JPWO2008087909A1 - 医療用粒子、及び分析用粒子、並びにそれらの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の第二の課題は、目的とする生体分子の捕捉能力に優れ、洗浄工程における溶解や劣化の少ない化学的・物理的安定性を有する分析用粒子を提供すること、さらには前記特性に加えてタンパク質等に対して非特異的吸着がより少なく、SN比の高い分析用粒子を提供することである。
(1)核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該粒子表面に高分子化合物を含む層を形成した医療用粒子、
(2)前記重合性成分が、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含む(1)に記載の医療用粒子、
(3)生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーの官能基が、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、及びビオチンから選ばれる少なくとも一つの官能基である(1)又は(2)に記載の医療用粒子、
(4)生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーが下記の一般式[1]で表される活性エステル基を有するモノマーである(1)〜(3)のいずれかに記載の医療用粒子、
(5)前記活性エステル基がp−ニトロフェニルエステル又はN−ヒドロキシスクシンイミドエステルである(4)に記載の医療用粒子、
(6)前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが下記の一般式[2]で表されるモノマーを含む(2)〜(5)のいずれかに記載の医療用粒子、
(7)前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、メトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレート及び/又はエトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレートを含む(2)〜(6)項のいずれかに記載の医療用粒子、
(8)前記メトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレート及び/又はエトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数が3〜100である(7)に記載の医療用粒子、
(9)前記重合性官能基がメタクリル基、アクリル基、及びビニル基よりなる群から選ばれる1種以上である(1)〜(8)のいずれかに記載の医療用粒子、
(10)前記連鎖移動基がメルカプト基である(1)〜(8)のいずれかに記載の医療用粒子、
(11)前記核となる粒子が無機材料からなる(1)〜(10)のいずれかに記載の医療用粒子、
(12)前記無機材料が無機酸化物からなる(11)に記載の医療用粒子、
(13)前記無機酸化物が酸化ケイ素である(12)に記載の医療用粒子、
(14)前記核となる粒子の表面への重合性官能基、または連鎖移動基の導入が、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤と核となる粒子表面の官能基との共有結合の形成によってなされる(1)〜(13)のいずれかに記載の医療用粒子、
(15)前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤が重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランである(14)に記載の医療用粒子、
(17)更に、重合性官能基、または連鎖移動基を導入した核となる粒子と重合性モノマーを溶媒中で混合することにより重合反応を進行させる工程、及び乾燥する工程を含む(16)に記載の医療用粒子の製造方法、
(18)前記重合反応がラジカル重合反応である(17)に記載の医療用粒子の製造方法、
(20)前記重合性成分がアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含む(19)に記載の分析用粒子、
(21)前記生理活性物質を固定化する官能基がアルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、及びビオチンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの官能基である(19)又は(20)に記載の分析用粒子、
(22)前記生理活性物質が核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、抗原、プロテインA,プロテインG、リガンド、ペプチド、グルタチオン、低分子化合物、ビオチン、糖鎖、レクチン、及び糖タンパクよりなる群から選ばれる少なくとも一つである(19)〜(21)のいずれかに記載の分析用粒子、
(24)前記リン酸塩緩衝液のリン酸塩濃度が0.1M以上5M以下である(23)に記載の分析用粒子の製造方法、
(25)前記リン酸塩がリン酸2水素カリウム、リン酸2水素ナトリウム、リン酸水素2カリウム、又はリン酸水素2ナトリウムである(23)又は(24)に記載の分析用粒子の製造方法、
(26)(19)〜(22)のいずれかに記載の分析用粒子を、標的生体分子の溶解液、血液、血漿、血清、細胞破砕液、細胞培養液、及び組織破砕液から選ばれる少なくとも一つの溶液に接触させることにより標的生体物質を回収することを特徴とする分析用粒子の使用方法、
である。
更に、本発明によれば、目的とする生体分子の捕捉能力に優れ、洗浄工程において表面の高分子化合物を含む層の溶解や劣化の少ない、化学的・物理的安定性を有する分析用粒子を提供することができる。また、高分子化合物の成分にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーからなる成分を加えることにより、タンパク質等の非特異的吸着がより少ない分析用粒子を提供することができる。
また、本発明の分析用粒子は、生体分子の相互作用を分析するための粒子であって、核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該粒子表面に高分子化合物を含む層を形成し、次いで高分子化合物を含む層の生理活性物質を固定化する官能基を介して生理活性物質を固定化した分析用粒子である。
Xの繰り返し数pは1〜100の整数であり、より好ましくは2〜90の整数であり、最も好ましくは2〜80の整数である。各種pの混合物が用いられる場合には、重合体としては、pは平均値として特定される。繰り返し数pが2以上の場合は、繰り返されるXは同一であっても、異なっていてもよい。
生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーとは異なるアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの構造は特に限定しないが、一般式[2]で表される(メタ)アクリル基と炭素数1〜10のアルキレングリコール残基Yの連鎖からなる化合物であることが好ましい。
例えば、核となる粒子が二酸化ケイ素である場合、ESCAによる測定により、粒子表面の高分子化合物に由来する炭素元素と二酸化ケイ素粒子に由来するケイ素元素のピーク強度比(C/Si)から、二酸化ケイ素粒子表面に存在する高分子化合物の量を比較定量することができる。核となる粒子が二酸化ケイ素である場合、本発明の粒子は、粒子表面の高分子化合物に由来する炭素元素と二酸化ケイ素粒子に由来するケイ素元素のピーク強度比(C/Si)が1.0以上であることを達成可能である。前記ピーク強度比(C/Si)の上限は特に限定されないが、前記(C/Si)が5.0以下を目安とすることができる。ここでESCAによる測定は、X線光電子分光装置(例えば、アルバックファイ社製、ESCA5400MC)を用いて、例えば、分析表面:1.0×3.5mm、X線源:MgKα線、出射角:45degという条件で測定できる。
また、例えば、核となる粒子が無機材料である場合、元素分析により、本発明の粒子中の高分子化合物量を、粒子中の炭素元素含有量として定量することができる。核となる粒子が無機材料である場合、本発明の粒子は、粒子中の炭素元素含有量が10〜40重量%であることを達成可能である。ここで元素分析は、元素分析装置(例えば、パーキンエルマー2400II型元素分析装置)を用いて行うことができる。
生理活性物質を溶解した溶液を粒子に接触させる方法はさまざまであるが、たとえば容器に粒子を取り分けた後、溶液を分注し、攪拌する方法や、粒子をカラム状に充填し、溶液を送液することにより接触させる方法などがある。
分析用粒子に固定化した生理活性物質が捕捉した物質である標的生体物質を回収する方法は、特に限定するものではなく、分析用粒子を検体溶液中に浸し、捕捉物質と生理活性物質の反応を行い、粒子上に捕捉物質を固定化し、ついで捕捉物質が固定化した粒子を塩濃度やpHを調整した溶液、または界面活性剤を含む溶液、交換反応を行うための化学種を含む溶液等に浸し、捕捉物質を遊離させる方法などが挙げられる。回収した物質を定量する方法としては、特に限定するものではなく、捕捉された物質に由来する特定波長の吸収や蛍光などを分光光度法で定量する方法や、SDS-PAGEなどが挙げられる。
かくして、本発明の分析用粒子は捕捉物質を精製回収する担体として好適に用いることができる。
また、本発明の分析用粒子をマイクロ流路への充填剤としても用いることができ、微量検体からの物質回収、免疫分析、イムノクロマト法など各用途に用いることができる。
(p−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート(MEONP)の合成)
0.01molのポリエチレングリコールモノメタクリレート(日本油脂株式会社製Blenmer PE−200)を20mLのクロロホルムに溶解させた後、−30℃まで冷却した。−30℃に保ちながらこの溶液に、予め作製しておいた0.01molのp−ニトロフェニルクロロフォーメート(Aldrich社製)と0.01molのトリエチルアミン(和光純薬工業株式会社製)及びクロロホルム20mLの均一溶液をゆっくりと滴下した。−30℃にて1時間反応させた後、室温でさらに2時間溶液を撹拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してp−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート(以下MEONPと記載)粗体を得た。さらに、得られた粗体をシリカゲルカラムにて精製を行った。得られたモノマーを重クロロホルム溶媒中1H―NMRで測定し、エチレングリコール残基が4.5単位含まれていることを確認した。
メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン(信越化学工業株式会社製LS3380)7.45gをpH3.0の酢酸水溶液39.3gに添加し、室温で1時間攪拌した。そこにシリカビーズ(平均粒径5μm、細孔径70Å、富士シリシア化学株式会社製SMB70−5)5gを投入し85℃で2時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、100℃で1時間加熱した。その後、得られたシリカビーズをエタノールで分散させて、室温で1時間振とうし、遠心分離により上澄みを除去する操作を2回繰り返し、さらに、エタノールで分散させてボルテックスミキサーで攪拌し、遠心分離により上澄みを除去する操作を5回繰り返した後、乾燥させた。
数平均分子量Mn=約475のポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、以下PEGMA475と記載、Aldrich社製)、MEONPを脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は0.2mol/L、それぞれのモル比はPEGMA475、MEONPの順に80:20である。そこにAIBNを0.004mol/Lになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、上記のメタクリロキシプロピルトリメトキシシランで処理したシリカビーズ1gを投入し、アルゴンガス雰囲気下、60℃で22時間反応させた。次いで、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、エタノールで分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を5回繰り返した後、吸引ろ過によりビーズを回収し、よく乾燥させた。
メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン(GELEST社製)13.0gをpH3.0の酢酸水溶液100gとエタノール100mlを混合した溶液に添加し、室温で1時間攪拌した。そこにシリカビーズ(平均粒径5μm、細孔径70Å、富士シリシア化学株式会社製SMB70−5)10gを投入し70℃で2時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、100℃で1時間加熱した。その後の洗浄、乾燥操作、及びPEGMA475、MEONPとの重合反応、重合反応後の洗浄、乾燥操作は実施例1と同様の方法で行った。
実施例I−1、及び実施例I−2で得られたシリカビーズ約37mgを0.1mol/Lの2−アミノエタノール(溶媒:pH9.5、0.05mol/LのTris−HCl緩衝液)で室温下、1時間処理し、MEONPの不活性化を行った。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液(PBS)で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を5回行い乾燥させた。得られたシリカビーズ10mgに5μg/mLの西洋わさびペルオキシダーゼ(以下HRPと記載)標識化抗体溶液(DakoCytomation社製Polyclonal Rabbit Anti−Mouse Immunogloblins/HRPをPBSで260倍に希釈)270μLを投入し、室温で30分間攪拌した後、遠心分離により上澄みを除去した。次いで、0.05%の濃度で非イオン性界面活性剤(SIGMA社製、TritonX100(T9284-100ML))を含むPBSを投入し、よく分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を15回繰り返した後、フィルターユニット(MILLIPORE社製、商標:Ultrafree−MC)を用いてシリカビーズを回収した。回収したシリカビーズにHRPの基質である3,3’,5,5’−Tetramethylbenzidine(以下TMBZと記載)溶液(住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ用発色キットより調製し使用)を加え室温で15分間攪拌することによりTMBZとシリカビーズ表面に非特異的に吸着したHRP標識化抗体とを反応をさせた後、反応停止液(住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ発色キットより使用)を加え反応を停止させた。その後、フィルターユニットによりシリカビーズと反応液を分離し、反応液における450nmの吸光度を測定した。この吸光度には主としてシリカビーズに非特異的に吸着されたHRP標識化抗体の量が反映される。
実施例I−1、及び実施例I−2で得られたシリカビーズ約37mgを50μg/mLのアビジン溶液(PIERCE製、NeutrAvidinTMBiotin−Binding ProteinをpH8.5のリン酸水素二カリウム緩衝液で希釈)と混合し37℃で4時間処理した後、遠心分離により上澄みを除去し、リン酸緩衝液(PBS)で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を5回行い、さらに0.1mol/Lの2−アミノエタノール(溶媒:pH9.5、0.05mol/LのTris−HCl緩衝液)で室温下、1時間処理し、MEONPの不活性化を行った。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液(PBS)で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を5回行い乾燥させた。得られたシリカビーズ10mgにアビジンと特異的に結合する5μg/mLのビオチン標識化HRP溶液(Zymed Laboratories,Inc.製、Biotinylated PeroxidaseをPBSで200倍に希釈)270μL、または5μg/mLのHRP標識化抗体溶液270μLを投入し、室温で30分間攪拌した後、遠心分離により上澄みを除去した。次いで、0.05%の濃度で非イオン性界面活性剤(SIGMA社製、TritonX100(T9284-100ML))を含むPBSを投入し、よく分散させた後、遠心分離により上澄みを除去する操作を15回繰り返し、フィルターユニット(MILLIPORE社製、商標:Ultrafree−MC)を用いてシリカビーズを回収した。回収したシリカビーズにTMBZ溶液(住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ用発色キットより調製し使用)を加え室温で15分間攪拌することによりTMBZとシリカビーズ表面に特異的に捕捉されたビオチン標識化HRP、又は非特異的に吸着したHRP標識化抗体とを反応をさせた後、反応停止液(住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ発色キットより使用)を加え反応を停止させた。その後、フィルターユニットによりシリカビーズと反応液を分離し、反応液における450nmの吸光度を測定した。この吸光度には上記操作においてビオチン標識化HRP溶液を投入した場合には、主としてシリカビーズに特異的に捕捉されたビオチン標識化HRPの量が反映され、HRP標識化抗体溶液を投入した場合には、主としてシリカビーズに非特異的に吸着されたHRP標識化抗体の量が反映される。
実施例I−1、及び実施例I−2で得られたシリカビーズを用いて、ESCAによる表面分析を行った。シリカビーズ表面の高分子化合物に由来する炭素元素とシリカビーズに由来するケイ素元素のピーク強度比(C/Si)から、シリカビーズ表面に存在する高分子化合物の量を比較定量することができる。
シリカビーズ(平均粒径5μm、細孔径70Å、富士シリシア化学株式会社製SMB70−5)をそのまま用い、前記と同様、非特異的吸着量評価、及びタンパク質の特異的捕捉評価を行った。
数平均分子量Mn=約1100のポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、以下PEGMA1100と記載、Aldrich社製)、MEONPを脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は0.3mol/L、それぞれのモル比はPEGMA1100、MEONPの順に70:30である。そこにさらに(3-メルカプトプロピル)ジメチルエトキシシラン(以下MPDESと記載、アヅマックス社製)およびAIBNをそれぞれ0.003mol/Lになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、60℃で6時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物の0.3wt%シクロヘキサノン溶液にシリカビーズ(平均粒径5μm、細孔径70Å、富士シリシア化学株式会社製SMB70−5)を投入し、ボルテックスミキサーでよく攪拌した。吸引ろ過によりビーズを回収し、よく乾燥させた後、150℃で2時間加熱処理を施した。
得られたシリカビーズを用い、前記と同様、表面分析、非特異吸着量評価、及びタンパク質の特異的捕捉評価を行った。
《実施例II−1》
0.5Mのリン酸水素二カリウム(和光純薬製:164−04295)水溶液中に一次抗体である抗マウスIgG2aが12μg/mlになるように調製された溶液を作製した。この溶液500μリットルに、上記実施例I−1で得られたシリカビーズ約10mgを入れ、37℃で4時間攪拌し、1次抗体を固定化した。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液(PBS)で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を5回行い乾燥させた。次いで0.1mol/Lの2−アミノエタノール(溶媒:pH9.5、0.05mol/LのTris−HCl緩衝液)で室温下、1時間処理し、MEONPの不活性化を行った。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液(PBS)で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を5回行い乾燥させて、分析用粒子を得た。
1.2Mのリン酸水素二カリウム(和光純薬製:164−04295)水溶液を用いた以外は実施例II−1と同様に操作した。
2.4Mのリン酸水素二カリウム(和光純薬製:164−04295)水溶液を用いた以外は実施例II−1と同様に操作した。
シリカビーズ(平均粒径5μm、細孔径70Å、富士シリシア化学株式会社製SMB70−5)をそのまま用いた。
上記実施例I−1で得られたシリカビーズ約37mgを0.1mol/Lの2−アミノエタノール(溶媒:pH9.5、0.05mol/LのTris−HCl緩衝液)で室温下、1時間処理し、MEONPの不活性化を行った。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液(PBS)で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を5回行い乾燥させた。
上記比較例I−2で得られたシリカビーズを用いた以外は実施例II−1と同様に操作した。
(抗原抗体反応1)
PBSバッファ(日水製薬製:組織培養用ダルベッコPBS(−)を純水1リットル中に9.6g溶解したバッファ)で10%に希釈したFBS(子牛血清)溶液を作製した。この溶液中に抗原であるマウスIgG2aを添加し20nmol/リットルとした溶液を作製した。この溶液をPBSバッファ(日水製薬製:組織培養用ダルベッコPBS(−)を純水1リットル中に9.6g溶解したバッファ)で10%に希釈したFBS(子牛血清)で1倍、2倍、3倍、4倍希釈溶液となるように希釈した。これらの希釈溶液および抗原であるマウスIgG2aを含まない10%FBS溶液各1mlを室温にて2時間、実施例II−1〜II−3、比較例II−1〜II−3で得られた分析用粒子1mgと接触させることにより抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後、遠心分離により上澄みを除去した後、0.05wt%の非イオン性界面活性剤Tween20(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製)を添加したリン酸緩衝液(PBS)で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を5回行った。
二次抗体であるHRP標識抗マウスIgG2aをPBSバッファ(日水製薬製:組織培養用ダルベッコPBS(−)を純水1リットル中に9.6g溶解したバッファ)に添加することにより20nmol/リットルの溶液を作製した。この溶液1mlと各ビーズ1mgとを室温にて2時間、抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後0.05wt%の非イオン性界面活性剤Tween20(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製)を添加したリン酸緩衝液(PBS)で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を5回行った。
最後にHRP発色試薬である、TMBZ発色キット(住友ベークライト株式会社製)を用いて発色反応を行った。発色剤100容量に対し基質液を1容量の割合で加え発色液とした。発色液を100μlに各ビーズ1mgを投入し、15分間暗所で静置させた後、停止液を100μl投入し発色反応を停止した。発色した溶液の450nmの吸光度をTECAN社製プレートリーダーを用いて測定した。
(抗原抗体反応1)
PBSバッファ(日水製薬製:組織培養用ダルベッコPBS(−)を純水1リットル中に9.6g溶解したバッファ)で10%に希釈したヒト血清溶液を作製した。この溶液中に抗原であるマウスIgG2aを添加し20nmol/リットルとした溶液を作製した。この溶液をPBSバッファ(日水製薬製:組織培養用ダルベッコPBS(−)を純水1リットル中に9.6g溶解したバッファ)で10%に希釈したヒト血清で4倍希釈溶液となるように希釈した。この希釈溶液1mlを室温にて2時間、実施例II−1〜II−3、比較例II−1〜II−3で得られた分析用粒子と接触させることにより抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後、遠心分離により上澄みを除去した後、0.05wt%の非イオン性界面活性剤Tween20(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製)を添加したリン酸緩衝液(PBS)で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を5回行った。
得られたビーズをグリシン―塩酸溶液(pH2.5)、30μlに分散させ、遠心分離により上澄液を回収した。得られた上澄液とlaemmli buffer(0.25MTrispH6.8、6%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、40%グリセリン、0.04%ブロモフェノールブルー水溶液)を1対1の割合で混合し、90℃で5分加熱した。冷却後各溶液を200Vで45分間電気泳動を行った。電気泳動を行ったゲルを銀染色(和光純薬製、銀染色MSキット、299−58901)することにより得られたバンドを解析した。
0.5Mのリン酸水素二カリウム(和光純薬製:164−04295)水溶液中に5’末端にアミノ基を有した鎖長24bpのオリゴDNA(TAGAAGCATTTGCGGTGGACGATG(配列番号1)(シグマジェノシス社製)を1μg/μlの濃度になるように調製された溶液を作製した。この溶液500μリットルに上記実施例I−1で得られたシリカビーズ約10mgを入れ、37℃で4時間攪拌し、DNAを固定化した。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液(PBS)で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を5回行い乾燥させた。次いで0.1mol/Lの2−アミノエタノール(溶媒:pH9.5、0.05mol/LのTris−HCl緩衝液)で室温下、1時間処理し、MEONPの不活性化を行った。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液(PBS)で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を5回行い乾燥させた。
1.2Mのリン酸水素二カリウム(和光純薬製:164−04295)水溶液を用いた以外は実施例II−4と同様に操作した。
4.5Mのリン酸水素二カリウム(和光純薬製:164−04295)水溶液中を用いた以外は実施例II−4と同様に操作した。
上記比較例I−2で得られたシリカビーズを用いた以外は実施例II−4と同様に操作した。
DNA溶液2; 5’末端にビオチン標識を有した鎖長24bpのオリゴDNA(CATCGTCCACCGCAAATGCTTCTA(配列番号2)(シグマジェノシス社製)を0.002μg/μlの濃度になるように3×SSC(ここで、SSCとは、SIGMA社製、SSC Buffer 20x Concentrate(S6639−1L)を20倍希釈したものをいい、組成は、クエン酸ナトリウム0.015mol/l、及び塩化ナトリウム0.15mol/lである。3×SSCとは、SSCを3倍に濃縮したものをいう。)、0.2%SDSの溶液に溶解した。
次に、この溶液と実施例II−4〜II−6、比較例II−1、II−2及びII−4で得られた分析用粒子1mgを接触させ、65℃で3時間攪拌することで、固定化されたオリゴDNAとビオチン標識オリゴDNAとのハイブリダイゼーションを行なった。その後、遠心分離により上澄を除去した後、2×SSC、0.5%SDS中で分散させ、遠心分離により上澄を除去する操作を5回行った。ついで各ビーズを0.1μg/mlのストレプトアビジン溶液に分散させ、30分間室温で攪拌した。遠心分離により上澄みを除去した後、0.05wt%の非イオン性界面活性剤Tween20(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製)を添加したリン酸緩衝液(PBS)で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を5回行った。
最後にHRP発色試薬である、TMBZ発色キット(住友ベークライト株式会社製)を用いて発色反応を行った。発色剤100容量に対し基質液を1容量の割合で加え発色液とした。発色液を100μlに各ビーズ1mgを投入し、15分間暗所で静置させた後、停止液を100μl投入し発色反応を停止した。発色した溶液の450nmの吸光度をTECAN社製プレートリーダーを用いて測定した。シグナル強度の結果を表5に示す。
0.5Mのリン酸水素二カリウム(和光純薬製:164−04295)水溶液中に鎖長18merのペプチド(CERIKIKALIPKNAGVSD)(株式会社免疫生物研究所社製)を10μg/μlの濃度になるように調製された溶液を作製した。この溶液500μリットルに上記実施例I−1で得られたシリカビーズ約10mgを入れ、37℃で4時間攪拌し、ペプチドを固定化した。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液(PBS)で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を5回行い乾燥させた。次いで0.1mol/Lの2−アミノエタノール(溶媒:pH9.5、0.05mol/LのTris−HCl緩衝液)で室温下、1時間処理し、MEONPの不活性化を行った。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液(PBS)で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を5回行い乾燥させた。
1.2Mのリン酸水素二カリウム(和光純薬製:164−04295)水溶液中を用いた以外は実施例II−7と同様に操作した。
4.5Mのリン酸水素二カリウム(和光純薬製:164−04295)水溶液中を用いた以外は実施例II−7と同様に操作した。
上記比較例I−2で得られたシリカビーズを用いた以外は実施例II−7と同様に操作した。
鎖長18merのペプチド(CERIKIKALIPKNAGVSD)をウサギに免疫し、このペプチドに対する抗体を作製した。得られた抗血清を用いて評価を行った。
得られたビーズをグリシン−塩酸溶液(pH2.5)、30μlに分散させ、遠心分離により上澄液を回収した。得られた上澄液とlaemmli buffer(0.25MTrispH6.8、6%SDS、40%グリセリン、0.04%ブロモフェノールブルー水溶液)を1対1の割合で混合し、90℃で5分加熱した。冷却後各溶液を200Vで45分間電気泳動を行った。電気泳動を行ったゲルを銀染色(和光純薬製、銀染色MSキット、299−58901)することにより得られたバンドを解析した。
Claims (26)
- 核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該粒子表面に高分子化合物を含む層を形成した医療用粒子。
- 前記重合性成分が、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含む請求の範囲第1項に記載の医療用粒子。
- 生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーの官能基が、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、及びビオチンから選ばれる少なくとも一つの官能基である請求の範囲第1項又は第2項に記載の医療用粒子。
- 前記活性エステル基がp−ニトロフェニルエステル又はN−ヒドロキシスクシンイミドエステルである請求の範囲第4項に記載の医療用粒子。
- 前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、メトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレート及び/又はエトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレートを含む請求の範囲第2項〜第6項のいずれかに記載の医療用粒子。
- 前記メトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレート及び/又はエトキシポリエチレングリコール(メタ)アクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数が3〜100である請求の範囲第7項に記載の医療用粒子。
- 前記重合性官能基がメタクリル基、アクリル基、及びビニル基よりなる群から選ばれる1種以上である請求の範囲第1項〜第8項のいずれかに記載の医療用粒子。
- 前記連鎖移動基がメルカプト基である請求の範囲第1項〜第8項のいずれかに記載の医療用粒子。
- 前記核となる粒子が無機材料からなる請求の範囲第1項〜第10項のいずれかに記載の医療用粒子。
- 前記無機材料が無機酸化物からなる請求の範囲第11項に記載の医療用粒子。
- 前記無機酸化物が酸化ケイ素である請求の範囲第12項に記載の医療用粒子。
- 前記核となる粒子の表面への重合性官能基、または連鎖移動基の導入が、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤と核となる粒子表面の官能基との共有結合の形成によってなされる請求の範囲第1項〜第13項のいずれかに記載の医療用粒子。
- 前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤が重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランである請求の範囲第14項に記載の医療用粒子。
- 請求の範囲第1項〜第15項のいずれかに記載の医療用粒子の製造方法であって、重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランを酸性水溶液中で加水分解する工程、次いで前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランの酸性水溶液中で核となる粒子を撹拌下、加熱する工程、及び乾燥後、更に加熱する工程、を含む医療用粒子の製造方法。
- 更に、重合性官能基、または連鎖移動基を導入した核となる粒子と重合性モノマーを溶媒中で混合することにより重合反応を進行させる工程、及び乾燥する工程を含む請求の範囲第16項に記載の医療用粒子の製造方法。
- 前記重合反応がラジカル重合反応であることを特徴とする請求の範囲第17項に記載の医療用粒子の製造方法。
- 生体分子の相互作用を分析するための粒子であって、核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該粒子表面に高分子化合物を含む層を形成し、次いで高分子化合物を含む層の前記生理活性物質を固定化する官能基を介して生理活性物質を固定化したことを特徴とする分析用粒子。
- 前記重合性成分がアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含む請求の範囲第19項に記載の分析用粒子。
- 前記生理活性物質を固定化する官能基がアルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、及びビオチンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの官能基である請求の範囲第19項又は第20項に記載の分析用粒子。
- 前記生理活性物質が核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、抗原、プロテインA,プロテインG、リガンド、ペプチド、グルタチオン、低分子化合物、ビオチン、糖鎖、レクチン、及び糖タンパクよりなる群から選ばれる少なくとも一つである請求の範囲第19項〜第21項のいずれかに記載の分析用粒子。
- 請求の範囲第19項〜第22項のいずれかに記載の分析用粒子の製造方法であって、高分子化合物を含む層を形成した粒子に生理活性物質をリン酸塩緩衝液に溶解した溶液を接触させる工程を含む分析用粒子の製造方法。
- 前記リン酸塩緩衝液のリン酸塩濃度が0.1M以上5M以下である請求の範囲第23項に記載の分析用粒子の製造方法。
- 前記リン酸塩がリン酸2水素カリウム、リン酸2水素ナトリウム、リン酸水素2カリウム、又はリン酸水素2ナトリウムである請求の範囲第23項又は第24項に記載の分析用粒子の製造方法。
- 請求の範囲第19項〜第22項のいずれかに記載の分析用粒子を、標的生体分子の溶解液、血液、血漿、血清、細胞破砕液、細胞培養液、及び組織破砕液から選ばれる少なくとも一つの溶液に接触させることにより標的生体物質を回収することを特徴とする分析用粒子の使用方法。
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