JP5425775B2 - 抗cd27抗体 - Google Patents
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Description
S152抗体は、正常B細胞およびT細胞に対しても親和性を有することが示されている。これまでにガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27分子を特異的に認識するような抗体は知られていない。
一般に非ヒト抗体、例えばマウス抗体などをヒトに投与すると、異物として認識されることにより、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体(Human Anti Mouse Antibody:HAMA)が誘導されることが知られている。HAMAは投与されたマウス抗体と反応し、副作用を引き起こしたり(非特許文献12〜15)、マウス抗体の体内からの消失を速め(非特許文献16〜18)、マウス抗体の治療効果を低下させてしまうことが知られている(非特許文献19、20)。
ヒト化抗体は、マウス抗体などの非ヒト抗体と比較して、ヒトへの投与を行う上で、様々な利点を有している。例えば、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が延長したことが報告されている(非特許文献21、非特許文献22)。すなわち、ヒト化抗体は、非ヒト抗体に比べ、ヒトにおいて副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される。
(1)ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含む、CD27遺伝子によってコードされるポリペプチド(以下、CD27と記す)の細胞外領域を特異的に認識し、結合するモノクローナル抗体または該抗体断片。
(2)O結合型糖鎖が結合した、CD27の細胞外領域のうち、ガラクトースが結合したO結合型糖鎖を含むCD27の細胞外領域は認識せず、ガラクトースが結合していない0結合型糖鎖を含むCD27の細胞外領域を認識し、結合するモノクローナル抗体または該抗体断片。
(3)ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖が、シアリルTn抗原またはTn抗原から選ばれる少なくとも1つのO結合型糖鎖である、(1)または(2)に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
(4)ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖がTn抗原である、(3)に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
(5)モノクローナル抗体が、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27の細胞外領域への結合において、モノクローナル抗体KM4030と競合反応するモノクローナル抗体である(3)または(4)記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
(6)モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体KM4030が結合する、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27の細胞外領域に存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体である、(1)〜(3)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
(7)モノクローナル抗体が、受託番号FERM BP-10976として寄託されているハイブリドーマから生産されるモノクローナル抗体である、(1)〜(6)のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片。
(8)モノクローナル抗体が、遺伝子組換え抗体である、(1)〜(6)のいずれか1項に記載の抗体または該抗体断片。
(9)遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる抗体である、(8)に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
(10)抗体断片が、Fab、Fab’、F(ab’)2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(Diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)およびCDRを含むペプチドから選ばれる抗体断片である(1)〜(9)のいずれか1項に記載の抗体断片。
(11)(1)〜(7)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
(12)ハイブリドーマが、受託番号FERM BP-10976として寄託されているハイブリドーマである、(11)に記載のハイブリドーマ。
(13)(1)〜(10)のいずれか1項に記載の抗体または該抗体断片をコードするDNA。
(14)(13)に記載のDNAを含有する組換え体ベクター。
(15)(14)に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
(16)(11)または(12)に記載のハイブリドーマまたは(15)に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に(1)〜(10)のいずれか1項に記載の抗体または該抗体断片を生成蓄積させ、該培養物から抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする(1)〜(10)のいずれか1項に記載の抗体または該抗体断片の製造方法。
(17)(1)〜(10)のいずれか1項に記載の抗体または該抗体断片を用いる、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27の免疫学的検出または測定方法。
(18)(1)〜(10)のいずれか1項に記載の抗体または該抗体断片を用いる、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27の検出試薬。
(19)(1)〜(10)のいずれか1項に記載の抗体または該抗体断片を用いる、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患の診断薬。
(20)ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患がIgA腎症である、(19)に記載の診断薬。
(21)ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患が癌である、(19)に記載の診断薬。
(22)(1)〜(10)のいずれか1項に記載の抗体または抗体断片を有効成分として含有する、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患の治療薬。
(23)ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患がIgA腎症である、(22)に記載の治療薬。
(24)CD27遺伝子によりコードされるポリペプチドにガラクトースを欠失したO型糖鎖が結合した構造が関与する疾患が癌である、(22)に記載の治療薬。
(25)(1)〜(10)のいずれか1項に記載の抗体または該抗体断片を用いてガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が発現した細胞を検出または測定することを含む、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患の診断方法。
(26)(1)〜(10)のいずれか1項に記載の抗体または該抗体断片を用いてガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27を検出または測定することを含む、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患の診断方法。
(27)ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患がIgA腎症である、(25)または(26)に記載の診断方法。
(28)ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患が癌である、(25)または(26)に記載の診断方法。
(29)ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患の診断薬を製造するための、(1)〜(10)のいずれか1項に記載の抗体または該抗体断片の使用。
(30)ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患の治療薬を製造するための、(1)〜(10)のいずれか1項に記載の抗体または該抗体断片の使用。
(31)ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患がIgA腎症である、(29)または(30)に記載の抗体または該抗体断片の使用。
(32)ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患が癌である、(29)または(30)に記載の抗体または該抗体断片の使用。
CD27としては、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号2で示されるアミノ酸配列において1つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCD27の機能を有するポリペプチド、ならびに配列番号2で示されるアミノ酸配列と60 %以上、好ましくは80 %以上、さらに好ましくは90 %以上、最も好ましくは95 %以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつCD27の機能を有するポリペプチドなどがあげられる。
本発明において、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27遺伝子によってコードされるポリペプチドの細胞外領域とは、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27であればいずれのものでもよく、具体的には、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含む、配列番号1で示される塩基配列によってコードされるCD27の細胞外領域があげられる。
O結合型糖鎖が結合するポリペプチドにおけるアミノ酸残基としては、CD27タンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列中のセリン(Ser)またはスレオニン(Thr)のアミノ酸残基が挙げられる。
本発明の、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27(以下、糖鎖不全CD27と記載する)を発現した細胞を取得する方法としては、O結合型糖鎖合成プロセスにおいて、ポリペプチド上のSer/Thrに結合したN-アセチルガラクサミン(GalNAc)にGalを付加する酵素、該酵素の活性に関与するタンパク質またはuridine 5’-diphospate-galactose(UDP-galactose)の輸送に関わるタンパク質などの活性を、低下または欠損させた細胞株にCD27をコードするDNAを導入することにより、糖鎖不全CD27発現細胞を作製することができる。また、正常O型糖鎖を含むCD27を発現する細胞に対して、シアリダーゼおよびガラクトシダーゼ等の糖鎖切断酵素を作用させることにより、ガラクトースの結合していないO結合型糖鎖を有するCD27発現細胞を作製することも可能である。
UDP-galactoseの輸送に関わるタンパク質としては、UDP-Galactose transporterなどがあげられる。UDP-galactose transporterの活性が低下または欠損した細胞株としては、Lec8細胞[Glycobiology.1,307-14(1991)]などがあげられる。
更に、糖鎖不全CD27タンパク質を作製する方法としては、上述のCD27発現細胞を用いて、糖鎖不全CD27タンパク質を発現、精製する方法などがあげられる。
上述のようにして得られた糖鎖不全CD27細胞または糖鎖不全CD27に対して本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片は結合活性を有する。
ハイブリドーマは、例えば上記の糖鎖不全CD27を発現した細胞などを抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性を有する抗体生産細胞を誘導し、さらに、該抗体生産細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより、調製することができる。該ハイブリドーマを培養するか、あるいは該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより糖鎖不全CD27抗体を取得することができる。
エピトープとは、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、糖鎖が結合したアミノ酸配列および糖鎖が結合したアミノ酸配列からなる立体構造などがあげられる。本発明のモノクローナル抗体のエピトープとしては、糖鎖不全CD27タンパク質の立体構造があげられる。
より具体的には、ハイブリドーマKM4026により生産されたモノクローナル抗体KM4026、モノクローナル抗体KM4026と競合して糖鎖不全CD27の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体、およびモノクローナル抗体KM4026が結合する糖鎖不全CD27細胞外領域に存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体があげられる。
本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM4028により生産されたモノクローナル抗体KM4028、モノクローナル抗体KM4028と競合して糖鎖不全CD27の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体、およびモノクローナル抗体KM4028が結合する糖鎖不全CD27細胞外領域に存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体もあげられる。
更に、本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマKM4031により生産されたモノクローナル抗体KM4031、モノクローナル抗体KM4031と競合して糖鎖不全CD27の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体、およびモノクローナル抗体KM4031が結合する糖鎖不全CD27細胞外領域に存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体などがあげられる。
本発明のモノクローナル抗体と競合反応するモノクローナル抗体としては、具体的には上述のように各種モノクローナル抗体と糖鎖不全CD27の細胞外領域に存在するエピトープに対して競合反応を有するもモノクローナル抗体があげられる。
また本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合するモノクローナル抗体としては、具体的には上述のように各種モノクローナル抗体が認識する糖鎖不全CD27細胞外領域に存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体があげられる。
遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体または該抗体断片など、遺伝子組換え技術により製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、抗原結合活性を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。
本発明のヒト型キメラ抗体は、以下のようにして製造することができる。すなわち、本発明の、糖鎖不全CD27を特異的に認識、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体、もしくは糖鎖不全CD27を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより、VHおよびVLをコードするcDNAを取得し、ヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して抗体を発現させて作製することができる。
本発明のヒト化抗体は、本発明の糖鎖不全CD27タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから産生される非ヒト抗体の、VHおよびVLのCDRのアミノ酸配列を、任意のヒト抗体のVHおよびVLのフレームワーク(以下、FRと記す)に移植した抗体可変領域(以下、V領域と記す)をコードするcDNAを構築し、ヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターに、それぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
本発明のヒト化抗体としては、抗体のVHのCDR1〜3が配列番号40〜42で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のVLのCDR1〜3が配列番号43〜45で表されるアミノ酸配列であるヒト化抗体、抗体のVHのCDR1〜3が配列番号46〜48で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のVLのCDR1〜3が配列番号49〜51で表されるアミノ酸配列であるヒト化抗体、抗体のVHのCDR1〜3が配列番号52〜54で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のVLのCDR1〜3が配列番号55〜57で表されるアミノ酸配列であるヒト化抗体、抗体のVHのCDR1〜3が配列番号58〜60で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のVLのCDR1〜3が配列番号61〜63で表されるアミノ酸配列であるヒト化抗体および抗体のVHのCDR1〜3が配列番号64〜66で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のVLのCDR1〜3が配列番号67〜69で表されるアミノ酸配列であるヒト化抗体があげられる。
更に、本発明のヒト化抗体としては、具体的には以下に示すヒト化抗体があげられる。
抗体のVHが配列番号96で表されるアミノ酸配列中の30番目のSer、48番目のVal、49番目のSer、77番目のAsn、および97番目のAlaが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するヒト化抗体。
好ましくは抗体のVHが配列番号96で表されるアミノ酸配列中の48番目のVal、49番目のSer、および97番目のAlaが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するヒト化抗体。
上記のアミノ酸改変の結果得られる抗体VHのアミノ酸配列としては、配列番号96で表されるアミノ酸配列中の30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換する改変から選ばれる少なくとも1つの改変が導入されたアミノ酸配列があげられる。
6個の改変が導入されたVHのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号96で表されるアミノ酸配列中の
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、93番目のValをThrに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列
などがあげられる。
49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、93番目のValをThrに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、49番目のSerをAlaに、93番目のValをThrに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、93番目のValをThrに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、77番目のAsnをGlyに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、93番目のValをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、93番目のValをThrに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、および93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列
などがあげられる。
77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
49番目のSerをAlaに、93番目のValをThrに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、93番目のValをThrに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、77番目のAsnをGlyに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、93番目のValをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、93番目のValをThrに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、および93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、93番目のValをThrに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、77番目のAsnをGlyに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、49番目のSerをAlaに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、49番目のSerをAlaに、93番目のValをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、49番目のSerをAlaに、93番目のValをThrに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、および93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、93番目のValをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、93番目のValをThrに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、77番目のAsnをGlyに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、77番目のAsnをGlyに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、77番目のAsnをGlyに、および93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、および93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、および77番目のAsnをGlyに置換したアミノ酸配列
などがあげられる。
3個の改変が導入されたVHのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号96で表されるアミノ酸配列中の
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、および49番目のSerをAlaに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、および77番目のAsnをGlyに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、および93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、48番目のValをIleに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、49番目のSerをAlaに、および77番目のAsnをGlyに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、49番目のSerをAlaに、および93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、49番目のSerをAlaに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、49番目のSerをAlaに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、77番目のAsnをGlyに、および93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、77番目のAsnをGlyに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、77番目のAsnをGlyに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、93番目のValをThrに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、93番目のValをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、および77番目のAsnをGlyに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、および93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、49番目のSerをAlaに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、77番目のAsnをGlyに、および93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、77番目のAsnをGlyに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、77番目のAsnをGlyに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、93番目のValをThrに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、93番目のValをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、および93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列、
49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
49番目のSerをAlaに、77番目のAsnをGlyに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
49番目のSerをAlaに、93番目のValをThrに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
49番目のSerをAlaに、93番目のValをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
49番目のSerをAlaに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
77番目のAsnをGlyに、93番目のValをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
77番目のAsnをGlyに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
93番目のValをThrに、97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列
などがあげられる。
30番目のSerをAsnに、および48番目のValをIleに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、および49番目のSerをAlaに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、および77番目のAsnをGlyに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、および93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
30番目のSerをAsnに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、および49番目のSerをAlaに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、および77番目のAsnをGlyに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、および93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
48番目のValをIleに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
49番目のSerをAlaに、および77番目のAsnをGlyに置換したアミノ酸配列、
49番目のSerをAlaに、および93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列、
49番目のSerをAlaに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
49番目のSerをAlaに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
77番目のAsnをGlyに、および93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列、
77番目のAsnをGlyに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
77番目のAsnをGlyに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
93番目のValをThrに、および97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、
93番目のValをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、
97番目のAlaをThrに、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列
などがあげられる。
30番目のSerをAsnに置換したアミノ酸配列、48番目のValをIleに置換したアミノ酸配列、49番目のSerをAlaに置換したアミノ酸配列、77番目のAsnをGlyに置換したアミノ酸配列、93番目のValをThrに置換したアミノ酸配列、97番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列、および117番目のThrをValに置換したアミノ酸配列、があげられる。
抗体のVLについては、例えば配列番号97で表されるアミノ酸配列中の21番目のIle、40番目のPro、58番目のVal、85番目のThr、および87番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列があげられる。
上記のアミノ酸改変の結果得られるVLのアミノ酸配列としては、配列番号97で表されるアミノ酸配列中の21番目のIleをLeuに、40番目のProをLeuに、58番目のValをIleに、85番目のThrをAlaに、および87番目のTyrをPheに置換する改変から選ばれる少なくとも1つの改変が導入されたアミノ酸配列があげられる。
5個の改変が導入されたVLのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号97で表されるアミノ酸配列中の21番目のIleをLeuに、40番目のProをLeuに、58番目のValをIleに、85番目のThrをAlaに、および87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列などがあげられる。
40番目のProをLeuに、58番目のValをIleに、85番目のThrをAlaに、および87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、
21番目のIleをLeuに、58番目のValをIleに、85番目のThrをAlaに、および87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、
21番目のIleをLeuに、40番目のProをLeuに、85番目のThrをAlaに、および87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、
21番目のIleをLeuに、40番目のProをLeuに、58番目のValをIleに、および87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、
21番目のIleをLeuに、40番目のProをLeuに、58番目のValをIleに、および85番目のThrをAlaに置換したアミノ酸配列
などがあげられる。
21番目のIleをLeuに、40番目のProをLeuに、および58番目のValをIleに置換したアミノ酸配列、
21番目のIleをLeuに、40番目のProをLeuに、および85番目のThrをAlaに置換したアミノ酸配列、
21番目のIleをLeuに、40番目のProをLeuに、および87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、
21番目のIleをLeuに、58番目のValをIleに、および85番目のThrをAlaに置換したアミノ酸配列、
21番目のIleをLeuに、58番目のValをIleに、および87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、
21番目のIleをLeuに、85番目のThrをAlaに、および87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、
40番目のProをLeuに、58番目のValをIleに、および85番目のThrをAlaに置換したアミノ酸配列、
40番目のProをLeuに、58番目のValをIleに、および87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、
58番目のValをIleに、85番目のThrをAlaに、および87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
などがあげられる。
21番目のIleをLeuに、および40番目のProをLeuに置換したアミノ酸配列、
21番目のIleをLeuに、および58番目のValをIleに置換したアミノ酸配列、
21番目のIleをLeuに、および85番目のThrをAlaに置換したアミノ酸配列、
21番目のIleをLeuに、および87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、
40番目のProをLeuに、および58番目のValをIleに置換したアミノ酸配列、
40番目のProをLeuに、および85番目のThrをAlaに置換したアミノ酸配列、
40番目のProをLeuに、および87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、
58番目のValをIleに、および85番目のThrをAlaに置換したアミノ酸配列、
58番目のValをIleに、および87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、
85番目のThrをAlaに、および87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
などがあげられる。
21番目のIleをLeuに置換したアミノ酸配列、40番目のProをLeuに置換したアミノ酸配列、58番目のValをIleに置換したアミノ酸配列、85番目のThrをAlaに置換したアミノ酸配列、および87番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列、があげられる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に内在的に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトB細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりFab、scFvなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により2本の完全なH鎖およびL鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
欠失、置換、挿入および/または付加されるアミノ酸の数は1個以上でありその数は特に限定されないが、モレキュラー・クローニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci USA,82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数である。例えば、1〜数十個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン
G群:フェニルアラニン、チロシン
本抗体のエフェクター活性としては、ADCC活性、CDC活性、抗体依存性貪食活性(antibody dependent cellular phagocytosis, ADCP)、オプソニン化効果などがあげられ、種々の方法で制御することができる。
抗体のFc領域に結合した糖鎖を制御する方法としては、IgG抗体の297番目の糖鎖を除去することでADCC、CDC活性を低下させる方法[Molecular Immunology, 32, 1311, (1995), WO2008/030564]、抗体のFc領域へのガラクトースの結合を低下させてCDC活性を低下させる方法などがあげられる。
本発明の抗体断片としては、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、diabody、dsFvおよびCDRを含むペプチドなどがあげられる。
Fabは、IgGをタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち(H鎖の224番目のアミノ酸残基で切断される)、H鎖のN末端側約半分とL鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のF(ab’)2は、本発明の糖鎖不全CD27タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のFab’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
本発明のFab’は、本発明の糖鎖不全CD27タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するF(ab’)2を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のFab’断片をコードするDNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
本発明のscFvは、本発明の糖鎖不全CD27タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
本発明のdiabodyは、本発明の糖鎖不全CD27タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体を取得し、scFvをコードするDNAをPのアミノ酸配列の長さが8残基以下となるように構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
本発明のdsFvは、本発明の糖鎖不全CD27タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
本発明のCDRを含むペプチドは、本発明の糖鎖不全CD27タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体のVHおよびVLのCDRをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
本発明には、本発明の糖鎖不全CD27タンパク質を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または抗体断片に、薬剤、タンパク質、放射性同位元素などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体とのコンジュゲートを包含する。
タンパク質としては、サイトカイン、増殖因子、毒素タンパク質などがあげられる。
さらに、抗体または該抗体断片に結合させる薬剤は、プロドラッグの形態でもよい。本発明におけるプロドラッグとは、腫瘍環境に存在する酵素などによって化学的な修飾を受け、癌細胞を傷害する作用を有する物質に変換される薬剤をいう。
抗体医薬としては、抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原、腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗原、病変部位の血管新生に関与する抗原に対する抗体があげられる。
免疫賦活剤としては、イムノアジュバントとして知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤が、β-1,3-グルカン(レンチナン、シゾフィラン)、αガラクトシルセラミド(KRN7000)、菌体粉末(ピシバニール、BCG)、菌体抽出物(クレスチン)があげられる。
放射性同位元素としては、131I、125I、90Y、64Cu、199Tc、77Lu、211At、Re186、Re188、In111等があげられる。放射性同位元素は、クロラミンT法等によって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、methylbenzyldiethylene- triaminepentaacetic acid (MX-DTPA)などがあげられる。
放射線照射としては、X線、γ線などの光子(電磁波)照射、電子線、陽子線、重粒子線などの粒子線照射などが含まれる。
本発明の検出方法、定量方法、検出試薬、定量試薬または診断薬は、特定の標識体を本発明の抗体に標識して用いる方法があげられる。標識体としては、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体があげられ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル、ロフィンなどの発光物質、フルオレシン・イソチアネート(FITC)、トリメチルローダミン(RITC)などの蛍光物質などがあげられる。
以下に、本発明の抗体の製造方法について、具体的に説明する。
(1)抗原の調製
下記に記載の方法により、CD27全長またはその部分長をコードするcDNAを含む発現ベクターを、O結合型糖鎖合成プロセスにおいて、ポリペプチド上のSer/Thrに結合したGalNAcにGalを付加する酵素、該酵素の活性に関与する蛋白質またはUDP-galactoseの輸送に関わるタンパク質などの活性が低下または欠損した酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入することにより、抗原となる糖鎖不全CD27もしくは糖鎖不全CD27を発現させた細胞を得ることができる。また、糖鎖不全CD27を細胞膜上または培養液中に多量に発現している各種ヒト由来培養細胞、ヒト組織などから、糖鎖不全CD27を精製して抗原を調製する方法、または糖鎖不全CD27の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原として用いることもできる。更に、糖鎖付加能のない大腸菌等の原核生物を用いて発現、精製したCD27に、試験管内で糖鎖を付加することで、糖鎖不全CD27を得ることができる。
上述のようにして得られた、糖鎖不全CD27、正常O結合型糖鎖を有するCD27のタンパク質または発現細胞は、目的の抗体のスクリーニング、取得された抗体の抗原に対する反応性を確認するために、使用することができる。
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞において自律複製可能又は染色体中への組込が可能で、ポリペプチドをコードするDNAを転写できる位置に適当なプロモーターを含有しているものが用いられる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110 (1972)]、Gene,17,107(1982)やMolecular&General Genetics,168,111 (1979)に記載の方法等を挙げることができる。
遺伝子機能を低下させる方法としては、アンチセンス法、リボザイム法[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96, 1886 (1999)]、相同組換え法[Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)、Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)]、RNA-DNA oligonucleotide(RDO)法、RNA interference(RNAi)法[Nature, 391, 806, (1998)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 15502, (1998)、Nature, 395, 854, (1998)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 5049, (1999)、Cell, 95, 1017, (1998)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1451, (1999) roc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13959, (1998)、Nature Cell Biol., 2, 70, (2000)]、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法[Nature Genetics,25, 35, (2000)]等があげられる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β-D-チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
ポリペプチドが宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法[J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、ロウらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)]、又は特開平05-336963、WO94/23021等に記載の方法を用いることで、該遺伝子産物を宿主細胞外に分泌させることができる。
ポリペプチドは、例えば、以下のようにして単離・精製することができる。
ポリペプチドが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)−セファロース、DIAION HPA-75(三菱化学社製)等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(Pharmacia社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独又は組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
3〜20週令のマウス、ラットまたはハムスターに上記のように調製した抗原を免疫して、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、CD27ノックアウト動物を被免疫動物として用いる方法もある。
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、8−アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来)骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology,18,1(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J. Immunology,6,511(1976)]、 SP2/O -Ag14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]、P3-X63-Ag8(X63)[Nature, 256,495(1975)]などが用いられる。これらの細胞株は、8−アザグアニン培地[RPMI-1640培地にグルタミン(1.5 mM) 、2−メルカプトエタノール(5×10-5M)、ジェンタマイシン(10μg/mL) および牛胎児血清(FCS)を加えた培地(以下、正常培地という。)に、さらに8−アザグアニン(15μg/mL)を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日2×107個以上の細胞数を確保する。
前述した抗体産生細胞と骨髄腫細胞をMEM培地またはPBS(リン酸二ナトリウム1.83 g、リン酸一カリウム0.21 g、食塩7.65 g、蒸留水1リットル、pH7.2)でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞:骨髄腫細胞=5〜10:1になるよう混合し、遠心分離(1200 rpm、5分間)した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール-1000(PEG-1000)2 g、MEM 2 mLおよびジメチルスルホキシド 0.7 mLの混液 0.2〜1 mL/108 抗体産生細胞を加え、1〜2分間毎にMEM培地1〜2 mLを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50 mLになるようにする。遠心分離(900 rpm、5分間)後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をHAT培地[正常培地にヒポキサンチン(10-4 mol/L)、チミジン(1.5×10-5 mol/L)およびアミノプテリン(4×10-7 mol/L)を加えた培地]100 mL中に懸濁する。この懸濁液を96ウェル培養用プレートに100μL/ウェルずつ分注し、5% CO2インキュベーター中、37℃で7〜14日間培養する。
また、ついで、限界希釈法によりクローニングを2回繰り返し[1回目は、HT培地(HAT培地からアミノプテリンを除いた培地)、2回目は、正常培地を使用する]、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
プリスタン処理[2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン(Pristane)0.5 mLを腹腔内投与し、2週間飼育する]した8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、(4)で得られた抗CD27モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞2×106〜5×107 細胞/匹を腹腔内注射する。10〜21日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離(3,000 rpm、5分間)して固形分を除去後、40〜50 % 硫酸アンモニウムで塩析した後、カプリル酸沈殿法、DEAE−セファロースカラム、プロテインA−カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、IgGあるいは、IgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
(6)バインディングアッセイ
抗原としては、本項(1)に記載の方法により、本発明において用いられるCD27ポリペプチドをコードするcDNAを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入して得た遺伝子導入細胞やリコンビナントタンパク質、あるいはヒト組織から得た精製ポリペプチドや部分ペプチドを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、BSA(ウシ血清アルブミン)やKLH(Keyhole Limpet hemocyanin)などのキャリアタンパク質とコンジュゲートを作製して、これを用いる。
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の作製方法を示す。
(1) 遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
遺伝子組換え抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
非ヒト抗体のVH及びVLをコードするcDNAは以下の様にして取得することができる。
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりmRNAを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAをファージ或いはプラスミドなどのベクターにクローニングしてcDNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のC領域部分或いはV領域部分をコードするDNAをプローブとして用い、VHまたはVLをコードするcDNAを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のVHまたはVLの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりVHまたはVLの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
ハイブリドーマ細胞から全RNAを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法[Methods in Enzymol.,154,3(1987)]等、またキットとしてはRNA easy kit(QIAGEN社製)等が挙げられる。全RNAからmRNAを調製する方法としては、オリゴ(dT)固定化セルロースカラム法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)]等、またキットとしてはOligoTM-dT30<Super>mRNA Purification Kit(Takara社製)等があげられる。ハイブリドーマ細胞からmRNAを調製するキットとしては、Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen社製)、Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia社製)等があげられる。
cDNAの合成及びcDNAライブラリー作製法としては、常法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989);Current Protocols in Molecular Biology], Supplement 1-34]、或いは市販のキット、例えば、Super ScriptTM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(Invitrogen社製)やZAP-cDNA Synthesis Kit(Stratagene社製)を用いる方法等があげられる。
(3)ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項2の(1)に記載の遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHまたはCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のVHまたはVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、非ヒト抗体のVHまたはVLをコードするcDNAの3’末端側と、ヒト抗体のCHまたはCLの5’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計した、VHおよびVLのcDNAを作製する。作製されたVHおよびVLのcDNAを、それぞれを本項2の(1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHまたはCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、非ヒト抗体VHまたはVLをコードするcDNAを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成DNAを用いてPCR法によりそれぞれ増幅し、それぞれを本項2の(1)に記載の遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
ヒト化抗体のVHまたはVLをコードするcDNAは、以下の様にして構築することができる。まず、非ヒト抗体のVHまたはVLのCDRのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のVHまたはVLのフレームワーク領域(以下、FRと表記する)のアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するFRのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも良い。例えば、Protein Data Bank等のデータベースに登録されているヒト抗体のFRのアミノ酸配列、ヒト抗体のFRの各サブグループの共通アミノ酸配列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]等があげられる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のVHまたはVLのFRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性(少なくとも60%以上)のFRのアミノ酸配列を選択する。次に、選択したヒト抗体のVHまたはVLのFRのアミノ酸配列に、もとの抗体のCDRのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト化抗体のVHまたはVLのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]を考慮してDNA配列に変換し、ヒト化抗体のVHまたはVLのアミノ酸配列をコードするDNA配列をそれぞれ設計する。設計したDNA配列に基づき、100塩基前後の長さからなる数本の合成DNAを合成し、それらを用いてPCR法を行う。この場合、PCRでの反応効率及び合成可能なDNAの長さから、H鎖、L鎖とも6本の合成DNAを設計することが好ましい。
ヒト化抗体は、非ヒト抗体のVH及びVLのCDRのみをヒト抗体のVH及びVLのFRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下してしまうことが知られている[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。この原因としては、元の非ヒト抗体のVH及びVLでは、CDRだけでなく、FR内のアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しているため、ヒト化により非ヒト抗体のFRのアミノ酸残基が、ヒト抗体のFRのアミノ酸残基に置換されると、結抗原合活性が低下してしまうと考えられている。この問題を解決するため、ヒト化抗体では、ヒト抗体のVH及びVLのFRのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、CDRのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。ヒト化抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるFRのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するために、X線結晶解析[J. Mol. Biol., 112, 535(1977)]或いはコンピューターモデリング[Protein Engineering,7, 1501(1994)]等による抗体の立体構造の構築及び解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト化抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト化抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
(6)ヒト化抗体発現ベクターの構築
本項2の(1)に記載の遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHまたはCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のVHまたはVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、本項2の(3)及び(6)に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクター、或いはそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、COS-7細胞(ATCC CRL1651)が一般に用いられる[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC press,283(1991)]。COS-7細胞への発現ベクターの導入法としては、DEAE-デキストラン法[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC press,283(1991)]、リポフェクション法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等があげられる。
本項2の(3)及び(6)に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法[特開平2-257891、Cytotechnology,3,133(1990)]等があげられる。
精製した本発明の抗体または抗体断片の反応特異性は、下記のようにして評価することができる。
正常型糖鎖を発現する細胞、およびO結合型糖鎖合成プロセスにおいて、ポリペプチド上のSer/Thrに結合したGalNAcにGalを付加する酵素、該酵素の活性に関与するタンパク質またはuridine 5’-diphospate-galactose(UDP-galactose)の輸送に関わるタンパク質などの活性が、低下または欠損した細胞株を宿主として、CD27コードする塩基配列(配列番号1)を発現させたCD27発現細胞をそれぞれ作製することができる。このようにして、正常O結合型糖鎖を有するCD27を発現した細胞、糖鎖不全CD27を発現した細胞を作製し、それぞれのCD27を発現する細胞株と精製抗体との反応性を、ELISA法および蛍光抗体法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]などで測定することができる。
4.本発明の糖鎖不全CD27を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体抗体またはその抗体断片を用いた疾患の診断方法
本発明の抗体または該抗体断片を用いて糖鎖不全CD27または該ポリペプチドが発現した細胞を検出または定量することにより、糖鎖不全CD27が関連する疾患を診断することができる。
糖鎖不全CD27が関連する疾患のうち、例えばIgA腎症の診断は以下のようにして行うことができる。
糖鎖不全CD27が関連する疾患のうち、例えば癌の診断は以下のようにして行うことができる。
免疫学的検出または測定方法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的検出または測定方法としては、放射性物質標識免疫抗体法(RIA)、酵素免疫測定法(EIAまたはELISA)、蛍光免疫測定法(FIA)、発光免疫測定法(luminescent immunoassay)、ウエスタンブロット法および物理化学的手法(TIA、LAPIA、PCIA)などがあげられる。
酵素免疫測定法(EIAまたはELISA)としては、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法があげられ、例えばサンドイッチELISA法などが用いられる。酵素免疫測定法で用いる標識体としては、前述のとおり、任意の公知(石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院)の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、ビオチン標識などを用いることができる。
該ポリペプチドが発現している細胞の検出には、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、免疫沈降法、免疫細胞染色法、および免疫組織染色法などが、好ましく用いられる。また、FMAT8100HTSシステム(アプライドバイオシステム社製)を用いる蛍光抗体染色法なども用いることができる。
ELISA用96ウェルプレートに上述した本発明の抗体または該抗体断片を固相化した後、BSA-PBSによりブロッキングする。抗体が精製されていない状態の例えばハイブリドーマ株培養上清などの精製されていない状態である場合には、抗マウスイムノグロブリンあるいはラットイムノグロブリンまたはプロテインAあるいはGなどをあらかじめELISA用96ウェルプレートに固相化しBSA-PBSでブロッキングした後、ハイブリドーマ株培養上清を分注して結合させる。BSA-PBSを捨てPBSでよく洗浄した後、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞や組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより免疫沈降物をSDS-PAGE用サンプルバッファーで抽出し、上記のウエスタンブロッティングにより検出を行う。
5.本発明の糖鎖不全CD27ポリペプチドを特異的に認識し、結合するモノクローナル抗体または該抗体断片を用いた疾患の治療方法
本発明の糖鎖不全CD27ポリペプチドを特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片は、糖鎖不全CD27ポリペプチドが関与する疾患の治療に用いることができる。
更に、IgA腎症を発症し、ネフローゼ症候群を呈する疾患や腎不全を呈するものも、疾患としてあげることができる。
血液癌としては、具体的に白血病、リンパ腫(Hodgkin lymphoma、non-Hodgkin lymphoma)多発性骨髄腫などがあげられる。具体的なnon-Hodgkin lymphomaとしては、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、小リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、モルトリンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫、形質細胞腫などがあげられる。
本発明の治療剤としては、本発明の抗体または該抗体断片を有効成分とする癌の治療剤があげられる。ADCC活性やCDC活性などのエフェクター活性を有するがん治療剤、あるいはアポトーシス誘導作用による癌の治療剤等も、本発明の治療剤として包含される。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、抗体またはペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
(1)ヒトCD27遺伝子のクローニング
クロンテック社より購入したヒト末梢血由来cDNAライブラリーより、以下の手順でCD27をコードする遺伝子を単離した。1倍濃度のBD Advantage PCR緩衝液(クロンテック社製)および1倍濃度の添付dNTPを含む反応液にヒト末梢血単核球由来一本鎖cDNA 25 ng、0.2μmol/L cd27fw(配列番号3)、0.2μmol/L cd27809B(配列番号4)および1倍濃度のAdvantage 2 PCR polymerase Mix(クローンテック社製)を用いて、合計50μLとし、PCR反応を行った。反応条件は98℃ 15秒間、68℃ 30秒間のサイクルを30サイクル行った。該反応液を2%アガロースゲル電気泳動で分離後、約1 kbpのPCR産物をTOPO TA Cloning Kit(インビトロジェン社製)を用いて添付の使用説明書に従ってpCR-2.1ベクターに挿入した。PCR増幅断片が挿入されたプラスミドを用いて大腸菌を形質転換し、各クローンから得られるプラスミドを調製し、DNA配列を確認した結果、配列番号1記載のDNA配列を有するpCR 2.1 CD27を取得した(図1)。
(2)ヒトCD27細胞外ドメインを有する遺伝子をクローン化したプラスミドの構築
次に以下に示すPCR反応を行うことによりC末端側に存在する膜貫通領域を除去したCD27をコードするcDNAの単離を行った。0.2 mmol/L dNTPs、1mmol/L塩化マグネシウムを含む反応液に、1ngのpCR 2.1 CD27、1μmol/L CD27-A(配列番号5)、1μmol/L CD27-B(配列番号6)および2.5単位のKOD polymerase(東洋紡社製)を用いて、合計50 μLとし、98℃ 15秒間、68℃ 30秒間のサイクルを25サイクルの条件でPCR反応を行った。該反応液を2%アガロースゲル電気泳動で分離後、約600 bpのPCR産物を、Zero Blunt PCR Cloning Kit(インビトロジェン社製)を用いて添付の使用説明書に従ってpCR-Bluntベクターに導入した。本ヒトCD27細胞外ドメインを有する遺伝子をクローン化したプラスミドをpCRCD27axbとした(図2)。
(3)変異型ヒトIgG4Fc領域を有するベクターpBShCγ4SPの構築
WO97/10354に記載の野生型ヒトIgG4サブクラスのC領域をコードするcDNAを有するプラスミドpBShCγ4を用いて、野生型ヒトIgG4サブクラスのC領域(ヒンジ領域)の108番目のSerがProに置換された変異型ヒトIgG4サブクラスのC領域を有するプラスミドpBShCγ4SPを構築した。本改変を行うことによりIgGヒンジ領域を介した2量体形成が安定化することが知られている(モレキュラー・イムノロジー、30,105,1993)。鋳型としてプラスミドpBShCγ4の1 ngを含む50μLの反応液 [10mM Tris-HCl (pH8.3)、50mM 塩化カリウム、1.5 mM塩化マグネシウム、0.001 % ゼラチン、200μM dNTPs、0.5μM Primer1(配列番号7)、0.5μM Primer2(配列番号8)および2unitsのTaKaRa Ex Taq DNA polymerase]を調製し、GeneAmp PCR system 9700(パーキンエルマー社製)を用いて94℃にて2分間、55℃にて2分間、72℃にて2分間のサイクルを30サイクル行った。反応液をQIAquick PCR Purification Kit(キアゲン社製)を用いて添付の使用説明書に従い精製後、制限酵素EcoT14I(タカラバイオ社製)で処理し、0.8 %アガロースゲル電気泳動にて分離後、QIAquick Gel Extraction Kit(キアゲン社製)を用いて添付の使用説明書に従い、増幅断片を回収した。プラスミドpBShCγ4を制限酵素EcoT14Iで切断後、Alkaline phosphatase (タカラバイオ社製)処理により5’末端のリン酸を除去し、同様に0.8%アガロースゲル電気泳動にて分離後、QIAquick Gel Extraction Kitを用いて添付の使用説明書に従い、プラスミド断片を回収した。回収した増幅断片とプラスミドpBShCγ4由来のプラスミド断片を連結し、目的のcDNAを含むプラスミドpBShCγ4SPを構築した(図3)。
(4)ヒトIgG4Fcの部分配列を含むcDNAのクローニング
以下に示すPCR反応を行うことにより、5’末端に制限酵素BamHIサイト、3’末端にSalI制限酵素を有するヒトIgG4FcをコードするDNA断片を増幅した。0.2 mmol/L dNTPs、1mmol/L塩化マグネシウムを含む反応液に上記(3)で構築したpBShCγ4SP 25 ng、1μmol/L g4A(配列番号9)、1μmol/L g4B(配列番号10)および2.5単位のKOD polymerase(東洋紡社製)を用いて、合計50μLとし、PCR反応を行った。反応条件は98℃ 15秒間、68℃ 30秒間のサイクルを25サイクルで行った。該反応液を2 %アガロースゲル電気泳動で分離後、約700 bpのPCR産物をZero Blunt PCR Cloning Kit(インビトロジェン社製)を用いて添付の使用説明書に従ってpCR-Bluntベクターに導入した。本プラスミドをpCRIgG4FcBamHISalI(図4)とした。
(5)動物細胞用発現ベクターpKANTEX XhoI/SalIの構築
WO97/10354に記載されているヒト化抗体発現ベクターpKANTEX93を制限酵素XhoI(タカラバイオ社製)および制限酵素SalI(タカラバイオ社製)で消化後、0.8 %アガロースゲル電気泳動で分離後、Gel Extraction Kit(キアゲン社製)を用いて約9.8 kbpのプラスミド断片を回収した。回収したDNA断片の5’および3’末端をDNA Ligation Kit(タカラバイオ社製)を用いて連結し、得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌DH5α株(東洋紡績社製)を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、QIAprep Spin Miniprep Kit(キアゲン社製)を用いて組換えプラスミドDNAを単離し、抗体L鎖の発現ユニットが除かれていることを制限酵素NotI(タカラバイオ社製)およびKpnI(タカラバイオ社製)消化により確認した。該プラスミドをpKANTEX XhoI/SalIと命名した(図5)。
(6)可溶型CD27細胞外ドメイン発現プラスミドpKANTEX CD27IgG4Fcの作製
上記(2)で作製したpCR 2.1 CD27axbを、NotIおよびBamHIを用いて消化することにより得られる、約600bpの断片、および上記(3)で作製したpCRIgG4FcBamHISalIをBamHIおよびSalI消化して得られる約700 bpのDNA断片を、上記(5)で得られたpKANTEX XhoI/SalIをNotIおよびSalI消化して得られる約8.8 kbpのDNA断片に連結することにより、CD27-Fcを発現するためのプラスミドpKANTEX CD27IgG4Fcを得た(図6)。本プラスミドにコードされる可溶型CD27-Fc融合タンパク質(以下、CD27-Fcと記載することもある)の遺伝子配列を配列番号11に、アミノ酸配列を配列番号12に記載した。該発現ベクターを用いて形質転換した大腸菌を100 mLのLB培地に播種し、一晩培養を行った後に回収し、Qiafilter Plasmid midi kit (キアゲン社製)を用いて添付のプロトコールに従ってプラスミドを精製した。精製後、30 μgのプラスミドベクターを制限酵素AatII消化により線状化した。線状化後、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行い、1/10濃度TEバッファー(1 mM Tris HCl, 0.1 mM EDTA)に溶解した後、DNA濃度を測定し、遺伝子導入に供した。
(7)CD27-Fcの発現
CHO/DG44細胞(Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 555 (1986)、以下、DG44と記す)あるいはLec8細胞へのCD27-Fc発現プラスミドpKANTEX CD27IgG4Fcの導入は、エレクトロポレーション法[サイトテクノロジー, 3, 133 (1990)]に準じて、以下の手順で行った。まず、基本培地[10 % ウシ胎児透析血清(インビトロージェン社)および50μg/mL Gentamycin(ナカライテスク社)および1×HT supplement(インビトロージェン社製)を添加したIscove’s Modified Dulbecco’s Medium(インビトロジェン社)]で継代したDG44細胞を、K-PBS緩衝液[137 mmol/L KCl、2.7 mmol/L NaCl、8.1 mmol/L Na2HPO4、1.5 mmol/L KH2PO4、4.0 mmol/L MgCl2]に懸濁して8×106個/mLとし、細胞懸濁液を調製した。調製した細胞懸濁液200μL(1.8×106個)を上記(6)で調製した線状化プラスミドpKANTEXCD27IgG4Fc 10μgと混和した。但しLec8細胞の継代は、1×HT supplementを添加しない基本培地(以下、HT-培地と記す)で行った。該細胞DNA混和液をGene Pulser Cuvette(電極間距離2 mm)(BIO-RAD社)へ移した後、遺伝子導入装置Gene Pulser(BIO-RAD社)を用いて、パルス電圧0.35 KV、電気容量250μFの条件で遺伝子導入を行った。該細胞懸濁 液を、HT-培地[10% ウシ胎児透析血清(インビトロージェン社製)および50μg/mL Gentamycin(ナカライテスク社)を添加したIscove’s Modified Dulbecco’s Medium(インビトロジェン社製)]10 mLに混和し、75cm2接着細胞用フラスコ(グライナー社製)に播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内で培養を行った。3日間培養した後、G418(シグマ社製)を最終濃度が0.5 mg/mLになるように添加して、さらに10日間培養した。10日後、182cm2接着細胞用フラスコ(グライナー社製)に継代し、コンフルエントになるまで培養を続けた。コンフルエントになった時点で、無血清培地EXCELL301(JRH Bioscience社製)に培地交換を行い、1週間培養後、培養上清を回収し、下記に記載の方法で精製を行った。
(8)CD27-Fcの精製
(7)で培養を行った培養上清を、3000rpm、4℃の条件で10分間の遠心分離を行い、上清を回収した後、0.22μm孔径PES Membrane(旭テクノグラス社製)を用いて上清を濾過した。0.8cm径のカラムにMab Select(Amersham Pharmacia Biotech社製) 0.5 mLを充填し、精製水 3.0 mLおよび0.2 M ホウ酸−0.15 M NaCl緩衝液(pH7.5)(以下、ホウ酸バッファーと記す)3.0 mLを順次通塔した。さらに、0.1 M クエン酸緩衝液(pH3.5)2.0 mLおよびホウ酸バッファー1.5 mLで順次洗浄することによって担体の平衡化を行った。次に、上記培養上清をカラムに通塔した後、ホウ酸バッファー3.0mLで洗浄した。洗浄後、0.1Mクエン酸緩衝液(pH 3.5)1.25 mLを用いて担体に吸着した抗体の溶出を行った。溶出は250 μLづつ、5画分に分けて取得した。次に、得られた精製画分のSDS-PAGE解析を行い、目的蛋白質の溶出が確認された画分をまとめ、PBSバファーを用いて、4℃で一昼夜透析を行った。透析後、CD27-Fc溶液を回収し、0.22μm孔径Millex GV(MILLIPORE社)を用いて滅菌濾過した後に、280nmの吸光度(OD280 nm)を吸光光度計(SHIMADZU UV-1700)を用いて測定し、CD27-Fc濃度を算出した(OD280 nm=1.0で0.68 mg/mLと換算; εM=134655, MW=92840より算出した)。各宿主細胞由来のCD27-Fc発現細胞、約300mLの無血清培養液上清から、Lec8由来CD27-Fcを3.6mg、CHO/DG44由来CD27-Fcを2.2mgを得た。それぞれのタンパク質について、溶出画分のSDS-PAGEでの解析結果を図7に示す。
(9)糖鎖構造の確認
上記(8)で精製したCD27-FcをPBSで10倍に希釈した溶液16μLに、5倍濃度のSDSサンプルバッファー 4μLを添加した後、90℃、5分間処理したものをSDS-PAGEに供した。電気泳動は5-20 % SDS-ポリアクリルアミドゲルe-PAGEL(ATTO社製, Cat. No. E-T520L)を使用し、ATTOラピダス・ミニスラブ電気泳動槽で20 mA/枚の電流で、90 分間電気泳動した。PVDF膜(Millipore Immobilon社製, Cat. No. IPVH304F0)への転写は、ATTOホライズブロットを使用し、180 mA、90分間の条件で行った。転写後の膜は10 %BSAを含むPBS(以下、10 %BSA-PBSと表記する)に浸し、4℃で一晩静置することでブロッキングした。その後、1 % BSA-PBSを用いて5μg/mLに調製した、抗RCAS1抗体クローン22-1-1(MBL社製, Cat.No. D060-3)を加え、室温2時間反応した。0.05 % Tween-20-PBS(和光純薬社製, Cat. No.167-11515)を用いて室温30分間洗浄した後、1 % BSA-PBSにて2000倍希釈した2次抗体ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン(DAKO社製、Cat.No.P0161)で室温1時間反応した。0.05% Tween-20-PBSを用い室温で30分間洗浄した後に、ECL Western blotting detection reagent(Amersham Pharmacia Biotech社製、Cat.No. RPN2106)を用いて検出した。その結果を図8に示す。
また、抗RCAS1抗体22-1-1は、O結合型糖鎖であるTn抗原を認識することが明らかにされており、抗Tn抗体として知られている[J.B.C., 278, 22998-23007, (2003))]。抗Tn抗体である抗RCAS-1抗体クローン22-1-1は、DG44由来CD27-Fcには全く結合しないが、Lec8由来のCD27-Fcには特異的に結合した。Lec8で生産したCD27-Fcには、ガラクトースが結合していないO型糖鎖であるTn抗原が、結合していることが確認された。
(1)CD27発現プラスミドpKANTEX CD27の構築
実施例1で作製したpCR 2.1 CD27より、遺伝子発現に不要なcDNA部分を除去したcDNA断片を、以下に示すPCR反応により作製した。
0.2mmol/L dNTPs、1mmol/L塩化マグネシウムを含む反応液に1ngのpCR 2.1 CD27、1μmol/L CD27-A(配列番号5)、1μmol/L CD27-C(配列番号13)および2.5単位のKOD polymerase(東洋紡社製)を用いて、合計50 μLとし、PCR反応を行った。反応条件は98℃ 15秒間、68℃ 30秒間のサイクルを25サイクルで行った。該反応液を2 % アガロースゲル電気泳動で分離後、約800 bpのPCR産物を、Zero Blunt PCR Cloning Kit(インビトロジェン社製)を用いて添付の使用説明書に従って、pCR-Bluntベクターに導入し、配列番号1記載のDNA配列を有するpCR27axc取得した(図9)。次に、pCR27axcを制限酵素NotIおよび制限酵素SalIで消化して得られる約780bpのDNA断片を、実施例1で作製したpKANTEX XhoI/SalIを制限酵素NotIおよび制限酵素SalIで消化して得られる、約8.9 kbpのDNA断片に連結することにより、CD27を発現するためのプラスミドpKANTEX CD27を構築した(図10)。本プラスミドにコードされるCD27遺伝子配列を配列番号1に、該遺伝子から翻訳されるアミノ酸配列を配列番号2に示した。該発現ベクターを用いて形質転換した大腸菌を、100 mLのLB培地に播種し、一晩培養を行った。培養後に、菌体を回収し、Qiafilter Plasmid midi kit (キアゲン社製)を用いて添付のプロトコールに従ってプラスミドを精製した。精製後、30μgのプラスミドベクターを制限酵素AatII消化により、線状化した。線状化後、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を行い、1/10濃度TEバッファー(1mM Tris HCl, 0.1mM EDTA)に溶解した後、濃度を測定し、遺伝子導入を行った。
(2)CD27発現プラスミドpKANTEX CD27の導入
上記(1)で作製したCD27発現プラスミドpKANTEX CD27を、Lec8細胞およびCHO/DG44細胞に、遺伝子導入することにより、CD27を発現するLec8細胞およびDG44細胞の樹立を行った。導入するプラスミドとしてpKANTEXCD27を用いる以外は実施例1に記載の方法で実施した。ただし、遺伝子導入後の細胞は、HT-培地30 mLに懸濁し、100μL/ウェルとなるように3枚の96ウェルプレートに播種した。播種2日後に500μg/mL G418を含む継代用培地に交換し、10日間培養を行った。10日後、50 nM MTX(Sigma aldrich社製)を含むHT-培地に交換し、MTX耐性株を取得した。Lec8株由来のCD27発現株をCD27/Lec8-4、一方、DG44細胞由来のCD27発現細胞をCD27/DG44-8と命名した。
(3)CD27発現細胞の確認
(2)で作製したCD27発現細胞のCD27発現を確認するため、フローサイトメーター(FCM)を用いて、下記のように解析を行った。
(1)免疫原の調製
実施例1で得られたLec8株生産CD27-Fc 50μgを、水酸化アルミニウムアジュバント(Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p99、1988)2 mgおよび百日咳ワクチン(千葉県血清研究所製)1×109細胞とともに、4週令雌SDラット3匹に投与した。投与2週間後より、Lec8株生産CD27-Fc 50μgを1週間に1回、計3回投与した。尾静脈より部分採血し、得られた抗血清の結合活性を、ABI8200セルラーディテクションシステム(アプライドバイオ社製)または、フローサイトメーター(Cytomics FC500 MPL、ベックマンコールター社製)を用いた蛍光細胞染色法により測定し、充分な抗体価を示したマウスから最終免疫3日後に脾臓を摘出した。脾臓をMEM(Minimum Essential Medium)培地(日水製薬社製)中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離(1200rpm、5分間)した。得られた沈殿画分にトリス−塩化アンモニウム緩衝液(pH7.6)を添加し、1〜2分間処理することにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分(細胞画分)をMEM培地で3回洗浄し、細胞融合に用いた。
(2)バインディングELISA
バインディングELISAに用いる抗原には、実施例1で得られたLec8株生産CD27-FcおよびDG44細胞生産CD27-Fcをそれぞれ用いた。96ウェルのELISA用プレート(グライナー社)に、上記のCD27-Fcタンパク質を5μg/mL、50μL/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。該プレートを洗浄後、1 % BSA-PBSを100μL/ウェルで加え、室温で1時間放置し、残っている活性基をブロックした。放置後、1 % BSA-PBSを捨て、該プレートに一次抗体として被免疫動物抗血清あるいはハイブリドーマ培養上清を50μL/ウェルで分注し、2時間放置した。該プレートを0.05 % ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート[(ICI社商標Tween 20相当品:和光純薬社製)]-PBS(以下Tween-PBSと表記)で洗浄後、2次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン(Zymed社)を50μL/ウェル加えて室温、1時間放置した。該プレートをTween-PBSで洗浄後、ABTS〔2.2-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾール-6-スルホン酸)アンモニウム〕基質液〔1 mmol/L ABTS−0.1 mol/Lクエン酸バッファー(pH4.2),0.1%H2O2〕を添加し、発色させOD415 nmの吸光度をプレートリーダー(Emax;Molecular Devices社)を用いて測定した。
(3)蛍光細胞染色法(ABI8200セルラーディテクションシステム解析)
実施例2で作製したCD27/Lec8-4およびCD27/DG44-8をアッセイ用細胞として用いた。50nM MTX および500 ng/mL G418を添加した継代用培地で継代したCD27/Lec8-4およびCD27/DG44-8を0.05 % Trypsin溶液(Invitrogen社製)で剥離し、ABI8200用黒色96ウェルプレートに1×104個/100μL Medium/ウェルで播種し、1晩培養した。該プレートに一次抗体として被免疫ラット抗血清あるいはハイブリドーマ培養上清を10μL/ウェルで分注し、2次抗体としてALEXA647標識抗ラットイムノグロブリンG(H+L)(Invitrogen社製)を100μL/ウェルで加えて、遮光下で4時間放置した。レーザー光633 He/Neで励起された650〜685 nmの蛍光をABI8200セルラーディテクションシステム(アプライドバイオ社製)で測定した。
(4)蛍光細胞染色法(フローサイトメーター解析)
実施例2で作製したCD27/Lec8-4およびCD27/DG44-8をアッセイ用細胞として用いた。50 nM MTX および500μg/mL G418を添加したHT-培地を用いて継代したCD27/Lec8-4およびCD27/DG44-8を、0.02 % EDTA溶液(ナカライテスク社製)を用いて剥離した後、各細胞をPBSで洗浄した。洗浄後、1〜5×105個の細胞を50μLの1 % BSA-PBSに懸濁した後、1次抗体として被免疫ラット抗血清あるいはハイブリドーマ培養上清を50μL/ウェルで分注し、氷温中で30分間反応させた。また、ネガティブコントロールとして、ウシ血清アルブミン、マウスIgG1アイソタイプコントロール(コスモバイオ社製)およびラットIgG2aアイソタイプコントロール(コスモバイオ社製)を、ポジティブコントロールとして、抗RCAS1抗体22-1-1(MBL社製)および抗CD27マウスモノクローナル抗体(ベックマンコールター社製)を用いて、同時に反応させた。反応後、PBSを用いて遠心分離を2回行い細胞を洗浄し、2次抗体としてALEXA488標識抗ラットイムノグロブリンG(H+L)(Invitrogen社製)を、50μL/ウェルで加えて氷温中、遮光下で30分間反応させた。再びPBSを用いて遠心分離を2回行い細胞を洗浄した後、500μLの1 % BSA-PBSに懸濁してレーザー光488 nmアルゴンで励起される510〜530 nmの蛍光をフローサイトメーター(ベックマンコールター社製、Cytomics FC500 MPL)で測定した。
(5)マウス骨髄腫細胞の調製
8−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3X63Ag8U.1(P3-U1:ATCCより購入)を正常培地(10 % FCS RPMI培地)で培養し、細胞融合時に2×107個以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
(6)ハイブリドーマの作製
上記(1)で得られたマウス脾臓細胞と上記(5)で得られた骨髄腫細胞とを、10:1になるよう混合し、遠心分離(250×g,5分間)した。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングリコール−1000(PEG-1000)1g、MEM培地1mLおよびジメチルスルホキシド0.35mLの混液を、108個のマウス脾臓細胞あたり0.5mL加え、該懸濁液に1〜2分間毎にMEM培地1mLを数回加えた後、更にMEM培地を加えて全量が50mLになるようにした。
これら糖鎖不全CD27に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、糖鎖合成経路に関連する酵素、輸送タンパク質の活性が欠損していないDG44株およびUDP-galactose transporterの活性が低下または欠損しているLec8株を利用することで、正常糖鎖CD27および糖鎖不全CD27をそれぞれ発現させた組み換え細胞を作製し、正常糖鎖CD27発現細胞やLec8株には結合せず、糖鎖不全CD27発現細胞にのみに特異的に結合するモノクローナル抗体をスクリーニングすることが可能な系を考案し、約6000ウェル規模のスクリーニングアッセイを行うことで取得した。
(7)モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した7週令ヌード雌マウス(ICR)に上記(6)で得られたハイブリドーマ株を5〜20×106細胞/匹を腹腔内注射した。10〜21日後、ハイブリドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取(1〜8 mL/匹)した。該腹水を、シリンジフィルター(孔径5μm)を用いてろ過し、固形分を除去した。精製IgGモノクローナル抗体は、カプリル酸沈殿法[Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]により精製することにより取得した。モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキット(rat monoclonal antibody isotyping kit, DSファーマバイオメディカル社製)を用いたバインディングELISAにより行った。その結果、各抗体のサブクラスは、抗糖鎖不全CD27モノクローナル抗体KM4026はラットIgG2aクラス、抗糖鎖不全CD27モノクローナル抗体KM4027はラットIgG2bクラス、抗糖鎖不全CD27モノクローナル抗体KM4028はラットIgG1クラス、抗糖鎖不全CD27モノクローナル抗体KM4030はラットIgG2aクラス、および抗糖鎖不全CD27モノクローナル抗体KM4031はラットIgG1クラス、であることが明らかになった。
下記に示す競合ELISA系を用いて、抗糖鎖不全CD27モノクローナル抗体KM4030およびKM4031の反応特異性の検討を行った。実施例1で得られたLec8株生産CD27-Fcを、5μg/mLの濃度で、96ウェルのELISAプレート(グライナー社製)に、50μL/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。該プレートを洗浄後、1 % BSA-PBSを200μL/ウェルで加え室温で1時間放置し、残っている活性基をブロックした。放置後、1 % BSA-PBSを捨て、該プレートに一次抗体として、希釈した抗糖鎖不全CD27モノクローナル抗体KM4030精製抗体またはKM4031精製抗体を、50μL/ウェルで分注した。同時に、結合競合物質として、Lec8生産CD27-Fcタンパク質、DG44生産CD27-Fcタンパク質あるいはヒトイムノグロブリンを、20、2、0.2、0.02μg/mLの濃度で加え、抗体と結合競合物質とを共存させた。プレートを室温で2時間放置した後、0.05 % ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート[(ICI社商標Tween 20相当品:和光純薬社製)]-PBS(以下Tween-PBSと表記)で洗浄後、2次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン(Zymed社製)を、50 μL/ウェルで加えて、室温、1時間放置した。該プレートをTween-PBSで洗浄後、ABTS〔2.2-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾール-6-スルホン酸)アンモニウム〕基質液〔1 mmol/L ABTS−0.1 mol/Lクエン酸バッファー(pH4.2),0.1 % H2O2〕を添加し、発色させた後、OD415 nmの吸光度をプレートリーダー(Emax;Molecular Devices社)を用いて測定した。
抗ヒトIgG4抗体(Pharmingen社製)を、Amine Coupling Kit(ビアコア社製)を用い、添付プロトコールに従い、アミンカップリング法によりCM5センサーチップ(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)に固定化した。実施例1(7)で得られたDG44産生CD27−Fcに対し、Prozyme Glyco Enzymatic Deglycosilation Kit (Prozyme社製)およびProO-Link Extender Deglycosylation Plus (Prozyme社製)のシアリダーゼAもしくはβ(1-4)ガラクトシダーゼを用いて添付のプロトコールに従って糖鎖消化酵素処理を行った、Tn抗原型CD27-FcもしくはシアリルTn抗原型CD27-Fcを添加し、抗ヒトIgG4抗体を固定化したチップ上に200-250RU(resonanceユニット)になるようにキャプチャーさせた。その後、20000ng/mLから5段階に希釈した測定サンプル(抗糖鎖不全CD27モノクローナル抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030およびKM4031)を30μL/minの流速でチップ上に流し、各濃度のセンサーグラムを取得し、装置添付の解析ソフトBiacore T100 Evaluation software(Biacore社製)を用いて解析した。
(1)抗糖鎖不全CD27モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞からのmRNAの調製
実施例3で取得した各ハイブリドーマKM4026、KM4027、KM4028、KM4030およびKM4031それぞれ、5×107〜1×108個の細胞より、RNAeasy Mini kit(QIAGEN社製)およびOligotexTM-dT30<Super>mRNA Purification Kit(TaKaRa社製)を用いて、それぞれ添付の使用説明書に従い、各抗糖鎖不全CD27モノクローナル抗体のmRNAを調製した。
(2)抗糖鎖不全CD27モノクローナル抗体のH鎖およびL鎖可変領域の遺伝子クローニング
実施例5(1)で取得したモノクローナル抗体のmRNAから、BD SMART RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences社製)を用いて、添付の使用説明書に従ってcDNAを取得した。取得したcDNAを鋳型として、ラットIgG1に特異的なプライマー(配列番号14)、ラットIgG2aに特異的なプライマー(配列番号15)、ラットIgG2bに特異的なプライマー(配列番号16)、またはラットCH1特異的なプライマー(配列番号17)を用いて、それぞれPCR反応を行い、各抗体の重鎖可変領域(以下、VHと記す)のcDNA断片を増幅した。また抗体の各サブクラス特異的プライマーの代わりにラットIg(κ)特異的プライマー(配列番号18)および(配列番号19)を用いてPCRを行い、各抗体の軽鎖可変領域(以下、VLと記す)のcDNA断片を増幅した。KM4026、KM4030、KM4031のVLおよびVHを増幅するためのPCR反応はAdvantage 2 PCR kit(Clontech社製)を用いて、KM4027、KM4028のVLおよびVHを増幅するためのPCR反応はKOD Plus Polymerase(東洋紡社製)を用いて、それぞれ添付の使用説明書に従って行った。
(3)抗CD27モノクローナル抗体可変領域の遺伝子配列の解析
実施例5(2)で得られたプラスミドに含まれる、抗糖鎖不全CD27モノクローナル抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030およびKM4031のVHの全塩基配列を配列番号20から配列番号24に、該配列から推定されるシグナル配列を含んだVHの全アミノ酸配列を配列番号25から配列番号29に、またVLの全塩基配列を配列番号30から配列番号34に、該配列から推定されるシグナル配列を含んだVLの全アミノ酸配列を配列番号35から配列番号39にそれぞれ示した。
(1)抗糖鎖不全CD27キメラ抗体発現ベクターの構築
本発明で作製するキメラ抗体は、実施例5(3)で得られた抗CD27ラットモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域に、US97/10354に開示されているヒトIgG1の重鎖定常領域およびヒトκの軽鎖定常領域をそれぞれ連結したキメラ抗体である。方法としては、実施例5(3)で得られた各モノクローナル抗体のVLまたはVHが含まれているpCRベクターと、US97/10354に記載されているヒトIgG1の重鎖定常領域およびヒトκの軽鎖定常領域が含まれる抗体発現ベクターpKANTEX93とを用いて、抗糖鎖不全CD27キメラ抗体発現ベクターを以下のようにして構築した(図15、図16、図17、図18)。
抗CD27モノクローナル抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030、KM4031のVL の各EcoRI-BsiWI断片と、pKANTEX93を制限酵素EcoRIおよびBsiWIで消化して得られるDNA断片を、Ligation High(東洋紡社製)を用いて添付の使用説明書に従って連結させた。連結されたDNA断片を用いて大腸菌DH5α(東洋紡社製)を形質転換し、各クローンから得られるプラスミドを調整し、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(PEバイオシステムズ社製)を用いて添付の使用説明書に従って反応後、同社のシーケンサーABI PRISM3700により塩基配列を解析した。その結果、抗CD27モノクローナル抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030、KM4031のVLをコードするcDNAが挿入された、pKANTEX93を取得した。続いて、抗CD27モノクローナル抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030、KM4031のVH の各NotI-ApaI断片と、抗CD27モノクローナル抗体の各VLが挿入されたpKANTEX93を制限酵素NotIおよびApaIで消化して得られるDNA断片を、Ligation High(東洋紡社製)を用いて添付の使用説明書に従って連結させた。連結されたDNA断片を用いて大腸菌DH5α(東洋紡社製)を形質転換し、各クローンから得られるプラスミドを調整し、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(PEバイオシステムズ社製)を用いて添付の使用説明書に従って反応後、同社のシーケンサーABI PRISM3700により塩基配列を解析した。その結果、抗CD27モノクローナル抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030、KM4031のVLおよびVHをコードするcDNAがそれぞれ挿入された、抗CD27キメラ抗体発現ベクターを取得した。
(2)動物細胞を用いた抗糖鎖不全CD27キメラ抗体の発現
上記(1)で得られた抗糖鎖不全CD27キメラ抗体発現ベクターを用いて抗糖鎖不全CD27キメラ抗体の動物細胞での発現を、常法[Antibody Engineering, A Practical Guide,W.H. Freeman and Company(1992)]により行い、抗糖鎖不全CD27キメラ抗体(キメラ型KM4026、キメラ型KM4028、キメラ型KM4030およびキメラ型KM4031)を産生する形質転換株を取得した。発現させる動物細胞株としては、α1,6-フコシルトランスフェラーゼ(FUT8)の遺伝子をダブルノックアウトしたCHO/DG44細胞株(以下、FUT8ノックアウトCHO細胞)を用いた。この宿主細胞株で発現させた抗体のN-結合型複合型糖鎖のコア部分には、フコースが付加されないことが知られている(WO2002/31140)。
(3)精製キメラ抗体の取得
上記(2)で得られた形質転換株キメラ型KM4026、キメラ型KM4028、キメラ型KM4030およびキメラ型KM4031を、通常の培養法で培養した後、細胞懸濁液を回収し、3000 rpm、4℃の条件で20分間の遠心分離を行い、培養上清を回収した後、0.22μm孔径Millex GVフィルターを通して濾過滅菌した。得られた培養上清から、実施例1(7)と同様の方法により、Mab Selectを用いて抗糖鎖不全CD27キメラ抗体キメラ型KM4026、キメラ型KM4028、キメラ型KM4030およびキメラ型KM4031を精製した。
(4)抗糖鎖不全CD27キメラ抗体のフコース含量測定
WO2002/31140に記載の方法に従い、各抗糖鎖不全CD27キメラ抗体のFc領域のN結合複合型糖鎖の還元末端に存在するN-アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合を調べた。結果を表2に示す。
以下の(1)から(3)では、実施例6で得られた抗糖鎖不全CD27キメラ抗体キメラ型KM4026、キメラ型KM4028、キメラ型KM4030およびキメラ型KM4031の活性評価を行った。
(1)ビアコアによる抗糖鎖不全CD27キメラ抗体のヒト糖鎖不全CD27-Fcへの結合活性評価
抗糖鎖不全CD27キメラ抗体キメラ型KM4026、キメラ型KM4028、キメラ型KM4030のヒト糖鎖不全CD27-Fcに対する結合活性を反応速度論的に解析するため、表面プラズモン共鳴法(SPR法)を用いて結合活性測定を行った。以下の操作は全てBiacore T100(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用いて行った。実施例1(7)で得られたLec8由来CD27-Fcを、アミンカップリング法によりCM5センサーチップ(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)に固定化した。CD27-Fcを固定化したチップに9μg/mLから3倍希釈で段階的に希釈して5濃度に調製した測定サンプル(キメラ型KM4026、キメラ型KM4028、キメラ型KM4030およびキメラ型KM4031)をシングルカイネティクスの自動プログラムに従い低濃度から順に連続添加して測定した。装置添付の解析ソフトBiacore T100 Evaluation software(Biacore社製)を用い、Bivalent Analyteモデルで解析し、各抗体のヒト糖鎖不全CD27-Fcに対する結合速度定数ka及び解離速度定数kdを算出した。
表3に示すように、キメラ型KM4026、キメラ型KM4028、キメラ型KM4030およびキメラ型KM4031はいずれも、ヒト糖鎖不全CD27-Fcに対し、1×10-8から1×10-9 mol/Lの高いアフィニティーを示した。
実施例2と同様の方法で作製したCD27/DG44-4細胞、CD27/Lec8-4細胞およびLec8細胞をアッセイ用細胞として用いた。500μg/mL G418添加HT-培地を用いて継代したCD27/DG44-4および50 nmol/L MTX および500μg/mL G418添加HT-培地を用いて継代したCD27/Lec8-4を、0.02% EDTA溶液を用いて剥離した後、各細胞をPBSで洗浄した。洗浄後、5×105個の細胞を50μLの1% BSA-PBSに懸濁した後、1次抗体として抗糖鎖不全CD27キメラ抗体(キメラ型KM4026、キメラ型KM4028、キメラ型KM4030およびキメラ型KM4031)を0.02、0.2、2および10μg/mLに調製した抗体液を50μL/ウェルで分注し、氷温中で1時間反応させた。ポジティブコントロールとして、抗Tn抗体である抗RCAS1マウス抗体22-1-1(MBL社製)および抗CD27マウス抗体O323(Santa Cruz biotechnology社製)を用いた。反応後、PBSを用いて遠心分離を2回行って細胞を洗浄し、2次抗体としてALEXA Fluoro 488標識抗ヒトイムノグロブリンG(H+L)、ALEXA Fluoro 488標識抗マウスイムノグロブリンG(H+L)もしくはALEXA Fluoro 488標識抗ヒトイムノグロブリンM(μ)を、50μL/ウェルで加え、氷温、遮光下で30分間反応させた。再びPBSを用いて遠心分離を2回行い、細胞を洗浄した後、500μLの1% BSA-PBSに懸濁してレーザー光488 nmアルゴンで励起される510〜530 nmの蛍光をフローサイトメーター(ベックマンコールター社製、Cytomics FC500 MPL)で測定した。図19(A)〜(C)に結果を示す。
以上のことから、本発明の抗糖鎖不全CD27キメラ抗体キメラ型KM4026、キメラ型KM4028、キメラ型KM4030およびキメラ型KM4031は、細胞表面に発現している糖鎖不全CD27を特異的に認識していることが明らかになった。
(3)抗糖鎖不全CD27キメラ抗体の抗体依存性細胞傷害活性(ADCC活性)の評価
実施例2で作製したCD27/Lec8-4細胞に対する抗糖鎖不全CD27キメラ抗体キメラ型KM4026、キメラ型KM4028、キメラ型KM4030およびキメラ型KM4031のADCC活性を、以下に示す方法に従って測定した。
(3)−1 標的細胞懸濁液の調製
50 nmol/L MTX および500μg/mL G418添加HT-培地を用いて継代したCD27/Lec8-4細胞を、0.02% EDTA溶液を用いて剥離した後、PBSで洗浄し、5%透析済みウシ胎児血清(dFBS)(インビトロジェン社製)を含むフェノールレッド不含有RPMI1640培地(インビトロジェン社製)(以下、ADCC用培地と記す)で洗浄し、同培地で至適濃度に調製して標的細胞懸濁液とした。
(3)−2 エフェクター細胞懸濁液の調製
末梢血単核球(Peripheral blood mononuclear cell:PBMC)は、健常人末梢血から以下に示した方法により分離した。ヘパリンナトリウム注N「シミズ」(清水製薬社製)を0.5 mL加えたシリンジを用いて、健常人から健常人末梢血50 mLを採血した。15 mLチューブに3 mLずつ分注したモノ・ポリ分離溶液(DSファーマバイオメディカル社製)の上に、3.5 mLの採取した末梢血を静かに重層し、400×g、ブレーキオフ、室温の条件で20分間遠心分離して、単核球層を分離した。こうして得られた単核球画分を、ADCC用培地を用いて2回洗浄し、同培地により至適な細胞数に調製してエフェクター細胞懸濁液とした。
(3)−3 ADCC活性の測定
LDH-Cytotoxic Test Wako(Wako社製)を用い、付属の説明書に従い以下の手順で測定した。
(式)
ADCC活性(%)={([検体の吸光度]−[標的細胞自然遊離の吸光度]−[エフェクター細胞自然遊離の吸光度])/([標的細胞全遊離の吸光度]−[標的細胞自然遊離の吸光度])}×100
その結果、抗体のFc領域のN結合複合型糖鎖にコアフコースが結合していない抗糖鎖不全CD27キメラ抗体キメラ型KM4026、キメラ型KM4028、キメラ型KM4030およびキメラ型KM4031はいずれも、CD27/Lec8-4細胞に対して、高いADCC活性を示した。
(4)抗糖鎖不全CD27キメラ抗体の補体依存性細胞傷害活性(CDC活性)の評価
実施例2で作製したCD27/Lec8-4細胞に対する抗糖鎖不全CD27キメラ抗体キメラ型KM4026、キメラ型KM4028、キメラ型KM4030およびキメラ型KM4031のCDC活性を、以下に示す方法に従って測定した。
(式)
CDC活性(細胞傷害活性[%])={1−(反応ウェルの吸光度−100%Lysisウェルの吸光度)/(0%Lysisウェルの吸光度−100%Lysisウェルの吸光度)}×100
その結果、本発明で取得した抗糖鎖不全CD27キメラ抗体キメラ型KM4026、キメラ型KM4028、キメラ型KM4030およびキメラ型KM4031は、いずれもCDC活性を示した。
(1)カニクイザルCD27遺伝子のクローニング
カニクイザル末梢血由来RNAより、以下の手順でCD27をコードする遺伝子を単離した。カニクイザル末梢血よりTrizol(インビトロジェン社製)を用いて単離したRNAを鋳型として3.3μg使用し、SuperScriptIIIfirst strandキット(インビトロジェン社製)に添付されたオリゴdTを1μL、dNTP Mixを1μL含む、全量5μLから成る溶液を調製した。該調製した溶液を65℃で5分間反応後に氷上で1分間急冷したのち、SuperScriptIIIfirst strandキットに添付された10×RTバッファーを2μL、DTTを2μL、RNase OUTを1μL、RTを1μL添加し、50℃で50分間逆転写反応を行った。反応後、85℃で5分間加熱し逆転写酵素を失活させたのち、SuperScriptIIIfirst strandキットに添付されたRNase Hを1μL添加し、37℃で20分間反応させRNAを完全に分解した。本カニクイザル末梢血由来一本鎖cDNAは使用するまで-20℃で保存した。
(2)サルCD27発現プラスミドpKANTEX mfCD27Hisの構築
C末端にHisタグを付加したカニクイザルCD27発現ベクターpKANTEX mfCD27Hisを以下の方法にて作製した。
(3)サルCD27発現プラスミドpKANTEX mfCD27Hisの導入
上記(2)で作製したカニクイザルCD27発現プラスミドpKANTEX mfCD27HisをLec8細胞およびCHO/DG44細胞に遺伝子導入することにより、カニクイザルCD27を発現するLec8細胞およびDG44細胞の樹立を行った。導入するプラスミドとしてpKANTEX mfCD27Hisを用いる以外は実施例1(6)に記載の方法で実施した。ただし、遺伝子導入後の細胞は、HT-培地30 mLに懸濁し、100μL/ウェルとなるように3枚の96ウェルプレートに播種した。播種1日後に500μg/mL G418を含む継代用培地に交換し、10日間培養を行い、G418耐性クローン株を取得した。Lec8株由来のカニクイザルCD27発現株をカニクイザルCD27/Lec8細胞、一方、DG44細胞由来のカニクイザルCD27発現細胞をカニクイザルCD27/DG44細胞と記載する。
実施例8で作製したカニクイザルCD27/DG44細胞、カニクイザルCD27/Lec8細胞をアッセイ用細胞として用いた。
(1)蛍光細胞染色法(フローサイトメーター解析)による抗糖鎖不全CD27キメラ抗体のサルCD27発現細胞への反応性評価
抗糖鎖不全CD27キメラ抗体キメラ型KM4026、キメラ型KM4028、キメラ型KM4030およびキメラ型KM4031のカニクイザルCD27発現細胞に対する結合活性を、以下の方法に従って測定した。
(2)抗糖鎖不全CD27キメラ抗体のサルCD27発現細胞に対するADCC活性の評価
500μg/mL G418添加HT-培地を用いて継代したカニクイザルCD27/Lec8細胞を、0.02% EDTA溶液を用いて剥離した後、PBSで洗浄した後、ADCC用培地で洗浄して同培地で至適濃度に調製して標的細胞懸濁液とした。また、エフェクター細胞懸濁液の調製およびADCC活性の測定は、実施例7と同様の方法で行った。図26に結果を示す。
以上のことから、本発明の抗糖鎖不全CD27キメラ抗体キメラ型KM4026、キメラ型KM4028、キメラ型KM4030およびキメラ型KM4031はいずれも、糖鎖不全カニクイザルCD27細胞に交差反応性を示すことが明らかとなった。各抗糖鎖不全CD27キメラ抗体の糖鎖不全カニクイザルCD27に対する反応性には強弱が認められ、認識するエピトープの違いが示唆された。
(1)抗糖鎖不全CD27ヒト化抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列の設計
抗糖鎖不全CD27ヒト化抗体のVHのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
初めに、配列番号58,59および60でそれぞれ表される抗糖鎖不全CD27ラットモノクローナル抗体KM4030VHのCDR1〜3のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のVHのFRのアミノ酸配列を選択した。配列解析システムとしてGCG Package (Genetics Computer Group社製) を用いて、既存の蛋白質のアミノ酸データベースをBLASTP法(Nucleic Acid Res., 25, 3389 (1997))により抗糖鎖不全CD27ラットモノクローナル抗体KM4030と相同性の高いヒト抗体を検索した。相同性スコアと実際のアミノ酸配列の相同性を比較したところ、SWISSPROTデータベースアクセッションナンバーBAH04525、The repertoire of neutralizing monoclonal antibodies against H3N2 influenza viruses in human (以下、BAH04525と称す)が83.9%を示し、最も相同性の高いヒト抗体であったため、この抗体のFRのアミノ酸配列を選択した。
次に、抗糖鎖不全CD27ヒト化抗体のVLのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
以上の結果から、ヒト抗体のVLのサブグループIの共通配列のFRのアミノ酸配列の適切な位置に抗糖鎖不全CD27ラットモノクローナル抗体KM4030のVLのCDRのアミノ酸配列を移植した。しかし、配列番号38に記載の抗糖鎖不全CD27ラットモノクローナル抗体KM4030のVLのアミノ酸配列中の124番目のLeuは、カバットらがあげるヒト抗体FRのアミノ酸配列の相当する部位において、最も使用される頻度が高いアミノ酸残基ではないが、比較的高い頻度で使用されるアミノ酸残基であるため、上記の抗糖鎖不全CD27ラットモノクローナル抗体KM4030のアミノ酸配列で認められるアミノ酸残基を用いることとした。このようにして、配列番号97で表される抗糖鎖不全CD27ヒト化抗体のVLのアミノ酸配列LV0を設計した。
(2)抗糖鎖不全CD27ヒト化抗体の作製および評価
抗糖鎖不全CD27ヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードするDNAは、抗糖鎖不全CD27ラットモノクローナル抗体KM4030のVHまたはVLのアミノ酸配列をコードするDNAで用いられているコドンを利用し、アミノ酸改変を行う場合は、哺乳動物細胞で高頻度で使用されるコドンを用いて、作製した。抗糖鎖不全CD27ヒト化抗体のHV0およびLV0のアミノ酸配列をコードするDNA配列を配列番号98、99にぞれぞれ示し、またアミノ酸改変を行った可変領域HV2、HV3、HV5、およびHV7のアミノ酸配列をコードするDNA配列を、配列番号100、102、104、および106にそれぞれ示した。
配列番号2−ヒトCD27 アミノ酸配列
配列番号3−人工配列の記載:CD27フォワードプライマー
配列番号4−人工配列の記載:CD27809B
配列番号5−人工配列の記載:CD27-Aプライマー
配列番号6−人工配列の記載:CD27-Bプライマー
配列番号7−人工配列の記載:プライマー1
配列番号8−人工配列の記載:プライマー2
配列番号9−人工配列の記載:g4Aプライマー
配列番号10−人工配列の記載:g4Bプライマー
配列番号11−人工配列の記載:CD27-Fcタンパク質 DNA配列
配列番号12−人工配列の記載:CD27-Fcタンパク質アミノ酸配列
配列番号13−人工配列の記載:CD27-Cプライマー
配列番号14−人工配列の記載:ラットIgG1に特異的なプライマー
配列番号15−人工配列の記載:ラットIgG2aに特異的なプライマー
配列番号16−人工配列の記載:ラットIgG2bに特異的なプライマー
配列番号17−人工配列の記載:ラットCH1特異的なプライマー
配列番号18−人工配列の記載:ラットIg(κ)特異的プライマー1
配列番号19−人工配列の記載:ラットIg(κ)特異的プライマー2
配列番号20−KM4026 VH 塩基配列
配列番号21−KM4027 VH 塩基配列
配列番号22−KM4028 VH 塩基配列
配列番号23−KM4030 VH 塩基配列
配列番号24−KM4031 VH 塩基配列
配列番号25−KM4026 VH アミノ酸配列
配列番号26−KM4027 VH アミノ酸配列
配列番号27−KM4028 VH アミノ酸配列
配列番号28−KM4030 VH アミノ酸配列
配列番号29−KM4031 VH アミノ酸配列
配列番号30−KM4026 VL 塩基配列
配列番号31−KM4027 VL 塩基配列
配列番号32−KM4028 VL 塩基配列
配列番号33−KM4030 VL 塩基配列
配列番号34−KM4031 VL 塩基配列
配列番号35−KM4026 VL アミノ酸配列
配列番号36−KM4027 VL アミノ酸配列
配列番号37−KM4028 VL アミノ酸配列
配列番号38−KM4030 VL アミノ酸配列
配列番号39−KM4031 VL アミノ酸配列
配列番号40−KM4026 VH CDR1
配列番号41−KM4026 VH CDR2
配列番号42−KM4026 VH CDR3
配列番号43−KM4026 VL CDR1
配列番号44−KM4026 VL CDR2
配列番号45−KM4026 VL CDR3
配列番号46−KM4027 VH CDR1
配列番号47−KM4027 VH CDR2
配列番号48−KM4027 VH CDR3
配列番号49−KM4027 VL CDR1
配列番号50−KM4027 VL CDR2
配列番号51−KM4027 VL CDR3
配列番号52−KM4028 VH CDR1
配列番号53−KM4028 VH CDR2
配列番号54−KM4028 VH CDR3
配列番号55−KM4028 VL CDR1
配列番号56−KM4028 VL CDR2
配列番号57−KM4028 VL CDR3
配列番号58−KM4030 VH CDR1
配列番号59−KM4030 VH CDR2
配列番号60−KM4030 VH CDR3
配列番号61−KM4030 VL CDR1
配列番号62−KM4030 VL CDR2
配列番号63−KM4030 VL CDR3
配列番号64−KM4031 VH CDR1
配列番号65−KM4031 VH CDR2
配列番号66−KM4030 VH CDR3
配列番号67−KM4031 VL CDR1
配列番号68−KM4031 VL CDR2
配列番号69−KM4031 VL CDR3
配列番号70−人工配列の記載:KM4026 VL キメラ プライマー1
配列番号71−人工配列の記載:KM4026 VL キメラ プライマー2
配列番号72−人工配列の記載:KM4026 VH キメラ プライマー1
配列番号73−人工配列の記載:KM4026 VH キメラ プライマー2
配列番号74−人工配列の記載:KM4027 VL キメラ プライマー1
配列番号75−人工配列の記載:KM4027 VL キメラ プライマー2
配列番号76−人工配列の記載:KM4027 VH キメラ プライマー1
配列番号77−人工配列の記載:KM4027 VH キメラ プライマー2
配列番号78−人工配列の記載:KM4028 VL キメラ プライマー1
配列番号79−人工配列の記載:KM4028 VL キメラ プライマー2
配列番号80−人工配列の記載:KM4028 VH キメラ プライマー1
配列番号81−人工配列の記載:KM4028 VH キメラ プライマー2
配列番号82−人工配列の記載:KM4030 VL キメラ プライマー1
配列番号83−人工配列の記載:KM4030 VL キメラ プライマー2
配列番号84−人工配列の記載:KM4030 VH キメラ プライマー1
配列番号85−人工配列の記載:KM4030 VH キメラ プライマー2
配列番号86−人工配列の記載:KM4031 VL キメラ プライマー1
配列番号87−人工配列の記載:KM4031 VL キメラ プライマー2
配列番号88−人工配列の記載:KM4031 VH キメラ プライマー1
配列番号89−人工配列の記載:KM4031 VH キメラ プライマー2
配列番号90−人工配列の記載:プライマー mfCD27_5UTR
配列番号91−人工配列の記載:プライマー mfCD27_3UTR
配列番号92−カニクイザルCD27 cDNA配列
配列番号93−人工配列の記載:プライマー mfCD27toKAN_5
配列番号94−人工配列の記載:プライマー mfCD27HisKAN_3
配列番号95−人工配列の記載:Hisタグ付きカニクイザルCD27 cDNA配列
配列番号96−人工配列の記載:KM4030 HV0 アミノ酸配列
配列番号97−人工配列の記載:KM4030 LV0 アミノ酸配列
配列番号98−人工配列の記載:KM4030 HV0 塩基配列
配列番号99−人工配列の記載:KM4030 LV0 塩基配列
配列番号100−人工配列の記載:KM4030 HV2 塩基配列
配列番号101−人工配列の記載:KM4030 HV2 アミノ酸配列
配列番号102−人工配列の記載:KM4030 HV3 塩基配列
配列番号103−人工配列の記載:KM4030 HV3 アミノ酸配列
配列番号104−人工配列の記載:KM4030 HV5 塩基配列
配列番号105−人工配列の記載:KM4030 HV5 アミノ酸配列
配列番号106−人工配列の記載:KM4030 HV7 塩基配列
配列番号107−人工配列の記載:KM4030 HV7 アミノ酸配列
Claims (26)
- ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含む、CD27遺伝子によってコードされるポリペプチド(以下、CD27と記す)の細胞外領域を特異的に認識し、結合するモノクローナル抗体または該抗体断片であって、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖単体は認識せず、且つO結合型糖鎖が結合した、CD27の細胞外領域のうち、ガラクトースが結合したO結合型糖鎖を含むCD27の細胞外領域は認識せず、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27の細胞外領域を認識し、結合するモノクローナル抗体または該抗体断片。
- ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖が、シアリルTn抗原またはTn抗原から選ばれる少なくとも1つのO結合型糖鎖である、請求項1に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
- ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖がTn抗原である、請求項2に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
- CDR1〜3がそれぞれ配列番号58〜60で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号61〜63で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
- モノクローナル抗体が、受託番号FERM BP−10976として寄託されているハイブリドーマから生産されるモノクローナル抗体である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
- モノクローナル抗体が、遺伝子組換え抗体である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
- 遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる抗体である、請求項6に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
- 抗体断片が、Fab、Fab’、F(ab’)2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(Diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)およびCDRを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体断片。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
- ハイブリドーマが、受託番号FERM BP−10976として寄託されているハイブリドーマである、請求項9に記載のハイブリドーマ。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片をコードするDNA。
- 請求項11に記載のDNAを含有する組換え体ベクター。
- 請求項12に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
- 請求項9または10に記載のハイブリドーマまたは請求項13に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項1〜8のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を生成蓄積させ、該培養物からモノクローナル抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体または該抗体断片の製造方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いる、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27の免疫学的検出または測定方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いる、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27の検出試薬。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いる、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患の診断薬。
- ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患がIgA腎症である、請求項17に記載の診断薬。
- ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患が癌である、請求項17に記載の診断薬。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または抗体断片を有効成分として含有する、ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患の治療薬。
- ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患がIgA腎症である、請求項20に記載の治療薬。
- ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患が、癌である、請求項20に記載の治療薬。
- ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患の診断薬を製造するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片の使用。
- ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患の治療薬を製造するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片の使用。
- ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患がIgA腎症である、請求項23または24に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片の使用。
- ガラクトースが結合していないO結合型糖鎖を含むCD27が関与する疾患が癌である、請求項23または24に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片の使用。
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