JPWO2013133221A1 - microRNA阻害剤 - Google Patents
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Abstract
Description
5’-CACAAACCATGCCTGCTGCTA-3’(配列番号1)
Q11およびQ12は、それぞれ独立して、単結合、CH2(メチレン基)、NH(イミノ基)、C=O(カルボニル基)、C=S(チオカルボニル基)、C=NH(イミノメチレン基)、O、またはSであり、
Q1およびQ2は、それぞれ独立して、単結合、CH2(メチレン基)、NH(イミノ基)、C=O(カルボニル基)、C=S(チオカルボニル基)、C=NH(イミノメチレン基)、O、またはSであり、
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
L1は、n個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
前記microRNAの配列に対する相補的配列は、それぞれ、−OR1−または−OR2−を介して、前記リンカー残基に結合し、
前記リンカー残基が、前記microRNAの相補的配列の間に位置している場合は、R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造(I−0)であり、
前記リンカー残基が、末端に位置する前記microRNAの相補的配列の端部に位置している場合は、R1およびR2は、それぞれ独立して、H、保護基またはリン酸保護基であり;
Aは、任意の原子団である。
R100は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、1個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。R100における前記任意の置換基としては、例えば、前記Ra、Rb、RcおよびRdにおいて例示する後述の置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。また、前記化学式(Iα2)の構造が、下記化学式(Iα3)で表されることがさらに好ましい。
R100は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、1個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。具体的には、例えば、前記化学式(Iα2)中のR100と同様である。また、前記化学式(Iβ2)の構造が、下記化学式(Iβ3)で表されることがさらに好ましい。
X1およびX2は、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHであり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
L1は、n個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
前記microRNAの配列に対する相補的配列は、それぞれ、−OR1−または−OR2−を介して、前記アミノ酸残基に結合し、
前記アミノ酸残基が、前記microRNAの相補的配列の間に位置している場合は、R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造(I)であり、
前記アミノ酸残基が、末端に位置する前記microRNAの相補的配列の端部に位置している場合は、R1およびR2は、それぞれ独立して、H、保護基またはリン酸保護基であり;
Aは、任意の原子団であり、ただし、下記化学式(Ia)は、アミノ酸またはペプチドである。
R100は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、1個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。R100における前記任意の置換基としては、例えば、前記Ra、Rb、RcおよびRdで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。また、前記化学式(Ia2)の構造は、例えば、下記化学式(Ia3)であってもよい。
Q11およびQ12は、それぞれ独立して、単結合、CH2(メチレン基)、NH(イミノ基)、C=O(カルボニル基)、C=S(チオカルボニル基)、C=NH(イミノメチレン基)、O、またはSであり、
Q1およびQ2は、それぞれ独立して、単結合、CH2(メチレン基)、NH(イミノ基)、C=O(カルボニル基)、C=S(チオカルボニル基)、C=NH(イミノメチレン基)、O、またはSであり、
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
R11およびR21は、それぞれ独立して、H、保護基またはリン酸保護基であり;
L1は、n個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR11に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR21に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
Aは、任意の原子団である。
X1およびX2は、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHであり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
R11およびR21は、それぞれ独立して、H、保護基またはリン酸保護基であり;
L1は、n個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR11に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR21に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
Aは、任意の原子団であり、ただし、下記化学式(Ia)は、アミノ酸またはペプチドである。
−P(OR6)(NR7R8) (P3)
前記化学式(P3)において、R6は、水素原子または任意の置換基である。置換基R6は、例えば、炭化水素基が好ましく、前記炭化水素基は、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。置換基R6は、例えば、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等の炭化水素等があげられ、さらに、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。置換基R6は、具体的には、例えば、β−シアノエチル基、ニトロフェニルエチル基、メチル基等があげられる。
後述の各実施例および参考例のオリゴヌクレオチド(microRNA阻害剤)において、グリシン残基(Gly)導入用分子(本発明のモノマー)は、以下のようにして合成した。
(Gly)
―HN−CH2−CO−
12−アミノドデカノール(4.81g, 23.9mmol)及びトリフルオロ酢酸エチル(6.79g, 47.8mmol)のエタノール溶液(100mL)を室温下に終夜撹拌した。その反応混合物を減圧下に濃縮することにより、無色シロップ状の12−トリフルオロアセトアミドドデカノール(1)(6.98g, q.)を得た。
化合物1(3.00g, 10.08mmol)に対し無水ピリジンを用いて3回共沸乾燥した。その共沸残渣に4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(4.32g, 12.1mmol)及び無水ピリジン(50mL)を加え、室温下に終夜撹拌した。得られた反応混合物にメタノール(10mL)を加え室温で30分撹拌した後、減圧下に室温で溶媒を約30mLになるまで留去した。その後、ジクロロメタン(200mL)を加え、飽和重曹水で3回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。このようにして得られた未精製の残渣のメタノール溶液(100mL)に、水酸化ナトリウム(2.02g, 50.40mmol)を加え室温で終夜撹拌した。その反応混合物を、減圧下に約30mLまで濃縮し、水(100mL)及びジクロロメタン(200mL)を加え、有機層を分取した。分取した有機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。その後、乾燥剤(硫酸ナトリウム)をろ別し溶媒を減圧下に留去した。生成した残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール(95:5)+0.05%ピリジン)に付し、12−(4,4’−ジメトキシトリチルオキシ)ドデカンアミン(2)(5.19g, q.)を得た。以下に、12−(4,4’−ジメトキシトリチルオキシ)ドデカンアミン(2)の機器分析値を示す。
1H−NMR(CDCl3):δ=7.45−7.43(2H,m),7.34−7.25(6H,m),7.21−7.20(1H,m),6.83−6.79(4H,m),3.78(6H,s), 3.04−3.01(2H,t,J=6.3Hz),2.70−2.67(2H,t,J=6.8Hz),1.61−1.54(6H,m),1.33−1.24(14H,m).
Fmoc−グリシン(Fmoc−Gly−OH、和光純薬工業株式会社から購入)(2.00g, 6.73mmol)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.66g, 8.07mmol)及び1−ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物(2.31g, 16.14mmol)の無水N,N−ジメチルホルムアミド溶液(70mL)に化合物2(4.07g, 8.07mmol)の無水N,N−ジメチルホルムアミド溶液(30mL)をアルゴン雰囲気下に室温で加え、アルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下に35℃で濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン(200mL)を加え、飽和重曹水で3回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール(95:5)+0.05%ピリジン)に付し、無色シロップ状のFmoc−グリシルグリシン−4,4’−ジメトキキシトリチルオキシブチルドデカンアミド(3)(5.88g, q.)を得た。
化合物3(5.88g, 6.73mmol)にN,N−ジメチルホルムアミド(10mL)及びピペリジン(4.8mL)を室温で加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下に溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール(9:1)+0.05%ピリジン)に付し、グリシン−4,4’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド(4)(3.44g, 91%)を得た。以下に、グリシン−4,4’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド(4)の機器分析値を示す。
1H−NMR(CDCl3):δ=7.47−7.44(2H,m),7.33−7.26(6H,m),7.21−7.20(1H,m),6.83−6.80(4H,m),3.79(6H,s), 3.34(2H,s),3.30−3.25(2H,t,J=6.6Hz),3.06−3.02(2H,t,J=6.3Hz),1.64−1.50(6H,m),1.38−1.25(14H,m).
化合物4(3.15g, 5.62mmol)を無水ピリジンで3回共沸乾燥後、アルゴン雰囲気下に12−ヒドロキシドデカン酸(3.41g, 6.74mmol)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(1.29g, 6.74mmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物(2.06g, 13.48mmol)、及び無水ジクロロメタン(50mL)を室温で加え、10分間撹拌した。このようにして得た混合物にトリエチルアミン(2.05g, 20.22mmol)を加え、アルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン(200mL)を加え飽和重曹水で3回、更に飽和食塩水で1回洗浄した。有機層を分取し硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール(95:5)+0.05%ピリジン)に付し、無色シロップ状のヒドロキシドデカンアミドグリシン−4,4’−ジメトキキシトリチルオキシドデカンアミド(5)(2.97g, 70%)を得た。以下に、ヒドロキシドデカンアミドグリシン−4,4’−ジメトキキシトリチルオキシドデカンアミド(5)の機器分析値を示す。
1H−NMR(CDCl3):δ=7.42−7.40(2H,m),7.33−7.26(6H,m),7.22−7.21(1H,m),6.83−6.80(4H,m),3.84(2H,s),3.79(6H,s),3.64−3.61(2H,t,J=6.3Hz),3.26−3.24(2H,t,J=6.1Hz),3.08−3.06(2H,t,J=5.6Hz),2.28−2.24(2H,t,J=6.8Hz),1.69−1.52(12H,m),1.44−1.39(26H,m).
化合物5(2.78g, 3.76mmol)を無水ピリジンで3回共沸乾燥した。つぎに、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(772mg, 4.51mmol)を加え、減圧下に脱気してアルゴンガスを充填し、無水アセトニトリル(3mL)を加えた。さらに、2−シアノエトキシ−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(1.36g, 4.51mmol)の無水アセトニトリルジクロロメタン溶液(3mL)を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で4時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン(150mL)を加え、飽和重曹水で2回、更に飽和食塩水で1回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。残渣をアミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ(展開溶媒:n−ヘキサン−アセトン(7:3)+0.05%ピリジン)に付し、ドデカン酸アミドグリシン−4,4’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト(6)(2.72g, 77%, HPLC98.5%)を得た。以下に、ドデカン酸アミドグリシン−4,4’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト(6)の機器分析値を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ=7.41−7.49(m, 2H), 7.26−7.30(m, 6H), 7.17−7.19(m, 1H), 6.80−6,83(m, 4H), 6.46−6.62(m, 2H), 4.07−4.29(m, 2H), 3.89(d, J=5.4Hz, 2H), 3.75−3.87(m, 4H), 3.67 (s, 6H), 3.47−3.70(m, 4H), 3.20−3.26(m, 2H), 3.02(t, J=6.4Hz, 2H, CH2), 2.63(t, 6.4Hz, 2H, CH3), 1.56−1.63(m, 6H), 1.47−1.51(m, 2H), 1.24−1.33(m, 26H), 1.13−1.20(m, 12H):
P−NMR(CDCl3): δ=146.62.
後述の各実施例および参考例のオリゴヌクレオチド(microRNA阻害剤)において、グリシン二量体残基(GlyGly)導入用分子(本発明のモノマー)は、以下のようにして合成した。
(Gly)
―HN−CH2−CO−
(GlyGly)
―HN−CH2−CO−HN−CH2−CO−
4−アミノブタノール(2.50g, 28.05mmol)及びトリフルオロ酢酸エチル(19.92g, 140.26mmol)のエタノール溶液(100mL)を室温下に終夜撹拌した。反応混合物を減圧下に濃縮することにより、無色シロップ状の4−トリフルオロアセトアミドブタノール(11)(5.44g, q.)を得た。
化合物1(4.15g, 22.40mmol)に対し無水ピリジンを用いて3回共沸乾燥した。その共沸残渣に4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(9.60g, 28.3mmol)及び無水ピリジン(100mL)を加え、室温下に終夜撹拌した。得られた反応混合物にメタノール(10mL)を加え室温で30分撹拌した後、減圧下に室温で溶媒を約20mLになるまで留去した。その後、ジクロロメタン(200mL)を加え、飽和重曹水で3回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。このようにして得られた未精製の残渣(9.00g)のテトラヒドロフラン溶液(50mL)に対し、水酸化ナトリウム(3.71g, 92.7mmol)の水溶液(70mL)を加えた。この混合物を室温下で激しく撹拌しながら、テトラブチルアンモニウムフロリド3水和物(180mg)を加え、更に激しく室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物に対し酢酸エチル(200mL)及び水(100mL)を加え有機層を分取した。水層は更に酢酸エチルで抽出し、抽出液は先に分取した有機層と併せて硫酸ナトリウムで乾燥した。その後、乾燥剤(硫酸ナトリウム)をろ別し溶媒を減圧下に留去した。生成した残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール(9:1)+0.05%ピリジン)に付し、4−(4,4’−ジメトキシトリチルオキシ)ブチルアミン(12)(6.36g, 87%)を得た。以下に、4−(4,4’−ジメトキシトリチルオキシ)ブチルアミン(12)の機器分析値を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ=7.42−7.45(m, 2H), 7.26−7.34(m, 12H), 7.17−7.20(m,1H), 6.80−6.84(m, 4H), 3.79(s, 6H), 3.48(s, 2H, NH2), 3.06(t, 6.8 Hz, 2H, CH2), 2.67(t, 7.4 Hz, 2H, CH2), 1.60−1.65(m, 2H, CH2), 1.49−1.55(m, 2H, CH2)
Fmoc−グリシルグリシン(Fmoc−GlyGly−OH、China Langchem社より購入)(2.50g, 7.05mmol)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.75g, 8.46mmol)及び1−ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物(2.59g, 16.92mmol)の無水N,N−ジメチルホルムアミド溶液(70mL)に化合物12(3.31g, 8.46mmol)の無水N,N−ジメチルホルムアミド溶液(50mL)をアルゴン雰囲気下に氷冷下で加えた。氷浴を除去した後、前記混合液をアルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下に35℃で濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン(200mL)を加え、飽和食塩水で2回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール(95:5)+0.05%ピリジン、次いで、ジクロロメタン−メタノール(9:1)+0.05%ピリジン)に付し、無色シロップ状のFmoc−グリシルグリシン−4,4’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド(13)(3.49g, 68%)を得た。
化合物13(3.00g, 4.12mmol)にアセトニトリル(5mL)及びピペリジン(2.4mL)を室温で加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下に溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール(9:1)+0.05%ピリジン)に付し、グリシルグリシン−4,4’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド(14)(1.13g, 54%)を得た。以下に、グリシルグリシン−4,4’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド(14)の機器分析値を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ=7.40−7.42(m, 2H), 7.25−7.31(m, 12H), 7.19−7.21(m,1H), 6.80−6.84(m, 4H), 3.89(d, J=5.9Hz, 2H), 3.79(s, 6H), 3.37(s, 2H), 3.25(t, J=5.8Hz, 2H, CH2), 2.67(t, J=5.8Hz, 2H, CH2), 1.57−1.65(m, 4H, CH2).
化合物14(1.07g, 2.11mmol)を無水アセトニトリルで3回共沸乾燥後、アルゴン雰囲気下に6−ヒドロキシヘキサン酸(336mg, 2.54mmol)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(487mg, 2.54mmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物(778mg, 5.08mmol)、及び無水ジクロロメタン(20mL)を室温で加え、10分間撹拌した。このようにして得た混合物にトリエチルアミン(778mg, 5.08mmol)を加え、アルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン(150mL)を加え飽和重曹水で3回、更に飽和食塩水で1回洗浄した。有機層を分取し硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール(95:5)+0.05%ピリジン)に付し、無色シロップ状のヒドロキシへキサン酸アミドグリシルグリシン−4,4’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド(15)(890mg,68%)を得た。以下に、ヒドロキシへキサン酸アミドグリシルグリシン−4,4’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド(15)の機器分析値を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ=7.41−7.42(m, 2H), 7.27−7.34(m, 12H), 7.18−7.21(m,1H), 6.81−6.83(m, 4H), 3.92(d, J=5.43Hz, 2H, CH2), 3.84(d, J=5.9Hz, 2H), 3.79(s, 6H), 3.60(m, 2H, CH2), 3.23−3.28(m, 2H, CH2), 3.05−3.10(m, 2H, CH2), 2.56(t, J=7.3Hz, 2H, CH2), 1.50−1.72(m, 8H), 1.30−1.45(m, 2H, CH2).
化合物15(824mg, 1.33mmol)を無水ピリジンで3回共沸乾燥した。つぎに、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(274mg, 1.60mmol)を加え、減圧下に脱気してアルゴンガスを充填し、無水アセトニトリル(1mL)を加えた。さらに、2−シアノエトキシ−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(482mg, 1.60mmol)の無水アセトニトリル溶液(1mL)を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で4時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン(100mL)を加え、飽和重曹水で2回、更に飽和食塩水で1回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。残渣をアミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ(展開溶媒:ジクロロメタン−アセトン(7:3)+0.05%ピリジン)に付し、へキサン酸アミドグリシルグリシン−4,4’−ジメトキシトリチルオキシブチルアミドホスホロアミダイト(16)(938mg, 86%, HPLC 98.2%)を得た。以下に、へキサン酸アミドグリシルグリシン−4,4’−ジメトキシトリチルオキシブチルアミドホスホロアミダイト(16)の機器分析値を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ=7.36−7.47(m, 3H), 7.24−7.30(m, 5H), 7.18−7.19(m,1H), 6.80−6.82(m, 4H), 3.92(d, J=4.9 Hz, 2H, CH2), 3.84(d, J=5.4 Hz, 2H), 3.76(s, 6H), 3.73−3.85 (m, 4H), 3.54−3.64(m, 4H), 3.18−3.25 (m, 2H, CH2), 3.05−3.10(m, 2H, CH2), 2.60(t, J=6.3 Hz, 2H, CH2), 2.23(t, 7.4 Hz, 2H, CH2), 1.55−1.68(m, 8H), 1.30−1.45(m, 2H, CH2). 1.15−1.18(m, 12H):
P−NMR(CDCl3): δ=146.57.
HPLC:Retention time 6.25min(Shimadzu SPD−10AV(XBridge OST C18, 4.6mm×50mm))
後述の各実施例および参考例のオリゴヌクレオチド(microRNA阻害剤)において、テレフタル酸アミド残基(TPA)導入用分子であるテレフタル酸アミダイト(本発明のモノマー)は、下記スキーム7にしたがって合成した。なお、TPAは、「テレフタル酸アミド残基」と記したが、テレフタル酸残基であるということもできる。
4−アミノブタノール(2.50g, 28.05mmol)及びトリフルオロ酢酸エチル(19.92g, 140.22mmol)のエタノール溶液(100mL)を室温下で終夜撹拌した。その反応混合物を減圧下で濃縮することにより、化合物17(5.20g, q.)を得た。
化合物17(5.20g, 28.05mmol)及び4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(11.40g,33.66mmol)の無水ピリジン溶液(20mL)を室温下で終夜撹拌した。ジクロロメタン(200mL)を加え、飽和重曹水で3回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。このようにして得られた未精製の残渣のメタノール溶液(100mL)に、水酸化ナトリウム(5.61g, 140.23mmol)を加え室温下で終夜撹拌した。その反応混合物を減圧下で濃縮し、水(200mL)を加えた。ジクロロメタン(200mL)で2回抽出した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。生成した残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール(9:1)+0.05%ピリジン)に付し、化合物18(8.20g, 75%)を得た。以下に、化合物18の機器分析値を示す。
1H−NMR(CDCl3):δ=7.44−7.42(2H, m), 7.34−7.25(6H, m), 7.20(1H, d, J=7.3Hz), 6.82(4H, m), 3.78(6H, s), 3.06(2H, t, J=6.3Hz), 2.68(2H, t, J=7.1 Hz), 1.59(4H, m).
テレフタル酸モノメチル(3.00g, 16.65mmol)、4−アミノブタノール(0.89g, 9.98mmol)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(2.06g, 9.98mmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物(3.06g, 19.96mmol)、トリエチルアミン(5.05g, 49.9mmol)の無水テトラヒドロフラン溶液(70mL)を還流しながら5時間撹拌した。室温まで冷却後、生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣に酢酸エチル(50mL)を加え、沈殿をろ別し、目的物である化合物19を1.52g得た。ろ液は減圧下で濃縮し、トルエンで洗浄した。沈殿をろ別し、目的物である化合物19を0.83g得た。ろ液にジクロロメタン(200mL)を加え、飽和重曹水で2回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。そして目的物である化合物19を0.37g得た。得られた目的物(化合物19)を合計すると、収量2.72g,収率65%であった。以下に、化合物19の機器分析値を示す。
1H−NMR(CDCl3):δ=8.10−8.07(2H, m), 7.83(2H, m), 3.94(3H, s), 3.74(2H, t, J=5.9Hz), 3.50(2H, m), 1.92(2H, dd, J=12.7, 3.4Hz), 1.80−1.65(2H, m).
化合物19(2.33g, 9.27mmol)及び水酸化ナトリウム(1.85g,46.36mmol)のメタノール溶液(70mL)を室温下で終夜撹拌した。その反応混合物を減圧下で濃縮し、水を加えた。さらに、2規定(2mol/L)塩酸により、pHを2に調製した。生成した沈殿をろ別し、沈殿物を減圧下で乾燥させ、目的物である化合物20(1.95g, 89%)を得た。以下に、化合物20の機器分析値を示す。
1H−NMR(DMSO−d6):δ=8.00(2H, d, J=8.3Hz), 7.92(2H, d, J=8.3Hz),1.72(2H, d, J=12.7Hz), 1.63−1.45(4H, m), 1.15(2H, m).
化合物18(3.09g, 7.88mmol)、化合物20(1.70g, 7.16mmol)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.63g, 7.88mmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物(2.41g, 15.76mmol)、およびトリエチルアミン(3.62g, 35.80mmol)の無水N,N−ジメチルホルムアミド溶液(170mL)を、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン(300mL)を加え、飽和重曹水で3回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。残渣をトルエンでトリチレーションして、生じた沈殿をろ別し、沈殿物を減圧下で乾燥させた。このようにして、目的物である化合物21(3.94g, 90%)を得た。以下に、化合物21の機器分析値を示す。
1H−NMR(CDCl3):δ=7.76−7.67(4H, m), 7.40(2H, d, J=7.3Hz), 7.27(6H, m), 7.19(1H, m), 6.80(4H, d, J=8.8Hz), 3.78(6H, s), 3.73(2H, t, J=5.9Hz), 3.48(4H, m), 3.12(2H, t, J=5.6Hz), 1.72(8H, m).
化合物21(1.50g, 2.46mmol)を無水ピリジンで3回共沸乾燥した。つぎに、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(630mg, 3.68mmol)を加え、減圧下で脱気してアルゴンガスを充填し、無水ジクロロメタン(1mL)を加えた。さらに、2−シアノエトキシ−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(1.11g, 3.68mmol)の無水ジクロロメタン溶液(1mL)を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で4時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン(200mL)を加え、飽和重曹水で3回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、アミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ(展開溶媒:n−ヘキサン−アセトン(7:3)+0.05%ピリジン)に付し、化合物22(1.86g,93%)を得た。以下に、化合物22の機器分析値を示す。
1H−NMR(CDCl3):δ=7.74(4H, m), 7.41(2H, m), 7.31−7.24(6H, m), 7.20(1H, m), 6.80(4H, m), 3.85−3.56(10H, m), 3.45(4H, m), 3.12(2H, t, J=5.9Hz), 2.60(2H, dd, J=11.0, 4.6Hz), 2.16(2H, t, J=3.4Hz), 1.72(8H, t, J=5.9Hz), 1.17(12H, m).
31P−NMR(CDCl3): δ=147.10.
阻害対象のmicroRNAをhsa-miR-16-5pおよびhsa-miR-122の二つとして、前述の化学合成方法により、下記のようにして、microRNA阻害剤を製造した。まず、前記相補的配列は、前記二つのmicroRNAの全配列または一部と相補的にした。また、前記相補的配列の数を3つにし、これらをグリシン残基(Gly)で連結し、両端に位置する前記相補的配列の各端部にもグリシン残基(Gly)を連結した。そして、Huh-7細胞に前記二種類のmicroRNA阻害剤を導入し、導入後24時間後に回収したmicroRNAの発現量をqPCRで確認した。その結果を図4に示す。同図に示すように、本例の二つのmicroRNA阻害剤(Sponge Oligo)は、導入しなかった場合(Normal)に比べ、優位にmicroRNAを阻害したことが分かる。
1−a:オリゴヌクレオチド
下記塩基配列および後述の表1に示すとおり、microRNAであるhsa-miR-16-5pの配列に対する相補的配列をGly(前記G1)またはGlyGly(前記G2)で連結したmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果(microRNA阻害活性)を測定した。なお、以下において、hsa-miR-16-5pを、単に「miR-16」という。また、本実施例および後述の各実施例(参考例も含む)において、microRNAは、特に断らない限り、miR-16である。
(実施例2−1)
spo-D-3(Gly含有Bubble型スポンジオリゴ)
5'-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3' (配列番号2)
(参考例2−1)
spo-D-7(Gly含有Bubble型モノマーデコイ)
5'-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3' (配列番号3)
(実施例2−2)
spo-D-13(GlyGly含有Perfect型スポンジオリゴ)
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3' (配列番号4)
(参考例2−2)
spo-D-14(GlyGly含有Perfect型モノマーデコイ)
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3' (配列番号5)
(実施例2−3)
spo-D-16(GlyGly含有Bubble型スポンジオリゴ)
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3' (配列番号6)
(参考例2−3)
spo-D-17(GlyGly含有Bubble型モノマーデコイ)
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3' (配列番号7)
(参考例2−4)
spo-D-9(Gly含有Bubble型スポンジオリゴネガティブコントロール)
5'-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-T-3' (配列番号8)
(参考例2−5)
spo-D-18(GlyGly含有Perfect型スポンジオリゴネガティブコントロール)
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-T-3' (配列番号9)
(参考例2−6)
spo-D-20(GlyGly含有Bubble型スポンジオリゴネガティブコントロール)
5'-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-T-3' (配列番号10)
(参考例2−7)
hsa-miR-16 miRCURY LNA microRNA Power Inhibitor (426845-00) (LNA-miR16)
GCCAATATTTACGTGCTGCT (配列番号11)
(参考例2−8)
miRCURY LNATM microRNA Power Antisense Control B (199021-00) (LNA-Neg.Con)
AGAGCTCCCTTCAATCCAAA (配列番号12)
細胞株は、ヒト大腸がん細胞株であるHCT116(ATCC社)を用いた。培地は、10%FBSを含むDMEM培地(Nacalai社)を用いて、37℃、10%CO2存在下で培養した。
レポータープラスミドは、以下のレポーター遺伝子を持つプラスミドを使用した。
(1)pGL4-miR16
Promega社のpGL4.74[hRluc/TK] vectorは、図5に示すように、HSV-TKプロモーターの支配下にウミシイタケルシフェラーゼ(Renilla Luciferase)遺伝子を発現するプラスミドである。pGL4-miR16は、このvectorのルシフェラーゼ遺伝子の下流にmiR-16の標的配列を組み込んだものであり、miR-16の活性によって、ルシフェラーゼの発現量が抑制される構造になっている。
(2)pGL4-NTC
pGL4-NTCは、前記pGL4.74[hRluc/TK] vectorのルシフェラーゼ遺伝子の下流に、miR-16と反応しない非特異的配列を組み込んだものであり、pGL4-miR16に対するコントロールとして使用した。
(3)pMIR-REPORT Luciferase
Ambion社のpMIR-REPORT Luciferaseは、図6に示すようにCMVプロモーターの支配下にホタルルシフェラーゼ(FireflyLuciferase)遺伝子を発現するプラスミドである。前記pGL4-miR16または前記GL4-NTCとコトランスフェクションすることによって、トランスフェクション効率をモニターするために使用した。
2−a:レポーター遺伝子のHCT116細胞へのトランスフェクション
前記HCT116細胞を、1×105/cm2の密度で6cmディッシュに播種し、抗生物質を含まないDMEM培地(10%FBS)を用いて培養した。また、OptiMEM (Gibco社) 500μlにpGL4-NTC(2μg)及びpMIR-REPORT(2μg)を加えたもの、またはpGL4-miR16(2μg)及びpMIR-REPORT(2μg)を加えたものを調製した(溶液A)。また、別のチューブにOptiMEM 500μLにLipofectamine 2000 (Invitrogen)を20μL加えたものを調製した(溶液B)。両液をよく撹拌し、室温で5分間静置した後、溶液A及び溶液Bを混ぜ、さらに室温で20分間静置した。この間に、前記播種した細胞の培地を新しい培地に交換した。20分後、前記溶液A及び溶液Bの混合液を、前記細胞を含む培養液に加え、引き続き37℃、10%CO2存在下で8時間培養を続けた。その後、前記細胞の培地を新しい培地に交換した。
前記レポーター遺伝子をトランスフェクションしたHCT116細胞を回収し、5×104ウエルになるように、24ウェルデイッシュに播種した。次に、前記pGL4-NTC及びpMIR-REPORTをトランスフェクションした細胞または前記pGL4-miR16及びpMIR-REPORTをトランスフェクションした細胞それぞれに対して、スポンジオリゴ、モノマーデコイ、またはLNAのトランスフェクションを行った。まず、OptiMEM 50μLに10μMの前記スポンジオリゴ溶液、前記LNA溶液を1.25μL、または10μMの前記モノマーデコイ溶液を3.75μL加え、溶液Cを作成した。また、OptiMEM 50μLにLipofectamine RNAiMAX (Invitrogen社)を2μL加え、溶液Dを調製した。溶液C及び溶液Dをそれぞれ、室温で5分間静置した後、溶液C及び溶液Dを混ぜ、さらに室温で20分間静置した。この間に、前記播種した細胞の培地を新しい培地に交換した。20分後、溶液C、溶液Dの混合液を、前記レポーター遺伝子をトランスフェクションしたHCT116細胞を含む培養液に加え、引き続き37℃、10%CO2存在下で24時間培養を続けた。その後、前記細胞の培地を新しい培地に交換した。このトランスフェクションにより、スポンジオリゴまたはLNAの終濃度は、25nM、モノマーデコイの終濃度は、75nMとなっている。
前記スポンジオリゴ、モノマーデコイ、またはLNAを、トランスフェクションしてから48時間後、それぞれの細胞内のルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase(登録商標) Reporter Assay System(Promega社)を使用して、添付のプロトコールに従って測定した。測定機器は、Berthold Centro 960(Berthold社)を用いた。
上述のように、pMIR-REPORT由来のホタルルシフェラーゼはトランスフェクション効率を反映し、pGL4-NTCおよびpGL4-miR16由来のウミシイタケルシフェラーゼはmiR-16の活性を反映する。従って、ウミシイタケルシフェラーゼの活性値(ApGL4-NTCまたはApGL4-miR16)をホタルルシフェラーゼの活性値(ApMIR-REPORT(NTC)またはApMIR-REPORT(miR-16))で割ると、標準化されたウミシイタケルシフェラーゼ活性値を得る。pGL4-NTC由来の標準化されたウミシイタケルシフェラーゼ活性値を1とした時のpGL4-miR16由来のウミシイタケルシフェラーゼ活性値がmiR-16によって抑制された値となる。従って、それぞれのスポンジオリゴ、モノマーデコイ、またはLNAに対して、以下の計算式でmiR-16活性抑制効果の値を得た。
得られた結果を図7〜9に示す。なお、図7〜9における縦軸は、miR-16活性抑制効果(活性阻害効果または活性抑制能ともいう)を表す。後述の図10〜21においても同じである。図7はGly含有Bubble型スポンジオリゴ(実施例2−1)、図8はGlyGly含有Perfect型スポンジオリゴ(実施例2−2)、図9はGlyGly含有Bubble型スポンジオリゴ(実施例2−3)を用いた結果である。図示のとおり、いずれの場合も、スポンジオリゴはLNAに匹敵するmiR-16活性抑制能を持つことが示された。さらに、本実施例のスポンジオリゴは、その構造上、LNAと比較して、きわめて簡便性に優れ、かつ汎用性が高いという利点を有する。また、本実施例では、スポンジオリゴとモノマーデコイのmiR-16結合配列の配列数を同数とするために、スポンジオリゴの3倍の濃度のモノマーデコイを用いたが、スポンジオリゴの方がモノマーデコイよりも高いmiR-16活性抑制能を持つことが示された。このことは、スポンジオリゴ上で、miRNAの結合が協調的に起こっていることを示している。
1-a:オリゴヌクレオチド
下記配列および後述の表2に示すとおり、miR-16対する相補的配列をGlyGly(前記G2)で連結したmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果(microRNA阻害活性)を測定した。
(実施例3−1)
spo-D-16(GlyGly含有Bubble型DNAスポンジオリゴ)
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3' (配列番号6)
(実施例3−2)
spo-R-16(GlyGly含有Bubble型RNAスポンジオリゴ)
5'-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-U-3' (配列番号13)
またそれぞれに対する以下のネガティブコントロールオリゴを使用した。
(参考例3−1)
spo-D-20(GlyGly含有Bubble型DNAスポンジオリゴネガティブコントロール)
5'-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-T-3' (配列番号10)
(参考例3−2)
spo-R-20(GlyGly含有Bubble型RNAスポンジオリゴネガティブコントロール)
5'-GlyGly-CGCCAAUAUUCCAUUAUAAGA-GlyGly-CGCCAAUAUUCCAUUAUAAGA-GlyGly-CGCCAAUAUUCCAUUAUAAGA-GlyGly-U-3' (配列番号14)
(参考例3−3)
LNA-miR16 GCCAATATTTACGTGCTGCT (配列番号11)
(参考例3−4)
LNA-Neg.Con AGAGCTCCCTTCAATCCAAA (配列番号12)
細胞株および培地は、実施例2と同じ細胞株及び培地を利用した。
レポータープラスミドは、実施例2と同じレポーター遺伝子を持つプラスミドを使用した。
2−a:レポーター遺伝子のHCT116細胞へのトランスフェクション
HCT116細胞を用いて、実施例2と同様の方法で、レポーター遺伝子プラスミドpGL4-NTC(2μg)およびpMIR-REPORT(2μg)を、またはpGL4-miR16(2μg)およびpMIR-REPORT(2μg)を、それぞれHCT116細胞へトランスフェクションした。
前記レポーター遺伝子をトランスフェクションした細胞に対して、(実施例A2)と同様の方法で、スポンジオリゴまたはLNAのトランスフェクションを行った。このトランスフェクションにより、スポンジオリゴ及びLNAは終濃度が25nMになっている。
前記スポンジオリゴまたはLNAをトランスフェクションしてから48時間後、それぞれの細胞内のルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase(登録商標) Reporter Assay System (Promega社)を使用して、添付のプロトコールに従って測定した。測定機器は、Berthold Centro 960 (Berthold社)を用いた。
実施例2と同様の方法によりmiR-16活性抑制効果の値を得た。
得られた結果を図10に示す。図示のとおり、実施例のDNA型スポンジオリゴおよびRNA型スポンジオリゴのいずれも、ネガティブコントロールと比較してきわめて高いmiR-16活性抑制能を有していた。さらに、本実施例のDNA型スポンジオリゴおよびRNA型スポンジオリゴのいずれも、その構造上、LNAと比較して、きわめて簡便性に優れ、かつ汎用性が高いという利点を有する。さらに、それに加え、本実施例のDNA型スポンジオリゴは、miR-16活性抑制能がRNA型スポンジオリゴよりも高く、LNAに匹敵する高いmiR-16活性抑制能を持つことが示された。
1−a:オリゴヌクレオチド
下記塩基配列および後述の表3に示すとおり、miR-16の配列に対する相補的配列をGly(前記G1)、GlyGly(前記G2)またはTPAで連結したmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果(microRNA阻害活性)を測定した。
(実施例4−1)
spo-D-3(Gly含有Bubble型スポンジオリゴ)
5'-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3' (配列番号2)
(実施例4−2)
spo-D-16(GlyGly含有Bubble型スポンジオリゴ)
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3' (配列番号6)
(実施例4−3)
spo-D-13(GlyGly含有Perfect型スポンジオリゴ)
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3' (配列番号4)
(実施例4−4)
spo-D-15(TPA含有Perfect型スポンジオリゴ)
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-T-3' (配列番号15)
(実施例4−5)
spo-D-21(TPA含有Bubble型スポンジオリゴ)
5'-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-T-3' (配列番号16)
(実施例4−6)
spo-D-22(TPA含有Bulge型スポンジオリゴ)
5'-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-T-3' (配列番号17)
(実施例4−7)
spo-D-23(GlyGly含有Bulge型スポンジオリゴ)
5'-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-T-3' (配列番号18)
(参考例4−1)
spo-D-9(Gly含有Bubble型スポンジオリゴネガティブコントロール)
5'-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-T-3' (配列番号8)
(参考例4−2)
spo-D-20(GlyGly含有Bubble型スポンジオリゴネガティブコントロール)
5'-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-T-3' (配列番号10)
(参考例4−3)
spo-D-18(GlyGly含有Perfect型スポンジオリゴネガティブコントロール)
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-T-3' (配列番号9)
(参考例4−4)
spo-D-19(TPA含有Perfect型スポンジオリゴネガティブコントロール)
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-T-3' (配列番号19)
(参考例4−5)
LNA-miR16 GCCAATATTTACGTGCTGCT (配列番号11)
(参考例4−6)
LNA-Neg.Con AGAGCTCCCTTCAATCCAAA (配列番号12)
細胞株は、ヒト大腸がん細胞株であるHCT116(ATCC社)またはヒト胎児腎臓細胞株であるHEK293T(ATCC社)を用いた。培地は、10%FBSを含むDMEM培地(Nacalai社)を用いて、37℃、10%CO2存在下で培養した。
レポータープラスミドは、実施例2と同じレポーター遺伝子を持つプラスミドを使用した。
2−a:レポーター遺伝子のHCT116細胞またはHEK293T細胞へのトランスフェクション
HCT116細胞または293T細胞を用いて、実施例2と同様の方法で、レポーター遺伝子プラスミドpGL4-NTC(2μg)及びpMIR-REPORT(2μg)またはpGL4-miR16(2μg)及びpMIR-REPORT(2μg)をそれぞれトランスフェクションした。
前記レポーター遺伝子をトランスフェクションした細胞に対して、(実施例A2)と同様の方法で、スポンジオリゴまたはLNAのトランスフェクションを行った。このトランスフェクションにより、スポンジオリゴまたはLNAの終濃度は、25nMになっている。
前記スポンジオリゴまたはLNAを前記HCT116細胞またはHEK293T細胞にトランスフェクションしてから48時間後、それぞれの細胞内のルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase(登録商標) Reporter Assay System (Promega社)を使用して、添付のプロトコールに従って測定した。測定機器は、Berthold Centro 960 (Berthold社)を用いた。
実施例2と同様の方法でmiR-16活性抑制効果の値を得た。
得られた結果を図11から図17に示す。図11は、HCT116細胞を用いてGly型スポンジオリゴとGlyGly型スポンジオリゴを比較したものである。その結果、GlyGly型スポンジオリゴはGly型よりも少し強い抑制効果を持つことがわかった。図12から図17は、GlyGly型スポンジオリゴとTPA型スポンジオリゴを比較したものである。図12から図14はHCT116細胞を用いたもので、図15から図17はHEK293T細胞を用いた結果である。Perfect型のスポンジオリゴを用いると、HCT116細胞ではTPA型の方が、活性が高く(図12)、HEK293T細胞では両者の活性はほぼ同じであった(図15)。Bubble型スポンジオリゴを用いた場合は、HCT116細胞でもHEK293T細胞でもGlyGly型の方が活性が高かった(図13および16)。Bulge型スポンジオリゴを用いた場合は、HCT116細胞ではTPA型の方が、活性が高く(図14)、HEK293T細胞ではGlyGly型の方が活性が高かった(図17)。以上の結果から、本実施例のスポンジオリゴにおいて、TPA型およびGlyGly型は、Gly型よりも、in vitroにおけるmiR-16活性に対する少し強い抑制効果を有することが確認された。また、TPA型およびGlyGly型のmiR-16活性抑制効果には、ほとんど差はなかった。
1−a:オリゴヌクレオチド
下記塩基配列および後述の表4に示すとおり、miR-16の配列に対する相補的配列をTPAで連結したmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果(microRNA阻害活性)を測定した。
(実施例5−1)
spo-D-15(TPA含有Perfect型スポンジオリゴ)
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-T-3' (配列番号15)
(実施例5−2)
spo-D-21(TPA含有Bubble型スポンジオリゴ)
5'-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-T-3' (配列番号16)
(実施例5−3)
spo-D-22(TPA含有Bulge型スポンジオリゴ)
5'-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-T-3' (配列番号17)
(参考例5−1)
spo-D-19(TPA含有Perfect型スポンジオリゴネガティブコントロール)
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-T-3' (配列番号19)
(参考例5−2)
LNA-miR16 GCCAATATTTACGTGCTGCT (配列番号11)
(参考例5−3)
LNA-Neg.Con AGAGCTCCCTTCAATCCAAA (配列番号12)
活性測定には、実施例4と同じ細胞株を利用した。
レポータープラスミドは、実施例2と同じレポーター遺伝子を持つプラスミドを使用した。
2−a:レポーター遺伝子のHCT116細胞またはHEK293T細胞へのトランスフェクション
HCT116細胞または293T細胞を用いて、(実施例A2)と同様の方法で、レポーター遺伝子プラスミドpGL4-NTC(2μg)およびpMIR-REPORT(2μg)またはpGL4-miR16(2μg)およびpMIR-REPORT(2μg)をそれぞれHCT116細胞またはHEK293T細胞へトランスフェクションした。
前記レポーター遺伝子をトランスフェクションした細胞に対して、(実施例A2)と同様の方法で、スポンジオリゴまたはLNAのトランスフェクションを行った。このトランスフェクションにより、スポンジオリゴまたはLNAの終濃度は、25nMになっている。
スポンジオリゴまたはLNAをトランスフェクションしてから48時間後、それぞれの細胞内のルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase(登録商標) Reporter Assay System(Promega社)を使用して、添付のプロトコールに従って測定した。測定機器は、Berthold Centro 960(Berthold社)を用いた。
実施例2と同様の方法でmiR-16活性抑制効果の値を得た。
得られた結果を図18および19に示す。図18は、HCT116細胞を用いてmiR-16結合配列がPerfect型、Bubble型、またはBulge型の場合のスポンジオリゴ活性を比較したものである。その結果、これら3者にほとんど差はないが、その中でもPerfect型およびBulge型が、in vitroにおけるmiR-16活性に対する比較的強い抑制効果を示した。図19は、HEK293T細胞を用いてmiR-16結合配列がPerfect型、Bubble型またはBulge型の場合のスポンジオリゴ活性を比較したものである。その結果、これら3者の中では、Bulge型がin vitroにおけるmiR-16活性に対する最も強い抑制効果を示した。
2 相補的配列
3 リンカー残基
Claims (42)
- microRNA阻害剤であって、阻害の対象となるmicroRNAの配列に対する相補的配列を二つ以上有し、前記二つ以上の相補的配列が、リンカー残基を介して連結していることを特徴とするmicroRNA阻害剤。
- 両末端に位置する前記相補的配列の端部にリンカー残基が結合していることを特徴とする請求項1記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記リンカー残基が、アミノ酸残基、ポリアミン残基、およびポリカルボン酸残基からなる群から選択される少なくとも一つを含む請求項1または2記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記リンカー残基が、ポリカルボン酸残基である請求項1から3のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記ポリカルボン酸残基が、テレフタル酸残基である請求項3または4記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記リンカー残基が、アミノ酸残基である請求項1から3のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記アミノ酸残基が、グリシン残基、テレフタル酸アミド残基またはプロリン残基である請求項3または6記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記二つ以上の相補的配列の間に位置しているアミノ酸残基が、複数のアミノ酸残基が連結したものであることを特徴とする請求項3、6および7のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記相補的配列の端部に結合したアミノ酸残基が、複数のアミノ酸残基が連結したものであることを特徴とする請求項3および6から8のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記二つ以上の相補的配列の間に位置しているアミノ酸残基、および、前記相補的配列の端部に結合したアミノ酸残基の少なくとも一方が、グリシン二量体または三量体の残基である請求項8または9記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記リンカー残基が、下記化学式(I−0)で表される請求項1から10のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
Q11およびQ12は、それぞれ独立して、単結合、CH2(メチレン基)、NH(イミノ基)、C=O(カルボニル基)、C=S(チオカルボニル基)、C=NH(イミノメチレン基)、O、またはSであり、
Q1およびQ2は、それぞれ独立して、単結合、CH2(メチレン基)、NH(イミノ基)、C=O(カルボニル基)、C=S(チオカルボニル基)、C=NH(イミノメチレン基)、O、またはSであり、
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
L1は、n個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
前記microRNAの配列に対する相補的配列は、それぞれ、−OR1−または−OR2−を介して、前記リンカー残基に結合し、
前記リンカー残基が、前記microRNAの相補的配列の間に位置している場合は、R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造(I−0)であり、
前記リンカー残基が、末端に位置する前記microRNAの相補的配列の端部に位置している場合は、R1およびR2は、それぞれ独立して、H、保護基またはリン酸保護基であり;
Aは、任意の原子団である。 - 前記化学式(I−0)中、Q11およびQ12が、それぞれカルボニル基である請求項11記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記化学式(I−0)中、Q1およびQ2が、それぞれイミノ基である請求項12記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記化学式(I−0)中、Q11およびQ12が、それぞれイミノ基である請求項11記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記化学式(I−0)中、Q1およびQ2が、それぞれカルボニル基である請求項16記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記リンカー残基が、アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基が、下記化学式(I)で表される請求項1から3および6から10のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
X1およびX2は、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHであり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
L1は、n個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
前記microRNAの配列に対する相補的配列は、それぞれ、−OR1−または−OR2−を介して、前記アミノ酸残基に結合し、
前記アミノ酸残基が、前記microRNAの相補的配列の間に位置している場合は、R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造(I)であり、
前記アミノ酸残基が、末端に位置する前記microRNAの相補的配列の端部に位置している場合は、R1およびR2は、それぞれ独立して、H、保護基またはリン酸保護基であり;
Aは、任意の原子団であり、ただし、下記化学式(Ia)は、アミノ酸またはペプチドである。
- 前記アミノ酸残基における前記アミノ酸が、天然アミノ酸および人工アミノ酸の少なくとも一方である請求項1から3、6から10および20のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記天然アミノ酸が、タンパク質を構成するアミノ酸である請求項21記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記アミノ酸残基における前記アミノ酸が、グリシン、α−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシリシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、プロリン、4−ヒドロキシプロリン、トリプトファン、β−アラニン、1−アミノ−2−カルボキシシクロペンタン、アミノ安息香酸、アミノピリジンカルボン酸および下記化学式(Ia2)で表されるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも1種類であり、前記アミノ酸は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い、請求項1から3、6から10、20および21のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
R100は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、1個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。 - 前記化学式(I−1)において、n=11およびm=12である、請求項25記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記化学式(I−4)において、n=5およびm=4である、請求項25記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記化学式(I−6)において、n=4およびm=4である、請求項25記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記相補的配列が、RNAまたはDNAである請求項1から28のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
- 下記配列番号2、4、6、13および15〜18のいずれかで表される請求項1から29のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
5'-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3' (配列番号2)
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3' (配列番号4)
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3' (配列番号6)
5'-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-U-3' (配列番号13)
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-T-3' (配列番号15)
5'-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-T-3' (配列番号16)
5'-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-T-3' (配列番号17)
5'-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-T-3' (配列番号18)
前記配列番号2で表される配列中のGlyは、下記化学式(G1)で表される原子団であり、ただし、5’末端に結合する塩基がない場合は、5’末端には水素原子(H)が結合しており、
(Gly)
―HN−CH2−CO−
前記配列番号4、6、13または18で表される配列中のGlyGlyは、下記化学式(G2)で表される原子団であり、ただし、5’末端に結合する塩基がない場合は、5’末端には水素原子(H)が結合しており、
(GlyGly)
―HN−CH2−CO−HN−CH2−CO−
前記配列番号15、16または17で表される配列中のTPAは、下記化学式(TPA)で表される原子団であり、ただし、5’末端に結合する塩基がない場合は、5’末端には水素原子(H)が結合している。
- 核酸分子合成用のモノマーであって、
下記化学式(II)の構造を有することを特徴とするモノマー。
X1およびX2は、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHであり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
R11およびR21は、それぞれ独立して、H、保護基またはリン酸保護基であり;
L1は、n個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR11に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR21に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
Aは、下記化学式(A1)または(A2)で表される原子団であり;
R100は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、1個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。 - 前記化学式(II−4)において、n=5およびm=4である、請求項33記載のモノマー。
- 前記化学式(II−6)において、n=4およびm=4である、請求項33記載のモノマー。
- 前記化学式(II)において、L1は、前記ポリエーテル鎖であり、前記ポリエーテル鎖が、ポリエチレングリコールである、請求項31から35のいずれか一項に記載のモノマー。
- 前記化学式(II)において、L1の原子個数(n)とL2の原子個数(m)との合計(m+n)が、0〜30の範囲である、請求項31から36のいずれか一項に記載のモノマー。
- 標識物質を含む、請求項31から37のいずれか一項に記載のモノマー。
- 安定同位体を含む、請求項31から38のいずれか一項に記載のモノマー。
- 自動核酸合成用である、請求項31から39のいずれか一項に記載のモノマー。
- 核酸分子の製造方法であって、
請求項31から40のいずれか一項に記載のモノマーを使用することを特徴とする製造方法。 - 前記核酸分子が、請求項1から30のいずれか一項に記載の記載のmicroRNA阻害剤である請求項41記載の製造方法。
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