WO2019027298A9 - Trail 및 cd를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Trail 및 cd를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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이순민
김혜연
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    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector

Definitions

  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising, as an active ingredient, mesenchymal stem cells expressing TRAIL and depressant
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of cancers containing mesenchymal stem cells expressing TRAIL and depressant as an active ingredient.
  • TRAIL Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis s-Inducing Ligand
  • TRAIL Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis s-Inducing Ligand
  • TRAIL selectively kills cells by activating apoptotic signaling pathway by binding to cell death receptors-4 (DR-4), DR-5, decoy receptors or decoy receptors-2 present on the cell surface .
  • DR-4 cell death receptors-4
  • DR-5 decoy receptors or decoy receptors-2 present on the cell surface .
  • TRAIL is not expressed in all human tissues.
  • TRAIL is not expressed in human brain tissue but is instead related to neuroblastoma (Neuroglia), vascular inflammatory diseases and apoptosis (Dorr J. et al., J Neurosci., 22 (4): RC209, 2002).
  • the glial cells are cancerous, the glial ganglion develops, and it is known that the glioma is difficult to treat because it destroys the brain tissue and travels around the brain.
  • attempts have been made to treat TRAIL by artificially expressing TRAIL in cancer cells, but there is a problem that it is difficult to effectively express TRAIL in cancer cells.
  • CD cytosine deaminase
  • 5-FU 5-fluorouracil
  • 5-FC cytotoxic 5-FC
  • 5-FU shows a by-stander ef fect, which is secreted out of the cell and kills the adjacent cells.
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • the MSC can be relatively easily obtained from various tissues such as bone marrow, umbilical cord blood, and fat.
  • MSCs have specificity to migrate to inflammatory, cancerous or injured areas and are also of great advantage as delivery vehicles for delivery of therapeutic drugs.
  • the immune function of the human body can be controlled by inhibiting or activating the functions of immune cells such as T cells, B cells, dendritic cells and natural killer cells.
  • T cells T cells
  • B cells dendritic cells and natural killer cells.
  • Korean Patent No. 1585032 discloses a cell treatment agent containing mesenchymal stem cells cultured in a hydrogel.
  • the above document provides a composition that can be directly administered by shortening the pretreatment process in the step of isolating mesenchymal stem cells for use as a cell therapy agent.
  • the problems of the mesenchymal stem cells as described above and the measures to solve them I do not mention it at all. Therefore, it is necessary to study the safe and effective mesenchymal stem cells that can be used as a cell therapy agent.
  • the present inventors have studied to develop an effective cancer therapeutic agent, and as a result, they have confirmed that mesenchymal stem cells expressing TRAIL and CD simultaneously inhibit the formation and metastasis of cancer, thus exhibiting anticancer effects.
  • Task solution mesenchymal stem cells expressing TRAIL and CD simultaneously inhibit the formation and metastasis of cancer, thus exhibiting anticancer effects.
  • One aspect of the present invention provides a method for preventing or treating cancer comprising, as an active ingredient, mesenchymal stem cells transformed to express TNF-associated cell death-inducing ligand protein (TRAIL) and cytosine deaminase (CD)
  • TRAIL TNF-associated cell death-inducing ligand protein
  • CD cytosine deaminase
  • Another aspect of the present invention provides the use of a pharmaceutical composition of the present invention for preventing or treating cancer.
  • Another aspect of the invention provides the use of a pharmaceutical composition of the invention for the manufacture of a medicament for the prophylaxis or treatment of cancer.
  • Another aspect of the present invention provides a method of treating cancer comprising the step of administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising TRAIL and CD-expressing mesenchymal stem cells as an active ingredient of the present invention inhibits the formation and metastasis of cancer cells by inducing apoptosis of cancer cells.
  • the mesenchymal stem cells have a high cell proliferation rate as immortalized mesenchymal stem cells and can regulate the expression of TRAIL and CD proteins in the cells according to the presence or absence of the doxycycline treatment, The possibility of differentiation is low, and cell death is induced by 5-FC treatment, so that residual stem cells can be removed and safety is high.
  • the anticancer effect of cell lines expressing TRAIL and CD at the same time is very superior, so that the pharmaceutical composition of the present invention can be usefully used for prevention or treatment of cancer.
  • FIG. 1 is a graph comparing cell proliferation rates according to the presence or absence of immortalization of mesenchymal stem cells (MSC) 0 2019/027298 1 »(: 1 ⁇ 1 ⁇ 2018/008901 The graph is:
  • imMSC immortalized MSC
  • MSC MSC not immortalized
  • Axis Accumulated PDL.
  • Figure 2 is a schematic representation of the construction of a gene construct inserted into a pBD-4 lentivirus vector:
  • TRE a promoter comprising tetracycline response elements
  • TRAIL TNF-associated cell death-inducing ligand
  • IRES internal ribosome entry site
  • CD CD protein
  • FIG. 3 shows the expression of CD90, CD44, CD105 and CD73 surface antigen proteins in TRAIL protein and MSCXBM-03 expressing CD protein.
  • FIG. 4 is a graph showing that the BM-03 cell line maintains its pluripotency after transfection through lipogenesis, osteogenesis, or differentiation into cartilage-forming cells.
  • FIG. 5A shows the expression levels of TRAIL and CD in the BM-03 cell line, which is a deposit cell line.
  • the lane 1 represents the marker
  • the lane 2 represents the negative control
  • the lane 3 represents the positive control
  • the lanes 4 to 6 represent the BM-03 cell line.
  • FIG. 5B is a diagram quantifying the expression of TRAIL and CD in a BM-03 cell line, which is a deposit cell line, by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR).
  • FIG. 6 is a graph showing the expression of TRAIL protein in the BM-03 cell line according to the presence or absence of Dox treatment.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of 5-FC treatment on BM-03 cell line and the cell death effect of BM-03 cell line through FACS.
  • FIG. 8 is a graph showing the expression of TRAIL, CCR2 and CXCR4 in the BM-03 cell line.
  • FIG. 9 is a graph showing the PDL value of the BM-03 cell line obtained by subculture.
  • FIG. 10 shows the results of analysis of the karyotype of the BM-03 cell line.
  • FIG. 11 is a photograph showing the inhibitory effect on tumor formation by the injection of 81-03 cell line using human glioma-induced mice.
  • FIG. 12 is a graph showing the tumor size measured based on the photograph of FIG.
  • FIG. 13 is a graph showing an increase in the survival days of human glioma-induced mice according to 3 -03 cell line injection and 5-administration.
  • FIG. 14 is a photograph showing the effect of inhibiting tumor formation upon injection of 3103 cell line by concentration using human glioma-induced mice.
  • FIG. 15 is a graph showing the tumor size measured based on the photograph of FIG. 14.
  • FIG. 15 is a graph showing the tumor size measured based on the photograph of FIG. 14.
  • FIG. 16 is a graph showing an increase in the survival days of human glioma-induced mice according to the concentration of 81-03 cell line injected.
  • 17 is a diagram showing an experimental method for confirming tumor mobility of the 8,41-03 cell line using a transwell chamber.
  • FIG. 18 is a graph showing the tumor mobility of the 61-03 cell line in vitro using a transwell chamber .
  • FIG. 18 is a graph showing the tumor mobility of the 61-03 cell line in vitro using a transwell chamber .
  • 19 is a view checking the mobility of a tumor cell line using the yaw 3 ⁇ 41-03 glioma-induced mice over 111 ⁇ ⁇ 0.
  • Figure 20 is an immortalized the three types of glioma cells, mesenchymal stem cells 0 ⁇ 11: 5),
  • FIG. 21 shows the results of immunohistochemical analysis of mesenchymal stem cells immortalized in three glioma cells Or 8 -03 cell lines and / or 5-treated cells.
  • FIG. 22 is a graph showing the survival rate of glioma-induced mice after a single administration of 8103 cell line to glioma-induced mice.
  • FIG. 23 is a graph showing the survival rate of glial stem-induced mice after multi-dose administration of the myeloma-03 cell line to glioma-induced mice. Best Mode for Carrying Out the Invention
  • One aspect of the present invention provides a method of producing a transformed cell that simultaneously expresses a TNF-associated cell death-inducing ligand protein (TRAIL) and a cytosine deaminase (CD) protein As an active ingredient.
  • TRAIL TNF-associated cell death-inducing ligand protein
  • CD cytosine deaminase
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • TRAIL &quot refers to a TNF-associated cell death-inducing ligand protein, which refers to a type II transmembrane protein in the TNF family.
  • the TRAIL is one of suicide genes, 4) R-4), DR (which is a cytotoxic receptor present on the surface of a cell), TRAIL is a homotrimer capable of binding to three receptors, 5, decoy (decoy) receptor or the decoy receptor-thus in combination with the second activating the apoptosis signaling pathway Additionally, TRAIL is known to be non-toxic for the normal cells, induces apoptosis only in cancer cells specifically.
  • the TRAIL may be a human-derived protein, and may be a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the TRAIL may have about 70%, 80%, 90% or 95% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the gene encoding TRAIL may be a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the TRAIL-encoding gene may have about 70%, 80%, 90% or 95% homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the TRAIL-encoding gene may be a nucleotide sequence encoding a mutant of TRAIL that maintains TRAIL activity.
  • the variant of TRAIL may have about 70%, 80%, 90% or 95% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequence coding for the mutant TRAIL may have about 70%, 80%, 90% or 95% homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • CD used in the present invention means a cytosine deaminase protein.
  • the CD may be in the form of a fusion protein in which CD and UPRKuracil phosphoribosyltransferase are bound, Can be mixed with CD :: UPRT.
  • the CD contains 5-FC (5-fluorocytosine), which is harmless to human body (5-FU luorouraci 1), an anticancer substance with cytotoxicity, to induce apoptosis.
  • 5-FU shows a by-stander ef fect that is secreted out of the cell and kills the neighboring cells. Therefore, treating 5 - FC with CD - expressing cells can induce the death of 5 - FU - induced cancer cells near the suppressor cells.
  • the gene encoding the CD may be obtained by fusing the FCY1 gene encoding CDase of Saccharomyces cerevisiae and the FUR1A105 gene encoding UPRTase from which 35 amino acids are deleted from the N-terminus, And may be a codon-opt imitated sequence.
  • Such sequences may be those described in U.S. Patent Nos. 5,338, 678, WO 96/16183, and WO 99/54481.
  • the suppression may be a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the above conditions may have about 70%, 80%, 90% or 95% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the gene encoding the CD may be a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 may be the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the CD encoding gene may have about 70%, 80%, 90% or 95% homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the gene encoding the CD may be a nucleotide sequence encoding a mutant of CD that maintains CD activity.
  • the variant of CD may have about 70%, 80%, 90% or 95% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the nucleotide sequence encoding the mutant CD may have about 70%, 80%, 90% or 95% homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the cell can be a human embryonic stem cell (hES), a bone marrow stem cell (BMSC), a mesenchymal stem cell (MSC), a human neural stem cell cervical lymph node cells, cervical lymph nodes, hNSC, limbal stem cells, or oral mucosal epithelial cells.
  • hES human embryonic stem cell
  • BMSC bone marrow stem cell
  • MSC mesenchymal stem cell
  • a human neural stem cell cervical lymph node cells cervical lymph nodes
  • hNSC hNSC
  • the cells may be mesenchymal stem cells 2019/027298 1 »(: 1 ⁇ 1 ⁇ 2018/008901
  • the mesenchymal stem cells may be immortalized. Specifically, the mesenchymal stem cells may have introduced hTERT and c-Myc.
  • " n- transformation " used in the present invention means that a foreign gene is introduced into a cell regardless of the gene carrier and the introduction method, and the trait of the cell is changed by the introduced foreign gene.
  • the transfection can be carried out by introducing TRAIL and a gene encoding a mutant that maintains the activity of CD, TRAIL, and CD into a stem cell through a method known in the art.
  • transfect ion, microinjection, transduct ion, cell fusion, calcium phosphate precipitation method, liposome-mediated transfect ion, DEAE dextran-mediated trait The present invention relates to a method for introducing a nucleic acid into a cell, such as a DEAE Dextran-mediated transfect ion, a polybreneiediated transfect ion, an electroporat ion, a gene gun, (Wu et al., J. Bio. Chem., 267: 963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chern., 263: 14621-14624, 1988).
  • it is not limited thereto.
  • transfect ion means delivering a gene loaded into a recombinant lentiviral vector through a viral infection.
  • the transformed cells may be transfected with a recombinant lentivirus.
  • the lentivirus means a virus of retroviruses characterized by a prolonged incubation period. Lentiviruses can transfer genetic information into the DNA of a host cell. It is one of the most effective methods of gene transfer vectors that can replicate in non-dividing cells.
  • the transformed cells can be prepared by the following method:
  • hTERT and c-Myc are genes that disassociate mesenchymal stem cells.
  • other genes known as immortalized genes can also be used.
  • the hTERT and c-Myc proteins may be polypeptides having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 7, respectively.
  • the genes encoding the hTERT and c-Myc proteins may be polynucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 8, respectively.
  • tTA is a gene capable of regulating the expression of a target protein, which means tetracycline transactivator.
  • the Tet-off system used in the present invention can control the expression of a target protein depending on the presence or absence of tetracycline or doxycycline as described above.
  • the tertiary infection of step 2) above can be carried out using the recombinant lentiviral vector of the present invention which contains both TRAIL and CD gene in one vector.
  • the TRAIL and CD genes can be prepared into respective gene constructs and inserted into two lentiviral vectors, respectively. That is, a recombinant lentiviral vector into which a gene construct constructed to express a gene encoding TRAIL protein is inserted and a recombinant lentiviral vector into which a gene construct constructed to express a gene encoding CD protein are inserted It can be used for infection.
  • the transformed mesenchymal stem cells prepared as described above were designated as BM-03 and deposited on Jan. 6, 2017 with the accession number KCTC 13182BP at the BRC Center of the Korea Biotechnology Research Institute.
  • the terms "packaging plasmid” and " envelope plasmid " refer to a plasmid or an isolated nucleic acid used to efficiently produce lentivirus from a lentiviral vector.
  • the packaging plasmids and the envelope plasmids can be used as the Can be used in conjunction with the recombinant lentiviral vector of the present invention to efficiently produce a recombinant lentivirus from a recombinant lentiviral vector.
  • Such constructs contain elements useful in preparing lentiviral vectors from host cells and packaging them. Such elements include structural proteins such as gag precursors; processing proteins, such as pol I precursors; Protease, coat protein, and expression and regulatory signals necessary to produce the protein in the host cell and to produce the lentiviral particle.
  • a packaging plasmid for example, pRSV-Rev, psPAX, pCl -VSVG, pNHP, etc.
  • an envelope plasmid for example, pMD2. G, pLTR-G, pHEF-VSVG or the like
  • a plasmid vector synthesized using a known sequence for example, pMD2.
  • lentivirus vector refers to a retrovirus, which is a vector in the form of single-stranded RNA.
  • the lentivirus vector may also be referred to as a lentivirus transfer vector.
  • the vector is inserted into the genomic DNA of the subject cell to stably express the gene and can transfer the gene to the dividing cell and the non-dividing cell.
  • the vector does not induce the immune response of the human body, There is an advantage that a larger size gene can be delivered as compared with an adenovirus vector which is a viral vector used.
  • the recombinant lentiviral vector may comprise a gene encoding a TNF-associated cell death-inducing ligand protein (TRAIL), and a cytosine deaminase (CD) protein.
  • TRAIL TNF-associated cell death-inducing ligand protein
  • CD cytosine deaminase
  • the recombinant lentiviral vector may further comprise a gene coding for thymidine kinase (TK), CCR2 or CXCR4 protein.
  • TK thymidine kinase
  • CCR2 or CXCR4 protein This is an enzyme that catalyzes the thymidyl acid production reaction by binding phosphoric acid at the Y position of ATP to thymidine, whereby thymidine is transformed into a triphosphate form. Modified thymidine can not be used for DNA replication. Therefore, it is known to induce the death of cells containing the same.
  • the TK protein may be any known sequence. According to one embodiment, the above comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 It may be a polypeptide of the present invention.
  • the gene coding for the TK may be a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 may be the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 .
  • the CCR2 protein may be any known sequence.
  • the CCR2 may be a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19.
  • the CCR2-encoding gene may be a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 may be the nucleotide sequence of SEQ ID NO:
  • the CXCR4 protein may be any known sequence.
  • the CXCR4 may be a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.
  • the CXCR4-encoding gene may be a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 may be the nucleotide sequence of SEQ ID NO:
  • the CCR2 and CXCR4 proteins may increase the therapeutic efficacy of the mesenchymal stem cells of the present invention by increasing the mobility of the cancer cells.
  • the same cell line having such characteristics can be produced in large quantities, and thus it can be developed as a commercial therapeutic agent.
  • TRAIL and CD expressing mesenchymal stem cells of the present invention can be cell lines expressing CD, TRAIL, CCR2, CXCR4, CD90, CD44, CD105 and / or CD73 proteins.
  • such a cell line can be a cell line expressing more than 80% of TRAIL protein and more than 90% of CCR2 and CXCR4 when measured by FACS analysis.
  • the cell line may be a cell line expressing CD90, CD44, CD105 and / or CD73 protein.
  • the cell line may be a cell line expressing the CD90, CD44 and CD105 proteins.
  • the cell line may be a cell line expressing the CD90, CD105 and CD73 proteins.
  • the cell line may also be a cell line expressing the CD44, CD105 and CD73 proteins.
  • the cell line may be a cell line expressing the CD90, CD44, CD105 and CD73 proteins.
  • such a cell line may be a cell line which expresses 90% or more, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more of CD90, CD44, CD105 and / or CD73 protein when measured by FACS analysis.
  • mesenchymal stem cells expressing TRAIL and CD of the present invention are CD34, CDllb, 2019/027298 1 »(: 1 ⁇ 1 ⁇ 2018/008901
  • the mesenchymal stem cells of the present invention express CD90, CD44, CD105 and CD73 proteins as cell surface markers (95% as determined by FACS analysis) while expressing TRAIL, CD (cytosine deaminase), CCR2, ), CD34, CDllb, CD19, suppressor 45 and HLA-DR protein (less than 1% as measured by FACS assay).
  • CD90, CD44, CD105 and CD73 proteins as cell surface markers (95% as determined by FACS analysis) while expressing TRAIL, CD (cytosine deaminase), CCR2, ), CD34, CDllb, CD19, suppressor 45 and HLA-DR protein (less than 1% as measured by FACS assay).
  • the recombinant lentiviral vector of the present invention may contain one or two promoters.
  • the promoter may be a cytomegalovirus (CMV), respiratory syncytial virus (RSV), human elongation factor-1 alpha, EF-1a or tetracycline response elements (TRE) promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • RSV respiratory syncytial virus
  • TRE tetracycline response elements
  • the recombinant lentiviral vector can regulate the expression of TRAIL protein and CD protein by one promoter.
  • the promoter may be operably linked to a gene encoding a protein to be expressed.
  • the TRAIL and CD may be linked to a TRE promoter.
  • the TRE promoter can activate the transcription of the gene linked to the promoter by the tTA (tetracycline transact ivator) protein.
  • tTA tetracycline transact ivator
  • the tTA protein binds to the TRE promoter and activates transcription when tetracyclin or doxycyclin is absent. If they are present, they can not bind to the TRE promoter and activate the transcription.
  • the expression of TRAIL protein and CD protein can be controlled by the addition of tetracycline or doxycycline.
  • operably linked means that a particular polynucleotide is linked to another polynucleotide so that it can perform its function. That is, the fact that a gene encoding a particular protein is operatively linked to a promoter means that the action of the promoter ≪ / RTI > to mRNA and translated into the protein of interest.
  • the gene When the gene is linked to be transcribed, it may include an internal ribosome entry site (IRES) so that each protein can be expressed from the single transcript.
  • IRS internal ribosome entry site
  • IRES internal ribosome entry siRNA
  • IRES can be used to produce proteins that perform a plurality of different functions from a single transcript.
  • the recombinant lentiviral vector of the present invention can produce TRAIL and CD, respectively, by ligating the TRAIL and CD into IRES and transferring the same into a single transcript.
  • the term "cancer " used in the present invention means a common cancer including both blood cancer and solid cancer.
  • the cancer may be a cancer such as stomach cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, Cancer of the lungs, melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, endometrial cancer, Hodgkin V di sease, brain tumor, sarcoma cancer, esophageal cancer, small bowel cancer, thyroid cancer, prostate cancer, leukemia, lymphoma, bladder cancer, Spinal cord tumors, and spinal cord tumors.
  • a cancer such as stomach cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, Cancer of the lungs, melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, endometrial cancer, Hodgkin V di sease, brain tumor, sarcoma cancer, esophageal cancer,
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier as a kind of cell therapy agent.
  • a pharmaceutically acceptable carrier include those conventionally used in the manufacture of medicines such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, Cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
  • composition of the present invention may further comprise pharmaceutically acceptable additives selected from the group consisting of lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifying agents, suspending agents, preservatives and combinations thereof.
  • the carrier may comprise from about 1 wt.% To about 99.99 wt.%, Preferably from about 90 wt.% To about 99.99 wt.%, Based on the total weight of the pharmaceutical composition of the invention, % To about 20% by weight.
  • the pharmaceutical composition may be prepared by a conventional method, using a pharmaceutically acceptable carrier and May be prepared in unit dose form by formulating it with an excipient or may be prepared by intrusion into a multi-dose container.
  • the formulations may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.
  • Another aspect of the present invention provides the use of a pharmaceutical composition of the present invention for preventing or treating cancer.
  • Another aspect of the invention provides the use of a pharmaceutical composition of the invention for the manufacture of a medicament for the prophylaxis or treatment of cancer.
  • Yet another aspect of the present invention provides a method of preventing or treating cancer as described above, comprising the step of administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • the subject may be a mammal, particularly a human.
  • the administration route and dosage of the pharmaceutical composition can be administered to a subject in various ways and amounts depending on the condition of the patient and the side effects, and the optimal administration method and dose can be selected by a person skilled in the art within a suitable range.
  • the pharmaceutical composition may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances known to have a therapeutic effect on a disease to be treated, or may be formulated in combination with other drugs.
  • the above pharmaceutical composition when the above pharmaceutical composition is administered parenterally, examples thereof include subcutaneous, intraocular, intraperitoneal, intramuscular, oral, rectal, orbital, intracerebral, intracranial, spinal, intracerebral, There is intravenous, intravenous administration.
  • the pharmaceutical composition comprising the TRAIL and CD-expressing mesenchymal stem cells was administered intravenously or intracranially.
  • the above administration may be administered one or more times, one to three times, specifically two doses.
  • they can be administered at intervals of 12 to 48 hours, 24 to 36 hours, and more specifically, every 24 hours. In one embodiment of the invention, it was repeatedly administered at intervals of 24 hours for 7 days.
  • the above administration can be carried out in the case of cells, in an amount of 1 .0 x 10 5 to 1.0 x 10 11 cells per day, specifically, 1 x 10 7 to 1 x 10 9 cell counts on an adult basis. If the dose is high, it may be administered several times a day. 2019/027298 1 »(: 1 ⁇ 1 ⁇ 2018/008901
  • lentiviral vectors each containing the non-calcified genes c-Myc and hTERT were prepared. At this time, a gene construct expressing the tTA protein was inserted together to use the Tet-of-f system.
  • a pBD lentivirus vector was constructed by replacing the EF promoter sequence with the CMV promoter in the expression cassette of the pWPT vector (Addgene, USA), and by adding RSV promoter to the downstream thereof.
  • the pBD lentivirus vector was inserted such that the c-Myc gene (SEQ ID NO: 8) and the thymidine kinase (TK) gene (SEQ ID NO: 6) were linked by IRES and the expression was regulated by the CMV promoter.
  • the constructed vector was designated pBD-1.
  • the hTERT gene (SEQ ID NO: 10) was inserted into the pBD lentivirus vector so that the expression could be regulated by the CMV promoter.
  • genes having resistance to zeocin (ZeoR; SEQ ID NO: 16) was inserted so that expression could be regulated by the RSV promoter.
  • the constructed vector was designated pBD-2.
  • tTA tetracycline transact ivator gene
  • SEQ ID NO: 12 tetracycline transact ivator gene
  • PuroR puromycin
  • the lentivirus containing the non-exonuclease gene was produced by the following method. First, Lenti-X cells (Clontech Laboratories, USA) were inoculated into 150 mm dishes using DMEM medium containing 10% (v / v) FBS, Lt; / RTI > On the other hand, lentiviral vectors were extracted and quantified from DH5a E. coli cells using EndoFree Plasmin Maxi Ki (Qiagen, USA).
  • the cultured Lenti-X cells were washed with PBS, TrypLE TM Select
  • the cells were allowed to stand at 37 [deg.] C for about 5 minutes before the cells were desorbed.
  • the desorbed cells were neutralized by the addition of DMEM medium supplemented with 10% (v / v) FBS at 7 mO.
  • the neutralized cells were collected in a 50 M tube and centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes.
  • the supernatant was removed and cells were resuspended by adding 10 M of DMEM culture medium containing 10% (v / v) FBS.
  • the resuspended cells were counted with a hematocytometer and then dispensed into 1.2 ⁇ 10 7 cells in a 150 mm dish.
  • lentivirus concentrator LidiX concentrator, Clontech Laboratories, USA
  • the virus was centrifuged at 4 ° C and 4,000 rpm for 2 hours to obtain virus.
  • the resulting virus was resuspended in 0.5 M DMEM without FBS.
  • lentiviruses produced from pBD-1, pBD-2 and pBD-3 lentivirus vectors were prepared at concentrations of 4.0 x 10 8 TU / M, 2.0 x 10 s TU / M and 1.2 x 10 9 TU / iM, respectively.
  • Immortalized MSCs were prepared using lentiviruses containing the immortalized genes produced in Example 1.2. Above.
  • bone marrow-derived MSCs were prepared by the following method. Specifically, a bone marrow aspirate was obtained from the iliac crest of a healthy donor. It was mixed with 20 IU / M heparin in a sterile container to inhibit coagulation. The bone marrow mixture was centrifuged at 4 ° C and 739 RCF for 7 minutes, then the supernatant was removed and mixed with 10 volumes of sterilized water. The cells were centrifuged again under the same conditions to obtain a cell suspension.
  • the obtained pellet was suspended in DMEM-low glucose 11885-084 (Gibco, USA) medium containing 20% (v / v) FBS and 5 ng / m 2 of b-FGF (100-18B, Peprotech, USA) And dispensed into culture flasks. It was incubated at 37 ° C, 5% CO 2 for 24-48 hours and then replaced with fresh medium. Subsequently, the cells were subcultured by replacing them with new medium at intervals of 3 days to 4 days. After 2 weeks of culture, the cells were analyzed by using a fluorescence cell analyzer (FACS).
  • FACS fluorescence cell analyzer
  • the selected cells were infected with 100 M (l) of pBD-3 lentivirus vector. After infection, cells infected with pBD-3 lentivirus were selected by adding 1 // g / m simulated puromycin to the culture of the stabilized cells.
  • FIG. 1 shows the cell proliferation rate according to the presence or absence of MSC.
  • the MSC cells infected with lentiviruses containing the immortalized genes c-Myc and hTERT retained high cell proliferation rates even after 120 days of culture.
  • the cell proliferation rate of normal MSC cells decreased rapidly after 40 days of culture.
  • Example 2.1 Construction of Lentivirus Vector Containing TRAIL and CD Gene
  • the TRAIL gene (SEQ ID NO: 2) and the CD gene (SEQ ID NO: 4) were inserted into the pBD lentivirus vector prepared above.
  • the inserted TRAIL and CD genes were linked by IRES (internal ribosome entry si te), and their expression was regulated by the TRE promoter.
  • IRES internal ribosome entry si te
  • I law S is a ribosome binding site that allows translattion to begin without the 5'-cap structure, allowing two proteins to be expressed in one _A.
  • the TRE promoter can regulate the expression of the gene linked to the promoter depending on the presence or absence of doxycyclin (631311, Clontech, USA).
  • the constructed vector was named pBD-4, and the structure of the gene construct is shown in Fig.
  • Example 2.2 Production of lentiviruses containing IEAIL and CD genes Lentiviruses were produced in the same manner as described in Example 1.2. Above using lentiviral vectors containing the TRAIL and CD genes prepared in Example 2.1. The lentivirus produced was prepared at a concentration of 7.6 ⁇ 10 8 TU / M.
  • Example 1.3 The immortalized MSC prepared in Example 1.3. Above was infected with lentivirus containing the TRAIL and CD gene produced in Example 2.2, and MSCXBM-03 expressing TRAIL and CD among the infected MSCs Respectively. Infection was carried out in the same manner as described in Example 1.3.
  • Example 3.1 MSC transfection with lentiviruses including TRAIL and CD genes
  • the immortalized MSCs were infected with lentivirus containing TRAIL and CD genes, and then 1 g / M of doxycycline was added to the culture medium of the stabilized cells to inhibit the expression of TRAIL and CD. After the cells were stabilized, TRAIL and CD were induced by culturing in a culture medium in which toxin was removed for 72 hours. FACS was performed on the cells to select TRAIL-expressing cells on the cell surface. 2019/027298 1 »(1 ⁇ 1 ⁇ 2018/008901 Specifically, was dispensed such that the number of TRAIL and 5x10 s cells per MSC were infected with lentivirus containing the CD gene FACS tube.
  • the FACS tube was then centrifuged at 4 ° C for 5 minutes at 1,500 rpm to remove supernatant.
  • the cells were resuspended by adding 1 ml of FACS buffer (PBS containing fetal bovine serum), and the supernatant was removed by centrifugation under the same conditions. The above washing procedure was performed one more time and the cells were resuspended in 1 M FACS buffer.
  • FACS buffer PBS containing fetal bovine serum
  • FACSCLSRFortessa BD biosciences, USA
  • cells expressing TRAIL were selected.
  • the selected cells were cultured to form colonies.
  • Cells of a single clone were cultured from the formed colonies to establish a cell line and designated BM-03.
  • the cell line BM-03 was deposited with KCTC 13182BP on Jan. 6, 2017 to the BRC of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology.
  • the BM-03 cell line of the present invention expresses CD90, CD44, CD105, and CD73 surface antigen proteins in 95% or more and expresses CD34, CD1B, CD19, CD45 2019/027298 1 (1) ⁇ 2018/008901 and HLA-DR were expressed in less than 1%.
  • the expression ratio of surface markers was found to be in a wide range (6090%) according to the cell population (data not shown). This surface antigen protein expression was compared with the heterogeneous bone marrow-derived BM-MSC, indicating that the cell line of the present invention exhibited homogenous characteristics.
  • BM-03 cells were seeded in 12-well plates at a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 in order to confirm the differentiation potential into adipocytes.
  • the suspension was suspended at a concentration of 1.6 ⁇ 10 7 cells / M, 5 of which was seeded in 24 wells and cultured for 2 hours.
  • the chondrogenic differentiation medium (StemPro® cartilage formation differentiation kit, Thermo fisher Scientific, A10071-01) 500 was added, and the cells were replaced for 3 days and cultured for 14 days. After the culture, the medium was removed and the pellet was taken out from the dish by DPBS. After cryosection, the cells were stained with Alcian Blue and confirmed with a microscope.
  • Experimental Example 2.1 Experimental Example 2.1 < tb >< tb > The results are shown in Fig.
  • the thus-established cell line, 8103 specimen was thawed at 37 ° C for 1 minute in a constant temperature water bath, and 15 After the cells were transferred to a tube, the cells were subjected to cell lysis for 5 minutes at 1,500 ° C. After completely removing Table 3, the pellet was suspended and transferred into a 1.5-mm tube with 200 1 moles. 331 (?, 740952.250) was prepared, and the mixture was prepared as shown in Table 1 below. At this time, 100 positive 31-03 plasmids were used as a positive control and 1 purified water was added as a negative control.
  • CD gene expression level Three BM-03 cell lines (Lot # l, Lot # 2, Lot # 3) were used for qRT-PCR analysis for preclinical studies. 1 fragment of the BM-03 cell line was used for RT-PCR. For qPCR for quantification, the standard curve was generated by serially diluting the DNA of the BM-03 cell line used in the production of lentivirus.
  • the average of the TRAIL RNA detected by the Lot # l, Lot # 2 Lot # 3 and BM- 03 cell line was 6.22x l0 7 copies
  • CD RNA is total RNA 1 // lt; 7 > copies per gram.
  • EXPERIMENTAL EXAMPLE 4 Confirmation of Expression of TRAIL and CD Protein in Transfected Cell Lines Expression of TRAIL and CD proteins was induced in the BM-03 cell line established in Example 3.1 above by the same method as in Example 3.1. To confirm the expression of TRAIL according to the presence or absence of doxycycline. After that, expression of CD protein was confirmed in the cell line in which TRAIL expression was confirmed.
  • the BM-03 cell line was subcultured in a T75 flask for 5x10 < s > cells using DMEM medium containing 10% (v / v) FBS with or without the presence of Doxanthin / M.
  • Cells were obtained after 3 days of culture. Cells were counted and 5x10 5 cells were stained with PE ant i-human CD253 (TRAIL) antibody (BioLegend, 308206), PE Mouse IgGl and K Isotype Control Antibody (BioLegend, 400112).
  • TRAIL PE ant i-human CD253
  • TRAIL As shown in FIG. 6, when TRAIL was not expressed by adding doxycycline, it was confirmed that TRAIL was expressed in the BM-03 cell line cultured in the medium in which doxycycline was removed. Further, as shown in FIG. 7, when CD protein was expressed, it was found that cells were killed by 5-FC. That is, 2019/27298 1 (): 2018/008901 protein, and thus the TRAIL protein and the CD protein were expressed in the prepared mesenchymal stem cells, and the Tet-of f System. ≪ / RTI >
  • FACS was used to analyze the proportion of BM-03 cell lines expressing TRAIL, CCR2 and CXCR4. Specifically, in FACS Buf fer (PBS containing 2% fetal bovine serum) containing the antibody described in Table 3 below, cells were incubated at 4 ° C
  • FACS analysis was performed using an LSR Fortessa TM cell analyzer (BD Biosciences) and analyzed with f lowJo_V10 or BD FACS Diva software.
  • U-87MG-Luc cells Human glioma cell line U-87MG cells were obtained from the American Type Culture Collection and cultured in DMEM medium supplemented with 10% (v / v) FBS at 37 ° C and CO 2 5% .
  • U-87MG-Luc cells which express U-87MG cells stably expressing Luc, were prepared by transfecting the U-87MG cells with lentivirus containing a gene encoding firefly luciferase (Luc). After that,
  • U-87MG-Luc cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% (v / v) FBS at 37 ° C, CO 2 5% The cells were cultured under the conditions of 2019/027298 1: 1 ⁇ ⁇ 2018/008901.
  • mice were anesthetized intraperitoneally with ketamine 8 ylazine to intracranial xenografts of the U-87MG-Luc cells in 6-week-old male nude mice (Athymic Nude Mouse).
  • the 1 ⁇ 10 5 was resuspended cells may U-87MG-Luc cells in a 3 f d PBS, using a micro-injection pump (microinfusion pump) transferred to a Hamilton syringe (Hami l ton Company, Reno, NV) I took it.
  • micro-injection pump microinfusion pump
  • mice were then stereotactically stimulated to the right frontal lobe or both hemispheres located 2 mm lateral and 1 mm anterior to the bregma at a depth of 2.5 mm from the skull base of the anesthetized mouse ).
  • U-87MG-Luc cells were injected into the mouse in Example 4.1 and mesenchymal stem cells expressing TRAIL and CD 7 days later And injected into tumor cells.
  • BM-03 cells were resuspended in 8 1 PBS, and the tumor cells were cultured in a mouse in which 5-FC at a concentration of 500 mg / kg was injected for 7 days, Respectively.
  • BM-03 cells were injected on days 7, 21, and 35 after U-87MG-Luc cells were injected into the mice.
  • the number of mesenchymal stem cells for 8 f d PBS resuspended and then, 500 mg 5-FC for 7 days injected mice / kg concentration and non-injected mice on Were injected into the existing tumor cells.
  • U-87MG-Luc cells were injected into mice and the amount of in vivo luminescence was measured at a weekly interval from 6 days after the injection by a known method (Kim SM et al., International Journal of Nanomedicine 11: 13-23, 2016). Survival lasted up to 90 days.
  • mice injected with BM-03 cells and 5-FC showed luminescence lower than those of mice administered with control and BM-03 cells alone. Further, as shown in Fig. 13, BM-03 cells and 5-FC The survival of mice was also increased by 2018/008901.
  • Figs. The results of multi-dose administration experiments are shown in Figs. Specifically, as shown in Figs. 14 and 15, tumors of BM-03 cells and mice treated with 5-FC showed a decrease in luminescence signal than that of control tumors. In particular, the emission signals of BM-03 cells and 5-FC injected mice with a concentration of 1 x 10 s cel ls / 8 1 or 5 x 10 5 cel ls / 8 1 were significantly reduced. In addition, as shown in Fig. 16, the survival days of BM-03 cells and 5-FC injected mice with concentrations of 1 ⁇ 10 5 cel ls / 8 1 or 5x10 s cel ls / 8 1 were also dose-dependently increased.
  • the cells were cultured under different conditions in a transwell chamber with a 24-well 8 m pore filter and shown in FIG.
  • the cultured BM-03 cells were separated by treatment with trypsin and then washed. It was then resuspended in serum-free Dulbecco's modified Eagle's medium.
  • the cells in the cell culture incubator for 37 ° C temperature and 5% C0 2 condition were cultured for 48 hours.
  • the transwell chamber was then removed, washed and stained with di f f-quick Ki t (Sysmex).
  • the number of BM-03 cells infiltrating the septum was counted by an optical microscope. In this way, the average cell number per field was calculated to evaluate the ability of BM-03 cells to migrate.
  • BM-03 cell line has excellent ability to migrate to the tumor.
  • the BM-03 cell line was inoculated with the fluorescent material DiDCABD Bioquest, Inc. ) Were labeled to assess mobility to brain tumors. Specifically, the tumor growth site of the glioma-producing mice prepared in Example 4.1 After BM-03 cells transplanted with DiD-labeled cells in the opposite brain, migration of BM-03 cells was observed using IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (PerkinElmer) Respectively.
  • the human glioma cell line U87MG, U373MG or mouse glioma cell line GL26 was cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco) ). Specifically, on the first day of culture, glioma cells of lxlO 5 cells were plated on a 6-well plate. The second day of culture, immortalized neural the middle of gliomas can 2xl0 5 cells to a cell Stem Cells (imMSC) or BM-03 cells 5xl0 5 cells were added. On the fourth day of culture, 5-FC at a concentration of 10 mg / m 2 was treated in each well. On the 6th day of culture, stem cells and glioma cells were harvested and glioma cells were analyzed by FACS.
  • DMEM fetal bovine serum
  • glioma cells As a result, as shown in Fig. 20, about 40% of the glioma cells were killed in the BM-03 cell line treated group. In particular, over 70% of glioma cells were killed when treated with BM-03 and 5-FC. On the other hand, less than 10% of glioma cells were killed in the group treated with immortalized mesenchymal stem cells. In addition, when immortalized mesenchymal stem cells and 5-FC were treated, less than 10% of glioma cells were killed.
  • 8x10 ® cell number / 5 1 (as shown in Figure 22: 0 was increased (about a 25% survival rate of the cells 81-03 test group received single dose.
  • the 31-03 cell line was administered 4 times at 2-week intervals under the same conditions as the single dose, and 5-day administration was also carried out in the same cycle to evaluate the animal test effect through multiple administration.
  • the survival rate of the experimental group which received multiple administration of 8-lane 0 5 cells / 5 1 A 61-03 cells was increased by 25%.
  • KSDA The International Recognition Agency

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Abstract

본 발명은 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 암세포의 세포사멸을 유도함으로써 암세포의 형성 및 전이를 억제한다. 또한, 상기 중간엽줄기세포는 불사화된 중간엽줄기세포로서 높은 세포 증식율을 가지면서, 독시사이클린 처리 유무에 따라 세포 내에서 TRAIL 단백질 및 CD 단백질의 발현을 조절할 수 있기 때문에 도입 유전자의 지속적인 발현으로 인한 비정상적인 분화 가능성이 낮고, 5-FC 처리에 의해 세포사멸이 유도됨으로써 잔존 줄기세포를 제거할 수 있어 안정성이 높다. 뿐만 아니라, TRAIL 및 CD를 동시에 발현하는 세포주의 항암 효과가 우월함을 확인한 바, 본 발명의 약학 조성물은 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 명세서
TRAIL및抑를발현하는중간엽줄기세포를유효성분으로포함하는암의 예방또는치료용약학조성물 기술분야
본 발명은 TRAIL 및 抑를 발현하는중간엽줄기세포를 유효성분으로포함 하는암의 예방또는치료용약학조성물에 관한것이다. 배경기술
TRAIL(Tumor Necrosi s Factor-Related Apoptosi s- Inducing Ligand)은 TNF-연관세포사멸-유도 리간드 단백질로서， 인체 내 세포들의 세포사멸을선택 적으로 유도한다. TRAIL은 세포의 표면에 존재하는 세포사멸 수용체- 4(DR-4) , DR-5, 데코이 (decoy)수용체 또는데코이 수용체- 2와결합하여 세포사멸신호전 달계를 활성화시킴으로써 세포를 선택적으로 사멸시킨다. 하지만， 인간의 모든 신체 조직에서 TRAIL이 발현되는 것은아니다. 인간의 뇌조직에서는 TRAIL이 발 현되지 않고， 대신 신경교세포 (Neurogl ia)가신경염증성 질환 및 세포사멸에 관 여한다 (Dorr J . et a】 .， J Neurosci. , 22(4) :RC209, 2002) .
한편, 신경교세포가암세포화되면 신경교종이 발생하는데， 신경교종은정 상적인 뇌 조직을파괴하고뇌 속을돌아다녀 치료가까다로운 질병으로 알려져 있다. 이러한신경교종을 치료하기 위한치료제 개발에 있어서， TRAIL을 암세포 에 인위적으로발현시키는방법을통해 치료하고자하는시도가이루어지고있으 나, TRAIL을암세포에서 효과적으로발현시키기 어렵다는문제가있다.
한편， CD(cytosine deaminase)는 인체에 무해한 전구약물인 5-FC(5 - f luorocytosineM·세포독성을지닌항암물질인 5-FU(5-f luorouraci l )로전환시 켜 세포사멸을유도한다. 이때， 5-FU는세포밖으로분비되어 주변에 인접한세 포를죽이는주변인 효과 (by-stander ef fect)를나타낸다. 이러한 CD및 5-FC를 이용한항암치료는신경교종을 치료하는데 유용할수 있다. 그러나, 줄기세포의 증식에 한계가있어 시간이 지남에 따라 CD의 발현량이 감소하게 되어 5-FU의 항 암효과가줄어들게 되는문제점이 있다. 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 한편， 전 세계적으로세포를이용한치료방법이 개발되고 있으며， 성체줄 기세포를 이용한 세포치료제에 대해 많은 연구가 진행 중이다. 성체줄기세포인 중간엽줄기세포 (MSC)는뼈, 연골， 근육， 지방， 섬유아세포등으로분화할수 있 는다능성 (mult i potent) 세포이다. 상기 MSC는골수， 제대혈， 지방등다양한성 체조직에서 비교적 쉽게 얻을수 있다. MSC는 염증, 암조직 또는손상부위로 이 동하는 특이성이 있어， 치료 약물을 전달하기 위한 전달체로서도 큰 장점이 있 다. 또한， T세포, B세포, 수지상세포 및 자연살해 세포와같은 면역 세포의 기능을 억제하거나 활성화시켜， 인체의 면역기능을 조절할 수 있다. 그뿐 아니 라, MSC는시험관내 ( in vi tro)에서 비교적 쉽게 배양할수있다는장점이 있다. 이러한특성으로 인해 MSC를세포치료제로 이용하기 위한 연구가활발히 진행되 고있다.
그러나， 이와같은 MSC의 장점에도불구하고, 세포치료제로서 임상에 사 용할수 있는등급의 MSC를 생산하는데 다음과 같은문제가 있다. 첫째, MSC의 증식에는 한계가 있어， 이를 대량으로생산하기 어렵다. 둘째, 수득한 MSC는다 양한종류의 세포가혼합되어 있어, 생산시 동일한효과를유지하기 어렵다. 셋 째， MSC만을이용할경우치료효과가높지 않다.
한편， 대한민국등록특허 제 1585032호에서는하이드로겔에서 배양한중간 엽줄기세포를 함유하는세포 치료제를 개시하고 있다. 상기 문헌에는세포 치료 제로사용하기 위한중간엽줄기세포를 분리하는 공정에서 전처리 과정을단축하 여 바로투여 가능한조성물을 제공하고 있으나， 상기와같은중간엽줄기세포의 문제점 및 이를해소하기 위한방안에 대해서는전혀 언급하고 있지 않다. 따라 서， 세포치료제로사용할수있는안전하고효과적안중간엽줄기세포에 대한연 구가필요한실정이다.
특히， CD를 발현하도록 레트로바이러스를 이용하여 신경줄기세포를 형질 전환시킨 연구가 수행된 바 있다 (Jana Port now et al. , Clinical Cancer Research 23(12) :2951-2960, 2017) . 하지만, 상기 연구에서 사용된 줄기세포는 조직에서 수득한 일반적인 신경줄기세포로서 증식에 한계가 있어 대량 생산하기 어려운문제점이 있다. 그뿐아니라, 신경줄기세포의 증식에 한계로 인해 CD발 현량이 감소하여 완치할정도의 항암효과를기대하기 어렵다. 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 기술적 과제
이에 본 발명자들은 효과적인 암 치료제를 개발하기 위해 연구한 결과， TRAIL및 CD를동시에 발현하는중간엽줄기세포가암의 형성 및 전이를억제하여 항암효과를나타냄을확인함으로써 본발명을완성하였다. 과제 해결수단
상기 목적을달성하기 위하여，
본 발명의 일 측면은， TNF-연관세포사멸-유도 리간드 단백질 (TRAIL) 및 시토신 디아미네이즈 (CD) 단백질을 동시에 발현하도록 형질전환된 중간엽줄기세 포를유효성분으로포함하는암예방또는치료용약학조성물을제공한다.
본 발명의 다른 측면은， 암을 예방또는 치료하기 위한본 발명의 약학 조성물의 용도를제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은， 암 예방또는 치료용 약제를 제조하기 위한 본발명의 약학조성물의 용도를제공한다.
본발명의 또다른측면은， 본발명의 약학조성물을개체에 투여하는단 계를포함하는암을치료하는방법을제공한다. 발명의 효과
본 발명의 TRAIL및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함 하는 암예방또는 치료용 약학조성물은암세포의 세포사멸을유도함으로써 암 세포의 형성 및 전이를억제한다. 또한， 상기 중간엽줄기세포는불사화된중간엽 줄기세포로서 높은세포증식율을 가지면서， 독시사이클린 처리 유무에 따라세 포내에서 TRAIL및 CD단백질의 발현을조절할수 있기 때문에 도입 유전자의 지속적인발현으로인한비정상적인분화가능성이 낮고, 5-FC처리에 의해 세포 사멸이 유도됨으로써 잔존줄기세포를제거할수있어 안전성이 높다. 뿐만아니 라， TRAIL및 CD를동시에 발현하는세포주의 항암효과가매우우월함을확인한 바， 본발명의 약학조성물은암의 예방또는치료에 유용하게사용될수있다. 도면의 간단한설명
도 1은중간엽줄기세포 (MSC)의 불사화유무에 따른세포증식율을비교한 0 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 그래프이다:
imMSC： 불사화된 MSC；
MSC： 불사화되지 않은 MSC；
X축: 배양기간; 및
축: 누적된 PDL.
도 2는 pBD-4 렌티바이러스 벡터에 삽입한 유전자 컨스트럭트의 구성을 도식화한것이다:
TRE: 테트라사이클린 반응요소(tetracycline response elements)를포함 하는프로모터 ;
TRAIL： TNF-연관세포사멸-유도리간드;
IRES： 내부리보좀진입 부위; 및
CD： CD단백질.
도 3은 TRAIL 단백질 및 CD 단백질을 발현하는 MSCXBM-03)에서 CD90, CD44, CD105, CD73표면항원단백질의 발현을확인한도면이다.
도 4는 BM-03세포주가지방생성， 골형성， 또는 연골형성 세포로 분화한 것을통해 형질감염 이후에도다중분화능이 유지되는것을확인한도면이다. 도 5a는기탁세포주인 BM-03세포주에서 TRAIL및 CD의 발현량을확인한 도면이다. 1번 레인은마커, 2번 레인은음성대조군， 3번 레인은 양성대조군， 4 번내지 6번 레인은 BM-03세포주를나타낸다.
도 5b는 기탁세포주인 BM-03세포주에서 TRAIL및 CD의 발현을 정량 역 전사중합효소연쇄 반응 (qRT-PCR)을통해 정량한도면이다.
도 6은 독시사이클린 (Dox) 처리 유무에 따른 BM-03세포주의 TRAIL단백 질발현여부를확인한그래프이다.
도 7은 BM-03세포주에 5-FC를처리 유무에 따른 BM-03세포주의 세포사 멸효과를 FACS를통해 확인한그래프이다.
도 8은 BM-03세포주의 TRAIL, CCR2및 CXCR4의 발현유무를확인한도면 이다.
도 9는 계대 배양하여 수득한 BM-03세포주의 PDL값을측정하여 그래프 로나타낸것이다.
도 10은 BM-03세포주의 핵형을분석한결과를나타낸것이다. 2019/027298 1»（그1^1{2018/008901 도 11은 81-03세포주 주입에 따른종양 형성 억제효과를 인간신경교종 유발마우스를이용해 확인한사진이다.
도 12는도 11의 사진을토대로종양의 크기를측정하여 그래프로나타낸 도면이다.
도 13은 3 -03세포주주입 및 5-的투여에 따른 인간신경교종유발마 우스의 생존일증가를확인한도면이다.
도 14는 농도별 3103 세포주 주입에 따른 종양 형성 억제 효과를 인간 신경교종유발마우스를이용해 확인한사진이다.
도 15는도 14의 사진을토대로종양의 크기를측정하여 그래프로나타낸 도면이다.
도 16은농도별 81-03 세포주주입에 따른 인간신경교종유발마우스의 생존일증가를확인한도면이다.
도 17은트랜스웰챔버를이용한 8¾1-03세포주의 종양이동성을확인하는 실험방법을나타낸도면이다.
도 18은트랜스웰 챔버를 이용한 61-03세포주의 종양이동성을 vi tro 상에서 확인한도면이다.
도 19는신경교종유발마우스를이용하여 요¾1-03세포주의 종양이동성을 111 \^ 0상에서 확인한도면이다.
도 20은 3종류의 신경교종세포에 불멸화된 중간엽줄기세포 011^:5) ,
Figure imgf000007_0001
03세포주및/또는 5-的처리한후， 암세포의사멸정도를확인한도면이다. 도 21은 3종류의 신경교종세포에 불멸화된중간엽줄기세포
Figure imgf000007_0002
또는 8 -03 세포주 및/또는 5-的 처리한후， 줄기세포의 사멸 정도를 나타낸 도면이 다.
도 22는신경교종유발마우스에 8103세포주를단회투여한후신경교종 유발마우스의 생존율을나타낸도면이다.
도 23은신경교종유발마우스에 묘¾!-03세포주를 다회 투여한후신경교 종유발마우스의 생존율을나타낸도면이다. 발명의 실시를위한최선의 형태
이하， 본발명을구체적으로설명한다. 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 본 발명의 일 측면은， TNF-연관 세포사멸-유도 리간드 단백질(TRAIL) 및 시토신 디아미네이즈(CD) 단백질을 동시에 발현하는 형질전환된 세포를 유효성분으로포함하는암예방또는치료용약학조성물을제공한다.
본발명에서 사용하는용어 "TRAIL’이란, TNF-연관세포사멸-유도리간드 단백질로서， TNF패밀리 중 제 2형 막관통단백질을의미한다. 상기 TRAIL은자살 유전자 중 하나로써, 형질전환 세포들의 세포사멸을 선택적으로 유도한다. 구체적으로， 상기 TRAIL은 세 개의 수용체에 결합할 수 있는 호모트리머 (homotrimer) 형태로 존재한다. 상기 TRAIL은 세포 표면에 존재하는 세포사멸 수용체- 4 )R-4)， DR-5, 데코이 (decoy) 수용체 또는 데코이 수용체- 2와 결합하여 세포사멸 신호 전달계를 활성화시킨다. 또한， TRAIL은 정상 세포에 대해서는 독성이 없고, 암세포에서만 특이적으로 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다.
상기 TRAIL은 인간 유래의 단백질일 수 있으며, 서열번호 1의 아미노산 서열을갖는폴리펩티드일수있다. 상기 TRAIL은서열번호 1의 아미노산서열과 약 70%, 80%, 90%또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. TRAIL을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 2로 표시되는 염기서열일 수 있다. 또한, 상기 TRAIL을 코딩하는 유전자는서열번호 2의 염기서열과약 70%, 80%, 90%또는 95%이상의 상동성을 가질수있다.
또한, 상기 TRAIL을코딩하는유전자는 TRAIL의 활성을유지하는 TRAIL의 변이체를 코딩하는 염기서열일 수 있다. 상기 TRAIL의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 또한， 상기 TRAIL의 변이체를코딩하는 염기서열은서열번호 2의 염기서열과 약 70%, 80%, 90%또는 95%이상의 상동성을가질수있다.
본 발명에서 사용하는 용어 ’’CD"란， 시토신 디아미네이즈(cytosine deaminase) 단백질을 의미한다. 또한， 상기 CD는 CD와 UPRKuracil phosphoribosyltransferase)가 결합된 융합단백질의 형태일 수 있으며, 본 명세서에서 CD는 CD::UPRT와혼용될수있다.
또한, 상기 CD는 인체에 무해한 전구약물안 5-FC(5-fluorocytosine)를 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 세포 독성을 지닌 항암물질인 5-FU(5-f luorouraci 1 )로 전환시켜 세포사멸을 유도한다. 이때, 5-FU는 세포 밖으로 분비되어 주변에 인접한 세포를 죽이는 주변인 효과 (by-stander ef fect)를 나타낸다. 따라서， CD를 발현하는세포에 5 - FC를 처리하면 抑를 발현하는 세포 근처에서 5-FU로 인한 암세포의 사멸을 유도할수있다.
또한， 상기 CD를 코딩하는 유전자는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisi ae)의 CDase를 코딩하는 FCY1 유전자와, N- 말단으로부터 35개의 아미노산이 결실된 UPRTase를코딩하는 FUR1A105유전자를 융합하여 코돈최적화 (codon-opt imi zat ion)된서열일 수 있다. 상기 서열은미국 특허 제 5, 338, 678호， 국제특허공개 제 W0 96/16183호 및 국제특허공개 제 W0 99/54481호에 기재된것일수있다.
일 실시예에 의하면, 상기 抑는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 상기 況는서열번호 3의 아미노산서열과 약 70%,80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. CD를 코딩하는 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있다. 구체적으로， 상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 4로 표시되는 염기서열일 수 있다. 또한， 상기 CD을 코딩하는유전자는서열번호 4의 염기서열과약 70%, 80%, 90%또는 95%이상의 상동성을가질수있다.
또한, 상기 CD를코딩하는유전자는 CD의 활성을유지하는 CD의 변이체를 코딩하는 염기서열 일 수 있다. 상기 CD의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열과 약 70%, 80%, 90%또는 95%이상의 상동성을 가질 수 있다. 또한， 상기 CD의 변이체를코딩하는 염기서열은서열번호 4의 염기서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95%이상의 상동성을가질수있다.
상기 세포는 인간배아줄기세포 (human embryonic stem cel l , hES) , 골수줄기세포 (bone marrow stem cel l , BMSC) , 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cel l , MSC) , 인간신경줄기세포 (human neural stem cel l , hNSC) , 윤부줄기세포 ( l imbal stem cel l) 또는 경구점막상피세포 (oral mucosal epi thel ial cel l )일 수 있다. 구체적으로， 상기 세포는 중간엽줄기세포일 수 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901
있다.
또한， 상기 중간엽줄기세포는 불사화된 것일 수 있다. 구체적으로， 상기 중간엽줄기세포는 hTERT및 c-Myc유잔자가도입된것일수있다.
본발명에서 사용하는용어 n형질전환”이란， 유전자전달체와도입방법에 상관없이 외래 유전자를 세포에 도입하여, 도입된 외래 유전자에 의해 세포의 형질이 바뀌는것을의미한다.
상기 형질전환은 TRAIL및 CD와 TRAIL및 CD의 활성을유지하는변이체를 코딩하는유전자를당업계에 공지된 방법을통해 줄기세포에 도입하여 수행될수 있다. 예를 들면， 형질감염 (transfect ion)， 미세주사, 형질도입 (transduct ion) , 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염 ( l iposome-mediated transfect ion) , DEAE 덱스트란-매개된 형질감염 (DEAE Dextran- mediated transfect ion) , 폴리브렌-매개된 형질감염 (polybreneiediated transfect ion) , 전기천공법 (electroporat ion) , 유전자 총 (gene gun) 또는 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한다른공지의 방법에 의해 세포내로도입할수 있다 (Wu et a/. , J. Bio. Chem. , 267:963-967， 1992； Wu and Wu, J. Bio. Chern. , 263: 14621-14624, 1988) . 하지만， 이에 제한되는것은아니다.
상기 용어 "형질감염 (transfect ion)"은, 바이러스 감염 ( infect ion)을 통하여 재조합렌티바이러스벡터에 적재된유전자를전달하는것을의미한다. 구체적으로， 상기 형질전환된 세포는 재조합 렌티바이러스로 형질감염된 것일수있다.
상기 렌티바이러스는 장기간의 잠복기를 특징으로 하는 레트로 바이러스과의 바이러스를 의미한다 . 렌티바이러스는 숙주세포의 DNA 내에 유전정보를 전달할 수 있다. 비분열 세포에서 복제할 수 있는 유전자 전달 벡터의 가장효과적인방법 중하나이다.
상기 형질전환된세포는다음과같은방법으로제조될수있다:
1) 중간엽줄기세포에 hTERT 및 c_Myc 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 1차감염시키는단계;
2) 1차 감염된 중간엽줄기세포에 tTA유전자를 포함하는 렌티바이러스를 2차감염시키는단계;
3) 2차 감염된 중간엽줄기세포에 TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 렌티바이러스를 3차감염시키는단계.
상기 단계 1)에서 hTERT 및 c-Myc는 중간엽줄기세포를 불사화시키는 유전자로서， 상기 hTERT 및 c-Myc 이외에도 불사화 유전자로 알려진 다른 유전자도 사용 가능하다. 일 실시예에 의하면， 상기 hTERT 및 c-Myc 단백질은 각각서열번호 9및 서열번호 7의 아미노산서열을갖는폴리펩티드일 수 있다. 한편， 상기 hTERT 및 c-Myc 단백질을 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 10 및 서열번호 8의 염기서열을갖는폴리뉴클레오티드일수있다.
상기 단계 2)에서 tTA는표적 단백질의 발현을조절할수 있는유전자로， 테트라사이클린 트랜스액티베이터를 의미한다. 본 발명에서 사용된 Tet-off 시스템은， 상기 서술한바와같은방법으로테트라사이클린또는독시사이클린의 존재유무에 따라표적 단백질의 발현을조절할수있다.
상기 단계 2)의 3차 감염은 하나의 벡터에 TRAIL 및 CD 유전자를 모두 포함하는 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 그러나， 본 발명의 다른 측면에서, 상기 TRAIL 및 CD 유전자는 각각의 유전자 컨스트럭트로 제조되어 2개의 렌티바이러스 벡터에 각각 삽입될 수 있다. 즉, TRAIL 단백질을 코딩하는 유전자가 발현되도록 제조된 유전자 컨스트럭트가 삽입된 재조합 렌티바이러스 벡터와 CD단백질을코딩하는유전자가발현되도록 제조된 유전자 컨스트럭트가 삽입된 재조합 렌티바이러스 벡터가 3차 감염에 사용될수있다.
상기와 같은 방법으로 제조된 형질전환된 중간엽줄기세포를 BM-03으로 명명하고, 이를 2017년 1월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCTC 13182BP로기탁하였다.
상기 재조합 렌티바이러스는 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터， 패키징 플라스미드 및 엔벨로프 (envelope) 플라스미드로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를 분리하는단계를통하여 수득할수있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "패키징 플라스미드 (packaging plasmid)" 및 ’’엔벨로프 플라스미드 (envelope plasmid)”이란, 렌티바이러스 벡터로부터 렌티바이러스를 효율적으로 생산하기 위해 사용되는 플라스미드 또는 단리된 핵산을의미한다. 상기 패키징 플라스미드 및 엔벨로프플라스미드는본발명의 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 재조합 렌티바이러스 벡터로부터 재조합 렌티바이러스를 효율적으로 생산하기 위해 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터와 함께 사용될 수 있다. 이러한 구조물은 숙주세포에서 렌티바이러스 벡터를 제조하고， 이를 패키.징하는데 유용한요소들을함유한다. 상기 요소로는 gag전구체와같은구조단백질; po l 전구체와 같은 프로세싱 단백질; 프로테아제， 외피 단백질, 및 숙주세포에서 단백질을 제조하고 렌티바이러스 입자를 생산하는데 필요한 발현 및 조절 신호 등을포함할수있다.
재조합 렌티바이러스의 생산에는 Cl ontech Laborator i es사의 Lent i -X Lent i vi ral Express i on System이나， Addgene사에서 제공하는 패키징 플라스미드 (예를 들어， pRSV-Rev , psPAX , pCl -VSVG , pNHP 등) 또는 엔벨로프 플라스미드 (예를 들어， pMD2. G , pLTR-G , pHEF-VSVG 등) 또는 공지의 서열을 이용하여 합성한플라스미드벡터를사용할수있다.
본 발명에서 사용하는 용어 ”렌티바이러스 벡터"란， 레트로바이러스의 일종으로, 단일가닥 RNA 형태의 벡터를 의미한다. 상기 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 트랜스퍼 벡터와 혼용하여 지칭되기도 한다. 상기 렌티바이러스 벡터는감염 대상인 세포의 게놈 DNA에 삽입되어 안정되게유전자를발현시키며, 분열세포 및 비분열세포에 유전자를 전달할 수 있다. 상기 벡터는 인체의 면역반응을 유도하지 않기 때문에 발현이 지속적이다. 또한, 종래에 사용되는 바이러스 벡터인 아데노바이러스 벡터에 비하여 큰 사이즈의 유전자도 전달 가능한이점이 있다.
상기 재조합 렌티바이러스 벡터는 TNF-연관 세포사멸-유도 리간드 단백질 (TRAIL) , 및 시토신 디아미네이즈 (CD) 단백질을코딩하는유전자를포함할 수있다.
또한, 상기 재조합 렌티바이러스 벡터는 티미딘인산화효소 ( thymidine kinase , TK) , CCR2또는 CXCR4단백질을코딩하는유전자를더 포함할수 있다. 상기 는 ATP의 Y위치의 인산을 티미딘에 결합시켜 티미딜산 생성반응을 촉매하는효소로, 이로인해 티미딘은삼인산형태로변형된다. 변형된티미딘은 DNA 복제에 사용될 수 없다. 따라서， 이를 포함하는 세포의 사멸을 유도하는 것으로알려져 있다. 상기 TK단백질은공지된 서열이라면 모두사용가능하다. 일 실시예에 의하면， 상기 는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 폴리펩티드일 수 있다. 상기 TK를 코딩하는 유전자는 서열번호 5로 표시되는 아미노산서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며， 상기 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 6으로 표시되는 염기서열일 수 있다.
상기 CCR2단백질은공지된서열이라면모두사용가능하다. 일실시예에 의하면， 상기 CCR2는서열번호 19의 아미노산서열을갖는폴리펩티드일수있다. 상기 CCR2를 코딩하는 유전자는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며， 상기 서열번호 19로표시되는아미노산서열을 코딩하는염기서열은서열번호 20으로표시되는염기서열일수있다.
상기 CXCR4 단백질은 공지된 서열이라면 모두 사용 가능하다. 상기 CXCR4는 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 CXCR4를 코딩하는 유전자는 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 상기 서열번호 21로표시되는 아미노산서열을코딩하는 염기서열은서열번호 22로표시되는염기서열일수있다.
상기 CCR2 및 CXCR4 단백질은 본 발명의 중간엽줄기세포의 암세포 이동성을 증가시켜 치료 효능의 증대를 가져올 수 있다. 이러한 특징을 갖는 동일한세포주를대량으로생산할수있어상업적 치료제로서 개발이 가능하다. 본 발명의 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포는 CD, TRAIL, CCR2, CXCR4, CD90, CD44, CD105 및/또는 CD73 단백질을 발현하는 세포주일 수 있다. 특히, 이러한 세포주는 FACS분석법을 통해 측정할 경우, TRAIL단백질을 80% 이상발현하고, CCR2및 CXCR4를 90%이상발현하는세포주일수있다.
또한， 상기 세포주는 CD90, CD44, CD105및/또는 CD73단백질을발현하는 세포주일 수 있다. 구체적으로， 상기 세포주는 CD90, CD44 및 CD105 단백질을 발현하는세포주일수있다. 또한, 상기 세포주는 CD90, CD105및 CD73단백질을 발현하는세포주일수있다. 또한， 상기 세포주는 CD44, CD105및 CD73단백질을 발현하는 세포주일 수 있다. 또한, 상기 세포주는 CD90, CD44， CD105 및 CD73 단백질을발현하는세포주일수 있다. 특히 이러한세포주는 FACS분석법을통해 측정할 경우， CD90, CD44, CD105 및/또는 CD73 단백질을 90% 이상， 95%, 96%, 97% , 98%, 또는 99%이상발현하는세포주일수있다.
한편， 본발명의 TRAIL및 CD를발현하는중간엽줄기세포는 CD34, CDllb, 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901
CD19, CD45 및 HLA-DR단백질을 발현하지 않는 세포주일 수 있다. 구체적으로， 상기 TRAIL및 CD를발현하는중간엽줄기세포는 FACS분석법을통해 측정할경우， CD34, 抑 lib, CD19, CD45및 HLA-DR단백질을 10%, 5%, 3%, 2%, 또는 1%이하로 발현하는세포주일수있다.
바람직하게, 본 발명의 중간엽줄기세포는 TRAIL, CD(cytosine deaminase) , CCR2, CXCR4 단백질을 발현하면서， 세포 표면 마커로서 CD90, CD44, CD105 및 CD73 단백질을 발현하고 (FACS 분석법으로 측정하여 95% 이상)， CD34, CDllb, CD19, 抑 45 및 HLA-DR 단백질은 발현하지 않는 (FACS 분석법으로 측정하여 1% 미만)세포주일수있다.
본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터는 1또는 2개의 프로모터를포함할 수 있다. 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스 (CMV) , 호흡기세포융합바이러스 (RSV) , 인간성장인자 -1알파 (human elongat ion factor-1 alpha, EF-1 a ) 또는 TRE(tetracycl ine response elements)프로모터일수 있다. 일 실시예에 의하면， 재조합 렌티바이러스 벡터는 1개의 프로모터에 의해서 TRAIL 단백질 및 CD 단백질의 발현을 조절할 수 있다. 상기 프로모터는 발현시키고자하는단백질을코딩하는유전자에 작동가능하게 연결될수있다. 일실시예에 의하면， 상기 TRAIL및 CD는 TRE프로모터에 연결될수있다. 상기 TRE 프로모터는 tTA(tetracycl ine transact ivator) 단백질에 의하여 프로모터와 연결된 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있다. 구체적으로, tTA 단백질은 테트라사이클린 (tetracycl ine) 또는 독시사이클린 (doxycycl ine)이 존재하지 않을 때 TRE 프로모터에 결합하여 전사를 활성화시키고, 이들이 존재하는경우에는 TRE프로모터에 결합하지 못하여 전사를활성화시키지 못한다. 따라서， TRAIL 단백질 및 CD 단백질의 발현은 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 첨가여부에 의해조절될수있다.
상기 용어 ’’작동가능하게 연결된"은특정 폴리뉴클레오티드가그기능을 발휘할 수 있게 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 것을 의미한다. 즉， 특정 단백질을 코딩하는 유전자가 프로모터에 작동가능하게 연결되었다는 것은 당해 프로모터의 작용에 의해 mRNA로 전사되고 당해 단백질로 번역까지 될 수 있게 연결되었다는것을의미한다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터에서 하나의 프로모터에서 두 개 이상의 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901
유전자가 전사되도록 연결된 경우， 상기 하나의 전사체로부터 각각의 단백질이 발현될수있게 내부리보좀진입 부위 (IRES)를포함할수있다.
상기 "내부 리보좀 진입 부위 ( internal r ibosome entry si te, IRES) "는 진핵생물의 단백질 합성과정에서, 5’-캡 구조 대신 전사체의 중간부위에서부터 번역이 가능하도록 기능을하는 핵산서열을의미한다. IRES를 이용하여 하나의 전사체로부터 복수의 다른 기능을 수행하는 단백질을 생산할 수 있다. 일 실시예에 의하면， 본발명의 재조합 렌티바이러스 벡터는 TRAIL및 CD를 IRES로 연결하여 하나의 전사체로 전사시킨 후， 이로부터 각각의 단백질을 생산할 수 있다.
본발명에서 사용하는용어 "암”이란, 혈액암및 고형암을모두포함하는 일반적인 암을 의미한다. 상기 암은 위암, 결장암， 유방암, 폐암， 비소세포성폐암， 골암, 췌장암， 피부암， 두부 또는 경부암， 흑색종， 자궁암， 난소암， 직장암, 자궁내막암, 호지킨병 (Hodgkin V di sease) , 뇌종양, 육종암， 식도암， 소장암， 갑상선암， 전립선암， 백혈병, 림프종， 방광암， 중추신경계 종양 및 척수종양으로구성된군으로부터 선택되는어느하나일수있다.
상기 약학 조성물은 일종의 세포치료제로서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 담체는 약품 제조시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스， 덱스트로스， 수크로스， 솔비톨， 만니톨， 전분, 아카시아고무, 인산칼슘， 알기네이트, 젤라틴， 규산칼슘， 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈， 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스， 메틸하이드록시벤조에이트， 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘， 미네랄오일등을포함할수있다.
또한, 본발명의 약학조성물은윤활제， 습윤제， 감미제， 향미제， 유화제， 현탁제， 보존제 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 약학적으로 허용가능한첨가제를추가로포함할수있다.
상기 담체는본발명의 약학조성물총중량을기준으로약 1중량%내지 약 99.99 중량%， 바람직하게는 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있으며， 상기 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%로포함될수있다.
상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따라， 약학적으로 허용되는 담체 및 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나， 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액， 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제 또는 캅셀제 형태일수도있으며， 분산제또는안정화제를추가로포함할수있다. 본 발명의 다른 측면은， 암을 예방또는 치료하기 위한본 발명의 약학 조성물의 용도를제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은， 암 예방또는 치료용 약제를 제조하기 위한 본발명의 약학조성물의 용도를제공한다.
또한， 본 발명의 또 다른 측면은, 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는， 상기 서술한 바와 같은 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수있다. 상기 약학조성물의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고， 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가적절한범위로선택할수 있다. 또한, 상기 약학조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나， 다른약물과의 조합제제 형태로제형화될수있다.
상기 약학 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우， 그 예로는 피하, 눈， 복강내， 근육 내， 구강， 직장, 안와내, 뇌 내, 두개 내 (intracranial ) , 척추 내， 뇌실 내， 수강막 내， 비 내, 정맥 내 투여가 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포를 포함하는 약학 조성물을뇌실내또는두개뇌 투여하였다.
상기 투여는 1회 이상， 1 내지 3회 투여될 수 있고， 구체적으로 2회로 나누어 투여될 수 있다. 이를 반복투여하는 경우에는 12 내지 48시간， 24내지 36시간간격으로투여할수있고， 구체적으로는 24시간간격으로투여할수있다. 본발명의 일실시예에서는， 24시간간격으로 7일동안반복투여하였다.
또한， 상기 투여는 세포의 경우, 성인 기준 1일 l.OxlO5 내지 l.OxlO11 세포수， 구체적으로 l.OxlO7 내지 l.OxlO9 세포수의 양으로 투여될 수 있다. 투여량이 많은경우에는하루에 수회에 걸쳐투여될수있다. 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901
발명의 실시를위한형태
이하， 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐， 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은아니다.
실시예 1. 불사화된중간엽줄기세포（MSC）의 제조
실시예 1.1. 불사화유전자를포함하는렌티바이러스벡터의 제조
MSC를 불사화시키기 위하여， 불사화 유전자인 c-Myc 및 hTERT를 각각 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제조하였다. 이때, Tet-of f 시스템을 사용하기 위해 tTA단백질을발현하는유전자컨스트럭트를함께삽입하였다.
먼저， pWPT벡터（Addgene， 미국）의 발현 카세트내에 EF프로모터 서열을 CMV 프로모터로 치환하고， 그 하위에 RSV 프로모터를 추가 연결하도록 디자인하여 합성함으로써（바이오니아） pBD렌티바이러스벡터를제작하였다. 상기 pBD 렌티바이러스 벡터에, c-Myc 유전자（서열번호 8） 및 티미딘 인산화효소（thymidine kinase , TK） 유전자（서열번호 6）를 IRES로 연결하여 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될수있도록삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD- 1로명명하였다.
한편, pBD 렌티바이러스 벡터에， hTERT 유전자（서열번호 10）를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 여기에, 지오신（zeoc in）에 대한 저항성을 갖는 유전자（ZeoR; 서열번호 16）는 RSV 프로모터에 의해 발현이 조절될수있도록삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD- 2로명명하였다.
또한, pBD 렌티바이러스 벡터에, tTA（tetracycl ine transact ivator） 유전자（서열번호 12）를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 여기에 퓨로마이신（puromycin）에 대한저항성을갖는유전자（PuroR; 서열번호 14）는 RSV프로모터에 의해 발현이 조절될수 있도록삽입하였다. 상기 제작된벡터는 pBD-3으로명명하였다.
실시예 1.2. 불사화유전자를포함하는렌티바이러스의 생산
상기 실시예 1.1.에서 제작된 렌티바이러스 벡터를 이용하여， 다음과 같은방법으로불사화유전자를포함하는렌티바이러스를생산하였다. 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 먼저， 렌티 -X 세포（Clontech Laborator ies , 미국）는 10%（v/v） FBS가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 150 mm 디쉬（dish）에 배양하였다. 한편, 렌티바이러스벡터는 EndoFree Plasmin Maxi Ki t（Qiagen, 미국）를사용하여 DH5a 대장균세포로부터 추출및정량하였다.
상기 배양된 렌티 -X 세포를 PBS로 세척한 후, 3
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TrypLE™ Select
CTS™（Gibco, 미국）을첨가하였다. 세포를 37°C온도에서 약 5분동안방치한뒤， 세포가 탈착된 것을 확인하였다. 탈착된 세포를 7 m오의 10%（v/v） FBS가포함된 DMEM 배지를 첨가하여 중화시켰다. 중화된 세포는 50 M 튜브에 모아서 1 , 500 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 10 M의 10%（v/v） FBS가 포함된 DMEM 배양배지를 첨가하여 세포를 재현탁하였다. 재현탁한 세포는 헤마토사이토미터로 그 수를 측정한 뒤， 150 mm 디쉬에 1.2xl07개의 세포가 되도록분주하였다.
상기 분주된 세포의 세포 포화도가 약 90% 정도로 배양되었을 때, 12 용의 렌티바이러스 벡터， 12 용의 psPAX（Addgene : gag-pol 발현, 패키징 플라스미드）서열을 합성하여（바이오니아） 확보된 SL-PACK 플라스미드 및 2.4 / 의 pMD.G 플라스미드（Addgene; VSVG 발현, 엔벨로프 플라스미드）를 합성하여（바이오니아） 확보된 SL-ENV 플라스미스 혼합물을 상기 세포에 형질도입하였다. 형질도입을돕기 위해， 리포펙타민（Invi trogen， 미국）과플러스 리에이전트（Invi trogen, 미국）를 사용하였다. 형질도입 6시간 후, 10%（v/v） FBS가 포함된 DMEM으로 배지를 교환하였다. 이를 48시간 동안 배양한 뒤， 상층액을모았다.
상기 수득된 상층액을 렌티바이러스 농축키트（Lent i-X concentrator , Clontech Laborator ies , 미국）와 혼합한 후, 4°C 온도에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이를 4°C 온도, 4 ,000 rpm의 조건으로 2시간 동안 원심분리하여 바이러스를 수득하였다. 수득된 바이러스를 FBS가 포함되지 않은 0.5 M의 DMEM에 재현탁하였다. 그결과, pBD-1 , pBD-2및 pBD-3렌티바이러스벡터로부터 생산된 렌티바이러스를 각각 4.0xl08 TU/M , 2.0x10s TU/M 및 1.2xl09 TU/iM의 농도로준비하였다. 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 실시예 1.3. 불사화된 MSC의 제조
상기 실시예 1.2.에서 생산된 불사화유전자를 포함하는 렌티바이러스를 사용하여， 불사화된 MSC를제조하였다.
먼저， 골수유래 MSC를 다음과 같은 방법으로 준비하였다. 구체적으로， 건강한 공여자 (donor)의 장골능 ( i l i ac crest)에서 골수천자액 (bone marrow aspirate)을수득하였다. 이를멸균콘테이너에서 20 IU/M의 헤파린과혼합하여 응고를억제하였다. 상기 골수혼합액을 4°C온도, 739 RCF의 조건으로 7분동안 원심분리한후， 상층액을 제거하고， 10배 부피의 멸균된 물과혼합하였다. 이를 동일한조건으로다시 원심분리하여 세포의 될렛을수득하였다.
수득된 펠렛을 20%(v/v) FBS 및 5 ng/m£의 b-FGF(100-18B, Peprotech, 미국)가 포함된 DMEM-low glucose 11885-084, Gibco , 미국) 배지에 현탁하여 배양플라스크에 분주하였다. 이를 37°C온도， 5% C02조건에서 24내지 48시간 동안배양한뒤， 새로운배지로교체하였다. 이를 3일 내지 4일 간격으로새로운 배지로 교체하면서 계대 배양하였고， 배양 2주 후 형광세포분석기 (FACS)를 사용하여 MSC여부를확인하였다.
상기 실시예 1.2.에서 생산된 p抑- 1 렌티바이러스로 상기 준비된 MSC를 레트로넥틴 (Retronect in， Clontech Laborator ies, 미국)을 사용하여 100 MC)I로 감염시켰다. 감염된 세포에 동일한 방법으로， pBD-2 렌티바이러스 벡터를 100 이로 감염시켰다. 감염 후， 안정화된 세포의 배양액에 500 Ag/mC의 지오신을 첨가하여 pBD-2렌티바이러스가감염된세포를선별하였다.
상기 선별된 세포에 pBD-3 렌티바이러스 벡터를 100 M()I로 감염시켰다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 1 //g/m모의 퓨로마이신을 첨가하여 pBD-3 렌티바이러스가감염된세포를선별하였다.
MSC의 불사화 유무에 따른 세포 증식율을 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타나는 바와 같이， 불사화 유전자인 c-Myc 및 hTERT를 포함하는 렌티바이러스에 의해 감염된 MSC 세포는， 배양 120일 이후에도 높은 세포 증식율을유지하였다. 반면, 정상 MSC세포는배양 40일 이후에는세포증식율이 급격히 감소하였다. 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 실시예 2. TRAIL및 CD유전자를포함하는렌티바이러스의 제작
실시예 2.1. TRAIL및 CD유전자를포함하는렌티바이러스벡터의 제작 상기 제작된 pBD 렌티바이러스 벡터에， TRAIL유전자 (서열번호 2) 및 CD 유전자 (서열번호 4)를 삽입하였다. 이때， 삽입된 TRAIL 및 CD 유전자가 IRES( internal r ibosome entry si te)로 연결되고， TRE 프로모터에 의해 발현이 조절되도록 하였다. I則: S는 리보좀 결합부위로， 5’-캡 구조가 없어도 번역 (trans lat ion)이 시작될수있도록하여， 하나의 _A에서 두개의 단백질이 발현될수있게 한다. 한편， TRE프로모터는독시사이클린 (doxycycl ine， 631311, Clontech, 미국)의 첨가유무에 따라상기 프로모터와 연결된 유전자의 발현을 조절할수있다.
상기 제작된 벡터는 pBD-4로명명하였고， 그유전자컨스트럭트의 구조를 도 2에 나타내었다.
실시예 2.2. IEAIL및 CD유전자를포함하는렌티바이러스의 생산 상기 실시예 2.1.에서 제작된 TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 이용하여， 상기 실시예 1.2.에 기재된 바와 동일한 방법으로 렌티바이러스를 생산하였다. 생산된 렌티바이러스는 7.6xl08 TU/M의 농도로준비하였다.
실시예 3. TRAIL및 CD를발현하는 MSC의 제조
상기 실시예 1.3.에서 제조한 불사화된 MSC에， 상기 실시예 2.2.에서 생산한 TRAIL및 CD유전자를포함하는렌티바이러스를감염시킨후, 감염된 MSC 중 TRAIL 및 CD를 발현하는 MSCXBM-03)를 선별하였다. 감염은 실시예 1.3.에 기재된바와동일한방법으로수행하였다.
실시예 3.1. TRAIL 및 CD유전자를 포함하는 렌티바이러스를 이용한 MSC 형질감염
상기 불사화된 MSC에 TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 감염시킨 후， 안정화된 세포의 배양액에 1 g/M의 독시사이클린을 첨가하여 TRAIL 및 CD의 발현을 억제시킨 상태로 배양하였다. 세포가 안정화된 후， 독시사이클린을 제거한 배양 배지에서 72시간 동안 배양하여 TRAIL 및 CD의 발현을유도시켰고, 상기 세포로 FACS를수행하여 세포표면에 TRAIL을발현하는 세포를선별하였다. 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 구체적으로, TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스로 감염시킨 MSC를 FACS 튜브 당 5x10s 세포수가 되도록 분주하였다. 그 후, 상기 FACS 튜브를 4°C 온도에서, 1,500 rpm의 조건으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 여기에 1 m요의 FACS 완충액 (¾ 우태아 혈청이 포함된 PBS)을 첨가하여 세포를 재현탁하고, 동일한 조건으로 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 상기의 세척 과정을 1회 더 수행한 뒤, 1 M의 FACS 완충액에 세포를재현탁하였다.
재현탁한 세포에 200 의 FACS완충액에 0.3 의 LIVE/DEAD® Fixable
Near-IR Dead Cel l Stain(Li fe Techno 1 ogi es-Mo 1 ecu 1 ar Probes , 미국) 및 5 의 항- TRAIL항체인 APC ant i -human CD253항체 (BioLegend, Cat#. 308210， 미국)를 첨가한 혼합물을 첨가하여， 4°C 온도에서 30분간 반응시켰다. 반응 후， 상기와 같은방법으로세포를 2회 세척하였고, 상층액을제거하였다.
그 후, 2%(v/v) 포름알데히드 및 l%(v/v) FBS를 PBS에 첨가하여 고정 완충액 (f ixing buf fer)을 제조하였다. 세척된 세포에 300 의 고정 완충액을 첨가하고， 4°C 온도에서 최소 15분 동안 반응시켰다. 상기 세포를
FACSCLSRFortessa, BD biosciences, 미국)기기로 분석하여， TRAIL을 발현하는 세포를선별하였다.
또한， 상기 선별된 세포가 콜로니를 형성하도록 배양하였다. 형성된 콜로니로부터 단일클론의 세포를 배양하여 세포주를 확립하고 이를 BM-03이라고 명명하였다. 세포주 BM-03은 2017년 1월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 13182BP로기탁하였다.
실험예 1. 형질전환된세포주에서 표면항원단백질발현확인
TRAIL 및 CD를 발현하는 BM-03 세포주의 표면항원 단백질 발현을 인간 MSC분석 키트 (Stemf lowTM, Cat No 562245， BD)를 이용하여 분석하였다. 실험은 각 키트에 포함되어 있는 매뉴얼에 따라 수행되었고, 실험 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 BM-03 세포주는 CD90, CD44, CD105, 및 CD73 표면항원 단백질을 95%이상 발현하고， CD34, CD1B, CD19, CD45 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 및 HLA-DR은 1%미만으로 발현하고 있음을 확인하였다. 반면， 인체에서 분리한 골수 유래 MSC의 경우， cell population에 따라표면 마커의 발현 비율이 넓은 범위 (6090%)에서 확인되었다 (data not shown) . 이러한 표면항원 단백질의 발현을통해 heterogeneous한골수유래 BM-MSC와비교하여,본발명의 세포주가 homogenous한특성을나타내고있음을알수있다.
실험예 2. BM-03세포주의 분화능확인
실험예 2.1.지방세포 (adipocyte)로의 분화확인
지방세포로의 분화능을 확인을 위해 BM-03 세포주를 12 -웰 플레이트에 lxlO4 cells/cm2의농도로시딩 (seeding)하였다.일반배지를이용하여 37°C온도,
5% C02 배양기에서 2일 내지 3일간 배양한 뒤， 지방생성 분화 배지 (StemPro® 지방생성 분화 키트， Thermo fisher Scientific, A10070-01)로 교체하였다. 배지를 3일 내지 4일마다교체해주며 21일간배양하였다.배양이 완료되면오일- 레드-오 용액 염색 (Oil Red 0 solution staining)을 한 뒤 현미경으로 확인하였다. - 실험예 2.2.골아세포 (osteoblast)로의 분화확인
골형성 확인을 위해 12 -웰 플레이트에 5xl03 cel Is八: m2의 농도로 시딩하였다.일반배지를 이용하여 37°C온도, 5% C02배양기에서 2일 내지 3일간 배양한 뒤 골 형성 분화 배지 (StemPro® 골 형성 분화 키트， Thermo fisher
Scientific, A10072-01)으로교체하였다.배지를 3일 내지 4일 마다교체해주며 21알간 배양하였다. 배양이 완료되면 알리자린-테드-에스 염색 (Alizarin Red S staining)을한뒤 현미경으로확인하였다.
실험예 2.3.연골세포 (chondrocyte)로의 분화확인
연골형성 확인을위해 1.6xl07 cells/M의 농도로현탁하여 그중 5成를 24웰에 시딩한 뒤 2시간 동안 배양하였다. 연골형성 분화 배지 (StemPro® 연골형성 분화키트， Thermo fisher Scientific, A10071-01) 500 를첨가한뒤 3일 간격으로 교체해주며 14일간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 DPBS로 행구어 펠렛을 떼어내었다. 동결절편 (Cryosection) 과정을 거쳐 알시안 블루 염색 (Alcian Blue staining)을한뒤 현미경으로확인하였다. 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 상기 실험예 2.1. 내지 2.3.의 결과를도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 811-03 세포주의 다중 분화능
（ 매선 은 !!）을가지고있음을확인하였다.
실험예 3. 형질전환된세포주의 도입유전자확인시험
상기 확립된 세포주인 8103 검체를 37°〔 온도의 항온수조에서 약 1분간 해동하고 9 滅 표가 포함된 15
Figure imgf000023_0001
튜브에 옮긴 후 1,500 제으로 5분간 셀 다운 0 11 加·）시켰다. ?표3를 완전히 제거한 뒤， 1.5滅 튜브에 200 ¹므표으로 펠렛을 현탁하여 옮겼다.
Figure imgf000023_0002
331½（·， 740952.250）를 이용하여 를준비하고하기 표 1과같이 혼합물을만든후， 하기 표 2의 단계로的요을 수행하였다. 이때， 양성대조군으로 100 의 31-03 플라스미드 를, 음성대조군으로 1 의 정제수（（如）를넣었다.
【표 11
【표 2]
Figure imgf000023_0004
l%（v/v） 아가로오스 겔을 전기영동 키트에 넣었다. 첫번째 웰에 10成의 DNA Size Marker를로딩하였고, 다음웰부터 음성대조군, 양성대조군， 3개의 BM- 03검체 순서로 각각 10 4씩 로딩하였다. 이후 100 로 20분동안 전기영동을 실시하였고, 겔사진을찍어 그결과를도 5a에 나타내었다.
도 5a에 나타난 바와 같이， BM-03 세포주 검체 3개 모두 양성대조군과 동일한사이즈（1.2此）의 PCR프로덕트를확인하였다.
또한， 정량 역전사 충합 효소 연쇄 반응（qRT-PCR）을 수행하여 TRAIL및 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901
CD유전자발현량을확인하였다. 전임상연구를위한 3가지 BM-03세포주 (Lot#l, Lot #2, Lot#3)를 qRT-PCR분석에 사용했다. 상기 BM-03세포주의 RNA 1 fig을 RT- PCR에 사용하였다. 정량을위한 qPCR의 경우， 렌티바이러스의 생산에 사용된 BM- 03세포주의 DNA를연속적으로희석시켜 표준곡선을만들었다.
그결과， 도 5b에 나타난바와같이, 상기 Lot#l, Lot#2 및 Lot#3의 BM- 03 세포주로부터 검출된 TRAIL RNA의 평균은 6.22x l07 copies였고， CD RNA는 total RNA 1 //g당 4.82x l07 copies였다.
실험예 4. 형질전환된세포주에서 TRAIL및 CD단백질의 발현확인 상기 실시예 3.1.에서 확립된 BM-03 세포주에서 상기 실시예 3.1.과 동일한 방법으로 TRAIL 및 CD 단백질의 발현을 유도한 뒤， FACS를 수행하여 독시사이클린의 유무에 따른 TRAIL의 발현을 확인하였다. 이후 TRAIL의 발현이 확인된세포주에서 CD단백질의 발현을확인하였다.
구체적으로， 10%(v/v) FBS가포함된 DMEM배지에 독시사이클린 2能/ M이 들어간 배지와들어가지 않은 배지를 이용하여 BM-03 세포주를 T75 플라스크에 5x10s세포수가되도록 계대 배양하였다. 3일 동안배양한뒤 세포를수득하였다. 세포수를측정한뒤 각그룹당 5xl05세포를 PE ant i -human CD253(TRAIL)항체 (BioLegend, 308206) , PE Mouse IgGl, K Isotype Control Ant ibody (BioLegend, 400112)를 이용하여 염색하였다. 또한, 죽은 세포들을 배제한 후 발현을 확인하기 위해 LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cel l Stain Ki t (Thermos
Fisher Scient i f i c L34976) 항체를 이용하였다 FACS(LSRFortessa, BD
Biosciences)기기로분석하였다.
동일한 방법으로 세포를 배양한 후 독시사이클린을 제거하여 CD 발현을 유도하였다. 여기에 5-FC ( 5- f 1 uor ocy t os i ne , Sigma)를 100 j«g/m오의 농도로 첨가한뒤, 48시간후에 세포의 사멸을관찰하였다. 그 결과를도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 독시사이클린을 첨가하였을 때는 TRAIL이 발현되지 않았으나, 독시사이클린이 제거된 배지에서 배양한 BM-03세포주에서는 TRAIL이 발현되는 것을 확인하였다. 또한， 도 7에 나타난 바와 같이, CD 단백질이 발현하면, 5-FC에 의해 세포가 사멸하는 것을 알 수 있었다. 즉, CD 2019/027298 1»(：1^1{2018/008901 단백질의 발현에 의해 세포가 사멸되는 것을 관찰하였다. 따라서, 제조된 중간엽줄기세포에서 TRAIL 단백질 및 CD 단백질이 발현되고, 이는 Tet-of f 시스템에 의해조절되는것을확인하였다.
또한, TRAIL , CCR2및 CXCR4를발현하는 BM-03세포주의 비율을확인하기 위해 FACS를 사용하여 분석하였다. 구체적으로， 하기 표 3에 기재된 항체가 함유된 FACS Buf fer（2% 소태아 혈청을 포함한 PBS）에서 세포를 4°C 온도에서
30분 동안 반응시켰다. 그 후， 세포를 FACS 완충액으로 세척한 후， FACS 분석 전에 Fixing Buf ferd% 파라포름알데히드를 함유한 PBS）에 재현탁시켰다. FACS 분석은 LSR FortessaTM세포분석기（BD Biosciences）를 이용하여 수행되었으며， f lowJo_V10또는 BD FACS Diva소프트웨어로분석하였다.
【표 3】
Figure imgf000025_0001
발현되지 않는 TRAIL , CCR2 및 CXCR4 유전자가 BM-03 세포주에서 잘 발현하는 것을확인하였다. 또한， 세 개 Lot의 BM-03세포주를분석함으로써 TRAIL, CCR2 및 CXCR4유전자의 발현정도가균일한것을확인하였다.
상기 실험예 4.의 PCR 및 FACS 분석법의 실험결과들을 취합하여， 본 발명의 중간엽줄기세포의 QCCQual i ty Control） 기준을 아래와 표 4와 같이 수립하였다.
【표 4]
Figure imgf000025_0002
2019/027298 1»（：1^1{2018/008901
Figure imgf000026_0001
실험예 5. 형질전환된세포주의 PDL (Population doubling level)분석
4xl05개의 BM-03 세포주를 T75 플라스크에 2 能/ 의 독시사이클린이 포함된배지에 시딩하였다. 3일또는 4일 정도계대 배양하여 세포를수득한후， 세포수를측정하였다. 같은수의 세포를시딩하여 3일 내지 4일 간격으로 PDL을 측정하였다. PDL값은하기 수학식 1을 이용하여 계산하였고， 그결과를도 9에 나타내었다. 이때， 하기 수학식 1에서 는 초기 PDL, I는 배지에 시드된 초기 세포수， 는최종세포수율， 또는성장기 말의 세포수를나타낸다.
【수학식 1]
抑 L = X + 3.222 (log Y - log I) 도 9에 나타난 바와 같이, 장기 계대 배양으로 안정된 성장을 보여주고 있음을확인하였다.
실험예 6. 형질전환된세포주의 핵형 분석
BM-03 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 염색체 이상 여부를 판단하기 위해 이원생명과학연구원 (한국)에 분석 의뢰하여 정해진 프로토콜에 따라수행되었다. 분석 결과를도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이， BM-03 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 염색체에서 이상여부는관찰되지 않았으며 정상핵형임을확인하였다. 실시예 4. 동물모델을이용한 BM-03세포주의 항암효과확인
실시예 4.1. 신경교종유발마우스제조
아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 인간 신경교종 세포주인 U-87MG 세포를 얻어서 10%(v/v) FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 37°C온도， C02 5%조건으로배양하였다. 상기 U-87MG세포에 반딧불이 루시페라아제 (Luc)를 코딩하는 유전자를 포함하는 렌티바이러스로 형질감염시켜 Luc를안정적으로발현하는 U-87MG세포인 U-87MG-Luc세포를제작하였다. 그후,
U-87MG-Luc 세포를 10%(v/v) FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 37°C 온도, C02 5% 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 조건으로배양하였다.
6주령의 수컷 누드 마우스 (Athymic Nude Mouse)에 상기 U-87MG-Luc 세포를 두개내 이종이식 ( intracranial xenografts)하기 위해， 상기 마우스를 케타민/자일라진 (ketamine八ylazine)으로 복강내 마취시켰다. 상기 1＜:105 세포수의 U-87MG-Luc 세포를 3 fd PBS에 재현탁시킨 후, 미세주입 펌프 (microinfusion pump)를 사용하여 해밀턴 시린지 (Hami l ton Company, Reno, NV)에 옮겨 담았다. 그후, 상기 마취된 마우스의 두개 기저 (skul l base)로부터 2.5 mm의 깊이에서 브레그마 (bregma) 2 mm 측면 및 1 mm 전방에 위치한 우측 전두엽 또는 양쪽 반구 (hemi spheres)에 정위적 (stereotact ical ly)으로 주입하였다. 실시예 4.2. BM-03세포주에 의한종양억제 확인
BM-03 세포주 주입에 따른 신경교종 유발 마우스 뇌의 종양 억제를 확인하기 위해, 실시예 4.1.에서 U-87MG-Luc세포를마우스에 주입하고 7일후에 TRAIL및 CD를발현하는중간엽줄기세포를종양세포내로주입하였다.
단회투여 실험의 경우, 2.5xl05 세포수의 BM-03 세포를 8 ¹ PBS에 재현탁시킨 후, 500 mg/kg농도의 5-FC를 7일간주사한마우스와주사하지 않은 마우스에 존재하는 종양세포에 각각 주입하였다. 다회 투여 실험의 경우， U- 87MG-Luc세포를마우스에 주입한지 7일, 21일 및 35일이 되는날에 각각 BM-03 세포를 주입하였다. 구체적으로, 2xl04, lxlO5 또는 5x10s 세포수의 중간엽줄기세포를 8 fd PBS에 재현탁시킨 후， 500 mg/kg 농도의 5-FC를 7일간 주사한 마우스와 주사하지 않은 마우스에 존재하는 종양세포에 주입하였다. U- 87MG-Luc세포를마우스에 주입 6일후부터 일주일 간격으로공지의 방법을통해 생체 내 발광 양을 측정하였다 (Kim SM et al. International Journal of Nanomedicine 11: 13-23, 2016) . 생존은최대 90일동안이어졌다.
단회투여 실험의 결과를도 11내지 도 13에 나타내었다. 구체적으로， 도 11및도 12에 나타난바와같이， BM-03세포및 5-FC를주입한마우스의 종양은 대조군 (control) 및 BM-03 세포만을 투여한 마우스의 종양보다 발광이 감소하였다. 또한， 도 13에 나타난 바와 같이， BM-03 세포 및 5-FC를 투여한 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 마우스의 생존일도증가하였다.
다회 투여 실험의 결과를 도 14 내지 도 16에 나타내었다. 구체적으로, 도 14 및 도 15에 나타난 바와 같이， BM-03 세포 및 5-FC를 투여한 마우스의 종양은대조군 (control)의 종양보다발광신호가감소하였다. 특히, 1x10s cel l s/ 8 ¹ 또는 5x l05 cel l s/ 8 ¹ 농도의 BM-03 세포 및 5-FC를 주입한 마우스의 발광신호가크게 감소하였다. 또한, 도 16에 나타난바와같이， 1＜105 cel ls/ 8 ¹ 또는 5x10s cel ls/ 8 ¹ 농도의 BM-03 세포 및 5-FC를 주입한 마우스의 생존일도농도의존적으로증가하였다.
실험예 7. BM-03의 종양이동성 확인 ( in vitro)
BM-03 세포주의 종양 이동성을 확인하기 위해 24 -웰의 8 m기공 필터가 있는 트랜스웰 챔버에서 상이한 조건으로 배양하였고 도 17에 나타내었다. 배양한 BM-03 세포를 트립신을 처리하여 분리한 후 세척하였다. 그 후, serum free Dulbecco's modi f ied Eagle's medium에 재현탁시켰다. 상부 챔버에 3x l04 세포수/ 100 id 농도의 MSC를 넣고 무혈청 DMEM, 10% FBS가 첨가된 DMEM, 300 ng/vxi 況) F-la가 첨가된 DMEM, 300 ng/ml 마이 첨가된 DMEM 또는 U87 MG 배양배지의 조정배지 (condi t ioned media)를각각하부챔버에 넣어주었다. 그후, 세포를 37°C 온도 및 5% C02 조건의 세포 배양 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 그후， 트랜스웰챔버를꺼내어 세척하고 di f f-quick Ki t(Sysmex)로 염색하였다. 그 후， 격막을 침투한 BM-03 세포의 수를 광학 현미경으로 계수하였다. 이를 통해, 필드 당 평균 세포수를 계산하여 BM-03 세포의 종양 이동능력을평가하였다.
그결과, 도 18에 나타난바와 같이， 종양세포를 배양한배지를 넣어준 트랜스웰 챔버에서 격막을 통과한 BM-03 세포의 수가 많이 관찰되었다. 이를 통해 BM-03세포주가종양으로이동하는능력이 우수한것을확인하였다.
실험예 8. BM-03세포주의 종양이동성 확인 ( in vivo)
BM-03 세포주의 종양이동성 확인을 위해， BM-03 세포주에 형광물질인 DiDCABD Bioquest , Inc. )를 표지하여 뇌종양으로의 이동성을 평가하였다. 구체적으로, 실시예 4.1에서 제작한 신경교종 유발 마우스의 종양 형성부위의 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 반대편 뇌에 DiD가표지된 BM-03 세포를 이식한후， BM-03 세포의 이동을 IVIS Spectrum In Vivo Imaging System(PerkinElmer)를이용하여 관찰하였다.
그결과， 도 19에 나타난바와같이， BM-03세포주만을뇌에 이식할경우 세포의 이동이 전혀 없는 반면， 종양의 반대편에 이식한 BM-03 세포는 종양을 향해 반대편뇌로이동하는것을확인하였다.
실시예 5. BM-03세포주의 항암효능확인 ( in vitro)
상기 실시예 3.1.에서 확립된 BM-03세포주의 항암효능을확인하기 위해, 인간신경 교종세포주인 U87MG, U373MG또는마우스신경 교종세포주인 GL26을 10% 소태아 혈청 (Gibco)이 첨가된 DMEM(Hyclone)으로 배양하였다. 구체적으로， 배양 1일째, lxlO5세포수의 신경교종세포를 6 -웰플레이트에 도말하였다. 배양 2일째, 신경교종 세포에 2xl05 세포수의 불멸화된 중간엽줄기세포 (imMSC) 또는 5xl05세포수의 BM-03세포를 첨가하였다. 배양 4일째， 10 mg/m£농도의 5-FC를 각웰에 처리하였다. 배양 6일째, 줄기세포및신경교종세포를수거하고 FACS를 통해 신경교종세포를분석하였다.
그결과, 도 20에 나타난바와같이, BM-03세포주를처리한군에서 모두 약 40% 정도의 신경교종 세포가 사멸되었다. 특히, BM-03 세포주 및 5-FC를 처리하였을 때 70% 이상의 신경교종 세포가 사멸되었다. 반면， 불멸화된 중간엽줄기세포를 처리한군에서는 약 10%미만의 신경교종세포가사멸되었다. 또한, 불멸화된중간엽줄기세포및 5-FC를처리하였을때도 10%미만의 신경교종 세포가사멸되었다.
또한, 도 21에 나타난 바와 같이， BM-03 세포 및 5-FC를 처리한군에서 줄기세포가 잔존하지 않고 대부분 사멸하는 것을 확인하였다. 또한， 이를 통해 BM-03세포주가 CD를잘발현하고암세포살상능을나타낼수 있음을확인하였다. 실시예 6. BM-03 세포주의 항암 효능 확인 ( in vivo intraventr icular inject ion)
10마리의 6주령 BALB/c 누드 마우스에 U-87 MG-Luc lxlO5 세포수/ 3 fd 무혈청 배지를 stereotaxic apparatus를 사용하여 브레그마 (Bregma)로부터 AP 1.00, ML 1.50, DV -3.50 mm좌표에 투여하여 암을형성시켰다. 암이식 7일후， 8xl04또는 8xl05세포수/ 5 fd cryostor BM-03세포를 AP -0.50 mm, ML -1.20 mm, DV -2.40 mm 위치 ( intraventr icular inject ion)에 투여하였다. BM-03 투여 투， 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 이틀 후부터 7일간 5-1 500 八용을 복강투여하였다. 한편, 대조군으로 1◦마리의 누드마우스에（： 0 이 5 를투여하였다.
그결과， 도 22에 나타난바와같이， 8x10®세포수/ 5 ¹（： 0 （ 81-03 세포를단회투여 받은실험군의 생존율이 25%가량증가하였다.
또한， 단회투여와 동일한 조건으로 31-03 세포주를 2주 간격으로 4회 투여하며 5-的 투여도 동일한 사이클로 투여하여 다회 투여를 통한 동물시험 효력을 평가하였다. 그 결과， 도 23에 나타난 바와 같이， 8난05 세포수/ 5 ¹ 아 61-03세포를다회 투여 받은실험군의 생존율이 25%가량증가하였다.
【수탁번호】 기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : ^10131826?
수탁일자 : 20170106
2019/027298 1»（：1/10公018/008901
다의워차상미생分기탁의규제직令인에간한부다페스 «. .次약
식
원기탁에관한수탁증
하기 국제기탁기관에서정한규척 7.1에하라밝행원 수령인 (기탁자): 에스엘바이젠
134SS대한민국경기도성남시분당구대창판교로 700.코리아바이오파크 C동 7층
Figure imgf000031_0001

Claims

2019/027298 1»（：1^1{2018/008901 특허청구범위
1. 세포사멸-유도 리간드 단백질 (그 )， 및 시토신 디아미네이즈 (0)) 단백질을동시에 발현하는형질전환된중간엽줄기세포를유효성분으로포함 하는암예방또는치료용약학조성물.
2. 제 1항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포는불사화된것인， 약학조성물.
3. 제 1항에 있어서，
상기 중간엽줄기세포는
Figure imgf000032_0001
유전자가도입된 것인, 약학조성 물
4. 제 1항에 있어서,
상기 형질전환된 중간엽줄기세포는 재조합 렌티바이러스로 형질감염된 것 인, 약학조성물.
5. 제 3항에 있어서,
상기 재조합 렌티바이러스는 재조합 렌티바이러스 벡터， 패키징 플라스미 드및 엔벨로프플라스미드로숙주세포를형질전환시키는단계; 및
상기 형질전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를분리하는단계를통하여 수득되는것인， 약학조성물.
6. 제 5항에 있어서，
상기 재조합 렌티바이러스 벡터는 1?연관세포사멸-유도 리간드단백질 奸^比)， 및 시토신 디아미네이즈 01)) 단백질을코딩하는유전자를포함하는 것 인’ 약학조성물.
7. 제 6항에 있어서，
상기 단백질 및 00단백질을코딩하는유전자는서열번호 1및 서 열번호 3으로 표시되는 아미노산서열을 코딩하는 염기서열인 것인， 약학조성 물.
8. 제 7항에 있어서,
상기 서열번호 1 및 서열번호 3으로표시되는 아미노산서열을코딩하는 염기서열은 서열번호 2 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열인 것인， 약학조성 물. 2019/027298 1»（：1^1{2018/008901
9. 제 6항에 있이서,
상기 재조합 렌티바이러스 벡터가 1또는 2개의 프로모터를 포함하는 것 인， 약학조성물.
10. 제 9항에 있어서，
상기 프로모터가 사이토메갈로바이러스 (CMV)， 호흡기세포융합바이러스 (RSV) , 인간 성장인자
Figure imgf000033_0001
알파 (human elongat ion factor-1 alpha, EF-1 Q 또는 TRECtetracycl ine response elements)프로모터인， 약학조성물.
11. 제 6항에 있어서，
상기 재조합렌티바이러스벡터가내부리보좀진입 부위 (I則: S)를포함하 는것인, 약학조성물.
12. 제 1항에 있어서，
상기 형질전환된 중간엽줄기세포는 CCR2 및/또는 CXCR4 단백질을 발현하 는것인， 약학조성물.
13. 제 1항에 있어서，
상기 형질전환된 중간엽줄기세포는 CD90, CD44, CD105및/또는 CD73단백 질을발현하는것인， 약학조성물.
14. 제 1항에 있어서，
상기 형질전환된 중간엽줄기세포는 CD34, CDllb, CD19, CD45 및 HLA-DR 단백질을발현하지 않는것인, 약학조성물.
15. 제 1항내지 제 14항중어느한항에 있어서，
상기 암이 위암, 결장암， 유방암， 폐암, 비소세포성폐암， 골암， 췌장암， 피부암, 두부또는 경부암， 흑색종， 자궁암， 난소암， 직장암, 자궁내막암， 호지 킨병 (Hodgkin' s di sease) , 뇌종양， 육종암, 식도암， 소장암, 갑상선암， 전립선 암， 백혈병, 림프종， 방광암, 중추신경계 종양및 척수종양으로구성된 군으로 부터선택되는어느하나인 것인， 약학조성물.
16. 암을예방또는치료하기 위한제 1항의 약학조성물용도.
17. 암의 예방또는 치료용 약학조성물을 제조하기 위한제 1항의 약학조성 물용도. 2019/027298 1»（：1/10公018/008901
18. 제 1항의 약학조성물을개체에투여하는단계를포함하는암치료방법.
PCT/KR2018/008901 2017-08-04 2018-08-06 Trail 및 cd를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방또는 치료용 약학 조성물 WO2019027298A2 (ko)

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