JP4260872B1 - 高感度酵素免疫測定法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】一次抗体である固相抗体に対して測定対象の10ng/ml以下の低濃度アレルゲンを反応させ、このとき反応したアレルゲンに対して酵素で標識した二次抗体を反応させた後、前記酵素に反応する発色性または発光性の基質を加えて得られる酵素反応生成物を検出する酵素免疫測定法において、前記一次抗体に対するアレルゲンの反応条件、およびアレルゲンに対する二次抗体の反応条件を23℃以下、かつ6時間以上に調整する。
【選択図】なし
Description
このような菌類などの微生物については、1.0×104個/ml程度以上の検出ができればよいと考えられ、それより低濃度の定量測定が要求されることはないものと考えられる。
精製ダニ抗原Derf2(アサヒビール社製)をリン酸緩衝液にて既知濃度の抗原液を調製した。この既知濃度の抗原液について、サンドイッチELISA法により抗原量の測定を行なった。
実施例1〜24、比較例1〜48の各反応温度条件および反応時間条件における酵素免疫測定方法について、上記の反応停止後、マイクロプレートリーダー(Bio−Rad Laboratories Inc.製)を用いて490nmの吸光度を測定し、既知抗原濃度毎の吸光度と反応時間の関係を図1〜12に示した。
このように実施例の反応条件5〜12のような2〜20℃という低温反応条件では、反応時間は長く要するが、抗原濃度0.1〜6.25ng/mlの吸光度は、6時間を越えても安定しており、特に2〜10℃では24時間までは一次反応および二次反応共に特に安定していて、低濃度の抗原量を測定可能であることがわかる。
一方、比較例1〜24である反応条件1〜4のように温度条件が25℃以上である場合は、反応時間が3時間を越えると、高濃度の測定対象に比べて低濃度の吸光度は不安定であり、6.25ng/ml以下の抗原濃度の試料について吸光度は特に不安定になった。
精製ダニ抗原Derf2(アサヒビール社製)をリン酸緩衝液(pH7.3)にて既知濃度の抗原液を調製した。この既知濃度の抗原液をDerf2としてサンドイッチELISA法による抗原量の測定を行った。
実施例25〜29、比較例49〜51の各反応温度条件および反応時間条件における酵素免疫測定方法について、上記の反応停止後、マイクロプレートリーダー(Bio−Rad Laboratories Inc.製)を用いて490nmの吸光度を測定した。測定結果(抗原量、標準偏差、変動係数、回収率)を表3〜10に示した。
また、反応条件16〜20のように25℃未満の温度条件では0.5ng/ml未満(好ましくは0.5ng/ml未満0.1ng/ml以上)であっても変動係数は10以下であり、回収率も80%以上110%以下であることから正確に定量できていることが確認された。
Claims (5)
- 固相抗体に対してアレルゲンを反応させ、生成した抗原抗体複合体に酵素で標識した抗体を反応させ、前記酵素に反応する基質を加えて生じた酵素反応生成物を検出する酵素免疫測定法において、
前記固相抗体とアレルゲンとの反応および前記抗原抗体複合体と酵素標識抗体との反応における各反応温度を23℃以下とし、かつ各反応時間を6時間以上としたことを特徴とする高感度酵素免疫測定法。 - 測定対象のアレルゲンが、10ng/ml以下の低濃度のアレルゲンである請求項1に記載の高感度酵素免疫測定法。
- 測定対象のアレルゲンが、0.1〜5ng/mlの低濃度のアレルゲンである請求項1に記載の高感度酵素免疫測定法。
- 固相抗体とアレルゲンとの反応および前記抗原抗体複合体と酵素標識抗体との反応における各反応温度を2〜10℃とし、かつ各反応時間を12時間以上とした請求項1〜3のいずれかに記載の高感度酵素免疫測定法。
- 検出される酵素反応生成物の測定値の変動係数が10以下であり、かつ理論値より算出される酵素反応生成物の回収率が80〜110%である請求項1〜4のいずれかに記載の高感度酵素免疫測定法。
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