JPWO2015177933A1 - 磁性体粒子の操作方法および磁性体粒子操作用デバイス - Google Patents
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Abstract
Description
容器10は、外部からの磁場操作によって容器内の磁性固粒子や磁性体粒子を移動可能であり、液体を保持できるものであれば、その材質や形状は特に限定されない。例えば、試験管等の管状の容器や、エッペンドルチューブ等の錐形状の容器を用いることができる。また、内径1mm〜2mm程度、長さ50mm〜200mm程度の直管状構造体(キャピラリー)や、幅1mm〜2mm程度、深さ0.5mm〜1mm程度、長さ50mm〜200mm程度の直線状溝が形成された平面板材の上面に、別の平面板材を貼り合わせた構造体等を用いることもできる。なお、容器の形状は管状や面状に限定されず、粒子の移動経路が、十字あるいはT字等の分岐を有する構造であってもよい。容器の大きさを極力小さくすれば、微小液体操作用マイクロデバイス、または微小液体操作用チップとしても使用できる。
液体試料31は、分離・精製の対象となる目的物質を含む。目的物質としては、例えば核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンド、細胞等の生体由来物質が挙げられる。液体試料31は、目的物質の他に夾雑物を含む。例えば、血液から核酸の分離・精製を行う場合、液体試料31は、目的物質である核酸の他に、細胞から溶出したタンパク質や糖等の多種多様な夾雑物を含んでいる。
本発明に用いられる磁性体粒子71は、液体試料31中の目的物質を選択的に固定可能な粒子である。粒子表面への目的物質の固定方法は特に限定されず、物理固定、化学固定等の各種公知の固定化メカニズムが適用可能である。例えば、ファンデルワールス力、水素結合、疎水相互作用、イオン間相互作用、π−πスタッキング等の種々の分子間力により、粒子の表面あるいは内部に目的物質が固定される。核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンド、細胞等の目的物質は、分子認識等により、粒子表面に固定されてもよい。例えば、目的物質が核酸である場合は、シリカコーティングされた磁性体粒子を用いることにより、粒子表面に核酸を選択的に固定できる。また、目的物質が、抗体(例えば、標識抗体)、受容体、抗原およびリガンド等である場合、粒子表面のアミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、アピジン、ピオチン、ジゴキシゲニン、プロテインA、プロテインG等により、目的物質を粒子表面に選択的に固定できる。
本発明に用いられる磁性固体60は、磁性体であればその材料は特に限定されず、上記磁性体粒子を構成する磁性体として例示したのと同様に、鉄、コバルト、ニッケル等の強磁性金属、ならびにそれらの化合物、酸化物、および合金等が挙げられる。磁性固体の形状は特に限定されず、球状、多面体状、偏平形状、棒状等であってもよい。
以下では、図1(A)〜(C)を参照しながら、磁性体粒子の表面に目的物質として核酸を固定させる例を中心に説明する。まず、図1(A)に示すように、容器10内に、液体試料31、磁性体粒子71および磁性固体60が装填される。これらの装填順序は特に制限されない。
目的物質が固定された磁性体粒子71は、液体試料31から分離され、別の工程に供される。例えば、核酸の分離・精製では、磁性体粒子71を洗浄液中で洗浄して表面に付着した夾雑物を洗浄除去した後、溶出液中で磁性体粒子に固定されていた核酸を遊離溶出させることにより、目的物質である核酸を回収できる。回収された核酸は、必要に応じて濃縮や乾固等の操作を行った後、分析や反応等に供することができる。
本発明の方法は、前述の特許文献2(WO2012/086243)に開示されているような、水系液体層と、ゲル状媒体層とが交互に重層されたデバイスを用いた目的物質の分離・精製にも適用できる。このようなデバイスを用いる場合は、密閉系で一連の操作を実施できるため、開放系で行われるピペット操作に比べて、コンタミネーションの危険性を低減できる。
本発明の方法は、目的物質の溶解/固定の際の酵素処理が不要であるため、操作用デバイスの作製も容易である。すなわち、容器内に、磁性体粒子と、磁性固体と液体とを装填するだけで、図1に示すような、溶解/固定のためのデバイスを作成できる。容器内に装填される液体は、例えば、核酸抽出液等の細胞を溶解可能な液体である。この液体は、磁性体粒子の凝集を防ぐためのアルコール等が添加されたものでもよい。
<溶出/固定>
ヒト全血200μLを、容量1.5mLのポリプロピレンチューブ(Eppendorf セイフロックチューブ Cat.No. 0030 120.086)に採取し、Proteinase K(20mg/mL)水溶液5μLを加え、10秒間混合した。ここに、溶解/固定液 (30 mM Tris-HCl pH 8.0、30mM EDTA、5% Tween-20、0.5% Triton X-100、800 mM 塩酸グアニジン)100μLを加え、10秒間混合した後、予め68℃に保温したアルミブロック恒温槽で5分間インキュベートした。恒温槽からチューブを取出し、直ちに、イソプロパノール(75μL)に懸濁した平均粒子径約3μmの磁性ビーズ(東洋紡製の核酸抽出キット「MagExtractorTM-Genome」に付属の核酸抽出用シリカコート磁気ビーズ)1mgを加え、連続攪拌用アダプタを取り付けたボルテックスミキサーで5分間攪拌した。磁性体粒子分離用スタンドにチューブをセットし、1分間放置後、スタンドにセットした状態で、マイクロピペットを用いて、チューブ内の液体を除去した。
スタンドからチューブを外し、第1洗浄液(37% エタノール、4.8M 塩酸グアニジン、20mM Tris-HCl pH7.4)500μLを加え、チューブ内壁に集められた磁気ビーズ塊をピペッティングにより十分再懸濁した後、スタンドに再セットし、1分間放置後、スタンドにセットした状態で、マイクロピペットを用いて、チューブ内の液体を除去した。スタンドからチューブを外し、第2洗浄液(2mM Tris-HCl pH7.6、80% エタノール、20mM NaCl)500μLを加え、上記と同様に、再懸濁後にスタンドにセットして液体を除去した。
スタンドからチューブを外し、溶出液として蒸留水200μLを加え、磁気ビーズ塊をピペッティングにより再懸濁し、室温で5分間放置した。ピペッティングにより磁気ビーズを再懸濁させ、スタンドにチューブをセットし、1分間放置後、スタンドにセットした状態で、マイクロピペットを用いて、チューブ内の液体(DNA溶出液)を回収した。
ヒト全血200μLを、容量1.5mLのポリプロピレン製樹脂チューブに採取し、Proteinase Kを加えずに、溶解/固定液(50mM Tris-HCl pH 6.4、10 % Triton X-100、4M グアニジンイソシアネート)を加え、10秒間混合した。ここに、上記参考例1と同様に、イソプロパノールに懸濁した磁性ビーズを加え、さらに、粒径1mmのスチール球(新東工業製)を一個投入した。次に、ネオジム磁石(直径6mm、長さ23mmの円柱形、二六製作所製 商品名「NE127」)を、チューブの底からキャップ付近までの約2cmの距離で、チューブの外壁面に沿って毎秒5回の反復速度で往復移動させた。この際、スチール球が磁石に追随するように移動し、これに伴って磁気ビーズが液中で分散することが目視で確認された。
上記実施例1と同様に、ヒト全血に溶解/固定液、およびイソプロパノールに懸濁した磁性ビーズを加えた。その後、スチール球を投入せずに、ボルテックスミキサーで1分間攪拌し、磁性体粒子分離用スタンドにチューブをセットしてチューブ内の液体を除去した。その後は、上記参考例1と同様にして、洗浄および溶出を行い、DNA溶出液を回収した。
参考例、実施例および比較例で回収した溶出液のUV吸収スペクトルを、分光光度計(島津製作所製「BioSpec nano」)により測定した。結果を図3に示す。また、UV吸収スペクトルから求めた、波長230nm、260nm、280nmにおける吸光度の比(A260/A280、およびA260/A230)、ならびにDNAの回収量を表1に示す。
60,160 磁性固体
71,171 磁性体粒子
31,131 液体試料
9 磁石
150 核酸抽出用粒子操作デバイス
121〜123 ゲル状媒体
130 液体層(核酸抽出液)
132,133 液体層(洗浄液)
134 液体層(核酸溶出液)
Claims (11)
- 液体試料中の目的物質を磁性体粒子の表面に固定させるための磁性体粒子の操作方法であって、前記磁性体粒子は、前記目的物質を選択的に固定可能な粒子であり、
前記液体試料と、前記磁性体粒子と、前記磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体とを容器内に共存させた状態で、前記容器の外部からの磁場操作により、前記磁性固体とともに前記磁性体粒子が前記液体試料中で移動させられることにより、前記磁性体粒子の表面に前記目的物質が選択的に固定される、磁性体粒子の操作方法。 - 前記磁性体粒子が選択的に固定し得る前記目的物質が、核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンドおよび細胞からなる群から選択される1以上である、請求項1に記載の磁性体粒子の操作方法。
- 前記液体試料が、細胞を溶解可能な成分を含む、請求項1または2に記載の磁性体粒子の操作方法。
- 前記磁性固体は、粒径が100μm以上である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の磁性体粒子の操作方法。
- 前記磁性固体の粒径が、前記磁性体粒子の粒径の10倍以上である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の磁性体粒子の操作方法。
- 前記磁場操作によって、前記磁性固体とともに前記磁性体粒子が、前記液体試料中で往復運動させられる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の磁性体粒子の操作方法。
- 前記磁性固体は、液体内での腐食を防止するためのコーティング層を表面に有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の磁性体粒子の操作方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法により、磁性体粒子の表面に目的物質が選択的に固定された後、
前記目的物質が固定された前記磁性体粒子が、溶出液に接触させられることにより、前記目的物質が前記溶出液中に溶出される、磁性体粒子の操作方法。 - 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法に用いるための磁性体粒子操作用デバイスであって、
容器内に、液体と、目的物質を選択的に固定可能な磁性体粒子と、前記磁性体粒子よりも粒径の大きい磁性固体とが装填されている、磁性体粒子操作用デバイス。 - 前記容器内に装填された液体が、細胞を溶解可能な液体である、請求項9に記載の磁性体粒子操作用デバイス。
- 前記磁性体粒子および前記磁性固体が、前記液体中で共存している、請求項9または10に記載の磁性体粒子操作用デバイス。
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