JPWO2016133208A1 - 新規軟骨細胞誘導方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 次の工程を含む多能性幹細胞から軟骨細胞を製造する方法:
(i)多能性幹細胞をBMP2、TGFβおよびGDF5から成る群より選択される1以上の物質ならびにHMG-CoA還元酵素阻害薬を含む培養液中で接着条件で培養する工程、および
(ii)前記工程(i)で得られた細胞をBMP2、TGFβおよびGDF5から成る群より選択される1以上の物質ならびにHMG-CoA還元酵素阻害薬を含む培養液中で浮遊条件で培養する工程。
[2] 前記工程(i)および(ii)の工程で用いる培養液が、BMP2、TGFβ、GDF5およびHMG-CoA還元酵素阻害薬を含む培養液である、[1]に記載の方法。
[3] 前記HMG-CoA還元酵素阻害薬が、メバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチンおよびロバスタチンから成る群より選択される薬剤である、[1]または[2]に記載の方法。
[4] 前記HMG-CoA還元酵素阻害薬が、ロスバスタチンである、[3]に記載の方法。
[5] 前記工程(i)および(ii)の工程で用いる培養液が、さらに血清を含む培養液である、[1]から[4]のいずれか1項に記載の方法。
[6] 前記工程(ii)が、前記工程(i)で得られた細胞を分離溶液を用いずに、浮遊培養を行う工程である、[1]から[5]のいずれか1項に記載の方法。
[7]前記工程(i)で用いる多能性幹細胞が、細胞塊の状態である、[1]から[6]のいずれか1項に記載の方法。
[8]前記多能性幹細胞が、多能性幹細胞を未分化状態で培養できる培養液中で浮遊培養する工程を含む方法により製造された細胞塊である、[7]に記載の方法。
[9] 前記軟骨細胞が、軟骨細胞と細胞外マトリックスを含む塊である、[1]から[8]のいずれか1項に記載の方法。
[10] 前記工程(i)および(ii)が、それぞれ7日以上28日以下の期間で行われる工程である、[1]から[9]のいずれか1項に記載の方法。
[11] 前記工程(i)および(ii)が、それぞれ14日で行われる工程である、[10]に記載の方法。
[12] [1]から[11]に記載の方法で製造された軟骨細胞を含む、医薬品。
[13] 関節軟骨損傷治療用である、[12]に記載の医薬品。
(i)多能性幹細胞をBMP2、TGFβおよびGDF5から成る群より選択される1以上の物質ならびにHMG-CoA還元酵素阻害薬を含む培養液中で接着培養する工程、および
(ii)前記工程(ii)で得られた細胞をBMP2、TGFβおよびGDF5から成る群より選択される1以上の物質ならびにHMG-CoA還元酵素阻害薬を含む培養液中で浮遊培養する工程。
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚(例えば胚盤胞)の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
***幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、***形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、***幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008);国際公開WO 2007/069666)。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
ntES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している(T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502)。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がntES(nuclear transfer ES)細胞である。ntES細胞の作製のためには、核移植技術(J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646)とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
Muse細胞は、WO2011/007900に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは8時間または16時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、SSEA-3およびCD105が陽性である。
本工程(i)において使用される培養液は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へBMP2、TGFβおよびGDF5から成る群から選択される1以上の物質ならびにHMG-CoA還元酵素阻害薬を添加して調製することができる。本工程(i)で用いる好ましい培養液は、BMP2、TGFβ、GDF5およびHMG-CoA還元酵素阻害薬が添加された基礎培地である。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが挙げられる。基礎培地には、必要に応じて、血清(例えば、FBS)、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)(Invitrogen)、N2サプリメント(Invitrogen)、B27サプリメント(Invitrogen)、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3’-チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX(Invitrogen)、非必須アミノ酸(NEAA)、ピルビン酸ナトリウム、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの物質も含有しうる。本工程の1つの実施形態において、基礎培地は、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、アスコルビン酸、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質および1%血清を含むDMEMである。
本工程(ii)では、前記工程(i)で得られた細胞を培養容器より剥離させ、浮遊培養することで行い得る。本工程(ii)において、細胞培養物を剥離させる方法は、力学的分離方法(例えば、ピペッティング、またはスクレーパー等を用いる方法)により行うことが好ましく、プロテアーゼ活性および/またはコラゲナーゼ活性を有する分離溶液(例えば、トリプシンとコラゲナーゼの含有溶液Accutase(TM)およびAccumax(TM)(Innovative Cell Technologies, Inc)が挙げられる)を用いない方法が好ましい。
ヒトiPS細胞
Nakagawa M, et al, Sci Rep. 4:3594 (2014) に記載の方法で樹立された1231A3株を京都大学iPS細胞研究所より受領し、ヒトiPS細胞として用いた。
ヒトiPS細胞は、0.5X TrypLE Selectを添加し、インキュベーションの後、セルスクレーパーを用いて細胞を剥離させた。細胞を計数し、1.0 x 106から2.0 x 106個を 30 mLバイオリアクター(BWV-S03A、エイブル)へ移し、10nM Y-27632(Wako)を添加したStemFit AK03(Ajinomoto)を30 mLを加えて、6 cm magnetic stirrer(BWS-S03NOS-6、エイブル)により55 rpmで回転させ、37 ℃、CO2 5%の条件下で、5日間培養した。その結果、直径50μmから300μmのiPS細胞塊が得られた。
上記の方法で得られたiPS細胞塊を回収し、軟骨分化培地を5 mLを入れた10 cm culture dish(イワキ)へ半量または全量のiPS細胞塊を播種した。なお、軟骨分化培地としては、1% FBS(Invitrogen)、1% ITS-X(Invitrogen)、50μg/mL Ascorbic Acid(Nakalai)、Non-Essential A.A.(Invitrogen)、Sodium Pyruvate(Invitrogen)、10ng/mL BMP2(Astellas)、10ng/mL TGF-β1(Peprotech)、10ng/mL GDF5(J&J)、1μM Rosuvastatin(Biovision)、Penicilline&Streptomycin(Invitrogen)およびPlasmocin(invivo gene)を添加したDMEM(SIGMA)を用いた。播種後、37 ℃、CO2 5%条件下で培養した。2日または3日後に、新しい軟骨分化培地へ交換し、以後、2日から5日の間隔で培地交換を行い、2週間培養を継続した。すると、iPS細胞塊は次第にdishへ接着して結節(nodule)が形成された。
その結果、サフラニンOにて強く染色される細胞外マトリックスおよび軟骨細胞から成る細胞塊(軟骨パーティクル)が得られることが確認された(図1)。
ヒトiPS細胞
Nakagawa M, et al, Sci Rep. 4:3594 (2014) に記載の方法で樹立された1231A3株を京都大学iPS細胞研究所より受領し、ヒトiPS細胞として用いた。
ヒトiPS細胞は、0.5X TrypLE Selectを添加し、インキュベーションの後、セルスクレーパーを用いて細胞を剥離させた。細胞を計数し、0.5 - 1.0 x 107個を 100 mLバイオリアクター(BWV-S10A、エイブル)へ移し、10nM Y-27632(Wako)を添加したStemFit AK02N(Ajinomoto)を100 mLを加えて、magnetic stirrer(BWS-S03NOS-6、エイブル)により60 rpmで回転させ、37 ℃、CO2 5%の条件下で、4-7日間培養した。その結果、直径50μmから300 μmのiPS細胞塊が得られた。
上記の方法で得られたiPS細胞塊を回収し、軟骨分化培地を5 mLを入れた10 cm suspension culture dish(sumitomo)4 - 12 dishesへiPS細胞塊を播種した。なお、軟骨分化培地としては、1% FBS(Invitrogen)、1% ITS-X(Invitrogen)、50μg/mL Ascorbic Acid(Nakalai)、Non Essential A.A.(Invitrogen)、Sodium Pyruvate(Invitrogen)、10ng/mL BMP2(Peprotech)、10ng/mL TGF-β1(Peprotech)、10ng/mL GDF5(J&J)、1μM Rosuvastatin(Biovision)、Penicilline&Streptomycin(Invitrogen)およびPlasmocin(invivo gene)を添加したDMEM(SIGMA)を用いた。播種後、37 ℃、CO2 5%条件下で培養した。1 - 5日後に、新しい軟骨分化培地へ交換し、以後、2 - 7日の間隔で培地交換を行い、2 - 3週間培養を継続した。すると、iPS細胞塊は次第にdishへ接着して結節(nodule)が形成された。
その結果、サフラニンOにて強く染色される細胞外マトリックスおよび軟骨細胞から成る細胞塊(軟骨パーティクル)が得られることが確認された。
ヒトiPS細胞
Nakagawa M, et al, Sci Rep. 4:3594 (2014) に記載の方法で樹立されたFf-I01株を京都大学iPS細胞研究所より受領し、ヒトiPS細胞として用いた。
ヒトiPS細胞は、0.5X TrypLE Selectを添加し、インキュベーションの後、セルスクレーパーを用いて細胞を剥離させた。細胞を計数し、0.5 - 1.0 x 107個を 100 mLバイオリアクター(BWV-S10A、エイブル)へ移し、10nM Y-27632(Wako)を添加したStemFit AK03N(Ajinomoto)を100 mLを加えて、magnetic stirrer(BWS-S03NOS-6、エイブル)により60 rpmで回転させ、37 ℃、CO2 5%の条件下で、4 - 7日間培養した。その結果、直径50μmから300 μmのiPS細胞塊を得られた。
上記の方法で得られたiPS細胞塊を回収し、軟骨分化培地を5 mLを入れた10 cm suspension culture dish(sumitomo)4 - 12dishesへ iPS細胞塊を播種した。なお、軟骨分化培地としては、0.2% FBS(Invitrogen)、1% ITS-X(Invitrogen)、50μg/mL Ascorbic Acid(Nakalai)、Non Essential A.A.(Invitrogen)、Sodium Pyruvate(Invitrogen)、10ng/mL BMP2(PeproTech)、10ng/mL TGF-β3(Wako)、10ng/mL GDF5(Biovision)、1μM Rosuvastatin(Biovision)、を添加したDMEM(SIGMA)を用いた。播種後、37 ℃、CO2 5%条件下で培養した。1 - 3日後に、新しい軟骨分化培地へ交換し、以後、2 - 5日の間隔で培地交換を行い、2 - 3週間培養を継続した。すると、iPS細胞塊は次第にdishへ接着して結節(nodule)が形成された。
その結果、サフラニンOにて強く染色される細胞外マトリックスおよび軟骨細胞から成る細胞塊(軟骨パーティクル)が得られることが確認された。
実施例1において、分化開始から42日目に得られたヒトiPS細胞由来軟骨パーティクルをSCIDマウス(C.B-17/Icr-scid/scid Jcl)の皮下に移植し、3か月後および12か月後にマウスから移植部位を切り出し定法に従い組織標本を作製して組織学的分析に供した。その結果、図3に示したように、12か月後の移植部位では軟骨−骨様組織−軟骨という構造が形成された。これは、ヒトiPS細胞由来軟骨がマウスの皮下で、内軟骨性骨化を起こしたことを示すものである。拡大像では、軟骨が骨様組織に移行する部分の軟骨細胞は大きく肥大化しており、その周囲のマトリックスにはX型コラーゲンが発現していた。大きくなることとX型コラーゲンの発現は、肥大軟骨細胞の特徴であり、この部の軟骨細胞が肥大軟骨細胞であることを示す。肥大軟骨細胞が存在することから、内軟骨性骨化を起こしていると考えた。
ヒトiPS細胞由来軟骨パーティクルが内軟骨性骨化を起こすポテンシャルを持つこと、図2で示した形態的類似性、および図3で示した機能的類似性から、ヒトiPS細胞由来軟骨パーティクルが胎児(仔)の軟骨原基に相当することが示唆された。
実施例1において、分化開始から90日目に得られた2個のヒトiPS細胞由来軟骨パーティクルが培養液中で接触した状態で60日間培養した。その結果、図4に示したように、2個のパーティクルは融合(integration)して1個のパーティクルを形成した。もともとは、2個の独立した軟骨周膜に囲まれた軟骨組織であったが、融合部では軟骨周膜が消失し、軟骨組織同士でつながり始めていることが観察された。
軟骨の再生医療では、複数個の軟骨パーティクルを患者または動物モデルの軟骨欠損部に移植する。移植部が修復されるためには、軟骨パーティクル同士、および軟骨パーティクルと母床の軟骨が融合する必要がある。本発明により得られたヒトiPS細胞由来軟骨パーティクルはIn vitroで軟骨パーティクル同士が融合することが確認されたので、生体に移植後も融合が期待でき、良い修復が得られると考えられる。
Claims (13)
- 次の工程を含む多能性幹細胞から軟骨細胞を製造する方法:
(i)多能性幹細胞をBMP2、TGFβおよびGDF5から成る群より選択される1以上の物質ならびにHMG-CoA還元酵素阻害薬を含む培養液中で接着条件で培養する工程、および
(ii)前記工程(i)で得られた細胞をBMP2、TGFβおよびGDF5から成る群より選択される1以上の物質ならびにHMG-CoA還元酵素阻害薬を含む培養液中で浮遊条件で培養する工程。 - 前記工程(i)および(ii)の工程で用いる培養液が、BMP2、TGFβ、GDF5およびHMG-CoA還元酵素阻害薬を含む培養液である、請求項1に記載の方法。
- 前記HMG-CoA還元酵素阻害薬が、メバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチンおよびロバスタチンから成る群より選択される薬剤である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記HMG-CoA還元酵素阻害薬が、ロスバスタチンである、請求項3に記載の方法。
- 前記工程(i)および(ii)の工程で用いる培養液が、さらに血清を含む培養液である、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(ii)が、前記工程(i)で得られた細胞を分離溶液を用いずに、浮遊培養を行う工程である、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(i)で用いる多能性幹細胞が、細胞塊の状態である、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、多能性幹細胞を未分化状態で培養できる培養液中で浮遊培養する工程を含む方法により製造された細胞塊である、請求項7に記載の方法。
- 前記軟骨細胞が、軟骨細胞と細胞外マトリックスを含む塊である、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(i)および(ii)が、それぞれ7日以上28日以下の期間で行われる工程である、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(i)および(ii)が、それぞれ14日で行われる工程である、請求項10に記載の方法。
- 請求項1から11に記載の方法で製造された軟骨細胞を含む、医薬品。
- 関節軟骨損傷治療用である、請求項12に記載の医薬品。
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