JPWO2013118842A1 - ベンゾチオフェン化合物、該化合物を有効成分とするオルタナティブオートファジー誘導剤及び抗癌剤、並びに抗癌活性を有する化合物をスクリーニングするための方法 - Google Patents

ベンゾチオフェン化合物、該化合物を有効成分とするオルタナティブオートファジー誘導剤及び抗癌剤、並びに抗癌活性を有する化合物をスクリーニングするための方法 Download PDF

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Abstract

蛍光タンパク質が付加しているリソソームタンパク質を発現している細胞において、前記リソソームタンパク質の凝集による蛍光輝点の発生を指標として、オルタナティブオートファジーを誘導する活性を有する化合物を選択することにより、効率的に抗癌活性を有する化合物をスクリーニングすることが可能であることを見出した。そして、下記一般式（１）：【化１】で表されるベンゾチオフェン化合物がオルタナティブオートファジー誘導活性及び抗癌活性を有していることを見出した。

Description

本発明は、ベンゾチオフェン化合物、並びに該化合物を有効成分とするオルタナティブオートファジー誘導剤及び抗癌剤に関する。また、本発明は、ベンゾチオフェン化合物を用いるオルタナティブオートファジーを誘導するための方法及び癌を治療するための方法に関する。さらに、本発明は、抗癌活性を有する化合物をスクリーニングするための方法に関する。
オートファジー（マクロオートファジー）は、オルガネラ等の細胞内成分を分解する細胞内浄化機構である。オートファジーにおいては、二重膜（隔離膜）によってオルガネラ等が取り囲まれ、次いで該隔離膜を閉鎖し、さらにリソソームと融合することにより、その内容物であるオルガネラ等が分解されることが知られている。これまでの解析から、３０余りのオートファジーに関する分子が同定されており、これらの分子の中で、特にＡｔｇ５、Ａｔｇ７、ＬＣ３等がオ―トファジーの実行に必須の分子として考えられていた。
しかし、昨今、本発明者らによって、これらの分子を必要とせず、ゴルジ装置やエンドソームを起源とし、Ｒａｂ９等の分子によって調節されている新規のオートファジー（オルタナティブオートファジー）の存在が見出された（非特許文献１）。オルタナティブオートファジーは細胞ストレスによって強く誘導されることから、この機構の破綻が、癌等の誘発に関与していることが想定されている。このため、オルタナティブオートファジーを利用する、抗癌剤の開発が期待されているが、いまだ成功に至っていない。さらには、このような抗癌剤の候補となる化合物をスクリーニングする手法は未だ開発されていないのが現状である。
一方、ベンゾチオフェン化合物については、２位の置換基がアセトアミド基等であり、且つ６位の置換基が水素又はハロゲン原子であるベンゾチオフェン化合物がＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害活性を有すること、並びに癌増殖抑制作用を有していることが開示されている（特許文献１）。しかしながら、オルタナティブオートファジー誘導活性を有するベンゾチオフェン化合物は未だ同定されていない。
特開２００７−１５３７９２号公報
西田友哉、荒川聡子、清水重臣ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００９年１０月１日、４６１巻、７２６４号、６５４〜６５８ページ
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、オルタナティブオートファジーを誘導する活性を指標として、効率的に、抗癌活性を有する化合物をスクリーニングする方法を提供することにある。さらには、オルタナティブオートファジー誘導剤及び抗癌剤として有用なベンゾチオフェン化合物、並びに癌を治療するための方法を提供することにある。
本発明者らは、前記目的を達成すべく、先ず、被験化合物と、蛍光タンパク質が付加しているリソソームタンパク質Ｌａｍｐ１を発現しているＡｔｇ５欠損細胞とを接触させ、前記リソソームタンパク質の凝集による蛍光輝点の発生を指標として、オルタナティブオートファジーを誘導する活性を有する化合物を選択する系を構想した。そして、実際にこの系を利用して１１５８８種もの被験化合物からオルタナティブオートファジーを誘導する活性を有する化合物を選択し、さらに、これら化合物の中から、初代培養細胞には細胞死を誘導せず、不死化細胞（癌細胞）には細胞死を誘導できる化合物を選択した。また、選択した化合物を担癌非ヒト動物に導入し、当該担癌非ヒト動物が担持する癌の大きさを指標として抗癌活性を評価し、抗癌活性を有する化合物を複数同定した。
次いで、本発明者らは、前記蛍光輝点の発生を指標にオルタナティブオートファジーを誘導する活性があると認められた化合物及び認められなかった化合物について、担癌非ヒト動物を用いて抗癌活性を評価した。その結果、オルタナティブオートファジーを誘導する活性を有さない化合物については抗癌活性が全く認められず、一方、オルタナティブオートファジーを誘導する活性を有する化合物の殆どにおいて抗癌活性が認められた。
これら事実から、本発明者らは、蛍光輝点の発生を指標にオルタナティブオートファジーを誘導する活性を評価する系を利用して、効率的に、抗癌活性を有する化合物をスクリーニングすることが可能であることを見出し、本発明のスクリーニング方法を完成するに至った。
さらに、このスクリーニングを行った結果、２−アセトアミド−６−ブロモ−７−（２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）エトキシ）ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルエステル（Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）が、オルタナティブオートファジーを誘導する活性を有していることを見出した。さらにまた、当該化合物には細胞死を誘導する活性並びに抗癌活性を有していることも見出した。また、当該化合物及びその類似化合物に関して、オルタナティブオートファジーを誘導する活性及び抗癌活性について調べた結果、オルタナティブオートファジー誘導活性を有していないベンゾチオフェン化合物については抗癌活性が認められず、一方、オルタナティブオートファジー誘導活性を有するベンゾチオフェン化合物においては、その殆どにて抗癌活性が認められることも見出した。
さらに、本発明者らは、かかる知見に基づき、２位の置換基がアミノ基であり、且つ６位の置換基がハロゲン原子である新規ベンゾチオフェン化合物と、２位の置換基がアセトアミド基等であり、且つ６位の置換基が芳香族炭素環等である新規ベンゾチオフェン化合物とを合成し、これら化合物のオルタナティブオートファジー誘導活性を評価した結果、これら化合物が当該活性を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
従って、本発明は、ベンゾチオフェン化合物、並びに該化合物を有効成分とするオルタナティブオートファジー誘導剤及び抗癌剤に関する。また、本発明は、ベンゾチオフェン化合物を用いるオルタナティブオートファジーを誘導するための方法及び癌を治療するための方法に関する。さらに、本発明は、抗癌活性を有する化合物をスクリーニングするための方法に関する。より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
＜１＞ 下記一般式（１）：
［式（１）中、Ｒ１は、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環、又は−Ｒ６−Ｒ７で表わされる基を示す。Ｒ２は、ハロゲン原子、水酸基、−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７、又は−Ｏ−Ｒ６−Ｒ８で表わされる基を示す。Ｒ３は、水素原子又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９で表わされる基を示す。Ｒ４は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基を示す。Ｒ５は、酸素原子又はイミノ基を示す。また式（１）中、Ｒ６は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立に、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキレン基を示す。Ｒ７は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立に、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、炭素数が２〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルケニル基、又は炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示す。Ｒ８は、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。Ｒ９は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環、又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。］
で表されるベンゾチオフェン化合物を有効成分とするオルタナティブオートファジー誘導剤。
＜２＞ 下記一般式（１）：
［式（１）中、Ｒ１は、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環、又は−Ｒ６−Ｒ７で表わされる基を示す。Ｒ２は、ハロゲン原子、水酸基、−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７、又は−Ｏ−Ｒ６−Ｒ８で表わされる基を示す。Ｒ３は、水素原子又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９で表わされる基を示す。Ｒ４は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基を示す。Ｒ５は、酸素原子又はイミノ基を示す。また式（１）中、Ｒ６は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立に、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキレン基を示す。Ｒ７は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立に、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、炭素数が２〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルケニル基、又は炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示す。Ｒ８は、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。Ｒ９は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環、又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。］
で表されるベンゾチオフェン化合物を細胞に導入する工程を含む、オルタナティブオートファジーを誘導するための方法。
＜３＞ 下記（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択される少なくとも一つのベンゾチオフェン化合物
（ａ） 下記一般式（１）：
［式（１）中、Ｒ１は、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。Ｒ２は、ハロゲン原子、水酸基、−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７、又は−Ｏ−Ｒ６−Ｒ８で表わされる基を示す。Ｒ３は、水素原子又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９で表わされる基を示す。Ｒ４は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基を示す。Ｒ５は、酸素原子又はイミノ基を示す。また式（１）中、Ｒ６は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキレン基を示す。Ｒ７は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、炭素数が２〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルケニル基、又は炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示す。Ｒ８は、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。Ｒ９は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環、又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。］
で表されるベンゾチオフェン化合物
（ｂ） 前記一般式（１）：
［式（１）中、Ｒ１は、ハロゲン原子を示す。Ｒ２は、ハロゲン原子、水酸基、又は−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７で表わされる基を示す。Ｒ３は、水素原子で表わされる基を示す。Ｒ４は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基を示す。Ｒ５は、酸素原子又はイミノ基を示す。また式（１）中、Ｒ６は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキレン基を示す。Ｒ７は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、炭素数が２〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルケニル基、又は炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示す。］
で表されるベンゾチオフェン化合物。
＜４＞ ＜３＞に記載のベンゾチオフェン化合物を有効成分とする抗癌剤。
＜５＞ ＜３＞に記載のベンゾチオフェン化合物を患者に投与する工程を含む、癌を治療するための方法。
＜６＞ 下記（ａ）の工程を含む、抗癌活性を有する化合物をスクリーニングするための方法
（ａ）蛍光タンパク質が付加しているリソソームタンパク質を発現している細胞と、被験化合物とを接触させ、前記リソソームタンパク質の凝集による蛍光輝点の発生を指標として、オルタナティブオートファジーを誘導する活性を有する化合物を選択する工程。
＜７＞ 下記（ｂ）の工程をさらに含む、＜６＞に記載の方法
（ｂ）細胞と被験化合物とを接触させ、接触後の前記細胞の生存率を指標として、細胞死を誘導する活性を有する化合物を選択する工程。
＜８＞ 工程（ｂ）において、前記細胞が初代培養細胞及び不死化細胞であり、前記初代培養細胞の生存率が８０％以上であり、且つ前記不死化細胞の生存率が３０％以下であることを前記指標とする、＜７＞に記載の方法。
＜９＞ 工程（ｂ）において、前記細胞がアポトーシス抵抗性細胞であり、前記生存率が２０％以下であることを前記指標とする、＜７＞に記載の方法。
＜１０＞ 下記（ｃ）の工程をさらに含む、＜７＞〜＜９＞のいずれか一に記載の方法
（ｃ）工程（ａ）においてオルタナティブオートファジーを誘導する活性を有する化合物として選択され、且つ工程（ｂ）において細胞死を誘導する活性を有する化合物として選択された化合物を、担癌非ヒト動物に導入し、当該担癌非ヒト動物が担持する癌の大きさを測定し、得られた測定値が、当該被験化合物を導入していない担癌非ヒト動物が担持する癌の大きさの測定値より小さい場合、当該被験化合物を抗癌活性を有する化合物として選択する工程。
本発明によれば、オルタナティブオートファジー誘導剤及び抗癌剤として有用なベンゾチオフェン化合物、並びに癌の治療方法を提供することが可能となる。また、本発明の抗癌活性を有する化合物をスクリーニングするための方法によれば、オルタナティブオートファジーを誘導する活性を指標として、抗癌活性を有する化合物、特にアポトーシス抵抗性を獲得した癌細胞に対して有効に作用する抗癌活性を有する化合物を、効率的にスクリーニングすることが可能となる。
Ｌａｍｐ１−ＧＦＰ発現細胞における、電子顕微鏡を用いて計測して得られた一細胞当りのオートファジーの面積と、Ｌａｍｐ１−ＧＦＰの凝集による蛍光輝点の蛍光強度との相関関係を示すプロット図である。 本発明の方法により、オルタナティブオートファジーを誘導する活性を有し、且つ細胞死を誘導する活性を有する化合物として選択された２４化合物を、担癌マウスに投与し、各化合物を投与してから２０日後の腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフである。 本発明の方法により選択された化合物＃０９（本発明にかかるベンゾチオフェン化合物）を接触させたｐ５３欠損癌細胞（５３Ｔ）における、リソソームタンパク質 Ｌａｍｐ２の凝集を観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。 本発明の方法により選択された化合物＃０９を接触させたｐ５３欠損癌細胞（５３Ｔ）における、オートファジーの発生を観察した結果を示す、電子顕微鏡写真である。 本発明の方法により選択された化合物＃１３を接触させたｐ５３欠損癌細胞（５３Ｔ）における、リソソームタンパク質 Ｌａｍｐ２の凝集を観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。 本発明の方法により選択された化合物＃１３を接触させたｐ５３欠損癌細胞（５３Ｔ）における、オートファジーの発生を観察した結果を示す、電子顕微鏡写真である。 本発明の方法により選択された化合物＃０９を接触させた際の、正常細胞及び癌細胞の生存率を示すグラフである。なお、図中、四角は正常細胞の生存率を示し、丸は癌細胞の生存率を示す。 本発明の方法により選択された化合物＃１３を接触させた際の、正常細胞及び癌細胞の生存率を示すグラフである。なお、図中、四角は正常細胞の生存率を示し、丸は癌細胞の生存率を示す。 本発明の方法により選択された化合物＃０９を導入した担癌マウスにおける腫瘍体積を示すプロット図である。 本発明の方法により選択された化合物＃０９を導入した担癌マウスにおける腫瘍体積を示すプロット図である。 本発明の方法により選択された化合物＃１３を導入した担癌マウスにおける腫瘍体積を示すプロット図である。 本発明の方法により選択された化合物＃１３を導入した担癌マウスにおける腫瘍体積を示すプロット図である。 本発明の方法により選択された化合物＃０９を導入した担癌マウスの生存率の推移を示すグラフである。なお図中、「ｖｅｈｉｃｌｅ」は、ＤＭＳＯを投与した担癌マウス（陰性対照）の生存率の推移を示す（図１４及び１５においても同様）。 本発明の方法により選択された化合物＃１３を導入した担癌マウスの生存率の推移を示すグラフである。 抗癌剤エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）を導入した担癌マウスの生存率の推移を示すグラフである。 化合物＃０９及びその類似化合物（化合物＃３４、＃３５、＃３７、＃３８、＃３９、＃４０、＃４１、＃４２、＃４３、＃４４、＃４５及び＃４６）のオルタナティブオートファジー誘導能を示すグラフである。なお図中の縦軸は、各化合物を添加した際の一細胞当りの各々のオートファジー面積（Ｌａｍｐ１−ＧＦＰの凝集による蛍光輝点が細胞において占める面積）を、化合物＃０９を添加した際のそれを１として評価し、得られた比活性値である。 化合物＃０９及びその類似化合物（化合物＃３４、＃３５、＃３７、＃３８、＃３９、＃４０、＃４１、＃４２、＃４３、＃４４、＃４５又は＃４６）を導入した担癌マウスにおける腫瘍体積を示すプロット図である。 化合物＃０９及びその類似化合物（ＴＭＤ−４７３、ＴＭＤ−５１１〜５２０、ＴＭＤ−５９３及びＴＭＤ−５９４）のオルタナティブオートファジー誘導能を示すグラフである。なお図中の縦軸は、各化合物を添加した際の一細胞当りの各々のオートファジー面積を、化合物＃０９を添加した際のそれを１として評価し、得られた比活性値である。
本発明のオートファジー誘導剤は、下記一般式（１）：
［式（１）中、Ｒ１は、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環、又は−Ｒ６−Ｒ７で表わされる基を示す。Ｒ２は、ハロゲン原子、水酸基、−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７、又は−Ｏ−Ｒ６−Ｒ８で表わされる基を示す。Ｒ３は、水素原子又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９で表わされる基を示す。Ｒ４は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基を示す。Ｒ５は、酸素原子又はイミノ基を示す。また式（１）中、Ｒ６は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立に、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキレン基を示す。Ｒ７は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立に、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、炭素数が２〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルケニル基、又は炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示す。Ｒ８は、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。Ｒ９は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環、又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。］
で表されるベンゾチオフェン化合物を有効成分とするオルタナティブオートファジー誘導剤である。
前記一般式（１）における「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を意味する。Ｒ１における「ハロゲン原子」としては、臭素原子が好ましい。
「５〜１０員環の芳香族炭素環」としては、単環であっても多環であってもよく、例えば、ベンゼン、ナフタレン、インデンが挙げられる。
「５〜１０員環の芳香族複素環」としては、硫黄原子、窒素原子及び酸素原子から選択される少なくとも１種のヘテロ原子を含み、単環であっても多環であってもよい。ヘテロ原子の置換数としては１〜３が好ましく、より好ましくは１である。このような５〜１０員環の芳香族複素環としては、チオフェン、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイソチアゾール、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドール、イソインドール、インダゾール、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、チアゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、フラザンが挙げられる。
また、前記一般式（１）において、「５〜１０員環の芳香族炭素環」及び「５〜１０員環の芳香族複素環」は、置換可能な部位に、任意に組み合わせて１又は複数個の置換基を有していてもよい。このような置換基としては特に制限はなく、例えば、ハロゲン原子、アミノ基、イミノ基、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、アリール基、アリールアミノ基、ヒドロキシ基、シロキシ基、ニトロ基、シアノ基、アジ基、アジドアルキル基が挙げられる。
前記一般式（１）におけるＲ６は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキレン基を示す。このようなアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、エチルエチレン基、ジメチルエチレン基、ブチルエチレン基、シクロヘキシレン基、シクロペンチレン基が挙げられる。
前記一般式（１）におけるＲ７は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基、炭素数が２〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルケニル基で置換されていてもよいアミノ基、又は炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示す。「置換されていてもよいアミノ基」は、置換可能な部位に、任意に組み合わせて１又は複数個の置換基を有していても良いアミノ基のことを意味する。
「炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基」としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基が挙げられる。
「炭素数が２〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルケニル基」としては、例えば、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、イソプロペニル基、２−ブテニル基、１，３−ブタジエニル基、２−ペンテニル基、２−ヘキセニル基、シクロプロペニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基が挙げられる。
「炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のヒドロキシアルキル基」としては、例えば、ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、２−ヒドロキシブチル基、２−（ヒドロキシメチル）プロピル基、２−ヒドロキシペンチル基、３−ヒドロキシペンチル基、５−ヒドロキシペンチル基、２−ヒドロキシヘキシル基、６−ヒドロキシヘキシル基が挙げられる。
本発明のオートファジー誘導剤にかかるＲ１は、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環、又は−Ｒ６−Ｒ７で表わされる基を示す。「ハロゲン原子」としては前述の通りだが、好ましくは臭素原子である。また、「置換基」としては前述の通りだが、好ましくは、ハロゲン原子、アルキル基、ニトロ基、アルコキシ基、アルキルチオ基、ヒドロキシル基、アルキルアミノ基、ハロゲン化アルキル基、アジ基、アジドアルキル基であり、より好ましくは、フッ素原子、ニトロ基、メチル基、メチルチオ基、ヒドロキシル基、ジメチルアミノ基、トリフルオロメチル基、アジ基、アジドメチル基であり、オルタナティブオートファジー誘導能がより高いという観点から、さらに好ましくは、アルキルチオ基（特に、メチルチオ基）、アルコキシ基（特に、メトキシ基）、ヒドロキシル基である。さらに、「５〜１０員環の芳香族炭素環」としては前述の通りだが、ベンゼンが好ましい。また、「５〜１０員環の芳香族複素環」としては、チオフェン、ピリジンが好ましく、オルタナティブオートファジー誘導能がより高いという観点から、チオフェン（特に、３−チオフェン、２−チオフェン）がより好ましい。
さらに、本発明のオートファジー誘導剤にかかるＲ１における「置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環」及び「置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環」として、さらに好ましくは、下記式にて表わされる置換基である。下記式にて「Ｍｅ」はメチル基（ＣＨ３基）を示す（以下、同様）。
これらのうち、特に好ましくは、下記式にて表わされる置換基である。
本発明のオートファジー誘導剤にかかるＲ１におけるＲ６としては前述の通りだが、好ましくは、メチレン基である。またＲ１におけるＲ７としては前述の通りだが、好ましくはジエチル基で置換されているアミド基、２−プロペニル基で置換されているアミド基、ヒドロキシエチル基で置換されているアミド基、４−ヒドロキシブチル基で置換されているアミド基である。
さらに、本発明のオートファジー誘導剤にかかるＲ１における「−Ｒ６−Ｒ７で表わされる基」として、より好ましくは、下記式にて表わされる置換基である。
本発明のオートファジー誘導剤にかかるＲ２は、ハロゲン原子、水酸基、−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７、又は−Ｏ−Ｒ６−Ｒ８で表わされる基を示す。かかる「ハロゲン原子」としては前述の通りだが、好ましくは塩素原子である。また、かかるＲ６としては前述の通りだが、好ましくは、メチレン基、エチレン基である。さらに、かかるＲ７としては前述の通りだが、好ましくはジエチル基で置換されているアミド基である。本発明のオートファジー誘導剤にかかるＲ１及びＲ２において、Ｒ６又はＲ７は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立に前述の基を示すものである。
Ｒ８は、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。かかる「置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環」及び「置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環」は前述の通りであるが、好ましくはベンゼンである。
また、本発明のオートファジー誘導剤にかかるＲ２における「−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７、又は−Ｏ−Ｒ６−Ｒ８で表わされる基」としては、より好ましくは、下記式にて表わされる置換基である。
本発明のオートファジー誘導剤にかかるＲ３は、水素原子又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９で表わされる基を示す。Ｒ９は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環、又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。Ｒ９における「炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基」、「置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環」、「置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環」としては前述の通りだが、「炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基」としてはメチル基が好ましく、また、「置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環」としてはベンゼンが好ましい。
前記一般式（１）におけるＲ４は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基を示す。Ｒ４における「炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基」としては前述の通りだが、「炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基」としては、メチル基、エチル基が好ましい。
前記一般式（１）におけるＲ５は、酸素原子又はイミノ基（ＮＨ基）を示す。
また、本発明のオートファジー誘導剤の有効成分であるベンゾチオフェン化合物としては、より好ましくは、下記式（１−１）〜（１−３３）にて表わされるベンゾチオフェン化合物である。
また、後述の実施例に示す通り、オルタナティブオートファジー誘導能がより高いという観点から、本発明のオートファジー誘導剤の有効成分であるベンゾチオフェン化合物としては、さらに好ましくは、前記式（１−１０）、（１−１４）、（１−１５）、（１−１７）又は（１−１８）にて表わされるベンゾチオフェン化合物であり、特に好ましくは、前記式（１−１５）にて表わされるベンゾチオフェン化合物である。
また、本発明のベンゾチオフェン化合物には、薬理学上許容される塩又は溶媒和物も含まれる。このような薬理学上許容される塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素塩、硝酸塩、硫酸水素酸塩、リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、樟脳スルホン酸塩、スルファミン酸塩、マンデル酸塩、プロピオン酸塩、グリコール酸塩、ステアリン酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、パモン酸塩、フェニル酢酸塩、グルタミン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、スルファニル酸塩、２−アセトキシ安息香酸塩、エタンジスルホン酸塩、シュウ酸塩、イセチオン酸塩、ギ酸塩、トリフルオロ酢酸塩、エチルコハク酸塩、ラクトビオン酸塩、グルコン酸塩、グルコヘプトン酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ラウリル硫酸塩、アスパラギン酸塩、アジピン酸塩、ヨウ化水素酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、ピクリン酸塩、チオシアン酸塩、ウンデカン酸塩が挙げられる。また、溶媒和物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、水和物も含まれるものとする。
さらに、本発明のベンゾチオフェン化合物には、幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体等の総ての異性体及び異性体混合物が含まれる。また、本発明のベンゾチオフェン化合物が生体内で酸化、還元、加水分解、抱合等の代謝を受けてなお所望の活性を示す化合物をも包含し、さらに本発明は生体内で酸化、還元、加水分解等の代謝を受けて本発明のベンゾチオフェン化合物を生成する化合物をも包含する。また、本発明のオ―トファジー誘導剤は、後述の通り、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。
本発明のベンゾチオフェン化合物の入手方法としては特に制限はなく、例えば、前記式（１−１）〜（１−８）にて表わされるベンゾチオフェン化合物は、ファーメックス社（Ｐｈａｒｍｅｋｓ社、ロシア）より購入することもできる。
また、本発明のベンゾチオフェン化合物の合成方法としては特に制限はなく、例えば、以下の方法で製造することができる。下記式（２）、（３）及び（１ａ）〜（１ｄ）にて表わされるベンゾチオフェン化合物において、Ｒ４〜Ｒ９は前述の通りである。
「Ｇｒｉｎｅｖ．Ａ．Ｎ．ら、「２−（アシルアミノ）−７−ヒドロオキシベンゾ［ｂ］チオフェン誘導体の合成 臭素化及びニトロ化」、Ｋｈｉｍｉｙａ Ｇｅｔｅｒｏｓｉｋｌｉｃｈｅｓｋｉｋｈ Ｓｏｅｄｉｎｅｎｉｉ、１９８７年、４巻、４６０〜４６２ページ」の記載に沿って、先ず下記式（２）にて表わされるベンゾチオフェン化合物を溶媒（例えば、クロロホルム）中にて臭素と反応させて、下記式（３）にて表わされるベンゾチオフェン化合物を合成する。
次いで、下記式（３）にて表わされるベンゾチオフェン化合物を溶媒（例えば、ジオキサンと水との混合溶媒）中にて塩基（例えば、炭酸カリウム）と反応させることにより、下記式（１ａ）にて表わされるベンゾチオフェン化合物を合成することができる。
また、前記式（１ａ）にて表わされるベンゾチオフェン化合物を溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド）中にて、ハロゲン化化合物（Ｘ−Ｒ６−Ｒ７で表わされる化合物又はＸ−Ｒ６−Ｒ８で表わされる化合物）と反応させることにより、下記式（１ｂ）にて表わされるベンゾチオフェン化合物を合成することもできる。
前記ハロゲン化化合物において、Ｘとは、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）を意味する。また、前記式（１ｂ）及び後述の式（１ｃ）〜（１ｅ）にて表わされるベンゾチオフェン化合物において、Ｒ２は「−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７又は−Ｏ−Ｒ６−Ｒ８で表わされる基」を示す。
さらに、溶媒中（例えば、アセトニトリルと水との混合溶媒）、塩基（例えば、リン酸カリウム）及びパラジウム触媒（例えば、ジクロロビス［ジ−ｔ−ブチル（ｐ−ジメチルアミノフェニル）ホスフィノ］パラジウム（II)）下にて、前記式（１ｂ）にて表わされるベンゾチオフェン化合物とボロン酸試薬（Ｒ１−Ｂ（ＯＨ）２で表わされる化合物）とを反応させることにより、下記式（１ｃ）にて表わされるベンゾチオフェン化合物を合成することもできる。
前記ボロン酸試薬、前記式（１ｃ）にて表わされるベンゾチオフェン化合物及び後述の式（１ｅ）にて表わされるベンゾチオフェン化合物において、Ｒ１は「置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環、又は−Ｒ６−Ｒ７で表わされる基」を示す。
また、前記式（１ｂ）にて表わされるベンゾチオフェン化合物を、溶媒中（例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）とメタノールとの混合溶媒、メタノールと水との混合溶媒、）にて、強塩基等（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム）により加水分解することにより下記式（１ｄ）にて表わされるベンゾチオフェン化合物を合成することもできる。さらにまた、前記と同様にして、前記式（１ｃ）にて表わされるベンゾチオフェン化合物を加水分解することにより下記式（１ｅ）にて表わされるベンゾチオフェン化合物を合成することもできる。
各合成方法においては、各化合物における置換基を保護するために、適宜保護基を導入してもよい。このような保護基としては特に制限はなく、例えば、メチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチルエステル基、アセタール基、フタロイル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基が挙げられる。さらに、保護基を導入した化合物を用いた場合においては、必要に応じて、各保護基に応じた脱保護反応に供してもよい。
また、各合成方法において得られた反応混合物から目的の生成物の単離、精製は、特に制限はなく、適宜公知の手法（濃縮、結晶化、蒸留、懸濁精製、クロマトグラフィーによる精製等）を選択して行うことができる。
以上、本発明のベンゾチオフェン化合物（前記式（１ａ）〜（１ｄ）にて表わされるベンゾチオフェン化合物）の好適な合成方法について説明したが、本発明の化合物の合成方法は上記方法に限定されるものではない。また、本発明の化合物の具体的な製造方法は後述の実施例に示されているので、当業者であれば、上記及び実施例の記載を参照しつつ、反応原料、反応試薬、反応条件（例えば、溶媒、反応温度、触媒、反応時間）等を適宜選択しつつ、必要に応じてこれらの方法に適宜、修飾ないし改変を加えることにより、本発明のベンゾチオフェン化合物を製造することは可能である。
本発明において、「オルタナティブオートファジー」とは、オートファジー関連分子Ａｔｇ５やＡｔｇ７を用いることなく、オートファゴソームが形成され、さらにリソソームが融合することにより、該オートファゴソームに取り込まれた細胞内成分が分解される、細胞内浄化機構を意味する。前記一般式（１）で表わされる前述のベンゾチオフェン化合物は、後述の実施例において示す通り、オルタナティブオートファジーを誘導する活性を有している。従って、本発明は、当該化合物を有効成分とするオルタナティブオートファジー誘導剤のみならず、当該ベンゾチオフェン化合物を細胞に導入する工程を含む、オルタナティブオートファジーを誘導するための方法をも提供することができる。
当該ベンゾチオフェン化合物の細胞への「導入」は、通常、細胞の培養液に当該ベンゾチオフェン化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されず、適宜公知の手法を選択して行うことができる。導入する当該ベンゾチオフェン化合物の濃度は化合物の性質（溶解度、毒性等）により異なる。例えば、当該ベンゾチオフェン化合物を前記細胞の培養液に添加する濃度としては、０．１ｎＭ〜１００μＭの範囲にて適宜選択することが好ましい。また、例えば、当該ベンゾチオフェン化合物を細胞の培養液に添加している時間としては、１０分〜４８時間が好ましい。
前記一般式（１）で表わされる前述のベンゾチオフェン化合物のうち、前記式（１−８）〜（１−３３）にて表わされるベンゾチオフェン化合物については、本発明において新たに設計されたものである。
従って、本発明は、下記（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択される少なくとも一つのベンゾチオフェン化合物を提供することができる。
（ａ） 前記一般式（１）：
［式（１）中、Ｒ１は、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。Ｒ２は、ハロゲン原子、水酸基、−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７、又は−Ｏ−Ｒ６−Ｒ８で表わされる基を示す。Ｒ３は、水素原子又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９で表わされる基を示す。Ｒ４は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基を示す。Ｒ５は、酸素原子又はイミノ基を示す。また式（１）中、Ｒ６は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキレン基を示す。Ｒ７は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、炭素数が２〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルケニル基、又は炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示す。Ｒ８は、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。Ｒ９は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環、又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。］
で表されるベンゾチオフェン化合物
（ｂ） 前記一般式（１）：
［式（１）中、Ｒ１は、ハロゲン原子を示す。Ｒ２は、ハロゲン原子、水酸基、又は−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７で表わされる基を示す。Ｒ３は、水素原子で表わされる基を示す。Ｒ４は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基を示す。Ｒ５は、酸素原子又はイミノ基を示す。また式（１）中、Ｒ６は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキレン基を示す。Ｒ７は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、炭素数が２〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルケニル基、又は炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示す。］
で表されるベンゾチオフェン化合物。
前記（ａ）のベンゾチオフェン化合物において、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環、Ｒ２〜Ｒ５は前述の通りである。前記（ｂ）のベンゾチオフェン化合物において、ハロゲン原子、−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７で表わされる基、Ｒ４及びＲ５は前述の通りである。
前記（ａ）のベンゾチオフェン化合物としては、好ましくは、前記（１−９）〜（１−３３）にて表わされるベンゾチオフェン化合物であり、前記（ｂ）のベンゾチオフェン化合物としては、前記（１−８）にて表わされるベンゾチオフェン化合物である。
前記（ａ）及び（ｂ）のベンゾチオフェン化合物には、前述の通り、薬理学上許容される塩又は溶媒和物も含まれ、幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体等の総ての異性体及び異性体混合物も含まれる。さらに、前述の通り、前記（ａ）及び（ｂ）のベンゾチオフェン化合物が生体内で酸化、還元、加水分解、抱合等の代謝を受けてなお所望の活性を示す化合物をも包含し、さらに本発明は生体内で酸化、還元、加水分解等の代謝を受けて前記（ａ）及び（ｂ）のベンゾチオフェン化合物を生成する化合物をも包含する。また、前記（ａ）及び（ｂ）のベンゾチオフェン化合物の合成方法としても特に制限はなく、例えば、前述の合成方法にて製造することができる。
後述の実施例において示す通り、前記一般式（１）で表わされる前述のベンゾチオフェン化合物はオルタナティブオートファジーを誘導する活性のみならず、癌細胞特異的に細胞死を誘導できることも明らかになった。従って、本発明は、前記（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択される少なくとも一つのベンゾチオフェン化合物を有効成分とする抗癌剤を提供することができる。
本発明において「抗癌」活性とは、癌細胞の増殖を抑制する活性、及び/又は癌細胞の死を誘導する活性のことを意味する。本発明の抗癌剤並びに癌を治療するための方法が対象とする癌としては特に制限はなく、例えば、上咽頭腫、甲状腺腫瘍、中枢神経系腫瘍（神経芽細胞腫、星状細胞腫、多形性膠芽腫等）、黒色腫、血管腫瘍、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍、血腫、白血病、リンパ腫、子宮頸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、大腸癌、肝癌、泌尿生殖器癌、骨肉腫、軟骨肉腫、胃癌、膵臓癌が挙げられる。
本発明の抗癌剤及びオルタナティブオートファジー誘導剤は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経口的又は非経口的に使用することができる。
これら製剤化においては、薬理学上許容される担体又は媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。また、本発明の抗癌剤及びオルタナティブオートファジー誘導剤は、公知の他の抗癌剤と併用してもよい。
本発明の抗癌剤及びオルタナティブオートファジー誘導剤の好ましい投与形態としては特に制限はなく、経口投与又は非経口投与、より具体的には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与が挙げられる。
本発明の抗癌剤及びオルタナティブオートファジー誘導剤は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。
本発明の抗癌剤又はオルタナティブオートファジー誘導剤を投与する場合、その投与量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態等に応じて、適宜選択される。例えば、１回当たりの本発明の抗癌剤又はオルタナティブオートファジー誘導剤の投与量は、有効成分である前記（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択される少なくとも一つのベンゾチオフェン化合物の量として、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．２ｇ／ｋｇ体重が好ましい。
このように本発明は、本発明の抗癌剤等を対象に投与することによって、癌を治療することができる。従って、本発明は、前記（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択される少なくとも一つのベンゾチオフェン化合物を投与することを特徴とする、癌を治療するための方法をも提供するものである。
本発明の抗癌剤等の製品又はその説明書は、癌を治療するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品又は説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装等に表示を付したこと、又は製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物等に表示を付したことを意味する。また、癌を治療するために用いられる旨の表示においては、本発明のベンゾチオフェン化合物を投与することにより、オルタナティブオートファジーを誘導し、癌細胞特異的に細胞死を誘導できることも本発明の抗癌剤の作用機序に関する情報として含むことができる。
以上が、本発明の、ベンゾチオフェン化合物、オルタナティブオートファジー誘導剤、抗癌剤、オルタナティブオートファジーを誘導するための方法及び癌を治療するための方法についての説明となる。次に、本発明の抗癌活性を有する化合物をスクリーニングするための方法について、工程ごとに説明する。
＜オルタナティブオートファジーを誘導する活性を指標として、抗癌活性を有する化合物を選択する工程＞
本発明の抗癌活性を有する化合物をスクリーニングするための方法は、
（ａ）蛍光タンパク質が付加しているリソソームタンパク質を発現している細胞と、被験化合物とを接触させ、前記リソソームタンパク質の凝集による蛍光輝点の発生を指標として、オルタナティブオートファジーを誘導する活性を有する化合物を選択する工程
を含む方法である。
本発明において「オルタナティブオートファジー」とは、オートファジー関連分子Ａｔｇ５やＡｔｇ７を用いることなく、オートファゴソームが形成され、さらにリソソームが融合することにより、該オートファゴソームに取り込まれた細胞内成分が分解される細胞内浄化機構を意味する。
本発明において「抗癌活性」とは、癌細胞の増殖を抑制する活性、及び／又は癌細胞の死を誘導する活性を意味する。標的となる癌細胞としては、例えば、上咽頭腫、甲状腺腫瘍、中枢神経系腫瘍（神経芽細胞腫、星状細胞腫、多形性膠芽腫等）、黒色腫、血管腫瘍、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍、血腫、白血病、リンパ腫、子宮頸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、大腸癌、肝癌、泌尿生殖器癌、骨肉腫、軟骨肉腫、胃癌、膵臓癌の癌細胞が挙げられる。
本発明にかかる「リソソームタンパク質」としては、リソソームに特異的に発現しているタンパク質であればよく、例えば、Ｌａｍｐ１、Ｌａｍｐ２、Ｌｉｍｐ１、Ｌｉｍｐ２、ＡＥＰが挙げられる。
本発明において、前記リソソームタンパク質に付加する「蛍光タンパク質」としては、励起光を受けて蛍光を発することのできるタンパク質であればよく、例えば、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙが挙げられる。
蛍光タンパク質は、リソソームタンパク質の機能を抑制しない限り、リソソームタンパク質のＮ末側、Ｃ末側のいずれに付加させてもよい。また、直接的にリソソームタンパク質に付加させてもよく、スペーサーを介して間接的に付加させてもよい。
また、リソソームタンパク質には、前記蛍光タンパク質に加えて、さらに、他の機能性タンパク質が付加していてもよい。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、例えば、Ｍｙｃ−タグ（ｔａｇ）、Ｈｉｓ−タグ、ヘマグルチン（ＨＡ）−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。
本発明において、リソソームタンパク質を発現させる「細胞」としては特に制限はないが、オルタナティブオートファジーの誘導に依存するリソソームタンパク質の凝集を検出し易いという観点から、Ａｔｇ５、Ａｔｇ７、Ａｔｇ９、Ａｔｇ１２及びＡｔｇ１６からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質の機能が抑制されている細胞が好ましい。
Ａｔｇ５等の機能が抑制されている細胞は、当業者であれば、適宜公知の手法を選択することにより調製することができる。公知の手法としては、例えば、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞において、相同組換えにより、前記Ａｔｇ５等の遺伝子を欠損させる、または、当該遺伝子に変異を導入する方法が挙げられる。このような多能性幹細胞を胚盤胞に移植することにより作製した非ヒト動物から、Ａｔｇ５等の機能が抑制されている所望の細胞を単離することができる。また、このような多能性幹細胞をサイトカイン等の存在下で培養することにより、Ａｔｇ５等の機能が抑制されている所望の分化細胞を調製することができる。
本発明においては、細胞におけるＡｔｇ５等の機能を抑制するための相同組換え以外の方法として、例えば、前記Ａｔｇ５等の遺伝子に相補的な配列からなるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンス核酸を細胞に導入する方法を用いても良い。
蛍光タンパク質が付加しているリソソームタンパク質を発現している細胞は、当業者であれば、適宜公知の手法を選択することにより調製することができる。公知の手法としては、例えば、蛍光タンパク質が付加しているリソソームタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持するベクターを細胞に導入する方法が挙げられる。用いられる「ベクター」としては、例えば、蛍光タンパク質が付加しているリソソームタンパク質をコードするＤＮＡを挿入した、プラスミドＤＮＡ、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクターが挙げられる。当該ＤＮＡを効率的に発現させるために、ベクターは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリＡシグナル、薬剤耐性遺伝子等の選択マーカー等を保持していることが好ましい。
ベクターの細胞への導入は、ベクターとしてプラスミドＤＮＡを用いる場合には、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等の公知の方法を利用することができる。また、ベクターとしてウィルスベクターを用いる場合には、例えば、リン酸カルシウム法等によりウィルスベクターをパッケージング細胞に導入して、当該細胞にウィルス粒子を生産させ、回収したウイルス粒子を前記細胞に接触させる方法を利用することができる。
細胞における、蛍光タンパク質が付加しているリソソームタンパク質の「発現」は、一過的なものであってもよく、恒常的なものであってもよい。
こうして調製した細胞に接触させる「被験化合物」としては特に制限はなく、例えば、合成低分子化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製又は部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物又は動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。
細胞への被験化合物の「接触」は、通常、細胞の培養液に被験化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。接触させる被験化合物の濃度は、その種類や性質（溶解度、毒性等）により異なる。例えば、低分子化合物の場合、前記細胞の培養液に添加する濃度としては、０．１ｎＭ〜１００μＭの範囲にて適宜選択することが好ましい。また、被験化合物を前記細胞に接触させる時間としては、１０分〜４８時間が好ましい。
被験化合物を接触させた細胞において発生する「前記リソソームタンパク質の凝集による蛍光輝点」は、Ａｔｇ５やＡｔｇ７を利用せずに隔離膜とトランス・ゴルジ／エンドソームとの融合によって形成されたオートファゴソームに、蛍光タンパク質が付加しているリソソームタンパク質が融合し、それらが凝集（集積）することにより生じる輝点である。
本発明における蛍光輝点の発生の検出は、例えば、前記蛍光タンパク質に対応した励起フィルター及び吸収フィルターを備えた蛍光顕微鏡による観察、フローサイトメーターによる解析、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）等のイメージングサイトメーターによる解析により行うことができる。ハイスループットに解析できるという観点から、イメージングサイトメーターによる解析により検出を行うことが好ましい。
蛍光輝点の発生の程度は、例えば、蛍光輝点の数、１細胞あたりの蛍光輝点の面積、蛍光輝点の面積が前記リソソームタンパク質を発現している細胞において占める割合等により評価することができる。
蛍光輝点の発生の程度を、１細胞あたりの蛍光輝点の面積により評価する場合、オートファジーが観察されない細胞においては、蛍光輝点の面積は４μｍ２未満であるという観点から、１細胞当りの蛍光輝点の面積が４μｍ２以上（例えば、４〜１００μｍ２）であることを、オルタナティブオートファジーを誘導する活性を有す化合物の選択の指標とすることが好ましい。
また、図１において示す通り、１細胞あたり蛍光輝点が占める面積（蛍光輝点の細胞内において占める割合）は、１細胞あたりの蛍光強度と比例関係にあることが、本実施例において初めて明らかになった。従って、当該面積（割合）に代わり、蛍光強度をオルタナティブオートファジーを誘導する活性を有する化合物の選択の指標として用いることもできる。
オルタナティブオートファジーを誘導する活性を有する化合物の選択においては、このような絶対的な評価に代えて、対照との比較による相対的な評価を利用することもできる。すなわち、被験化合物を接触させた細胞における蛍光輝点の発生の程度が、被験化合物と接触していない細胞のそれらと比較して高ければ、当該被験化合物をオルタナティブオートファジーを誘導する活性を有する化合物として選択することができる。
＜インビトロにおける細胞死を誘導する活性を指標として、抗癌活性を有する化合物を選択する工程＞
本発明の抗癌活性を有する化合物をスクリーニングするための方法において、前記工程（ａ）に加え、さらに、細胞と被験化合物とを接触させ、接触後の前記細胞の生存率を指標として、細胞死を誘導する活性を有する化合物を選択する工程（工程（ｂ））を含むことが好ましい。これにより、より効率的に抗癌活性の高い化合物をスクリーニングすることができる。
一般的に、細胞のプログラム細胞死は、形態学的にアポトーシス（タイプ１細胞死）、オートファジーを伴う細胞死（タイプ２細胞死）、細胞小器官の膨潤と小胞の出現を伴うがリソソームの関与がない細胞死（タイプ３細胞死）に分類される。
工程（ｂ）における「細胞死を誘導する活性」としては前記いずれの細胞死を誘導する活性であってもよいが、アポトーシス抵抗性を示す癌細胞に対して抗癌活性を示す化合物を選択できるという観点から、オートファジーを伴う細胞死（タイプ２細胞死）を誘導する活性であることが好ましい。
細胞死を誘導する活性の指標となる「細胞の生存率」の検出方法としては、特に制限はないが、アネキシン−Ｖ（Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ）染色法やヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ、ＰＩ）染色法等のアポトーシスを特異的に検出する方法ではなく、例えば、トリパンブルー色素排除試験法、ＭＴＴアッセイ、ＸＴＴアッセイ、アラマーブルー染色法、トリチウムチミジン取込み試験、臭素化デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込み試験、酸化還元色素であるレサズリンが生細胞により蛍光産物レゾルフィンに変換されることを利用したＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ（登録商標、ＣＴＢ）測定法等のアポトーシス非特異的な検出方法であることが好ましく、より簡便に感度よく細胞死を検出できるという観点から、ＣＴＢ測定法がより好ましい。
工程（ｂ）における「細胞」としては特に制限はないが、例えば、初代培養細胞及び不死化細胞を用いることができる。
「初代培養細胞」は、生体から採取した細胞を最初に播種して培養することによって得られる細胞であり、当業者であれば適宜公知の手法を選択し、調製することができる。「不死化細胞」としては、例えば、ＳＶ４０Ｔ抗原を導入することにより不死化した細胞、ｍｙｃやｒａｓ等を導入又は活性化することにより不死化した細胞等が挙げられる。なお、これら不死化細胞の性質は癌細胞に近いことが知られている。また、これら細胞は、当業者であれば適宜公知の手法を適宜選択して調製することができる。
初代培養細胞及び不死化細胞を用いる場合、細胞死を誘導する活性を有する化合物の選択は、被験化合物と接触させた際の初代培養細胞の生存率が８０％以上であり、且つ被験化合物と接触させた際の不死化細胞の生存率が３０％以下であることを指標とすることができる。
また、工程（ｂ）における「細胞」としては、例えば、アポトーシス抵抗性細胞を用いることもできる。これにより、アポトーシスとは異なるプログラム細胞死を効率良く検出することができ、ひいてはアポトーシス抵抗性を示す癌細胞に対して抗癌活性を示す化合物を選択することができる。
「アポトーシス抵抗性細胞」としては、例えば、アポトーシス阻害タンパク質（Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２等）の機能が亢進されている細胞や、アポトーシス誘導タンパク質（Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ａｐａｆ−１、ｃａｓｐａｓｅ−９、ｃａｓｐａｓｅ−３等）の機能が抑制されている細胞が挙げられる。これら細胞は、当業者であれば公知の手法を適宜選択し、調製することができる。例えば、アポトーシス阻害タンパク質の発現が亢進されている細胞を調製する際には、蛍光タンパク質が付加しているリソソームタンパク質を発現している細胞を調製するための前記方法と同様の方法を利用することができ、またアポトーシス誘導タンパク質の機能が抑制されている細胞を調製する際には、Ａｔｇ５等の機能が抑制されている細胞を調製するための前記方法と同様の方法を利用することができる。
アポトーシス抵抗性細胞を用いる場合、細胞死を誘導する活性を有する化合物の選択は、被験化合物と接触させた際の当該細胞の生存率が２０％以下であることを指標とすることができる。
さらに、工程（ｂ）における「細胞」としては、半数以上の癌においてｐ５３の異常が確認されており、またｐ５３タンパク質の機能が抑制されていると、ＤＮＡ傷害等によって誘導されるアポトーシスに対する抵抗性が獲得されるという観点から、ｐ５３タンパク質の機能が抑制されている細胞を用いることができる。
「ｐ５３タンパク質の機能が抑制されている細胞」は、当業者であれば公知の手法（例えば、Ａｔｇ５等の機能が抑制されている細胞を調製するための前記方法と同様の方法）を適宜選択し、調製することができる。
ｐ５３タンパク質の機能が抑制されている細胞を用いる場合、細胞死を誘導する活性を有する化合物の選択は、被験化合物と接触させた際の当該細胞の生存率が２０％以下であることを指標とすることができる。
工程（ｂ）における細胞死を誘導する活性を有する化合物の選択においては、上記のような絶対的な評価に代えて、対照との比較による相対的な評価を利用することもできる。すなわち、被験化合物を接触させた細胞における生存率が、被験化合物と接触していない細胞のそれらと比較して低ければ、当該被験化合物を細胞死を誘導する活性を有する化合物として選択することができる。
なお、工程（ｂ）における「被験化合物」及び「接触」については、前述の工程（ａ）と同様である。
＜インビボにおける細胞死を誘導する活性を指標として、抗癌活性を有する化合物を選択する工程＞
本発明の抗癌活性を有する化合物をスクリーニングするための方法において、前記工程（ａ）及び工程（ｂ）に加え、さらに、工程（ａ）においてオルタナティブオートファジーを誘導する活性を有する化合物として選択され、且つ工程（ｂ）において細胞死を誘導する活性を有する化合物として選択された化合物を、担癌非ヒト動物に導入し、当該担癌非ヒト動物が担持する癌の大きさを測定し、得られた測定値が、当該被験化合物を導入していない担癌非ヒト動物が担持する癌の大きさの測定値より小さい場合、当該被験化合物を抗癌活性を有する化合物として選択する工程（工程（ｃ））を含むことが好ましい。これにより、より効率良く、抗癌活性の高い化合物をスクリーニングでき、さらには生存率の改善、転移の有無等を併せて調べることにより、実際の癌治療・予防効果も予測できる。
工程（ｃ）における「担癌非ヒト動物」は、体内に癌を担持する非ヒト動物である。癌としては特に制限はなく、前述のような上咽頭腫等が挙げられる。癌を担持する「非ヒト動物」としてはヒト以外の動物であればよく、マウス、ラット、サル、チンパンジー、ブタ、ヒツジ、ヤギ、トリ、ゼブラフィッシュ、カエル等が挙げられる。さらに、「担癌非ヒト動物」において担持される癌は、自然発生的に生じたものであってもよく、放射線の照射や発癌性物質（化学物質、がんウィルス、がん遺伝子）の導入によって調製されたものであってもよい。また、前記担持される癌は、後述の実施例３において示すように、体外にて調製された癌細胞が導入されたものであってもよい。導入される癌細胞と非ヒト動物との関係は同種の関係であってもよく、異種の関係であってもよい。
工程（ｃ）において、化合物を担癌非ヒト動物に導入する投与形態としては特に制限はないが、癌への注射等による直接投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、経口投与、気道内投与、直腸投与、筋肉内投与等が挙げられる。また、当業者であれば、各投与形態に適した公知の手法（剤型等）を選択することにより、担癌非ヒト動物に導入を達成することはできる。
工程（ｃ）における「化合物の導入」は癌治療に適した化合物をスクリーニングするという観点からは、後述の実施例に示す通り、非ヒト動物が癌を担持した後に導入することが好ましく、癌予防に適した化合物をスクリーニングするという観点からは、例えば、体外にて調製された癌細胞を非ヒト動物に導入するのと同時に、またはその前に、化合物を導入することが好ましい。
担癌非ヒト動物に導入する化合物の量としては特に制限はなく、例えば、１回量として０．１ｎｍｏｌ〜１００μｍｏｌ／個体を、１日１〜５回、１〜３週間かけて、毎日又は数日（２〜５日）ごとに導入することができる。複数回導入する場合には、１回量が同量であってもよいが、段階的に導入する量を上げていっても、又は下げていってもよい。
工程（ｃ）において検出する「担癌非ヒト動物が担持する癌の大きさ」は、当該癌の体積のみならず、当該癌の長径、短径であってもよく、また当該癌の体積を反映している重量であってもよい。担癌非ヒト動物が担持する癌の大きさを測定することによって得られた「測定値」には、実際の測定値のみならず、例えば、当該癌の長径等の測定値に基づき算出された体積の値も含まれる。
得られた測定値が、当該被験化合物を導入していない担癌非ヒト動物が担持する癌の大きさの測定値より小さい場合、当該被験化合物を抗癌活性を有する化合物として選択することができる。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
東京医科歯科大学ケミカルバイオロジースクリーニングセンター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｍｄ．ａｃ．ｊｐ／ｍｒｉ／ＳＢＳ／ｃｂｓｃ／ＣｏｐｙＰｌａｔｅＬｉｓｔ／ＣｏｐｙＰｌａｔｅ．ｈｔｍｌ）から提供を受けた１１５８８種の化合物を被験化合物とし、以下に示す方法にて、リソソームタンパク質の凝集による蛍光輝点の発生を指標として、オルタナティブオートファジーを誘導する活性を有する化合物を選択した。
＜Ｌａｍｐ１−ＧＦＰ発現細胞の調製＞
先ず、ＡＴＧ５欠損マウス胎児線維芽細胞（「ＡＴＧ５−ＫＯ ＭＥＦ」とも称する）にレトロウィルスを用いて、Ｌａｍｐ１とＧＦＰとの融合タンパク質（「Ｌａｍｐ１−ＧＦＰ」とも称する）を発現する遺伝子を導入した。そして、Ｌａｍｐ１−ＧＦＰの発現の高い細胞をクローニングし、Ｌａｍｐ１−ＧＦＰ／ＡＴＧ５−ＫＯ ＭＥＦとして調製した。
ＡＴＧ５−ＫＯ ＭＥＦは、胎生１４．５日のＡＴＧ５欠損Ｃ５７／Ｂ６Ｊ系マウスより樹立したＭＥＦに、ＳＶ４０Ｔ抗原を発現する遺伝子をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステム（ａｍａｘａ社製）を用いた電気穿孔法にて導入し、不死化することにより、調製した。また、レトロウィルスは、レトロウィルスパッケージング細胞であるｐｌａｔ Ｅ細胞にＭＳＣＶ−Ｌａｍｐ１−ＧＦＰ（ｚｅｏｃｉｎ耐性）ベクターを導入することにより、作製した。
＜リソソームタンパク質の凝集が占める細胞内の割合と、該凝集による蛍光輝点の蛍光強度との相関についての検証＞
Ｌａｍｐ１−ＧＦＰ発現細胞において生じるオーファジーの程度、すなわち１細胞あたりのＬａｍｐ１−ＧＦＰの凝集が占める面積と、Ｌａｍｐ１−ＧＦＰの凝集による蛍光輝点の蛍光強度とが相関しているかどうかを調べた。
すなわち、先ずエトポシドを１０μＭ投与することによって、Ｌａｍｐ１−ＧＦＰ発現細胞にオルタナティブオートファジーを誘導した。そして、オルタナティブオートファジーを誘導する処理を施してから、１６時間後に、当該細胞をグルタルアルデハイドにより固定した後、１細胞あたりのＧＦＰの蛍光量をＩｎ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて定量した。その後、同一サンプルを電子顕微鏡にて観察し、１細胞あたりのＬａｍｐ１−ＧＦＰの凝集が占める面積（オートファジー領域が占める面積）を算出した。得られた結果を図１に示す。
図１に示した結果から明らかなように、電子顕微鏡にて計測したオートファジー領域が占める面積と、１細胞あたりのＬａｍｐ１−ＧＦＰの凝集による蛍光輝点の蛍光強度とは比例関係にあることが示された。従って、オーファジーの程度は、Ｌａｍｐ１−ＧＦＰの凝集による蛍光輝点の蛍光強度を指標としても評価できることが明らかになった。
＜オルタナティブオートファジー誘導活性の評価＞
前日に１×１０４／９６ｗｅｌｌになるよう播種したＬａｍｐ１−ＧＦＰ／ＡＴＧ５−ＫＯ ＭＥＦに、被験化合物を最終濃度５０μＭとなるよう添加し、３７℃、１０％ＣＯ２にて５時間培養した。
そして、観察に際し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を最終濃度１ｎｇ／ｍｌとなるように培養液に添加し、５分間インキュベーションした後、培養液をＨＢＳＳ１００μｌに置換した。次いで、ＩＮＣＥＬＬ ＡＮＡＬＹＺＥＲ １０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にて、１ｗｅｌｌあたりランダムに５視野を撮影した。そして、得られた観察視野内において、Ｌａｍｐ１−ＧＦＰの凝集による蛍光輝点が細胞において占める面積が４μｍ２以上であった被験化合物をオルタナティブオートファジーを誘導する活性を有する化合物として選択した。
その結果、実施例１においては、供した１１５８８種の化合物のうち、オルタナティブオートファジーを誘導する活性を有する化合物として５４化合物が選択された。
（実施例２）
東京医科歯科大学ケミカルバイオロジースクリーニングセンターから提供を受けた１１５８８種の化合物を被験化合物とし、以下に示す方法にて、細胞の生存率を指標として、細胞死を誘導する活性を有する化合物を選択した。
＜がん細胞特異的に細胞死を誘導する化合物の選択＞
本実施例においては、増殖速度の遅い初代培養野生型ＭＥＦ（ｐｒｉｍａｒｙ ＭＥＦ）と、ＳＶ４０Ｔ抗原を導入することにより不死化した、増殖速度の速いｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ＭＥＦとを用いて、がん細胞特異的に細胞死を誘導する化合物の選択を行った。すなわち、先ず、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ＭＥＦを２ｘ１０４／ｗｅｌｌ、ｐｒｉｍａｒｙ ＭＥＦを４ｘ１０４／ｗｅｌｌになるように、９６ｗｅｌｌプレートに播種した。そして、その翌日に、化合物を最終濃度５０μＭとなるよう添加し、３７℃、１０％ＣＯ２にて２４時間培養した。次いで、Ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｂｌｕｅ（ＣＴＢ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添付のプロトコールの通りに使用し、各被験化合物と接触させた細胞の生存率を測定した。そして、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ＭＥＦで細胞死を大きく誘導し（生存率３０％以下）、ｐｒｉｍａｒｙ ＭＥＦで細胞死を誘導しない（生存率８０％以上）被験化合物を、がん細胞特異的に細胞死を誘導する化合物として選択した。その結果、実施例２においては、供した１１５８８種の化合物のうち、４１１化合物が選択された。
（実施例３）
前記１１５８８種の化合物のうち、実施例１において選択され、かつ実施例２においても選択された２４化合物を被験化合物とし、以下に示す担癌非ヒト動物を用いた方法にて、抗癌活性を有する化合物を選択した。
＜ｉｎ ｖｉｖｏにおける、抗癌活性を有する化合物の選択＞
ｐ５３欠損Ｃ５７／Ｂ６Ｊマウスに自然発生した腫瘍より樹立した腫瘍細胞株（「５３Ｔ」とも称する）を、野生型Ｃ５７／Ｂ６Ｊマウスの腹側皮内４箇所に３ｘ１０５細胞ずつ移植し、翌日より隔日で５回、各化合物をマウスに投与した。各化合物の濃度は０．４μｍｏｌ／（５０μｌ ＤＭＳＯ＋１００μｌ ＰＢＳ）／匹／回とした。また陰性対照群として、同量のＤＭＳＯのみを投与したものも用意した。そして、移植後２１日（３週間）のマウスの腫瘍径を計測し、腫瘍体積を算出して対照群との比較を行った。得られた結果を図２に示す。なお図２中、縦軸は腫瘍体積の平均値（ｍｍ３）を示し、１０００ｍｍ２付近の横軸に平行な線は、陰性対照群における腫瘍体積の平均値を示す。
図２に示した結果から明らかなように、実施例１において選択され、かつ実施例２においても選択された２４化合物のうち、５化合物（ｃｈｅｍ０４、ｃｈｅｍ０９、ｃｈｅｍ１３、ｃｈｅｍ１６及びｃｈｅｍ２４）がｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗癌活性を有する化合物として選択された。
（実施例４）
実施例３において選択された ｃｈｅｍ０９及びｃｈｅｍ１３について、以下に示す腫瘍細胞株を用いた方法にて、これらのオルタナティブオートファジー誘導活性を確認した。
ｃｈｅｍ０９及びｃｈｅｍ１３を各々「化合物＃０９」及び「化合物＃１３」とも称する。また、各化合物の構造は下記の通りである。なお、化合物＃０９（ＳＴＯＣＫ３Ｓ−９４４５３）及び＃１３（ＳＴＯＣＫ４Ｓ−３２８１１）はサプライヤーＩＢＳ社より購入したものを本実施例及び以下の実施例に供した。
前記式にて「Ｅｔ」はエチル基（Ｃ２Ｈ５基）を示し、「Ａｃ」はアセチル基（Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３基）を示す（以下、同様）。
＜オルタナティブオートファジー誘導活性の評価＞
前述のＬａｍｐ１−ＧＦＰ／ＡＴＧ５−ＫＯ ＭＥＦを用いた＜オルタナティブオートファジー誘導活性の評価＞と同様にして、ｐ５３欠損Ｃ５７／Ｂ６Ｊマウスに自然発生した腫瘍より樹立した腫瘍細胞株（「５３Ｔ」とも称する）に化合物＃０９又は＃１３を最終濃度２０μＭとなるように培養液に添加し、その６時間後に蛍光顕微鏡及び電子顕微鏡にて観察した。なお、本評価においては、Ｌａｍｐ１の代わりにＬａｍｐ２を用いた。得られた結果を図３〜６に示す。
図３〜６に示した結果から明らかなように、化合物＃０９又は♯１３を投与したｐ５３欠損癌細胞において、リソソームタンパク質 Ｌａｍｐ２の凝集並びにオ―トファジーの発生が観察された。従って、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（化合物＃０９及び♯１３）は、癌細胞において、オルタナティブオートファジーを誘導できることが確認された。
（実施例５）
以下に示す腫瘍細胞株を用いた方法にて、化合物＃０９及び＃１３の抗癌活性を確認した。
＜ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗癌活性の評価＞
先ず、マウス腫瘍細胞株 ５３Ｔを２ｘ１０４／ｗｅｌｌになるように、９６ｗｅｌｌプレートに播種した。そして、その翌日に、ＤＭＳＯに溶解させた化合物＃０９又は♯１３を最終濃度１、５、１０、２０又は５０μＭとなるように添加した。また、陰性対照としてＤＭＳＯのみを添加したものも用意した。次いで、３７℃、１０％ＣＯ２にて２４時間培養した後、Ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｂｌｕｅ（ＣＴＢ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添付のプロトコールの通りに使用し、ＣＴＢ試薬を添加してから１０分後の各細胞の蛍光発色量を、化合物＃０９又は♯１３と接触させた細胞におけるＣＴＢ計測値として、かかる計測値に基づき、下記式にて化合物＃０９及び♯１３の細胞死誘導率を算出した。
細胞死誘導率＝（陰性対照におけるＣＴＢ計測値−化合物添加細胞におけるＣＴＢ計測値）／陰性対照におけるＣＴＢ計測値
得られた結果を表１に示す。
表１に示した結果から明らかなように、化合物＃０９及び＃１３ともに、最終濃度５０μＭにて２４時間刺激することにより、９０％以上の腫瘍細胞株に細胞死を誘導できることが明らかになった。従って、本発明のスクリーニング方法によって、抗癌活性を有する化合物を選択できることが確認された。
（実施例６）
化合物＃０９及び＃１３について、以下に示す正常細胞及び癌細胞を用いた方法にて、これらの細胞死を誘導する活性が、癌細胞に対して特異的なものであるかどうかを調べた。
＜癌細胞特異的に細胞死を誘導する活性についての評価＞
前述の＜ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗癌活性の評価＞と同様にして、初代線維芽細胞（正常細胞）又はＳＶ４０で不死化した線維芽細胞（癌細胞）に、化合物＃０９又は＃１３を最終濃度２０μＭとなるように培養液に添加して得られたＣＴＢ計測値に基づき、細胞生存率を経時的に算出した。なお、細胞生存率は、１−細胞死誘導率とした。得られた結果を図７及び８に示す。
図７及び８に示した結果から明らかなように、化合物＃０９及び＃１３共に、正常細胞に対して細胞死を殆ど誘導しなかったが、癌細胞に対しては顕著な細胞死誘導活性を示した。従って、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（化合物＃０９及び＃１３）は、癌細胞に対して特異的に細胞死を誘導できることが確認された。
（実施例７）
以下に示す担癌マウスを用いた方法にて、化合物＃０９及び＃１３のｉｎ ｖｉｖｏにおける抗癌活性を確認した。
＜ｉｎ ｖｉｖｏにおける、抗癌活性を有する化合物の選択＞
５３Ｔを、野生型Ｃ５７／Ｂ６Ｊマウスの腹側皮内４箇所に３ｘ１０５細胞ずつ移植し、翌日より隔日で５回、化合物＃０９又は＃１３を、０（ＤＭＳＯのみ）、５、１０又は２０μＭにて、マウス６匹ずつに投与した。そして、移植後２１日（３週間）のマウスの腫瘍径を計測し、腫瘍体積を算出した。得られた結果を図９及び１１に示す。なお、図９及び１１において、各点は、マウス１匹における４カ所の腫瘍の平均体積を表わす。
また、前記と同様にして、５３Ｔをマウスに移植し、その翌日より隔日にて５回、化合物＃０９を１０μＭの濃度にて、化合物＃１３は５μＭの濃度にて、担癌マウス４匹ずつに投与した。そして、移植後２１日（３週間）のマウスの腫瘍径を計測し、腫瘍体積を算出した。また、陰性対照としてＤＭＳＯを投与した群も調製し、同様に腫瘍体積を算出した。そして、これらの実験を独立して３度行った。得られた結果を図１０及び１２に示す。なお、図１０及び１２において、各点は、マウス１匹における４カ所の腫瘍の平均体積を表わす。
図９〜１２に示した結果から明らかなように、化合物＃０９及び＃１３共に、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗癌活性を示した。特に、図９に示す通り、化合物＃０９の抗癌活性は用量依存的な活性であることが確認された。また図１１に示す通り、化合物＃１３については５μＭという低濃度にて投与しても、顕著な抗癌活性が示されることが確認された。
（実施例８）
以下に示す方法にて、化合物♯０９及び＃１３について、各化合物を投与した担癌マウスの生存率を調べた。また対照として既に臨床にて抗癌剤として使用されているエトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）も担癌マウスに投与し、その生存率を調べた。すなわち、前述の＜ｉｎ ｖｉｖｏにおける、抗癌活性を有する化合物の選択＞と同様にして、野生型Ｃ５７／Ｂ６Ｊマウスの腹側皮内４箇所に３ｘ１０５細胞ずつ５３Ｔをマウスに移植し、その翌日より隔日にて５回、化合物＃０９又は＃１３を１０μＭにて担癌マウス１２匹ずつに投与した。また、対照としてエトポシドも１０μＭにて担癌マウスに投与した。さらに、陰性対照としてＤＭＳＯを投与した群も調製した。そして、これら担癌マウスの生存率を調べ、各化合物投与後の生存曲線を得た。得られた結果を図１３〜１５に示す。
図１３〜１５に示した結果から明らかなように、担癌マウスの生存率において、化合物♯０９及び＃１３はエトポシドよりも高い改善効果を示した。従って、本発明のスクリーニング方法によって、既存の抗癌剤よりも強い癌治療効果を有する化合物を選抜できることが明らかになった。また、化合物♯０９は、既存の抗癌剤よりも強い癌治療効果を有する化合物であることが明らかになった。
（実施例９）
化合物＃０９及びその類似化合物について、実施例１に記載の方法と同様の方法にて、各化合物のオルタナティブオートファジー誘導能を評価した。また、これら化合物について、実施例５に記載の方法と同様の方法にて、各化合物の抗癌活性を評価した。得られた結果を図１６及び１７に示す。化合物＃０９及びその類似化合物の構造は以下の通りである。なお、これら類似化合物は、Ｐｈａｒｍｅｋｓ社（ロシア）から購入した。
図１６及び１７に示した結果から明らかなように、オルタナティブオートファジー誘導活性を有していない化合物＃０９の類似化合物（化合物＃３７、＃３８、＃４０、＃４２、＃４４及び＃４６）については、抗癌活性が認められなかった。一方、オルタナティブオートファジー誘導活性を有する化合物＃０９及びその類似化合物においては、その殆どにて抗癌活性が認められた。なお、化合物♯３６及び♯４７については、低濃度にて添加しても強い殺細胞効果（ネクローシス）を示し、毒性が強いため、生体への投与は困難であると判定した。
従って、本発明のスクリーニング方法における、リソソームタンパク質の凝集による蛍光輝点の発生を指標として、オートファジーを誘導する活性を有する化合物を選択する工程の有用性が実証された。
（実施例１０）
化合物＃０９の類似化合物として、下記構造式からなる新規ベンゾチオフェン化合物（ＴＭＤ−４５９及びＴＭＤ−４６０）を設計し、合成した。
すなわち、下記に示す材料及び方法にて、先ず、「Ｇｒｉｎｅｖ．Ａ．Ｎ．ら、「２−（アシルアミノ）−７−ヒドロオキシベンゾ［ｂ］チオフェン誘導体の合成 臭素化及びニトロ化」、Ｋｈｉｍｉｙａ Ｇｅｔｅｒｏｓｉｋｌｉｃｈｅｓｋｉｋｈ Ｓｏｅｄｉｎｅｎｉｉ、１９８７年、４巻、４６０〜４６２ページ」の記載に沿って、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅを合成し、化合物＃９へと誘導した。次に、化合物＃９からＴＭＤ−４５９及びＴＭＤ−４６０を合成した。
＜材料及び方法＞
（１） クロマトグラフィー
分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、あらかじめシリカゲルが塗布されたガラスプレート（ＭＥＲＣＫ ５７１５、ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４）を用いて行った。スポット検出は、紫外線ランプ（２５４ｎｍ）、ヨウ素吸着、過マンガン酸カリウム水溶液による呈色によって行った。
分取用フラッシュカラムクロマトグラフィーには、シリカゲル（和光純薬 ２９５−３４０６１，Ｐｒｅｓｅｐ（Ｒ）（Ｌｕｅｒ Ｌｏｃｋ） Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ（ＨＣ−Ｎ） Ｔｙｐｅ Ｌ）を用い、中圧分取液体クロマトグラフ（山善、ＥＰＣＬＣ−Ｗ−Ｐｒｅｐ ２ＸＹ Ａ−Ｔｙｐｅ）にて行った。
分取用薄層クロマトグラフィーは、シリカゲル（ＭＥＲＣＫ １．０７７４７．２５００，ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４）を塗布したガラスプレートを作製し、これを用いて行った。
（２） 核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル
１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル（５００ＭＨｚ）は、Ｂｒｕｋｅｒ社製、ＡＶＡＮＣＥ５００核磁気共鳴装置を用いて測定した。化学シフト（δ）は、ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ（（ＣＨ３）４Ｓｉ）（ＣＤＣｌ３中での測定；０ｐｐｍ）又は測定溶媒の非重水素化体由来のピーク（ＣＤ３ＯＤでの測定：３．３１ｐｐｍ；ＤＭＳＯ−ｄ６での測定：２．４９ｐｐｍ）を内部標準として相対的値として表した。シグナル***線様式の略語ｓ、ｄ、ｔ、ｑ、ｍ、ｂｒはそれぞれ単重線、二重線、三重線、四重線、多重線、幅広線を表す。
１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル（１２６ＭＨｚ）は、Ｂｒｕｋｅｒ社製、ＡＶＡＮＣＥ５００核磁気共鳴装置を用いて測定した。化学シフト（δ）は、測定溶媒の炭素由来のピーク（ＣＤＣｌ３中での測定：７７．０ｐｐｍ；ＣＤ３ＯＤでの測定：４９．０ｐｐｍ）を内部標準として相対的値として表した。
（３） 化学薬品
すべての試薬は特に記さない限り、市販のものをそのまま使用した。反応、抽出、クロマトグラフィー用の溶媒には、酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、脱水ジクロロメタン、脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、メタノール、１，４−ジオキサン、酢酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の市販品をそのまま用いた。
反応試薬は、以下に挙げる物を使用した。和光純薬工業株式会社からはｅｔｈｙｌ ２−ａｍｉｎｏ−４，５，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．３２５−８９５６２）、無水酢酸（Ｃａｔ．Ｎｏ．０１１−００２７６）、酢酸（Ｃａｔ．Ｎｏ．０１７−００２５６）、二クロム酸カリウム（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６３−０３６６５）、臭素（Ｃａｔ．Ｎｏ．０２０−０２４０３）、チオ硫酸ナトリウム（Ｃａｔ．Ｎｏ．１９７−０３５８５）、炭酸カリウム（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６２−０３４９５）、水酸化ナトリウム（Ｃａｔ．Ｎｏ．１９８−１３７６５）を、東京化成工業株式会社からはＮ−（２−クロロエチル）ジエチルアミン塩酸塩（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ０３０２）を購入し、そのまま反応に用いた。
（４） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−４，５，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅの合成
Ｅｔｈｙｌ ２−ａｍｉｎｏ−４，５，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（２５ｇ，１１１ｍｍｏｌ）、酢酸（１５０ｍＬ）、無水酢酸（１９ｍＬ，２００ｍｍｏｌ）の混合物を８５℃で２４時間撹拌した。この反応溶液に対して水１００ｍＬを加え、沈殿をろ取することで、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−４，５，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（３０ｇ，ｑｕａｎｔ．）を白色固体として得た；ＴＬＣ Ｒ ｆ＝０．３８（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）；１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．３８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），１．７６−１．８１（ｍ，４Ｈ），２．２５（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｔ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，２Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，２Ｈ），４．３２（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１１．２６（ｂｒ ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １４．５，２３．１，２３．２，２３．９，２４．６，２６．６，６０．７，１１１．５，１２６．９，１３０．９，１４７．８，１６６．９，１６７．１。
（５） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−４，５，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−７−ｏｘｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅの合成
Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−４，５，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（６．６ｇ，２５ｍｍｏｌ）に酢酸（３５ｍＬ）を加え、６０℃に加熱した後、二クロム酸カリウム（１０ｇ，５２ｍｍｏｌ）と蒸留水（１０ｍＬ）の懸濁液を、反応混合物が８０℃以上にならないようにゆっくり加えた後、６０℃で２４時間撹拌した。この反応混合物に対して重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した（×３）。有機層を飽和食塩水（×１）で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝４／１の後、酢酸エチルのみ）にて精製し、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−４，５，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−７−ｏｘｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（２．７３ｇ，９．７ｍｍｏｌ，３９％）を白色固体として得た；ＴＬＣ Ｒ ｆ＝０．４８（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）；１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．４３（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），２．１６（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），２．５７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），３．０７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），４．３９（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１１．５５（ｂｒ ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １４．５，２４．０，２６．８，３７．９，６１．５，１１２．１，１２７．７，１５０．１，１５６．２，１６６．３，１６７．９，１９２．７。
（６） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−ｈｙｄｒｏｌｏｘｙｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅの合成
アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−４，５，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−７−ｏｘｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（２．５ｇ，８．９ｍｍｏｌ）のクロロホルム（２５ｍＬ）溶液に対して、臭素（１．０ｍＬ，１９ｍｍｏｌ）のクロロホルム（５．０ｍＬ）溶液をゆっくり加えた後、３時間加熱還流（油浴温度７５℃）した。室温まで冷却し、室温で１６時間撹拌した後、チオ硫酸ナトリウム水溶液を加え、生成物を塩化メチレンで抽出した（×３）。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝４／１、１／１）にて精製し、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６，６−ｄｉｂｒｏｍｏ−４，５，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−７−ｏｘｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（２．９ｇ，６．６ｍｍｏｌ，７４％）を白色固体として得た。次に、アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６，６−ｄｉｂｒｏｍｏ−４，５，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−７−ｏｘｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（２．９ｇ，６．６ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）溶液に対して、炭酸カリウム（１．４ｇ，１０ｍｍｏｌ）の水（３．０ｍＬ）溶液を加え、３０分間加熱還流（油浴温度１２０℃）した。生じた灰色沈殿をろ取し、メタノールで洗浄することでｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（２．２ｇ，６．１ｍｍｏｌ，９３％）を灰色固体として得た；ＴＬＣ Ｒ ｆ＝０．２０（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）；１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １．５０（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），４．４８（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），５．８９（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），１１．７１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １４．６，２４．１，６１．４，１０３．３，１０６．４，１１７．１，１２１．５，１２９．４，１３５．６，１４６．７，１５３．５，１６６．７，１６８．３。
（７） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（化合物＃０９）の合成
アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（３３１ｍｇ，０．９３ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）溶液に対して、炭酸カリウム（４０３ｍｇ，２．９ｍｍｏｌ）とＮ−（２−クロロエチル）ジエチルアミン塩酸塩（３４１ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で１２時間撹拌した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（塩化メチレン／メタノール＝５０／１，１０／１）にて精製し、Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（１９０ｍｇ，４５％）をうす茶色固体として得た；ＴＬＣ Ｒ ｆ＝０．５６（塩化メチレン／メタノール＝１０／１）；１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １．１３（ｂｒ
ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ），１．５０（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．７０−２．７９（ｂｒ，４Ｈ），３．０４−３．０９（ｂｒ，２Ｈ），４．２７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），４．４８（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），１１．７０（ｂｒ ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １１．９，１４．６，２４．１，４７．８，５２．６，６１．５，７１．６（ｂｒ），１０６．６，１１０．３，１２０．４，１２９．１，１３１．１，１３５．３，１５０．５，１５３．１，１６６．６，１６８．３。
（８） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−ｂｒｏｍｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−４６０）の合成
アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（化合物＃０９）（４６ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２．０ｍＬ）とメタノール（２．０ｍＬ）との混合溶液に対して、０℃で水酸化ナトリウム水溶液（１．０Ｍ，０．２０ｍＬ，０．２０ｍｍｏｌ）を加えた。１時間撹拌後、濃縮し、分取用薄層クロマトグラフィー（展開溶媒 塩化メチレン／メタノール＝１０／１）にて精製し、ｅｔｈｙｌ ２−ａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−ｂｒｏｍｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−４６０）（３２．５ｍｇ，７８％）を茶色油状液体として得た；ＴＬＣ Ｒ ｆ＝０．３７（塩化メチレン／メタノール＝１０／１）；１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １．０９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ），１．４４（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），２．６９（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，４Ｈ），２．９８（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），４．１８（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），４．４０（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），６．６３（ｂｒ ｓ，２Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １２．０，１４．８，４７．８，５２．７，６０．３，７１．５，１００．３ １０８．４，１１９．５，１２３．８，１３０．９，１３８．９，１４９．８，１６４．８，１６６．２。
（９） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−ｐｈｅｎｙｌｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−４５９）の合成
アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（化合物＃０９）（２２ｍｇ，５０μｍｏｌ）、フェニルボロン酸（１０ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、リン酸カリウムｎ水和物（２３ｍｇ，ｃａ．１ｍｍｏｌ）、ｂｉｓ［ｄｉ−ｔ−ｂｕｔｙｌ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ］ｄｉｃｈｌｏｒｏｐａｌｌａｄｉｕｍ（１．８ｍｇ，２．５μｍｏｌ）のアセトニトリル（１．０ｍＬ）と水（０．１０ｍＬ）の溶液を１００℃で１２時間撹拌した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣を分取用薄層クロマトグラフィー（展開溶媒 塩化メチレン／メタノール＝１０／１）にて精製し、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−ｐｈｅｎｙｌｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−４５９）（１８ｍｇ，８２％）を黄色固体として得た。これをアセトニトリルで再結晶し、無色の結晶を得た；ＴＬＣ Ｒ ｆ＝０．５６（塩化メチレン／メタノール＝１０／１）；１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ０．８５−０．９９（ｂｒ，６Ｈ），１．５５（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），２．４１−２．５６（ｂｒ，４Ｈ），２．６６−２．７５（ｂｒ，２Ｈ），３．７０−３．７９（ｂｒ，２Ｈ），４．５３（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），７．３２−７．４８（ｍ，４Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），８．０７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），１１．７８（ｂｒ ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １１．８（ｂｒ），１４．６，２４．２，４７．６，５２．５（ｂｒ），６１．３，７１．２（ｂｒ），１０６．７，１１９．３，１２７．４，１２８．５８，１２８．６３，１２９．０，１２９．４０，１２９．４３，１３５．２，１３８．３，１５０．９，１５３．３，１６６．９，１６８．２。
そして、このようにして得られたこれら新規ベンゾチオフェン化合物（ＴＭＤ−４５９及びＴＭＤ−４６０）について、実施例１に記載の方法と同様の方法にて、各化合物のオルタナティブオートファジー誘導能を評価した。なお、実施例１０においては、各化合物が最終濃度が１０、２０、３０、４０又は５０μＭになるように培養液に添加した。また、化合物♯９も対照例として前記濃度にて培養液に添加した。そして、これら化合物を添加してから５時間後に、ＩＮＣＥＬＬ ＡＮＡＬＹＺＥＲ １０００にて、１ｗｅｌｌあたりランダムに５視野を撮影し、Ｌａｍｐ１−ＧＦＰの凝集による蛍光輝点の有無を目視にて判定した。
その結果、図には示さないが、１０μＭ以上の濃度の、化合物♯９、ＴＭＤ−４５９又はＴＭＤ−４６０にて刺激することにより、観察した視野における全ての細胞においてＬａｍｐ１−ＧＦＰの凝集が観察された。従って、これらベンゾチオフェン化合物のいずれにおいても、オルタナティブオートファジー誘導能を有していることが明らかになった。
（実施例１１）
ＴＭＤ−４６０及び化合物＃０９の細胞死を誘導する活性を、以下に示す方法にて評価した。
先ず、ＳＶ４０Ｔ抗原を導入して不死化した野生型マウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）を２ｘ１０４／ｗｅｌｌ、ｐｒｉｍａｒｙ ＭＥＦを２ｘ１０４／ｗｅｌｌになるように、９６ｗｅｌｌプレートに播種した。そして、その翌日に、化合物を最終濃度１０、２０、３０、４０又は５０μＭとなるよう各々添加した。また、陰性対照としてＤＭＳＯのみを添加したものも用意した。次いで、３７℃、１０％ＣＯ２にて２４時間培養した後、ＣＴＢを添付のプロトコールの通りに使用し、ＣＴＢ試薬を添加してから１０分後の各細胞の蛍光発色量を、ＴＭＤ−４６０又は化合物＃０９と接触させた細胞におけるＣＴＢ計測値として得、かかる計測値に基づき、下記式にて各化合物の細胞死誘導率を算出した。
細胞死誘導率＝（陰性対照におけるＣＴＢ計測値−化合物添加細胞におけるＣＴＢ計測値）／陰性対照におけるＣＴＢ計測値
得られた結果を表２に示す。
表２に示した結果から明らかなように、ＴＭＤ−４６０及び化合物＃０９ともに、最終濃度２０μＭにて２４時間刺激することにより、８０％以上のＳＶ４０Ｔ抗原によって不死化したＭＥＦに細胞死を誘導できることが明らかになった。
（実施例１２）
化合物＃０９の類似化合物として、下記構造式からなる新規ベンゾチオフェン化合物（ＴＭＤ−４７３、ＴＭＤ−５１１〜ＴＭＤ−５２０、ＴＭＤ−５９３及びＴＭＤ−５９４）を設計し、合成した。
（１０） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（３−ａｚｉｄｏ−５−ａｚｉｄｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−４７３）の合成
前記式にて「Ｍｅ」はメチル基（ＣＨ３基）を示す（以下、同様）。
アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（化合物＃０９）（２３ｍｇ，５０μｍｏｌ）、３−アジド−５−アジドメチルフェニルボロン酸（２２ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、リン酸カリウムｎ水和物（２３ｍｇ，ｃａ．１ｍｍｏｌ）、ｂｉｓ［ｄｉ−ｔ−ｂｕｔｙｌ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ］ｄｉｃｈｌｏｒｏｐａｌｌａｄｉｕｍ（１．８ｍｇ，３．０μｍｏｌ）のアセトニトリル（１．０ｍＬ）と水（０．１０ｍＬ）の溶液を８０℃で１２時間撹拌した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣を分取用薄層クロマトグラフィー（展開溶媒 塩化メチレン／メタノール＝１０／１）にて精製し、eｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（３−ａｚｉｄｏ−５−ａｚｉｄｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−４７３）（２３ｍｇ，８４％）を黄色固体として得た。これをアセトニトリルで再結晶し、無色の結晶を得た；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．６１（塩化メチレン／メタノール＝１０／１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ０．９２−０．９７（ｂｒ，６Ｈ），１．５２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．４５−２．５０（ｂｒ，４Ｈ），２．６８−２．７４（ｂｒ，２Ｈ），３．７２−３．７９（ｂｒ，２Ｈ），４．４０（ｓ，２Ｈ），４．５０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．００（ｓ，１Ｈ），７．３１（ｓ，１Ｈ），７．３８（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．０６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），１１．７５（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
（１１） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１１）の合成
アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（化合物＃０９）（２３ｍｇ，５１μｍｏｌ）、４−メトキシフェニルボロン酸（１５ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、リン酸カリウムｎ水和物（２３ｍｇ，ｃａ．１ｍｍｏｌ）、ｂｉｓ［ｄｉ−ｔ−ｂｕｔｙｌ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ］ｄｉｃｈｌｏｒｏｐａｌｌａｄｉｕｍ（１．７ｍｇ，２．５μｍｏｌ）のアセトニトリル（１．０ｍＬ）と水（０．１０ｍＬ）の溶液を８０℃で１２時間撹拌した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣を分取用薄層クロマトグラフィー（展開溶媒 塩化メチレン／メタノール＝１０／１）にて精製し、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１１）（２３ｍｇ，９６％）を黄色固体として得た。これをアセトニトリルで再結晶し、無色の結晶を得た；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．４７（塩化メチレン／メタノール＝１０／１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ０．９５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ），１．５２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．４８（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．７１（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７５（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），４．５０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），６．９６−７．００（ＡＡ’ＢＢ’，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５５−７．５９（ＡＡ’ＢＢ’，２Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），１１．７４（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
（１２） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１２）の合成
アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（化合物＃０９）（２３ｍｇ，５１μｍｏｌ）、４−ヒドロキシフェニルボロン酸（１４ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、リン酸カリウムｎ水和物（２３ｍｇ，ｃａ．１ｍｍｏｌ）、ｂｉｓ［ｄｉ−ｔ−ｂｕｔｙｌ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ］ｄｉｃｈｌｏｒｏｐａｌｌａｄｉｕｍ（１．４ｍｇ，２．０μｍｏｌ）のアセトニトリル（２．０ｍＬ）と水（０．２０ｍＬ）の溶液を８０℃で１２時間撹拌した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣を分取用薄層クロマトグラフィー（展開溶媒 塩化メチレン／メタノール＝１０／１）にて精製し、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１２）（１６ｍｇ，６８％）を黄色固体として得た。これをアセトニトリルで再結晶し、無色の結晶を得た；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．２２（塩化メチレン／メタノール＝１０／１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １．０５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ），１．５２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．６５（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．８６（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），４．５０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），６．８６−６．８９（ＡＡ’ＢＢ’，２Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４６−７．４９（ＡＡ’ＢＢ’，２Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），１１．７４（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
（１３） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１３）の合成
アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（化合物＃０９）（２２ｍｇ，５０μｍｏｌ）、４−ジメチルアミノフェニルボロン酸（１７ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、リン酸カリウムｎ水和物（２３ｍｇ，ｃａ．１ｍｍｏｌ）、ｂｉｓ［ｄｉ−ｔ−ｂｕｔｙｌ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ］ｄｉｃｈｌｏｒｏｐａｌｌａｄｉｕｍ（１．７ｍｇ，３．０μｍｏｌ）のアセトニトリル（１．０ｍＬ）と水（０．１０ｍＬ）の溶液を８０℃で１２時間撹拌した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣を分取用薄層クロマトグラフィー（展開溶媒 塩化メチレン／メタノール＝１０／１）にて精製し、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１３）（１４ｍｇ，５７％）を茶色固体として得た；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．３９（塩化メチレン／メタノール＝１０／１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ０．９５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ），１．５０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），２．４９（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．７３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．００（ｓ，６Ｈ），３．７７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），４．４９（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），６．７９−６．８２（ＡＡ’ＢＢ’，２Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５２−７．５５（ＡＡ’ＢＢ’，２Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），１１．７２（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
（１４） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１４）の合成
アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（化合物＃０９）（２４ｍｇ，５１μｍｏｌ）、４−フルオロフェニルボロン酸（１５ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、リン酸カリウムｎ水和物（２３ｍｇ，ｃａ．１ｍｍｏｌ）、ｂｉｓ［ｄｉ−ｔ−ｂｕｔｙｌ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ］ｄｉｃｈｌｏｒｏｐａｌｌａｄｉｕｍ（１．６ｍｇ，２．５μｍｏｌ）のアセトニトリル（２．０ｍＬ）と水（０．２０ｍＬ）の溶液を８０℃で１２時間撹拌した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣を分取用薄層クロマトグラフィー（展開溶媒 塩化メチレン／メタノール＝１０／１）にて精製し、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１４）（２２ｍｇ，９２％）を黄色固体として得た。これをアセトニトリルで再結晶し、無色の結晶を得た；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．５０（塩化メチレン／メタノール＝１０／１）１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ０．９４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ），１．５２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．４５（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．６９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），４．５０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．１０−７．１６（ｍ，２Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５８−７．６３（ｍ，２Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），１１．７４（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
（１５） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１５）の合成
アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（化合物＃０９）（２３ｍｇ，５０μｍｏｌ）、４−トリフルオロメチルフェニルボロン酸（１９ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、リン酸カリウムｎ水和物（２０ｍｇ，ｃａ．１ｍｍｏｌ）、ｂｉｓ［ｄｉ−ｔ−ｂｕｔｙｌ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ］ｄｉｃｈｌｏｒｏｐａｌｌａｄｉｕｍ（１．６ｍｇ，２．３μｍｏｌ）のアセトニトリル（２．０ｍＬ）と水（０．２０ｍＬ）の溶液を８０℃で１２時間撹拌した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣を分取用薄層クロマトグラフィー（展開溶媒 塩化メチレン／メタノール＝１０／１）にて精製し、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１５）（６．２ｍｇ，２４％）を茶色固体として得た；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．５６（塩化メチレン／メタノール＝１０／１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ０．８８−０．９６（ｂｒ，６Ｈ），１．５２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．３８−２．４８（ｂｒ，４Ｈ），２．６６−２．７２（ｂｒ，２Ｈ），３．７０−３．７５（ｂｒ，２Ｈ），４．５１（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６８−７．７１（ＡＡ’ＢＢ’，２Ｈ），７．７５−７．７８（ＡＡ’ＢＢ’，２Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），１１．７６（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
（１６） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（３−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１６）の合成
アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（化合物＃０９）（２４ｍｇ，５２μｍｏｌ）、３−メチルフェニルボロン酸（１４ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、リン酸カリウムｎ水和物（２３ｍｇ，ｃａ．１ｍｍｏｌ）、ｂｉｓ［ｄｉ−ｔ−ｂｕｔｙｌ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ］ｄｉｃｈｌｏｒｏｐａｌｌａｄｉｕｍ（１．６ｍｇ，２．５μｍｏｌ）のアセトニトリル（１．０ｍＬ）と水（０．１０ｍＬ）の溶液を８０℃で１２時間撹拌した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣を分取用薄層クロマトグラフィー（展開溶媒 塩化メチレン／メタノール＝１０／１）にて精製し、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（３−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１６）（２２ｍｇ，９０％）を黄色固体として得た。これをアセトニトリルで再結晶し、無色の結晶を得た；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．４２（塩化メチレン／メタノール＝１０／１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ０．９３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ），１．５２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．４６（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．７０（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），４．５０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．１６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄｄ，Ｊ＝７．６，７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３９−７．５２（ｍ，３Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），１１．７４（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
（１７） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（２−ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１７）の合成
アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（化合物＃０９）（２３ｍｇ，５０μｍｏｌ）、２−メチルチオフェニルボロン酸（１７ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、リン酸カリウムｎ水和物（２３ｍｇ，ｃａ．１ｍｍｏｌ）、ｂｉｓ［ｄｉ−ｔ−ｂｕｔｙｌ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ］ｄｉｃｈｌｏｒｏｐａｌｌａｄｉｕｍ（１．６ｍｇ，２．５μｍｏｌ）のアセトニトリル（２．０ｍＬ）と水（０．２０ｍＬ）の溶液を８０℃で１２時間撹拌した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣を分取用薄層クロマトグラフィー（展開溶媒 塩化メチレン／メタノール＝１０／１）にて精製し、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（２−ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１７）（１８ｍｇ，７３％）を茶色固体として得た；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．３６（塩化メチレン／メタノール＝１０／１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ０．９０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ），１．５０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ），２．３５−２．４２（ｍ，５Ｈ），２．６１（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７４−２．８３（ｂｒ，２Ｈ），４．４９（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．２０（ｄｄｄ，Ｊ＝１．２，７．２，７，２Ｈｚ，１Ｈ），７．２７−７．３９（ｍ，４Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），１１．７６（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
（１８） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１８）の合成
アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（化合物＃０９）（２４ｍｇ，５３μｍｏｌ）、４−ピリジルボロン酸（１２ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、リン酸カリウムｎ水和物（２３ｍｇ，ｃａ．１ｍｍｏｌ）、ｂｉｓ［ｄｉ−ｔ−ｂｕｔｙｌ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ］ｄｉｃｈｌｏｒｏｐａｌｌａｄｉｕｍ（１．６ｍｇ，２．５μｍｏｌ）のアセトニトリル（２．０ｍＬ）と水（０．２０ｍＬ）の溶液を８０℃で１２時間撹拌した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣を分取用薄層クロマトグラフィー（展開溶媒 塩化メチレン／メタノール＝１０／１）にて精製し、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１８）（６．０ｍｇ，２６％）を茶色固体として得た；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．２２（塩化メチレン／メタノール＝１０／１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ０．９６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ），１．５３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．５０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．７５（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．８０（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），４．５１（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５９−７．６２（ＡＡ’ＢＢ’，２Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．６６−８．６８（ＡＡ’ＢＢ’，２Ｈ），１１．７６（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
（１９） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（２−ｔｈｉｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１９）の合成
アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（化合物＃０９）（２３ｍｇ，５１μｍｏｌ）、２−チエニルボロン酸（１３ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、リン酸カリウムｎ水和物（２３ｍｇ，ｃａ．１ｍｍｏｌ）、ｂｉｓ［ｄｉ−ｔ−ｂｕｔｙｌ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ］ｄｉｃｈｌｏｒｏｐａｌｌａｄｉｕｍ（１．８ｍｇ，３．０μｍｏｌ）のアセトニトリル（１．０ｍＬ）と水（０．１０ｍＬ）の溶液を８０℃で１２時間撹拌した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣を分取用薄層クロマトグラフィー（展開溶媒 塩化メチレン／メタノール＝１０／１）にて精製し、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（２−ｔｈｉｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１９）（２０ｍｇ，８７％）を黄色固体として得た。これをアセトニトリルで再結晶し、無色の結晶を得た；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．４２（塩化メチレン／メタノール＝１０／１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １．０４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ），１．５２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．６０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．９４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），４．０１（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），４．４９（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．１１（ｄｄ，Ｊ＝３．６，５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｄｄ，Ｊ＝１．２，５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｄｄ，Ｊ＝１．２，３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），１１．７３（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
（２０） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（３−ｔｈｉｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５２０）の合成
アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−６−ｂｒｏｍｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（化合物＃０９）（２３ｍｇ，５０μｍｏｌ）、３−チエニルボロン酸（１３ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、リン酸カリウムｎ水和物（２３ｍｇ，ｃａ．１ｍｍｏｌ）、ｂｉｓ［ｄｉ−ｔ−ｂｕｔｙｌ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ］ｄｉｃｈｌｏｒｏｐａｌｌａｄｉｕｍ（１．８ｍｇ，３．０μｍｏｌ）のアセトニトリル（１．０ｍＬ）と水（０．１０ｍＬ）の溶液を８０℃で１２時間撹拌した。ろ過後、減圧濃縮し、残渣を分取用薄層クロマトグラフィー（展開溶媒 塩化メチレン／メタノール＝１０／１）にて精製し、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（３−ｔｈｉｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５２０）（２０ｍｇ，８６％）を黄色固体として得た。これをアセトニトリルで再結晶し、無色の結晶を得た；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．４２（塩化メチレン／メタノール＝１０／１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １．００（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ），１．５２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．５４（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．８１（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．８５（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），４．５０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３８（ｄｄ，Ｊ＝２．８，５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４９−７．５４（ｍ，２Ｈ），７．６７（ｄｄ，Ｊ＝１．２，２．８Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），１１．７３（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
（２１） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５９３）の合成
アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１１）（９．７ｍｇ，２０μｍｏｌ）のＴＨＦ（１．０ｍＬ）とメタノール（１．０ｍＬ）との混合溶液に対して、室温で水酸化ナトリウム水溶液（１．０Ｍ，０．１０ｍＬ，０．１０ｍｍｏｌ）を加えた。１時間撹拌後、濃縮し、分取用薄層クロマトグラフィー（展開溶媒 塩化メチレン／メタノール＝１０／１）にて精製し、ｅｔｈｙｌ ２−ａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５９３）（８．２ｍｇ，９３％）を黄色固体として得た；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．２２（塩化メチレン／メタノール＝１０／１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ０．９８−１．０２（ｂｒ，６Ｈ），１．４４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），２．４８−２．６０（ｂｒ，４Ｈ），２．６６−２．７３（ｂｒ，２Ｈ），３．７０−３．７５（ｂｒ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），４．４２（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），６．５５（ｂｒ ｓ，２Ｈ），６．９５−６．９８（ＡＡ’ＢＢ’，２Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５１−７．５４（ＡＡ’ＢＢ’，２Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）。
（２２） Ｅｔｈｙｌ ２−ａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５９４）の合成
アルゴン雰囲気下、ｅｔｈｙｌ ２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５１２）（９．４ｍｇ，２０μｍｏｌ）のＴＨＦ（１．０ｍＬ）とメタノール（１．０ｍＬ）との混合溶液に対して、室温で水酸化ナトリウム水溶液（１．０Ｍ，０．１０ｍＬ，０．１０ｍｍｏｌ）を加えた。１時間撹拌後、濃縮し、分取用薄層クロマトグラフィー（展開溶媒 塩化メチレン／メタノール＝１０／１）にて精製し、ｅｔｈｙｌ ２−ａｍｉｎｏ−７−［２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌｏｘｙ］−６−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＴＭＤ−５９４）（８．１ｍｇ，９５％）を無色固体として得た；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．１７（塩化メチレン／メタノール＝１０／１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １．０３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．４６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），２．５５−２．６２（ｂｒ，４Ｈ），２．７１−２．７５（ｂｒ，２Ｈ），３．７４−３．７８（ｂｒ，２Ｈ），４．４３（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），６．５７（ｂｒ ｓ，２Ｈ），６．８６−６．８９（ＡＡ’ＢＢ’，２Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４４−７．４７（ＡＡ’ＢＢ’，２Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）。
（実施例１３）
化合物＃０９及びその類似化合物（ＴＭＤ−４７３、ＴＭＤ−５１１〜ＴＭＤ−５２０、ＴＭＤ−５９３及びＴＭＤ−５９４）について、実施例１に記載の方法と同様の方法にて、各化合物のオルタナティブオートファジー誘導能を評価した。得られた結果を図１８に示す。
図１８に示した結果から明らかなように、これらベンゾチオフェン化合物（ＴＭＤ−４７３、ＴＭＤ−５１１〜ＴＭＤ−５２０、ＴＭＤ−５９３及びＴＭＤ−５９４）のいずれにおいても、オルタナティブオートファジー誘導能を有していることが明らかになった。
以上説明したように、本発明によれば、ベンゾチオフェン化合物を有効成分とするオルタナティブオートファジー誘導剤及び抗癌剤を提供することが可能となる。従って、本発明のベンゾチオフェン化合物を有効成分とする抗癌剤は、各種癌に対する治療及び予防（再発予防）において有用であり、特にアポトーシスに対する抵抗性を獲得している癌の治療等において有用である。
また、本発明においては、オルタナティブオートファジーを誘導する活性を指標とすることにより、抗癌活性を有する化合物を効率良くスクリーニングすることが可能となる。従って、本発明のスクリーニング方法は、各種癌に対する治療剤、予防剤（再発予防剤）の開発、特にアポトーシスに対する抵抗性を獲得している癌の治療剤等の開発に有用である。

Claims (10)

  1. 下記一般式（１）：
    ［式（１）中、Ｒ１は、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環、又は−Ｒ６−Ｒ７で表わされる基を示す。Ｒ２は、ハロゲン原子、水酸基、−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７、又は−Ｏ−Ｒ６−Ｒ８で表わされる基を示す。Ｒ３は、水素原子又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９で表わされる基を示す。Ｒ４は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基を示す。Ｒ５は、酸素原子又はイミノ基を示す。また式（１）中、Ｒ６は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立に、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキレン基を示す。Ｒ７は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立に、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、炭素数が２〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルケニル基、又は炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示す。Ｒ８は、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。Ｒ９は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環、又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。］
    で表されるベンゾチオフェン化合物を有効成分とするオルタナティブオートファジー誘導剤。
  2. 下記一般式（１）：
    ［式（１）中、Ｒ１は、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環、又は−Ｒ６−Ｒ７で表わされる基を示す。Ｒ２は、ハロゲン原子、水酸基、−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７、又は−Ｏ−Ｒ６−Ｒ８で表わされる基を示す。Ｒ３は、水素原子又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９で表わされる基を示す。Ｒ４は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基を示す。Ｒ５は、酸素原子又はイミノ基を示す。また式（１）中、Ｒ６は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立に、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキレン基を示す。Ｒ７は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立に、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、炭素数が２〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルケニル基、又は炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示す。Ｒ８は、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。Ｒ９は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環、又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。］
    で表されるベンゾチオフェン化合物を細胞に導入する工程を含む、オルタナティブオートファジーを誘導するための方法。
  3. 下記（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択される少なくとも一つのベンゾチオフェン化合物
    （ａ） 下記一般式（１）：
    ［式（１）中、Ｒ１は、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。Ｒ２は、ハロゲン原子、水酸基、−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７、又は−Ｏ−Ｒ６−Ｒ８で表わされる基を示す。Ｒ３は、水素原子又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９で表わされる基を示す。Ｒ４は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基を示す。Ｒ５は、酸素原子又はイミノ基を示す。また式（１）中、Ｒ６は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキレン基を示す。Ｒ７は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、炭素数が２〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルケニル基、又は炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示す。Ｒ８は、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。Ｒ９は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族炭素環、又は置換基を有していてもよい５〜１０員環の芳香族複素環を示す。］
    で表されるベンゾチオフェン化合物
    （ｂ） 前記一般式（１）：
    ［式（１）中、Ｒ１は、ハロゲン原子を示す。Ｒ２は、ハロゲン原子、水酸基、又は−Ｏ−Ｒ６−Ｒ７で表わされる基を示す。Ｒ３は、水素原子で表わされる基を示す。Ｒ４は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基を示す。Ｒ５は、酸素原子又はイミノ基を示す。また式（１）中、Ｒ６は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状又は環状のアルキレン基を示す。Ｒ７は、炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルキル基、炭素数が２〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のアルケニル基、又は炭素数が１〜６である直鎖状、分岐状若しくは環状のヒドロキシアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示す。］
    で表されるベンゾチオフェン化合物。
  4. 請求項３に記載のベンゾチオフェン化合物を有効成分とする抗癌剤。
  5. 請求項３に記載のベンゾチオフェン化合物を患者に投与する工程を含む、癌を治療するための方法。
  6. 下記（ａ）の工程を含む、抗癌活性を有する化合物をスクリーニングするための方法
    （ａ）蛍光タンパク質が付加しているリソソームタンパク質を発現している細胞と、被験化合物とを接触させ、前記リソソームタンパク質の凝集による蛍光輝点の発生を指標として、オルタナティブオートファジーを誘導する活性を有する化合物を選択する工程。
  7. 下記（ｂ）の工程をさらに含む、請求項６に記載の方法
    （ｂ）細胞と被験化合物とを接触させ、接触後の前記細胞の生存率を指標として、細胞死を誘導する活性を有する化合物を選択する工程。
  8. 工程（ｂ）において、前記細胞が初代培養細胞及び不死化細胞であり、前記初代培養細胞の生存率が８０％以上であり、且つ前記不死化細胞の生存率が３０％以下であることを前記指標とする、請求項７に記載の方法。
  9. 工程（ｂ）において、前記細胞がアポトーシス抵抗性細胞であり、前記生存率が２０％以下であることを前記指標とする、請求項７に記載の方法。
  10. 下記（ｃ）の工程をさらに含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法
    （ｃ）工程（ａ）においてオルタナティブオートファジーを誘導する活性を有する化合物として選択され、且つ工程（ｂ）において細胞死を誘導する活性を有する化合物として選択された化合物を、担癌非ヒト動物に導入し、当該担癌非ヒト動物が担持する癌の大きさを測定し、得られた測定値が、当該被験化合物を導入していない担癌非ヒト動物が担持する癌の大きさの測定値より小さい場合、当該被験化合物を抗癌活性を有する化合物として選択する工程。
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