JP2735901B2 - 微生物の生細胞，死細胞および微生物細胞以外の粒子の数の測定方法 - Google Patents
微生物の生細胞，死細胞および微生物細胞以外の粒子の数の測定方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は微生物細胞とその他の粒子とを含む試料に光
を照射し、上記試料中の全体の粒子から、微生物の生細
胞、死細胞および微生物以外の粒子の数を測定する方法
に関し、特に食品製造プラント、医薬品製造プラントに
おける製品の品質管理や殺菌装置の性能把握等、半導体
製造に使用される超純水製造装置のチェック等に有利に
適用される方法に関する。
を照射し、上記試料中の全体の粒子から、微生物の生細
胞、死細胞および微生物以外の粒子の数を測定する方法
に関し、特に食品製造プラント、医薬品製造プラントに
おける製品の品質管理や殺菌装置の性能把握等、半導体
製造に使用される超純水製造装置のチェック等に有利に
適用される方法に関する。
食品、医薬品製造分野、発酵工業等においては、原料
や製品の品質管理、殺菌装置の性能確認のため微生物検
査、測定が不可欠である。また半導体製造に使用される
超純水では、微生物細胞も含め、無機粒子の検査も重要
なチェック項目となっている。
や製品の品質管理、殺菌装置の性能確認のため微生物検
査、測定が不可欠である。また半導体製造に使用される
超純水では、微生物細胞も含め、無機粒子の検査も重要
なチェック項目となっている。
従来の微生物検査・測定方法には、顕微鏡法、寒天培
養法、バイオルミネッセンス法などがあるが、いずれの
方法も微生物細胞の生死までは判別できず、殺菌された
かどうかの評価はできないという欠点がある。すなわ
ち、寒天培養法は生細胞数の測定方法として最も広く用
いられている方法であるが、結果を得るまでに数十時間
以上と長い時間を要するため、殺菌管理に支障をきたす
場合が多い。バイオルミネッセンス法中で最も代表的な
ATP（アデノシン三リン酸）法は寒天培養法に比較し、
測定時間がいくぶん短縮される利点はあるが、生細胞数
が103〜104個/ml以上と比較的高濃度領域にしか適用で
きないという欠点がある。また前述の三者の方法では微
生物細胞とそれ以外の粒子の識別はできない。
養法、バイオルミネッセンス法などがあるが、いずれの
方法も微生物細胞の生死までは判別できず、殺菌された
かどうかの評価はできないという欠点がある。すなわ
ち、寒天培養法は生細胞数の測定方法として最も広く用
いられている方法であるが、結果を得るまでに数十時間
以上と長い時間を要するため、殺菌管理に支障をきたす
場合が多い。バイオルミネッセンス法中で最も代表的な
ATP（アデノシン三リン酸）法は寒天培養法に比較し、
測定時間がいくぶん短縮される利点はあるが、生細胞数
が103〜104個/ml以上と比較的高濃度領域にしか適用で
きないという欠点がある。また前述の三者の方法では微
生物細胞とそれ以外の粒子の識別はできない。
従来、粒子計測方法としてはパーティクルカウンタが
実用化されている。この方法はセル中を通過する試料に
光を照射し、粒子の散乱光を計測することにより粒子数
を求める方法であるが、微生物細胞とそれ以外の粒子を
識別することはできないため、殺菌管理等には使用でき
ない。
実用化されている。この方法はセル中を通過する試料に
光を照射し、粒子の散乱光を計測することにより粒子数
を求める方法であるが、微生物細胞とそれ以外の粒子を
識別することはできないため、殺菌管理等には使用でき
ない。
また、微生物細胞の生死を判別する方法として従来ア
クリジンオレンジという蛍光色素を使用すると、生細胞
は緑色に、死細胞は橙赤色に蛍光発色することから、こ
の差でもって生死判別が試みられたことがあるが、試料
の状態や試験条件のわずかな差により判別が不十分にな
り、信頼性に乏しいことから現在ではほとんど使われて
いない。
クリジンオレンジという蛍光色素を使用すると、生細胞
は緑色に、死細胞は橙赤色に蛍光発色することから、こ
の差でもって生死判別が試みられたことがあるが、試料
の状態や試験条件のわずかな差により判別が不十分にな
り、信頼性に乏しいことから現在ではほとんど使われて
いない。
以上のように従来技術には、試料中の微生物細胞の生
−死、微生物細胞以外の粒子の識別−計測を迅速かつ、
同時に、低濃度の試料に対しても行えるようなものはな
かった。
−死、微生物細胞以外の粒子の識別−計測を迅速かつ、
同時に、低濃度の試料に対しても行えるようなものはな
かった。
従来技術では、微生物細胞の生−死の識別ができな
い。生細胞を測定するには長時間必要（寒天培養
法）。高濃度の微生物細胞しか測定できない（バイオ
ルミネッセンス法）。微生物細胞とそれ以外の粒子と
の識別はできない（パーティクルカウンター）。などの
課題があり、原料や製品の品質管理、殺菌管理に支障を
きたすと共に使用範囲が限定されていた。
い。生細胞を測定するには長時間必要（寒天培養
法）。高濃度の微生物細胞しか測定できない（バイオ
ルミネッセンス法）。微生物細胞とそれ以外の粒子と
の識別はできない（パーティクルカウンター）。などの
課題があり、原料や製品の品質管理、殺菌管理に支障を
きたすと共に使用範囲が限定されていた。
本発明はこれらの課題を解決し、微生物細胞とそれ以
外の粒子の識別、微生物細胞の生−死の識別を同時にか
つ短時間で、そして細胞濃度が１個/ml以下の低濃度で
も高感度に測定できる方法を提供しようとするものであ
る。
外の粒子の識別、微生物細胞の生−死の識別を同時にか
つ短時間で、そして細胞濃度が１個/ml以下の低濃度で
も高感度に測定できる方法を提供しようとするものであ
る。
本発明者らは生細胞、死細胞、微生物細胞以外の粒子
を短時間で高感度に識別、計測する方法について実験・
検討を重ねた結果、 生細胞だけを識別する方法として、生細胞中に含ま
れる酵素又は補酵素と反応し蛍光を発する物質を作用さ
せ生細胞を光の点として計測する。
を短時間で高感度に識別、計測する方法について実験・
検討を重ねた結果、 生細胞だけを識別する方法として、生細胞中に含ま
れる酵素又は補酵素と反応し蛍光を発する物質を作用さ
せ生細胞を光の点として計測する。
死細胞だけを識別する方法として、細胞内に存在す
る核酸に作用する蛍光物質を試料に作用させ、光の点と
して計測する。
る核酸に作用する蛍光物質を試料に作用させ、光の点と
して計測する。
微生物以外の粒子の計測は、微生物細胞を含む全粒
子数を散乱光で計測し、，で測定した生細胞数、死
細胞数を差し引いて求める。
子数を散乱光で計測し、，で測定した生細胞数、死
細胞数を差し引いて求める。
という，，を組み合せた手段を用いることによ
り、生細胞数、死細胞数、微生物細胞以外の粒子が各々
識別・計測できることを確認した。
り、生細胞数、死細胞数、微生物細胞以外の粒子が各々
識別・計測できることを確認した。
本発明は上記知見によって完成されたものであって、
微生物細胞とその他の粒子とを含む試料に光を照射し、
上記試料中の全体の粒子から生じる個々の散乱光を光の
点として検出して全体の粒子数を計測する工程と、上記
試料中の生きている微生物細胞の酵素あるいは補酵素と
反応して蛍光物質を生成する試薬を添加し、生成する蛍
光物質を励起させる光を照射して微生物細胞から生じる
蛍光を光の点として検出して生きている微生物細胞の数
を計測する工程と、上記試料中の死んでいる微生物細胞
の核酸に作用する蛍光物質を添加し、該蛍光物質を励起
させる光を照射して微生物細胞から生じる蛍光を光の点
として検出して死んでいる微生物細胞の数を計測する工
程とを有することを特徴とする微生物の生細胞、死細胞
および微生物細胞以外の粒子の数の測定方法である。
微生物細胞とその他の粒子とを含む試料に光を照射し、
上記試料中の全体の粒子から生じる個々の散乱光を光の
点として検出して全体の粒子数を計測する工程と、上記
試料中の生きている微生物細胞の酵素あるいは補酵素と
反応して蛍光物質を生成する試薬を添加し、生成する蛍
光物質を励起させる光を照射して微生物細胞から生じる
蛍光を光の点として検出して生きている微生物細胞の数
を計測する工程と、上記試料中の死んでいる微生物細胞
の核酸に作用する蛍光物質を添加し、該蛍光物質を励起
させる光を照射して微生物細胞から生じる蛍光を光の点
として検出して死んでいる微生物細胞の数を計測する工
程とを有することを特徴とする微生物の生細胞、死細胞
および微生物細胞以外の粒子の数の測定方法である。
本発明において、生細胞の識別に用いる物質は、細胞
中に含まれる酵素又は補酵素と反応して蛍光を発するも
ので、具体的にはフルオレセイン二酢酸、ホモバニリン
酸、Ｏ−フタルアルデヒド、ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレチドなどが使用できるが、中でもスルオレセイン
二酢酸は生細胞に作用して特に強い蛍光を発するので特
に好ましい。
中に含まれる酵素又は補酵素と反応して蛍光を発するも
ので、具体的にはフルオレセイン二酢酸、ホモバニリン
酸、Ｏ−フタルアルデヒド、ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレチドなどが使用できるが、中でもスルオレセイン
二酢酸は生細胞に作用して特に強い蛍光を発するので特
に好ましい。
また死細胞の識別に用いた物質は、DAPI（４′,6−ジ
アミジノ２−フェニルインドール）、ローダミン、臭化
エチジューム、臭化プロピジュームであり、これらのい
ずれも死菌に対し、強い蛍光を発するので死菌を高感度
に検知・計測することができる。
アミジノ２−フェニルインドール）、ローダミン、臭化
エチジューム、臭化プロピジュームであり、これらのい
ずれも死菌に対し、強い蛍光を発するので死菌を高感度
に検知・計測することができる。
生細胞の識別に用いた例えばフルオレセン二酢酸は生
細胞に作用させると細胞内に浸透して細胞内に存在する
酵素、エラテラーゼの作用により加水分解されフルオレ
セインを生成する。このフルオレセインは450〜490nmの
波長を有する励起光を照射してやることにより510〜520
nmをピーク波長とする蛍光を発するため、細胞が発光し
て見える。
細胞に作用させると細胞内に浸透して細胞内に存在する
酵素、エラテラーゼの作用により加水分解されフルオレ
セインを生成する。このフルオレセインは450〜490nmの
波長を有する励起光を照射してやることにより510〜520
nmをピーク波長とする蛍光を発するため、細胞が発光し
て見える。
また、死細胞を識別する場合、例えばDAPIを作用させ
ると、死細胞は生細胞に比較して細胞壁、細胞幕が弱く
なって損傷を受けているため、DAPIが細胞内に入りやす
くなって核酸と結びつきやすくなる。核酸と結びついた
DAPIは330〜380nmの励起光を照射することにより、430
〜440nmをピーク波長とする蛍光を発するため死細胞が
明るく発色して見える。
ると、死細胞は生細胞に比較して細胞壁、細胞幕が弱く
なって損傷を受けているため、DAPIが細胞内に入りやす
くなって核酸と結びつきやすくなる。核酸と結びついた
DAPIは330〜380nmの励起光を照射することにより、430
〜440nmをピーク波長とする蛍光を発するため死細胞が
明るく発色して見える。
また微生物細胞を含む全粒子数を計測する場合、例え
ば生菌測定に用いた450〜490nmの励起光を利用し、これ
を照射してやれば励起光と同一波長域の450〜490nmの散
乱光が各粒子から発するので、これを検知・計測すれば
全粒子数が求まる。
ば生菌測定に用いた450〜490nmの励起光を利用し、これ
を照射してやれば励起光と同一波長域の450〜490nmの散
乱光が各粒子から発するので、これを検知・計測すれば
全粒子数が求まる。
本発明の一実施例を第１図によって説明する。第１図
において、１は試料に含まれる粒子に光を照射するため
の光源で、実施例では100Wの水銀灯を用いているが、蛍
光色素を励起する波長を有するものであればキセノンラ
ンプ、レーザー光でも構わない。１はハーフミラーで光
源１からの光を２軸方向に分割し、一方はセル24、他方
は全反射ミラー３を介してセル22に照射する。
において、１は試料に含まれる粒子に光を照射するため
の光源で、実施例では100Wの水銀灯を用いているが、蛍
光色素を励起する波長を有するものであればキセノンラ
ンプ、レーザー光でも構わない。１はハーフミラーで光
源１からの光を２軸方向に分割し、一方はセル24、他方
は全反射ミラー３を介してセル22に照射する。
22は生細胞と全粒子数の計数用セル、24は死細胞計測
用セルである。４は死細胞に作用させた色素を励起する
に必要な波長を通過させるフィルター、５は集光レンズ
である。また６は生細胞に作用させた色素を励起するに
必要な波長を通過させるフィルター、７は集光レンズで
ある。
用セルである。４は死細胞に作用させた色素を励起する
に必要な波長を通過させるフィルター、５は集光レンズ
である。また６は生細胞に作用させた色素を励起するに
必要な波長を通過させるフィルター、７は集光レンズで
ある。
微生物の生細胞、死細胞、それ以外の粒子を含む試料
はラインP1を経由して反応槽19に入るが、その時ライン
P2より、生菌検知物質を所定濃度で注入してやる。20は
温度ヒーター付きマグネチックスターラ、21は回転子で
試料を所定温度で撹拌混合するためのものである。反応
槽19にて所定時間撹拌反応を行うことにより、生細胞内
では蛍光物質が生成するようになる。この試料をライン
P3を経由して、セル22内を通過させる。セル22には蛍光
物質を励起するに必要な波長の光が照射されており、試
料が通過すると各粒子は散乱光を発する。各粒子の中で
生細胞は散乱光以外に蛍光も発する。
はラインP1を経由して反応槽19に入るが、その時ライン
P2より、生菌検知物質を所定濃度で注入してやる。20は
温度ヒーター付きマグネチックスターラ、21は回転子で
試料を所定温度で撹拌混合するためのものである。反応
槽19にて所定時間撹拌反応を行うことにより、生細胞内
では蛍光物質が生成するようになる。この試料をライン
P3を経由して、セル22内を通過させる。セル22には蛍光
物質を励起するに必要な波長の光が照射されており、試
料が通過すると各粒子は散乱光を発する。各粒子の中で
生細胞は散乱光以外に蛍光も発する。
８は散乱光をカットするための蛍光フィルタで生細胞
の発する蛍光を通過させレンズ９を介して受光器10に受
け、同受光器10の出力をパルスカウンタ11により生細胞
から発する蛍光を光の点としてパルスカウントすること
により生細胞数を計測する。
の発する蛍光を通過させレンズ９を介して受光器10に受
け、同受光器10の出力をパルスカウンタ11により生細胞
から発する蛍光を光の点としてパルスカウントすること
により生細胞数を計測する。
また、12はセル内を通過する粒子に励起光を照射した
時、各粒子から発する散乱光を集光するレンズで、13は
散乱光を受光するための受光器、14はパルスカウンタ
で、全粒子数を光の点として計測する。
時、各粒子から発する散乱光を集光するレンズで、13は
散乱光を受光するための受光器、14はパルスカウンタ
で、全粒子数を光の点として計測する。
セル22を出た試料はラインP4を介して反応槽23に入る
が、この時、ラインP5より死菌検知物質を所定濃度で添
加し反応槽23で所定時間反応させた後、ラインP6を介し
てセル24に入る。セル24には死細胞に作用させた色素を
励起するに必要な波長の光を照射しており、このセル内
を通過する粒子は散乱光および死細胞は散乱光以外に蛍
光を発する。15は散乱光をカットする蛍光フィルタで死
細胞の発する蛍光だけを通過させる。レンズ16を介して
受光器17により蛍光を受光し、パルスカウンタ18により
死細胞の発する蛍光を光の点としてパルスカウントし死
細胞数を求める。
が、この時、ラインP5より死菌検知物質を所定濃度で添
加し反応槽23で所定時間反応させた後、ラインP6を介し
てセル24に入る。セル24には死細胞に作用させた色素を
励起するに必要な波長の光を照射しており、このセル内
を通過する粒子は散乱光および死細胞は散乱光以外に蛍
光を発する。15は散乱光をカットする蛍光フィルタで死
細胞の発する蛍光だけを通過させる。レンズ16を介して
受光器17により蛍光を受光し、パルスカウンタ18により
死細胞の発する蛍光を光の点としてパルスカウントし死
細胞数を求める。
なお、生菌検知物質としてフルオレセイン二酢酸を用
いた場合、反応槽19での反応時間は10分以内でありまた
死菌検知物質としてDAPIを用いた場合、反応槽23での反
応時間は１分以内であり、本発明方法では約10分という
従来の寒天培養法の数十時間の測定時間に比較して格段
に短くてすみ、またセル内を通過する個々の粒子を１
個、１個、光の点のパルスとしてカウントする方式であ
るため、１個/ml以下という極めて低い細胞濃度でも測
定を可能とする。
いた場合、反応槽19での反応時間は10分以内でありまた
死菌検知物質としてDAPIを用いた場合、反応槽23での反
応時間は１分以内であり、本発明方法では約10分という
従来の寒天培養法の数十時間の測定時間に比較して格段
に短くてすみ、またセル内を通過する個々の粒子を１
個、１個、光の点のパルスとしてカウントする方式であ
るため、１個/ml以下という極めて低い細胞濃度でも測
定を可能とする。
本発明においては、生細胞および死細胞の発する蛍光
量の強さ、およびこの蛍光を検知するために必要な受光
器の選定が最も大きな技術的ポイントである。そこで本
発明者等はこれらの点について検討するため対象試料と
して酵母を用い光学的、電気的に生細胞、死細胞からの
蛍光量の測定を行った結果、生細胞１個当りの蛍光発光
量はフルオレセイン二酢酸を50μg/ml作用させた時、30
〜80pW、そして死菌１個当りの蛍光発光量はDAPIを１μ
g/ml作用させた時、約100〜200pWという数値を得た。そ
こで、この光エネルギーを検知する能力を有する受光器
を選定し試験に使用した。
量の強さ、およびこの蛍光を検知するために必要な受光
器の選定が最も大きな技術的ポイントである。そこで本
発明者等はこれらの点について検討するため対象試料と
して酵母を用い光学的、電気的に生細胞、死細胞からの
蛍光量の測定を行った結果、生細胞１個当りの蛍光発光
量はフルオレセイン二酢酸を50μg/ml作用させた時、30
〜80pW、そして死菌１個当りの蛍光発光量はDAPIを１μ
g/ml作用させた時、約100〜200pWという数値を得た。そ
こで、この光エネルギーを検知する能力を有する受光器
を選定し試験に使用した。
なお、この実施例では、セル22により生菌と全粒子数
を、セル24にて死菌数を計測する例を示したが、セル22
で死菌数をセル24にて生菌数を計測してもよいし、散乱
光の測定は22,24のどちらのセルを行ってもかまわな
い。
を、セル24にて死菌数を計測する例を示したが、セル22
で死菌数をセル24にて生菌数を計測してもよいし、散乱
光の測定は22,24のどちらのセルを行ってもかまわな
い。
次に本装置を用いた試験実施例を示す。
（１）試料溶液 48時間培養したBaker′s Yeast（酵母）を遠心分離器
により遠心濃縮（3000rpm、５分間）して細胞を回収
し、pH7.0、1/15Mリン酸バッファー液で洗浄したものを
生細胞とした。
により遠心濃縮（3000rpm、５分間）して細胞を回収
し、pH7.0、1/15Mリン酸バッファー液で洗浄したものを
生細胞とした。
また死細胞はこれを121℃５分間加熱処理したものを
使用した。微生物細胞以外の粒子としてはポリスチレン
ラテックス標準粒子を使用し生細胞：死細胞：ポリスチ
レンラテックス標準粒子＝1:10:10の割合で混合し、総
粒子数として約100個/mlの濃度になるように調整した。
使用した。微生物細胞以外の粒子としてはポリスチレン
ラテックス標準粒子を使用し生細胞：死細胞：ポリスチ
レンラテックス標準粒子＝1:10:10の割合で混合し、総
粒子数として約100個/mlの濃度になるように調整した。
（２）フルオレセイン二酢酸溶液 アセトンにフルオレセイン二酢酸を溶解して1mg/mlの
濃度に調整したものを試料に対し50μg/mlの濃度になる
ように添加した。
濃度に調整したものを試料に対し50μg/mlの濃度になる
ように添加した。
（３）DAPI溶液 純水にDAPIを100μg/mlの濃度になるように調整し試
料に対し１μg/mlの濃度で添加した。
料に対し１μg/mlの濃度で添加した。
（４）試料処理量、反応条件 試料を10mg/minの処理速度で内径1mmφのガラス製セ
ル内を通過させたが、この時、反応槽19では37℃、５分
間、また反応槽23では室温で１分間試料と色素との反応
を行わせた。
ル内を通過させたが、この時、反応槽19では37℃、５分
間、また反応槽23では室温で１分間試料と色素との反応
を行わせた。
（５）測定条件 照射光として100W水銀ランプを使用し、励起フィルタ
６には450〜490nmの波長域を通過するもの、また蛍光フ
ィルタ８は510nm以上の波長域を通過するものを使用し
た。また死菌を励起させるためのフィルタ４には、330
〜380nmの波長域を通過するもの、蛍光フィルタ15には4
20nm以上の波長域を通過するものを用いた。
６には450〜490nmの波長域を通過するもの、また蛍光フ
ィルタ８は510nm以上の波長域を通過するものを使用し
た。また死菌を励起させるためのフィルタ４には、330
〜380nmの波長域を通過するもの、蛍光フィルタ15には4
20nm以上の波長域を通過するものを用いた。
（６）測定結果 パルスカウンタにてカウントされた各々の粒子数を第
１表に示す。この値は試料10ml当りの粒子カウント数で
ある。この結果より生菌：死菌：微生物細胞以外の粒子
数（全粒子数−生菌数−死菌数）＝52:508:480となり初
期設定値の1:10:10にほぼ近い数値を得ることができ
た。
１表に示す。この値は試料10ml当りの粒子カウント数で
ある。この結果より生菌：死菌：微生物細胞以外の粒子
数（全粒子数−生菌数−死菌数）＝52:508:480となり初
期設定値の1:10:10にほぼ近い数値を得ることができ
た。
〔発明の効果〕 本発明の効果として （１） 従来法では不可能であった生菌、死菌、微生物
細胞以外の粒子数をそれぞれ識別して計測できる。
細胞以外の粒子数をそれぞれ識別して計測できる。
（２） 従来寒天培養法では数十時間必要であった微生
物細胞の計測が本発明方法により10分以内で測定でき
る。
物細胞の計測が本発明方法により10分以内で測定でき
る。
（３） また、各細胞、粒子を光の点としてパルスカウ
ントすることにより低い細胞濃度の試料でも測定でき
る。
ントすることにより低い細胞濃度の試料でも測定でき
る。
となり、殺菌装置の性能把握、原料、製品の品質管理が
高精度かつ迅速に行えるようになった。
高精度かつ迅速に行えるようになった。
第１図は本発明の実施例を説明するための説明図であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 土井 崇史 神奈川県横浜市金沢区幸浦１丁目８番地 １ 三菱重工業株式会社基盤技術研究所 内 (56)参考文献 国際公開89／8714（ＷＯ，Ａ１)
Claims (1)
- 【請求項１】微生物細胞とその他の粒子とを含む試料に
光を照射し、上記試料中の全体の粒子から生じる個々の
散乱光を光の点として検出して全体の粒子数を計測する
工程と、上記試料中の生きている微生物細胞の酵素ある
いは補酵素と反応して蛍光物質を生成する試薬を添加
し、生成する蛍光物質を励起させる光を照射して微生物
細胞から生じる蛍光を光の点として検出して生きている
微生物細胞の数を計測する工程と、上記試料中の死んで
いる微生物細胞の核酸に作用する蛍光物質を添加し、該
蛍光物質を励起させる光を照射して微生物細胞から生じ
る蛍光を光の点として検出して死んでいる微生物細胞の
数を計測する工程とを有することを特徴とする微生物の
生細胞、死細胞および微生物細胞以外の粒子の数の測定
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1269130A JP2735901B2 (ja) | 1989-10-18 | 1989-10-18 | 微生物の生細胞，死細胞および微生物細胞以外の粒子の数の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1269130A JP2735901B2 (ja) | 1989-10-18 | 1989-10-18 | 微生物の生細胞，死細胞および微生物細胞以外の粒子の数の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03131743A JPH03131743A (ja) | 1991-06-05 |
| JP2735901B2 true JP2735901B2 (ja) | 1998-04-02 |
Family
ID=17468110
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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1989
- 1989-10-18 JP JP1269130A patent/JP2735901B2/ja not_active Expired - Fee Related
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