JP2000189197A - Ａｔｐ消去剤、ａｔｐ消去法および細胞内ａｔｐの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】（１）測定系のＡＴＰ、特に遊離ＡＴＰを効率
的に消去できるＡＴＰ消去剤、（２）測定系のＡＴＰ、
特に遊離ＡＴＰの消去法、（３）上記ＡＴＰ消去法と生
物発光法とを組合わせた、迅速かつ高感度な細胞内ＡＴ
Ｐの測定法、を提供すること。 【解決手段】ルシフェラーゼを有効成分とするＡＴＰ消
去剤、該ＡＴＰ消去剤を用いる測定系中のＡＴＰ消去法
および該ＡＴＰ消去剤を用いる細胞内ＡＴＰの測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ルシフェラーゼを有効
成分とするＡＴＰ消去剤、該ＡＴＰ消去剤を用いる測定
系のＡＴＰ消去法および該ＡＴＰ消去剤を用いる細胞内
ＡＴＰの測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】試料中の測定するべきＡＴＰ（以下「標
的ＡＴＰ」という）の測定は、各種工業分野において広
く行なわれている。食品衛生、バイオテクノロジー、臨
床検査、医学などの分野では、試料中の細胞の有無の判
定、試料中の生細胞数の測定等を目的として、細胞内Ａ
ＴＰの測定が行なわれている。

【０００３】細胞内ＡＴＰの測定法としては、生物発光
法を利用する方法が一般的である。生物発光とは、発光
性生物（発光細菌、ホタルイカ、昆虫ホタル等）の発光
器官で見られる発光現象である。生物発光は、発光基質
であるルシフェリンと、酵素であるルシフェラーゼとの
反応により生じる。昆虫ホタルの系では、ＡＴＰ、およ
びマグネシウムイオンの存在下、ルシフェリンと、ルシ
フェラーゼとの反応により光が生じる。ホタルルシフェ
ラーゼは、細胞内ＡＴＰの測定用試薬として広く使用さ
れている。

【０００４】生物発光法を利用する細胞内ＡＴＰの測定
法ではまず、細胞を含む試料をＡＴＰ抽出試薬と接触さ
せて、細胞内ＡＴＰを細胞外に抽出する。ＡＴＰ抽出試
薬としては、界面活性剤、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、
トリス緩衝液、エタノ−ル、溶菌酵素等を含むものが使
用されている。次いで、抽出されたＡＴＰを、ルシフェ
リンおよびルシフェラ−ゼを含む生物発光試薬（ルシフ
ェリン−ルシフェラーゼ発光試薬）と接触させ、この時
に生成した発光量を測定して細胞内ＡＴＰ量を求める。
上記分野における細胞数の測定法は、迅速且つ高感度で
あることが要求される。例えば食品衛生の分野では、製
品出荷のために製品の微生物汚染の検査は必要不可欠で
ある。

【０００５】従来、この検査は混釈培養法により行なわ
れているが、検査に１日以上を要するために、結果が出
るまで製品を倉庫に保管しておかなければならない。こ
のため流通効率の点で問題があるだけでなく、牛乳など
の製品では保管時間が長くなるにつれて微生物汚染の可
能性が高くなる。また食品で汚染を問題にする微生物濃
度は総じて低濃度であるため、高感度な検査が要求され
る。このため、生物発光試薬を使用する方法は、迅速且
つ高感度な細胞数の測定法として広く使用されている。

【０００６】ところで、ＡＴＰは、含有量の差こそあ
れ、すべての生物の細胞内に含まれるものである。この
ため、標的ＡＴＰの測定法においては、標的ＡＴＰ以外
のＡＴＰ（以下「遊離ＡＴＰ」という）が測定系（例え
ば、試料、培地、各種試薬、容器、測定器具・装置等）
に混入することによる測定感度の低下が問題となってい
た。すなわち、遊離ＡＴＰが測定系に混入した場合、遊
離ＡＴＰが標的ＡＴＰと同時に測定されるため、標的Ａ
ＴＰのみを正確に測定することが困難になる。作業者の
手指や空中の埃等に付着したＡＴＰは、遊離ＡＴＰとな
り得るが、これの測定系へ混入を防止することは困難で
ある。また、試料中の生細胞数を測定する場合、死細胞
から放出されたＡＴＰが遊離ＡＴＰとして作用するた
め、生細胞数の正確な測定が困難になるという問題があ
った。さらに、測定系において精製度の低い試薬を使用
する場合、該試薬に遊離ＡＴＰが混入しているおそれも
ある。例えば、酵母エキスを含む培地中に存在する微生
物の細胞数を、細胞内ＡＴＰ量に基づいて計数する場
合、酵母エキス由来の遊離ＡＴＰが大量に存在するた
め、細胞内ＡＴＰ量の正確な測定が困難になるという問
題があった。特に生物発光試薬を使用する細胞内ＡＴＰ
の測定法においては、遊離ＡＴＰがバックグランド発光
量（ノイズ）として同時に測定されることにより、測定
感度が低下するという点が問題であった。

【０００７】生物が存在する場所にはＡＴＰが存在する
ので、測定系への遊離ＡＴＰの混入を完全に防止するこ
とは非常に困難である。このため、標的ＡＴＰの測定法
においては、測定系へ混入した遊離ＡＴＰを効率的に除
去する方法の確立が求められていた。遊離ＡＴＰの除去
法としては、試料よりメンブレンフィルタ−を用いて除
去するメンブレンフィルタ−法、遠心分離により分離す
る遠心分離法が公知である。しかしながら、これらの方
法は、操作が非常に煩雑で、ＡＴＰ除去率も十分でない
という問題点を有している。上記以外の方法としては、
ＡＴＰ消去剤を用いて遊離ＡＴＰを消去する方法が知ら
れている。「ＡＴＰ消去剤」とは、以下の（１）または
（２）の活性を有する試薬のことである。 （１）ＡＴＰ分子を分解する活性。 （２）ＡＴＰ分子を、標的ＡＴＰの測定感度を低下させ
ないような他の分子に変換する活性。

【０００８】ＡＴＰ分解酵素を有効成分とするＡＴＰ消
去剤により遊離ＡＴＰを消去する方法（酵素法）は公知
である。酵素法は、操作が簡便であり、かつ遊離ＡＴＰ
の消去効率が高いという点で優れている。ＡＴＰ分解酵
素としては、例えば、アピラ−ゼ、アデノシントリホス
ファタ−ゼ（ＡＴＰａｓｅ）、ヘキソキナ−ゼまたはＡ
ＴＰピロホスファタ−ゼ等が挙げられる（月刊フ−ドケ
ミカル、食品化学新聞社発行、９５年５月号、第５５〜
６３ペ−ジ；特開平２−６５８００；ＵＳＰ５，３１
６，９０７、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ 第２１８巻 ２０−２５ページ １９９４
年、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓ
ｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｆ
ｉｓｈｅｒｉｅｓ 第５２巻 ９号 １６９５ページ
１９８６年、Ｍａｒｉｎｅ Ｅｃｏｌｏｇｙ−Ｐｒｏｇ
ｒｅｓｓ Ｓｅｒｉｅｓ １３巻 ３０５−３０９ペー
ジ １９８３年）。酵素法と、生物発光試薬とを組み合
わせて細胞内ＡＴＰを測定する方法も公知である。

【０００９】従来の酵素法では、どの程度遊離ＡＴＰが
消去できているかがわからないまま、操作を行わなけれ
ばならないという問題があった。すなわち、遊離ＡＴＰ
の消去状況の確認ができないために、遊離ＡＴＰの消去
時間が不十分である場合があった。また、必要以上に消
去時間をとりすぎた場合には、試料中の細胞が増殖して
しまうので、生細胞数を正確に測定できないという問題
もあった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は主とし
て、（１）測定系のＡＴＰ、特に遊離ＡＴＰを効率的に
消去できるＡＴＰ消去剤、（２）測定系のＡＴＰ、特に
遊離ＡＴＰの消去法、（３）上記ＡＴＰ消去法と生物発
光法とを組合わせた、迅速かつ高感度な細胞内ＡＴＰの
測定法、を提供することにある。

【００１１】なお、「ＡＴＰの消去」とは、測定系の全
てのＡＴＰ分子を消去することのみならず、標的ＡＴＰ
の測定に実質的に影響しない程度まで測定系のＡＴＰ
（特に遊離ＡＴＰ）の量を減少させることも意味する。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来生物
発光試薬の成分として使用されていたルシフェラーゼが
ＡＴＰ消去剤として有用であることを見出し、その知見
に基づいて本発明を完成した。

【００１３】すなはち本発明は、以下のＡＴＰ消去剤、
ＡＴＰ消去法および細胞内ＡＴＰの測定法に関する。 １．ルシフェラーゼを有効成分として含有するＡＴＰ消
去剤。 ２．ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含有するＡＴ
Ｐ消去剤。 ３．有効成分としてさらにＡＴＰ分解酵素を含有する、
１または２項記載のＡＴＰ消去剤。 ４．測定系に、１〜３項のいずれかに記載のＡＴＰ消去
剤を添加することを特徴とする、測定系のＡＴＰ消去
法。

【００１４】５．以下の工程を含むことを特徴とする、
細胞内ＡＴＰの測定法。 （１）細胞を含む試料に、１〜３項のいずれかに記載の
ＡＴＰ消去剤を添加し、試料中の遊離ＡＴＰを消去する
第１工程。 （２）第１工程で添加したＡＴＰ消去剤中の酵素活性を
失活させる第２工程。 （３）細胞内ＡＴＰを抽出する第３工程。 （４）抽出されたＡＴＰを測定する第４工程 ６．以下の工程を含むことを特徴とする、細胞内ＡＴＰ
の測定法。 （１）細胞を含む試料に、１〜３項のいずれかに記載の
ＡＴＰ消去剤を添加し、試料中の遊離ＡＴＰを消去する
第１工程。 （２）試料にＡＴＰ抽出試薬を添加して、細胞内ＡＴＰ
を抽出するとともに、第１工程で添加したＡＴＰ消去剤
中の酵素活性を失活させる第２工程 （３）抽出されたＡＴＰを測定する第３工程 ７．ＡＴＰ抽出試薬が界面活性剤である、６項に記載の
細胞内ＡＴＰの測定法。 ８．抽出されたＡＴＰの測定方法が、ルシフェリン−ル
シフェラーゼ発光試薬を使用する方法であることを特徴
とする、５〜７項のいずれかに記載の細胞内ＡＴＰの測
定法。 ９．ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬に含まれる
ルシフェラーゼが、ＡＴＰ抽出試薬に耐性を有すること
を特徴とする、８項に記載の細胞内ＡＴＰの測定法。

【００１５】

【発明の実施の形態】Ｉ．本発明のＡＴＰ消去剤につい
て 本発明のＡＴＰ消去剤は、ルシフェラーゼを有効成分と
して含有することを特徴とする。ルシフェラーゼとして
は、測定系のＡＴＰを消去する活性を有するものであれ
ば、どのような発光性生物を由来とするものであっても
よい。本発明では、例えば、ホタルイカ、昆虫等を由来
とするルシフェラーゼが使用できる。ルシフェラーゼと
しては、上記生物の発光器官から精製した天然型ルシフ
ェラーゼや、遺伝子工学的手法により調製した組み換え
型ルシフェラーゼ、さらには天然型ルシフェラーゼのア
ミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸に付加、欠失、
置換等の変異を導入した変異型ルシフェラーゼを使用す
ることができる。

【００１６】昆虫ルシフェラーゼのうち、特にホタル、
例えば、ゲンジボタル（Luciola cruciata）、ヘイケボ
タル（Luciola lateralis）、ヒメボタル（Hotaria pa
rvula）、アメリカ産ホタル（Photinus pyralis）等を
由来とするものは、入手が容易であり、本発明のルシフ
ェラーゼとして好適である。

【００１７】ＡＴＰ消去剤は、ルシフェラーゼ以外の他
の成分を含有していてもよい。他の成分としては、例え
ば、生物発光に必要な成分、具体的にはルシフェリンが
挙げられる。有効成分がホタルルシフェラーゼであるＡ
ＴＰ消去剤は、他の成分として、ホタルルシフェリン、
マグネシウムイオンを含有していることが好ましい。

【００１８】生物発光に必要な成分を含むＡＴＰ消去剤
を使用する場合、発光量の変化を測定することにより、
ＡＴＰの消去状況の確認が可能となる。

【００１９】ホタルルシフェラーゼは、ホタルルシフェ
リン、マグネシウムイオン等の存在下、以下の反応によ
りＡＴＰを消去する。

【００２０】

【化１】 ＡＴＰ消去効率をより向上させるため、ＡＴＰ消去剤
は、有効成分としてルシフェラーゼおよびＡＴＰ分解酵
素を含有することが好ましい。ＡＴＰ分解酵素として
は、例えば、アデノシンリン酸デアミナーゼ、アピラ−
ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘ
キソキナ−ゼ及びアデノシントリホスファタ−ゼが使用
できる。ＡＴＰ分解酵素は、単独で、また2種以上を混
合して使用できる。また、有効成分以外の他の成分とし
ては、賦形剤、分散剤、乳化剤、保存剤、防腐剤、ｐＨ
緩衝剤、吸湿剤等が使用可能である。ＡＴＰ消去剤に含
有される他の成分の種類や、有効成分との混合比等は特
に限定されず、ＡＴＰ消去剤の用途・操作性・測定系の
種類、試料の状態等に応じて適宜設定すれば良い。な
お、ＡＴＰ消去剤の形状は特に限定されず、固体状（例
えば、顆粒状、粉末状、錠剤状等）であっても、液体状
であってもよい。

【００２１】操作の簡便化のため、ＡＴＰ消去剤は液体
状であることが好ましい。その場合、有効成分であるル
シフェラーゼあるいはＡＴＰ分解酵素を、適当な緩衝液
（例えば、リン酸緩衝液、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝
液、メス（ＭＥＳ）緩衝液）に溶解すればよい。 ＩＩ．測定系のＡＴＰ消去法について 本発明のＡＴＰ消去法は、測定系に上記のＡＴＰ消去剤
を添加することを特徴とする。本発明は、測定系（例え
ば、試料、培地、各種試薬、容器、測定器具・装置等）
に混入あるいは付着したＡＴＰ（特に遊離ＡＴＰ）の消
去法として有用である。測定系に添加されるルシフェラ
ーゼの終濃度、ＡＴＰ消去剤と測定系との接触条件等
は、測定系の種類・性状等に応じて適宜設定すればよ
い。ＡＴＰ消去剤の添加は、例えば以下の方法により実
施できる。 （１）試料、培地、各種試薬等に、ＡＴＰ消去剤を添加
する。 （２）容器、測定器具・装置等を溶液状のＡＴＰ消去剤
により洗浄する。 以下、試料にＡＴＰ消去剤を添加する方法について説明
する。

【００２２】試料は、標的ＡＴＰを含むと思われるもの
であれば特に限定されないが、例えば飲食物・医薬品・
化粧品等の各工業製品・その半製品・その原料、海水、
河川水、工業用水、下水、土壌、尿、糞便、血液、喀
痰、膿汁、細胞の培養液等である。また、細菌汚染検
査、清浄度検査、拭き取り検査等の各種検査における検
体も、本発明の試料とすることができる。さらには、上
記試料を適当な溶媒（例えば、蒸留水、生理的食塩水、
リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等
等）に懸濁した溶液を試料としてもよい。試料が固形分
を含む場合には、該試料を上記溶媒に懸濁するか、ミキ
サ−などでホモジナイズすれば溶液状のものと同様に扱
うことができる。

【００２３】拭き取り検査における検体を試料とする場
合は、綿棒のような拭き取りスティックを無菌水で湿ら
せ検査箇所を拭き取った後に、無菌水又は試薬液をいれ
た試験管の中ですすぎ、その液体部分を試料とする。

【００２４】標的ＡＴＰが細胞内ＡＴＰである場合は、
細胞を含むと思われる溶液あるいは細胞の培養液等を試
料とすればよい。また、上記の溶液あるいは培養液を、
親水性または疎水性の濾過膜で濾過して細胞を捕捉した
後に該濾過膜を試料としてもよい。なお、ここでいう細
胞とは、例えば、酵母、カビ、キノコ、細菌、放線菌、
単細胞藻類、ウイルス、原生動物、動物または植物の細
胞及び組織培養物等を意味する。

【００２５】本発明の方法はＡＴＰの消去状況の確認が
容易であることから、ＡＴＰ消去法として優れている。
特に、生物発光に必要な成分を含むＡＴＰ消去剤（例え
ば、有効成分としてホタルルシフェラーゼ、他の成分と
してホタルルシフェリンおよびマグネシウムイオンを含
有するＡＴＰ消去剤）を使用する場合、発光量の変化を
測定することにより、ＡＴＰの消去状況を確認できる。
この場合、測定系にＡＴＰ消去剤を添加した後、生じる
発光量の経時的変化を、発光測定装置（ルミノメータ
ー）を用いて測定すればよい。

【００２６】測定系が液体状（試料、培地、各種試薬
等）であって、その容量が少ない場合は、全量をルミノ
メーターに供して発光量を測定すればよい。また、その
容量が多いときは、試料等の一部を採取して発光量を測
定すればよい。 ＩＩＩ．細胞内ＡＴＰの測定法 １． 本発明の細胞内ＡＴＰの測定法は、以下の工程を
含むことを特徴とする。 （１）細胞を含む試料に、本発明のＡＴＰ消去剤を添加
し、試料中の遊離ＡＴＰを消去する第１工程。 （２）第１工程で添加したＡＴＰ消去剤中の酵素活性を
失活させる第２工程。 （３）細胞内ＡＴＰを抽出する第３工程。 （４）抽出されたＡＴＰを測定する第４工程。 ２．第１工程では、ＡＴＰ消去剤中のルシフェラーゼと
遊離ＡＴＰとが反応することにより、遊離ＡＴＰが消去
される。有効成分がホタルルシフェラーゼを使用する際
は、ホタルルシフェラーゼ、ホタルルシフェリン、およ
びマグネシウムイオンを含むＡＴＰ消去剤を使用するこ
とが好ましい。

【００２７】試料に添加されるルシフェラーゼの終濃
度、ＡＴＰ消去剤と試料との接触条件等は、試料の種類
・性状等に応じて適宜設定すればよい。ホタルルシフェ
ラーゼを有効成分とするＡＴＰ消去剤を使用する場合、
第1工程は、例えば、以下の条件で実施すればよい。 （１）ルシフェラーゼの終濃度：０．００１ＧＬＵ／ｍ
ｌ以上（特に０．０１〜１０ＧＬＵ／ｍｌであることが
好ましい）。

【００２８】なお、ＧＬＵとは、以下の方法により得ら
れる発光量の単位である。まず、ルシフェラーゼ標品を
酵素希釈液（1 mM EDTA, 1 mM 2-メルカプトエタノー
ル, 1% BSA, 50 mM HEPES, (pH 7.5)）にて適宜希釈
し、その100μｌに、100μｌの基質溶液（1.4 mMルシフ
ェリン, 40 mM ATP, 300 mM MgSO4.7H2O, 50 mMHEPES,
(pH 7.5)）を添加する。ついで、生じた発光の発光量
を、BLR-201 Luminescence reader（アロカ社製）を用
いて以下の設定条件で測定する。 測定レンジ：x100、表示数値：x1000、測定温度：30
℃、測定時間：20秒間 この条件での測定値が1００００００ countの時の活性
値を1 ＧLU（キ゛カ゛ライトユニット）/mlとする。（２）ｐＨ条
件：弱酸性〜弱アルカリ性（特にｐＨ５．０〜８．５が
好ましい） （３）反応温度：２０〜５０℃（特に３０〜４５℃が好
ましい） （４）反応時間：約２時間以内（特に１〜６０分が好ま
しい） 遊離ＡＴＰの消去状況の確認は、試料の全量または一部
をルミノメーターに供して発光量の経時的変化を測定す
ればよい。 ３．第２工程では、ＡＴＰ消去剤中の酵素活性を失活さ
せる。ここでいう酵素とは、有効成分であるルシフェラ
ーゼのことである。また、ＡＴＰ消去剤がＡＴＰ分解酵
素を含む場合、酵素とはルシフェラーゼおよびＡＴＰ分
解酵素を意味する。酵素活性を失活させる方法として
は、特に限定されないが、例えば、活性阻害剤を添加す
ることにより酵素を失活させる方法が挙げられる。酵素
の活性阻害剤としては、後述するＡＴＰ抽出試薬を使用
することができる。その他の方法として、ＡＴＰ消去剤
を含む試料を加熱することにより酵素を熱失活させる方
法がある。さらには、酸またはアルカリを添加すること
により、試料のｐＨを、該酵素が失活する範囲に変化さ
せる方法が使用できる。４．第３工程の細胞内ＡＴＰを
抽出する方法としては、試料にＡＴＰ抽出試薬を添加す
る方法が好適である。ＡＴＰ抽出試薬としては、ＡＴＰ
の抽出法は特に限定されないが、例えば、ＡＴＰ抽出試
薬を試料に添加する方法が採用される。ＡＴＰ抽出試薬
としては、例えば、エタノールとアンモニアの混合液、
メタノール、エタノール、界面活性剤、トリクロル酢
酸、過塩素酸等が使用できる。界面活性剤はＡＴＰの抽
出効率が高いので、ＡＴＰ抽出試薬として好適である。
界面活性剤としては、アニオン界面活性剤（例えば、ド
デシル硫酸ナトリウム（SDS）、ラウリル硫酸カリウ
ム、モノラウロイルリン酸ナトリウム、アルキルベンス
ルホン酸ナトリウム）、カチオン界面活性剤（例えば、
塩化ベンザルコニウム（BAC）、塩化ベンゼトニウム（B
ZC）、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチル
アンモニウム、塩化ミリスチルジメチルベンジルアンモ
ニウム）、両性（ツイッター）界面活性剤（例えばTwit
tergent Detergent 3-08, 3-10, 3-12, 3-14, 3-16、Te
go）、非イオン性界面活性剤（例えば、 Tween 20, 60,
80、Span 60, 80、 Triton X-45, X-100, ポリオキシ
エチレンエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル）が使用できる。

【００２９】なお本発明では、第２工程と第３工程とを
同時に実施してもよい。2つの工程を同時に実施する簡
便な方法は、酵素の活性阻害剤を兼ねるＡＴＰ抽出試薬
を試料に添加する方法である。この場合は、試料にＡＴ
Ｐ抽出試薬を添加して、細胞内ＡＴＰを抽出するととも
に、第１工程で添加したＡＴＰ消去剤中の酵素活性を失
活させる。上記のＡＴＰ抽出試薬は、試料に添加する終
濃度を適宜設定することにより、酵素の活性阻害剤とし
て使用可能である。例えば、ホタルルシフェラーゼは、
界面活性剤により失活させることが可能である。野生型
ゲンジボタルルシフェラーゼは、０．０１％の塩化ベン
ザルコニウムの存在下では、発光反応の触媒活性は約２
０％にまで低下する。

【００３０】第４工程の細胞内ＡＴＰの測定法は、特に
限定されないが、生物発光法を利用する方法が好適であ
る。この場合は、抽出されたＡＴＰを含む試料を、ルシ
フェリン−ルシフェラーゼ発光試薬と接触させ、生成し
た発光量を測定して細胞内ＡＴＰ量を求める。生物発光
試薬中のルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである
場合、生物発光試薬は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ
およびマグネシウムイオンを含むことが好ましい。生成
した発光量は、ルミノメーター、例えばルミテスター
Ｃ−１００、Ｋ−１００、Ｋ−２００、Ｋ−２１０（い
ずれもキッコーマン社製）、ルミネッセンスリーダーＢ
ＬＲ−２０１改良型（アロカ社製）、Lumat LB9501
（ベルトールド社製）により測定することができる。ま
た、細胞を捕捉した濾過膜を試料とする場合、生物発光
画像解析システム装置、例えばＡＲＧＵＳ−５０／ＣＬ
〔テーパーファイバー付：浜松ホトニクス（株）社製〕
を用いて濾過膜上の輝点を撮像することにより、細胞数
を測定することが可能である。

【００３１】ところで、一般に試料に添加するＡＴＰ抽
出試薬の濃度が高い程、細胞内ＡＴＰの抽出効率は高く
なる。しかしながら、ＡＴＰ抽出試薬の濃度が高すぎる
と、ＡＴＰ抽出試薬が細胞内ＡＴＰの測定工程を阻害
し、測定感度く低下する場合がある。このため、細胞内
ＡＴＰの測定工程において用いる試薬は、高濃度のＡＴ
Ｐ抽出試薬の存在下でも阻害を受けないものであること
が好ましい。例えば、細胞内ＡＴＰの測定工程において
ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬を使用する場
合、該発光試薬中のルシフェラーゼは、試料に添加され
たＡＴＰ抽出試薬に耐性を有するものであることが好ま
しい。この場合、ＡＴＰ消去剤の有効成分であるルシフ
ェラーゼがＡＴＰ抽出試薬により失活するものであるこ
とが好ましい。そうすることにより、ＡＴＰ抽出試薬を
除去あるいは中和することなく、細胞内ＡＴＰの測定工
程を実施できるので、操作の簡便化が可能となる。

【００３２】界面活性剤に耐性を有するルシフェラーゼ
としては、特願平９−３６１０２２号に記載の２種類の
変異型ルシフェラーゼ（「HLK」及び「HIK」）が使用可
能である。また、該変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配
列において１若しくは複数のアミノ酸が付与、欠失若し
くは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ界面活性剤
に耐性を有するルシフェラーゼ活性を有するポリペプチ
ドも使用可能である。

【００３３】「HLK」及び「HIK」は、耐熱性ヘイケボタ
ルルシフェラーゼのアミノ酸配列に変異を導入して作成
されたものである。HLKをコードする遺伝子を含む組み
換え大腸菌は、工業技術院生命工学工業技術研究所にFE
RM BP-６１４７として寄託されている。またHIKをコー
ドする遺伝子を含む組み換え大腸菌は、工業技術院生命
工学工業技術研究所にFERM BP-６１４６として寄託さ
れている。

【実施例】以下実施例によりさらに詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。 [実施例１]トリプトソイブイヨン培地を試料とし、ルシ
フェラーゼを有効成分とするＡＴＰ消去剤を用いて該試
料中の遊離ＡＴＰを消去した。 １．試薬等の調製 （１）ＡＴＰ消去剤の調製 本発明のＡＴＰ消去剤：１５０ＧＬＵ／ｍｌ耐熱性ゲン
ジボタルルシフェラーゼ（特開平5-244942号公報記
載）、１．５ｍＭ ホタルルシフェリン（ワイエムシイ
社製）を含む２５ｍＭ トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）緩
衝液（１５ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．２% ＢＳ
Ａ、０．２ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．
３７％ スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）を含む）。 比較例のＡＴＰ消去剤：１５０ｍＵ／ｍｌ アピラ−ゼ
酵素液(シグマ社製)を含む、２５ｍＭ トリシン緩衝液
（１５ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．２% ＢＳＡ、
０．２ｍＭ ＤＴＴ、０．３７％ スクロースを含
む）。 （２）試料の調製：トリプトソイブイヨン培地（１．７
％トリペプトン、０．３％ソイペプトン、０．２５％ブ
ドウ糖、０．２５％リン酸2カリウム、０．５％塩化ナ
トリウム、ｐＨ７．３±０．２）（栄研化学社製）３ｇ
を精製水１００ｍｌに溶解して、トリプトソイブイヨン
培地を調製した。該培地を１２０℃で１５分間、滅菌処
理後、室温まで冷却し、これを試料とした。 ２．試料中の遊離ＡＴＰの消去 以下の方法により試料中の遊離ＡＴＰの消去を行ない、
本発明のＡＴＰ消去剤の効果を確認した。 第１工程：試料中の遊離ＡＴＰの消去 第２工程：発光量の測定 第３工程：ＡＴＰ検量線の作成 第４工程：試料中のＡＴＰ濃度の算出 （第１工程：試料中の遊離ＡＴＰの消去）各ＡＴＰ消去
剤０．６ｍｌを採取し、そこに、試料１．２ｍｌを加え
た後、室温で、ＡＴＰ消去を開始した。０、１０、３
０、６０分経過後に試料を０．１ｍｌ採取した。 （第２工程：発光量の測定）発光量の測定は、ルシフェ
ールＡＴＰ抽出試薬（キッコーマン社製）、ルシフェー
ル発光試薬−ＨＳ（キッコーマン社製、付属の発光試薬
溶解用液で溶解したもの）を用いて行った。採取した試
料０．１ｍｌにＡＴＰ抽出試薬０．１ｍｌを添加し、ル
シフェール発光試薬−ＨＳを０．１ｍｌ添加した。生成
した発光量を、キッコーマン社製発光測定装置「ルミテ
スター（Ｌｕｍｉｔｅｓｔｅｒ）Ｃ−１００により測定
した。このときの発光値をＳとした。

【００３４】一方、上記計測法において「採取した試料
０．１ｍｌ」の代わりに「超純水０．１ｍｌ」を用い、
それ以外は全く同様にして発光量の測定を行った。この
値を発光試薬のブランク値Ｒとした。

【００３５】そしてＳ−Ｒを求めて正味の発光値Ａとし
た。 （第３工程：ＡＴＰ検量線の作成）１×１０^-8Ｍになる
ように、ルシフェールＡＴＰ抽出試薬に溶解したＡＴＰ
を、さらに１０倍ずつ５段階希釈を行い、１×１０^-8〜
１×１０^-13Ｍの希釈列を作製した。

【００３６】０．１ｍｌ超純水に各濃度のＡＴＰを含む
ＡＴＰ抽出試薬を０．１ｍｌ添加し、ルシフェール発光
試薬−ＨＳ ０．１ｍｌを加えた。その発光量は、キッ
コーマン社製ルミテスターＣ−１００を用いて測定し
た。

【００３７】また、ＡＴＰを含まないＡＴＰ抽出試薬
０．１ｍｌ、超純水０．１ｍｌ、発光試薬−ＨＳ０．１
ｍｌを用いて発光測定を行い、この値をＡＴＰ検量線に
おける発光試薬のブランク値とした。添加したＡＴＰに
対する発光量の標準値は、発光量からブランク値を減じ
たものとした。実施例１における検量線を図１に示し
た。

【００３８】（第４工程：試料中のＡＴＰ濃度の量）生
物発光反応は、試料中の成分により発光阻害を受けるた
め、第2工程で得られた発光量Ａは見かけ値である。そ
こで、以下の方法で発光量Ａの補正を行い、試料中のＡ
ＴＰ濃度を算出した。先ず発光率Ｋを求め、次いで、前
記発光量Ａを発光率Ｋで除することにより補正値Ｙ（真
の発光量）を求めた。検量線（図1）を利用し、補正値
Ｙに対応するＡＴＰ濃度を算出した（後述する実施例に
おける補正発光値も、同様にして求めた）。

【００３９】補正値Ｙの求め方。

【００４０】Ｙ（補正値）＝ Ａ／Ｋ Ｋ＝｛Ｈ−Ａ｝／｛Ｇ―Ｒ｝ Ｈ（内標準値）：経時的に採取し得られた各試料０．１
ｍｌに、１×１０^-9ＭＡＴＰを含むＡＴＰ抽出試薬
０．１ｍｌおよび発光試薬０．１ｍｌを添加して得られ
た発光量の値。 Ａ（見かけ値）：上記各試料０．１ｍｌに、ＡＴＰを含
まないＡＴＰ抽出試薬０．１ｍｌおよび発光試薬０．１
ｍｌを添加して得られた発光量の値。 Ｇ（本標準値）：超純水０．１ｍｌに、ＡＴＰ標準液１
×１０^-9Ｍ ０．１ｍｌおよび発光試薬０．１ｍｌを添
加して得られた発光量の値。 Ｒ（ブランク値）：超純水０．１ｍｌに、ＡＴＰを含ま
ないＡＴＰ抽出試薬０．１ｍｌおよび発光試薬０．１ｍ
ｌを添加して得られた発光量の値。 なお、実施例１では、Ｇ＝３８２０１、Ｒ＝２０であっ
た。また、Ｈ，Ａ，Ｋを求めた結果を表１に示す。さら
に、上記以外の数値を表2（本発明）、表3（比較例）に
示した。

【００４１】

【表１】

【表２】

【表３】 以上の方法で算出した試料中のＡＴＰ濃度の経時的変化
を、図２に示した。本発明のＡＴＰ消去剤を用いること
により、トリプトソイブイヨン培地に含まれる遊離ＡＴ
Ｐ濃度を、６０分間で１００分の１以下に低減させるこ
とができたことがわかる。また、本発明のＡＴＰ消去剤
の効果は、比較例のＡＴＰ消去剤（アピラーゼを有効成
分とするもの）と同等であることがわかった。なお、本
発明のＡＴＰ消去剤に含まれる耐熱性ゲンジボタルルシ
フェラーゼの単位を０，３０，６０，１５０，３００Ｇ
ＬＵ／ｍｌとして同様の操作を行なった予備試験の結果
を図3に示す。図３より、添加するルシフェラーゼの単
位数が増える程、遊離ＡＴＰは短時間で消去されること
がわかる。ただし、１５０ＧＬＵと３００ＧＬＵの結果
は、ほぼ同様であった。このことから、実施例１では、
ＡＴＰ消去剤中のルシフェラーゼの単位数は１５０ＧＬ
Ｕ／ｍｌとした。[実施例２]トリプトソイブイヨン培地
を試料とし、ルシフェラーゼおよびＡＴＰ分解酵素を有
効成分とするＡＴＰ消去剤を用いて該試料中の遊離ＡＴ
Ｐを消去した。 １．試薬等の調製 （１）ＡＴＰ消去剤の調製 本発明のＡＴＰ消去剤：１５０ＧＬＵ／ｍｌ耐熱性ゲン
ジボタルルシフェラーゼ、１．５ｍＭ ホタルルシフェ
リン、１５０ｍＭ アデノシンリン酸デアミナーゼを含
む２５ｍＭ トリシン緩衝液（１５ｍＭ 酢酸マグネシ
ウム、０．２% ＢＳＡ、０．２ｍＭＤＴＴ、０．３７
％ スクロースを含む）。 比較例1のＡＴＰ消去剤：１５０ｍＵ／ｍｌアデノシン
リン酸デアミナ−ゼを含む２５ｍＭ トリシン緩衝液
（１５ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．２% ＢＳＡ、
０．２ｍＭ ＤＴＴ、０．３７％ スクロースを含
む）。 比較例２のＡＴＰ消去剤：３００ｍＵ／ｍｌアデノシン
リン酸デアミナ−ゼを含む２５ｍＭ トリシン緩衝液
（１５ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．２% ＢＳＡ、
０．２ｍＭ ＤＴＴ、０．３７％ スクロースを含
む）。 （２）試料：実施例１で調製したトリプトソイブイヨン
培地。 ２．試料中の遊離ＡＴＰの消去 実施例1と同様の方法により、試料中の遊離ＡＴＰの消
去、発光量の測定、ＡＴＰ検量線の作成および、ＡＴＰ
濃度の算出を行なった。

【００４２】実施例１と同様に、Ｈ（内標準値）、Ａ
（見かけ値）Ｇ（本標準値）Ｒ（ブランク値）を求め、
補正値Ｙ（真の発光量）を算出した。実施例２では、Ｇ
＝３８２０１、Ｒ＝２０とした。Ｈ，Ａ，Ｋを求めた結
果を表４（本発明のＡＴＰ消去剤）、表5（比較例１）
に示した。なお、比較例２における発光率Ｋは、比較例
１と同じであるとした。さらに、上記以外の数値を表６
（本発明）、表７（比較例1）、表８（比較例２）に示
した。

【００４３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】 以上の方法で算出した試料中のＡＴＰ濃度の経時的変化
を、図４に示した。消去時間６０分でのＡＴＰ濃度にお
いて、比較例１（１５０ｍＭ アデノシンリン酸デアミ
ナ−ゼを有効成分とするＡＴＰ消去剤）と比較例２（３
００ｍＭアデノシンリン酸デアミナ−ゼを有効成分とす
るＡＴＰ消去剤）との間で大きな差は見られない。しか
し、１５０ｍＭ アデノシンリン酸デアミナ−ゼに１５
０ＧＬＵ ルシフェラーゼを併用することにより、３０
０ｍＭ アデノシンリン酸デアミナーゼの場合より、さ
らに低い値にまで遊離ＡＴＰを消去することが可能にな
ったことがわかる。 [実施例３]トリプトソイブイヨン培地を試料とし、本発
明のＡＴＰ消去剤2種を用いて遊離ＡＴＰの消去および
消去状況の確認を行なった。 １．試薬等の調製 （１）ＡＴＰ消去剤の調製 ＡＴＰ消去剤１：１５０ＧＬＵ／ｍｌ耐熱性ゲンジボタ
ルルシフェラーゼ、１．５ｍＭ ホタルルシフェリンを
含む２５ｍＭ トリシン緩衝液（１５ｍＭ 酢酸マグネ
シウム、０．２% ＢＳＡ、０．２ｍＭ ＤＴＴ、０．
３７％ スクロースを含む）。 ＡＴＰ消去剤２：１５０ＧＬＵ／ｍｌ耐熱性ゲンジボタ
ルルシフェラーゼ、１．５ｍＭ ホタルルシフェリン、
１５０ｍＭ アデノシンリン酸デアミナーゼを含む２５
ｍＭ トリシン緩衝液（１５ｍＭ 酢酸マグネシウム、
０．２% ＢＳＡ、０．２ｍＭＤＴＴ、０．３７％ ス
クロースを含む）。 （２）試料：実施例１で調製したトリプトソイブイヨン
培地。 ２．試料中の遊離ＡＴＰの消去および消去状況の確認 上記のＡＴＰ消去剤１および２を測定用試験管に０．１
ｍｌ採取し、それぞれに試料０．２ｍｌを添加した。該
測定用試験管をルミテスターＣ−１００（キッコーマン
社製）にセットし、生じた光の発光量を、６０分間、経
時的に測定した。その結果を表９および図５に示した。

【００４４】

【表９】 図５からわかるように、発光量の経時変化は、実施例１
〜２における試料中のＡＴＰ濃度の経時変化と同様の傾
向を示した。試料から生じる発光量を測定することによ
り、遊離ＡＴＰの消去状況の確認が可能であることが示
された。

【００４５】[実施例４]本発明のＡＴＰ消去剤を用い
て、細胞を含む試料中の遊離ＡＴＰを消去し、次いで細
胞内ＡＴＰ由来の発光量を測定し、生細胞数と発光量と
の相関性を検討した。 １．試薬等の調製 （１）ＡＴＰ消去剤の調製 本発明のＡＴＰ消去剤１：１５０ＧＬＵ／ｍｌ耐熱性ゲ
ンジボタルルシフェラーゼ、１．５ｍＭ ホタルルシフ
ェリンを含む２５ｍＭ トリシン緩衝液（１５ｍＭ 酢
酸マグネシウム、０．２% ＢＳＡ、０．２ｍＭ ＤＴ
Ｔ、０．３７％ スクロースを含む）。 本発明のＡＴＰ消去剤２：１５０ＧＬＵ／ｍｌ耐熱性ゲ
ンジボタルルシフェラーゼ、１．５ｍＭ ホタルルシフ
ェリン、１５０ｍＭ アデノシンリン酸デアミナーゼを
含む２５ｍＭ トリシン緩衝液（１５ｍＭ 酢酸マグネ
シウム、０．２% ＢＳＡ、０．２ｍＭＤＴＴ、０．３
７％ スクロースを含む）。 （２）試料の調製：エセリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ＡＴＣＣ ２５９２２）およびバ
チルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ：ＡＴＣＣ ９３７２）を被検微生物とした。被検
微生物の培養液の希釈液を以下の方法で調製し、これを
試料とした。実施例１で調製したトリプトソイブイヨン
培地を、滅菌処理した２本の試験管にそれぞれ１０ｍｌ
ずつ分注した後、被検微生物を一白金耳接種し、３５℃
で一晩振とう培養して培養液を得た。上記培養液を、ト
リプトソイブイヨン培地を用いて１００００倍希釈し、
そこから５回の１０倍希釈を行い、合計６段階の希釈液
を調製した。

【００４６】２．試料中の遊離ＡＴＰの消去 以下の方法により試料中の生細胞数の測定を行なった。 第１工程：試料中の遊離ＡＴＰの消去 第２工程：細胞内ＡＴＰの抽出 第３工程：発光量の測定 第４工程：混釈培養法による試料のＣＦＵの算出 （第１工程：試料中の遊離ＡＴＰの消去）試料１．２ｍ
ｌに、ＡＴＰ消去剤０．６ｍｌを添加した後、室温で６
０分間放置し、試料中の遊離ＡＴＰの消去を行った。 （ 第２工程：細胞内ＡＴＰの抽出）遊離ＡＴＰを消去
した試料を０．１ｍｌ採取し、そこに、キッコーマン社
製ＡＴＰ抽出試薬０．１ｍｌを添加して、攪拌後、１０
秒間放置することにより細胞内ＡＴＰの抽出を行った。 （第３工程：発光量の測定）ＡＴＰ抽出を行った試料
０．２ｍｌに、キッコーマン社製ルシフェール発光試薬
−ＨＳ ０．１ｍｌを添加し、攪拌後、キッコーマン社
製ルミテスターＣ−１００を用いて、その発光量を測定
した。このときの発光量を、消去されてない遊離ＡＴＰ
と細胞内ＡＴＰのトータルの発光量（Ｔ）とした。

【００４７】試料のかわりに、被検微生物を含まないト
リプトソイブイヨン培地を用いて、遊離ＡＴＰの消去、
ＡＴＰ抽出剤の添加、発光量の測定を行った。このとき
の発光量を、消去できなかった遊離ＡＴＰ量（フリー
値）Ｆとした。

【００４８】トータル値Ｔからフリー値Ｆを減すること
により、細胞内ＡＴＰの正確な発光量を求めることがで
きる。実施例１と同様の方法により補正発光量を求め
た。 （第５工程：混釈培養法による試料のＣＦＵの算出）混
釈培養法を用いて、試料中に含まれる被検微生物のＣＦ
Ｕ（コロニーフォーミングユニット）を求めた。得られ
たＣＦＵを生細胞数の実測値とした。

【００４９】まず、滅菌シャーレに０．１ｍｌの試料を
滅菌ピペットで無菌的に採取し、あらかじめ、１２１℃
２０分間で滅菌処理を行い、その後、約５０℃に冷却し
た溶解済みの標準寒天培地（０．２５％酵母エキス、
０．５％トリプトン、０．１％ブドウ糖、ｐＨ７．１、
２．０％寒天）を加え、均一に混和した後、平板として
固めた。次に、その平板を３５℃で一晩培養し、出現し
たコロニーの計測を行った。そのコロニー数を、試料
０．１ｍｌに含まれていた微生物のＣＦＵとした。な
お、ＣＦＵ算出時の試料の採取と混釈は、発光量の測定
の直前に行った。

【００５０】上記により求められたＣＦＵ／ｍｌと補正
発光量（ＲＬＵ）との相関関係を、図６（本発明の消去
剤１の結果）、図７（本発明の消去剤１の結果）に示
す。図中、「Ｅ.ｃｏｌｉ」および「Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ」は、被検微生物として使用した「Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ」および「Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ」を意味する。

【００５１】図６、７より、本発明のＡＴＰ消去剤を用
いて遊離ＡＴＰを消去することにより、バックグラウン
ド発光を低く抑えことができ、細胞内ＡＴＰ由来の発光
量と生細胞数の実測値であるＣＦＵとの間に、高い相関
性を持たせることが可能になったことがわかった。本発
明のＡＴＰ消去剤およびＡＴＰ消去法が、細胞内ＡＴＰ
の測定法において好適に使用できることが示された。

【００５２】

【発明の効果】本発明により、ルシフェラーゼを有効成
分とするＡＴＰ消去剤、該ＡＴＰ消去剤を用いる測定系
のＡＴＰ消去法および該ＡＴＰ消去剤を用いる細胞内Ａ
ＴＰの測定法が提供された。本発明のＡＴＰ消去剤を用
いる場合、測定系から生じる発光を測定することによ
り、ＡＴＰの消去状況の確認を簡単に行なうことができ
る。本発明は、遊離ＡＴＰの消去する方法として好適で
ある。また、本発明のＡＴＰ消去剤は特に、試料中の遊
離ＡＴＰを消去して細胞内ＡＴＰを測定する方法におい
て好適に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１における検量線

【図２】実施例１におけるＡＴＰ濃度の経時的変化を示
す図

【図３】実施例１における予備試験の結果を示す図

【図４】実施例２におけるＡＴＰ濃度の経時的変化を示
す図

【図５】実施例３における発光量の経時的変化を示す図

【図６】実施例４におけるＣＦＵ／ｍｌと補正発光量と
の相関性を示す図

【図７】実施例４におけるＣＦＵ／ｍｌと補正発光量と
の相関性を示す図

フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA13 AA16 AA28 BA01 BB20 BB29 CA25 CB01 CB03 CB04 CB08 CB17 CB21 DA15 FB13 GC15 2G054 AA07 AA08 BA01 CA21 CE02 EA02 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ06 QQ07 QQ08 QQ15 QQ16 QQ17 QQ18 QQ19 QQ63 QR02 QR13 QR14 QR41 QR66 QS20 QX02

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ルシフェラーゼを有効成分として含有する
   ＡＴＰ消去剤。
2. 【請求項２】ルシフェリンおよびルシフェラーゼを含有
   するＡＴＰ消去剤。
3. 【請求項３】有効成分としてさらにＡＴＰ分解酵素を含
   有する、請求項１または２記載のＡＴＰ消去剤。
4. 【請求項４】測定系に、請求項１〜３のいずれかに記載
   のＡＴＰ消去剤を添加することを特徴とする、測定系の
   ＡＴＰ消去法。
5. 【請求項５】以下の工程を含むことを特徴とする、細胞
   内ＡＴＰの測定法。細胞を含む試料に、請求項１〜３の
   いずれかに記載のＡＴＰ消去剤を添加し、試料中の遊離
   ＡＴＰを消去する第１工程。第１工程で添加したＡＴＰ
   消去剤中の酵素活性を失活させる第２工程。細胞内ＡＴ
   Ｐを抽出する第３工程。抽出されたＡＴＰを測定する第
   ４工程
6. 【請求項６】以下の工程を含むことを特徴とする、細胞
   内ＡＴＰの測定法。細胞を含む試料に、請求項１〜３の
   いずれかに記載のＡＴＰ消去剤を添加し、試料中の遊離
   ＡＴＰを消去する第１工程。試料にＡＴＰ抽出試薬を添
   加して、細胞内ＡＴＰを抽出するとともに、第１工程で
   添加したＡＴＰ消去剤中の酵素活性を失活させる第２工
   程抽出されたＡＴＰを測定する第３工程
7. 【請求項７】ＡＴＰ抽出試薬が界面活性剤である、請求
   項６に記載の細胞内ＡＴＰの測定法。
8. 【請求項８】抽出されたＡＴＰの測定方法が、ルシフェ
   リン−ルシフェラーゼ発光試薬を使用する方法であるこ
   とを特徴とする、請求項５〜７のいずれかに記載の細胞
   内ＡＴＰの測定法。
9. 【請求項９】ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬に
   含まれるルシフェラーゼが、ＡＴＰ抽出試薬に耐性を有
   することを特徴とする、請求項８に記載の細胞内ＡＴＰ
   の測定法。