３〕多能性幹細胞由来の神経幹細胞が、以下の工程（１）を行い、次に工程（２）を行うことにより得られる神経幹細胞であることを特徴とする〔１〕又は〔２〕に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤、
（１）多能性幹細胞にシトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を導入する工程、
（２）多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる工程。
〔４〕シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が、ゲノム編集によって、多能性幹細胞のゲノムに挿入されていることを特徴とする〔３〕に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
〔５〕シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が、多能性幹細胞のハウスキーピング遺伝子の領域又はAAVS1領域に挿入されていることを特徴とする〔４〕に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
〔６〕ハウスキーピング遺伝子が、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であることを特徴とする〔５〕に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
〔７〕シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を、発現を人為的に調節できる遺伝子構造物とすることを特徴とする〔３〕に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
〔８〕遺伝子構造物が、ドキシサイクリンの添加によって発現する遺伝子構造物であることを特徴とする〔７〕に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
〔９〕多能性幹細胞由来の神経幹細胞が、以下の工程（１）を行い、次に工程（２）を行うことにより得られる神経幹細胞であることを特徴とする〔１〕又は〔２〕に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤、
（１）多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる工程、
（２）神経幹細胞にシトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を導入する工程。
〔１０〕多能性幹細胞が、iPS細胞であることを特徴とする〔１〕乃至〔９〕のいずれかに記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
〔１１〕以下の工程（Ａ１）を行い次に工程（Ａ２）を行う方法、又は工程（Ｂ１）を行い次に工程（Ｂ２）を行う方法であることを特徴とするシトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する神経幹細胞の作製方法、
（Ａ１）多能性幹細胞にシトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を導入する工程、
（Ａ２）多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる工程、
（Ｂ１）多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる工程、
（Ｂ２）神経幹細胞にシトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を導入する工程。
〔１２〕工程（Ａ１）において、シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を、ゲノム編集によって、多能性幹細胞のゲノムに挿入することを特徴とする〔１１〕に記載の神経幹細胞の作製方法。
〔１３〕工程（Ａ１）において、シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を、多能性幹細胞のハウスキーピング遺伝子の領域又はAAVS1領域に挿入することを特徴とする〔１２〕に記載の神経幹細胞の作製方法。
〔１４〕ハウスキーピング遺伝子が、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であることを特徴とする〔１３〕に記載の神経幹細胞の作製方法。
〔１５〕工程（Ａ１）において、シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を、発現を人為的に調節できる遺伝子構造物とすることを特徴とする〔１１〕に記載の神経幹細胞の作製方法。
〔１６〕遺伝子構造物が、ドキシサイクリンの添加によって発現する遺伝子構造物であることを特徴とする〔１５〕に記載の神経幹細胞の作製方法。
〔１７〕多能性幹細胞が、iPS細胞であることを特徴とする〔１１〕乃至〔１６〕のいずれかに記載の神経幹細胞の作製方法。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2017‐223202の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本発明は、iPS細胞やES細胞などの多能性幹細胞由来の神経幹細胞を用いた新たな脳腫瘍の治療手段を提供する。
yCD-UPRT発現・治療幹細胞(TSC)を用いた悪性脳腫瘍に対する自殺遺伝子細胞療法（混合移植モデル）の概要を示す図。 腫瘍の発光イメージング解析（IVIS）の結果を示す図。 発光イメージングのROI値の計測結果を示す図。 マウスから摘出した脳の写真（左）、マウス脳切片のHE染色画像（中央）、及びマウス脳切片のVenus蛍光画像（右）。 腫瘍体積の解析の結果を示す図。 移植TSCの生存解析の結果を示す図。上段及び中断が治療群、下段がコントロール群を示す。画像は、左からVenus染色（U87腫瘍細胞を染色）、KO染色（TSCを染色）、DAPI染色（核を染色）、merge（Venus、KO、DAPIの融合画像）である。 脳腫瘍モデルの生存解析の結果を示す図。 yCD-UPRT発現・治療幹細胞(TSC)を用いた悪性脳腫瘍に対する自殺遺伝子細胞療法（腫瘍形成後移植モデル）の概要を示す図。 腫瘍の発光イメージング解析（IVIS）の結果を示す図。 発光イメージングのROI値の計測結果を示す図。 マウスから摘出した脳の写真（左）、マウス脳切片のHE染色画像（中央）、及びマウス脳切片のVenus蛍光画像（右）。 腫瘍体積の解析の結果を示す図。 移植TSCの生存解析の結果を示す図。上段が治療群、下段がコントロール群を示す。画像は、左からVenus染色（U87腫瘍細胞を染色）、KO染色（TSCを染色）、DAPI染色（核を染色）、merge（Venus、KO、DAPIの融合画像）である。 脳腫瘍モデルの生存解析の結果を示す図。 yCD-UPRT発現TSCのタイムラプスイメージングの結果を示す図。上段が治療群、中段がコントロール群１、下段がコントロール群2を示す。 yCD-UPRT発現TSCのKO染色画像。上段が治療群、下段がコントロール群１を示す。 yCD-UPRT発現TSCのHE染色画像。上段が治療群、下段がコントロール群１を示す。 CRISPR/Cas9によるyCD-UPRT発現・治療幹細胞(TSC)を用いた悪性脳腫瘍に対する自殺遺伝子細胞療法（腫瘍形成後移植モデル）の概要を示す図。 腫瘍の発光イメージング解析（IVIS）の結果を示す図。 発光イメージングのROI値の計測結果を示す図。 マウスから摘出した脳の写真（左）、マウス脳切片のHE染色画像（中央）、及びマウス脳切片のVenus蛍光画像（右）。 腫瘍体積の解析の結果を示す図。 脳腫瘍モデルの生存解析の結果を示す図。 Tet誘導yCD-UPRT発現治療用幹細胞TSCを用いた悪性脳腫瘍に対する自殺遺伝子細胞療法（混合移植モデル）の概要を示す図。 腫瘍の発光イメージング解析（IVIS）の結果を示す図。 マウスから摘出した脳の写真（左）、マウス脳切片のHE染色画像（中央）、及びマウス脳切片のVenus蛍光画像（右）。 脳腫瘍モデルの生存解析の結果を示す図。 CRISPR/Cas9によるyCD-UPRT発現・治療幹細胞(TSC)を用いた悪性脳腫瘍幹細胞に対する自殺遺伝子細胞療法（腫瘍形成後移植モデル）の概要を示す図。 腫瘍の発光イメージング解析（IVIS）の結果を示す図。 発光イメージングのROI値の計測結果を示す図。 残存腫瘍解析の結果を示す図。 脳腫瘍モデルの生存解析の結果を示す図。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の脳腫瘍治療用細胞製剤は、シトシンデアミナーゼ（CD）によって5-フルオロウラシルに変換されるプロドラッグとともに使用される脳腫瘍治療用細胞製剤であって、シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（CD-UPRT遺伝子）を有する多能性幹細胞由来の神経幹細胞を含むことを特徴とするものである。
本発明における「多能性幹細胞」とは、当業者が通常用いる意味に解釈することができ、例えば、iPS細胞やES細胞が含まれる。
本発明における「脳腫瘍」とは、頭蓋内組織に発生する腫瘍を意味し、その具体例としては、グリオーマ（神経膠腫）、髄芽腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、下垂体腺腫、神経鞘腫、原発性中枢神経系リンパ腫、肉腫、脊髄腫瘍などを挙げることができる。本発明においては、これらのいずれの脳腫瘍も治療対象とすることができるが、グリオーマを治療対象とすることが好ましい。
本発明における「治療」とは、腫瘍細胞を死滅させることだけでなく、腫瘍細胞を減少させることや腫瘍細胞の増殖を阻害することをも含む意味である。
CD遺伝子及びUPRT遺伝子は、それぞれ5-フルオロシトシン（5-FC）及び5-フルオロウラシル（5-FU）をプロドラッグとする自殺遺伝子である。これらの自殺遺伝子を発現するベクターは市販されており、そのようなベクターを利用して、これらの自殺遺伝子を発現する多能性幹細胞や神経幹細胞を作製することができる。CD遺伝子及びUPRT遺伝子は、それぞれ単独でも抗腫瘍効果を有するが、これら二つの遺伝子を細胞に導入することにより、CD遺伝子を単独で導入した場合の約100倍の抗腫瘍効果が得られることが知られている。
本発明におけるプロドラッグは、CDによって5-FUに変換されるものであればどのようなものでもよい。このようなプロドラッグの具体例としては、5-FCを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。
本発明における「神経幹細胞」とは、ニューロン及びグリア細胞へ分化する細胞を供給する能力を持つ幹細胞をいう。本発明の細胞製剤は、この神経幹細胞を含むが、脳腫瘍の治療効果に大きな悪影響を及ぼさない限り、神経幹細胞以外の細胞を含んでいてもよい。後述するMol Brain 9:85, 2016記載の方法に従ってiPS細胞から神経幹細胞を作製すると、神経幹細胞だけでなく、神経前駆細胞も生じる。このため、本発明の細胞製剤は、神経幹細胞と神経前駆細胞の両方を含む場合がある。また、本発明において使用される神経幹細胞は、iPS細胞などの多能性幹細胞由来の神経幹細胞であり、脳などから採取された神経幹細胞がそのまま使用されることはない。
CD-UPRT遺伝子を有する多能性幹細胞由来の神経幹細胞は、以下に説明する工程（Ａ１）を行い次に工程（Ａ２）を行う方法、又は工程（Ｂ１）を行い次に工程（Ｂ２）を行う方法により作製することができる。
工程（Ａ１）では、多能性幹細胞にCD-UPRT遺伝子を導入する。
多能性幹細胞としては、ES細胞を使用することもできるが、iPS細胞を使用することが好ましい。使用するiPS細胞は、神経幹細胞へ分化させることのできるものであれば、その由来、導入する再プログラミング因子、再プログラミング因子の導入方法などは特に限定されないが、本発明の細胞製剤は主としてヒトの脳腫瘍の治療に用いられるので、このような場合にはヒト由来のiPS細胞を用いることが好ましい。この場合、iPS細胞は、細胞製剤を投与する患者由来のiPS細胞を用いてもよく、患者以外のヒト由来のiPS細胞を用いてもよい。また、上述のように、再プログラミング因子の導入方法も限定されないが、インテグレーションフリーなiPS細胞を用いることが好ましい。使用するiPS細胞は、公知の方法に従って作製してもよいが、京都大学iPS細胞研究所（CiRA）などの研究機関から入手することも可能である。
CD-UPRT遺伝子の多能性幹細胞への導入は、ウイルスベクターを使用して行ってもよいが、好ましくは、ゲノム編集を用いて行う。これは、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて自殺遺伝子を多能性幹細胞のゲノムに挿入した場合、自殺遺伝子は染色体にランダムに挿入されるため、挿入部位の遺伝子変異や周辺遺伝子の活性化、位置効果による自殺遺伝子の不活性化が懸念される。ウイルスベクターではなく、ゲノム編集を用いることにより、このような問題を回避できると考えられる。
ゲノム編集は、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9などを用いて行うことができ、これらの中では、CRISPR/Cas9を用いて行うことが好ましい。ゲノム編集により、CD-UPRT遺伝子を多能性幹細胞のハウスキーピング遺伝子の領域に挿入することが好ましい。ハウスキーピング遺伝子は、多くの細胞で一定量発現しているものであれば特に限定されない。その具体例としては、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子、シクロフィリン遺伝子、β-アクチン遺伝子、α-チューブリン遺伝子などを挙げることができ、これらの中では、GAPDH遺伝子が好ましい。また、CD-UPRT遺伝子を多能性幹細胞のAAVS1領域に挿入してもよい。アデノ随伴ウイルス(AAV) はヒトに対する病原性を有さず、AAVS1領域は外来遺伝子の挿入に対して安全性の高いゲノム領域と考えられている。
ウイルスベクターを用いて、CD-UPRT遺伝子を多能性幹細胞への導入する場合は、前述したように、染色体にランダムに挿入されることによる悪影響が考えられるので、CD-UPRT遺伝子を、発現を人為的に調節できる遺伝子構造物とすることが好ましい。このような遺伝子構造物は、公知の発現誘導システムであるテトラサイクリン誘導システム（PLoS One 8:e59890, 2013）を用いて作製することができる。このテトラサイクリン誘導システムは、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（rtTA）を発現する領域と、目的遺伝子とその上流に配置されるTREプロモーターを含む領域とからなる。rtTAはテトラサイクリンと結合することにより、TREプロモーターと結合し、下流にある目的遺伝子の発現を誘導する。このシステムを用いることにより、テトラサイクリンの添加によって、自殺遺伝子の発現を誘導することができる。なお、このシステムにおける発現の誘導は、上記のようにテトラサイクリンで行うこともできるが、通常、テトラサイクリンの誘導体であるドキシサイクリンによって行う。CD-UPRT遺伝子の発現を人為的に調節できる遺伝子構造物は、このテトラサイクリン誘導システム以外にも、薬剤誘導性プロモーターなどの各種誘導性プロモーターを用いて作製することも可能である。
ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなど挙げることができる。これらの中では、ゲノムに遺伝子を組み込むタイプのベクターが好ましく、レンチウイルスベクターが最も好ましい。ベクターには、CD-UPRT遺伝子以外にも、レポーター遺伝子やIRESなどの配列が含まれていてもよい。
工程（Ａ２）では、多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる。
多能性幹細胞から神経幹細胞への分化は、胚様体を介する方法、胚様体を介さない方法、公知のいずれの方法に従って行ってもよい。iPS細胞から分化させる場合は、例えば、Stem Cell Reports. 2017 Nov 14;9(5):1675-1691記載の方法に従って行うことができる。例えば、上記方法によれば、iPS細胞から胚様体の形成は、公知の胚様体形成培地を使って行うことができ、胚様体培地は、TGFβファミリー阻害剤（例えば、SB431542）及びBMP阻害剤（例えば、LDN-193189）を含むものである。
胚様体から神経幹細胞への分化は、公知のニューロスフェア培地を使って行うことができる。例えば、ニューロスフェア培地は、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子-2、白血病阻止因子、B-27 supplementなどを含むものである。胚様体をニューロスフェア培地で培養することにより、ニューロスフェアと呼ばれる神経幹細胞を含む細胞塊が形成される。形成されたニューロスフェアを回収し、単一細胞に分散し、ニューロスフェア培地で培養することにより、再びニューロスフェアが形成される。このような操作を何度か繰り返した後、ニューロスフェアを回収することにより、神経幹細胞を得ることができる。
工程（Ａ１）及び（Ａ２）を順次行うことによってCD-UPRT遺伝子を有する多能性幹細胞由来の神経幹細胞を作製した場合、多能性幹細胞を増殖させることにより安定的に治療用の神経幹細胞を提供できるという利点がある。
工程（Ｂ１）では、多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる。
工程（Ｂ１）における多能性幹細胞から神経幹細胞への分化は、工程（Ａ２）における分化と同様に行うことができる。
工程（Ｂ２）では、神経幹細胞にCD-UPRT遺伝子を導入する。
工程（Ｂ２）における神経幹細胞へのCD-UPRT遺伝子の導入は、工程（Ａ１）における導入と同様に行うことができる。但し、工程（Ａ１）においては、細胞毒性の問題が生じる可能性があることから、ゲノム編集を用いることやCD-UPRT遺伝子を、発現を人為的に調節できる遺伝子構造物とすることが好ましいが、工程（Ｂ２）においては細胞毒性の問題が生じる可能性は非常に低いので、これらのことを行う必要は通常ない。
なお、上述のように、本明細書においては、「神経幹細胞」という「物」を構造や特性ではなく、製造方法によって特定しているが、これは、細胞が生体の一部であることから、その構造や特性は極めて複雑であり、それらを特定する作業を行うことは、著しく過大な経済的支出や時間を必要とするからである。
本発明の細胞製剤は、神経幹細胞の他に、製剤上許容される他の成分を含んでいてもよい。このような他の成分としては、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを挙げることができる。また、凍結保存時の細胞を保護するためにジメチルスルフォキシドや血清アルブミンなどが含まれていてもよく、細菌の混入や増殖を防ぐために抗生物質などが含まれていてもよい。
本発明の細胞製剤中に含まれる神経幹細胞の数は、脳腫瘍の治療において所望の効果（例えば、腫瘍の消滅、腫瘍サイズの減少）が得られるように、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、適宜決めることができる。
本発明の細胞製剤は、複数回（例えば、2〜10回）、間隔（例えば、1日に2回、1日に1回、1週間に2回、1週間に1回、2週間に1回）をおいて投与してもよい。投与量は、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態などを考慮して、適宜決めることができるが、一個体（ヒト）あたり幹細胞１×１０6個〜１×１０10個で、１〜１０回の投与が好ましい。
本発明の細胞製剤の投与部位や投与方法は特に限定されない。投与方法としては、腫瘍局所投与、頚動脈内投与、静脈内投与などを挙げることができる。
本発明の細胞製剤とともに使用されるプロドラッグの投与部位や投与方法も特に限定されない。投与方法としては、上述した腫瘍局所投与、頚動脈内投与、静脈内投与のほか、腹腔内投与なども挙げることができる。
プロドラッグの投与時期は、本発明の細胞製剤の投与前、投与と同時、及び投与後のいずれであってもよいが、通常は、細胞製剤の投与後に、複数回に分けて投与する。プロドラッグの投与量は、使用するプロドラッグの種類、対象の性別、年齢、体重、患部の状態などを考慮して適宜決めることができるが、5-FCを投与する場合であれば、一個体（ヒト）あたり1回50-200mg/kg、1日4回で2〜3週間投与（28回〜42回）が好ましい。
細胞毒性を防止するためにテトラサイクリン誘導システムを使った場合には、自殺遺伝子を発現させるためドキシサイクリンも治療時に投与する。ドキシサイクリンの投与方法としては、経口投与、腫瘍局所投与、頚動脈内投与、静脈内投与、腹腔内投与などを挙げることができる。ドキシサイクリンの投与時期は、本発明の細胞製剤の投与前、投与と同時、及び投与後のいずれであってもよいが、通常は、細胞製剤の投与後に投与する。
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕 グリオーマ細胞に対する自殺遺伝子細胞療法
（Ａ）材料と方法
＜ヒトiPS細胞＞
使用したヒトiPS細胞(1210B2)は、京都大学iPS細胞研究所(CiRA)から入手した。1210B2は、ヒト末梢血単核細胞にエピソーマルベクターを用いて再プログラミング因子を導入する方法(Okita K, Yamakawa T, Matsumura Y, Sato Y, Amano N, Watanabe A, Goshima N, Yamanaka S. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 2013 Mar;31(3):458-66.)によって樹立された。ヒトiPS細胞は、iMatrix-511（ニッピ社製）でコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Stem Fit AK03またはAK03N培地（味の素社製）を用いて、既知のフィーダーフリーの方法(Nakagawa M, Taniguchi Y, Senda S, Takizawa N, Ichisaka T, Asano K, Morizane A, Doi D, Takahashi J, Nishizawa M, Yoshida Y, Toyoda T, Osafune K, Sekiguchi K, Yamanaka S. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 2014 Jan 8;4:3594.)で維持培養した。
＜ヒトiPS細胞から神経幹/前駆細胞(NS/PCs)への分化誘導＞
ヒトiPS細胞からNS/PCsへの分化誘導は、既知の方法(Sugai K, Fukuzawa R, Shofuda T, Fukusumi H, Kawabata S, Nishiyama Y, Higuchi Y, Kawai K, Isoda M, Kanematsu D, Hashimoto-Tamaoki T, Kohyama J, Iwanami A, Suemizu H, Ikeda E, Matsumoto M, Kanemura Y, Nakamura M, Okano H. Pathological classification of human iPSC-derived neural stem/progenitor cells towards safety assessment of transplantation therapy for CNS diseases. Mol Brain. 2016 Sep 19;9(1):85.)により行った。まずiPS細胞の培地中に10μM ROCK阻害剤Y276352（和光純薬工業社製）を添加し、1〜3時間インキュベーションした後、PBSで洗浄し、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて単一細胞へ分散した。単一細胞へ分散されたヒトiPS細胞は、10μM ROCK阻害剤Y276352を添加したEB(embryoid body)形成培地（C液を添加していないStem Fit培地に10μM SB431542, 100nM LDN-193189を添加）に懸濁し、低接着96穴培養プレート（Prime Surface 96V，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり9.0×103細胞/75μlになるように播種し、培養した。1日後にEB形成培地75μlを加え、以降、毎日半分量のEB形成培地を交換し、13〜14日間培養することにより、EBを得た。各ウェルからEBを回収し、NS(neurosphere)培地（D-MEM/Ham's F-12培地(HEPES含有)（和光純薬工業社製）に20 ng/ml 組換えヒト上皮成長因子(PeproTech社製), 20 ng/ml 組換えヒト線維芽細胞増殖因子-2 (PeproTech社製), 103 units/ml 組換えヒト白血病阻止因子(ナカライテスク社製), 2% B-27 supplement (Thermo Fisher Scientific社製), 1単位/ml ヘパリンナトリウム（エイワイファーマ社製）を添加）で7日間培養した。培地交換は、培養3日か4日目に1度行った。細胞塊を遠心で回収し、TrypLE Selectを用いて単一細胞へ分散後、NS培地に懸濁した。1×105細胞/mlの濃度で低接着フラスコ（Corning社製）に播種し、3〜4日ごとに培地交換を行い、10日間培養することにより1次NS/PCsを得た。同様にして、1次NS/PCsを遠心で回収し、TrypLE Selectを用いて単一細胞へ分散後、NS培地に懸濁し、1×105細胞/mlの濃度で低接着フラスコに播種し、3〜4日ごとに培地交換を行い、7〜10日間培養することにより2次、3次、4次、5次NS/PCsを得た。
＜レンチウイルスベクターを用いたNS/PCsへのyCD-UPRT遺伝子の導入-治療用幹細胞TSC(1)＞
yCD-UPRT発現レンチウイルスベクターの作製
yCD(yest cytosine deaminase)-UPRT(uracil phosphoribosyl transferase)のcDNAは、pSELECT-zeo-Fcy::furプラスミド(InvivoGen社製)よりPCR法によりpENTR/D-TOPO(Thermo Fisher Scientific社製)にサブクローニングし、塩基配列を確認したものを使用した。yCD-UPRT cDNAをレンチウイルスベクタープラスミドCSIV-EF-RfA-IRES2-hKO1にサブクローニングし、CSIV-EF-yCD-UPRT-IRES2-hKO1を得た。CSIV-EF-yCD-UPRT-IRES2-hKO1は、EF-1αプロモーター下でyCD-UPRTとhKO1(Humanized Kusabira-Orange蛍光タンパク質遺伝子)が発現するレンチウイルスベクターの作製に使用した。レンチウイルスベクターは既知の方法により作製した(Miyoshi H, Blomer U, Takahashi M, Gage FH, Verma IM. Development of a self-inactivating lentivirus vector. J Virol. 1998 Oct;72(10):8150-7.; Kurita R, Suda N, Sudo K, Miharada K, Hiroyama T, Miyoshi H, Tani K, Nakamura Y. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 2013;8(3):e59890.; Hashizume O, Ohnishi S, Mito T, Shimizu A, Ishikawa K, Nakada K, Soda M, Mano H, Togayachi S, Miyoshi H, Okita K, Hayashi J. Epigenetic regulation of the nuclear-coded GCAT and SHMT2 genes confers human age-associated mitochondrial respiration defects. Sci Rep. 2015 May 22;5:10434.)
yCD-UPRT発現NS/PCsの作製
ヒトiPS細胞から分化誘導した2次〜4次NS/PCsを遠心で回収し、TrypLE Selectを用いて単一細胞へ分散後、NS培地に懸濁し、1×105細胞/mlの濃度で低接着フラスコに播種し、CSIV-EF-yCD-UPRT-IRES2-hKO1レンチウイルスベクターをMOI(multiplicity of infection) 1〜2で感染させ、3〜4日ごとに培地交換を行い、7日間培養した。得られたNS/PCsに対して同様に再度CSIV-EF-yCD-UPRT-IRES2-hKO1レンチウイルスベクターをMOI 1〜2で感染させ、yCD-UPRT発現NS/PCs治療用幹細胞（TSC(1)）を作製した。yCD-UPRT発現NS/PCsは、培地に5-FC(Fluorocytosine) 1μg/mlを添加することにより細胞死が誘導されることを確認した。
＜CRISPR/Cas9によるGAPDH遺伝子領域へのyCD-UPRT遺伝子導入-治療用幹細胞TSC(2)＞
GAPDH遺伝子領域にyCD-UPRT遺伝子を導入したiPS細胞の作製
CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いてGAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)遺伝子領域にyCD-UPRTを組み込むため、GAPDHとyCD-UPRTとBsd(blasticidin耐性遺伝子)が2A peptide配列で繋がった形で挿入されるような相同組み換え用コンストラクト(HR-GAPDH-2A-yCD-UPRT-2A-Bsd)と、GAPDHの終止コドン近辺をターゲットとするgRNAおよびCas9発現ベクターコンストラクト(U6-GAPDH-gRNA4-Cas9)を作製した。これらのコンストラクトをヒトiPS細胞株(1210B2)にエレクトロポレーションで導入し、ブラストサイジンS存在下で培養し、クローニングを行った。相同組み換えiPS細胞株の確認は、各クローンのgenomic PCRおよびgenomic sequencingによる塩基配列確認により行った。
yCD-UPRT発現NS/PCsの作製
GAPDH遺伝子領域にyCD-UPRTを組み込んだiPS細胞から、NS/PCsへ分化誘導を行い、2次〜5次NS/PCsを得た（TSC(2)）。培地には常時ブラストサイジンS 2μg/mlを添加し培養を行った。yCD-UPRT発現NS/PCsは、培地に5-FC 1μg/mlを添加することにより細胞死が誘導されることを確認した。
＜ffLuc発現ヒトグリオーマ細胞株U87の作製＞
ヒトグリオーマ細胞株U87にffLuc(Venus蛍光タンパク質とLuc2ホタルルシフェラーゼの融合遺伝子)発現レンチウイルスベクター(CSII-EF-ffLuc)(Takahashi Y, Tsuji O, Kumagai G, Hara CM, Okano HJ, Miyawaki A, Toyama Y, Okano H, Nakamura M. Comparative study of methods for administering neural stem/progenitor cells to treat spinal cord injury in mice. Cell Transplant. 2011;20(5):727-39.)を感染させ、セルソーターによるクローンソートを行い、ffLucが安定に高発現するU87細胞株を得た。
＜脳腫瘍モデルマウスにおけるyCD-UPRT発現NS/PCsの治療効果の検討＞
yCD-UPRT発現・治療用幹細胞TSC(1)を用いた悪性脳腫瘍に対する自殺遺伝子細胞療法（混合移植モデル）
U87-ffLuc 1×105個/2μlとyCD-UPRT発現TSC(1) (NS/PCsにyCD-UPRTをレンチウイルスベクターで導入) 5×105個/2μlを混合し、全身麻酔したT細胞欠損マウス(Female BALB/c nude mouse, 20g, 6w)の右線条体(大泉門より右方2mm、脳表より深さ3mm)に定位的に移植した。その翌日から21日間、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(治療群1: TSC(＋)/5-FC(＋) 5mg/day, n=9)。もう一群として、5-FC (10mg/ml)を100μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(治療群2: TSC(＋)/5-FC 1mg/day, n=9)。コントロール群は、1M PBS 500μlを2週間同様に投与した(コントロール群1: TSC(＋)/5-FC(−), n=9)。また、U87-ffLucのみを移植した群も別のコントロール群として作製し、こちらは、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(コントロール群2: TSC(−)/5-FC(＋) 5mg/day, n=3)。同一個体の腫瘍の継時的変化はIVIS in vivo imaging systemで１週間ごとに観察した。IVIS撮影時は、イソフルラン吸入麻酔下にVivoGloTM Luciferin 30mg/ml を200μl腹腔内投与し、ピークに達する10分で撮影を行った。
また、腫瘍移植後3週目時点で治療群1・2、コントロール群1を3匹ずつ断頭灌流固定し、実際の腫瘍体積を計測した。断頭は、4%パラホルムアルデヒドを経心臓的に灌流固定することにより行った。取り出した脳組織は、10%及び20%スクロース置換し、ミクロトームにて、20μm厚にスライスし、不凍液が1mlずつ入った8ウェルディッシュに順に入れ、-20℃で保管した。
脳切片は、HE染色、またはU87はVenus蛍光タンパク質を発現しているため、蛍光顕微鏡観察により、さらに詳細に腫瘍体積を測定した。また、同じく3週目の各群脳組織をanti-KO antibodyで蛍光染色し、移植したTSCが残存しているかを評価した。最後に、各群の生存曲線を比較した。
yCD-UPRT発現・治療用幹細胞TSC(1)を用いた悪性脳腫瘍に対する自殺遺伝子細胞療法（腫瘍形成後移植モデル）
全身麻酔したT細胞欠損マウス (Female BALB/c nude mouse, 20g, 6w)の右線条体(大泉門より右方2mm、脳表より深さ3mm)にU87-ffLuc 1×104個/2μlを移植し、5日後に同部位に定位的にyCD-UPRT発現TSC (NS/PCsにyCD-UPRTをレンチウイルスベクターで導入)を1×106個/2μl移植した。その2日後、IVIS in vivo imaging systemで腫瘍の生着を確認した後、治療群は、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(TSC(＋)/5-FC (＋) 5mg/day, n=9)。コントロール群1は、1M PBS 500μlを2週間同様に投与した(コントロール群1: TSC(＋)/5-FC(−), n=9)。また、U87-ffLucのみを移植した群も別のコントロール群として作製し、こちらは、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(コントロール群2: TSC(−)/5-FC(＋) 5mg/day, n=3)。
腫瘍評価方法や生存曲線解析などはすべて上記混合移植モデルの治療効果の検討と同様に行った。
yCD-UPRT発現・治療用幹細胞TSC(2)を用いたスライス培養によるバイスタンダー効果及びNS/PCsの遊走の可視化（タイムラプスイメージング）
U87-ffLucを、1×105個、全身麻酔したT細胞欠損マウス (Female BALB/c nude mouse, 20g, 6w)の右線条体(大泉門より右方2mm、脳表より深さ3mm)に定位的に移植した（day0）。Day 7にyCD-UPRT発現TSC (NS/PCsにyCD-UPRTをレンチウイルスベクターで導入)を、同部位に定位的に移植した。その翌日（Day 8）に非灌流下で、断頭し、ビブラトームを用いて200μm厚の脳切片を作製し、sterile porous (0.4 μm) insert membranes (Merck Millipore)上でスライス培養を開始した。ガラスボトムには、1800μlのNS(neurosphere)培地（D-MEM/Ham's F-12培地(HEPES含有)（和光純薬工業社製）に20 ng/ml 組換えヒト上皮成長因子(PeproTech社製), 20 ng/ml 組換えヒト線維芽細胞増殖因子-2 (PeproTech社製), 103 units/ml組換えヒト白血病阻止因子(ナカライテスク社製), 2% B-27 supplement (Thermo Fisher Scientific社製), 1単位/ml ヘパリンナトリウム（エイワイファーマ社製）を添加）で満たした。腫瘍はVenusにより緑に、TSCはhKO1により赤で標識されており、同日より共焦点顕微鏡によりタイムラプスで5日間撮影を行った。治療ディッシュには、上記培地に200μlの10mg/mlの5-FCを投与した。コントロールディッシュ1には、培地に200μlの1M PBSを投与した。コントロールディッシュ2として、テモゾロミド 250μMを投与した。2日に1度培地交換を行い、5-FC, PBS, テモゾロミドを同様に投与した。
yCD-UPRT発現・治療用幹細胞TSC(2)を用いた悪性脳腫瘍に対する自殺遺伝子細胞療法（腫瘍形成後移植モデル）
全身麻酔したT細胞欠損マウス (Female BALB/c nude mouse, 20g, 6w)の右線条体(大泉門より右方2mm、脳表より深さ3mm)にU87-ffLuc 1×104個/2μlを移植し、5日後に同部位に定位的にyCD-UPRT発現TSC (iPS細胞にyCD-UPRTをCRISPR/Cas9で導入)を1×106個/2μl移植した。その2日後、IVIS in vivo imaging systemで腫瘍の生着を確認した後、さらに2日後、治療群は、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した（TSC(＋)/5-FC (＋), n=8)。コントロール群1は、1M PBS 500μlを2週間同様に投与した(コントロール群1: TSC/5-FC (−),n=7)。また、U87-ffLucのみを移植した群も別のコントロール群として作製し、こちらは、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(コントロール群2: TSC(−)/5-FC (＋),n=3)。
腫瘍評価方法や生存曲線解析などはすべて上記と同様に行った。
＜レンチウイルスベクターを用いたiPS細胞へのテトラサイクリン（Tet）誘導 yCD-UPRT遺伝子の導入-治療用幹細胞TSC(3)＞
Tet誘導 yCD-UPRT発現レンチウイルスベクターの作製
yCD-UPRT cDNAをレンチウイルスベクタープラスミドCSIV-RfA-TRE-EF-KTにサブクローニングし、CSIV-yCD-UPRT-TRE-EF-KTを得た。CSIV-yCD-UPRT-TRE-EF-KTは、EF-1αプロモーター下でhKO1とrtTA(reverse Tet-controlled transactivator)が発現し、テトラサイクリン(Tet)誘導型プロモーター下でyCD-UPRT が発現するレンチウイルスベクターの作製に使用した。レンチウイルスベクターは既知の方法により作製した。
Tet誘導yCD-UPRT発現NS/PCsの作製
ヒトiPS細胞にCSIV-yCD-UPRT-TRE-EF-KTレンチウイルスベクターをMOI約15で感染させ、培養後、セルソーターによるクローンソートを行い、hKO1が安定に高発現するiPS細胞株を得た。Tet誘導yCD-UPRT発現iPS細胞は、培地にドキシサイクリン（Dox）1μg/ml、5-FC 1μg/mlの添加で細胞死が誘導されることを確認した。
Tet誘導yCD-UPRT発現iPS細胞からNS/PCsへの分化誘導を行い、2次、3次Tet誘導yCD-UPRT発現NS/PCsを得た。これらTet誘導yCD-UPRT発現NS/PCsも、培地にDox 1μg/ml、5-FC 1μg/mlの添加で細胞死が誘導されることを確認した。
Tet誘導yCD-UPRT発現治療用幹細胞TSC(3)を用いた悪性脳腫瘍に対する自殺遺伝子細胞療法（混合移植モデル）
U87-ffLuc 1×105個/2μlとTSC(3)(iPS細胞にTet誘導 yCD-UPRTをレンチウイルスベクターで導入) 5×105個/2μlを混合し、全身麻酔したT細胞欠損マウス(Female BALB/c nude mouse, 20g, 6w)の右線条体(大泉門より右方2mm、脳表より深さ3mm)に定位的に移植した。その翌日から5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(治療群1: TSC(＋)/5-FC(＋)/Dox(＋) , n=7)。コントロール群1は、1M PBS 500μlを2週間同様に投与した(コントロール群1: TSC(＋)/5-FC(＋)/Dox (−), n=9)。また、U87-ffLucのみを移植した群も別のコントロール群として作製し、こちらは、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(コントロール群2: TSC(−)/5-FC(＋)/Dox(＋), n=4)。Doxは200mg/kg含有の餌により経口摂取させた。腫瘍評価方法や生存曲線解析などはすべて上記と同様に行った。
（Ｂ）結果
（１）yCD-UPRT発現・治療幹細胞(TSC)を用いた悪性脳腫瘍に対する自殺遺伝子細胞療法（混合移植モデル）
＜概要＞
治療幹細胞と腫瘍細胞を混合移植する場合（混合移植モデル）の自殺遺伝子細胞療法の概要を図１に示す。導入する自殺遺伝子は、酵母シトシンデアミナーゼ(yCD）とプロドラックである5-フルオロシトシン（5-FC）の組み合わせを用いた。CDは5-FCを 5-フルオロウラシル（5-FU）に変換することにより、DNAおよびRNA合成を抑制し、細胞死へ誘導するが、さらにyCDとウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（UPRT）遺伝子を組み合わせることにより、UPRTが5-FU をチミジル酸シンターゼ阻害剤の5-FUMP へ変換するため、yCD 単独と比べ100倍以上の強いバイスタンダー効果が得られる。局所のバイスタンダー効果は細胞周期依存性であり、腫瘍細胞のみを選択的に殺傷するため、高い治療指数（therapeutic index）が期待される。
induced Pluripotent Stem（iPS）細胞をNS/PCs に分化誘導後、yCD-UPRTをレンチウイルスベクターで遺伝子導入し、自殺遺伝子yCD-UPRTを発現する治療用幹細胞（Therapeutic stem cell: TSC）を樹立した。
T細胞欠損マウス脳（右線条体）にヒトグリオーマ細胞 (U87)1×105個とTSC 5×105個を混合移植した。治療群1（Group 1）では移植翌日から21日間、5-フルオロシトシン（5-FC） 250mg/kgを1日1回投与（TSC(＋)/5FC(＋) 5mg/day, n=9）し、治療群2（Group 2）では投与量を減らし、50mg/kgを同様に投与した (TSC(＋)/5FC 1mg/day, n=9)。コントロール群1（Group 3）はPBSを投与し（TSC(＋)/5FC(−), n=9)、コントロール群2（Group 4）では、U87のみを1×105個同様に移植し、同期間5-FC 250mg/kgを投与した（TSC(−)/5FC(＋) 5mg/day, n=3）。
腫瘍の発光イメージング解析（IVIS）を経時的に行いながら、生存解析を行った。また一部のマウスは、移植３週目に安楽死させて、脳の組織学的解析を行った。
＜発光イメージング解析（IVIS）による腫瘍の経時的解析＞
両治療群では両コントロール群と比較して、腫瘍は著明に縮小傾向を示した（図２）。発光イメージングのROI値を計測すると、治療群は有意に低く、特に2週目以降で顕著であった（図３）（TSC(＋)/5FC(＋) 5mg/day vs TSC(＋)/5FC(−), 2週目, P=0.0046, t-test）。
＜脳腫瘍モデルマウスの組織学的解析（グリオーマ・TSC移植3週目：n=3）＞
グリオーマ細胞（U87）は蛍光タンパクVenusが遺伝子導入されているため、蛍光顕微鏡を用いて腫瘍体積を定量的に解析した。治療群1の腫瘍体積は0.76±0.84mm3で、治療群2の腫瘍体積は2.15±1.86mm3で、両者ともコントロール群1の51.59±7.62mm3と比較して、有意に小さかった（図４及び図５）（TSC(＋)/5FC(＋) 5mg/day vs TSC(＋)/5FC(−), P=0.00033, t-test）。また、治療群1の腫瘍体積は、治療群2よりもさらに小さい傾向にあった。さらに、治療群1では3匹中1匹は、3週目時点で腫瘍は確認されず、腫瘍の完全消失を予想される結果となった。
また本治療法の安全性（iPS細胞の腫瘍化リスク）に関して、上記マウス脳内の移植TSCの死滅を確認した。TSCはKusabira-Orange（KO）が遺伝子導入されているため、KO抗体を用いた蛍光染色により解析を行った。その結果、コントロール群では、移植したTSCは脳内に残存していたが、両治療群では明らかな残存を認めなかった(各群n=3)（図６）。したがって、移植したTSCはyCD-UPRT/5FC systemにより3週間以内に死滅することが確認された。
＜脳腫瘍モデルの生存解析＞
両治療群では両コントロール群と比較して、有意な生存期間の延長が認められた（図７）。平均生存期間は治療群1で42日、治療群2で34日、コントロール群1で25日、コントロール群2で21日であった(TSC(＋)/5FC(＋) 5mg/day vs TSC(＋)/5FC(−), logrank, p＝0.001)。また、治療群1は治療群2よりもさらに有意に生存期間は延長した。
（２）yCD-UPRT発現・治療幹細胞(TSC)を用いた悪性脳腫瘍に対する自殺遺伝子細胞療法（腫瘍形成後移植モデル）
＜概要＞
腫瘍形成後に治療幹細胞を移植する場合（腫瘍形成後移植モデル）の自殺遺伝子細胞療法の概要を図８に示す。混合移植モデルの場合と同様に、induced Pluripotent Stem (iPS細胞)をNS/PCs に分化誘導後、yCD-UPRTをレンチウイルスベクターで遺伝子導入し、自殺遺伝子yCD-UPRTを発現する治療用幹細胞（Therapeutic stem cell: TSC）を樹立した。
T細胞欠損 マウス脳（右線条体）にヒトグリオーマ細胞 (U87)1×104個を移植し、5日後に同部位に定位的にTSCを1×106個移植した。その4日後、IVIS生体イメージングで腫瘍の生着を確認した後、治療群（Group 1）は、5-FC (250mg/kg)を1回/日,２週間腹腔内投与した(TSC(＋)/5FC (＋) 5mg/day, n=9)。コントロール群1（Group 2）は、PBS を2週間同様に投与した（TSC(＋)/5FC(−), n=9)。コントロール群2（Group 3）では、U87のみを移植し5-FC (250mg/kg)を1回/日 2週間投与した（TSC(−)/5FC(＋) 5mg/day, n=3）。
腫瘍の発光イメージング解析（IVIS）を経時的に行いながら、生存解析を行った。また一部のマウスは、腫瘍移植３週目に安楽死させて、脳の組織学的解析を行った。
＜発光イメージング解析（IVIS）による腫瘍の経時的解析＞
治療群では両コントロール群と比較して、腫瘍は縮小傾向を示した（図９）。発光イメージングのROI値を計測すると、治療群は有意に低く、特に2週目以降で顕著であった（図１０）（TSC(＋)/5FC(＋) vs TSC(＋)/5FC(−), P=0.032 t-test）。
＜脳腫瘍モデルマウスの組織学的解析（グリオーマ・TSC移植3週目：n=3）＞
グリオーマ細胞（U87）は蛍光タンパクVenusが遺伝子導入されているため、蛍光顕微鏡を用いて腫瘍体積を定量的に解析した。治療群の腫瘍体積は0.82±1.23mm3で、コントロール群1の43.73±24.0mm3と比較して、有意に小さかった（図１１及び１２）（TSC(＋)/5FC(＋) vs TSC(＋)/5FC(−), P=0.036, t-test）。
また本治療法の安全性（iPS細胞の腫瘍化リスク）に関して、上記マウス脳内の移植TSCの死滅を確認した。TSCはKusabira-Orange（KO）が遺伝子導入されているため、KO抗体を用いた蛍光染色により解析を行った。その結果、コントロール群1では、移植したTSCは脳内に残存していたが、治療群では明らかな残存を認めなかった(各群n=3)（図１３）。したがって、移植したTSCはyCD-UPRT/5FC systemにより3週間以内に死滅することが確認された。
＜脳腫瘍モデルの生存解析＞
治療群では両コントロール群と比較して、有意な生存期間の延長が認められた（図１４）。平均生存期間は治療群で36日、コントロール群1で20日、コントロール群2で21日であった(TSC(＋)/5FC(＋) vs TSC(＋)/5FC(−), logrank, p＝0.0013)。
上記の通り、ヒトiPS細胞由来NS/PCs に臨床応用可能なレンチウイルスベクターを用いてyCD-UPRTを導入し、ヒト脳腫瘍モデルマウスに移植すると、5-FC投与により著明な治療効果(バイスタンダー効果)を認め、本治療法の有効性を証明することができた。
＜脳スライス培養法によるタイムラプスイメージング＞
ffLuc-U87を1×105個、T細胞欠損マウス (右線条体)に定位的に移植した（day0）。Day 7にTSC（iPS細胞をNC/PCsに分化誘導後、yCD-UPRTをレンチウイルスベクターで遺伝子導入して作製したTSC）を、同部位に定位的に移植した。その翌日に非灌流下で、断頭しビブラトームを用いて200μm厚の脳切片を作成し、sterile porous (0.4 μm) insert membranes上でスライス培養を開始した。腫瘍はVenusにより緑に、TSCはhKO1により赤で標識されており、同日より共焦点顕微鏡で5日間撮影を行った。治療群として、培地に200μlの10mg/mlの5-FCを投与した。コントロール群1として、培地に200μlの1M PBSを、コントロール群2として、テモゾロミド 250μMを投与した。治療群では、移植したTSCは腫瘍内に遊走拡散し、その後5-FCに良好に反応死滅し、その後周囲腫瘍が死滅していく様子を観察することができた（図１５、図１６、図１７）。コントロール群1では、TSCは生存を続け、腫瘍の内部にまで遊走侵入する様子を確認できた（図１５、図１６、図１７）。コントロール群2として、テモゾロミドでは一時的な腫瘍増大に抑制効果はあったが、縮小効果は認めなかった（図１５）。
（３）CRISPR/Cas9によるyCD-UPRT発現・治療幹細胞(TSC)を用いた悪性脳腫瘍に対する自殺遺伝子細胞療法（腫瘍形成後移植モデル）
＜概要＞
ゲノム編集による自殺遺伝子を組込んだiPS細胞を利用した自殺遺伝子細胞療法の概要を図１８に示す。治療用神経幹細胞の安定供給のためには、ヒトiPS細胞にyCD-UPRT遺伝子を導入することが望ましい。レンチウイルスベクターによる遺伝子導入では、染色体にランダムに挿入されるため、挿入部位の遺伝子変異や周辺遺伝子の活性化、位置効果によるyCD-UPRTの不活性化が懸念される。この問題解決のため、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて、GAPDH遺伝子領域にyCD-UPRTを挿入したiPS細胞を作製した。このiPS細胞からNS/PCsを誘導し、yCD-UPRTを発現する治療用幹細胞（Therapeutic stem cell: TSC）を得た。
T細胞欠損 マウス脳（右線条体）にヒトグリオーマ細胞 (U87)1×104個を移植し、5日後に同部位に定位的にTSCを1×106個移植した。その4日後、IVIS生体イメージングで腫瘍の生着を確認した後、治療群（Group 1）は、5-FC (250mg/kg)を1回/日投与した(TSC(＋)/5FC (＋), n=6)。コントロール群1は（Group 2）、PBS を2週間同様に投与した（TSC/5FC (−),n=4)。コントロール群2（Group 3）では、U87のみを移植し5-FC (250mg/kg)を1回/日 2週間腹腔内投与した（TSC(−)/5FC (＋),n=3）。
腫瘍の発光イメージング解析（IVIS）を経時的に行いながら、生存解析を行った。また一部のマウスは、腫瘍移植３週目に安楽死させて、脳の組織学的解析を行った。
＜発光イメージング解析（IVIS）による腫瘍の経時的解析＞
治療群では両コントロール群と比較して、腫瘍は縮小傾向を示した（図１９）。発光イメージングのROI値を計測すると、治療群は低い傾向にあり、特に2週目以降で顕著であった（図２０）（TSC(＋)/5FC(＋) vs TSC(＋)/5FC(−), P=0.067, t-test）。
＜脳腫瘍モデルマウスの組織学的解析（グリオーマ・TSC移植3週目：n=3）＞
グリオーマ細胞（U87）は蛍光タンパクVenusが遺伝子導入されているため、蛍光顕微鏡を用いて腫瘍体積を定量的に解析した。治療群の腫瘍体積は6.02±7.08mm3で、コントロール群の74.12±31.6mm3と比較して、有意に小さかった（図２１及び図２２）（TSC(＋)/5FC(＋) vs TSC(＋)/5FC(−), P=0.022, t-test）。また治療群では、腫瘍が完全消失した個体も認めた（5-FC投与前 day7の時点で、IVISで腫瘍生着を確認済）。
＜脳腫瘍モデルの生存解析＞
治療群では両コントロール群と比較して、有意な生存期間の延長が認められた（図２３）。平均生存期間は、治療群で35日(うち一匹は解析のため打ち切り)、コントロール群1で20日、コントロール群2で21日であった(TSC(＋)/5FC(＋) vs TSC(＋)/5FC(−), logrank, p=0.0042)。治療群では、腫瘍が完全に消失し、生存を続けた例も認めた。
（４）Tet誘導yCD-UPRT発現治療用幹細胞TSCを用いた悪性脳腫瘍に対する自殺遺伝子細胞療法（混合移植モデル）
＜概要＞
Tet誘導yCD-UPRT発現治療用幹細胞TSCを用いた悪性脳腫瘍に対する自殺遺伝子細胞療法の概要を図２４に示す。NS/PCsではなく、iPS細胞の段階でレンチウイルスベクターによってyCD-UPRT遺伝子を導入するために、テトラサイクリンで誘導可能なyCD-UPRTをレンチウイルスベクターによってiPS細胞に導入し、ドキシサイクリン（Dox）を添加したときのみ遺伝子発現するようにした。その結果、Dox非添加状態では、iPS細胞は問題なくEBを経てNS/PCsに誘導可能であり、その後、Doxを添加しyCD-UPRTを発現させることで、5-FCに反応良好なNS/PCsを得た。
U87-ffLuc 1×105個/2μlとTSC 5×105個/2μlを混合し、全身麻酔したT細胞欠損マウス(Female BALB/c nude mouse, 20g, 6w)の右線条体(大泉門より右方2mm、脳表より深さ3mm)に定位的に移植した。その翌日から5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(治療群（Group 1）: TSC(＋)/5-FC(＋)/Dox(＋) , n=7)。コントロール群1（Group 2）は、1M PBS 500μlを2週間同様に投与した(コントロール群1: TSC(＋)/5-FC(＋)/Dox (−), n=9)。また、U87-ffLucのみを移植した群も別のコントロール群（Group 3）として作製し、こちらは、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(コントロール群2: TSC(−)/5-FC(＋)/Dox(＋), n=4)。Doxは200mg/kg含有の餌により経口摂取させた。腫瘍評価方法や生存曲線解析などはすべて上記と同様に行った。
腫瘍の発光イメージング解析（IVIS）を経時的に行ないながら、生存解析を行った。また一部のマウスは、腫瘍移植３週目に安楽死させて、脳の組織学的解析を行った。
＜発光イメージング解析（IVIS）による腫瘍の経時的解析及び腫瘍体積＞
治療群では両コントロール群と比較して、腫瘍は縮小傾向を示した（図２５）。グリオーマ細胞（U87）は蛍光タンパクVenusが遺伝子導入されているため、蛍光顕微鏡を用いて腫瘍体積を定量的に解析した。治療群の腫瘍体積はコントロール群と比較して、縮小傾向にあった（図２６）。
＜脳腫瘍モデルの生存解析＞
治療群では両コントロール群と比較して、有意な生存期間の延長が認められた（図２７）。平均生存期間は治療群で25.5日、コントロール群1で20日、コントロール群2で19日であった(TSC(＋)/5-FC(＋)/Dox(＋) vs TSC(＋)/5-FC(＋)/Dox(−), logrank, p=0.004)。
〔実施例２〕 グリオーマ幹細胞に対する自殺遺伝子細胞療法
＜CRISPR/Cas9によるyCD-UPRT発現・治療幹細胞(TSC)を用いた悪性脳腫瘍幹細胞 (hG008)に対する自殺遺伝子細胞療法（腫瘍形成後移植モデル）＞
全身麻酔したT細胞欠損マウス(Female BALB/c nude mouse, 20g, 6w)の右線条体(大泉門より右方2mm、脳表より深さ3mm)にヒトグリオーマ幹細胞株hG008-ffLuc 5×105個/2μlを移植し、45日後に同部位に定位的にyCD-UPRT発現TSC (iPS細胞にyCD-UPRTをCRISPR/Cas9で導入)を1×106個/2μl移植した。その7日後、IVIS in vivo imaging systemで腫瘍の信号を確認した後、治療群は、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(TSC(＋)/5-FC (＋) 5mg/day, n=8)。コントロール群1は、1M PBS 500μlを2週間同様に投与した(コントロール群1: TSC(＋)/5-FC(−), n=7)。また、hG008-ffLucのみを移植した群も別のコントロール群として作製し、こちらは、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(コントロール群2: TSC(−)/5-FC(＋) 5mg/day, n=3)。
腫瘍評価方法や生存曲線解析などはすべて上記混合移植モデルの治療効果の検討と同様に行った。
＜発光イメージング解析（IVIS）による腫瘍の経時的解析＞
IVIS in vivo imagingでは、治療群はコントロール2群と比較して5-FC投与後著明に信号は縮小した（図２９）。IVISの信号のROIは治療群は有意に低く、5-FC投与後7Wの時点では、p=0.0019と有意にコントロール群1と有意差を認めた（図３０）。
＜脳腫瘍モデルマウスの組織学的解析＞
hG008はVenus蛍光タンパク質で蛍光標識し可視化している。びまん性に浸潤する腫瘍モデルであるため、体積の計測は困難であるが、明らかに治療群はコントロール群１と比較して腫瘍は減少している（図３１）。また対側に浸潤する腫瘍が治療群はほとんど認めない（図３１）。
＜脳腫瘍モデルの生存解析＞
生存曲線は、治療群は有意に延長し、log-rank検定でコントロール群1とp=0.0026と有意差を認めた（図３２）。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
本発明の脳腫瘍治療用細胞製剤は医薬として用いることができるので、本発明は製薬などの産業分野において利用可能である。

Claims (17)

  1. シトシンデアミナーゼによって5-フルオロウラシルに変換されるプロドラッグとともに使用される脳腫瘍治療用細胞製剤であって、シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する多能性幹細胞由来の神経幹細胞を含むことを特徴とする脳腫瘍治療用細胞製剤。
  2. シトシンデアミナーゼによって5-フルオロウラシルに変換されるプロドラッグが、5-フルオロシトシンであることを特徴とする請求項１に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
  3. 多能性幹細胞由来の神経幹細胞が、以下の工程（１）を行い、次に工程（２）を行うことにより得られる神経幹細胞であることを特徴とする請求項１又は２に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤、
    （１）多能性幹細胞にシトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を導入する工程、
    （２）多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる工程。
  4. シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が、ゲノム編集によって、多能性幹細胞のゲノムに挿入されていることを特徴とする請求項３に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
  5. シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が、多能性幹細胞のハウスキーピング遺伝子の領域又はAAVS1領域に挿入されていることを特徴とする請求項４に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
  6. ハウスキーピング遺伝子が、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項５に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
  7. シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を、発現を人為的に調節できる遺伝子構造物とすることを特徴とする請求項３に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
  8. 遺伝子構造物が、ドキシサイクリンの添加によって発現する遺伝子構造物であることを特徴とする請求項７に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
  9. 多能性幹細胞由来の神経幹細胞が、以下の工程（１）を行い、次に工程（２）を行うことにより得られる神経幹細胞であることを特徴とする請求項１又は２に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤、
    （１）多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる工程、
    （２）神経幹細胞にシトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を導入する工程。
  10. 多能性幹細胞が、iPS細胞であることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
  11. 以下の工程（Ａ１）を行い次に工程（Ａ２）を行う方法、又は工程（Ｂ１）を行い次に工程（Ｂ２）を行う方法であることを特徴とするシトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する神経幹細胞の作製方法、
    （Ａ１）多能性幹細胞にシトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を導入する工程、
    （Ａ２）多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる工程、
    （Ｂ１）多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる工程、
    （Ｂ２）神経幹細胞にシトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を導入する工程。
  12. 工程（Ａ１）において、シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を、ゲノム編集によって、多能性幹細胞のゲノムに挿入することを特徴とする請求項１１に記載の神経幹細胞の作製方法。
  13. 工程（Ａ１）において、シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を、多能性幹細胞のハウスキーピング遺伝子の領域又はAAVS1領域に挿入することを特徴とする請求項１２に記載の神経幹細胞の作製方法。
  14. ハウスキーピング遺伝子が、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１３に記載の神経幹細胞の作製方法。
  15. 工程（Ａ１）において、シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を、発現を人為的に調節できる遺伝子構造物とすることを特徴とする請求項１１に記載の神経幹細胞の作製方法。
  16. 遺伝子構造物が、ドキシサイクリンの添加によって発現する遺伝子構造物であることを特徴とする請求項１５に記載の神経幹細胞の作製方法。
  17. 多能性幹細胞が、iPS細胞であることを特徴とする請求項１１乃至１６のいずれか一項に記載の神経幹細胞の作製方法。
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