CN111356463A - 使用多能干细胞的***基因脑肿瘤治疗药 - Google Patents

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Abstract

为了建立新的脑肿瘤的治疗手段，而提供脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，是与能被胞嘧啶脱氨酶转换成5‑氟尿嘧啶的前药一起使用的脑肿瘤治疗用细胞制剂，包含具有胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因的多能干细胞来源的神经干细胞。

Description

使用多能干细胞的***基因脑肿瘤治疗药
技术领域
本发明涉及脑肿瘤治疗用细胞制剂、以及在该细胞制剂中使用的神经干细胞的制作方法。
背景技术
恶性神经胶质瘤由于由广泛浸润到脑实质中的脑肿瘤干细胞(brain tumor stemcell,BTSC)产生的治疗抵抗性，因而通过现在的治疗法治疗极为困难。使用病毒载体的***基因疗法由于发挥旁观者效应而被期待有效性，但由于向浸润的肿瘤细胞的扩散不充分，因此临床试验的结果有限。最近，搞清楚了神经干细胞(neural stem cell,NSC)具有在脑肿瘤干细胞中游走、聚集的性质，以神经干细胞作为细胞载体(vehicle)应用于***基因治疗的尝试受到关注。另外，开发了利用具有与神经干细胞相似的性质的间充质干细胞的涉及***基因治疗的技术(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2006-345726号公报
发明内容
发明要解决的课题
如上所述，利用了神经干细胞、间充质干细胞的***基因治疗被寄予了大的期待，但临床上获得能够施与人且充分量的神经干细胞包含伦理上的问题，是困难的。对于间充质干细胞，虽然比神经干细胞容易获得，但既然是从生物体采集的，其采集量就有限。
另外，作为***基因，一般使用单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSVtk)(例如，专利文献1的实施例1中使用了该基因)，除此以外，已知胞嘧啶脱氨酶(CD)基因、尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRT)基因。已知CD基因和UPRT基因各自单独也具有抗肿瘤效果，但通过将两者组合(以下，有时将该两基因组合了的基因称为“CD-UPRT基因”)，抗肿瘤效果协同地提高。
本发明的目的在于在以上那样的背景下，解决神经干细胞、间充质干细胞的获得困难性问题，提供使用具有高抗肿瘤效果的CD-UPRT基因的新的脑肿瘤的治疗手段。
用于解决课题的手段
本发明者为了解决上述课题而反复进行了深入研究，结果发现，通过由iPS细胞分化诱导神经干细胞，能够获得用于***基因治疗法的充分量的神经干细胞。另外发现，通过利用基因组编辑将CD-UPRT基因***到iPS细胞的持家基因的区域，从而能够获得在安全性、品质管理、稳定供给性方面优异的CD-UPRT基因表达神经干细胞。进而发现，该CD-UPRT基因表达神经干细胞不仅对脑肿瘤细胞，对脑肿瘤干细胞也显示抗肿瘤效果。
本发明是基于以上见解完成的。
即，本发明提供以下〔1〕～〔17〕。
〔1〕脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，是与能被胞嘧啶脱氨酶转换成5-氟尿嘧啶的前药一起使用的脑肿瘤治疗用细胞制剂，包含具有胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因的多能干细胞来源的神经干细胞。
〔2〕根据〔1〕所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，能被胞嘧啶脱氨酶转换成5-氟尿嘧啶的前药是5-氟胞嘧啶。
〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，多能干细胞来源的神经干细胞是通过进行以下工序(1)、接着进行工序(2)而得的神经干细胞，
工序(1)，在多能干细胞中导入胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因，
工序(2)，使多能干细胞向神经干细胞分化。
〔4〕根据〔3〕所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因通过基因组编辑而被***到多能干细胞的基因组中。
〔5〕根据〔4〕所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因被***到多能干细胞的持家基因的区域或AAVS1区域。
〔6〕根据〔5〕所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，持家基因是甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因。
〔7〕根据〔3〕所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，将胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因制成能够人工地调节表达的基因结构物。
〔8〕根据〔7〕所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，基因结构物是通过添加多西环素而表达的基因结构物。
〔9〕根据〔1〕或〔2〕所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，多能干细胞来源的神经干细胞是通过进行以下工序(1)、接着进行工序(2)而得的神经干细胞，
工序(1)，使多能干细胞向神经干细胞分化，
工序(2)，在神经干细胞中导入胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因。
〔10〕根据〔1〕～〔9〕的任一项所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，多能干细胞是iPS细胞。
〔11〕具有胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因的神经干细胞的制作方法，其特征在于，是进行以下工序(A1)、接着进行工序(A2)的方法，或进行工序(B1)、接着进行工序(B2)的方法，
工序(A1)，在多能干细胞中导入胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因，
工序(A2)，使多能干细胞向神经干细胞分化，
工序(B1)，使多能干细胞向神经干细胞分化，
工序(B2)，在神经干细胞中导入胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因。
〔12〕根据〔11〕所述的神经干细胞的制作方法，其特征在于，在工序(A1)中，通过基因组编辑，将胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因***到多能干细胞的基因组中。
〔13〕根据〔12〕所述的神经干细胞的制作方法，其特征在于，在工序(A1)中，将胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因***到多能干细胞的持家基因的区域或AAVS1区域。
〔14〕根据〔13〕所述的神经干细胞的制作方法，其特征在于，持家基因是甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因。
〔15〕根据〔11〕所述的神经干细胞的制作方法，其特征在于，在工序(A1)中，将胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因制成能够人工地调节表达的基因结构物。
〔16〕根据〔15〕所述的神经干细胞的制作方法，其特征在于，基因结构物是通过添加多西环素而表达的基因结构物。
〔17〕根据〔11〕～〔16〕的任一项所述的神经干细胞的制作方法，其特征在于，多能干细胞是iPS细胞。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请特愿2017-223202的说明书和/或附图所记载的内容。
发明的效果
本发明提供使用iPS细胞、ES细胞等多能干细胞来源的神经干细胞的新的脑肿瘤的治疗手段。
附图说明
图1是显示使用yCD-UPRT表达·治疗干细胞(TSC)的针对恶性脑肿瘤的***基因细胞疗法(混合移植模型)的概要的图。
图2是显示肿瘤的发光成像分析(IVIS)的结果的图。
图3是显示发光成像的ROI值的测量结果的图。
图4是从小鼠摘出的脑的照片(左)、小鼠脑切片的HE染色图像(中央)、和小鼠脑切片的Venus荧光图像(右)。
图5是显示肿瘤体积的分析的结果的图。
图6是显示移植TSC的生存分析结果的图。上部和中部显示治疗组、下部显示对照组。图像自左起为Venus染色(染色U87肿瘤细胞)、KO染色(染色TSC)、DAPI染色(染色核)、归并(Merge，即Venus、KO、DAPI的融合图像)。
图7是显示脑肿瘤模型的生存分析的结果的图。
图8是显示使用yCD-UPRT表达·治疗干细胞(TSC)的针对恶性脑肿瘤的***基因细胞疗法(肿瘤形成后移植模型)的概要的图。
图9是显示肿瘤的发光成像分析(IVIS)的结果的图。
图10是显示发光成像的ROI值的测量结果的图。
图11是从小鼠摘出的脑的照片(左)、小鼠脑切片的HE染色图像(中央)、和小鼠脑切片的Venus荧光图像(右)。
图12是显示肿瘤体积的分析结果的图。
图13是显示移植TSC的生存分析结果的图。上部显示治疗组、下部显示对照组。图像自左起为Venus染色(染色U87肿瘤细胞)、KO染色(染色TSC)、DAPI染色(染色核)、归并(Merge，即Venus、KO、DAPI的融合图像)。
图14是显示脑肿瘤模型的生存分析的结果的图。
图15是显示yCD-UPRT表达TSC的时间序列成像的结果的图。上部显示治疗组、中部显示对照组1、下部显示对照组2。
图16是yCD-UPRT表达TSC的KO染色图像。上部显示治疗组、下部显示对照组1。
图17是yCD-UPRT表达TSC的HE染色图像。上部显示治疗组、下部显示对照组1。
图18是显示利用CRISPR/Cas9的使用yCD-UPRT表达·治疗干细胞(TSC)的针对恶性脑肿瘤的***基因细胞疗法(肿瘤形成后移植模型)的概要的图。
图19是显示肿瘤的发光成像分析(IVIS)的结果的图。
图20是显示发光成像的ROI值的测量结果的图。
图21是从小鼠摘出的脑的照片(左)、小鼠脑切片的HE染色图像(中央)、和小鼠脑切片的Venus荧光图像(右)。
图22是显示肿瘤体积的分析结果的图。
图23是显示脑肿瘤模型的生存分析的结果的图。
图24是显示使用Tet诱导yCD-UPRT表达治疗用干细胞TSC的针对恶性脑肿瘤的***基因细胞疗法(混合移植模型)的概要的图。
图25是显示肿瘤的发光成像分析(IVIS)的结果的图。
图26是从小鼠摘出的脑的照片(左)、小鼠脑切片的HE染色图像(中央)、和小鼠脑切片的Venus荧光图像(右)。
图27是显示脑肿瘤模型的生存分析的结果的图。
图28是显示利用CRISPR/Cas9的使用yCD-UPRT表达·治疗干细胞(TSC)的针对恶性脑肿瘤干细胞的***基因细胞疗法(肿瘤形成后移植模型)的概要的图。
图29是显示肿瘤的发光成像分析(IVIS)的结果的图。
图30是显示发光成像的ROI值的测量结果的图。
图31是显示残存肿瘤分析的结果的图。
图32是显示脑肿瘤模型的生存分析的结果的图。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明的脑肿瘤治疗用细胞制剂的特征在于，是与能被胞嘧啶脱氨酶(CD)转换成5-氟尿嘧啶的前药一起使用的脑肿瘤治疗用细胞制剂，包含具有胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因(CD-UPRT基因)的多能干细胞来源的神经干细胞。
本发明中的“多能干细胞”可以解释成本领域技术人员通常使用的含义，包含例如，iPS细胞、ES细胞。
本发明中的“脑肿瘤”是指在头盖内组织发生的肿瘤，作为其具体例，可列举胶质瘤(神经胶质瘤)、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、髓膜瘤、下垂体腺瘤、神经鞘瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、肉瘤、脊髓肿瘤等。本发明中，这些中的任意脑肿瘤都可以作为治疗对象，优选以胶质瘤作为治疗对象。
本发明中的“治疗”是不仅包含杀死肿瘤细胞，也包含使肿瘤细胞减少、抑制肿瘤细胞的增殖的含义。
CD基因和UPRT基因分别是以5-氟胞嘧啶(5-FC)和5-氟尿嘧啶(5-FU)为前药的***基因。表达这些***基因的载体有市售，可以利用这样的载体来制作表达这些***基因的多能干细胞、神经干细胞。CD基因和UPRT基因分别单独也具有抗肿瘤效果，但已知通过将这两基因导入细胞，能够得到单独导入CD基因时的约100倍的抗肿瘤效果。
本发明中的前药只要是能被CD转换成5-FU的，什么样的前药都可以。作为这样的前药的具体例，可列举5-FC，但并不限于此。
本发明中的“神经干细胞”是指具有提供分化成神经元和胶质细胞的细胞的能力的干细胞。本发明的细胞制剂包含该神经干细胞，但只要不给脑肿瘤的治疗效果带来大的恶劣影响，就也可以包含除了神经干细胞以外的细胞。如果按照后述的Mol Brain 9:85,2016记载的方法由iPS细胞制作神经干细胞，则不仅生成神经干细胞，还生成神经前体细胞。因此，本发明的细胞制剂有时包含神经干细胞和神经前体细胞两者。另外，本发明中使用的神经干细胞是iPS细胞等多能性干细胞来源的神经干细胞，不直接使用从脑等采集的神经干细胞。
具有CD-UPRT基因的多能干细胞来源的神经干细胞可以通过以下说明的进行工序(A1)接着进行工序(A2)的方法、或进行工序(B1)接着进行工序(B2)的方法来制作。
工序(A1)中，在多能干细胞中导入CD-UPRT基因。
作为多能干细胞，也可以使用ES细胞，但优选使用iPS细胞。使用的iPS细胞只要是能向神经干细胞分化的即可，对其来源、导入的重编程因子、重编程因子的导入方法等不特别限定，但本发明的细胞制剂主要用于人的脑肿瘤的治疗，因此在这样的情况下优选使用来源于人的iPS细胞。该情况下，iPS细胞可以使用来源于施与细胞制剂的患者的iPS细胞，也可以使用来源于患者以外的人的iPS细胞。另外，如上所述，对重编程因子的导入方法也不限定，但优选使用无外源基因整合(integration-free)的iPS细胞。使用的iPS细胞可以按照公知的方法制作，但也可以从京都大学iPS细胞研究所(CiRA)等研究机构获得。
CD-UPRT基因向多能干细胞的导入也可以使用病毒载体来进行，但优选使用基因组编辑进行。这是因为，在使用慢病毒载体等病毒载体将***基因***多能干细胞的基因组中时，***基因被随机***到染色体中，因而担心***部位的基因突变、周围基因的活性化、由位置效应造成的***基因的沉默。认为通过不使用病毒载体、而是使用基因组编辑，能够避免这样的问题。
基因组编辑可以使用ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等进行，其中，优选使用CRISPR/Cas9进行。优选通过基因组编辑，将CD-UPRT基因***到多能干细胞的持家基因的区域。持家基因只要是在多种细胞中一定量表达的就不特别限定。作为其具体例，可列举甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因、亲环蛋白基因、β-肌动蛋白基因、α-微管蛋白基因等，其中，优选GAPDH基因。另外，也可以将CD-UPRT基因***多能干细胞的AAVS1区域。腺相关病毒(AAV)对人不具有病原性，AAVS1区域被认为是相对于外来基因的***安全性高的基因组区域。
使用病毒载体将CD-UPRT基因向多能干细胞导入时，如前所述，因为考虑到随机***染色体中造成的恶劣影响，所以优选将CD-UPRT基因制成能够人工地调节表达的基因结构物。这样的基因结构物可以使用作为公知的表达诱导***的四环素诱导***(PLoS One8:e59890,2013)来制作。该四环素诱导***由表达反向四环素控制性反式作用因子(rtTA)的区域、和包含目的基因和配置在目的基因上游的TRE启动子的区域组成。rtTA通过与四环素结合，从而与TRE启动子结合，诱导位于下游的目的基因的表达。通过使用该***，能够通过四环素的添加而诱导***基因的表达。此外，该***中的表达的诱导可以如上所述通过四环素进行，但通常通过作为四环素的衍生物的多西环素来进行。CD-UPRT基因的能够人工地调节表达的基因结构物除了该四环素诱导***以外，也可以使用药剂诱导性启动子等各种诱导性启动子来制作。
作为病毒载体，优选使用腺病毒载体、腺相关病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体等病毒载体。这些之中，优选在基因组中***基因的类型的载体，最优选慢病毒载体。载体中除了CD-UPRT基因以外，还可以包含报告基因、IRES等的序列。
工序(A2)中，使多能干细胞向神经干细胞分化。
由多能干细胞向神经干细胞的分化可以按照介由类胚体的方法、不介由类胚体的方法、公知的任意方法进行。在由iPS细胞使其分化的情况下，例如，可以按照Stem CellReports.2017Nov 14；9(5):1675-1691记载的方法进行。例如，根据上述方法，由iPS细胞的类胚体的形成可以使用公知的类胚体形成培养基来进行，类胚体培养基包含TGFβ家族抑制剂(例如，SB431542)和BMP抑制剂(例如，LDN-193189)。
由类胚体向神经干细胞的分化可以使用公知的神经球培养基进行。例如，神经球培养基包含上皮生长因子、成纤维细胞生长因子-2、白血病抑制因子、B-27supplement(补剂)等。通过将类胚体用神经球培养基进行培养，从而形成被称为神经球的包含神经干细胞的细胞块。回收形成的神经球，分散成单一细胞，通过用神经球培养基进行培养，再次形成神经球。将这样的操作重复几次后，回收神经球，从而得到神经干细胞。
在通过依次进行工序(A1)和(A2)来制作具有CD-UPRT基因的多能干细胞来源的神经干细胞的情况下，具有通过使多能干细胞增殖而能够稳定地提供治疗用的神经干细胞这样的优点。
在工序(B1)中，使多能干细胞向神经干细胞分化。
工序(B1)中的由多能干细胞向神经干细胞的分化可以与工序(A2)中的分化同样地进行。
工序(B2)中，在神经干细胞中导入CD-UPRT基因。
工序(B2)中的向神经干细胞的CD-UPRT基因的导入可以与工序(A1)中的导入同样地进行。但是，工序(A1)中有可能产生细胞毒性问题，因而优选使用基因组编辑、或将CD-UPRT基因制成能够人工地调节表达的基因结构物，但工序(B2)中产生细胞毒性问题的可能性非常低，所以通常没有必要进行这些操作。
此外，如上所述，在本说明书中，“神经干细胞”这样的“物”不是通过结构或特性、而是通过制造方法特定，但这是因为，细胞是生物体的一部分，因而其结构、特性极为复杂，进行特定它们的操作需要显著过大的经济支出、时间。
本发明的细胞制剂除了神经干细胞之外，还可以包含制剂上容许的其他成分。作为这样的其他成分，可列举担载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。另外，为了保护冷冻保存时的细胞也可以包含二甲基亚砜、血清白蛋白等，为了防止细菌的混入、增殖也可以包含抗生素等。
为了在脑肿瘤的治疗获得所期望的效果(例如，肿瘤的消灭、肿瘤大小的减少)，本发明的细胞制剂中所含的神经干细胞的数量可以考虑对象的性别、年龄、体重、患部的状态、使用的细胞的状态等而适宜确定。
本发明的细胞制剂可以多次(例如，2～10次)、隔开间隔(例如，1天2次、1天1次、1周2次、1周1次、2周1次)进行施与。施与量可以考虑对象的性别、年龄、体重、患部的状态、使用的细胞的状态等适宜确定，但优选每一个体(人)为以干细胞1×106个～1×1010个、1～10次的施与。
对本发明的细胞制剂的施与部位、施与方法不特别限定。作为施与方法，可列举肿瘤局部施与、颈动脉内施与、静脉内施与等。
对与本发明的细胞制剂一起使用的前药的施与部位、施与方法也不特别限定。作为施与方法，除了上述的肿瘤局部施与、颈动脉内施与、静脉内施与之外，还可列举腹腔内施与等。
前药的施与时期可以是本发明的细胞制剂的施与前、施与的同时、和施与后的任一者，通常在细胞制剂的施与后分多次施与。前药的施与量可以考虑使用的前药的种类、对象的性别、年龄、体重、患部的状态等而适宜确定，但在施与5-FC的情况下，优选每一个体(人)以1次50-200mg/kg、1日4次施与2～3周(28次～42次)。
在为了防止细胞毒性而使用四环素诱导***的情况下，为了使***基因表达而在治疗时也施与多西环素。作为多西环素的施与方法，可列举经口施与、肿瘤局部施与、颈动脉内施与、静脉内施与、腹腔内施与等。多西环素的施与时期也可以是本发明的细胞制剂的施与前、施与的同时、和施与后的任一者，但通常在细胞制剂的施与后进行施与。
实施例
接下来，列举实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
〔实施例1〕针对胶质瘤细胞的***基因细胞疗法
(A)材料和方法
＜人iPS细胞＞
使用的人iPS细胞(1210B2)从京都大学iPS细胞研究所(CiRA)获得。1210B2通过使用附加型载体在人外周血单核细胞中导入重编程因子的方法(Okita K,Yamakawa T,Matsumura Y,Sato Y,Amano N,Watanabe A,Goshima N,Yamanaka S.An efficientnonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stemcells from cord bloodand peripheral blood cells.Stem Cells.2013Mar；31(3):458-66.)而构建。人iPS细胞接种在经iMatrix-511(ニッピ社制)涂覆的塑料培养皿中，使用StemFit AK03或AK03N培养基(味の素社制)通过已知的无饲养层(feeder-free)的方法(Nakagawa M,Taniguchi Y,Senda S,Takizawa N,Ichisaka T,Asano K,Morizane A,DoiD,Takahashi J,Nishizawa M,Yoshida Y,Toyoda T,Osafune K,Sekiguchi K,YamanakaS.A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of humaninduced pluripotent stem cells.Sci Rep.2014Jan 8；4:3594.)进行维持培养。
＜由人iPS细胞向神经干/前体细胞(NS/PCs)的分化诱导＞
由人iPS细胞向NS/PCs的分化诱导通过已知的方法(Sugai K,Fukuzawa R,Shofuda T,Fukusumi H,Kawabata S,Nishiyama Y,Higuchi Y,Kawai K,Isoda M,Kanematsu D,Hashimoto-Tamaoki T,Kohyama J,Iwanami A,Suemizu H,Ikeda E,Matsumoto M,Kanemura Y,Nakamura M,Okano H.Pathological classification ofhuman iPSC-derived neural stem/progenitor cells towards safety assessment oftransplantation therapy for CNS diseases.Mol Brain.2016Sep 19；9(1):85.)进行。首先在iPS细胞的培养基中添加10μM ROCK抑制剂Y276352(和光纯药工业社制)，孵育1～3小时后，用PBS洗涤，使用TrypLE Select(Life Technologies社制)分散成单一细胞。将分散成单一细胞的人iPS细胞悬浮在添加了10μM ROCK抑制剂Y276352的EB(类胚体，embryoidbody)形成培养基(在未添加C液的Stem Fit培养基中添加10μM SB431542,100nM LDN-193189)中，在低粘附96孔培养板(Prime Surface 96V，住友ベークライト社制)的每1孔中以9.0×103细胞/75μl接种，进行培养。1天后加入EB形成培养基75μl，以后，每天交换一半量的EB形成培养基，培养13～14天培养，从而得到EB。从各孔回收EB，在NS(neurosphere)培养基(在D-MEM/Ham's F-12培养基(含有HEPES)(和光纯药工业社制)中添加20ng/ml重组人表皮生长因子(PeproTech社制),20ng/ml重组人成纤维细胞生长因子-2(PeproTech社制),103单位/ml重组人白血病抑制因子(ナカライテスク社制),2％B-27supplement(ThermoFisher Scientific社制),1单位/ml肝素钠(エイワイファーマ社制))培养7天。培养基交换在培养第3天或第4天进行1次。将细胞块离心回收，使用TrypLE Select(胰蛋白酶替代物)分散成单一细胞后，悬浮在NS培养基中。以1×105细胞/ml的浓度接种在低粘附瓶(Corning社制)中，每隔3～4天进行培养基交换，培养10天，从而获得1次NS/PCs。同样地，将1次NS/PCs离心回收，使用TrypLE Select分散成单一细胞后，悬浮在NS培养基中，以1×105细胞/ml的浓度接种在低粘附瓶中，每隔3～4天进行培养基交换，培养7～10天，从而获得2次、3次、4次、5次NS/PCs。
＜使用慢病毒载体的向NS/PCs的yCD-UPRT基因的导入-治疗用干细胞TSC(1)＞
yCD-UPRT表达慢病毒载体的制作
将yCD(yest cytosine deaminase)-UPRT(uracil phosphoribosyltransferase)的cDNA利用pSELECT-zeo-Fcy::fur质粒(InvivoGen社制)通过PCR法亚克隆到pENTR/D-TOPO(Thermo Fisher Scientific社制)中，确认了碱基序列之后使用。将yCD-UPRT cDNA亚克隆到慢病毒载体质粒CSIV-EF-RfA-IRES2-hKO1中，得到CSIV-EF-yCD-UPRT-IRES2-hKO1。CSIV-EF-yCD-UPRT-IRES2-hKO1用于在EF-1α启动子下表达yCD-UPRT和hKO1(Humanized Kusabira-Orange荧光蛋白质基因)的慢病毒载体的制作。慢病毒载体通过已知的方法制作(Miyoshi H,Blomer U,Takahashi M,Gage FH,Verma IM.Development of aself-inactivating lentivirus vector.J Virol.1998Oct；72(10):8150-7.；Kurita R,Suda N,Sudo K,Miharada K,Hiroyama T,Miyoshi H,Tani K,Nakamura Y.Establishmentof immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produceenucleated red blood cells.PLoS One.2013；8(3):e59890.；Hashizume O,Ohnishi S,Mito T,Shimizu A,Ishikawa K,Nakada K,Soda M,Mano H,Togayachi S,Miyoshi H,Okita K,Hayashi J.Epigenetic regulation of the nuclear-coded GCAT and SHMT2genes confers human age-associated mitochondrial respiration defects.SciRep.2015May 22；5:10434.)
yCD-UPRT表达NS/PCs的制作
将由人iPS细胞分化诱导的2次～4次NS/PCs离心回收，使用TrypLE Select分散成单一细胞后，悬浮在NS培养基中，以1×105细胞/ml的浓度接种于低粘附瓶，使其以MOI(multiplicity of infection)1～2感染CSIV-EF-yCD-UPRT-IRES2-hKO1慢病毒载体，每隔3～4天进行培养基交换，培养7天。对得到的NS/PCs同样地再次以MOI 1～2感染CSIV-EF-yCD-UPRT-IRES2-hKO1慢病毒载体，制作yCD-UPRT表达NS/PCs治疗用干细胞(TSC(1))。yCD-UPRT表达NS/PCs确认了通过在培养基中添加5-FC(Fluorocytosine)1μg/ml而能够诱导细胞死亡。
＜利用CRISPR/Cas9的向GAPDH基因区域的yCD-UPRT基因导入-治疗用干细胞TSC(2)＞
在GAPDH基因区域导入了yCD-UPRT基因的iPS细胞的制作
为了使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因区域***yCD-UPRT，制作将GAPDH与yCD-UPRT与Bsd(杀稻瘟菌素(blasticidin)耐性基因)以2A肽序列相连的形式***的同源重组用构建体(HR-GAPDH-2A-yCD-UPRT-2A-Bsd)，和以GAPDH的终止密码子附近为靶标的gRNA和Cas9表达载体构建体(U6-GAPDH-gRNA4-Cas9)。将这些构建体通过电穿孔导入人iPS细胞株(1210B2)中，在杀稻瘟菌素S存在下培养，进行克隆。同源重组iPS细胞株的确认通过各克隆的基因组PCR和利用基因组测序的碱基序列确认来进行。
yCD-UPRT表达NS/PCs的制作
由在GAPDH基因区域***了yCD-UPRT的iPS细胞向NS/PCs进行分化诱导，得到2次～5次NS/PCs(TSC(2))。在培养基添加常时杀稻瘟菌素S 2μg/ml进行培养。yCD-UPRT表达NS/PCs确认了通过在培养基中添加5-FC 1μg/ml而能够诱导细胞死亡。
＜ffLuc表达人胶质瘤细胞株U87的制作＞
使人胶质瘤细胞株U87感染ffLuc(Venus荧光蛋白质与Luc2萤荧光素酶的融合基因)表达慢病毒载体(CSII-EF-ffLuc)(Takahashi Y,Tsuji O,Kumagai G,Hara CM,OkanoHJ,Miyawaki A,Toyama Y,Okano H,Nakamura M.Comparative study of methods foradministering neural stem/progenitor cells to treat spinal cord injury inmice.Cell Transplant.2011；20(5):727-39.)，进行利用细胞分选仪的克隆分选，得到ffLuc稳定地高表达的U87细胞株。
＜脑肿瘤模型小鼠中的yCD-UPRT表达NS/PCs的治疗效果的研究＞
使用yCD-UPRT表达·治疗用干细胞TSC(1)的针对恶性脑肿瘤的***基因细胞疗 法(混合移植模型)
将U87-ffLuc 1×105个/2μl与yCD-UPRT表达TSC(1)(利用慢病毒载体在NS/PCs中导入yCD-UPRT)5×105个/2μl混合，定位移植到全身麻醉后的T细胞缺陷小鼠(雌性BALB/c裸小鼠,20g,6周))的右纹状体(前囟门的右方2mm、距脑表面纵深3mm)。从其次日开始21天内，以500μl 1次/天腹腔内施与5-FC(10mg/ml)2周(治疗组1:TSC(+)/5-FC(+)5mg/day,n＝9)。作为另一组，以100μl 1次/天腹腔内施与5-FC(10mg/ml)2周(治疗组2:TSC(+)/5-FC1mg/day,n＝9)。对照组同样地施与1M PBS 500μl 2周(对照组1:TSC(+)/5-FC(－),n＝9)。另外，也制作仅移植了U87-ffLuc的组作为别的对照组，它们以500μl 1次/天腹腔内施与5-FC(10mg/ml)2周(对照组2:TSC(－)/5-FC(+)5mg/day,n＝3)。同一个体的肿瘤的经时变化通过IVIS体内成像***每隔1周观察。IVIS拍摄时，在异氟烷吸入麻醉下腹腔内施与200μl的VivoGloTM Luciferin 30mg/ml，在达到峰的10分钟中进行拍摄。
另外，在肿瘤移植后第3周的时间点对治疗组1·2、对照组1各3只进行斩首灌流固定，测量实际的肿瘤体积。斩首通过经心脏地灌流固定4％多聚甲醛来进行。取出的脑组织经10％和20％蔗糖置换，用切片机制成20μm厚的切片，依次加入到各加有防冻液1ml的8孔皿中，在-20℃保管。
将脑切片进行HE染色，或U87由于表达Venus荧光蛋白质而通过荧光显微镜观察，进一步详细测定肿瘤体积。另外，将同为第3周的各组的脑组织用抗KO抗体进行荧光染色，评价移植的TSC是否残存。最后，将各组的生存曲线进行比较。
使用yCD-UPRT表达·治疗用干细胞TSC(1)的针对恶性脑肿瘤的***基因细胞疗 法(肿瘤形成后移植模型)
在全身麻醉后的T细胞缺陷小鼠(雌性BALB/c裸小鼠,20g,6周)的右纹状体(前囟门的右方2mm、距脑表面纵深3mm)中移植U87-ffLuc 1×104个/2μl，5天后在同部位定位地移植yCD-UPRT表达TSC(利用慢病毒载体在NS/PCs中导入yCD-UPRT)1×106个/2μl。其2天后，经IVIS体内成像***确认肿瘤着生后，治疗组以500μl 1次/天腹腔内施与5-FC(10mg/ml)2周(TSC(+)/5-FC(+)5mg/day,n＝9)。对照组1同样地施与1M PBS 500μl 2周(对照组1:TSC(+)/5-FC(－),n＝9)。另外，也制作仅移植了U87-ffLuc的组作为别的对照组，它们以500μl 1次/天腹腔内施与5-FC(10mg/ml)2周(对照组2:TSC(－)/5-FC(+)5mg/day,n＝3)。
肿瘤评价方法、生存曲线分析等全部与上述混合移植模型的治疗效果的研究同样地进行。
使用yCD-UPRT表达·治疗用干细胞TSC(2)的利用切片培养的旁观者效应和NS/ PCs的游走的可视化(时间序列成像)
将U87-ffLuc 1×105个定位移植到全身麻醉后的T细胞缺陷小鼠(雌性BALB/c裸小鼠,20g,6周)的右纹状体(前囟门的右方2mm、距脑表面纵深3mm)(第0天)。在第7天在同部位定位移植yCD-UPRT表达TSC(利用慢病毒载体在NS/PCs中导入yCD-UPRT)。其次日(第8天)在非灌流下斩首，使用振动切片机制作200μm厚的脑切片，在无菌多孔(0.4μm)***膜(Merck Millipore)上开始切片培养。在玻璃瓶中，用1800μl的NS(神经球，neurosphere)培养基(在D-MEM/Ham's F-12培养基(含有HEPES)(和光纯药工业社制)中添加20ng/ml重组人表皮生长因子(PeproTech社制),20ng/ml重组人成纤维细胞生长因子-2(PeproTech社制),103单位/ml重组人白血病抑制因子(ナカライテスク社制),2％B-27supplement(ThermoFisher Scientific社制),1单位/ml肝素钠(エイワイファーマ社制))充满。肿瘤通过Venus而被标记成绿色，TSC通过hKO1而被标记成红色，同一天开始用共聚焦显微镜以时间序列进行5天拍摄。治疗盘中对上述培养基施与200μl的10mg/ml的5-FC。对照盘1中对培养基施与200μl的1M PBS。作为对照盘2，施与替莫唑胺250μM。2天1次进行培养基交换，同样地施与5-FC、PBS、替莫唑胺。
使用yCD-UPRT表达·治疗用干细胞TSC(2)的针对恶性脑肿瘤的***基因细胞疗 法(肿瘤形成后移植模型)
在全身麻醉后的T细胞缺陷小鼠(雌性BALB/c裸小鼠,20g,6周)的右纹状体(前囟门的右方2mm、距脑表面纵深3mm)中移植U87-ffLuc 1×104个/2μl，5天后在同部位定位地移植yCD-UPRT表达TSC(用CRISPR/Cas9在iPS细胞中导入yCD-UPRT)1×106个/2μl。其2天后，经IVIS体内成像***确认肿瘤着生后，再2天后，治疗组以500μl 1次/天腹腔内施与5-FC(10mg/ml)2周(TSC(+)/5-FC(+),n＝8)。对照组1同样地施与1M PBS500μl 2周(对照组1:TSC/5-FC(－),n＝7)。另外，也制作仅移植了U87-ffLuc的组作为别的对照组，它们以500μl1次/天腹腔内施与5-FC(10mg/ml)2周(对照组2:TSC(－)/5-FC(+),n＝3)。
肿瘤评价方法、生存曲线分析等全部与上述同样地进行。
＜使用慢病毒载体的对iPS细胞的四环素(Tet)诱导yCD-UPRT基因的导入-治疗用干细胞TSC(3)＞
Tet诱导yCD-UPRT表达慢病毒载体的制作
将yCD-UPRT cDNA亚克隆到慢病毒载体质粒CSIV-RfA-TRE-EF-KT中，得到CSIV-yCD-UPRT-TRE-EF-KT。CSIV-yCD-UPRT-TRE-EF-KT用于在EF-1α启动子下表达hKO1和rtTA(reverse Tet-controlled transactivator)、在四环素(Tet)诱导型启动子下表达yCD-UPRT的慢病毒载体的制作。慢病毒载体通过已知的方法制作。
Tet诱导yCD-UPRT表达NS/PCs的制作
使人iPS细胞以MOI约15感染CSIV-yCD-UPRT-TRE-EF-KT慢病毒载体，培养后，进行利用细胞分选仪的克隆排序，得到hKO1稳定地高表达的iPS细胞株。Tet诱导yCD-UPRT表达iPS细胞确认了通过在培养基中添加多西环素(Dox)1μg/ml、5-FC 1μg/ml而能够诱导细胞死亡。
进行由Tet诱导yCD-UPRT表达iPS细胞向NS/PCs的分化诱导，得到2次、3次Tet诱导yCD-UPRT表达NS/PCs。这些Tet诱导yCD-UPRT表达NS/PCs也确认了通过在培养基中添加Dox1μg/ml、5-FC 1μg/ml而能够诱导细胞死亡。
使用Tet诱导yCD-UPRT表达治疗用干细胞TSC(3)的针对恶性脑肿瘤的***基因细 胞疗法(混合移植模型)
将U87-ffLuc 1×105个/2μl与TSC(3)(利用慢病毒载体在iPS细胞中导入Tet诱导yCD-UPRT)5×105个/2μl混合，定位移植到全身麻醉后的T细胞缺陷小鼠(雌性BALB/c裸小鼠,20g,6周)的右纹状体(前囟门的右方2mm、距脑表面纵深3mm)中。从次日开始，以500μl 1次/天腹腔内施与5-FC(10mg/ml)2周(治疗组1:TSC(+)/5-FC(+)/Dox(+),n＝7)。对照组1同样地施与1M PBS 500μl 2周(对照组1:TSC(+)/5-FC(+)/Dox(－),n＝9)。另外，也制作仅移植了U87-ffLuc的组作为别的对照组，它们以500μl 1次/天腹腔内施与5-FC(10mg/ml)2周(对照组2:TSC(－)/5-FC(+)/Dox(+),n＝4)。Dox通过含有200mg/kg饲料使其经口摄取。肿瘤评价方法、生存曲线分析等全部与上述同样地进行。
(B)结果
(1)使用yCD-UPRT表达·治疗干细胞(TSC)的针对恶性脑肿瘤的***基因细胞疗法(混合移植模型)
＜概要＞
将治疗干细胞与肿瘤细胞混合移植时(混合移植模型)的***基因细胞疗法的概要示于图1。导入的***基因使用酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)与作为前药的5-氟胞嘧啶(5-FC)的组合。CD通过将5-FC转换成5-氟尿嘧啶(5-FU)，从而抑制DNA和RNA合成，向细胞死亡诱导，但通过进一步组合yCD与尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRT)基因，UPRT将5-FU向胸苷酸合成酶抑制剂5-FUMP转换，因而与单独的yCD相比能得到100倍以上强的旁观者效应。局部的旁观者效应为细胞周期依赖性，选择性地仅杀伤肿瘤细胞，因此期待高的治疗指数(therapeutic index)。
将induced Pluripotent Stem(iPS)细胞(诱导多能干细胞)分化诱导成NS/PCs后，将yCD-UPRT利用慢病毒载体进行基因导入，建立表达***基因yCD-UPRT的治疗用干细胞(Therapeutic stem cell:TSC)。
在T细胞缺陷小鼠脑(右纹状体)中混合移植人胶质瘤细胞(U87)1×105个和TSC 5×105个。治疗组1(Group 1)中，从移植次日开始21天，1天1次施与5-氟胞嘧啶(5-FC)250mg/kg(TSC(+)/5FC(+)5mg/day,n＝9)，治疗组2(Group 2)中减少施与量，同样地施与50mg/kg(TSC(+)/5FC1mg/day,n＝9)。对照组1(Group 3)中施与PBS(TSC(+)/5FC(－),n＝9)，对照组2(Group 4)中同样地仅移植U87 1×105个，同时期施与5-FC250mg/kg(TSC(－)/5FC(+)5mg/day,n＝3)。
一边经时地进行肿瘤的发光成像分析(IVIS)，一边进行生存分析。另外使一部分小鼠在移植第3周安乐死，进行脑的组织学分析
＜利用发光成像分析(IVIS)的肿瘤的经时分析＞
两治疗组中，与两对照组相比，肿瘤明显显示缩小倾向(图2)。测定发光成像的ROI值的结果是，治疗组有意义地低，特别在第2周以后是显著的(图3)(TSC(+)/5FC(+)5mg/dayvs TSC(+)/5FC(－),第2周,P＝0.0046,t检验)。
＜脑肿瘤模型小鼠的组织学分析(胶质瘤·TSC移植第3周：n＝3)＞
胶质瘤细胞(U87)由于基因导入了荧光蛋白Venus，因而使用荧光显微镜定量地分析肿瘤体积。治疗组1的肿瘤体积为0.76±0.84mm 3，治疗组2的肿瘤体积为2.15±1.86mm3，两者均与对照组1的51.59±7.62mm 3相比有意义地小(图4和图5)(TSC(+)/5FC(+)5mg/day vs TSC(+)/5FC(－),P＝0.00033,t检验)。另外，治疗组1的肿瘤体积与治疗组2相比有更小的倾向。进而，治疗组1中3只中1只在第3周的时间点没有确认到肿瘤，形成了预想肿瘤完全消失的结果。
另外关于本治疗法的安全性(iPS细胞的肿瘤化风险)，确认了上述小鼠脑内的移植TSC的死亡。TSC由于基因导入有Kusabira-Orange(KO)，因而通过使用KO抗体的荧光染色进行分析。其结果是，对照组中移植的TSC在脑内残存，但两治疗组中没有发现明显的残存(各组n＝3)(图6)。因此确认了，移植的TSC通过yCD-UPRT/5FC***而在3周以内死亡。
＜脑肿瘤模型的生存分析＞
两治疗组中与两对照组相比，确认了有意义的生存时期延长(图7)。平均生存时期治疗组1为42天，治疗组2为34天，对照组1为25天，对照组2为21天(TSC(+)/5FC(+)5mg/dayvs TSC(+)/5FC(－),logrank,p＝0.001)。另外，治疗组1与治疗组2相比生存时期进一步有意义地延长。
(2)使用yCD-UPRT表达·治疗干细胞(TSC)的针对恶性脑肿瘤的***基因细胞疗法(肿瘤形成后移植模型)
＜概要＞
将在肿瘤形成后移植治疗干细胞时(肿瘤形成后移植模型)的***基因细胞疗法的概要示于图8。与混合移植模型时同样地，将induced Pluripotent Stem(iPS)细胞(诱导多能干细胞)分化诱导成NS/PCs后，将yCD-UPRT利用慢病毒载体进行基因导入，建立表达***基因yCD-UPRT的治疗用干细胞(Therapeutic stem cell:TSC)。
在T细胞缺陷小鼠脑(右纹状体)中混合移植人胶质瘤细胞(U87)1×104个，5天后在同部位定位地移植TSC1×106个。其4天后，经IVIS体内成像***确认肿瘤着生后，治疗组(Group 1)以1次/天腹腔内施与5-FC(250mg/kg)2周(TSC(+)/5FC(+)5mg/day,n＝9)。对照组1(Group 2)同样地施与PBS 2周(TSC(+)/5FC(－),n＝9)。在对照组2(Group 3)中，仅移植U87以1次/天施与5-FC(250mg/kg)2周(TSC(－)/5FC(+)5mg/day,n＝3)。
一边经时地进行肿瘤的发光成像分析(IVIS)，一边进行生存分析。另外使一部分小鼠在肿瘤移植第3周安乐死，进行脑的组织学分析
＜利用发光成像分析(IVIS)的肿瘤的经时分析＞
治疗组中，与两对照组相比，肿瘤显示缩小倾向(图9)。测定发光成像的ROI值的结果是，治疗组有意义地低，特别在第2周以后是显著的(图10)(TSC(+)/5FC(+)vs TSC(+)/5FC(－),P＝0.032t检验)。
＜脑肿瘤模型小鼠的组织学分析(胶质瘤·TSC移植第3周：n＝3)＞
胶质瘤细胞(U87)由于基因导入了荧光蛋白Venus，因而使用荧光显微镜定量地分析肿瘤体积。治疗组的肿瘤体积为0.82±1.23mm 3，与对照组1的43.73±24.0mm 3相比，有意义地小(图11和12)(TSC(+)/5FC(+)vs TSC(+)/5FC(－),P＝0.036,t检验)。
另外关于本治疗法的安全性(iPS细胞的肿瘤化风险)，确认了上述小鼠脑内的移植TSC的死亡。TSC由于基因导入有Kusabira-Orange(KO)，因而通过使用KO抗体的荧光染色进行分析。其结果是，对照组1中移植的TSC在脑内残存，但治疗组中没有发现明显的残存(各组n＝3)(图13)。因此确认了，移植的TSC通过yCD-UPRT/5FC***而在3周以内死亡。
＜脑肿瘤模型的生存分析＞
治疗组中与两对照组相比，确认了有意义的生存时期延长(图14)。平均生存时期治疗组为36天，对照组1为20天，对照组2为21天(TSC(+)/5FC(+)vs TSC(+)/5FC(－),logrank,p＝0.0013)。
如上所述，如果对人iPS细胞来源NS/PCs使用能够临床应用的慢病毒载体导入yCD-UPRT，移植到人脑肿瘤模型小鼠中，则通过5-FC施与而确认了明显的治疗效果(旁观者效应)，能够证明本治疗法的有效性。
＜利用脑切片培养法的时间序列成像＞
将U87-ffLuc 1×105个定位移植到T细胞缺陷小鼠(右纹状体)中(第0天)。在第7天在同部位定位移植TSC(将iPS细胞分化诱导成NC/PCs后，利用慢病毒载体基因导入yCD-UPRT而制作的TSC)。其次日在非灌流下斩首，使用振动切片机制作200μm厚的脑切片，在无菌多孔(0.4μm)***膜上开始切片培养。肿瘤通过Venus而被标记成绿色，TSC通过hKO1而被标记成红色，同一天开始用共聚焦显微镜进行5天拍摄。作为治疗组，对培养基施与200μl的10mg/ml的5-FC。作为对照组1，对培养基施与200μl的1M PBS，作为对照组2，施与替莫唑胺250μM。治疗组中，能够观察到移植的TSC在肿瘤内游走扩散，然后对5-FC良好地反应死亡，然后周围肿瘤死亡的状态(图15、图16、图17)。对照组1中，能够确认TSC继续生存，游走侵入到肿瘤的内部的状态(图15、图16、图17)。作为对照组2，替莫唑胺对一时的肿瘤增大有抑制效果，但没有确认缩小效果(图15)。
(3)使用了利用CRISPR/Cas9的yCD-UPRT表达·治疗干细胞(TSC)的针对恶性脑肿瘤的***基因细胞疗法(肿瘤形成后移植模型)
＜概要＞
将利用通过基因组编辑***了***基因的iPS细胞的***基因细胞疗法的概要示于图18。为了治疗用神经干细胞的稳定供给，期望在人iPS细胞中导入yCD-UPRT基因。利用慢病毒载体的基因导入中，在染色体中随机***，因而担心***部位的基因突变、周围基因的活性化、由位置效应造成的yCD-UPRT的沉默。为了解决该问题，使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，制作在GAPDH基因区域***了yCD-UPRT的iPS细胞。由该iPS细胞诱导NS/PCs，得到表达yCD-UPRT的治疗用干细胞(Therapeutic stem cell:TSC)。
在T细胞缺陷小鼠脑(右纹状体)中混合移植人胶质瘤细胞(U87)1×104个，5天后在同部位定位地移植TSC1×106个。其4天后，经IVIS体内成像***确认肿瘤着生后，治疗组(Group 1)以1次/天施与5-FC(250mg/kg)(TSC(+)/5FC(+),n＝6)。对照组1(Group 2)同样地施与PBS2周(TSC/5FC(－),n＝4)。对照组2(Group 3)中，仅移植U87以1次/天腹腔内施与5-FC(250mg/kg)2周(TSC(－)/5FC(+),n＝3)。
一边经时地进行肿瘤的发光成像分析(IVIS)，一边进行生存分析。另外使一部分小鼠在肿瘤移植第3周安乐死，进行脑的组织学分析
＜利用发光成像分析(IVIS)的肿瘤的经时分析＞
治疗组中，与两对照组相比，肿瘤显示缩小倾向(图19)。测定发光成像的ROI值的结果是，治疗组有低的倾向，特别在第2周以后是显著的(图20)(TSC(+)/5FC(+)vs TSC(+)/5FC(－),P＝0.067,t检验)。
＜脑肿瘤模型小鼠的组织学分析(胶质瘤·TSC移植第3周：n＝3)＞
胶质瘤细胞(U87)由于基因导入了荧光蛋白Venus，因而使用荧光显微镜定量地分析肿瘤体积。治疗组的肿瘤体积为6.02±7.08mm 3，与对照组的74.12±31.6mm 3相比，有意义地小(图21和图22)(TSC(+)/5FC(+)vs TSC(+)/5FC(－),P＝0.022,t检验)。另外治疗组中也确认了肿瘤完全消失的个体(在5-FC施与前7天的时间点，通过IVIS确认肿瘤着生之后)。
＜脑肿瘤模型的生存分析＞
治疗组中与两对照组相比，确认了有意义的生存时期延长(图23)。平均生存时期治疗组为35天(其中一只为了分析而中止)，对照组1为20天，对照组2为21天(TSC(+)/5FC(+)vs TSC(+)/5FC(－),logrank,p＝0.0042)。治疗组中，也确认了肿瘤完全消失、继续生存的例子。
(4)使用Tet诱导yCD-UPRT表达治疗用干细胞TSC的针对恶性脑肿瘤的***基因细胞疗法(混合移植模型)
＜概要＞
将使用Tet诱导yCD-UPRT表达治疗用干细胞TSC的针对恶性脑肿瘤的***基因细胞疗法的概要示于图24。为了不是在NS/PCs、而是在iPS细胞的阶段通过慢病毒载体导入yCD-UPRT基因，将能够用四环素诱导的yCD-UPRT通过慢病毒载体导入iPS细胞，使其仅在添加多西环素(Dox)时基因表达。其结果是，在Dox非添加状态下，iPS细胞能够没有问题地经EB而诱导成NS/PCs，然后，添加Dox而使yCD-UPRT表达，从而得到对5-FC反应良好的NS/PCs。
将U87-ffLuc 1×105个/2μl与TSC 5×105个/2μl混合，定位移植到全身麻醉后的T细胞缺陷小鼠(雌性BALB/c裸小鼠,20g,6周)的右纹状体(前囟门的右方2mm、距脑表面纵深3mm)中。从次日开始，以500μl 1次/天腹腔内施与5-FC(10mg/ml)2周(治疗组(Group 1):TSC(+)/5-FC(+)/Dox(+),n＝7)。对照组1(Group 2)同样地施与1M PBS500μl 2周(对照组1:TSC(+)/5-FC(+)/Dox(－),n＝9)。另外，也制作仅移植了U87-ffLuc的组作为别的对照组(Group 3)，它们以500μl 1次/天腹腔内施与5-FC(10mg/ml)2周(对照组2:TSC(－)/5-FC(+)/Dox(+),n＝4)。Dox通过含有200mg/kg饲料使其经口摄取。肿瘤评价方法、生存曲线分析等全部与上述同样地进行。
一边经时地进行肿瘤的发光成像分析(IVIS)，一边进行生存分析。另外使一部分小鼠在肿瘤移植第3周安乐死，进行脑的组织学分析
＜利用发光成像分析(IVIS)的肿瘤的经时分析和肿瘤体积＞
治疗组中，与两对照组相比，肿瘤显示缩小倾向(图25)。胶质瘤细胞(U87)由于基因导入了荧光蛋白Venus，因而使用荧光显微镜定量地分析肿瘤体积。治疗组的肿瘤体积与对照组相比有缩小倾向(图26)。
＜脑肿瘤模型的生存分析＞
治疗组中与两对照组相比，确认了有意义的生存时期延长(图27)。平均生存时期治疗组为25.5天，对照组1为20天，对照组2为19天(TSC(+)/5-FC(+)/Dox(+)vs TSC(+)/5-FC(+)/Dox(－),logrank,p＝0.004)。
〔实施例2〕针对胶质瘤干细胞的***基因细胞疗法
＜使用了利用CRISPR/Cas9的yCD-UPRT表达·治疗干细胞(TSC)的针对恶性脑肿瘤干细胞(hG008)的***基因细胞疗法(肿瘤形成后移植模型)＞
在全身麻醉后的T细胞缺陷小鼠(雌性BALB/c裸小鼠,20g,6周)的右纹状体(前囟门的右方2mm、距脑表面纵深3mm)中移植人胶质瘤干细胞株hG008-ffLuc 5×105个/2μl，45天后在同部位定位地移植yCD-UPRT表达TSC(利用CRISPR/Cas9在iPS细胞中导入yCD-UPRT)1×106个/2μl。其7天后，经IVIS体内成像***确认肿瘤着生后，治疗组以500μl 1次/天腹腔内施与5-FC(10mg/ml)2周(TSC(+)/5-FC(+)5mg/day,n＝8)。对照组1同样地施与1M PBS500μl 2周(对照组1:TSC(+)/5-FC(－),n＝7)。另外，也制作仅移植了hG008-ffLuc的组作为别的对照组，它们以500μl 1次/天腹腔内施与5-FC(10mg/ml)2周(对照组2:TSC(－)/5-FC(+)5mg/day,n＝3)。
肿瘤评价方法、生存曲线分析等全部与上述混合移植模型的治疗效果的研究同样地进行。
＜利用发光成像分析(IVIS)的肿瘤的经时分析＞
在IVIS体内成像中，治疗组与对照2组相比5-FC施与后明显地信号缩小(图29)。关于IVIS的信号的ROI，治疗组有意义地低，在5-FC施与后7周的时间点，p＝0.0019这样有意义地与对照组1确认了显著性差异(图30)。
＜脑肿瘤模型小鼠的组织学分析＞
hG008用Venus荧光蛋白质进行荧光标记而可视化。因为是弥漫性浸润的肿瘤模型，所以体积的测量困难，但明显治疗组与对照组1相比肿瘤减小(图31)。另外治疗组基本没有确认到浸润到对侧的肿瘤(图31)。
＜脑肿瘤模型的生存分析＞
关于生存曲线，治疗组有意义地延长，通过log-rank检验与对照组1确认了p＝0.0026这样的显著性差异(图32)。
本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请均直接作为参考而纳入本说明书中。
产业可利用性
本发明的脑肿瘤治疗用细胞制剂能够作为医药使用，因此本发明能够在制药等产业领域利用。

Claims (17)

1.脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，是与能被胞嘧啶脱氨酶转换成5-氟尿嘧啶的前药一起使用的脑肿瘤治疗用细胞制剂，包含具有胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因的多能干细胞来源的神经干细胞。
2.根据权利要求1所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，能被胞嘧啶脱氨酶转换成5-氟尿嘧啶的前药是5-氟胞嘧啶。
3.根据权利要求1或2所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，多能干细胞来源的神经干细胞是通过进行以下工序(1)、接着进行工序(2)而得的神经干细胞，
工序(1)，在多能干细胞中导入胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因，
工序(2)，使多能干细胞向神经干细胞分化。
4.根据权利要求3所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因通过基因组编辑而被***到多能干细胞的基因组中。
5.根据权利要求4所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因被***到多能干细胞的持家基因的区域或AAVS1区域。
6.根据权利要求5所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，持家基因是甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因。
7.根据权利要求3所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，将胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因制成能够人工地调节表达的基因结构物。
8.根据权利要求7所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，基因结构物是通过添加多西环素而表达的基因结构物。
9.根据权利要求1或2所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，多能干细胞来源的神经干细胞是通过进行以下工序(1)、接着进行工序(2)而得的神经干细胞，
工序(1)，使多能干细胞向神经干细胞分化，
工序(2)，在神经干细胞中导入胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因。
10.根据权利要求1～9的任一项所述的脑肿瘤治疗用细胞制剂，其特征在于，多能干细胞是iPS细胞。
11.具有胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因的神经干细胞的制作方法，其特征在于，是进行以下工序(A1)、接着进行工序(A2)的方法，或进行工序(B1)、接着进行工序(B2)的方法，
工序(A1)，在多能干细胞中导入胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因，
工序(A2)，使多能干细胞向神经干细胞分化，
工序(B1)，使多能干细胞向神经干细胞分化，
工序(B2)，在神经干细胞中导入胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因。
12.根据权利要求11所述的神经干细胞的制作方法，其特征在于，在工序(A1)中，通过基因组编辑，将胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因***到多能干细胞的基因组中。
13.根据权利要求12所述的神经干细胞的制作方法，其特征在于，在工序(A1)中，将胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因***到多能干细胞的持家基因的区域或AAVS1区域。
14.根据权利要求13所述的神经干细胞的制作方法，其特征在于，持家基因是甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因。
15.根据权利要求11所述的神经干细胞的制作方法，其特征在于，在工序(A1)中，将胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因制成能够人工地调节表达的基因结构物。
16.根据权利要求15所述的神经干细胞的制作方法，其特征在于，基因结构物是通过添加多西环素而表达的基因结构物。
17.根据权利要求11～16的任一项所述的神经干细胞的制作方法，其特征在于，多能干细胞是iPS细胞。
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