JPWO2016063522A1 - 抗ヒトGas6モノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書は、本願の優先権の基礎である米国仮出願US62/066,687(2014年10月21日出願)の明細書に記載された内容を包含する。 本発明は、ヒトGrowth Arrest Specific 6 (hGas6)に特異的に結合する抗体であって、ヒトGas6の314、315及び316番目のアミノ酸残基のうち、少なくとも一つのアミノ酸残基に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片、前記抗体または抗体断片をコードする塩基配列を含む核酸、前記核酸を含む形質転換細胞、前記抗体または抗体断片の製造方法、前記抗体または抗体断片を用いたGas6の検出または測定用試薬、前記抗体または抗体断片を有効成分として含むGas6関連疾患の治療薬または診断薬、またはGas6関連疾患の治療薬または診断薬の製造のための前記抗体または抗体断片の使用に関する。
これまでに、抗ヒトGas6モノクローナル抗体としては、WG1(特許文献1)及びCNTO300(非特許文献22)が知られている。WG1及びCNTO300は、in vitroでGas6とその受容体であるAxlとの結合を阻害する活性を有することが報告されている。また、その他のGas6中和抗体については知られていない。
すなわち、本発明は以下の(1)〜(19)に関する。
(1) ヒトGas6の314、315及び316番目のアミノ酸残基のうち、少なくとも一つのアミノ酸残基に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片。
(2) モノクローナル抗体が、ヒトGas6の314、315及び316番目のアミノ酸残基に結合するモノクローナル抗体である、(1)に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
(3) モノクローナル抗体が、下記(a)〜(e)から選ばれるいずれか一つの抗体である、(1)または(2)に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
(a) 抗体のVHのCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号79、80及び81に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号82、83及び84に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(b)抗体のVHのCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号85、86及び87に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号88、89及び90に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(c) 前記(a)または(b)に記載の抗体と、ヒトGas6への結合について競合する抗体。
(d)前記(a)または(b)に記載の抗体が結合するエピトープを含むエピトープに結合する抗体、すなわち、前記(a)または(b)に記載の抗体が結合するエピトープを含むエピトープへの結合に対して競合する抗体。
(e)前記(a)または(b)に記載の抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体、すなわち、前記(a)または(b)に記載の抗体が結合するエピトープへの結合に対して競合する抗体。
(4) モノクローナル抗体が、下記(a)〜(e)から選ばれるいずれか一つの抗体である、(1)〜(3)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
(a)抗体のVHのアミノ酸配列が配列番号69に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのアミノ酸配列が配列番号72に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(b)抗体のVHのアミノ酸配列が配列番号75に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのアミノ酸配列が配列番号78に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(c)抗体のVHのアミノ酸配列が配列番号135に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのアミノ酸配列が配列番号123に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(d)抗体のVHのアミノ酸配列が配列番号195に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのアミノ酸配列が配列番号174に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(e)抗体のVHのアミノ酸配列が配列番号186に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのアミノ酸配列が配列番号180に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(5) モノクローナル抗体が遺伝子組換え抗体である(1)〜(4)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
(6) 遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、(5)に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
(7) 抗体断片が、Fab、Fab’、(Fab’)2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)及びCDRを含むペプチドから選ばれる、(1)〜(6)のいずれか一つに記載の抗体断片。
(8) (1)〜(7)のいずれか一つに記載の抗体または該抗体断片をコードする塩基配列を有する核酸。
(9) (8)に記載の核酸を含む形質転換細胞。
(10) (9)に記載の細胞を培地で培養し、培養液から該抗体または該抗体断片を採取することを含む (1)〜(7)に記載の抗体または該抗体断片の製造方法。
(11) (1)〜(7)に記載の抗体または該抗体断片を(所望により薬理学的に許容しうる担体とともに)含むGas6の検出または測定用試薬。
(12) (1)〜(7)に記載の抗体または該抗体断片を有効成分として(所望により薬理学的に許容しうる担体とともに)含む、Gas6関連疾患の治療薬。
(13) Gas6関連疾患が腎または癌の疾患である(12)に記載の治療薬。
(14) 腎の疾患が進行性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸体腎炎、糖尿病性腎症またはIgA腎症である(13)に記載の治療薬。
(15) 癌の疾患が肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎癌またはグリオブラストーマである(13)に記載の治療薬。
(16) (1)〜(7)に記載の抗体または該抗体断片を有効成分として(所望により薬理学的に許容しうる担体とともに)含む、Gas6関連疾患の診断薬。
(17) (1)〜(7)に記載の抗体または該抗体断片を用いてGas6の検出または測定をすることを含む、Gas6関連疾患の診断方法。
(18) Gas6関連疾患の治療薬の製造のための、(1)〜(7)のいずれか一つに記載の抗体または該抗体断片の使用。
(19) Gas6関連疾患の診断薬の製造のための、(1)〜(7)のいずれか一つに記載の抗体または該抗体断片の使用。
(a) 抗体の重鎖可変領域(Heavy chain variable region)(以下、VHと称する)の相補性決定領域(Complementarity Determining Region)(以下、CDRと称する)1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号79、80及び81に記載されるアミノ酸配列であって、かつ軽鎖可変領域(Light chain variable region)(以下、VLと称する)のCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号82、83及び84に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(b)抗体のVHのCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号85、86及び87に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号88、89及び90に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(c) 前記(a)または(b)に記載の抗体と、ヒトGas6への結合について競合する抗体 (d)前記(a)または(b)に記載の抗体が結合するエピトープを含むエピトープに結合する抗体。
(e)前記(a)または(b)に記載の抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
(a)抗体のVHのアミノ酸配列が配列番号69に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのアミノ酸配列が配列番号72に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(b)抗体のVHのアミノ酸配列が配列番号75に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのアミノ酸配列が配列番号78に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(c)抗体のVHのアミノ酸配列が配列番号135に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのアミノ酸配列が配列番号123に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(d)抗体のVHのアミノ酸配列が配列番号195に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのアミノ酸配列が配列番号174に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(e)抗体のVHのアミノ酸配列が配列番号186に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのアミノ酸配列が配列番号180に記載されるアミノ酸配列である抗体。
本発明においてヒトGas6としては、配列番号4に記載のアミノ酸配列もしくはNCBIアクセッション番号NP_000811のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号4に記載のアミノ酸配列またはNCBIアクセッション番号NP_000811のアミノ酸配列において1つ以上のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されたアミノ酸配列から成り、かつヒトGas6の機能を有するポリペプチド、または配列番号4に記載のアミノ酸配列またはNCBIアクセッション番号NP_000811のアミノ酸配列と60%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列から成りかつヒトGas6の機能を有するポリペプチドなどがあげられる。
翻訳後修飾により修飾されたアミノ酸配列としては、糖鎖がOH置換基を有するTyrおよびSerに結合したO結合型糖鎖、NH2置換基を有するGlnおよびAsnに結合したN結合型糖鎖ならびに硫酸分子がOH置換基を有するTyrに結合した硫酸基などが結合したアミノ酸配列があげられる。
本発明において、Gas6受容体として具体的にはAxl、Sky、Mer TK等が挙げられる。
(1)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の2番目のVal、15番目のLeu、46番目のLeu、73番目のLeu、78番目のLeu、及び87番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(2)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の2番目のVal、46番目のLeu、73番目のLeu、78番目のLeu、及び87番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(3)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の46番目のLeu、73番目のLeu、及び87番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(4)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の15番目のLeu、及び73番目のLeuが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(5)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の78番目のLeu、及び87番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(6)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の78番目のLeuが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(7)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の87番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(1)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の2番目のValをIleに、46番目のLeuをValに、73番目のLeuをPheに、78番目のLeuをValに、及び87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の2番目のValをIleに、15番目のLeuをAlaに、46番目のLeuをValに、73番目のLeuをPheに、及び87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の2番目のValをIleに、15番目のLeuをAlaに、73番目のLeuをPheに、78番目のLeuをValに、及び87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の15番目のLeuをAlaに、46番目のLeuをValに、73番目のLeuをPheに、78番目のLeuをValに、及び87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の46番目のLeuをValに、73番目のLeuをPheに、78番目のLeuをValに、及び87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の2番目のValをIleに、73番目のLeuをPheに、78番目のLeuをValに、及び87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の2番目のValをIleに、46番目のLeuをValに、73番目のLeuをPheに、及び78番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の2番目のValをIleに、15番目のLeuをAlaに、73番目のLeuをPheに、及び87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の46番目のLeuをValに、73番目のLeuをPheに、及び87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の15番目のLeuをAlaに、46番目のLeuをValに、及び87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の15番目のLeuをAlaに、46番目のLeuをValに、及び78番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の46番目のLeuをValに、73番目のLeuをPheに、及び78番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の78番目のLeuをValに、及び87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の15番目のLeuをAlaに、及び73番目のLeuをPheに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の46番目のLeuをValに、及び78番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の2番目のValをIleに、及び15番目のLeuをAlaに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の2番目のValをIleに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の46番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の78番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号105で表わされるアミノ酸配列中の87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の2番目のVal、9番目のSer、20番目のVal、38番目のArg、46番目のGlu、77番目のSer、93番目のVal、及び95番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(2)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の9番目のSer、20番目のVal、38番目のArg、46番目のGlu、93番目のVal、及び95番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(3)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の9番目のSer、46番目のGlu、93番目のVal、及び95番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(4)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の46番目のGlu、93番目のVal、及び95番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(5)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の2番目のVal、20番目のVal、及び95番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(6)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の9番目のSer、38番目のArg、及び46番目のGluが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(7)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の93番目のVal、及び95番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(8)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の46番目のGluが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(1)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、20番目のValをIleに、38番目のArgをLysに、46番目のGluをLysに、77番目のSerをThrに、93番目のValをThrに、及び95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、2番目のValをIleに、9番目のSerをProに、20番目のValをIleに、38番目のArgをLysに、77番目のSerをThrに、及び93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、9番目のSerをProに、20番目のValをIleに、38番目のArgをLysに、46番目のGluをLysに、93番目のValをThrに、及び95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、9番目のSerをProに、38番目のArgをLysに、46番目のGluをLysに、77番目のSerをThrに、93番目のValをThrに、及び95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、9番目のSerをProに、20番目のValをIleに、46番目のGluをLysに、及び93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、9番目のSerをProに、46番目のGluをLysに、93番目のValをThrに、及び95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、20番目のValをIleに、46番目のGluをLysに、93番目のValをThrに、及び95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、38番目のArgをLysに、46番目のGluをLysに、93番目のValをThrに、及び95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、2番目のValをIleに、20番目のValをIleに、及び95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、9番目のSerをProに、38番目のArgをLysに、及び46番目のGluをLysに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、46番目のGluをLysに、93番目のValをThrに、及び95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、9番目のSerをProに、38番目のArgをLysに、及び95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、9番目のSerをProに、及び38番目のArgをLysに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、20番目のValをIleに、及び77番目のSerをThrに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、46番目のGluをLys、及び95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、93番目のValをThrに、及び95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(1) 配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、20番目のValをIleに置換したアミノ酸配列
(2) 配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、38番目のArgをLysに置換したアミノ酸配列
(3) 配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、46番目のGluをLysに置換したアミノ酸配列
(4) 配列番号129で表わされるアミノ酸配列中の、95番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(1)抗体のVHが配列番号135で表わされるアミノ酸配列及び/又は抗体のVLが配列番号123で表わされるアミノ酸配列を含むヒト化抗体
(2)抗体のVHが図8に示されるいずれかのアミノ酸配列及び/又は抗体のVLが配列番号123で表わされるアミノ酸配列を含むヒト化抗体
(3)抗体のVHが配列番号135で表わされるアミノ酸配列及び/又は抗体のVLが図7に示されるいずれかのアミノ酸配列を含むヒト化抗体
(1)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の4番目のLeu、13番目のAla、15番目のVal、43番目のAla、64番目のGly、73番目のLeu、78番目のLeu、85番目のThr、及び104番目のValが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(2)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の13番目のAla、15番目のVal、64番目のGly、73番目のLeu、78番目のLeu、85番目のThr、及び104番目のValが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(3)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の13番目のAla、15番目のVal、43番目のAla、73番目のLeu、78番目のLeu、及び85番目のThrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(4)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の13番目のAla、15番目のVal、73番目のLeu、及び78番目のLeuが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(5)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の15番目のVal、78番目のLeu、及び85番目のThrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(6)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の13番目のAla、及び43番目のAlaが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(7)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の43番目のAlaが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(1)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の4番目のLeuをValに、13番目のAlaをValに、64番目のGlyをSerに、73番目のLeuをPheに、78番目のLeuをThrに、85番目のThrをAspに、及び104番目のValをLeuに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の13番目のAlaをValに、15番目のValをThrに、43番目のAlaをProに、64番目のGlyをSerに、73番目のLeuをPheに、78番目のLeuをThrに、及び85番目のThrをAspに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の4番目のLeuをValに、15番目のValをThrに、43番目のAlaをProに、64番目のGlyをSerに、78番目のLeuをThrに、85番目のThrをAspに、及び104番目のValをLeuに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の4番目のLeuをValに、15番目のValをThrに、43番目のAlaをProに、64番目のGlyをSerに、73番目のLeuをPheに、78番目のLeuをThrに、及び85番目のThrをAspに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の4番目のLeuをValに、15番目のValをThrに、43番目のAlaをProに、64番目のGlyをSerに、85番目のThrをAspに、及び104番目のValをLeuに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の13番目のAlaをValに、15番目のValをThrに、43番目のAlaをProに、64番目のGlyをSerに、78番目のLeuをThrに、及び85番目のThrをAspに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の15番目のValをThrに、43番目のAlaをProに、64番目のGlyをSerに、73番目のLeuをPheに、78番目のLeuをThrに、及び85番目のThrをAspに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の13番目のAlaをValに、43番目のAlaをProに、64番目のGlyをSerに、73番目のLeuをPheに、78番目のLeuをThrに、及び85番目のThrをAspに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の4番目のLeuをValに、13番目のAlaをValに、15番目のValをThrに、及び43番目のAlaをProに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の13番目のAlaをValに、15番目のValをThrに、43番目のAlaをProに、及び85番目のThrをAspに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の13番目のAlaをValに、15番目のValをThrに、73番目のLeuをPheに、及び78番目のLeuをThrに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の13番目のAlaをValに、15番目のValをThrに、73番目のLeuをPheに、及び85番目のThrをAspに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の13番目のAlaをValに、15番目のValをThrに、及び73番目のLeuをPheに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の13番目のAlaをValに、73番目のLeuをPheに、及び85番目のThrをAspに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の15番目のValをThrに、78番目のLeuをThrに、及び85番目のThrをAspに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の43番目のAlaをProに、73番目のLeuをPheに、及び78番目のLeuをThrに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の13番目のAlaをValに、及び15番目のValをThrに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の13番目のAlaをValに、及び43番目のAlaをProに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の15番目のValをThrに、及び85番目のThrをAspに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の43番目のAlaをProに、及び64番目のGlyをSerに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の13番目のAlaをValに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の43番目のAlaをProに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の73番目のLeuをPheに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号156で表わされるアミノ酸配列中の85番目のThrをAspに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の2番目のVal、9番目のSer、38番目のArg、46番目のGlu、79番目のSer、93番目のVal、及び112番目のValが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(2)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の2番目のVal、38番目のArg、46番目のGlu、79番目のSer、及び112番目のValが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(3)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の2番目のVal、9番目のSer、79番目のSer、及び112番目のValが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(4)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の9番目のSer、46番目のGlu、及び93番目のValが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(5)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の38番目のArg、46番目のGlu、及び93番目のValが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(6)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の38番目のArg、及び46番目のGluが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(7)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の9番目のSer、及び93番目のValが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(8)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の46番目のGluが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(1)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、2番目のValをIleに、9番目のSerをProに、38番目のArgをLysに、46番目のGluをLysに、及び112番目のValをIleに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、2番目のValをIleに、38番目のArgをLysに、46番目のGluをLysに、79番目のSerをAlaに、及び112番目のValをIleに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、2番目のValをIleに、38番目のArgをLysに、46番目のGluをLysに、79番目のSerをAlaに、及び93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、9番目のSerをProに、38番目のArgをLysに、46番目のGluをLysに、93番目のValをThrに、及び112番目のValをIleに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、2番目のValをIleに、9番目のSerをProに、79番目のSerをAlaに、及び112番目のValをIleに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、9番目のSerをProに、38番目のArgをLysに、46番目のGluをLysに、及び79番目のSerをAlaに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、9番目のSerをProに、38番目のArgをLysに、46番目のGluをLysに、及び93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、9番目のSerをProに、46番目のGluをLysに、79番目のSerをAlaに、及び112番目のValをIleに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、9番目のSerをProに、46番目のGluをLysに、及び93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、2番目のValをIleに、38番目のArgをLysに、及び46番目のGluをLysに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、38番目のArgをLysに、46番目のGluをLysに、及び79番目のSerをAlaに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、38番目のArgをLysに、46番目のGluをLysに、及び93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、38番目のArgをLysに、及び46番目のGluをLysに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、9番目のSerをProに、及び93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、9番目のSerをProに、及び38番目のArgをLysに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、79番目のSerをAlaに、及び93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、9番目のSerをProに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、38番目のArgをLysに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、46番目のGluをLysに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号186で表わされるアミノ酸配列中の、93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列
(1)抗体のVHが配列番号195で表わされるアミノ酸配列及び/又は抗体のVLが配列番号174で示されるアミノ酸配列を含むヒト化抗体
(2)抗体のVHが図10に示されるいずれかのアミノ酸配列及び/又は抗体のVLが配列番号174で表わされるアミノ酸配列を含むヒト化抗体
(3)抗体のVHが配列番号195で表わされるアミノ酸配列及び/又は抗体のVLが図9に示されるいずれかのアミノ酸配列を含むヒト化抗体
(4)抗体のVHが配列番号186で表わされるアミノ酸配列及び/又は抗体のVLが配列番号180で表わされるアミノ酸配列を含むヒト化抗体
(5)抗体のVHが図10に示されるいずれかのアミノ酸配列及び/又は抗体のVLが配列番号180で表わされるアミノ酸配列を含むヒト化抗体
(6)抗体のVHが配列番号186で表わされるアミノ酸配列及び/又は抗体のVLが図9に示されるいずれかのアミノ酸配列を含むヒト化抗体
Fabは、IgG抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち(H鎖の224番目のアミノ酸残基で切断される)、H鎖のN末端側約半分とL鎖全体がジスルフィド結合(S-S結合)で結合した、分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ領域のS-S結合を切断した分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Diabodyは、抗原結合特異性の同じまたは異なるscFvが2量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する2価の抗原結合活性または異なる抗原に対する特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
以下に、本発明の抗体の製造方法、疾患の治療方法、および疾患の診断方法について、具体的に説明する。
(1)抗原の調製
抗原となるヒトGas6は、ヒトGas6全長またはその部分長をコードするcDNAを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞などに導入したヒトGas6発現細胞から精製することで得られる。また、ヒトGas6を多量に発現している各種ヒト細胞株、ヒト細胞、ヒト組織などからヒトGas6を精製することによっても得ることが出来る。さらに、Fmoc法、またはtBoc法などの化学合成法によりヒトGas6の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。ヒトGas6またはヒトGas6の部分配列を有する合成ペプチドには、C末端もしくはN末端にFLAGもしくはHisなどの公知のタグが付加されていてもよい。
宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞、または動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
また、該ヒトGas6をコードするDNAの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするヒトGas6の生産率を向上させることができる。
ヒトGas6の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、または宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるヒトGas6の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
得られたヒトGas6は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。
3〜20週令のマウス、ラットまたはハムスターなどの動物に、(1)で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、マウスGas6ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、8-アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来)骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J. Immunology, 6, 511 (1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature, 276, 269 (1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J. Immunology, 123, 1548 (1979)]、またはP3-X63-Ag8(X63)[Nature, 256, 495 (1975)]などが用いられる。
(2)で得られる融合用抗体産生細胞と(3)で得られる骨髄腫細胞をMinimum Essential Medium(MEM)培地またはPBS(リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸一カリウム0.21g、食塩7.65g、蒸留水1リットル、pH7.2)でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞:骨髄腫細胞=5〜10:1になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール−1000(PEG-1000)、MEM培地およびジメチルスルホキシドの混液を37℃で、攪拌しながら加える。さらに1〜2分間毎にMEM培地1〜2 mLを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50 mLになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にHAT培地[ヒポキサンチン、チミジン、およびアミノプテリンを加えた正常培地]中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を5% CO2インキュベーター中、37℃で7〜14日間培養する。
プリスタン処理[2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン(Pristane)0.5 mLを腹腔内投与し、2週間飼育する]した8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、(4)で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。10〜21日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、40〜50% 硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、DEAE-セファロースカラム、プロテインA−カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、IgGあるいはIgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
モノクローナル抗体の選択は以下に示す酵素免疫測定法によるバインディングアッセイまたは競合アッセイなどにより行う。これらの方法以外に、Biacore(登録商標)によるKinetics解析などによりモノクローナル抗体を選択することもできる。また、公知の方法[The Prostate, 67, 1163 (2007)]により、抗体の標的抗原を同定することでモノクローナル抗体を選択することもできる。
抗原としては、(1)で得られるヒトGas6をコードするcDNAを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、あるいは動物細胞などに導入して得られたリコンビナントタンパク質、またはヒト組織から得た精製ポリペプチドあるいは部分ペプチドなどを用いる。抗原がリコンビナントタンパク質である場合には、FLAGまたはHisなどのタグが付加されていてもよい。抗原が部分ペプチドである場合には、BSAまたはKLHなどのキャリアタンパク質とコンジュゲートを作製して、これを用いる。
(1)に記載の方法に準じて、ヒトAxl細胞外ドメインとヒトIgG1重鎖定常領域融合タンパク質(hAxl-hFc)を調整する。hAxl-hFcは、ヒトAxl細胞外ドメインとIgG1重鎖定常領域との間に適当な制限酵素認識配列を有していてもよい。得られたhAxl-hFcを96ウェルプレートに分注し、固相化する。次に、ハイブリドーマ培養上清または精製モノクローナル抗体などの被験物質及び(1)で得られるタグ付きhGas6の混合溶液をウェルに分注し、反応させる。PBSまたはPBS-Tweenなどでよく洗浄した後、検出用抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質または放射線化合物などで標識した上記タグに対する抗体を分注して反応させる。PBS-Tweenでよく洗浄した後、検出用抗体の標識物質に応じた反応を行い、hGas6とhAxl-hFcとの結合を阻害するモノクローナル抗体を選択する。
Biacore(登録商標) T100を用い、抗原と被験物質の間の結合におけるカイネティクスを測定し、その結果を機器付属の解析ソフトウエアで解析をする。抗マウスIgG抗体をセンサーチップCM5にアミンカップリング法により固定した後、ハイブリドーマ培養上清または精製モノクローナル抗体などの被験物質を流し、適当量結合させ、更に濃度既知の複数濃度の抗原を流し、結合、解離を測定する。得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、1:1バインディングモデルによりカイネティクス解析を行い、各種パラメータを取得する。または、ヒトGas6、該部分ペプチド、該部分ペプチドをキャリアタンパク質とコンジュゲートしたものをセンサーチップ上に、例えばアミンカップリング法により固定した後、濃度既知の複数濃度の精製モノクローナル抗体を流し、結合および解離を測定する。得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、バイバレントバインディングモデルによるカイネティクス解析を行い、各種パラメータを取得する。
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の作製方法を示す。
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
非ヒト抗体のVH及びVLをコードするcDNAの取得およびアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
(1)で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHまたはCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のVHまたはVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
ヒト化抗体のVHまたはVLをコードするcDNAは、以下のようにして構築することができる。
ヒト化抗体は、非ヒト抗体のVHおよびVLのCDRのみをヒト抗体のVHおよびVLのFRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する[BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)]。ヒト化抗体では、ヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、CDRのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。
(1)で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHまたはCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のVHまたはVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。
(3)および(6)で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、またはそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
(3)および(6)で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法[特開平2-257891、Cytotechnology, 3, 133 (1990)]などを用いる。
精製した本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。
本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片は、ヒトGas6依存的な細胞増殖、病変などGas6が関連する疾患であれば、いずれのヒトGas6関連疾患の治療に用いることができる。
経口投与に適当な製剤は、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、または顆粒剤などである。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、またはその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて製造する。
さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いて、ヒトGas6またはヒトGas6が発現した細胞を検出または測定することにより、ヒトGas6関連疾患を診断することができる。
ヒトGas6関連疾患である腎または癌疾患の診断は、例えば患者体内に存在するヒトGas6を免疫学的手法により検出または測定して行うことができる。また、患者体内の細胞に発現しているヒトGas6をフローサイトメトリーなどの免疫学的手法を用いて検出することにより診断を行うことができる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
タコニック社よりGas6へテロKOマウスの***を購入した。購入したGas6ヘテロKOマウスのバックグラウンドは129/SvEv-C57BL/6であった。日本クレア社にて、当該Gas6へテロKOマウスの***をC57BL/6NJclマウスの卵子と体外受精させた後、レシピエントマウスに受精卵を移植して仔を得た。得られた仔に対し、公知の方法でジェノタイピングを行いGas6遺伝子がノックアウトされていることを確認し、Gas6 ホモKOマウスを得た。
免疫及びスクリーニングに使用するために、以下に記載する方法で、C末端にFLAG-tagを付加したヒト、カニクイサル、ラット及びマウスのGas6組換えタンパク質を作製した。以下、それぞれhGas6-F、cGas6-F、rGas6-F、及びmGas6-Fと記す。
hGas6-F遺伝子配列が組み込まれた動物細胞発現ベクターは、ヒトGas6の遺伝子配列(配列番号3、GenBankアクセッション番号:NM_000820)が組み込まれたプラスミド(Invitrogen社製)から以下のように作製した。
cGas6-F遺伝子が組み込まれた動物細胞発現ベクターを、以下の方法で構築した。まず最初にカニクイサルGas6遺伝子のクローニングを行った。カニクイサルGas6遺伝子を含むDNA断片はPCRにより増幅した。PCRは、鋳型であるカニクイサル肺由来のcDNA(CytoMol社製)、各10 pmolのプライマー3、4(配列番号5、6)、KOD-plus-(東洋紡社製)、及び2%DMSOを含む20 μLの反応液を調製し、94℃で2分間保温した後、94℃で15秒間、65℃で30秒間、及び68℃で2.5分間を1サイクルとして35サイクル行った。以降は(1)と同様の方法で、pCR4-Blunt-TOPOベクターに増幅DNA断片(cGas6遺伝子を含むDNA断片)を挿入したプラスミドpCR4-cGas6を得た。得られたプラスミドについて通常の方法でシーケンス解析を行い、得られたカニクイサルGas6の塩基配列を配列番号7に、当該塩基配列から推定されるカニクイサルGas6のアミノ酸配列を配列番号8に示した。
rGas6-F遺伝子が組み込まれた動物細胞発現ベクターを以下の方法で作製した。
rGas6-F遺伝子を含むDNA断片は、PCR法により増幅させた。PCRは、鋳型であるラット心臓又は肝臓由来のcDNA(タカラバイオ社製)、各10 pmolのプライマー7、8(配列番号11、12)、及びKOD FX(東洋紡社製)を含む20 μLの反応液を調製し、94℃で2分間保温した後、94℃で15秒間、58℃で30秒間、及び68℃で2.5分間を1サイクルとして30サイクル行った。
得られたpCR4-rGas6-Fをもとにして、(1)と同様の方法で、pKANTEX93にrGas6-F遺伝子を挿入し、rGas6-F動物細胞発現ベクターであるpKANTEX-rGas6-Fを得た。
mGas6-F遺伝子が組み込まれた動物細胞発現ベクターを、以下に記載する方法で作製した。
mGas6-F遺伝子を含むDNA断片をPCRにより増幅させた。PCRは、鋳型であるマウス腎臓又は肺由来のcDNA(ambion社製)、各10 pmolのプライマー7、9(配列番号11及び15)のプライマー、及びKOD FX(東洋紡社製)を含む20 μLの反応液を調製し、94℃で2分間保温した後、94℃で15秒間、58℃で30秒間、及び68℃で2.5分間を1サイクルとして30サイクル行った。(1)と同様の方法で、pCR4-Blunt-TOPOベクターにPCRで増幅させたDNA断片(mGas6-F遺伝子を含むDNA断片)を挿入し、プラスミドpCR4-mGas6-Fを得た。得られたプラスミドが有するマウスGas6の塩基配列は、GenBankアクセッション番号:NM_019521で示されるマウスGas6の塩基配列(配列番号16)と一致し、PCRに起因する遺伝子変異が生じていないことを確認した。得られたpCR4-mGas6-Fをもとにして、(1)と同様の方法でpKANTEX93にmGas6-F遺伝子を挿入し、mGas6-F動物細胞発現ベクターであるpKANTEX-mGas6-Fを得た。
hGas6-Fの安定発現細胞株を樹立するため、(1)で作製したhGas6-F発現ベクターpKANTEX-hGas6-Fを、エレクトロポレーション法[サイトテクノロジー、3,133(199)]を用いて、以下のようにしてdhfrが欠損したCHO細胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)]に導入した。
細胞の培養は、通常継代には基礎培地[10% 透析FBS(GIBCO社製)、1×HT溶液(invitrogen社製)、50μg/mL Gentamicin(ナカライテスク社製)を含むIMDM(Invitrogen社製)]を使用した。遺伝子導入後の細胞の選抜時には50 nM、200 nMもしくは500 nMのmethotrexate hydrate(Sigma-Aldrich社製)(以下、MTXと記載する)を含む基礎培地(MTX培地)を使用した。いずれの細胞も、37℃、5% CO2条件下で静置培養した。
(2)〜(4)で作製したpKANTEX-cGas6-F、pKANTEX-rGas6-F、及びpKANTEX-mGas6を、(5)と同様の方法で宿主細胞に導入し、cGas6-F、rGas6-F及びmGas6-F安定発現細胞株を樹立した。
上記のベクターは、いずれも制限酵素MulIを用いて酵素処理することにより線状化させた。フェノール/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該線状化ベクターを精製し、滅菌水に溶解させて実験に供した。
培養上清中のcGas6-Fの発現量は、human Gas6 ELISA kit(R&D社製)を用いて測定した。また、rGas6-F及びmGas6-Fの発現量は、mouse Gas6 ELISA kit(R&D社製)を用いて測定した。
活性型Gas6タンパク質を取得するためには、Gas6のGlaドメインに含まれるグルタミン酸残基のγ位の炭素が、Gla化修飾関連酵素であるGGCXによりカルボキシル化される必要がある。また、GGCXの活性化には、還元ビタミンKが必須であり、還元ビタミンKは、VKOR(vitamin K epoxide reductase complex subunit 1)によりビタミンKエポキシドが還元されてできる[Journal of Thrombosis and Haemostasis 3, 1873-1878(2005)]。そこで、活性型Gas6を得るため、ヒトGGCX(以下、hGGCXと記載する)及びラットVKOR(以下、rVKORと記載する)発現ベクターを作製した。
pAGE-rVKOR(XhoI)とpAGE-hGGCXをそれぞれXhoIで酵素処理し、(1)と同様の方法でpAGE249由来のプロモーター領域を含むhGGCX断片をpAGE-rVKOR(XhoI)に挿入してpAGE-VKOR-hGGCXを得た。
活性型の各種Gas6-Fの安定発現株を作製するため、(5)と同様の方法で、(5)及び(6)で作製した各種Gas6-F安定発現細胞株に(7)で作製したGla化修飾関連酵素発現ベクターpAGE-VKOR-hGGCXを導入した。
(8)で樹立した活性型の各種Gas6-F安定発現細胞株を、MTX・ハイグロマイシン培地に懸濁し、接着細胞用フラスコで3日間培養した。次に、培地を無血清培地[EX-CELL 302(Sigma-Aldrich社製)に6mM L-Glutamine(インビトロジェン社製)、100 ng/mL ビタミンK3(ナカライテスク社製)、500 nM MTX、500 μg/mL ハイグロマイシン、100nM 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt(Sigma-Aldrich社製)および50μg/mL Gentamicinを添加した培地]に交換し、5日間培養した後、培地を回収した。回収した培地を遠心分離し、得られた培養上清を0.22 μmフィルター(Thermo Scientific社製)を用いて滅菌濾過した。
(1)ヒトAxl細胞外ドメインとヒトIgG1重鎖定常領域との複合体(以下、hAxl-hFcと記す)発現ベクターの構築
hAxl-hFc遺伝子配列が組み込まれた動物細胞発現用ベクターを以下の方法で作製した。
cAxl-hFcの調製に必要となる発現ベクターを構築した。最初に実施例2(1)と同様の方法で、カニクイサルAxl遺伝子をpCR4-Blunt-TOPOベクターに組み込んだプラスミドを取得した。PCRは、鋳型であるカニクイサル腎臓由来のcDNA(CytoMol社製)、各10 pmolのプライマー14、15(配列番号30、31)、KOD-FX(東洋紡社製)、及び2%DMSOを含む20 μLの反応液を調製し、94℃で2分間保温した後、94℃で15秒間、60℃で30秒間、及び68℃で3.5分間を1サイクルとして30サイクル行った。得られたプラスミドが有するカニクイサルAxlの塩基配列を配列番号32に示した。また、当該塩基配列より推定されるカニクイサルAxlのアミノ酸配列を配列番号33に示した。
rAxl-hFcの調製に必要となる発現ベクターを以下に記載する方法で構築した。GenScript社にて、ラットAxlの細胞外ドメインの塩基配列を全合成し、pUC57プラスミドに組み込んだpUC57-rAxlを得た。ラットAxlの細胞外ドメインの塩基配列は、配列番号40で表わされるラットAxlの塩基配列(GenBankアクセッション番号NM_0317941)の1〜1329番目の塩基を使用した。
mAxl-mFcの調製に必要となる発現ベクターを以下に記載する方法で構築した。タカラバイオ社にて、配列番号48で示したmAxl-mFcを含む塩基配列を全合成し、pMD19プラスミドに組み込んだpMD19-mAxl-mFcを得た。mAxl-mFcは、5’末端からBglII及びMluI認識配列、マウスAxlの細胞外ドメインをコードする塩基配列(配列番号46で示されるマウスAxlの塩基配列のうち、1〜1329番目の塩基配列)、BamHI、SalI及びEcoRI認識配列ならびにマウスIgG1重鎖定常領域をコードする塩基配列からなる。 pMD19-mAxl-mFcを制限酵素BglII及びBamHIで酵素処理し、(1)と同様の方法でpKTABEX-Tc26.2に挿入し、mAxl-mFc組換え体発現ベクターpKTABEX- mAxl-mFcを得た。
hAxl-hFc及びmAxl-mFcの安定発現株を作製するため、宿主細胞に発現ベクターを導入した。hAxl-hFc及びmAxl-mFc発現用宿主細胞としてCHO-K1(理研)を用いた。細胞培養については、通常継代には、4 mM L-Glutamine(invitrogen社製)及び50μg/mL Gentamicin(ナカライテスク社製)を含むEX-CELL 325 PF(ニチレイバイオサイエンス社製)(基礎培地)を使用した。また、遺伝子導入株の選抜時には3μg/mL Cycloheximide Ready Made Solution (SIGMA社製)を含む基礎培地(CHX培地)を使用した。いずれの細胞も、37℃、5% CO2条件下で振とう培養した。
(1)で取得した10μg のpKTABEX-hAxl-hFc、20μgのトランスポゼース発現ベクター(WO2010/143698)(以下、TPEX_pMugと記載する)を含む溶液をエレクトロポレーション用キュベット(Gene Pulser cuvette,Bio-Rad社製)に添加した。PBSで調製した4×106 個/mLのCHO-K1細胞懸濁液を該キュベットに400μL加えた。キュベット中の細胞懸濁液を混和した後、Gene Pulser(BIO-RAD)を用いてパルス電圧300 V、電気容量500μFの条件にて遺伝子導入を行った。
cAxl-hFc及びrAxl-hFcの一過性発現株を作製するため、宿主細胞に発現ベクターを導入した。
cAxl-hFc及びrAxl-hFc発現用宿主細胞としてCHO-S(Life Tecnologies社製)を用いた。細胞の継代には4 mM L-Glutamine(invitrogen社製)を含むFree Style CHO(invitrogen社製)を使用し、37℃、5% CO2条件下で振とう培養した。
(5)で取得したhAxl-hFc及びmAxl-mFc安定発現細胞株を、公知のタンパク質発現用の培地に懸濁し、三角フラスコで7日間培養した後、培養上清を回収した。回収した培養上清を遠心分離し、得られた培養上清を0.22 μmフィルターを用いてろ過することでhAxl-hFcを含む培養上清を調製した。同様の手法で、mAxl-mFcを含む培養上清を調製した。
(1)CNTO抗体発現ベクターの作製
US7547767特許明細書に記載されている抗Gas6モノクローナル抗体WG1のVH及びVLの塩基配列(US7547767特許明細書のSEQ ID NO:25、27)をもとにして、当該抗体(以下、CNTO抗体と記載する)の発現ベクターを以下に記載する方法で作製した。IDT社にて、CNTO抗体のVH及びVLの塩基配列の全合成を行い、適当なプラスミドに組み込んだ。CNTO抗体のVH及びVLの塩基配列を、それぞれ配列番号61、63に記載した。また、CNTO抗体のVH及びVLのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号62、64に記載した。US7547767において配列番号25で表わされるWG1のVHの塩基配列の305番目がNと記載されていたため、カバットのヒト抗体配列情報(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept Health and Human Services(1991))および305番目の塩基とコドンを形成する304、306番目の塩基配列より、305番目の塩基としてチミジンを使用した。発現用ベクターpKANTEX93(WO97/10354)の適当な位置に公知の方法でCNTO抗体の遺伝子配列を挿入し、CNTO抗体発現ベクターであるpKANTEX-CNTOを構築した。
実施例2(5)と同様の方法で、dhfrが欠損したCHO細胞に、(1)で調製したpKANTEX-CNTOを導入し、CNTO抗体安定発現細胞株を作製した。
(2)で取得したCNTO抗体安定発現細胞株を、500 nM MTX培地に懸濁し、接着細胞用フラスコで3日間培養した。次に、培地をEX-CELL 302(6mM L-Glutamine、100nM 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt、50μg/mL Gentamicinを含む)に交換し、5日間培養した後、培養上清を回収した。回収した培養上清を遠心分離し、上清を0.22 μmフィルターを用いてろ過することでCNTO抗体を含む培養上清を調製した。
調製した培養上清より、通常の方法でCNTO抗体を精製した。レジンはMabSelect SuRe (GE ヘルスケア社製)を使用した。得られたCNTO抗体は、0.22 μmフィルターを用いて滅菌ろ過した後、試験に用いた。CNTO抗体の吸光係数は、1.43であった。
(1)動物への免疫と抗体産生細胞の調製
実施例2(9)で作製したhGas6-FまたはrGas6-Fを、実施例1で得られたKOマウスに免疫した。マウスの免疫には、アジュバントとして水酸化アルミニウム(Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,p99,1988)、及び百日咳ワクチン(ナカライテスク社製)を用いた。
8-アザグアニン耐性マウス 骨髄腫細胞株P3X63Ag8U.1(P3-U1:ATCCより購入)を、10%FCS(MOREGATE BIOTECH社製)を含むRPMI1640(Wako社製)にて培養し、細胞融合の親株として用いた。
(1)で得られたマウス脾細胞と(2)で得られた骨髄腫細胞を8:1の割合で混合し、遠心分離(1200 rpm、5分間)した。得られた沈殿画分(細胞群)に対して、0.5 mLのポリエチレングリコール−1000(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)を、穏やかに揺らしながら、徐々に加えた。次に、37℃の水浴の中で該細胞液に1 mL のMEMを1分間隔で5回加え、最後に45 mL のMEMを加えた。その後、遠心分離(900rpm、5分間)した。得られた沈殿画分(細胞群)を、HAT培地(10%ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地に、HAT Media Supplement(インビトロジェン社製)を添加した培地)に懸濁させ、脾細胞数を1.5×107個/plateに調製した。該細胞懸濁液を96ウェルプレートに200 μLずつ播種し、37℃、5% CO2の条件下で培養した。ウェル内の細胞がスクリーニングに適した細胞数になる前日に、HAT培地を用いて培地を交換した。
(3)で作製したハイブリドーマについて、ヒト及びラットのGas6とAxlとの結合を阻害する抗体を産生するハイブリドーマを、以下に記載する競合ELISA法にて選択した。
以下に記載する抗原結合ELISA法により、(4)で選択したハイブリドーマの培養上清中の抗体が、hGas6-F及びrGas6-Fに結合し、hGas6と相同性の高いヒトProteinS及びFLAG-tag(BAP-F)には結合しないことを確認した。
(4)及び(5)で選択したハイブリドーマは、クローニング用培地(10%ウシ胎児血清、1% HT Supllement(インビトロジェン社製)、 0.2% Gentamicin Sulfate Solution(ナカライテスク社製)を添加した、エスクロン・クローニングメデューム(エーディア社製))を用いて限界希釈し、96ウェルプレートに播種しクローン化を行った。クローン化は1回のみ行った。以上の操作により、ヒト及びラットGas6に結合し、さらにヒト及びラットGas6とAxlとの結合を阻害する活性を有する抗体を産生するハイブリドーマを二株単離した。
(6)で単離したハイブリドーマを、細胞密度が1×107個/100 mLとなるように浮遊フラスコに播種した。培地には5%のFetal Bovine Serum-Ultra Low IgG (インビトロジェン社製)を含むHybridoma SFM培地(インビトロジェン社製)を用いた。細胞を37℃で7日間静置培養した後、細胞を含む培地を回収した。回収した培地を遠心分離し、得られた培養上清を0.22 μmフィルターを用いてろ過した。
以下に記載する競合ELISA法を用いて、より天然に近い状態の各種Gas6に対する取得抗体の結合性を確認した。
KM5320-mKG1抗体、 KM5321-mKG1抗体及びCNTO抗体について、実施例5(4)と同様の方法で、各種Gas6とAxlとの結合阻害活性を測定した。反応液には、100 ng/mLの各種Gas6-F溶液(実施例2(9)で得られた各種Gas6-F溶液を1% BSA-PBSで希釈した溶液)と最終濃度の2倍濃度の各抗体溶液(実施例4(3)及び実施例5(7)で得られた抗体溶液を1% BSA-PBSで希釈したもの)を等量ずつ混合したものを用いた。
以上より、KM5320-mKG1抗体、KM5321-mKG1抗体は、CNTO抗体よりも強力な中和活性を有することが示された。
Gas6の受容体としては、Axlの他に、Sky及びMerが知られている。Gas6が細胞上に発現した当該受容体に結合すると、細胞内では当該受容体を介したシグナル伝達経路が活性化される。この細胞内シグナル伝達に対する取得抗体の作用を確認するため、Gas6受容体の強制発現細胞株を用いたレポーターアッセイを実施した。
まず、ヒトAxlの発現ベクターを構築した。
当該ベクターは、配列番号26で表わされるヒトAxlの遺伝子配列(GeneCopoeia社製)(GenBankアクセッション番号NM_021913)が組み込まれたプラスミドを鋳型として以下に記載する方法で作製した。鋳型プラスミド、各10 pmolのプライマー22、23(配列番号50、51)およびPrimeSTAR HS DNA Polymerase(タカラバイオ社製)を含む20 μLの反応液を調製し、94℃で5分間保温した後、98℃で10秒間、55℃で5秒間、72℃で3分30秒間を1サイクルとして30サイクルのPCRを行った。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動に供し、QIAquick Gel Extraction Kit(キアゲン社製)を用いて約2.7kbpの増幅DNA断片(hAxlの塩基配列を含むDNA断片)を回収した。また、公知の適当な動物細胞発現ベクターをEcoRI及びBamHIで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した後、QIAquick Gel Extraction Kit を用いて目的のDNA断片を回収した。得られた2種類のDNA断片をIn-Fusion HD Cloning Kit(クロンテック社製)を用いて結合させ、hAxl組換え体発現ベクターを得た。得られた発現ベクター中に含まれるヒトAxl遺伝子配列について解析したところ、配列番号26で表わされるヒトAxl遺伝子の1546番目のシトシンがチミジンに置換されていた。しかし、いずれの塩基配列についても、推定されるアミノ酸配列が同一(GenBankアクセッション番号NP_068713)であり、同じ塩基配列の遺伝子多型が存在することから、本配列を以降の実験に使用した。
上記(1)で作製した3種類のGas6受容体発現ベクター及びレポーターベクターを以下に記載する方法で宿主細胞HEK293F細胞(インビトロジェン社)に導入した。細胞培養の培地は、FreeStyle 293 Expression Medium(invitrogen社製)を使用し、37℃、5% CO2条件下で振とう培養した。レポーターベクターは、マウスのEgr1認識配列(配列番号60)をルシフェラーゼレポーターベクターであるpGL3ベクター(プロメガ社製)に挿入したpGL3-mEgr1を使用した(Nature 444,770-774,2006、PNAS85(21),7857-61,1988)。
(2)で作製した3種のGas6受容体(Axl、SkyまたはMer)-mEgr1転写因子プロモーターのレポーター細胞株を1.6×104個/ウェルとなるように96ウェル黒色プレートに80μLずつ播種した。次に、80μg/mL(最終濃度の10倍濃度)のKM5320-mKG1又はKM5321-mKG1を含む培地[実施例5(7)で得た抗体溶液をFreeStyle 293 Expression Medium(invitrogen社製)で希釈したもの]を10μL/ウェルで添加し、一時間静置培養した。アイソタイプコントロールとして、上記と同様の方法で調整した80μg/mLのIgG1 isotype control (purified mouse monoclonal IgG1、R&D社製)を含む培地を10μL/ウェルで添加した。
実施例8よりも生体に近い条件下で、Gas6とGas6受容体の結合により生じる細胞内シグナルに対する取得抗体の作用を確認した。Gas6の結合によりGas6受容体が活性化されると、当該受容体発現細胞内でAktがリン酸化されることが知られている。そのため、各Gas6受容体を天然に発現しているヒト腎メサンギウム細胞(Sciencell社製、以下、単にヒトメサンギウム細胞と記載する)を使用して、以下に記載する方法でGas6添加によるAktのリン酸化レベルを検出した。
取得抗体とCNTO抗体が競合してヒトGas6に結合するか否かを、競合ELISAを用いて確認した。
(1)抗ヒトGas6モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞からの総RNAの調製
5×106個のKM5320-mKG1抗体、KM5321-mKG1抗体をそれぞれ産生するハイブリドーマより、RNAeasy Mini kit(QIAGEN社製)及びQIA shredder(QIAGEN社製)を用いて、総RNAを調製した。
(1)で取得した1 μgの総RNAから、SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech社製)を用いて、cDNAを作製した。得られたcDNAを鋳型として、キット添付のユニバーサルプライマーA mix(フォワードプライマーを含有する)と、マウスIgG1重鎖定常領域をコードするリバースプライマー(プライマー28(配列番号65))及びPrimeSTAR Max DNA Polymerase (タカラバイオ社製)を含む25μLの反応液を調製し、PCRを行った。PCRは、98℃で10秒間保温した後、98℃で10秒間、55℃で5秒間、及び72℃で5秒間を1サイクルとして30サイクル行い、各抗体のVHの遺伝子を含むDNA断片を増幅した。
(2)で得られたKM5320-mKG1抗体のVHの全塩基配列を配列番号67に、該配列から推定された、シグナル配列を含んだVHの全アミノ酸配列を配列番号68に、配列番号68に示したアミノ酸配列からシグナル配列を除いたアミノ酸配列を配列番号69にそれぞれ示した。また、KM5320-mKG1抗体のVLの全塩基配列を配列番号70に、該配列から推定された、シグナル配列を含んだVLの全アミノ酸配列を配列番号71に、配列番号71に示したアミノ酸配列からシグナル配列を除いたアミノ酸配列を配列番号72にそれぞれ示した。
以下に記載する方法で抗Gas6マウスモノクローナル抗体 KM5320-mKG1抗体及びKM5321-mKG1抗体からマウス-ラットIgG1キメラ抗体(以下、単にラットキメラ抗体と略記する)を作製した。以下、それぞれのラットキメラ抗体をKM5320-rKG1抗体及びKM5321-rKG1抗体と記載する。
公知の適当な動物細胞発現ベクターの適当な位置に、KM5320-rKG1抗体の重鎖全長の塩基配列(配列番号91)および軽鎖全長の塩基配列(配列番号93)を通常の方法を用いてタンデムに組み込んだ。配列番号91で表わされるKM5320-rKG1抗体の重鎖全長の塩基配列は、KM5320抗体のVHの全塩基配列(配列番号67)およびラットIgG1重鎖定常領域を含む遺伝子配列からなる。また、配列番号93で表わされるKM5320-rKG1抗体の軽鎖全長の塩基配列は、KM5320抗体のVLの全塩基配列(配列番号70)とラットIg(κ)定常領域を含む遺伝子配列からなる。
(1)で作製した発現ベクターを、実施例2(5)および通常の方法に準じて、CHO-K1細胞(European Collection of Cell Cultures;ECACC)に導入し、ラットキメラ抗体安定発現細胞株を作製した。
(2)で作製したラットキメラ抗体安定発現細胞を、公知のタンパク質発現用の培地で数日間培養し、培養上清を回収した。実施例3(7)および公知の方法に準じて、回収した培養上清よりKM5320-rKG1及びKM5321-rKG1を精製した。実施例2(9)に記載の方法に準じて抗体の吸光度を測定すると、KM5320-rKG1抗体の吸光係数は1.54、KM5321-rKG1抗体の吸光係数は、1.45であった。
取得抗体のエピトープを解析するため、ヒトGas6ドメイン欠損体および当該タンパク質のアミノ酸の一部をアラニンに置換した変異タンパク質を調製し、取得抗体の結合活性の変化を確認した。
hGas6からGlaドメインを除去し、かつC末端にFLAGタグ及びHisタグを付加したGas6変異体(以下、hGas6-FHと記載する)を取得するために、以下に記載した方法で当該タンパク質の発現ベクターを作製した。
(1)に記載したhGas6-FHのアミノ酸配列のうち、配列番号4で表わされるヒトGas6の全長アミノ酸配列の314番目のロイシン、315番目のグルタミン、316番目のプロリンと対応するアミノ酸を全てアラニンに置換した変異体(以下hGas6-FH-L314A,Q315A,P316Aまたは単にアラニン置換体と記載する)の発現ベクターを作製した。
ヒトGas6変異体(hGas6-Fおよびアラニン置換体)の発現細胞株の調製には、Expi293細胞(invitrogen社製)を用いた。細胞培養の培地にはExpi293TM Expression Medium(invitrogen社製)を使用し、37℃、5% CO2条件下で振とう培養した。Expi293細胞に、(1)、(2)で作製した各種ヒトGas6変異体発現ベクターを導入し、各種ヒトGas6変異体の一過性発現細胞株を得た。細胞への発現ベクターの導入には、ExpiFectamine 293 Transfection Kit(invitrogen社製)を添付文書に従って使用した。
(3)で取得した各種ヒトGas6変異体一過性発現細胞株を、ExpiFectamine 293 Transfection Kit(invitrogen社製)の添付文書に従い、4日間培養して培地を回収した。回収した培地を遠心分離し、得られた培養上清を0.22 μmフィルターを用いてろ過することで、各種ヒトGas6変異体を含む培養上清を調製した。
取得抗体が結合するGas6のエピトープを決定するため、(4)で精製した各種ヒトGas6変異体に対する結合活性を実施例6に記載の方法に準じて評価した。実験はN=2で行い、得られた吸光度の平均値が0.1以下のときを結合しない、2以上のときを結合すると判定した。
Gas6依存的な癌細胞増殖に対する抗ヒトGas6モノクローナル抗体の作用を確認するため、3種類のヒト癌細胞株を用いて細胞増殖アッセイを行った。
膵臓癌細胞株Panc-1細胞(American Type Culture Collection)、悪性黒色腫細胞株A375細胞(大日本製薬)、胃癌細胞株MKN7細胞(理研セルバンク)を用いて増殖アッセイを行った。各細胞におけるGas6受容体の発現の有無は、フローサイトメーターを用いて実施例9と同様の方法で測定し、それぞれ、AxlとMer、AxlとSky、AxlとSkyが発現していることを確認した。
(1) KM5320ヒト化抗体のVLおよびVHのアミノ酸配列の設計
以下に記載する方法で、KM5320ヒト化抗体の各種VLおよびVHのアミノ酸配列を設計した。以降の記述では様々なVL、VHのアミノ酸配列を有するKM5320ヒト化抗体の総称として、hzKM5320抗体と記載する。
KM5321ヒト化抗体の各種VLおよびVHのアミノ酸配列についても、実施例15(1)と同様の方法で設計した。以降の記述では、以降の記述では様々なVL、VHのアミノ酸配列を有するKM5321ヒト化抗体の総称として、hzKM5321抗体と記載する。
ヒト化抗体(hzKM5320, hzKM5321抗体)の可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、動物細胞で高頻度に使用されるコドンを用いて設計した。これら塩基配列を用いて、ヒト化抗体の発現ベクターを構築し、ヒト化抗体を発現させた。
表2に示したhzKM5320、hzKM5321抗体の発現ベクターを、以下に記載する方法で構築した。
作製したヒト化抗体を、Expi293F Expression System Kit(Life Technologies社製)を使用して一過性に発現させた。プラスミドの導入の方法は添付書類に従った。軽鎖の発現ベクターと重鎖の発現ベクターは、1:2の比率で混合して導入した。
実施例16に記載の方法に準じて、KM5320およびKM5321の可変領域アミノ酸配列を、EU index S228P、L235E、R409Kのアミノ酸残基置換を含む変異ヒトIgG4定常領域に結合させたヒト型キメラ抗体(以下それぞれKM5320キメラ抗体、KM5321キメラ抗体と記載する)を作製した。これらキメラ抗体と、実施例17で得られたhzKM5320、hzKM5321抗体のヒトGas6に対する結合活性を比較することを目的とし、実施例2で作製したヒトGas6を用いて、表面プラズモン共鳴法(SPR法)による結合性試験を実施した。測定機器として、Biacore(登録商標)T100(GE Healthcare社製)を使用した。
実施例6に記載した方法に準じて、hzKM5320抗体とhzKM5321抗体のヒトGas6タンパク質への結合活性をELISAで測定した。キメラ抗体及びヒト化抗体は定常領域がヒト由来抗体であるため、2次抗体として1% BSA-PBSで3000倍希釈したGoat anti Human IgG(H&L) Ads to Ms,Rb,Bv,Ho Horseradish Peroxidase(American Qualex社製、A110PD) を含む溶液を使用した。測定値のバックグラウンドを低減させるため、2次抗体希釈液は、抗DNPマウスIgG1抗体50μg/mLと混合したものを室温で1時間インキュベートしたものを使用した。得られた結果を図11に示す。図11のグラフについて、抗体毎に各濃度における吸光値からLogistic曲線によるカーブフィッティングを行い、統計解析言語R(Ver. 3.02)を用いてKM5320、KM5321キメラ抗体およびhzKM5320、hzKM5321抗体の結合のEC50値およびそのSE値を算出した。結果を表8に示す。hzKM5320 LV5HV2抗体は、KM5320キメラ抗体と同程度の結合活性を示した。また、hzKM5321 LV6HV2b、LV7bHV0抗体も、KM5321キメラ抗体と同程度の結合活性を示した。
実施例7と同様の方法で、hzKM5320、hzKM5321抗体のヒトGas6タンパク質とAxlとの結合阻害活性を測定した。得られた結果を図12に示す。図12のグラフについて、抗体毎に各濃度におけるELISAの吸光値からLogistic曲線によるカーブフィッティングを行い、統計解析言語Rを用いてKM5320、KM5321キメラ抗体およびhzKM5320、hzKM5321抗体の結合阻害のIC50値およびそのSE値を算出した。結果を表9に示す。hzKM5320 LV5HV2抗体は、KM5320キメラ抗体の7割程度の結合阻害活性を維持していることが明らかになった。また、hzKM5321 LV6HV2b抗体およびhzKM5321 LV7bHV0抗体は、KM5321キメラ抗体と同程度の結合阻害活性維持していることが明らかになった。
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Claims (19)
- ヒトGas6のアミノ酸配列の314、315及び316番目のアミノ酸残基のうち、少なくとも一つのアミノ酸残基に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片。
- モノクローナル抗体が、ヒトGas6の314、315及び316番目のアミノ酸残基に結合するモノクローナル抗体である、請求項1に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
- モノクローナル抗体が、下記(a)〜(e)から選ばれるいずれか一つの抗体である、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
(a) 抗体の重鎖(以下、H鎖と略記する)可変領域(以下、VHと略記する)の相補性決定領域(complementarity determining region; CDR、以下CDRと略記する)1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号79、80及び81に記載されるアミノ酸配列であって、かつ軽鎖(以下、L鎖と略記する)可変領域(以下、VLと略記する)のCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号82、83及び84に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(b)抗体のVHのCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号85、86及び87に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号88、89及び90に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(c) 前記(a)または(b)に記載の抗体と、ヒトGas6への結合について競合する抗体。
(d)前記(a)または(b)に記載の抗体が結合するエピトープを含むエピトープに結合する抗体。
(e)前記(a)または(b)に記載の抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。 - モノクローナル抗体が、下記(a)〜(e)から選ばれるいずれか一つの抗体である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
(a)抗体のVHのアミノ酸配列が配列番号69に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのアミノ酸配列が配列番号72に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(b)抗体のVHのアミノ酸配列が配列番号75に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのアミノ酸配列が配列番号78に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(c)抗体のVHのアミノ酸配列が配列番号135に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのアミノ酸配列が配列番号123に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(d)抗体のVHのアミノ酸配列が配列番号195に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのアミノ酸配列が配列番号174に記載されるアミノ酸配列である抗体。
(e)抗体のVHのアミノ酸配列が配列番号186に記載されるアミノ酸配列であって、かつVLのアミノ酸配列が配列番号180に記載されるアミノ酸配列である抗体。 - モノクローナル抗体が遺伝子組換え抗体である請求項1〜4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
- 遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、請求項5に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
- 抗体断片が、Fab、Fab’、(Fab’)2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)及びCDRを含むペプチドから選ばれる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗体断片。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体または該抗体断片をコードする塩基配列を有する核酸。
- 請求項8に記載の核酸を含むベクターを含む形質転換細胞。
- 請求項9に記載の細胞を培地で培養し、培養液から該抗体または該抗体断片を採取することを含む、請求項1〜7に記載の抗体または該抗体断片の製造方法。
- 請求項1〜7に記載の抗体または該抗体断片を含むGas6の検出または測定用試薬。
- 請求項1〜7に記載の抗体または該抗体断片を有効成分として含む、Gas6関連疾患の治療薬。
- Gas6関連疾患が腎または癌の疾患である請求項12に記載の治療薬。
- 腎の疾患が糸球体腎炎、糖尿病性腎症またはIgA腎症である請求項13に記載の治療薬。
- 癌の疾患が肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎癌またはグリオブラストーマである請求項13に記載の治療薬。
- 請求項1〜7に記載の抗体または該抗体断片を有効成分として含む、Gas6関連疾患の診断薬。
- 請求項1〜7に記載の抗体または該抗体断片を用いてGas6の検出または測定をすることを含む、Gas6関連疾患の診断方法。
- Gas6関連疾患の治療薬の製造のための、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体または該抗体断片の使用。
- Gas6関連疾患の診断薬の製造のための、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体または該抗体断片の使用。
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