JPWO2005050518A1 - Method of creating interaction map using gene and / or protein database, and software and apparatus for realizing the method - Google Patents

Abstract

ポストゲノム機能解析において、蛋白質間および蛋白質-核酸間などの相互作用ネットワーク解析から公知の蛋白質の新たな機能やこれまで知られていなかった新規の蛋白質などの重要な生体高分子の発見による医薬品の創製などに応用可能な遺伝子ネットワーク・マップを提供する。遺伝子および／又は蛋白質の相互関係のデータに基づき遺伝子および／又は蛋白質の相互関係を示すマップの作成方法において、相互関係として遺伝子および／又は蛋白質の機能エレメントに基づく相互関係を用いる。In post-genome functional analysis, the discovery of important biopolymers such as new functions of known proteins and new proteins that have not been known from the analysis of interaction networks between proteins and protein-nucleic acids. Providing gene network maps that can be applied to creation, etc. In the method of creating a map showing the correlation between genes and / or proteins based on the correlation data between genes and / or proteins, correlations based on functional elements of genes and / or proteins are used as correlations.

Description

本発明は、蛋白質および遺伝子のデータベースを用いた複合体形成又は相互作用の関係性を表す図(ネットワーク・マップ)およびその図の作成方法、ならびにそれを実現するためのソフトウエアおよび装置に関する。   The present invention relates to a diagram (network map) representing the relationship of complex formation or interaction using a protein and gene database, a method of creating the diagram, and software and apparatus for realizing the diagram.

現在、多様な生物のゲノムの塩基配列が解読されようとしている。ゲノムシーケンスの研究では、第２幕のポストシーケンスの研究として、解読したゲノム情報からその意味を解析する研究、すなわち、遺伝子や蛋白質の構造や機能解析(非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３)、および蛋白質間、核酸-蛋白質間相互作用解析などが期待されている(非特許文献４、非特許文献５)。   Currently, genome sequences of various organisms are being decoded. In the research of genome sequence, as the post-sequence study of Act 2, the study of analyzing the meaning from the decoded genome information, that is, the structure and function analysis of genes and proteins (Non-patent Document 1, Non-patent Document 2, Non-patent Document Patent Document 3) and protein-protein / nucleic acid-protein interaction analysis are expected (Non-Patent Document 4, Non-Patent Document 5).

以上のような技術を駆使したポストゲノム機能解析によって、蛋白質間および蛋白質-核酸間などの相互作用ネットワーク解析から公知の蛋白質の新たな機能やこれまで知られていなかった新規の蛋白質などの重要な生体酵素の発見による医薬品の創製などが期待されている。   By using post-genome functional analysis that makes full use of the above-mentioned techniques, it is possible to analyze important functions such as new functions of known proteins and new proteins that have not been known so far from analysis of protein-protein and protein-nucleic acid interaction networks. The creation of pharmaceuticals by the discovery of biological enzymes is expected.

蛋白質間相互作用の検出方法として、これまで免疫沈降(非特許文献６)、GST融合蛋白質によるプルダウン・アッセイ(非特許文献７)、TAP法 (非特許文献８)、酵母ツーハイブリッド法 (非特許文献９)などが知られている。一方、進化分子工学のツールとして誕生した「遺伝子(遺伝子型)と蛋白質(表現型)の対応付け」を応用して、ポストゲノム機能解析における蛋白質間相互作用を網羅的に解析する方法として、in vitroウイルス法 (非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、特許文献１、特許文献２)、STABLE法 (非特許文献１３)、ファージディスプレー法 (非特許文献１４)、リボソーム・ディスプレイ法（非特許文献１５、特許文献３）、mRNA-ペプチドヒュージョン(mRNAディスプレイ)法(非特許文献１６)などが知られている。   As methods for detecting protein-protein interactions, immunoprecipitation (Non-patent Document 6), pull-down assay using GST fusion protein (Non-patent Document 7), TAP method (Non-patent Document 8), yeast two-hybrid method (Non-patent Document) Document 9) is known. On the other hand, as a method for comprehensive analysis of protein-protein interactions in post-genome functional analysis by applying `` association of genes (genotypes) and proteins (phenotypes) '' that was born as an evolutionary molecular engineering tool, In vitro virus method (Non-patent document 10, Non-patent document 11, Non-patent document 12, Patent document 1, Patent document 2), STABLE method (Non-patent document 13), Phage display method (Non-patent document 14), Ribosome display Methods (Non-patent Document 15 and Patent Document 3), mRNA-peptide fusion (mRNA display) method (Non-patent Document 16), and the like are known.

さらに、表面プラズモン共鳴法、蛍光共鳴エネルギー移動法、蛍光偏光解消法、エバネッセント場イメージング法、蛍光相関分光法、蛍光イメージング法、固相酵素免疫検定法などが知られている。また、ピューロマイシン等の核酸誘導体を用いて翻訳系中で蛋白質のC末端を修飾する方法(特許文献４、特許文献５)が知られている。   Furthermore, surface plasmon resonance, fluorescence resonance energy transfer, fluorescence depolarization, evanescent field imaging, fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence imaging, solid-phase enzyme immunoassay, and the like are known. In addition, a method of modifying the C-terminus of a protein in a translation system using a nucleic acid derivative such as puromycin (Patent Documents 4 and 5) is known.

以上のようなさまざまな方法によって、蛋白質や遺伝子の複合体や相互作用解析が進み、その結果として、網羅的な遺伝子ネットワーク・マッピングが行われ、そのネットワーク・マップから、生物学的に意味のある事柄を抽出してこようとする研究が盛んとなっている。   Through various methods as described above, protein and gene complexes and interaction analysis proceed, and as a result, comprehensive gene network mapping is performed, and the network map is biologically meaningful. Research that tries to extract matters has been thriving.

現在、主に、TAP法、酵母ツーハイブリッド法などの網羅的解析結果をバイオインフォマティックスでデータ処理し、遺伝子間又は蛋白質間ネットワーク・マップを描き出し、いろいろな角度から解析検討が行われている(非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９)。従来の遺伝子間又は蛋白質間ネットワーク・マップ技術では、単純に相互作用のある遺伝子間又は蛋白質間を結合させるものである。
Saegusa A. Nature 401, 6751 (1999) Dalton R, Abbott A. Nature 402, 6763 (1999) 宮本悦子、柳川弘志 (2000) シリーズ・ポストシークエンスのゲノム科学3: プロテオミクス, pp.136-145 宮本悦子、柳川弘志 (2001) 蛋白質・核酸・酵素、46(2), pp.138-147) 宮本悦子、柳川弘志 (2001) 蛋白質・核酸・酵素、48(11), pp.1474-1480) Xiong et al. 1993 Nature 366, 701-704 Kaelin, et al. 1991 Cell 64, 521-532 Guillaume Rigaut, et al., Nature biotechnology 17, 1030 (1999) Fields S, Song O. Nature 340, 245 (1989) Miyamoto-Sato E, et al. Viva Origino 25, 35 (1997) Nemoto N, et al. FEBS Lett. 414, 405 (1997) Miyamoto-Sato, E. et al. Nucleic Acids Res. 31, e78 (2003) 国際公開第ＷＯ９８／１６６３６号パンフレット 国際公開第ＷＯ０２／４６３９５号パンフレット Doi N, Yanagawa H. FEBS Lett. 457, 227 (1999) Smith G.P. Science 228, 1315 (1985) Mattheakis, L.C. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9022-9026 国際公開第ＷＯ９５／１１９２２号パンフレット Roberts R.W, Szostak J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297 米国特許第６，２２８，９９４号明細書 国際公開第ＷＯ０２／４８３４７号パンフレット Schwikowski B., Uetz P. & Fields S. Nat. Biotechnol. 18, 1257-1261 (2000) Bader, G.D. & Hogue Christopher, Nat. Biotechnol. 20, 991-997 (2002) Legrain, P., Wojcik, J. & Gauthier, J-M. Trends in Genetics 17, 346-352 (2001) Currently, comprehensive analysis results such as the TAP method and yeast two-hybrid method are processed with bioinformatics, and network maps between genes or proteins are drawn and analyzed from various angles. (Non-patent document 17, Non-patent document 18, Non-patent document 19). In the conventional gene-protein or protein-protein network map technology, the gene-protein or protein-protein that interacts is simply combined.
Saegusa A. Nature 401, 6751 (1999) Dalton R, Abbott A. Nature 402, 6763 (1999) Junko Miyamoto, Hiroshi Yanagawa (2000) Genome Science in Series Postsequence 3: Proteomics, pp.136-145 (Reiko Miyamoto, Hiroshi Yanagawa (2001) Protein, Nucleic Acid, Enzyme, 46 (2), pp.138-147) (Reiko Miyamoto, Hiroshi Yanagawa (2001) Protein, Nucleic Acid, Enzyme, 48 (11), pp.1474-1480) Xiong et al. 1993 Nature 366, 701-704 Kaelin, et al. 1991 Cell 64, 521-532 Guillaume Rigaut, et al., Nature biotechnology 17, 1030 (1999) Fields S, Song O. Nature 340, 245 (1989) Miyamoto-Sato E, et al. Viva Origino 25, 35 (1997) Nemoto N, et al. FEBS Lett. 414, 405 (1997) Miyamoto-Sato, E. et al. Nucleic Acids Res. 31, e78 (2003) International Publication No. WO98 / 16636 Pamphlet International Publication No. WO02 / 46395 Pamphlet Doi N, Yanagawa H. FEBS Lett. 457, 227 (1999) Smith GP Science 228, 1315 (1985) Mattheakis, LC et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9022-9026 International Publication No. WO95 / 11922 Pamphlet Roberts RW, Szostak JW (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297 US Pat. No. 6,228,994 International Publication No. WO02 / 48347 Pamphlet Schwikowski B., Uetz P. & Fields S. Nat. Biotechnol. 18, 1257-1261 (2000) Bader, GD & Hogue Christopher, Nat. Biotechnol. 20, 991-997 (2002) Legrain, P., Wojcik, J. & Gauthier, JM.Trends in Genetics 17, 346-352 (2001)

従来の遺伝子又は蛋白質のネットワーク・マップは、単純に相互作用のある遺伝子や蛋白質を結合することでネットワーク(図１A)を作図している。そのため、この方法では、マップからの複合体の予測、構造と機能とのリンクによる創薬への応用などが困難である。本発明の課題は、ポストゲノム機能解析において、蛋白質間および蛋白質-核酸間などの相互作用ネットワーク解析から公知の蛋白質の新たな機能やこれまで知られていなかった新規の蛋白質などの重要な生体高分子の発見による医薬品の創製などに応用可能な遺伝子ネットワーク・マップを提供することである。   A conventional gene or protein network map draws a network (FIG. 1A) by simply combining genes and proteins that interact with each other. Therefore, with this method, it is difficult to predict a complex from a map and apply it to drug discovery by linking structure and function. The subject of the present invention is that in post-genome functional analysis, important functions such as a new function of a known protein or a novel protein that has not been known so far are analyzed from interaction network analysis between proteins and between protein and nucleic acid. The goal is to provide a genetic network map that can be applied to the creation of pharmaceuticals through the discovery of molecules.

本発明者らは、蛋白質−蛋白質又は蛋白質−核酸の相互作用する領域で、アミノ酸配列又は核酸配列で表示される機能エレメントに着目し、延べの遺伝子間や蛋白質間の結合ではなくて、相互作用のある遺伝子や蛋白質の機能エレメント間の結合によるネットワーク(図１B)を作図すると、一層生物学的に意味のあるマップを提供できることを見出し、本発明を完成した。   The present inventors pay attention to functional elements represented by amino acid sequences or nucleic acid sequences in a protein-protein or protein-nucleic acid interacting region, and not interactions between all genes or proteins, but interactions. It was found that a more biologically meaningful map can be provided by constructing a network (FIG. 1B) by binding between functional elements of certain genes and proteins.

本発明は、以下のものを提供する。   The present invention provides the following.

１． 遺伝子および／又は蛋白質の相互関係のデータに基づき遺伝子および／又は蛋白質の相互関係を示すマップの作成方法であって、相互関係が遺伝子および／又は蛋白質の機能エレメントに基づく相互関係であることを特徴とする方法。   1. A method for creating a map showing a correlation between genes and / or proteins based on data on the correlation between genes and / or proteins, wherein the correlation is a correlation based on functional elements of genes and / or proteins And how to.

２． 機能エレメントが、遺伝子および／又は蛋白質の相互作用解析によりランダムライブラリーから抽出された配列に基づき決定されたものである１に記載の方法。   2. 2. The method according to 1, wherein the functional element is determined on the basis of a sequence extracted from a random library by gene and / or protein interaction analysis.

３． ランダムライブラリーが核酸配列のランダムライブラリーである２記載の方法。   3. 3. The method according to 2, wherein the random library is a random library of nucleic acid sequences.

４． ランダムライブラリーが対応付け分子のランダムライブラリーである２記載の方法。   4). 3. The method according to 2, wherein the random library is a random library of mapping molecules.

５． 相互作用解析が、in vitroウイルスを用いる相互作用解析である２〜４のいずれか１項に記載の方法。   5. 5. The method according to any one of 2 to 4, wherein the interaction analysis is an interaction analysis using an in vitro virus.

６． 遺伝子および／又は蛋白質の間の相互関係のデータを記憶する記憶手段、ならびに、記憶手段から読み出された相互関係のデータに基づき遺伝子および／又は蛋白質の間の相互関係を示すマップを描画する手段としてコンピューターを機能させるためのプログラムであって、遺伝子および／又は蛋白質の相互関係が、遺伝子および／又は蛋白質の機能エレメントに基づく相互関係であることを特徴とするプログラム。   6). Storage means for storing data of correlation between genes and / or proteins, and means for drawing a map showing the correlation between genes and / or proteins based on the correlation data read from the storage means A program for causing a computer to function as a program, wherein the correlation between genes and / or proteins is a correlation based on functional elements of genes and / or proteins.

７． 機能エレメントが、遺伝子および／又は蛋白質の相互作用解析によりランダムライブラリーから抽出された配列に基づき決定されたものである６に記載のプログラム。   7). 7. The program according to 6, wherein the functional element is determined based on a sequence extracted from a random library by gene and / or protein interaction analysis.

８． ランダムライブラリーが核酸配列のランダムライブラリーである７記載のプログラム。   8). 8. The program according to 7, wherein the random library is a random library of nucleic acid sequences.

９． ランダムライブラリーが対応付け分子のランダムライブラリーである７記載のプログラム。   9. 8. The program according to 7, wherein the random library is a random library of mapping molecules.

１０． 相互作用解析が、in vitroウイルスを用いる相互作用解析である７〜９のいずれか１項に記載のプログラム。   10. The program according to any one of 7 to 9, wherein the interaction analysis is an interaction analysis using an in vitro virus.

１１． ６〜１０のいずれか１項に記載されたプログラムを記録したコンピューター読み取り可能な記録媒体。   11. The computer-readable recording medium which recorded the program as described in any one of 6-10.

１２． 遺伝子および／又は蛋白質の間の相互関係のデータを記憶する記憶手段、ならびに、記憶手段から読み出された相互関係のデータに基づき遺伝子および／又は蛋白質の間の相互関係を示すマップを描画する手段を備える、遺伝子および／又は蛋白質の相互関係を示すマップの作成装置であって、遺伝子および／又は蛋白質の相互関係が、遺伝子および／又は蛋白質の機能エレメントに基づく相互関係であることを特徴とする装置。   12 Storage means for storing data of correlation between genes and / or proteins, and means for drawing a map showing the correlation between genes and / or proteins based on the correlation data read from the storage means An apparatus for creating a map showing a correlation between genes and / or proteins, wherein the correlation between genes and / or proteins is a correlation based on functional elements of genes and / or proteins apparatus.

１３． 機能エレメントが、遺伝子および／又は蛋白質の相互作用解析によりランダムライブラリーから抽出された配列に基づき決定されたものである１２に記載の装置。   13. 13. The apparatus according to 12, wherein the functional element is determined based on a sequence extracted from a random library by gene and / or protein interaction analysis.

１４． ランダムライブラリーが核酸配列のランダムライブラリーである１２記載の装置。   14 13. The apparatus according to 12, wherein the random library is a random library of nucleic acid sequences.

１５． ランダムライブラリーが対応付け分子のランダムライブラリーである１２記載の装置。   15. 13. The apparatus according to 12, wherein the random library is a random library of mapping molecules.

１６． 相互作用解析が、in vitroウイルスを用いる相互作用解析である１３〜１５のいずれか１項に記載の装置。   16. The apparatus according to any one of 13 to 15, wherein the interaction analysis is an interaction analysis using an in vitro virus.

１７． in vitroウイルスを用いる相互作用解析により、相互作用する遺伝子又は蛋白質のライブラリーを得、そのライブラリーの遺伝子又は蛋白質の核酸配列又はアミノ酸配列から抽出された配列に基づき機能エレメントを決定することを含む、機能エレメントの決定方法。   17. including obtaining a library of interacting genes or proteins by in vitro virus interaction analysis and determining functional elements based on sequences extracted from the nucleic acid or amino acid sequences of the genes or proteins in the library , How to determine functional elements.

本発明は、延べの遺伝子や蛋白質のネットワーク・マップではなくて、遺伝子や蛋白質の機能エレメントを抽出し、それら機能エレメントを抽出した遺伝子や蛋白質のデータベースを用いた機能エレメント間の結合によるネットワーク・マップを提供する（図１）。そのことによって、遺伝子間や蛋白質間のネットワークの詳細な解析や複合体の予想が可能となり、構造解析と合わせて解析することにより、創薬支援システムへ応用可能なマップを提供することが可能になる。   The present invention is not a network map of all genes and proteins, but a network map obtained by extracting functional elements of genes and proteins, and connecting the functional elements using a database of genes and proteins from which the functional elements are extracted. (FIG. 1). As a result, detailed analysis of networks between genes and proteins and prediction of complexes are possible, and by combining with structural analysis, it is possible to provide maps applicable to drug discovery support systems. Become.

複合体の予測に関しては、図２に示すように、たとえば、三つの蛋白質の相互作用を従来のマップで書くと、三つの蛋白質の複合体について(I)の場合なのか(II)の場合なのかを予測することは不可能であったが、機能エレメントに基づくマップでは、蛋白質d, eが同じ機能ドメインで蛋白質Aと相互作用しているならば、複合体は(I)ではなくて(II)の場合であることが予測できる。   Regarding the prediction of the complex, as shown in FIG. 2, for example, when the interaction of three proteins is written on a conventional map, it is the case of (I) or (II) about the complex of three proteins. However, in the map based on functional elements, if protein d and e interact with protein A in the same functional domain, the complex is not (I) ( It can be predicted that this is the case of II).

構造解析と機能解析のリンクによる創薬への応用に関しては、図３に示すように、機能エレメントが決定された蛋白質について構造解析を行えば、構造解析と機能解析のリンクが可能となる。これまでの相互作用マップでは、相互作用している部位の配列までは知りようがなかったが、機能エレメントに基づくマップでは、相互作用している特定の配列とその部分の構造を比較することが可能となり、阻害剤などの創薬のためのミューテーション実験などに大変有利となる。   Regarding application to drug discovery by linking structural analysis and functional analysis, as shown in FIG. 3, if structural analysis is performed on a protein for which a functional element is determined, the structural analysis and functional analysis can be linked. In previous interaction maps, it was impossible to know the sequence of the interacting site, but in the map based on functional elements, it is possible to compare the specific sequence interacting with the structure of that part. It becomes possible, and it is very advantageous for mutation experiments for drug discovery such as inhibitors.

図４のように、機能エレメントが抽出された蛋白質(遺伝子)の各機能エレメントを選択したときのネットワーク・パターンは、それぞれ異なってくる。一つの蛋白質(遺伝子)でもさまざまなネットワークに関係している可能性があり、これまでのような延べの結合のみを表示する方法では、生体のパスウエイを予想することは困難であった。   As shown in FIG. 4, the network patterns when the functional elements of the protein (gene) from which the functional elements are extracted are different. Even a single protein (gene) may be related to various networks, and it has been difficult to predict biological pathways using the conventional method of displaying only total bonds.

また、図５のように、機能エレメントに基づく遺伝子ネットワーク・マップは、各機能エレメントに基づくネットワーク・パターンから複合体を予測可能であり、構造解析データと照らし合わせながら、注目している遺伝子のin vivoでのパスウエイを予想し、それを検証するための実験を組み立てる支援が可能となる。   In addition, as shown in FIG. 5, the gene network map based on the functional elements can predict a complex from the network pattern based on each functional element. Predict pathology in vivo and assist in assembling experiments to verify it.

最終的には、機能エレメントに基づくネットワーク・マップを土台として、複合体の予想や構造解析データとの融合により、図６のような生体の遺伝子ネットワークのモデルを提案できる。   Finally, based on a network map based on functional elements, a model of a biological gene network as shown in FIG. 6 can be proposed by fusing with complex prediction and structural analysis data.

また、IVV法(図７)による機能エレメント抽出によるマッピングでは、擬陽性が少ないため、酵母ツーハイブリッド法のように擬陽性をバイオインフォマティックのレベルで解決する必要が無く、大変有利となる(図８)。IVV法による機能エレメント決定法は、通常には、以下のように実施できる。図９に示すように、シーケンス配列を入力し、ベクター配列を除去し、cDNA配列を抽出し、データベース検索し、蛋白質フレームやIVVフレームを確認する。以上によって、IVVとして蛋白質を発現しているテンプレートのみ選択し、それらのテンプレートをアライメントとクラスタリングにかけ、各クラスターから蛋白質や遺伝子の共通配列を抽出比較し、機能エレメントを決定する。それら機能エレメントを抽出した遺伝子や蛋白質を集めてデータベースとし、そのデータベースを用いたネットワーク・マップを提供することができる。   In addition, since mapping by functional element extraction by the IVV method (FIG. 7) has few false positives, there is no need to solve false positives at the bioinformatics level as in the yeast two-hybrid method (FIG. 8). . The functional element determination method by the IVV method can be usually performed as follows. As shown in FIG. 9, the sequence sequence is input, the vector sequence is removed, the cDNA sequence is extracted, the database is searched, and the protein frame and the IVV frame are confirmed. As described above, only templates expressing a protein as IVV are selected, the templates are subjected to alignment and clustering, a common sequence of proteins and genes is extracted and compared from each cluster, and functional elements are determined. Genes and proteins from which these functional elements are extracted can be collected into a database, and a network map using the database can be provided.

本発明の機能エレメントに基づく遺伝子ネットワーク・マップの一例を示す。従来の遺伝子ネットワーク・マップと本発明の機能エレメントに基づいた遺伝子ネットワーク・マップを比較して示す。ここでは、A遺伝子(蛋白質)が３つの機能エレメントから構成されている。An example of the gene network map based on the functional element of this invention is shown. A conventional gene network map is compared with a gene network map based on the functional elements of the present invention. Here, the A gene (protein) is composed of three functional elements. 本発明の機能エレメントに基づく遺伝子ネットワーク・マップにおける複合体予測の一例を示す。蛋白質eと蛋白質dが蛋白質Aの同じ機能エレメントで結合する場合は、Iのケースの複合体はあり得ないことが予想される。I: ３つの蛋白質からなる複合体、II:２つの蛋白質からなる複合体。An example of the complex prediction in the gene network map based on the functional element of the present invention is shown. When protein e and protein d are bound by the same functional element of protein A, it is expected that there cannot be a complex in the case of I. I: a complex composed of three proteins, II: a complex composed of two proteins. 本発明で用いられる機能エレメントが抽出された蛋白質(遺伝子)の一例を示す。機能解析において機能エレメントが抽出された蛋白質は、構造解析結果と合わせることで、機能解析と構造解析の橋渡しが可能となり、創薬などに貢献可能となる。ここでは３つの機能エレメント(Element)が抽出された蛋白質を示している。An example of a protein (gene) from which functional elements used in the present invention have been extracted is shown. Proteins from which functional elements have been extracted in functional analysis can be combined with structural analysis results to bridge functional analysis and structural analysis, thereby contributing to drug discovery and the like. Here, the protein from which three functional elements (Element) are extracted is shown. 機能エレメントが抽出された蛋白質(遺伝子)と各機能エレメントを選択したときの本発明の機能エレメントに基づくネットワーク・パターンの例を示す。The example of the network pattern based on the functional element of this invention when the protein (gene) from which the functional element was extracted and each functional element is selected is shown. 遺伝子ネットワークの一例を示す。本発明の機能エレメントに基づく遺伝子ネットワーク・マップは、各機能エレメントに基づくネットワーク・パターンから複合体を予測可能であり、構造解析と照らし合わせながら、注目している遺伝子のin vivoでのパスウエイを予想し、それを検証するための実験を組み立てる支援が可能となる。An example of a gene network is shown. The gene network map based on the functional elements of the present invention can predict a complex from the network pattern based on each functional element, and predict the in vivo pathway of the gene of interest while comparing with the structural analysis. And support for assembling experiments to verify it. 生体の遺伝子ネットワーク・モデルの一例を示す。本発明の機能エレメントに基づく遺伝子ネットワーク・マップを土台として、複合体の予想や構造解析との融合により、最終的に提供されると考えられる仮想的な例である。An example of a biological gene network model is shown. This is a hypothetical example that is considered to be finally provided by fusion with prediction of a complex and structural analysis based on a gene network map based on the functional element of the present invention. 遺伝子ネットワーク・マップおよび機能エレメントが抽出された蛋白質(遺伝子)を実現するためのIVVセレクション法による解析システムの一例を示す。IVVセレクション法による解析システムは、IVVセレクションによる一次スクリーニングとＣ末端ラベル化法などを利用した相互作用解析であるポストセレクションとしての二次スクリーニングからなる。一次スクリーニングで物質や蛋白質と相互作用を検出し、さらに、相互作用の詳細をFCCSやマイクロアレイなどの二次スクリーニングで解析することが可能である。また、本発明の蛋白質や核酸配列は、IVV又はＣ末端ラベル化蛋白質として、単独でFCCSやマイクロアレイなどにより物質や蛋白質との相互作用解析に利用することも可能である。また、本発明の蛋白質や核酸配列のIVVを用いた進化分子工学に応用し、一次スクリーニングにより機能性蛋白質の創出に利用することも可能であり、その際に、一次スクリーニングと二次スクリーニングを組み合わせて、創出した機能性蛋白質の相互作用の詳細を解析することも可能である。An example of an analysis system using an IVV selection method for realizing a protein (gene) from which a gene network map and functional elements are extracted is shown. The analysis system based on the IVV selection method includes a primary screening based on IVV selection and a secondary screening as post-selection which is an interaction analysis using the C-terminal labeling method. It is possible to detect interactions with substances and proteins in the primary screening, and further analyze the details of the interactions in secondary screening such as FCCS and microarrays. In addition, the protein or nucleic acid sequence of the present invention can be used as an IVV or C-terminal labeled protein alone for analyzing an interaction with a substance or protein by FCCS or microarray. It can also be applied to evolutionary molecular engineering using IVV of proteins and nucleic acid sequences of the present invention, and can be used to create functional proteins by primary screening, in which case primary screening and secondary screening are combined. It is also possible to analyze the details of the interaction of the created functional protein. 遺伝子ネットワーク・マップおよび機能エレメントが抽出された蛋白質(遺伝子)を実現するためのIVVセレクション法による信頼性の高いデータベースの構築の一例を示す。従来法では、擬陽性の高いデータをバイオインフォマティックスによる後処理で解決を試みてきたが、IVVセレクション法では、擬陽性の低い実験データが最初から提供される。An example of the construction of a highly reliable database by the IVV selection method for realizing a protein (gene) from which a gene network map and functional elements are extracted is shown. In the conventional method, data with high false positives have been attempted to be resolved by post-processing with bioinformatics, but the IVV selection method provides experimental data with low false positives from the beginning. 遺伝子ネットワーク・マップおよび機能エレメントが抽出された蛋白質(遺伝子)を実現するためのIVVセレクション法の検出配列データ解析フローを示す。IVVセレクション法による解析システムで検出した配列のシーケンスを入力し、配列の前処理の後、データベース検索、アライメント解析してクラスタリングにより各機能エレメントの共通配列を抽出し、解析結果の一覧を遺伝子カタログとして表示する。さらに、それらの解析結果をデータベースとして蓄え、それらのデータをもとにして、遺伝子ネットワーク・マップ又は機能エレメントが抽出された蛋白質(遺伝子)を作図する。The detection sequence data analysis flow of the IVV selection method for realizing a protein (gene) from which a gene network map and functional elements are extracted is shown. Input the sequence of sequences detected by the IVV selection method analysis system. After sequence preprocessing, database search, alignment analysis and clustering to extract common sequences of each functional element, and a list of analysis results as a gene catalog. indicate. Further, the analysis results are stored as a database, and a protein (gene) from which a gene network map or a functional element is extracted is drawn based on the data. 機能エレメントに基づく遺伝子ネットワーク・マップおよび機能エレメントが抽出された蛋白質(遺伝子)を実現するために用いることのできるIVVのランダムプライミングライブラリーとその製法の概略を示す。RNAライブラリーを鋳型として、9塩基からなるランダム配列と特定配列（tag２ 配列）を含むランダムプライマーを用いてランダムプライミング法により逆転写でmRNAに相補的な一本鎖cDNAライブラリー(ssDNAライブラリー)を合成する(I)。RNaseHによりcDNAとRNAの二本鎖からRNAのみを分解すると同時に、DNAポリメラーゼIによるcDNAに相補的なDNAを合成し、さらに、DNAリガーゼによりDNA ポリメラーゼIにより合成されたDNA間にあるニックを修正して二本鎖DNAライブラリー(dsDNA ライブラリー)を合成する(II)。合成された二本鎖cDNAはDNAポリメラーゼIにより合成された側のみ5'末端にリン酸基を持つのでこれを利用し、特定配列(5'UTR=プロモーター+エンハンサー)を持つアダプターをDNAリガーゼを用いて結合し、ライゲーテッドdsDNA ライブラリーを合成する(III)。アダプターとランダムプライマーの特定配列を利用してPCRを行い、5'側にプロモーターとエンハンサーの配列、3'側にA tailをもつ対応付け分子のcDNAライブラリー(IVV cDNAライブラリー)を作成する(IV)。次にIVV cDNAライブラリーを転写してIVV RNAライブラリーとし(V)、IVVとするためのスペーサーをライゲーションし(VI)、さらに、無細胞翻訳系などで翻訳すれば、対応付け分子のライブラリーとなる(VII)。A gene network map based on functional elements and an IVV random priming library that can be used to realize a protein (gene) from which functional elements have been extracted and an outline of the production method are shown. Single-stranded cDNA library complementary to mRNA by reverse transcription by random priming method using random primer consisting of random sequence consisting of 9 bases and specific sequence (tag2 sequence) using RNA library as template (ssDNA library) Is synthesized (I). RNaseH breaks down only RNA from the double strands of cDNA and RNA, simultaneously synthesizes DNA complementary to cDNA by DNA polymerase I, and corrects nicks between DNA synthesized by DNA polymerase I by DNA ligase Then, a double-stranded DNA library (dsDNA library) is synthesized (II). Since the synthesized double-stranded cDNA has a phosphate group at the 5 'end only on the side synthesized by DNA polymerase I, this is used to convert an adapter with a specific sequence (5' UTR = promoter + enhancer) into a DNA ligase. To synthesize a ligated dsDNA library (III). Perform PCR using a specific sequence of adapter and random primer to create a cDNA library (IVV cDNA library) of matching molecules with promoter and enhancer sequences on the 5 'side and A tail on the 3' side ( IV). Next, transcribe the IVV cDNA library into an IVV RNA library (V), ligate the spacer to make IVV (VI), and translate it with a cell-free translation system, etc. (VII). 翻訳テンプレート（Ａ）ならびにその構成要素であるコード分子（Ｂ）およびスペーサー分子（Ｃ）の構成を示す。翻訳テンプレートは、コード分子由来のコード部とスペーサー分子由来のスペーサー部からなる。F1およびF2は蛍光色素を示す。The structure of the translation template (A) and its constituent elements, the coding molecule (B) and the spacer molecule (C) are shown. The translation template consists of a coding portion derived from a coding molecule and a spacer portion derived from a spacer molecule. F1 and F2 represent fluorescent dyes. Ｃ末端修飾された蛋白質(Ｃ末端ラベル化蛋白質)（Ａ）、本発明の翻訳テンプレート（Ｂ）、および、修飾剤（Ｃ）の構成を示す。The structures of the C-terminal modified protein (C-terminal labeled protein) (A), the translation template (B) of the present invention, and the modifying agent (C) are shown. 無細胞共翻訳による複合体の形成の概略を示す。A: ベイトとプレイが無細胞翻訳系で共に翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは単数(I)であっても複数(II)であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子(結合体)であっても構わない。B: ベイトの共存下、プレイが無細胞翻訳系で翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは単数(I)であっても複数(II)であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子(結合体)であっても構わない。An outline of complex formation by cell-free cotranslation is shown. A: Bait and prey are translated and interacted together in a cell-free translation system, forming a complex in the cell-free translation system. A prey may be singular (I) or plural (II), and even a polypeptide itself obtained by translation in a cell-free translation system is a mapping molecule (conjugate). It doesn't matter. B: In the presence of bait, prey is translated and interacts in a cell-free translation system to form a complex in the cell-free translation system. A prey may be singular (I) or plural (II), and even a polypeptide itself obtained by translation in a cell-free translation system is a mapping molecule (conjugate). It doesn't matter. 複合ベイトを用いた場合の無細胞共翻訳による複合体の形成の概略を示す。 複合ベイトを構成する一部のベイトとプレイが無細胞翻訳系で共に翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは、単数(I)であっても複数(II)であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子(結合体)であっても構わない。また、複合ベイトは、図に示した無細胞翻訳系で翻訳されたポリペプチドとDNAベイトの組合せに限られず、無細胞翻訳系で翻訳された複数又は単独のポリペプチドと、無細胞翻訳系で共存する複数又は単独のベイト(たとえば、DNAベイトなど)の組み合わせが挙げられる。The outline of formation of a complex by cell-free cotranslation when using a composite bait is shown. Part of the bait and prey constituting the composite bait are translated and interacted together in a cell-free translation system to form a complex in the cell-free translation system. Prey may be singular (I) or plural (II), and even a polypeptide itself obtained by translation in a cell-free translation system may be an associated molecule (conjugate). It does not matter. In addition, the composite bait is not limited to the combination of the polypeptide translated in the cell-free translation system and the DNA bait shown in the figure, and a plurality or a single polypeptide translated in the cell-free translation system and the cell-free translation system. A combination of plural or single baits (for example, DNA baits) coexisting can be mentioned. 無細胞共翻訳による複合体のスクリーニング方法の概略を示す。 図１３および１４で示したような無細胞共翻訳による複合体形成の工程(1)、その複合体のプレイをスクリーニングする工程(2)、および、プレイの解析の工程(3)により、無細胞共翻訳とスクリーニングをトータルにin vitroで実現することができる。プレイが対応付け分子でかつ複数であれば、RT-PCR又はPCRによってプレイをコードするmRNA又はDNAを再構成することにより再度(1)の工程からスクリーニングを繰り返すことができる。また、得られたプレイを解析後、ベイトとして(1)の工程からスクリーニングを新たに繰り返すことができる。The outline of the screening method of the complex by cell-free cotranslation is shown. The step of complex formation by cell-free cotranslation as shown in FIGS. 13 and 14 (1), the step of screening prey of the complex (2) and the step of analysis of prey (3) Co-translation and screening can be realized in vitro. If the prey is an associated molecule and there are plural, screening can be repeated from step (1) again by reconstituting mRNA or DNA encoding prey by RT-PCR or PCR. Moreover, after analyzing the obtained play, screening can be newly repeated from step (1) as a bait. 遺伝子ネットワーク・マップおよび機能エレメントが抽出された蛋白質(遺伝子)を実現するための手段である機能エレメント決定方法を示す。ランダム・ライブラリーなどからIVVセレクション法などにより検出された複数の遺伝子(蛋白質)配列、又は複数の核酸(DNA)配列が得られたものをアライメントし、クラスタリングによって機能エレメントを抽出する。ここでは、c-Jnuの複数の遺伝子(蛋白質)配列（模様で示す）が得られており、E2のみを持つグループとE2+E3のグループとE1+E2+E3のグループに分けることが出来る。各グループの共通配列を抽出して機能エレメントとした。３つの機能エレメント毎又はその組み合わせによる機能が存在する可能性が考えられる。A functional element determination method, which is a means for realizing a protein (gene) from which a gene network map and functional elements have been extracted, will be described. A plurality of gene (protein) sequences or a plurality of nucleic acid (DNA) sequences detected from a random library or the like by an IVV selection method or the like are aligned, and functional elements are extracted by clustering. Here, a plurality of c-Jnu gene (protein) sequences (indicated by patterns) are obtained, and can be divided into a group having only E2, an E2 + E3 group, and an E1 + E2 + E3 group. The common sequence of each group was extracted and used as a functional element. There is a possibility that a function by every three functional elements or a combination thereof exists. 図１６で抽出したc-Jun遺伝子の機能エレメントE1、E2、E3のアミノ酸配列および核酸配列を示す。FIG. 16 shows the amino acid sequences and nucleic acid sequences of functional elements E1, E2, and E3 of the c-Jun gene extracted in FIG. 図１６で機能エレメントE1、E2、E3を抽出したc-Jun遺伝子とその構造解析結果との照合を示す。FIG. 16 shows a comparison between the c-Jun gene from which the functional elements E1, E2, and E3 have been extracted and the structural analysis results. 図１６で抽出したc-Jun遺伝子の機能エレメントE1、E2、E3を用いたネットワーク・マップと機能エレメントの選択によるネットワーク・マップのパターンの違いを示す。FIG. 16 shows the difference between the network map using the functional elements E1, E2, and E3 of the c-Jun gene extracted in FIG. 16 and the network map pattern depending on the selection of the functional elements. 本発明のマップ作成装置の構成の一例を示す。An example of the structure of the map creation apparatus of this invention is shown.

＜１＞本発明のネットワーク・マップの作成方法
本発明の作成方法は、相互関係が遺伝子および／又は蛋白質の機能エレメントに基づく相互関係であることの他は、通常の、遺伝子および／又は蛋白質の相互関係のデータに基づき遺伝子および／又は蛋白質の相互関係を示すマップ（ネットワーク・マップ）の作成方法と同様でよい。このようなマップはグラフとも呼ばれることがある。また、表示する相互関係の種類によっては、遺伝子ネットワーク・マップ、遺伝子発現制御ネットワークと呼ばれることもある。<1> Method for creating network map of the present invention The method for creating a network map of the present invention is a method for creating a normal gene and / or protein except that the correlation is based on a functional element of the gene and / or protein. This may be the same as the method for creating a map (network map) showing the correlation between genes and / or proteins based on the correlation data. Such a map is sometimes called a graph. In addition, depending on the type of correlation displayed, it may be called a gene network map or gene expression control network.

マップを作成する方法としては、ネットワークを、遺伝子および／又は蛋白質をノード、相互関係をエッジとするグラフとみなして、グラフ表示のアルゴリズムによりマップを作成する方法が挙げられる。代表的なものとしては、「スプリングモデル」と呼ばれるモデルにより作成する方法が挙げられる。   As a method for creating a map, there is a method in which a network is regarded as a graph having genes and / or proteins as nodes and mutual relationships as edges, and a map is created by a graph display algorithm. A typical method is a method of creating a model called a “spring model”.

相互関係には、ある遺伝子が他の遺伝子を制御する関係、蛋白質間で相互作用する関係、ある蛋白質が、他の蛋白質をコードする遺伝子の発現に影響する関係などの直接および間接に作用する関係が含まれる。   Relationships that directly and indirectly act, such as a relationship in which a gene controls another gene, a relationship in which proteins interact, a relationship in which a certain protein affects the expression of a gene encoding another protein Is included.

本発明の作成方法で作成されるネットワーク・マップとは、遺伝子又は蛋白質の相互作用に寄与する特定の配列の結合関係をマッピングしたものである。遺伝子又は蛋白質の相互作用に寄与する特定の配列を機能エレメントと呼び、この配列は、一つの遺伝子又は蛋白質に０−複数存在することがある。機能エレメントがゼロのものは、孤立した遺伝子や蛋白質であり、機能エレメントが沢山あるものは、他のいろいろな遺伝子や蛋白質と相互作用があることを表している。図１(II)のように、たとえば、A遺伝子が３つの機能エレメントを持つ場合、A遺伝子の３つのサブ領域(機能エレメント)とそれぞれさまざまな蛋白質のサブ領域(機能エレメント)との相互作用関係を結合したマップが、本発明による遺伝子ネットワーク・マップである。   The network map created by the creation method of the present invention is a mapping of the binding relationships of specific sequences that contribute to gene or protein interactions. A specific sequence that contributes to the interaction of a gene or protein is called a functional element, and this sequence may exist 0 to plural in one gene or protein. Those with zero functional elements are isolated genes and proteins, and those with many functional elements indicate that they interact with various other genes and proteins. As shown in Fig. 1 (II), for example, when the A gene has three functional elements, the interaction relationship between the three subregions (functional elements) of the A gene and the subregions (functional elements) of various proteins. Is a gene network map according to the present invention.

ここで、機能エレメントとは、遺伝子又は蛋白質の相互作用に寄与する特定の配列であり、遺伝子の場合は核酸配列であり、蛋白質の場合はアミノ酸配列とそれをコードする核酸配列である。いわゆる機能モチーフ、機能ドメインなどと呼ばれている配列でもかまわない。すなわち、あらゆる相互作用解析によって得られた遺伝子間又は蛋白質間の相互作用に寄与する特定の配列であり、たとえば、ミューテーション実験やゲルシフト・アッセイなど配列の一部の改変や削除による相互作用に最低限必要な配列の決定、又は構造決定による相互作用領域の決定、又は、IVVや酵母ツーハイブリッド、ファージ・ディスプレイ法などによって得られた配列でもかまわない。   Here, the functional element is a specific sequence that contributes to the interaction of a gene or protein. In the case of a gene, it is a nucleic acid sequence, and in the case of a protein, an amino acid sequence and a nucleic acid sequence that encodes it. Sequences called so-called functional motifs or functional domains may also be used. In other words, it is a specific sequence that contributes to the interaction between genes or proteins obtained by any interaction analysis. For example, the minimum sequence interaction or modification such as mutation experiment or gel shift assay It may be a sequence obtained by determination of a necessary sequence, determination of an interaction region by structure determination, IVV, yeast two-hybrid, phage display method or the like.

遺伝子および／又は蛋白質の機能エレメントに基づく相互関係を示すマップにおいては、一の遺伝子および／又は蛋白質が有する機能エレメントが、その一の遺伝子および／又は蛋白質に存在することが分かるように表示することが好ましい。例えば、図１のように、機能エレメントの相互関係を示す表示（図１では実線）と、同一の遺伝子および／又は蛋白質に存在することを示す表示（図１では点線）に分けることにより区別して表示する方法が挙げられる。   In a map showing the interrelationship based on the functional elements of genes and / or proteins, display so that it can be seen that the functional elements of one gene and / or protein are present in the one gene and / or protein Is preferred. For example, as shown in FIG. 1, the display can be distinguished by dividing the display into a display showing the interrelationship of functional elements (solid line in FIG. 1) and a display showing the presence of the same gene and / or protein (dotted line in FIG. 1). The method of displaying is mentioned.

本発明によるマップによって、図２に示したように、複合体の予想が可能となる。たとえば、三つの蛋白質の相互作用を従来のマップで書くと、三つの蛋白質の複合体について(I)の場合なのか(II)の場合なのかを予測することは不可能であった。本発明によるマップでは、蛋白質d, eが同じ機能ドメインで蛋白質Aと相互作用しているならば、複合体は(I)ではなくて(II)の場合であることが予測できる。   The map according to the present invention allows prediction of the complex as shown in FIG. For example, when the interaction of three proteins is written on a conventional map, it is impossible to predict whether the complex of three proteins is the case of (I) or (II). In the map according to the present invention, if proteins d and e interact with protein A in the same functional domain, it can be predicted that the complex is not (I) but (II).

本発明で用いられる蛋白質や遺伝子は、相互作用解析において、ベイト又はプレイとして、ランダム・ライブラリーを利用している場合に、ライブラリーから複数のテンプレートが検出されることにより、相互作用に必要な共通配列を抽出できる方法で解析された蛋白質や遺伝子であることが好ましい。   Proteins and genes used in the present invention are necessary for interaction by detecting a plurality of templates from the library when a random library is used as bait or prey in the interaction analysis. It is preferably a protein or gene analyzed by a method capable of extracting a common sequence.

ここで、ランダム・ライブラリーとは、ライブラリーを構成する遺伝子や蛋白質が、ある一通りの配列ではなく、幾通りもの配列で構成されているものである。そのことによって、相互作用解析では、一つの遺伝子で複数のテンプレートを検出できるので、その中で相互作用に必要な共通配列を機能エレメントとして抽出できる。ランダム・ライブラリーは、核酸ライブラリー、ペプチド・ライブラリー、蛋白質ライブラリーなどが考えられ、核酸ライブラリーでは、蛋白質の結合するプロモーター領域などが機能エレメントとして抽出され、ペプチド・ライブラリー、蛋白質ライブラリーなどでは、蛋白質同士の結合領域や核酸のプロモーター領域と結合する領域などが機能エレメントとして抽出される。   Here, the random library is one in which genes and proteins constituting the library are composed of several sequences instead of one sequence. As a result, in the interaction analysis, a plurality of templates can be detected with one gene, and thus a common sequence necessary for the interaction can be extracted as a functional element. The random library may be a nucleic acid library, peptide library, protein library, etc. In the nucleic acid library, a promoter region to which a protein binds is extracted as a functional element, and the peptide library, protein library For example, a binding region between proteins or a region binding to a promoter region of a nucleic acid is extracted as a functional element.

共通配列の抽出によって機能エレメントが決定された蛋白質や遺伝子を用いることによって、図３に示したように、構造解析された蛋白質のどのような構造に機能エレメントが当たるのかを解析可能となり、相互作用(機能)と構造のリンクが可能となる。このことによって、構造解析と機能解析のリンクによる創薬への応用などが現実的となる。たとえば、これまでの蛋白質による相互作用解析や酵母ツーハイブリッド法などでは、相互作用している部位の配列までは知りようがなかったが、本発明では、相互作用している特定の配列とその部分の構造を比較することが可能となり、阻害剤などの創薬のためのミューテーション実験などに大変有利となる。   By using proteins and genes whose functional elements have been determined by extracting common sequences, as shown in Fig. 3, it is possible to analyze the structure of the structurally analyzed protein and the functional elements. (Function) and structure can be linked. This makes it practical to apply to drug discovery by linking structural analysis and functional analysis. For example, in the conventional interaction analysis with proteins and the yeast two-hybrid method, it was impossible to know the sequence of the interacting site, but in the present invention, the specific sequence interacting with the portion It is possible to compare the structures of each other, which is very advantageous for mutation experiments for drug discovery such as inhibitors.

図４のように、機能エレメントが決定された蛋白質や遺伝子の各機能エレメントを選択したときのネットワーク・パターンは、それぞれ異なってくる。一つの蛋白質や遺伝子でもさまざまなネットワークに関係している可能性があり、これまでのような延べの結合のみを表示する方法では、生体のパスウエイを予想することは困難である。   As shown in FIG. 4, the network patterns when the functional elements of proteins and genes for which functional elements are determined are different. Even a single protein or gene may be related to various networks, and it is difficult to predict biological pathways using the conventional method of displaying only the total number of connections.

また、図５のように、機能エレメントに基づく遺伝子ネットワーク・マップは、各機能エレメントに基づくネットワーク・パターンから複合体を予測可能であり、構造解析データと照らし合わせながら、注目している遺伝子のin vivoでのパスウエイを予想し、それを検証するための実験を組み立てる支援が可能となる。たとえば、詳細に解析してパスウエイを明確にしたいある蛋白質がある場合、ある蛋白質をベイトとするのみならず、その蛋白質の遺伝子のプロモーター部分にも注目し、たとえばAP1サイトがあれば、AP1サイトと相互作用する蛋白質fos/Junなどの蛋白質もベイトとすることで並列的な解析を行えば、ある蛋白質の上流(up-regulation)から下流(down-regulation)へのパスウエイを推測可能となる。   In addition, as shown in FIG. 5, the gene network map based on the functional elements can predict a complex from the network pattern based on each functional element. Predict pathology in vivo and assist in assembling experiments to verify it. For example, if there is a protein that you want to analyze in detail and clarify the pathway, not only bait that protein, but also pay attention to the promoter part of that protein's gene. For example, if there is an AP1 site, If parallel analysis is performed by using a protein such as the interacting protein fos / Jun as a bait, it is possible to estimate the pathway of a certain protein from upstream (down-regulation) to downstream (down-regulation).

最終的には、本発明の機能エレメントに基づくネットワーク・マップを土台として、複合体の予想や構造解析データとの融合により、図６のような生体の遺伝子ネットワークのモデルを提案できる。   Finally, based on the network map based on the functional elements of the present invention, a model of a biological gene network as shown in FIG. 6 can be proposed by fusing with complex prediction and structural analysis data.

ランダム・ライブラリーを用いた対応付け分子であるIVV法による機能エレメント決定方法を以下に詳しく説明する。図７に示すように、一次スクリーニング(IVVセレクション)として、cDNA、ランダム・ペプチド、ランダム・プロテインなどのランダム・ライブラリーを用いたIVV法でベイト(低分子化合物、核酸、蛋白質など)と相互作用のあるプレイ集団をライブラリーから検出し、C末端ラベル化法などを利用した二次スクリーニング(ポスト・セレクション)で検証するシステムである。   The functional element determination method by the IVV method, which is a mapping molecule using a random library, will be described in detail below. As shown in Fig. 7, as the primary screening (IVV selection), interaction with baits (low molecular compounds, nucleic acids, proteins, etc.) by IVV method using random libraries such as cDNA, random peptides, random proteins, etc. It is a system that detects pre-population populations with a library and verifies them by secondary screening (post-selection) using the C-terminal labeling method.

IVV法(図７)により決定された機能エレメントによるマッピングでは、IVVセレクションでの擬陽性が少なく、かつポスト・セレクションで擬陽性の排除を行うために、酵母ツーハイブリッド法のように擬陽性をバイオインフォマティックスのレベルで解決する必要が無く、大変有利となる(図８)。したがって、本発明は、本発明の作成方法において使用するのに好ましい機能エレメントの決定方法、すなわち、in vitroウイルスを用いる相互作用解析により、相互作用する遺伝子又は蛋白質のライブラリーを得、そのライブラリーの遺伝子又は蛋白質の核酸配列又はアミノ酸配列から抽出された配列に基づき機能エレメントを決定することを含む、機能エレメントの決定方法も提供する。   In mapping by functional elements determined by the IVV method (Fig. 7), in order to eliminate false positives in IVV selection and eliminate false positives in post selection, false positives are bioinformatics as in the yeast two-hybrid method. There is no need to solve the problem at the level, which is very advantageous (FIG. 8). Therefore, the present invention provides a library of interacting genes or proteins by a method for determining a functional element preferable for use in the production method of the present invention, that is, an interaction analysis using an in vitro virus. There is also provided a method for determining a functional element comprising determining a functional element based on a sequence extracted from the nucleic acid sequence or amino acid sequence of the gene or protein.

従来のTAP法、酵母ツーハイブリッド法(1:1のマトリックス型解析)などでは、蛋白質の相互作用する領域である機能エレメントを抽出することは困難である。しかしながら、in vitro virus(IVV)法、ファージディスプレイ法などでは、ランダムプライマーなどを用いたライブラリー(一つの遺伝子について幾通りもの部分配列を包含したライブラリー)を利用することにより、遺伝子や蛋白質の相互作用する領域である機能エレメントを抽出することが可能となる。酵母ツーハイブリッド法でもランダムプライマーなどを用いたライブラリー(一つの遺伝子について幾通りもの部分配列を包含したライブラリー)を利用することで機能エレメントの抽出は可能であるが、一般的にはマトリックス型が採用されており、かつ擬陽性が多いなどの問題がある。また、ファージディスプレイ法では、ペプチド・ライブラリーのため、機能エレメントの抽出にはライブラリーの平均長が短すぎるという問題点がある。一方、図４に示したように、我々が先に発明してきたIVVとそのライブラリー(特許文献：特願2002-360039)を用いる方法では、機能エレメントを抽出するのに、ライブラリーの平均長は十分に長く、酵母ツーハイブリッド法などと比較して擬陽性の少ないデータが得られる(図５)。このことによって、より正確なネットワーク・マッピングが可能となる。また、IVV法ではベイトは核酸でも蛋白質でもセレクションが可能なため、蛋白質−蛋白質相互作用のみならず、蛋白質−核酸相互作用についてもデータベースを構築することが可能となり、より網羅ネットワーク・マッピングが可能となる。そして、IVVの機能エレメント抽出法により得られる機能エレメントを用いることは、１）複合体の予測(図２)；２）構造解析と機能解析とのリンクによる創薬への応用(図３)などにおいて有利である。   In the conventional TAP method, yeast two-hybrid method (1: 1 matrix type analysis), etc., it is difficult to extract functional elements that are regions where proteins interact. However, in the in vitro virus (IVV) method, phage display method, etc., by using a library using random primers (a library that includes several partial sequences for one gene), It is possible to extract a functional element that is an interacting area. In the yeast two-hybrid method, it is possible to extract functional elements by using a library using random primers (a library that includes several partial sequences for one gene). Is employed and there are many false positives. Moreover, since the phage display method is a peptide library, there is a problem that the average length of the library is too short for the extraction of functional elements. On the other hand, as shown in FIG. 4, in the method using IVV and the library (Patent Document: Japanese Patent Application No. 2002-360039) that we have invented earlier, the average length of the library is used to extract the functional elements. Is sufficiently long, and data with fewer false positives can be obtained compared to the yeast two-hybrid method or the like (FIG. 5). This allows for more accurate network mapping. In addition, the IVV method allows selection of both baits and nucleic acids and proteins, so it is possible to construct a database not only for protein-protein interactions but also for protein-nucleic acid interactions, enabling more comprehensive network mapping. Become. And, using functional elements obtained by IVV functional element extraction method 1) Prediction of complex (Figure 2); 2) Application to drug discovery by linking structural analysis and functional analysis (Figure 3), etc. Is advantageous.

IVV法による機能エレメント決定法の例について以下に説明する。図９に示すように、IVVセレクションで検出したシーケンス配列から、ベクター配列を除去し、cDNA配列を抽出し、必要によりデータベース検索し、蛋白質フレームを確認すると同時に、IVVフレームを確認する。さらに、それらのシーケンス配列をアライメントにかけ、各蛋白質(遺伝子)の共通配列を機能エレメントとして抽出する。   An example of a functional element determination method based on the IVV method will be described below. As shown in FIG. 9, a vector sequence is removed from a sequence sequence detected by IVV selection, a cDNA sequence is extracted, a database search is performed if necessary, a protein frame is confirmed, and simultaneously an IVV frame is confirmed. Further, these sequence sequences are subjected to alignment, and a common sequence of each protein (gene) is extracted as a functional element.

IVVセレクションで検出したシーケンス配列とは、市販のシーケンサー(ABI,BECKMANなど)の波形データとその解析に基づく配列データである。   Sequence sequences detected by IVV selection are waveform data of commercially available sequencers (ABI, BECKMAN, etc.) and sequence data based on the analysis thereof.

ベクター配列の除去とは、シーケンスのためのクローニングに用いたベクター配列を除去し、余分な配列を除去してcDNAライブラリー配列のみとすることである。   The removal of the vector sequence is to remove the vector sequence used for cloning for the sequence and to remove the extra sequence so that only the cDNA library sequence is obtained.

cDNA配列の抽出とは、データベース検索にかけるために、ライブラリーに共通の配列を除去し、ここでは、cDNA配列のみとすることである。   Extraction of a cDNA sequence is to remove a sequence common to the library and to use only the cDNA sequence in this case for database search.

データベース検索とは、核酸データベースとして、ntなどがあり、蛋白質データベースとして、nrなどがあり、その他、refseq, fantom2などのデータベース、ゲノム・データベースなどがある。   Database search includes nt as a nucleic acid database, nr as a protein database, and other databases such as refseq and fantom2, and a genome database.

蛋白質フレームの確認とは、無細胞翻訳系で翻訳されたフレームがデータベースに登録されている蛋白質のORFとフレームが一致するかどうかを確認することである。フレームが一致していない場合は、フレーム・シフトなのか、3'UTR, 5'UTRの配列なのか、などを明らかにする。   The confirmation of the protein frame is to check whether the frame translated by the cell-free translation system matches the frame with the ORF of the protein registered in the database. If the frames do not match, clarify whether it is a frame shift or a 3'UTR, 5'UTR array.

IVVフレームの確認とは、無細胞翻訳系で翻訳されうる配列なのかどうかを確認することである。すなわち、ストップ・コドンが複数出てくるか、場所はＮ末端側か、などによって判断する。   Confirmation of the IVV frame is to confirm whether the sequence can be translated by a cell-free translation system. That is, whether or not a plurality of stop codons appear or whether the location is on the N-terminal side is determined.

アライメントとクラスタリング解析による共通配列の抽出は、通常の方法によって行うことができる。このような抽出を行うためのソフトウェア（例えばClustalX）が入手可能である。以上のような処理を施した配列プールの中で類似の配列、ここでは、同じ遺伝子を抽出し、その配列間でクラスタリングし、クラスタリングにおける各共通配列を抽出比較し、機能エレメントとして抽出する。   Extraction of common sequences by alignment and clustering analysis can be performed by a normal method. Software for performing such extraction (eg ClustalX) is available. In the sequence pool subjected to the above processing, similar sequences, here, the same genes are extracted, clustered between the sequences, the common sequences in the clustering are extracted and compared, and extracted as functional elements.

以下、本発明の具体的なマップや蛋白質を実現するための機能エレメント決定方法の例として、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出においてIVV法を用いるものについて詳細に説明する。   Hereinafter, as an example of a functional element determination method for realizing a specific map or protein of the present invention, a method using the IVV method in detecting an interaction between bait and prey will be described in detail.

IVV法に使用されるRNA又はmRNAライブラリーは、原核、真核生物、ウイルスなどあらゆる種のいかなる組織から抽出したRNA又はmRNAライブラリーでも構わない。また、解読したゲノムやcDNAライブラリーを転写したRNAライブラリーやそれを再現した人工のRNAライブラリー、又は自然には存在しない配列を含む人工のcDNAライブラリーを転写したRNAライブラリーでも構わない。   The RNA or mRNA library used in the IVV method may be an RNA or mRNA library extracted from any tissue of any species such as prokaryotic, eukaryotic, and virus. Alternatively, an RNA library obtained by transcribing the decoded genome or cDNA library, an artificial RNA library reproducing the same, or an RNA library obtained by transcribing an artificial cDNA library containing a sequence that does not exist in nature may be used.

一本鎖(ss)DNAライブラリーは、上記のRNA又はmRNAライブラリーを特定配列を持つランダムプライマーで逆転写(図１０、I)したライブラリーである。この際の逆転写酵素としては特に定めはなく、SuperScript II RT (SuperScript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen), Sensiscript Reverse Transcriptase(Qiagen)などで良い。また、ランダムプライマーのアダプター部分の特定配列については、最終的に対応付け分子のライブラリーを作成できるものあれば制限はないが、通常には、図１０にあるように、3'tail又はTag 2と3'tailを含む配列となる。ここで、3'tailは、A配列としてポリAｘ8配列、又はXA配列としてXhoI配列や４塩基以上で(C又はG)NN(C又はG)の配列とA配列の組み合わせが挙げられる。Tag 2は、親和性タグ配列としてFlag-tag配列、HA-tag、IgGのプロテインA(zドメイン)などの抗原抗体反応を利用したもの、His-tagなど、蛋白質を検出又は精製できるいかなる手段を用いるための配列でもかまわない。ここで、翻訳効率に影響する範囲としては、Ｃ末端ラベル化蛋白質合成の際は、XA配列の組み合わせが好ましく、IVV形成の際は、A配列が好ましい。また、3'tailのXA配列又はA配列は、IVVのPEGスペーサーや翻訳をさらに促進するPEG(Boc)スペーサーとのライゲーションの際に必要な配列でもある。   A single-stranded (ss) DNA library is a library obtained by reverse transcription (FIG. 10, I) of the above RNA or mRNA library with a random primer having a specific sequence. The reverse transcriptase at this time is not particularly defined, and may be SuperScript II RT (SuperScript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen), Sensiscript Reverse Transcriptase (Qiagen), or the like. Further, the specific sequence of the adapter part of the random primer is not limited as long as it can finally create a library of corresponding molecules, but usually, as shown in FIG. 10, 3'tail or Tag 2 And an array containing 3'tail. Here, 3'tail includes a poly Ax8 sequence as the A sequence, an XhoI sequence as the XA sequence, and a combination of the (C or G) NN (C or G) sequence and the A sequence with 4 or more bases. Tag 2 uses any means that can detect or purify proteins, such as Flag-tag sequence, HA-tag as an affinity tag sequence, antigen-antibody reaction such as IgG protein A (z domain), His-tag, etc. It may be an array for use. Here, the range affecting the translation efficiency is preferably a combination of XA sequences when synthesizing a C-terminal labeled protein, and an A sequence is preferable when forming IVV. The 3A tail XA sequence or A sequence is also a sequence necessary for ligation with an IVV PEG spacer or a PEG (Boc) spacer that further promotes translation.

対応付け分子の構成は、例えば、WO 02/46395に記載されており、対応付け分子の形成に必要な配列、すなわち、特定配列は当業者であれば、このような公知の構成に基づき、適宜設定できる。   The structure of the associating molecule is described in, for example, WO 02/46395, and the sequence necessary for forming the associating molecule, that is, the specific sequence is appropriately determined by those skilled in the art based on such a known structure. Can be set.

dsDNAライブラリーは、上記のssDNAライブラリーを二本鎖DNAに合成(図１０、II)したものである。この際、DNAポリメラーゼIによる相補鎖DNAの合成とRNase HによるRNA分解を同時に行い、さらに、DNAリガーゼで、DNAポリメラーゼIにより合成されたDNA間のニックをつなぐ。合成された二本鎖DNAライブラリーは、DNAポリメラーゼIにより合成された相補鎖のみ5'末端がリン酸化されており、3'末端に特定の配列を持つことが重要な特徴である。なお、dsDNAライブラリーは、この方法により形成されることが好ましいが、一本鎖DNAの相補鎖DNAの5'末端のみがリン酸化されているdsDNAライブラリーが形成される限り、他の酵素を用いてもよいし、他の原理によって形成してもよい。   The dsDNA library is obtained by synthesizing the above ssDNA library into double-stranded DNA (FIG. 10, II). At this time, synthesis of complementary strand DNA by DNA polymerase I and RNA degradation by RNase H are simultaneously performed, and further, nicks between DNAs synthesized by DNA polymerase I are connected by DNA ligase. An important feature of the synthesized double-stranded DNA library is that only the complementary strand synthesized by DNA polymerase I is phosphorylated at the 5 ′ end and has a specific sequence at the 3 ′ end. The dsDNA library is preferably formed by this method, but as long as a dsDNA library in which only the 5 ′ end of the complementary strand DNA of the single-stranded DNA is phosphorylated is formed, other enzymes can be used. It may be used or formed by other principles.

ライゲーテッドdsDNAライブラリーは、上記のdsDNAライブラリーに、特定配列を持つアダプターをDNAリガーゼによりライゲーション(図１０、III)したものである。この際に、アダプター主鎖の5'末端はリン酸化されていないことでセルフライゲーションを回避することが特徴であり、ライゲーション効率の良いDNAリガーゼでライゲーションできるようにアダプターの3'末端に主鎖より短い副鎖をハイブリダイゼーションし二本鎖にしておくことが好ましい。ここで、アダプターの副鎖の5'末端もリン酸化されていないことが必要であり、理論的には主鎖より短ければよいが、ハイブリダイゼーションの有効性を考えると6bp以上であることが好ましい。ライゲーションをRNAリガーゼで行う場合は、アダプターは一本鎖とし、ここでもアダプターをリン酸化しない。ただし、IVVランダムライブラリー作成時では、テンプレートの3'末端がRNAリガーゼの良いアクセプターとなるための配列(A配列)を有しており、テンプレート同士のライゲーションが起こる確率は、DNAリガーゼを用いた作成方法より断然高くなる点が不利である。また、RNAリガーゼはDNAリガーゼに比較してライゲーション効率が落ちるので、総合的に見て、ライゲーションをDNAリガーゼで行うことが好ましい。また、アダプターの特定配列については、最終的に対応付け分子のライブラリーを作成できるものあれば制限はないが、通常には、図１０にあるように、5'UTR又は5'UTR とTag 1を含む配列となる。5'UTRは、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなり、転写プロモーターはT7/T3又はSP6などが利用でき、特に制限はないが、小麦の無細胞翻訳系では、転写プロモーターとしてはSP6、翻訳のエンハンサー配列としてはオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用することが好ましい。翻訳エンハンサーのオメガ配列の一部(O29)は、TMVのオメガ配列の一部を含んだものである(Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631-4638、および、WO 02/48347の図３参照)。Tag 1については、先程のTag２と同様であるが、Tag 1とTag２の両方を配する場合は、異なるTag配列を配するようにする。ライゲーションされるアダプターには、これら5'UTR又は5'UTR とTag 1の一部又は全部の配列が含まれる場合がある。   The ligated dsDNA library is obtained by ligating an adapter having a specific sequence to the above dsDNA library with a DNA ligase (FIG. 10, III). At this time, the 5 'end of the adapter main chain is not phosphorylated, and it is characterized by avoiding self-ligation, so that the 3' end of the adapter can be ligated with DNA ligase with high ligation efficiency. It is preferable to hybridize short sub-strands into double strands. Here, it is necessary that the 5 ′ end of the adapter secondary chain is not phosphorylated, and theoretically, it should be shorter than the main chain. However, in view of the effectiveness of hybridization, it is preferably 6 bp or more. . When ligation is performed with RNA ligase, the adapter is single-stranded and again does not phosphorylate the adapter. However, at the time of IVV random library creation, the 3 'end of the template has a sequence (A sequence) to be a good acceptor of RNA ligase, and DNA ligase was used for the probability of ligation between templates. The disadvantage is that it is significantly higher than the creation method. In addition, since RNA ligase has a lower ligation efficiency than DNA ligase, it is preferable to perform ligation with DNA ligase as a whole. Further, the specific sequence of the adapter is not limited as long as it can finally create a library of mapping molecules. Usually, as shown in FIG. 10, 5′UTR or 5′UTR and Tag 1 Is an array containing 5'UTR consists of a transcription promoter and a translation enhancer. T7 / T3 or SP6 can be used as the transcription promoter, but there are no particular restrictions. In the wheat cell-free translation system, SP6 is the transcription promoter and the translation enhancer sequence. It is preferable to use an omega sequence or a sequence containing a part of the omega sequence. Part of the translation enhancer omega sequence (O29) contains part of the TMV omega sequence (Gallie DR, Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., Vol. 20, 4631-4638, and , See FIG. 3 of WO 02/48347). Tag 1 is the same as Tag 2 described above, but when both Tag 1 and Tag 2 are arranged, different Tag arrays are arranged. The ligated adapter may contain a part or all of these 5′UTR or 5′UTR and Tag 1 sequences.

本発明のIVV cDNAライブラリーは、上記のライゲーテッドdsDNAライブラリーをテンプレートとして、特定の配列を有する5'および3'プライマーでPCR(図１０、IV)を行い合成する。5'および3'プライマーは、5'UTR、Tag 1、Tag 2、3'tailの特定の配列でアニーリングし、かつ5'UTR、Tag 1、Tag 2、3'tailの一部をアダプター配列として含む場合がある。このPCRで5'UTR、Tag 1、Tag 2、3'tailなどの特定配列を持つcDNAライブラリーが完成する。   The IVV cDNA library of the present invention is synthesized by PCR (FIG. 10, IV) with 5 ′ and 3 ′ primers having specific sequences using the above-mentioned ligated dsDNA library as a template. 5 'and 3' primers anneal with specific sequences of 5'UTR, Tag 1, Tag 2, 3'tail, and a portion of 5'UTR, Tag 1, Tag 2, 3'tail as an adapter sequence May include. This PCR completes a cDNA library having specific sequences such as 5 ′ UTR, Tag 1, Tag 2, and 3 ′ tail.

本発明のIVV RNAライブラリーは、上記のIVV cDNAライブラリーを転写(図１０、V)して得られる。この際、このIVV RNAライブラリーをこのまま翻訳することやＣ末端ラベル化剤存在化に翻訳することでＣ末端ラベル化蛋白質ライブラリーを合成することが可能である。転写の酵素は、特定配列に選択したT3, T7又はSP6などの酵素となる。   The IVV RNA library of the present invention is obtained by transcription (FIG. 10, V) of the above IVV cDNA library. At this time, it is possible to synthesize a C-terminal labeled protein library by translating the IVV RNA library as it is or by translating it into the presence of a C-terminal labeling agent. The transcription enzyme is an enzyme such as T3, T7 or SP6 selected for the specific sequence.

本発明のIVVライゲーテッドRNAライブラリーは、上記のIVV RNAライブラリーをスペーサーとライゲーション(図１０、VI)して得られる。スペーサーとしては、IVV形成の場合はIVVのPEGスペーサー、およびC末端ラベル化蛋白質合成のためのPEG(Boc)スペーサーなどが考えられる。ライゲーション酵素としては、RNAリガーゼを用いる方法が代表的だが、その他、DNAリガーゼを用いるものや光反応による連結など何でもよく、特に限定されるものではない。   The IVV ligated RNA library of the present invention is obtained by ligating the above IVV RNA library with a spacer (FIG. 10, VI). As the spacer, in the case of IVV formation, a PEG spacer of IVV, a PEG (Boc) spacer for synthesis of a C-terminal labeled protein, and the like can be considered. As a ligation enzyme, a method using RNA ligase is typical, but any other method using DNA ligase or ligation by photoreaction may be used and is not particularly limited.

本発明のIVVランダムプライミングライブラリーは、上記のIVVライゲーテッドRNAライブラリーを無細胞翻訳系又は細胞内で翻訳(図１０、VII)して得られる。   The IVV random priming library of the present invention is obtained by translating the above IVV ligated RNA library in a cell-free translation system or in a cell (FIG. 10, VII).

IVVのPEGスペーサーおよびC末端ラベル化蛋白質合成のPEG(Boc)スペーサーは、CCA領域、PEG領域、ドナー領域からなる。最低限必要な構成は、ドナー領域である。翻訳効率に影響する範囲としては、ドナー領域のみならずPEG部を持つものが好ましく、さらにアミノ酸との結合能力のないピューロマイシンを持つことが好ましい。PEG領域のポリエチレングリコールの分子量の範囲は、400〜30,000で、好ましくは1,000〜10,000、より好ましくは2,000〜6,000である。また、CCA領域にはピューロマイシンを含む構成と含まない構成が可能であり、ピューロマイシンについては、ピューロマイシン（Puromycin）、3'-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（3'-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのPANS-Gly、バリンのPANS-Val、アラニンのPANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するPANS-全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として3'-アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, AANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのAANS-Gly、バリンのAANS-Val、アラニンのAANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するAANS-全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシド又はヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸又はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。CCA領域は、5'側に1残基以上のDNAおよび/又はRNAからなる塩基配列を持つことが好ましい。塩基の種類としては、C>(U又はT)>G>Aの順で好ましい。配列としては、dC-ピューロマイシン, rC-ピューロマイシンなど、より好ましくはdCdC-ピューロマイシン, rCrC-ピューロマイシン, rCdC-ピューロマイシン, dCrC-ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル-tRNAの3'末端を模倣したCCA配列(Philipps G.R. (1969) Nature 223, 374-377)が適当である。C末端ラベル化蛋白質合成のためのPEG(Boc)スペーサーでは、以上のピューロマイシン誘導体のアミノ基がアミノ酸と結合する能力を欠いたあらゆる物質、およびピューロマイシンを欠いたCCA領域も考えられる。PEG部は修飾物質を有する構成が可能である。このことによって、翻訳テンプレートを回収、精製による再利用、又は固定化などのためのタグとして利用することが出来る。少なくとも1残基のDNAおよび/又はRNAの塩基に修飾物質として、蛍光物質、ビオチン、又はHis-tagなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。   The PEG spacer for IVV and the PEG (Boc) spacer for C-terminal labeled protein synthesis are composed of a CCA region, a PEG region, and a donor region. The minimum required configuration is a donor region. As a range affecting the translation efficiency, those having not only the donor region but also the PEG portion are preferable, and further, puromycin having no ability to bind to amino acids is preferable. The molecular weight range of polyethylene glycol in the PEG region is 400 to 30,000, preferably 1,000 to 10,000, more preferably 2,000 to 6,000. In addition, the CCA region can be constructed with or without puromycin. For puromycin, puromycin, 3'-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside (3'-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-amino acids), for example, PANS-Gly whose amino acid part is glycine, PANS-Val of valine, PANS-Ala of alanine, and other PANS-all amino acids corresponding to all amino acids can be used. In addition, 3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside (AANS-amino acid, 3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, formed by dehydration condensation of the amino group of 3'-aminoadenosine and the carboxyl group of amino acid as a chemical bond For example, AANS-Gly having an amino acid part of glycine, AANS-Val of valine, AANS-Ala of alanine, and other AANS-all amino acids corresponding to all amino acids can be used. Further, a nucleoside or a nucleoside and amino acid ester-bonded one can also be used. In addition, nucleoside or a substance having a chemical structure skeleton similar to nucleoside and an amino acid or a substance having a chemical structure skeleton similar to amino acid can be used as long as they can be chemically bonded. The CCA region preferably has a base sequence composed of DNA and / or RNA having 1 residue or more on the 5 ′ side. The type of base is preferably C> (U or T)> G> A in this order. The sequence is dC-puromycin, rC-puromycin, etc., more preferably dCdC-puromycin, rCrC-puromycin, rCdC-puromycin, dCrC-puromycin, etc., and the 3 ′ end of aminoacyl-tRNA is A mimicked CCA sequence (Philipps GR (1969) Nature 223, 374-377) is suitable. In the PEG (Boc) spacer for C-terminal labeled protein synthesis, any substance lacking the ability of the amino group of the puromycin derivative to bind to an amino acid, and a CCA region lacking puromycin are also conceivable. The PEG portion can be configured to have a modifying substance. Thus, the translation template can be used as a tag for collection, reuse by purification, or immobilization. A substance obtained by introducing a fluorescent substance, biotin, various separation tags such as His-tag, etc. as a modifying substance into a base of at least one residue of DNA and / or RNA is possible.

Ｃ末端ラベル化剤は、蛋白質の翻訳系でのペプチド転移反応、すなわち、リボソーム上でのペプチド転移反応によって蛋白質と結合し得る基（残基を含む）をもつアクセプター部が、ヌクレオチドリンカーを介して修飾部と結合した構成をもつ。この修飾剤の存在下で蛋白質合成を行い、得られるＣ末端修飾蛋白質を精製し、分子間相互作用の検出系を用いることによって、蛋白質相互作用の検出が可能となる。修飾部には、PEG部と同様に修飾物質が含まれる。修飾物質として、非放射性修飾物質の具体例としては、蛍光性、非蛍光性修飾物質等が挙げられる。蛍光性物質としては、フルオレセイン系列、ローダミン系列、Cy3、Cy5、エオシン系列、NBD 系列等の蛍光色素や、緑色蛍光蛋白質（GFP）等の蛍光性蛋白質がある。また、非蛍光性物質としては、ビオチンのような補酵素、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質類、色素、ポリエチレングリコール等、何らかの目印となり得る化合物であればいかなるものでもよい。アクセプター部は、蛋白質の翻訳系で、ペプチド転移反応によって蛋白質と結合し得る基をもち、好ましくはピューロマイシン又はその誘導体の残基をもつ。ピューロマイシンはアミノアシルtRNAと類似した構造をもち、蛋白質合成を阻害する抗生物質として知られているが、低濃度では蛋白質のC末端に結合することが知られている（Miyamoto-Sato, E. et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 1176-1182）。本発明で用いることができるピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシンと類似した構造を有し、蛋白質のC末端に結合することができる物質であればいかなるものでもよい。具体例としては、3'-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド等が挙げられる。修飾部とアクセプター部との間をつなぐヌクレオチドリンカーとは、具体的には、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドが１個ないし複数個つながった核酸又は核酸誘導体であり、特に好ましい例として、シトシン塩基を含むリボヌクレオチド（-rC-）又はデオキシリボヌクレオチド（-dC-）が１個ないし複数個つながった化合物が挙げられる。その他、修飾部とアクセプター部との間に挿入することによって修飾蛋白質の収量を上げることができる物質であればいかなるものでもよい。本発明修飾剤においては、ヌクレオチドリンカーが2'-デオキシシチジル酸、2'-デオキシシチジル-(3',5')-2'-デオキシチジル酸、リボシチジル酸、又は、リボシチジル-(3',5')-リボシチジル酸であることが好ましい。修飾剤は、上記修飾部とアクセプター部とを所望のヌクレオチドリンカーを介して、それ自体既知の化学結合方法によって結合させることにより製造することができる。具体的には、例えば、適当な保護基で保護された上記アクセプター部を固相担体上に結合させ、核酸合成機を用いてヌクレオチドリンカーとしてヌクレオチドホスホアミダイト、およびデオキシヌクレオチドホスホアミダイト、機能性修飾物質として蛍光物質やビオチンなどを結合したホスホアミダイトを順次結合させた後、脱保護を行うことによって作製することができる。上記各部の種類、又は結合の種類によっては液相合成法で結合させるか又は両者を併用することもできる。また、機能性修飾物質としてニッケル等の金属イオンを用いる場合には、金属イオンが配位しうるニトリロトリ酢酸やイミノジ酢酸等のキレート性の試薬を結合させ、次いで金属イオンを配位させることができる。   The C-terminal labeling agent has a peptide transfer reaction in a protein translation system, that is, an acceptor moiety having a group (including a residue) that can bind to a protein by a peptide transfer reaction on a ribosome via a nucleotide linker. It has a structure combined with a modifier. By synthesizing the protein in the presence of this modifying agent, purifying the resulting C-terminal modified protein, and using a detection system for intermolecular interaction, the protein interaction can be detected. The modifying part contains a modifying substance as in the PEG part. Specific examples of the non-radioactive modifying substance as the modifying substance include fluorescent and non-fluorescent modifying substances. Examples of the fluorescent substance include fluorescent dyes such as fluorescein series, rhodamine series, Cy3, Cy5, eosin series, NBD series, and fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). The non-fluorescent substance may be any compound that can serve as a mark, such as a coenzyme such as biotin, a protein, a peptide, a saccharide, lipids, a dye, or polyethylene glycol. The acceptor part is a protein translation system and has a group capable of binding to a protein by a peptide transfer reaction, and preferably has a residue of puromycin or a derivative thereof. Puromycin has a structure similar to aminoacyl-tRNA and is known as an antibiotic that inhibits protein synthesis, but is known to bind to the C-terminus of proteins at low concentrations (Miyamoto-Sato, E. et al. al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 1176-1182). The puromycin derivative that can be used in the present invention may be any substance as long as it has a structure similar to puromycin and can bind to the C-terminus of the protein. Specific examples include 3′-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside, 3′-N-aminoacyl adenosine aminonucleoside and the like. Specifically, the nucleotide linker that connects between the modifying portion and the acceptor portion is a nucleic acid or nucleic acid derivative in which one or more ribonucleotides or deoxyribonucleotides are linked, and a particularly preferred example is a ribonucleotide containing a cytosine base. Examples thereof include compounds in which one or more nucleotides (-rC-) or deoxyribonucleotides (-dC-) are linked. In addition, any substance can be used as long as it can increase the yield of the modified protein by being inserted between the modified part and the acceptor part. In the modifying agent of the present invention, the nucleotide linker is 2′-deoxycytidylic acid, 2′-deoxycytidyl- (3 ′, 5 ′)-2′-deoxytidylic acid, ribocytidylic acid, or ribocytidyl- (3 ′, 5 ′)-ribocytidylic acid is preferred. The modifying agent can be produced by coupling the modifying part and the acceptor part through a desired nucleotide linker by a chemical bonding method known per se. Specifically, for example, the acceptor moiety protected with an appropriate protecting group is bound to a solid phase carrier, and a nucleotide phosphoramidite, deoxynucleotide phosphoramidite, and functional modifier as a nucleotide linker using a nucleic acid synthesizer As described above, the phosphoramidite bound with a fluorescent substance, biotin, or the like is sequentially bound, followed by deprotection. Depending on the type of each part or the type of bonding, they may be bonded by a liquid phase synthesis method, or both may be used in combination. When a metal ion such as nickel is used as the functional modifier, a chelating reagent such as nitrilotriacetic acid or iminodiacetic acid that can coordinate with the metal ion can be bound, and then the metal ion can be coordinated. .

無細胞蛋白質合成系の具体例としては、小麦胚芽抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、大腸菌S30抽出液等が挙げられる。これらの無細胞蛋白質合成系の中に、翻訳テンプレートであるライブラリーを加え、Ｃ末端ラベル化の場合は、同時に1〜100μMの修飾剤を加え、25〜37℃で1〜数時間保温することによってＣ末端修飾蛋白質が合成される。対応付けの場合は、翻訳テンプレートであるライブラリーを加えて、25〜37℃で1〜数時間保温するだけで対応付け分子が合成される。合成された両修飾蛋白質は、そのまま次の精製プロセス又は検出プロセス、又は直接細胞への導入に供することができる。細胞発現系の具体例としては、大腸菌、枯草菌、好熱菌、酵母等の細菌から、昆虫細胞、哺乳類等の培養細胞、さらに線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス等に至るまでいかなる細胞でもよい。これらの細胞の中に、上記Ｃ末端ラベル化又は対応付けされた両修飾蛋白質を直接導入することもできるし、あるいは、翻訳テンプレートであるライブラリーを導入し、Ｃ末端ラベル化の場合は、同時に1〜100μMの修飾剤を電気穿孔法、マイクロインジェクション法等により細胞の中に導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって修飾蛋白質が合成される。対応付けの場合は、対応付けテンプレートであるライブラリーを導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって対応付け分子が合成される。合成された両修飾蛋白質は、細胞を破砕することによって回収し次の精製プロセス又は検出プロセスに供することができる。また、そのまま細胞の中で検出プロセスに供することも可能である。   Specific examples of the cell-free protein synthesis system include wheat germ extract, rabbit reticulocyte extract, and Escherichia coli S30 extract. In these cell-free protein synthesis systems, add a translation template library, and in the case of C-terminal labeling, add 1-100 μM modifier at the same time and incubate at 25-37 ° C. for 1 to several hours. To synthesize a C-terminal modified protein. In the case of association, an association molecule is synthesized simply by adding a library as a translation template and incubating at 25 to 37 ° C. for 1 to several hours. Both synthesized modified proteins can be directly used for the next purification process or detection process, or directly introduced into cells. Specific examples of cell expression systems include any cells ranging from bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, thermophile and yeast to cultured cells such as insect cells and mammals, and nematodes, Drosophila, zebrafish, mice, etc. Good. In these cells, both the above-mentioned modified proteins associated with or labeled with the C-terminal can be directly introduced, or a library that is a translation template is introduced and simultaneously labeled in the case of C-terminal labeling. A modified protein is synthesized by introducing 1 to 100 μM of a modifying agent into cells by electroporation, microinjection, or the like, and keeping the cells at the optimal growth temperature for several hours. In the case of association, an association molecule is synthesized by introducing a library as an association template and incubating for several hours at the optimal growth temperature of the cells. Both synthesized modified proteins can be recovered by disrupting the cells and subjected to the next purification process or detection process. Moreover, it is also possible to use for a detection process in a cell as it is.

対応付け分子のライブラリーは、進化分子工学として、ダーウイン進化機構を利用して、「変異(Mutation)」、「選択(Selection)」、「増幅(Amplification)」の3つの単位操作を繰り返すことで漸進的に進化させ、所望の機能を獲得した物質を創製することで工学的に応用することが可能であり、また、ゲノム機能解析への応用として、cDNAライブラリーから所望の物質や蛋白質と相互作用を持つ一群の遺伝子配列を網羅的に解析可能である(図７)。本発明のライブラリーとしてIVVのcDNAをもちいて、一次スクリーニングで物質や蛋白質と相互作用を検出し、さらに、相互作用の詳細をFCCSやマイクロアレイなどの二次スクリーニングで解析することが可能である。また、本発明のライブラリーは、IVV又はＣ末端ラベル化蛋白質のライブラリーとして、単独でFCCSやマイクロアレイなどにより物質や蛋白質との相互作用解析に利用することも可能である。また、もちろん本発明のライブラリーをIVVを用いた進化分子工学に応用し、一次スクリーニングにより機能性蛋白質の創出に利用することも可能であり、その際に、一次スクリーニングと二次スクリーニングを組み合わせて、創出した機能性蛋白質の相互作用の詳細を解析することも可能である。   The library of mapping molecules uses the Darwinian evolution mechanism as evolutionary molecular engineering, and repeats the three unit operations of “Mutation”, “Selection”, and “Amplification”. It can be engineered by creating a substance that has evolved gradually and has acquired a desired function, and can be applied to genomic function analysis by interacting with a desired substance or protein from a cDNA library. A group of gene sequences having an action can be comprehensively analyzed (FIG. 7). By using IVV cDNA as a library of the present invention, it is possible to detect interactions with substances and proteins by primary screening, and to analyze the details of the interactions by secondary screening such as FCCS and microarray. In addition, the library of the present invention can be used as an IVV or C-terminal labeled protein library alone for analysis of interaction with substances and proteins by FCCS, microarray, or the like. Of course, it is also possible to apply the library of the present invention to evolutionary molecular engineering using IVV and to create functional proteins by primary screening. In that case, combining primary screening and secondary screening. It is also possible to analyze the details of the interaction of the created functional protein.

この場合に、対応付け分子の共翻訳スクリーニング/セレクションを用いた解析は非常に有効である。なぜなら、共翻訳スクリーニング/セレクション法によって、ベイト蛋白質と直接又は間接的に相互作用のある蛋白質を網羅的に検出することが可能となったからである。さらに、共翻訳スクリーニング/セレクション法などによる一次スクリーニング後に、二次スクリーニングとして、物質や蛋白質と相互作用の詳細をFCCSやマイクロアレイなどにより解析することが可能である。以上の解析は、in vitroにおける共翻訳や共翻訳スクリーニング法と組み合わせて利用することもできる。また、一次スクリーニングで対応付け分子を利用するときはA配列のコード部を利用し、二次スクリーニングでは、対応付け分子を利用するときはA配列のコード部、Ｃ末端ラベル化蛋白質を利用するときはXA配列のコード部をプライミングによって変更して使用することで、それぞれの効果を使い分けることが出来る。   In this case, analysis using co-translation screening / selection of mapping molecules is very effective. This is because the cotranslation screening / selection method enables comprehensive detection of proteins that interact directly or indirectly with the bait protein. Furthermore, after the primary screening by the cotranslation screening / selection method or the like, it is possible to analyze the details of the interaction with substances and proteins by FCCS or microarray as a secondary screening. The above analysis can also be used in combination with in vitro cotranslation and cotranslation screening methods. When using the mapping molecule in the primary screening, use the coding part of the A sequence. In the secondary screening, use the coding part of the A sequence and the C-terminal labeled protein when using the mapping molecule. Can be used properly by changing the code part of the XA sequence by priming.

上記で得られたIVVライブラリー又はＣ末端ラベル化蛋白質のライブラリーと「標的分子」を、修飾物質の種類や反応系の種類などにより適宜組み合わせて接触せしめ、該修飾蛋白質又は該標的分子が発する信号において両分子間の相互作用に基づいて発生される上記信号の変化を測定することにより相互作用を解析することが出来る。相互作用の解析は、例えば、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法により行われる。「標的分子」とは、IVV又はＣ末端ラベル化蛋白質と相互作用する分子を意味し、具体的には蛋白質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられる。蛋白質としては、本発明修飾蛋白質と相互作用する能力を有する限り特に制限はなく、蛋白質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、およびその機能が既知の蛋白質でも、未知の蛋白質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製された蛋白質、又は、ｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製した蛋白質等でも標的分子として用いることができる。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖蛋白質であってもよい。これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製された蛋白質か、又は、ｃＤＮＡライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳および精製された蛋白質を用いることができる。   The IVV library or the C-terminal labeled protein library obtained above and the “target molecule” are brought into contact with each other in an appropriate combination depending on the type of the modifying substance, the type of reaction system, etc., and the modified protein or the target molecule is emitted. The interaction can be analyzed by measuring the change in the signal generated based on the interaction between both molecules in the signal. The analysis of the interaction is performed by, for example, fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence imaging analyze, fluorescence resonance energy transfer, evanescent field molecular imaging, fluorescence depolarization, surface plasmon resonance, or solid phase enzyme immunoassay. Is called. “Target molecule” means a molecule that interacts with an IVV or C-terminal labeled protein, and specifically includes proteins, nucleic acids, sugar chains, low molecular weight compounds, and the like. The protein is not particularly limited as long as it has the ability to interact with the modified protein of the present invention, and may be the full length of the protein or a partial peptide containing a binding active site. The protein may be a protein having a known amino acid sequence and its function or an unknown protein. These can be used as target molecules even in a synthesized peptide chain, a protein purified from a living body, a protein translated from a cDNA library or the like using an appropriate translation system, and the like. The synthesized peptide chain may be a glycoprotein having a sugar chain bound thereto. Of these, a purified protein having a known amino acid sequence or a protein translated and purified from a cDNA library or the like using an appropriate method can be preferably used.

これら標的分子とIVV又はＣ末端ラベル化蛋白質との「相互作用」とは、通常は、蛋白質と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、および静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合および解離、蛋白質レセプターとリガンドの間の結合および解離、接着分子と相手方分子の間の結合および解離、酵素と基質の間の結合および解離、核酸とそれに結合する蛋白質の間の結合および解離、情報伝達系における蛋白質同士の間の結合と解離、糖蛋白質と蛋白質との間の結合および解離、又は糖鎖と蛋白質との間の結合および解離が挙げられる。   The “interaction” between these target molecules and IVV or C-terminal labeled proteins usually includes covalent bonds, hydrophobic bonds, hydrogen bonds, van der Waals bonds, and electrostatic force binding between proteins and target molecules. The term indicates an effect of a force acting between molecules resulting from at least one, but this term should be interpreted in the broadest sense and should not be construed as limiting in any way. The covalent bond includes a coordination bond and a dipole bond. In addition, electrostatic coupling includes electric repulsion in addition to electrostatic coupling. In addition, a binding reaction, a synthesis reaction, and a decomposition reaction resulting from the above action are also included in the interaction. Specific examples of interactions include binding and dissociation between antigen and antibody, binding and dissociation between protein receptor and ligand, binding and dissociation between adhesion molecule and partner molecule, binding and dissociation between enzyme and substrate, Binding and dissociation between a nucleic acid and a protein that binds to it, binding and dissociation between proteins in an information transmission system, binding and dissociation between a glycoprotein and a protein, or binding and dissociation between a sugar chain and a protein Is mentioned.

以下、共翻訳スクリーニング/セレクションを用いた解析方法の例について説明する。解析方法には、相互作用の検出方法および相互作用する蛋白質のスクリーニング方法が含まれる。   Hereinafter, an example of an analysis method using cotranslation screening / selection will be described. The analysis method includes a method for detecting interaction and a method for screening interacting proteins.

本発明検出方法は、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出において、プレイとして本発明のライブラリーを用いるものである。   The detection method of the present invention uses the library of the present invention as a play in the detection of the interaction between bait and play.

好ましくは、ベイトおよびプレイに特定の様式で分離用修飾および検出用標識を行い、そして、無細胞翻訳系においてベイトの存在下で、プレイを翻訳により生成させることによりベイトとプレイとを接触させることを主な特徴とするものである。本明細書においては、無細胞翻訳系においてベイトの存在下で、プレイを翻訳により生成させることによりベイトとプレイとを接触させることを「無細胞共翻訳」ともいう。   Preferably, bait and prey are subjected to separation modification and detection labels in a manner specific to the bait, and the bait and prey are contacted by generating the prey by translation in the presence of the bait in a cell-free translation system. Is the main feature. In the present specification, contacting a bait and prey by generating prey by translation in the presence of a bait in a cell-free translation system is also referred to as “cell-free cotranslation”.

本明細書において、ベイトおよびプレイの用語は、物質間の相互作用の解析の技術分野で通常に用いられる意味を有する。すなわち、既知の物質である蛋白質や核酸などをベイト(おとり)と呼び、それと相互作用する物質である蛋白質や核酸などをプレイ(獲物)と呼ぶ。本発明では、プレイは蛋白質であることが好ましい。   In this specification, the terms bait and prey have meanings commonly used in the technical field of analysis of interactions between substances. That is, a protein or nucleic acid that is a known substance is called a bait, and a protein or nucleic acid that interacts with the bait is called a prey. In the present invention, the prey is preferably a protein.

ここで、ベイトとしては、あらゆる蛋白質（ペプチドを含む）、核酸、抗体、ホルモンなどのリガンド、金属などの任意のものから構成される複合体が挙げられ、天然のものでも人工のもののいずれでも構わない。ベイトとしての分子量の制限などは特にない。たとえば蛋白質であれば、機能ドメイン又は機能ドメインを含む完全長蛋白質などが挙げられる。プレイライブラリーを用いる場合は、完全長蛋白質とすることでより網羅的検出が可能となる。   Here, examples of the bait include complexes composed of any protein (including peptides), ligands such as nucleic acids, antibodies, hormones, metals, and the like, and may be natural or artificial. Absent. There is no particular molecular weight limitation as a bait. For example, if it is a protein, the full length protein etc. which contain a functional domain or a functional domain are mentioned. When a play library is used, more comprehensive detection is possible by using a full-length protein.

また、プレイとしては、好ましくは、蛋白質のライブラリーが用いられる。プレイとしての分子量の制限などは特にない。   As a prey, a protein library is preferably used. There is no particular molecular weight limitation as play.

本発明検出方法は、好ましくは、上述のように、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出において、ベイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを主な特徴とするものである。従って、本発明検出方法の好ましい構成は、ベイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを除いて、ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の通常の検出方法と同様でよい。   The detection method of the present invention preferably performs detection labeling and separation modifications in a manner specific to bait and prey in the detection of the interaction between bait and prey, as described above, and is cell-free. The main feature is to perform translation. Therefore, a preferred configuration of the detection method of the present invention is to contact bait and prey except that bait and prey are subjected to detection labeling and separation modification in a specific manner, and cell-free cotranslation is performed. It may be similar to the usual method of detecting the interaction between bait and prey, including detecting the complex formed by contact.

ベイトおよびプレイの分離用修飾および検出用標識は、複合体の検出に適合したものが適宜選択されるが、無細胞共翻訳において、ベイトとプレイとが共に検出用標識で標識されたり、分離用修飾を受けたりしないように行われる必要がある。そのため、プレイは、検出用標識として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされるか、又は、対応付け分子とされ、それに応じて、ベイトは分離用修飾を有するものとされる。   The bait and prey separation modification and detection labels are appropriately selected to be suitable for complex detection. In cell-free cotranslation, both bait and prey are labeled with a detection label, or for separation. It needs to be done so as not to be qualified. Therefore, prey is a fusion protein with a protein that can be used as a label for detection, or an associated molecule, and accordingly, bait has a modification for separation.

プレイが融合蛋白質とされる場合には、ベイトは分離用修飾を有するようにする。ベイトが蛋白質である場合には、ベイトは、分離用修飾として使用できる蛋白質との融合蛋白質として、無細胞翻訳系において、ベイトを含む融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳が行われることにより無細胞翻訳系に存在させることが好ましい。   If the prey is a fusion protein, the bait should have a separation modification. When the bait is a protein, the bait is converted into a cell-free translation by translating the mRNA encoding the bait-containing fusion protein in a cell-free translation system as a fusion protein with a protein that can be used as a modification for separation. It is preferably present in the system.

ベイトが蛋白質の場合の分離用修飾の例としては、蛋白質として、GST蛋白質やTAP法などに用いられているCBP(カルモジュリンビーズとの親和性により分離可能)やプロテインA(IgG-プロテインA親和性により分離可能)、親和性タグとして、各種の抗体タグなどとの融合蛋白質とすることが挙げられる。ベイト自体が分離用修飾として使用できる性質を有する場合には、ベイトをそのまま、分離用修飾を有するベイトとして使用できる。プレイの検出用修飾としては、GFP(green fluorescent protein)などの蛍光蛋白質との融合蛋白質とすることが挙げられる。   Examples of modifications for separation when the bait is a protein include CBP (separable by affinity with calmodulin beads) and protein A (IgG-protein A affinity) used in GST protein, TAP method, etc. The affinity tag can be a fusion protein with various antibody tags. When the bait itself has a property that can be used as a modification for separation, the bait can be used as it is as a bait having the modification for separation. Examples of the modification for detection of prey include a fusion protein with a fluorescent protein such as GFP (green fluorescent protein).

上記の融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの調製およびこのｍＲＮＡの無細胞翻訳系での翻訳は通常の方法に従って行うことができる。ｍＲＮＡは、無細胞転写翻訳系において、ＤＮＡの転写により生成するものであってもよい。   Preparation of mRNA encoding the above fusion protein and translation of this mRNA in a cell-free translation system can be performed according to conventional methods. The mRNA may be generated by transcription of DNA in a cell-free transcription / translation system.

プレイが対応付け分子とされる場合には、ベイトには任意の分離用修飾を施すことができる。ベイトが蛋白質である場合には、上述の分離用修飾の例が挙げられる他、ベイトが核酸やドラッグなどの場合の分離用修飾の例としては、ストレプトアビジンやアビジンと相互作用のあるビオチンなどを利用することが挙げられる。ベイト自体が分離用修飾として使用できる性質を有する場合には、ベイトをそのまま、分離用修飾を有するベイトとして使用できる。   When prey is a mapping molecule, the bait can be subjected to any modification for separation. In the case where the bait is a protein, examples of the above-described separation modification can be given. In addition, examples of the separation modification in the case where the bait is a nucleic acid or a drug include streptavidin and biotin that interacts with avidin. It can be used. When the bait itself has a property that can be used as a modification for separation, the bait can be used as it is as a bait having the modification for separation.

対応付け分子とは、表現型と遺伝子型と対応付ける分子を意味する。対応付け分子は、通常には、遺伝子型を反映する塩基配列を有する核酸を含む遺伝子型分子と、表現形の発現に関与する蛋白質を含む表現型分子とが結合してなる分子である。この蛋白質としてプレイを用いることによりプレイを対応付け分子とすることができる。このような対応付け分子は、無細胞翻訳系において、プレイをコードするｍＲＮＡの翻訳を、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合するように行うこと、又は、無細胞転写翻訳系において、プレイをコードするＤＮＡの転写および翻訳を、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合するように行うことにより形成することができる。従って、この製造の際に、ベイトを存在させることにより、無細胞共翻訳を行うことができる。すなわち、下記（１）又は（２）により無細胞共翻訳を行うことができる。   The association molecule means a molecule that associates a phenotype with a genotype. The associating molecule is usually a molecule formed by binding a genotype molecule containing a nucleic acid having a base sequence reflecting the genotype and a phenotype molecule containing a protein involved in expression of the phenotype. By using prey as this protein, prey can be used as a mapping molecule. Such a mapping molecule can be used to translate mRNA encoding prey in a cell-free translation system so that the translated prey is associated with the mRNA, or code prey in a cell-free transcription translation system. Transcription and translation of the DNA to be performed can be formed by performing the translation so that the prey is associated with the DNA. Therefore, cell-free cotranslation can be performed by the presence of bait during the production. That is, cell-free cotranslation can be performed according to the following (1) or (2).

（１）無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするｍＲＮＡの翻訳を、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合するように行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させる。   (1) In the cell-free translation system, the prey is generated in the cell-free translation system by translating the mRNA encoding the prey in the presence of the bait so that the translated prey is associated with the mRNA. Let bait and play come into contact.

（２）無細胞転写翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするＤＮＡの転写および翻訳を、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合するように行うことにより、無細胞転写翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させる。   (2) In the cell-free transcription / translation system, in the presence of the bait, the transcription and translation of the DNA encoding the prey is performed so that the translated prey is associated with the DNA, thereby the cell-free transcription / translation system The play is generated and the bait and the play are brought into contact with each other.

以下、上記（１）および（２）の態様について説明する。
（１）の態様では、ｍＲＮＡが、その3'末端に結合したスペーサー領域と、スペーサー領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを有することにより、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合することが好ましい。このような対応付け分子を用いる相互作用の検出方法としては、in vitroウイルス方法が挙げられる。Hereinafter, the above aspects (1) and (2) will be described.
In the aspect of (1), the mRNA has a spacer region bound to its 3 ′ end and a peptide acceptor region that is bound to the spacer region and includes a group that can bind to a peptide by a peptide transfer reaction. It is preferred that the pre-treated prey is associated with the mRNA. An in vitro virus method is an example of a method for detecting an interaction using such a mapping molecule.

ｍＲＮＡは、好ましくは、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'側に結合した、プレイをコードするORF領域と、ORF領域の3'側に結合した、ポリA配列を含む3'末端領域を含む核酸である。好ましくは、ポリA配列の5'側に、SNNS（SはG又はC)配列を含む発現増幅配列（例えば制限酵素XhoIが認識する配列）が更に含まれる。5'末端にCap構造があってもなくても良い。   The mRNA preferably binds to the 5 ′ untranslated region containing the transcriptional promoter and translation enhancer, the ORF region encoding prey bound to the 3 ′ side of the 5 ′ untranslated region, and the 3 ′ side of the ORF region. A nucleic acid comprising a 3 'terminal region comprising a poly A sequence. Preferably, an expression amplification sequence (for example, a sequence recognized by the restriction enzyme XhoI) containing SNNS (S is G or C) sequence is further included on the 5 ′ side of the poly A sequence. The 5 ′ end may or may not have a Cap structure.

ポリA配列は、少なくとも２残基以上のdAおよび/又はrAの混合又は単一のポリA連続鎖であり、好ましくは、3残基以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは８残基以上のポリA連続鎖である。   The poly A sequence is a mixture of dA and / or rA of at least 2 residues or more or a single poly A continuous chain, preferably 3 residues or more, more preferably 6 or more, even more preferably 8 residues or more. Poly A continuous chain.

翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなる5'UTR、および、ポリA配列を含む3'末端領域の組み合わせがある。3'末端領域のポリA配列の効果は通常には10残基以下で発揮される。5'UTRの転写プロモーターはT7/T3又はSP6などが利用でき、特に制限はない。好ましくはSP6であり、特に、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用する場合はSP6を用いることが特に好ましい。翻訳エンハンサーは好ましくはオメガ配列の一部であり、オメガ配列の一部としては、TMVのオメガ配列の一部(O29; Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631-4638、および、WO 02/48347の図３参照)を含んだものが好ましい。   Elements that affect translation efficiency include a combination of a 5 ′ UTR composed of a transcription promoter and a translation enhancer, and a 3 ′ terminal region containing a polyA sequence. The effect of the poly A sequence in the 3 ′ end region is usually exerted with 10 residues or less. T7 / T3 or SP6 can be used as the 5 ′ UTR transcription promoter, and there is no particular limitation. SP6 is preferable, and SP6 is particularly preferable when an omega sequence or a sequence containing a part of the omega sequence is used as an enhancer sequence for translation. The translation enhancer is preferably part of the omega sequence, and part of the omega sequence may be part of the TMV omega sequence (O29; Gallie DR, Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., Vol. 20, 4631 -4638, and those including WO 02/48347).

また、翻訳効率に関し、3'末端領域においては、XhoI配列とポリA配列の組み合わせが好ましい。さらに、ORF領域の下流部分、すなわちXhoI配列の上流に親和性タグがついたものとポリA配列の組み合わせが好ましい。親和性タグ配列としては、抗原抗体反応など、蛋白質を検出できるいかなる手段を用いるための配列であればよく、制限はない。好ましくは、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるFlag-tag配列又はHis-tag配列である。ポリA配列効果としては、Flag-tag等の親和性タグにXhoI配列がついたものとそこへさらにポリA配列がついたものの翻訳効率が上昇する。ここで、His-tagについては、XhoI配列のない構成でも十分な翻訳効率を示し、有効である。   In terms of translation efficiency, a combination of an XhoI sequence and a polyA sequence is preferable in the 3 ′ end region. Further, a combination of a poly A sequence with an affinity tag in the downstream part of the ORF region, that is, upstream of the XhoI sequence is preferable. The affinity tag sequence is not particularly limited as long as it is a sequence for using any means capable of detecting a protein such as an antigen-antibody reaction. Preferably, it is a Flag-tag sequence or His-tag sequence which is a tag for affinity separation analysis by antigen-antibody reaction. As a poly A sequence effect, the translation efficiency of an affinity tag such as Flag-tag with an XhoI sequence and a poly A sequence added thereto is increased. Here, the His-tag is effective because it shows sufficient translation efficiency even in a configuration without an XhoI sequence.

上記の翻訳効率に関し効果のある構成は、対応付け効率にも有効である。   The configuration effective for the translation efficiency is also effective for the association efficiency.

5'UTRをSP6+O29とし、3'末端領域を、たとえば、Flag+XhoI+Aｎ(n=8)又はHis+ Aｎ(n=8)とすることで、各長さは、5'UTRで約49bp、3'末端領域で約38bp又は約26bpであり、PCRのプライマーにアダプター領域として組み込める長さである。このため、あらゆるベクターやプラスミドやcDNAライブラリーからPCRによって、5'UTRと3'末端領域をもったコード領域を簡単に作成できる。コード領域において、翻訳はORF領域を超えてされてもよい。すなわち、ORF領域の末端に終止コドンがなくてもよい。   By making 5′UTR SP6 + O29 and the 3 ′ end region, for example, Flag + XhoI + An (n = 8) or His + An (n = 8), each length is about 5′UTR. 49 bp, about 38 bp or about 26 bp in the 3 ′ end region, and is a length that can be incorporated as an adapter region into a PCR primer. For this reason, a coding region having a 5 ′ UTR and a 3 ′ terminal region can be easily prepared by PCR from any vector, plasmid, or cDNA library. In the coding region, translation may be done beyond the ORF region. That is, there may not be a stop codon at the end of the ORF region.

ペプチドアクセプター領域は、ペプチドのＣ末端に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ピューロマイシン、3'-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（3'-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのPANS-Gly、バリンのPANS-Val、アラニンのPANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するPANS-全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として3'-アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, AANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのAANS-Gly、バリンのAANS-Val、アラニンのAANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するAANS-全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシド又はヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸又はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。   The peptide acceptor region is not particularly limited as long as it can bind to the C-terminus of the peptide. For example, puromycin, 3'-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside (3'-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-amino acid) For example, PANS-Gly whose amino acid part is glycine, PANS-Val of valine, PANS-Ala of alanine, and other PANS-all amino acids corresponding to all amino acids can be used. In addition, 3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside (AANS-amino acid, 3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, connected by an amide bond formed as a result of dehydration condensation between the amino group of 3'-aminoadenosine and the carboxyl group of the amino acid For example, AANS-Gly having an amino acid part of glycine, AANS-Val of valine, AANS-Ala of alanine, and other AANS-all amino acids corresponding to all amino acids can be used. Further, a nucleoside or a nucleoside and amino acid ester-bonded one can be used. In addition, nucleoside or a substance having a chemical structure skeleton similar to nucleoside and an amino acid or a substance having a chemical structure skeleton similar to amino acid can be used as long as they can be chemically bonded.

ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と1残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。ここで、誘導体とは蛋白質翻訳系においてペプチドのＣ末端に結合できる誘導体を意味する。ピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピューロマイシン構造の一部が欠落しているものも包含する。ピューロマイシン誘導体の具体例としては、PANS-アミノ酸、AANS-アミノ酸などが挙げられる。   The peptide acceptor region is preferably composed of puromycin or a derivative thereof, or puromycin or a derivative thereof and one or two deoxyribonucleotides or ribonucleotides. Here, the derivative means a derivative capable of binding to the C-terminus of the peptide in the protein translation system. The puromycin derivatives are not limited to those having a complete puromycin structure, but also include those lacking a part of the puromycin structure. Specific examples of the puromycin derivative include PANS-amino acid and AANS-amino acid.

ペプチドアクセプター領域は、ピューロマイシンのみの構成でもかまわないが、5'側に1残基以上のDNAおよび/又はRNAからなる塩基配列を持つことが好ましい。配列としては、dC-ピューロマイシン, rC-ピューロマイシンなど、より好ましくはdCdC-ピューロマイシン, rCrC-ピューロマイシン, rCdC-ピューロマイシン, dCrC-ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル-tRNAの3'末端を模倣したCCA配列(Philipps, G.R. (1969) Nature 223, 374-377)が適当である。塩基の種類としては、C>(U又はT)>G>Aの順で好ましい。   The peptide acceptor region may be composed of puromycin alone, but preferably has a base sequence consisting of DNA and / or RNA of 1 residue or more on the 5 ′ side. The sequence is dC-puromycin, rC-puromycin, etc., more preferably dCdC-puromycin, rCrC-puromycin, rCdC-puromycin, dCrC-puromycin, etc., and the 3 ′ end of aminoacyl-tRNA A mimicked CCA sequence (Philipps, GR (1969) Nature 223, 374-377) is suitable. The type of base is preferably C> (U or T)> G> A in this order.

スペーサー領域は、好ましくは、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域である。スペーサー領域は、通常には、PEG領域の他に、核酸の3'末端に結合できるドナー領域を含む。   The spacer region is preferably a PEG region mainly composed of polyethylene glycol. The spacer region usually includes a donor region that can bind to the 3 ′ end of the nucleic acid in addition to the PEG region.

核酸の3'末端に結合できるドナー領域は、通常、１以上のヌクレオチドからなる。ヌクレオチドの数は、通常には１〜１５、好ましくは１〜２である。ヌクレオチドはリボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。ドナー領域は修飾物質を有していてもよい。   The donor region that can bind to the 3 ′ end of a nucleic acid usually consists of one or more nucleotides. The number of nucleotides is usually 1-15, preferably 1-2. The nucleotide may be ribonucleotide or deoxyribonucleotide. The donor region may have a modifying substance.

ドナー領域の5'末端の配列は、プレイをコードするコード領域とのライゲーション効率を左右する。コード領域とスペーサー領域をライゲーションさせるためには、少なくとも1残基以上を含むことが必要であり、ポリA配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のdC(デオキシシチジル酸)又は２残基のdCdC(ジデオキシシチジル酸)が好ましい。塩基の種類としては、C>(U又はT)>G>Aの順で好ましい。   The sequence at the 5 ′ end of the donor region affects the ligation efficiency with the coding region encoding prey. In order to ligate the coding region and the spacer region, it is necessary to contain at least one residue. For an acceptor having a poly A sequence, at least one residue of dC (deoxycytidylic acid) or 2 The residue dCdC (dideoxycytidylic acid) is preferred. The type of base is preferably C> (U or T)> G> A in this order.

PEG領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。ここで、主成分とするとは、PEG領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が20 bp以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が400以上であることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドの合計の数が10 bp以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が1000以上であることを意味する。   The PEG region is mainly composed of polyethylene glycol. Here, the main component means that the total number of nucleotides contained in the PEG region is 20 bp or less, or the average molecular weight of polyethylene glycol is 400 or more. Preferably, it means that the total number of nucleotides is 10 bp or less, or the average molecular weight of polyethylene glycol is 1000 or more.

PEG領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、400〜30,000、好ましくは1,000〜10,000、より好ましくは2,000〜8,000である。ここで、ポリエチレングリコールの分子量が約400より低いと、このスペーサー領域を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるが(Liu, R., Barrick, E., Szostak, J.W., Roberts, R.W. (2000) Methods in Enzymology, vol. 318, 268-293)、分子量1000以上、より好ましくは2000以上のPEGを用いると、対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。また、ポリエチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、特に分子量1000以上で良好であり、分子量400以下ではDNAスペーサーと性質がそれほどかわらず不安定となることがある。   The average molecular weight of polyethylene glycol in the PEG region is usually 400 to 30,000, preferably 1,000 to 10,000, and more preferably 2,000 to 8,000. Here, when the molecular weight of polyethylene glycol is lower than about 400, when a genotype molecule containing this spacer region is translated by correspondence, post-match translation may be necessary (Liu, R., Barrick, E., Szostak, JW, Roberts, RW (2000) Methods in Enzymology, vol. 318, 268-293), using PEGs with a molecular weight of 1000 or more, more preferably 2000 or more, high efficiency with only corresponding translation Since post-translation is possible, post-translation processing is not necessary. In addition, when the molecular weight of polyethylene glycol increases, the stability of genotype molecules tends to increase, especially when the molecular weight is 1000 or higher, and when the molecular weight is 400 or lower, the DNA spacer may not be so characteristic and unstable. .

ポリエチレングリコールを主成分とするスペーサー領域を有することによって、対応付け分子がウサギ網状赤血球のみならず小麦胚芽の無細胞翻訳系でも形成可能となり、両翻訳系での遺伝子型分子の安定性が飛躍的に向上し、翻訳後の処理を施すことが不要となる。   By having a spacer region composed mainly of polyethylene glycol, the mapping molecule can be formed not only in rabbit reticulocytes but also in cell-free translation systems of wheat germ, and the stability of genotype molecules in both translation systems has been dramatically improved. It is not necessary to perform post-translational processing.

（２）の態様では、ＤＮＡが、蛋白質とストレプトアビジン又はアビジンとの融合蛋白質をコードし、ＤＮＡがビオチンにより標識され、ＤＮＡ一分子がエマルジョンの一区画に含まれる状態で転写および翻訳が行われることにより、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合することが好ましい。このような対応付け分子を用いる相互作用の検出方法としては、STABLE法が挙げられる。   In the aspect (2), DNA encodes a protein and streptavidin or avidin fusion protein, DNA is labeled with biotin, and transcription and translation are performed in a state where one DNA molecule is contained in one section of the emulsion. Thus, it is preferable that the translated prey is associated with the DNA. As an interaction detection method using such an association molecule, the STABLE method can be mentioned.

エマルジョンは、通常には、２種の界面活性剤およびミネラルオイルと、無細胞転写翻訳系の反応液を混合して形成されるW/O型のエマルジョンである。W/O型のエマルジョンを形成するには、通常には、界面活性剤のHLB(hydrophile-lipophile balance)値が3.5〜６である必要がある。２種の界面活性剤を混合した場合のHLB値は、個々の界面活性剤のHLB値から簡単な計算式で求められる。例えば、Span 85(HLB=1.8およびTween 80(HLB=15.0)を、それぞれ40.2μlおよび9.8μlの割合で混合することによりHLB=4.4となる。界面活性剤とミネラルオイルの割合は、通常１：１８（容量比）である。また、反応液の割合はエマルジョン全体に対して１〜５０％（容量比）であり、通常は５％である。界面活性剤とミネラルオイルの混合物に、撹拌しながら、低温で、反応液をいくつかに分けて添加し、混合することによりエマルジョンを形成することができる。転写および翻訳の反応は、エマルジョンの温度を上げることにより、開始させることができる。   The emulsion is usually a W / O type emulsion formed by mixing two surfactants and mineral oil with a reaction solution of a cell-free transcription / translation system. In order to form a W / O type emulsion, it is usually necessary that the surfactant has an HLB (hydrophile-lipophile balance) value of 3.5-6. The HLB value when two kinds of surfactants are mixed can be obtained by a simple calculation formula from the HLB values of the individual surfactants. For example, by mixing Span 85 (HLB = 1.8 and Tween 80 (HLB = 15.0) at a rate of 40.2 μl and 9.8 μl, respectively, HLB = 4.4. The ratio of surfactant to mineral oil is usually 1: The ratio of the reaction solution is 1 to 50% (volume ratio) with respect to the whole emulsion, and usually 5%, and the mixture of surfactant and mineral oil is stirred. However, at low temperature, the reaction solution can be added in portions and mixed to form an emulsion, and the transcription and translation reactions can be initiated by raising the temperature of the emulsion.

プレイをコードするＤＮＡの調製およびこのＤＮＡの無細胞転写翻訳系での転写および翻訳は通常の方法に従って行うことができる。   Preparation of DNA encoding prey and transcription and translation of this DNA in a cell-free transcription / translation system can be performed according to ordinary methods.

上述のように、ベイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行うことにより、無細胞共翻訳により形成された複合体を特異的に検出することができる。   As described above, the complex formed by cell-free cotranslation can be specifically detected by performing detection labeling and separation modification in a specific manner on baits and preys.

ベイトとプレイの無細胞共翻訳において、無細胞共翻訳を行う無細胞翻訳系（無細胞転写翻訳系を含む）については、大腸菌E. coli、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系などいずれでも構わない。in vitroウイルス法では、対応付け分子の形成は、大腸菌E. coliではかなり不安定であるが、ウサギ網状赤血球の系(Nemoto N, Miyamoto-Sato E, Yanagawa H. (1997) FEBS Lett. 414, 405; Roberts R.W, Szostak J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297)では安定であることが確認されており、さらに小麦胚芽の系(特開2002-176987)ではより安定であることが確認されている。STABLE法では、大腸菌E. coli、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系などいずれでも構わない。   In cell-free co-translation of bait and prey, cell-free translation systems (including cell-free transcription and translation systems) that perform cell-free co-translation may be any of E. coli, rabbit reticulocytes, wheat germ systems, etc. . In the in vitro virus method, the formation of the mapping molecule is quite unstable in E. coli, but the rabbit reticulocyte system (Nemoto N, Miyamoto-Sato E, Yanagawa H. (1997) FEBS Lett. 414, 405; Roberts RW, Szostak JW (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297), and it is more stable in the wheat germ system (JP 2002-176987). It has been confirmed that there is. In the STABLE method, any of Escherichia coli E. coli, rabbit reticulocyte, wheat germ system and the like may be used.

無細胞共翻訳における翻訳又は転写および翻訳の条件は、用いる無細胞翻訳系に応じて適宜選択される。   The conditions for translation or transcription and translation in cell-free cotranslation are appropriately selected according to the cell-free translation system used.

無細胞翻訳系に添加するベイトとプレイのテンプレートは、無細胞翻訳系が転写も生じる無細胞転写翻訳系であれば、RNA又はDNAのどちらでも構わない。   The bait and prey template added to the cell-free translation system may be either RNA or DNA as long as the cell-free translation system also generates transcription.

以下、ベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートの例について説明する。   Hereinafter, an example of a translation template preferable for use as a bait will be described.

本態様の共翻訳スクリーニングにおけるベイトとして、図１１に示すように、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とPEGスペーサー部からなることを特徴とする翻訳テンプレートを利用する。コード部は、蛋白質に翻訳される情報であり、どのような配列でも良いが、好ましくは、コード部の3'末端領域にアクセプター (A配列)を持つ、あるいは、コード部の3'末端領域にアクセプター(A配列)を持ち、かつA配列の5'上流に翻訳増幅配列（X配列）を持つことを特徴とする。コード部のA配列として、短いポリA配列を含む。短いポリA配列とは、通常には２〜１０塩基のAからなる配列である。X配列として、(C又はG)NN(C又はG)配列を有する配列、たとえば、XhoI配列を有することを特徴とする。PEGスペーサー部は、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域、コード部と連結するためのドナー領域、および3'末端にCCA領域を持つ。PEGスペーサー部は、ドナー領域のみ、CCA領域のみでもかまわないが、好ましくは、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域を含む構成をとる。CCA領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とする。PEG領域のポリエチレングリコールの分子量は、500以上であることを特徴とする。また、ドナー領域および/又はCCA領域において、少なくとも1つの機能付与ユニット(F)を含むことを特徴とする。機能付与ユニット(F１および/又はF２)が、該翻訳テンプレートおよび/又は該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化又は蛍光ラベル化することを特徴とする。固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、フルオレセイン, Cy5, 又はローダミングリーン(RhG)などが考えられる。これらのコード部や翻訳テンプレート、およびそのライブラリー、さらに、リボソーム上で翻訳された蛋白質やそのライブラリーに関するものである。   As a bait in the cotranslation screening of this embodiment, as shown in FIG. 11, a translation template characterized by comprising a code part having information to be translated into a protein and a PEG spacer part is used. The coding part is information to be translated into a protein and may be any sequence. Preferably, the coding part has an acceptor (A sequence) in the 3 ′ end region of the coding part or in the 3 ′ end region of the coding part. It has an acceptor (A sequence) and a translation amplification sequence (X sequence) 5 ′ upstream of the A sequence. A short poly A sequence is included as the A sequence of the coding part. A short poly A sequence is usually a sequence consisting of 2 to 10 bases of A. The X sequence is characterized by having a sequence having a (C or G) NN (C or G) sequence, for example, an XhoI sequence. The PEG spacer portion has a PEG region mainly composed of polyethylene glycol, a donor region for linking with the code portion, and a CCA region at the 3 ′ end. The PEG spacer portion may be a donor region alone or a CCA region alone, but preferably has a configuration including a PEG region mainly composed of polyethylene glycol. The CCA region is characterized by having no function of binding to a protein translated by the translation template by a peptide transfer reaction. The molecular weight of polyethylene glycol in the PEG region is 500 or more. The donor region and / or the CCA region includes at least one function-imparting unit (F). The function-imparting unit (F1 and / or F2) is characterized in that the translation template and / or a protein translated from the translation template is immobilized or fluorescently labeled. Biotin or the like can be considered as an immobilizing substance, and fluorescein, Cy5, rhodamine green (RhG) or the like can be considered as a fluorescent substance. The present invention relates to these code parts, translation templates, and libraries thereof, as well as proteins translated on ribosomes and libraries thereof.

ベイトの翻訳テンプレート(図１１のＡ)は、コード分子(図１１のＢ)に由来するコード部とPEGスペーサー分子(図１１のＣ)に由来するPEGスペーサー部からなる。本態様では、基本的にはコード部の配列によらず、コード部にPEGスペーサー部を連結(ライゲーション)することでその安定性が向上して翻訳効率を向上出来る。しかしながら、さらにコード部の構成やPEGスペーサー部の種類によって、その翻訳効率をより向上させることが可能である。以下にその詳細を記載する。   The bait translation template (A in FIG. 11) consists of a coding portion derived from a coding molecule (B in FIG. 11) and a PEG spacer portion derived from a PEG spacer molecule (C in FIG. 11). In this embodiment, basically, the PEG spacer portion is linked (ligated) to the code portion regardless of the arrangement of the code portion, so that the stability is improved and the translation efficiency can be improved. However, depending on the configuration of the code part and the type of the PEG spacer part, the translation efficiency can be further improved. Details are described below.

本態様のコード部(図１１のＢ)は、5'末端領域、ORF領域、3'末端領域からなり、5'末端にCap構造があってもなくても良い。また、コード部の配列には特に制限はなく、あらゆるベクターやプラスミドに組み込まれたものとしての利用が考えられる。また、コード部の3'末端領域は、A配列としてポリAｘ8配列、又はX配列としてXhoI配列や４塩基以上でSNNS(SはG又はC)の配列を持つもの、およびA配列とX配列の組み合わせとしてのXA配列がある。A配列、X配列、又はXA配列の上流に親和性タグ配列としてFlag-tag配列、からなる構成が考えられる。ここで、親和性タグ配列としてはHA-tagやIgGのプロテインA(zドメイン)などの抗原抗体反応を利用したものやHis-tagなど、蛋白質を検出又は精製できるいかなる手段を用いるための配列でもかまわない。ここで、翻訳効率に影響する範囲としては、XA配列の組み合わせが重要であり、X配列のなかで、最初の４塩基が重要であり、SNNSの配列を持つものが好ましい。また、5'末端領域は、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなり、転写プロモーターはT7/T3又はSP6などが利用でき、特に制限はないが、小麦の無細胞翻訳系では、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用することが好ましく、プロモーターとしては、SP6を用いることが好ましい。翻訳エンハンサーのオメガ配列の一部(O29)は、TMVのオメガ配列の一部を含んだものである(Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631-4638、および、WO 02/48347の図３参照)。コード部のORF領域については、DNAおよび/又はRNAからなるいかなる配列でもよい。遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、又は、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。   The code part (B in FIG. 11) of this embodiment comprises a 5 ′ end region, an ORF region, and a 3 ′ end region, and may or may not have a Cap structure at the 5 ′ end. Moreover, there is no restriction | limiting in particular in the arrangement | sequence of a coding part, The utilization as what was integrated in all the vectors and plasmids can be considered. In addition, the 3 ′ end region of the coding part is a poly Ax8 sequence as an A sequence, an XhoI sequence as an X sequence, or a SNNS (S is G or C) sequence of 4 or more bases, and an A sequence and an X sequence. There is an XA sequence as a combination. A configuration comprising an A sequence, an X sequence, or a Flag-tag sequence as an affinity tag sequence upstream of the XA sequence is conceivable. Here, the affinity tag sequence may be any sequence that uses any means capable of detecting or purifying proteins, such as those using antigen-antibody reactions such as HA-tag and IgG protein A (z domain), and His-tag. It doesn't matter. Here, as a range that affects translation efficiency, the combination of XA sequences is important. Among the X sequences, the first four bases are important, and those having SNNS sequences are preferable. The 5 'terminal region consists of a transcription promoter and a translation enhancer. T7 / T3 or SP6 can be used as the transcription promoter, and there is no particular restriction. Or a sequence containing a part of the omega sequence is preferably used, and SP6 is preferably used as the promoter. Part of the translation enhancer omega sequence (O29) contains part of the TMV omega sequence (Gallie DR, Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., Vol. 20, 4631-4638, and , See FIG. 3 of WO 02/48347). The ORF region of the coding part may be any sequence consisting of DNA and / or RNA. A gene sequence, exon sequence, intron sequence, random sequence, or any natural sequence or artificial sequence is possible, and there is no sequence limitation.

本態様のPEGスペーサー分子(図１１のＣ)は、CCA領域、PEG領域、ドナー領域からなる。最低限必要な構成は、ドナー領域である。翻訳効率に影響する範囲としては、ドナー領域のみならずPEG領域を持つものが好ましく、さらにアミノ酸との結合能力のないピューロマイシンを持つことが好ましい。PEG領域のポリエチレングリコールの分子量の範囲は、400〜30,000で、好ましくは1,000〜10,000、より好ましくは2,000〜6,000である。また、CCA領域にはピューロマイシンを含む構成と含まない構成が可能であり、ピューロマイシンについては、ピューロマイシン（Puromycin）、3'-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（3'-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのPANS-Gly、バリンのPANS-Val、アラニンのPANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するPANS-全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として3'-アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, AANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのAANS-Gly、バリンのAANS-Val、アラニンのAANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するAANS-全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシド又はヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸又はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。本翻訳テンプレートでは、以上のピューロマイシン誘導体のアミノ基がアミノ酸と結合する能力を欠いたあらゆる物質、およびピューロマイシンを欠いたCCA領域も考えられるが、リボソーム上で蛋白質と結合不能なピューロマイシンを含むことで、より翻訳効率を高められる。その理由は定かではないが、蛋白質と結合不能なピューロマイシンがリボソームを刺激することでターンオーバーが促進される可能性がある。CCA領域(CCA)の 5'側に1残基以上のDNAおよび/又はRNAからなる塩基配列を持つことが好ましい。塩基の種類としては、C>(U又はT)>G>Aの順で好ましい。配列としては、dC-ピューロマイシン, rC-ピューロマイシンなど、より好ましくはdCdC-ピューロマイシン,rCrC-ピューロマイシン, rCdC-ピューロマイシン, dCrC-ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル-tRNAの3'末端を模倣したCCA配列(Philipps G.R. (1969) Nature 223, 374-377)が適当である。本発明の一態様では、これらのピューロマイシンが何らかの方法でアミノ酸と結合不可能となっている。   The PEG spacer molecule (C in FIG. 11) of this embodiment consists of a CCA region, a PEG region, and a donor region. The minimum required configuration is a donor region. The range that affects the translation efficiency is preferably one having not only the donor region but also the PEG region, and more preferably puromycin having no ability to bind to amino acids. The molecular weight range of polyethylene glycol in the PEG region is 400 to 30,000, preferably 1,000 to 10,000, more preferably 2,000 to 6,000. In addition, the CCA region can be constructed with or without puromycin. For puromycin, puromycin, 3'-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside (3'-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-amino acids), for example, PANS-Gly whose amino acid part is glycine, PANS-Val of valine, PANS-Ala of alanine, and other PANS-all amino acids corresponding to all amino acids can be used. In addition, 3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside (AANS-amino acid, 3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, connected by an amide bond formed as a result of dehydration condensation between the amino group of 3'-aminoadenosine and the carboxyl group of the amino acid For example, AANS-Gly having an amino acid part of glycine, AANS-Val of valine, AANS-Ala of alanine, and other AANS-all amino acids corresponding to all amino acids can be used. Further, a nucleoside or a nucleoside and amino acid ester-bonded one can be used. In addition, nucleoside or a substance having a chemical structure skeleton similar to nucleoside and an amino acid or a substance having a chemical structure skeleton similar to amino acid can be used as long as they can be chemically bonded. In this translation template, any substance in which the amino group of the above puromycin derivative lacks the ability to bind to an amino acid, and a CCA region lacking puromycin, are considered, but include puromycin that cannot bind to proteins on the ribosome. This can improve the translation efficiency. The reason is not clear, but puromycin that cannot bind to the protein may stimulate turnover by stimulating the ribosome. It is preferable to have a base sequence consisting of DNA and / or RNA of one residue or more on the 5 ′ side of the CCA region (CCA). The type of base is preferably C> (U or T)> G> A in this order. The sequence is dC-puromycin, rC-puromycin, etc., more preferably dCdC-puromycin, rCrC-puromycin, rCdC-puromycin, dCrC-puromycin, etc., and the 3 ′ end of aminoacyl-tRNA is A mimicked CCA sequence (Philipps GR (1969) Nature 223, 374-377) is suitable. In one embodiment of the present invention, these puromycins cannot be bound to amino acids in any way.

本態様のPEGスペーサー部は修飾物質(F１および/又はF２)を有する構成が可能である。このことによって、翻訳テンプレートを回収、精製による再利用、あるいは固定化などのためのタグとして利用することが出来る。少なくとも1残基のDNAおよび/又はRNAの塩基に修飾物質として、蛍光物質、ビオチン、あるいはHis-tagなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。また、コード部の5'末端領域をSP6+O29とし、3'末端領域を、たとえば、Flag+XhoI+A_n(n=8)とすることで、各長さは、5'末端領域で約60bp、3'末端領域で約40bpであり、PCRのプライマーにアダプター領域として設計可能な長さである。これによって新たな効果が生み出された。すなわち、あらゆるベクターやプラスミドやcDNAライブラリーからPCRによって、本態様の5'末端領域と3'末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、このコード部に、3'UTRの代わりとして PEGスペーサー部をライゲーションすることで、翻訳効率の高い翻訳テンプレートを得られる。The PEG spacer portion of this embodiment can be configured to have a modifying substance (F1 and / or F2). As a result, the translation template can be used as a tag for collection, reuse by purification, or immobilization. It is possible to introduce a fluorescent substance, biotin, or various separation tags such as His-tag as a modifying substance into at least one residue of DNA and / or RNA base. In addition, the 5 ′ end region of the coding part is SP6 + O29, and the 3 ′ end region is, for example, Flag + XhoI + A _n (n = 8), so that each length is about 5 ′ end region. The length is 60 bp, about 40 bp at the 3 ′ end region, and can be designed as an adapter region for PCR primers. This created a new effect. That is, it is possible to easily create the coding part having the 5 ′ terminal region and the 3 ′ terminal region of this embodiment by PCR from any vector, plasmid or cDNA library, and PEG as a substitute for 3 ′ UTR in this coding part. By ligating the spacer portion, a translation template with high translation efficiency can be obtained.

本態様のPEGスペーサー分子とコード分子のライゲーションは、その方法については、一般的なDNAリガーゼを用いるものや光反応による連結など何でもよく、特に限定されるものではない。RNAリガーゼを用いるライゲーションでは、コード部でライゲーション効率に影響を与える範囲としては3'末端領域のA配列が重要であり、少なくとも２残基以上のdAおよび/又はrAの混合又は単一のポリA連続鎖であり、好ましくは、3残基以上、より好ましくは６から８残基以上のポリA連続鎖である。PEGスペーサー部のドナー領域の5'末端のDNAおよび/又はRNA配列は、ライゲーション効率を左右する。コード部とPEGスペーサー部を、RNAリガーゼでライゲーションするためには、少なくとも1残基以上を含むことが必要であり、ポリA配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のdC(デオキシシチジル酸)又は２残基のdCdC(ジデオキシシチジル酸)が好ましい。塩基の種類としては、C>(U又はT)>G>Aの順で好ましい。さらに、ライゲーション反応時に、PEG領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することが好ましい。   The ligation between the PEG spacer molecule and the coding molecule of this embodiment is not particularly limited, and any method may be used such as a method using a general DNA ligase or a photoreaction ligation. In ligation using RNA ligase, the A sequence in the 3 ′ end region is important as the range that affects the ligation efficiency in the coding region, and a mixture of dA and / or rA of at least 2 residues or a single polyA It is a continuous chain, preferably a poly A continuous chain of 3 residues or more, more preferably 6 to 8 residues or more. The DNA and / or RNA sequence at the 5 ′ end of the donor region of the PEG spacer part affects the ligation efficiency. In order to ligate the coding part and the PEG spacer part with RNA ligase, it is necessary to contain at least one residue. For an acceptor having a poly A sequence, at least one residue of dC (deoxycysteine) is required. Diylic acid) or 2-residue dCdC (dideoxycytidylic acid) is preferred. The type of base is preferably C> (U or T)> G> A in this order. Furthermore, it is preferable to add polyethylene glycol having the same molecular weight as that of the PEG region during the ligation reaction.

次に、プレイとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートの例について説明する。   Next, an example of a translation template preferable for use as a play will be described.

本態様の共翻訳スクリーニングにおけるプレイとして、図１２に示すように、翻訳テンプレートによってＣ末端修飾された蛋白質(=対応付け分子)を利用する。翻訳テンプレートは、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とPEGスペーサー部からなる。コード部の3'末端にA配列を有し、A配列は、短いポリA配列を含む。PEGスペーサー部は、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域において、ポリエチレングリコールの分子量が400以上であることを特徴とする、また、ドナー領域および/又はCCA領域において、少なくとも1つの修飾物質(F１および/又はF２)を含むことを特徴とする。また、CCA領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有することを特徴とし、代表的にはCCA領域にピューロマイシンを有する。また、修飾物質(F１および/又はF２)が、該翻訳テンプレートおよび/又は該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化又は蛍光ラベル化することを特徴とする。固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、フルオレセイン, Cy5, 又はローダミングリーン(RhG)などが考えられる。これら、コード部および翻訳テンプレート、およびそのライブラリーが、リボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質(=対応付け分子)および蛋白質(=対応付け分子)のライブラリーに関するものである。   As a play in the cotranslation screening of this embodiment, as shown in FIG. 12, a protein (= corresponding molecule) modified with a C-terminal by a translation template is used. The translation template consists of a code part having information to be translated into a protein and a PEG spacer part. It has an A sequence at the 3 ′ end of the coding part, and the A sequence contains a short poly A sequence. The PEG spacer portion is characterized in that in the PEG region mainly composed of polyethylene glycol, the molecular weight of polyethylene glycol is 400 or more, and in the donor region and / or CCA region, at least one modifying substance (F1 and And / or F2). The CCA region has a function of binding to a protein translated by the translation template by a peptide transfer reaction, and typically has puromycin in the CCA region. The modifying substance (F1 and / or F2) is characterized in that the translation template and / or a protein translated from the translation template is immobilized or fluorescently labeled. Biotin or the like can be considered as an immobilizing substance, and fluorescein, Cy5, rhodamine green (RhG) or the like can be considered as a fluorescent substance. The present invention relates to a protein (= corresponding molecule) and a protein (= corresponding molecule) library synthesized by translating these coding parts and translation templates and their libraries on a ribosome.

プレイは、翻訳テンプレートを用いた翻訳によって合成された、翻訳テンプレートでＣ末端修飾された蛋白質(図１２のＡ；対応付け分子)であり、翻訳テンプレート(図１２のＢ)と、PEGによってＣ末端修飾された蛋白質(図１２のＣ)の構成に特徴を持つ。以下詳細に記述する。   Prey is a C-terminal modified protein (A in FIG. 12; mapping molecule) synthesized by translation using a translation template. The translation template (FIG. 12B) and C-terminal by PEG. It is characterized by the structure of the modified protein (C in FIG. 12). Details are described below.

翻訳テンプレート(図１２のＢ)のPEGスペーサー部は、ピューロマイシンがアミノ酸と連結できることを特徴とする以外は上記のベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートと同様である。また、コード部も上記のベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートと同様であるが、特に、対応付けに適した構成としては、3'末端領域をA配列にすることが重要であり、トータル蛋白の対応付けの効率が著しく向上してフリー蛋白質の量が激減する。ここでも、コード部の5'末端領域をSP6+O29とし、3'末端領域を、たとえば、Flag+XhoI+Aｎ(n=8)とすることで、各長さは、5'末端領域で約60bp、3'末端領域で約40bpであり、PCRのプライマーにアダプター領域として設計できる長さである。これによって、あらゆるベクターやプラスミドやcDNAライブラリーからPCRによって、本態様の5'末端領域と3'末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、PEGスペーサー部をライゲーションすることで、対応付け効率の高い翻訳テンプレートが得られる。   The PEG spacer portion of the translation template (B in FIG. 12) is the same as the preferred translation template for use as the bait described above except that puromycin can be linked to an amino acid. The coding part is also the same as the translation template preferred for use as the bait described above. In particular, as a configuration suitable for association, it is important that the 3 ′ end region is an A sequence, and the total protein The efficiency of the association is significantly improved and the amount of free protein is drastically reduced. Again, the 5 ′ end region of the coding part is SP6 + O29 and the 3 ′ end region is, for example, Flag + XhoI + An (n = 8), so that each length is about 5 ′ end region. The length is 60 bp, about 40 bp at the 3 ′ end region, and can be designed as an adapter region for PCR primers. This makes it possible to easily create the coding part with the 5 'end region and 3' end region of this embodiment by PCR from any vector, plasmid, or cDNA library, and linking the PEG spacer part by ligation. A highly efficient translation template can be obtained.

本態様のPEGによってＣ末端修飾された蛋白質(図１２のＣ)は、蛋白質の相互作用検出などにおいて、コード部を利用しない場合、たとえば、FCCS測定、蛍光リーダー、プロテインチップなどに応用する場合は、RNase Aなどで意図的に切断してもよい。切断することによって、コード部の妨害による蛋白質間相互作用の検出の困難性が解消出来る。また、単独の対応付け分子をプレートやビーズやスライドガラスに固定することも可能である。   The protein modified with C-terminal by PEG of this embodiment (C in FIG. 12) does not use the coding part in protein interaction detection or the like, for example, when applied to FCCS measurement, fluorescence reader, protein chip, etc. Alternatively, it may be intentionally cleaved with RNase A or the like. By cutting, it is possible to eliminate the difficulty in detecting protein-protein interactions due to interference with the code part. It is also possible to fix a single mapping molecule to a plate, bead, or slide glass.

無細胞共翻訳を、図１３を参照して説明する。図１３に示すように、ベイトの存在下でプレイがin vitroで翻訳される。図１３のＡおよびＢに示されるように、ベイトが蛋白質であって、無細胞翻訳系でプレイと同時に翻訳される場合と、ベイトが、核酸やホルモンなどであって、無細胞翻訳系に添加される場合がある。図１３に示すように、プレイは融合蛋白質又は対応付け分子とされる。   Cell-free cotranslation will be described with reference to FIG. As shown in FIG. 13, prey is translated in vitro in the presence of bait. As shown in FIGS. 13A and 13B, when the bait is a protein and is translated simultaneously with the play in the cell-free translation system, the bait is a nucleic acid, a hormone, or the like and added to the cell-free translation system. May be. As shown in FIG. 13, the prey is a fusion protein or a mapping molecule.

複合体は、ベイトと一つのプレイが結合して形成されること（Ｉ）の他に、ベイトに結合したプレイにさらに別のプレイが結合することにより形成されること（II）もある。   In addition to being formed by combining a bait and one play (I), the complex may be formed by combining another play with a play combined with the bait (II).

本発明検出方法によれば、in vitroで複合体の形成を行うことができるので、一貫してin vitroで蛋白質間又は核酸-蛋白質間などの相互作用を検出できる。   According to the detection method of the present invention, since a complex can be formed in vitro, it is possible to consistently detect interactions between proteins or between nucleic acids and proteins in vitro.

ベイトが蛋白質である場合は、ベイトとしては、目的蛋白質との相互作用のための機能ドメインのみの蛋白質、機能ドメインを含む蛋白質、又は完全長蛋白質などが挙げられる。ここで、完全長蛋白質を用いることは、複数の機能ドメインを有することが一般に予測されるため、さらに網羅的にプレイを検出可能となることから、好ましい。完全長蛋白質は、単独で完全長の蛋白質でもよいし、完全長の蛋白質を再構成する複数のベイトの集まりでもよい。   When the bait is a protein, examples of the bait include a protein having only a functional domain for interaction with a target protein, a protein containing a functional domain, or a full-length protein. Here, it is preferable to use a full-length protein because it is generally predicted to have a plurality of functional domains, so that the play can be detected more comprehensively. The full-length protein may be a full-length protein alone or a collection of a plurality of baits that reconstitute the full-length protein.

ベイトは、図１４に示したように、複合体であってもよく、これを「複合ベイト」と呼ぶ。複合体にすることによって、より非特異的な吸着を減らすことができ、かつ完全長蛋白質と同様の効果として、より網羅的にプレイを検出することが可能となる。   As shown in FIG. 14, the bait may be a complex, which is called “composite bait”. By using a complex, non-specific adsorption can be reduced and prey can be detected more comprehensively as an effect similar to that of a full-length protein.

以上のように、無細胞共翻訳で考えられる複合体としては、単独のベイトと単独のプレイの複合体、複合ベイトとプレイの複合体、ベイトと複数のプレイの複合体、および、複合ベイトと複数のプレイの複合体が可能である。従って、本発明検出法により検出可能な相互作用は、ベイトとプレイとの間の直接の相互作用だけでなく、複合体を形成するための間接的な相互作用をも包含するものである。   As described above, the complexes considered for cell-free cotranslation include single bait and single prey complex, composite bait and prey complex, bait and multiple prey complex, and composite bait and Multiple play complexes are possible. Therefore, the interaction detectable by the detection method of the present invention includes not only a direct interaction between bait and prey, but also an indirect interaction to form a complex.

本発明における無細胞共翻訳で最も重要なことは、蛋白質がネイティブな状態でフォールディングしており、翻訳されたての変性していない状態であり、相互作用するべきベイトとプレイ又はベイトとベイトやプレイとプレイが無細胞翻訳系に共存しており、速やかに相互作用できると言うことと考えられる。このことは、別々に翻訳して翻訳直後に混合して共存させるよりも、共に翻訳したものの方が優れた結果が得られたことにより支持される。すなわち、in vitroで翻訳された蛋白質がネイティブなフォールディング状態で、蛋白質又は核酸などと出会うことができるため、速やかに相互作用による複合体の形成が可能となったためと思われる。   The most important thing in the cell-free cotranslation in the present invention is that the protein is folded in its native state and is in a state in which it has not been denatured and has been translated, and bait and prey or bait and bait to interact with each other. Play and play coexist in a cell-free translation system and can be said to interact quickly. This is supported by the fact that better results were obtained when translated together than when translated separately and mixed immediately after translation. In other words, it seems that the in vitro translated protein can meet a protein or a nucleic acid in a native folding state, so that a complex can be rapidly formed by interaction.

従来の相互作用の検出法では、ベイトを大腸菌で大量に発現精製する必要があった。例えば、TAP法などでベイトとプレイの相互作用を細胞で発現させる場合は、最低一ヶ月の準備が必要であった。また、GST融合蛋白によるプルダウン法を採用しているmRNAディスプレイ法では、ベイトを大腸菌などで大量に発現させて精製するため、最低2〜3週間かかり、大腸菌で発現しないものはベイトに出来ないなどの問題があり、さらに、プレイと相互作用させるにはプレイの50〜100倍の量のベイトを添加する必要があった。無細胞共翻訳では、無細胞翻訳系において、ほぼ同量のmRNA又はDNAテンプレートを添加すればよいだけとなり、ベイトを細胞で発現させる必要は全くなくなり作業時間の大幅な短縮が行える。さらに、複合ベイトや完全長蛋白質によって、ベイトとプレイの相互作用をより強化し特異的なものとし、非特異的な結合の検出を回避することができる。また、複合ベイトによって、その第二のベイトと相互作用するより多くのプレイを網羅的に解析できる。   In the conventional detection method of interaction, it was necessary to express and purify the bait in large quantities in E. coli. For example, when expressing the bait and prey interaction in cells by the TAP method or the like, preparation of at least one month was required. In addition, the mRNA display method adopting the pull-down method with GST fusion protein takes a minimum of 2 to 3 weeks because bait is expressed and purified in large quantities in Escherichia coli, etc. Furthermore, in order to interact with play, it was necessary to add 50 to 100 times the amount of bait. In cell-free cotranslation, it is only necessary to add approximately the same amount of mRNA or DNA template in a cell-free translation system, and there is no need to express bait in cells, and the working time can be greatly reduced. In addition, complex baits and full-length proteins can enhance the bait and prey interaction to be more specific and avoid detection of non-specific binding. Also, the composite bait can comprehensively analyze more plays that interact with the second bait.

これまで、一貫してin vitroで相互作用による複合体形成とスクリーニングを実現するシステムは存在しなかったが、以上の本発明検出法によって、ベイトも含めて完全にin vitroで翻訳とスクリーニングを行って、蛋白質間又は蛋白質-核酸間の相互作用を非特異的な検出を回避しかつ網羅的に検出可能なシステムを構築できる。従って、本発明は、本発明検出方法を利用したスクリーニング方法も提供する。   So far, there has been no system that can achieve complex formation and screening by interaction in vitro. However, with the above detection method of the present invention, translation and screening can be performed completely in vitro including bait. Thus, it is possible to construct a system capable of comprehensively detecting interactions between proteins or protein-nucleic acids while avoiding non-specific detection. Therefore, the present invention also provides a screening method using the detection method of the present invention.

本発明スクリーニング法は、ベイトとプレイが無細胞共翻訳を通して相互作用して複合体を形成し、複合体のスクリーニングによってベイトと相互作用するプレイを解析することを特長とする。従って、本発明スクリーニング方法は、本発明検出方法により、ベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程を含む他は、ベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程、および、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイの通常のスクリーニング方法と同様でよい。   The screening method of the present invention is characterized in that a bait and prey interact through cell-free cotranslation to form a complex, and the prey that interacts with the bait is analyzed by screening the complex. Therefore, the screening method of the present invention includes a detection step of detecting an interaction between bait and play by the detection method of the present invention, in addition to a detection step of detecting an interaction between bait and play, and It may be the same as a normal screening method for a play that interacts with a bait, including a selection step of selecting a play in which an interaction is detected.

本発明スクリーニング方法は、選択工程で選択されたプレイを調製する調製工程をさらに含み、調製されたプレイを、検出工程で使用されたベイトの代わりに又はそのベイトと共に用いて、検出工程、選択工程および調製工程を繰り返すことが好ましい。この態様は、例えば、図１５に示すように、1)プレイおよびベイトが相互作用を形成する無細胞翻訳系における無細胞共翻訳の工程、2)ベイトと相互作用しているプレイを検出するスクリーニングの工程、3)プレイを分析および解析する工程、および4) 3)で分析および解析されたプレイを新たな次のベイトとし、1)から繰り返す工程から構成される。1)および2)の工程が検出工程および選択工程に相当し、3)の工程が調製工程に相当する。すなわち、検出工程のうちの、ベイトとプレイを接触させる工程が無細胞共翻訳の工程に相当し、検出工程のうちの複合体の検出および選択工程がスクリーニングの工程に相当する。   The screening method of the present invention further includes a preparation step for preparing the prey selected in the selection step, and the prepared prey is used in place of or in combination with the bait used in the detection step. It is preferable to repeat the preparation process. In this embodiment, for example, as shown in FIG. 15, 1) a step of cell-free cotranslation in a cell-free translation system in which prey and bait form an interaction, and 2) screening for detecting prey interacting with bait. 3) Analyzing and analyzing the play, 4) Playing the play analyzed and analyzed in 3) as a new next bait, and repeating from 1). The steps 1) and 2) correspond to the detection step and the selection step, and the step 3) corresponds to the preparation step. That is, the step of bringing the bait and prey into contact in the detection step corresponds to the cell-free cotranslation step, and the complex detection and selection step in the detection step corresponds to the screening step.

本発明スクリーニング法では、選択工程で選択されたプレイを再度検出工程に付してもよい。   In the screening method of the present invention, the play selected in the selection step may be subjected to the detection step again.

本発明スクリーニング法では、ベイトと複数のプレイの集団であるプレイ・ライブラリーとの無細胞共翻訳を行い、スクリーニングの工程において、２つ以上のプレイが検出されてもよい。   In the screening method of the present invention, cell-free cotranslation between a bait and a play library that is a group of a plurality of plays may be performed, and two or more plays may be detected in the screening step.

図１４に示すように、複合ベイトとプレイが共存し、相互作用によって複合ベイトとプレイの複合体を形成する場合がある。この無細胞共翻訳で、プレイ・ライブラリーの複数のプレイがベイトと共存し、相互作用によってベイトと複数のプレイの複合体を形成することによって、スクリーニングにおいて、一挙に網羅的な相互作用する複数のプレイを検出できる。また、ベイトが完全長蛋白質であることによって、完全長蛋白質は一般に相互作用の機能ドメインを複数含むので、より多くのプレイを網羅的に検出可能となる。   As shown in FIG. 14, the composite bait and the play may coexist, and a composite bait and play complex may be formed by interaction. In this cell-free cotranslation, multiple plays in the play library coexist with the bait, and a complex of bait and multiple plays is formed by the interaction. Can be detected. In addition, since the bait is a full-length protein, the full-length protein generally includes a plurality of functional domains of interaction, so that more preys can be comprehensively detected.

さらに、図１４に示すように、複合ベイトと相互作用する複数のプレイの複合体を形成することによって、複合ベイトと相互作用する複数のプレイを検出でき、また、第二のベイトがベイトとプレイの相互作用の補強剤となり、より特異的な相互作用が実現されることによって、網羅的検出における非特異的検出の回避が可能となる。in vitroウイルス法やSTABLE法など進化分子工学的手法では、プレイは対応付け分子(fusion)となる。プレイ・ライブラリーや複数のプレイを用いた場合の複合体の形成では、プレイは直接ベイトと相互作用する場合としない場合がある。   Furthermore, as shown in FIG. 14, by forming a complex of multiple plays interacting with the composite bait, multiple plays interacting with the composite bait can be detected, and the second bait can play with the bait. By realizing a more specific interaction, it becomes possible to avoid non-specific detection in exhaustive detection. In evolutionary molecular engineering methods such as the in vitro virus method and the STABLE method, prey becomes a fusion molecule. In the formation of a complex when using a play library or multiple plays, play may or may not interact directly with the bait.

複合体のスクリーニングにより得られた複合体が対応付け分子である場合には、図１５に示すように、複合体を形成するプレイをRT-PCR又はPCRにより検出し、さらに、PCR産物をプレイとして再スクリーニングする（プレイの再構築）、あるいは、PCR産物から解析したプレイを新たな次のベイトとしてスクリーニングしてもよい。ここで、PCR産物から再スクリーニングする、あるいは、PCR産物から解析したプレイを新たな次のベイトとしてスクリーニングする方法は、in vitroウイルス法やSTABLE法など進化分子工学的手法においてのみ可能であり、プルダウン法、TAP法など蛋白質を直接解析する方法ではできない。   When the complex obtained by screening the complex is a mapping molecule, as shown in FIG. 15, the prey forming the complex is detected by RT-PCR or PCR, and the PCR product is used as the prey. Rescreening (play reconstruction) or prey analyzed from PCR products may be screened as a new next bait. Here, re-screening from PCR products or screening of prey analyzed from PCR products as a new next bait is possible only in evolutionary molecular engineering methods such as in vitro virus method and STABLE method. It is not possible to directly analyze proteins such as the TAP method or the TAP method.

対応付け分子を用いた場合には、スクリーニングの後、RT-PCR又はPCRによって蛋白質プレイの遺伝子配列を知ることが出来る。図１３および１４に示すように、ここでの蛋白質プレイとは、ベイトと相互作用しているプレイ又はそのプレイと相互作用しているプレイなどであり、ベイトと相互作用しているすべての複数のプレイが網羅的に解析できる。さらにプレイの再スクリーニングが必要な場合は、RT-PCR又はPCRの産物であるDNAテンプレートを転写し、同じサイクルを繰り返す。また、RT-PCR又はPCRとそれに続くシークエンスによってプレイが定まった場合は、その蛋白質プレイはベイトとして使えるようになる。はじめのベイトに対して相互作用するプレイが複数個見つかれば、複合ベイトを形成することが出来るようになり、さらにより多くのプレイを検出することが出来るようになる。   When the mapping molecule is used, the gene sequence of protein prey can be known after screening by RT-PCR or PCR. As shown in FIGS. 13 and 14, the protein play here is a play interacting with a bait or a play interacting with the play, and the like. Play can be comprehensively analyzed. If further pre-screening is required, the DNA template that is the product of RT-PCR or PCR is transcribed and the same cycle is repeated. Also, if play is determined by RT-PCR or PCR followed by a sequence, the protein play can be used as a bait. If a plurality of plays interacting with the first bait are found, a composite bait can be formed, and even more plays can be detected.

無細胞共翻訳を用いると、プルダウン法やTAP法においても一貫してin vitroで蛋白質間相互作用を検出できることになるが、TAP法では対応付け分子を形成していないので、プレイの解析において直接的に蛋白質を解析しなければならない。そこで、プルダウン法やTAP法をスクリーニングの方法としてin vitroウイルス法やSTABLE法に応用すれば、対応付け分子を形成しているので、RT-PCR又はPCRによって、相互作用するプレイの解析においてその遺伝子配列を簡単に検出することが出来る。さらに、無細胞共翻訳を用いると、in vitroウイルス法やSTABLE法において、一貫してin vitroで蛋白質間相互作用を検出できることになる。また、プレイの数が莫大な場合は、サイクルを回すことで再スクリーニングによりプレイを絞り込むことが可能である。また、解析されたプレイは、次の解析では、ベイトとして使うことができ、ベイトの数が増えれば、ベイトの複合化が進み、さらなるプレイが検出されることにつながる。このように、プレイをベイトとして次のサイクルで使用することは、対応付け分子を用いるin vitroウイルス法やSTABLE法などでのみ簡単に実現できる。しかしながら、mRNAディスプレイなどの方法では、新しいベイトのGST融合蛋白を大腸菌で大量合成と精製が必要であり、ベイトの用意に時間がかかり困難である。無細胞共翻訳によれば、その必要もなく簡単にサイクルを回すことが出来る。   When cell-free cotranslation is used, protein-protein interactions can be detected in vitro consistently in the pull-down method and TAP method. Protein must be analyzed. Therefore, if the pull-down method or TAP method is applied to the in vitro virus method or the STABLE method as a screening method, an associated molecule is formed, so that the gene can be analyzed in the analysis of prey interacting by RT-PCR or PCR. The sequence can be easily detected. Furthermore, when cell-free cotranslation is used, protein-protein interactions can be consistently detected in vitro in the in vitro virus method or the STABLE method. When the number of plays is enormous, it is possible to narrow down the play by re-screening by rotating the cycle. In addition, the analyzed play can be used as a bait in the next analysis. If the number of baits increases, the combination of baits advances, and further play is detected. Thus, the use of prey as a bait in the next cycle can be easily realized only by the in vitro virus method or the STABLE method using the mapping molecule. However, methods such as mRNA display require large-scale synthesis and purification of a new bait GST fusion protein in E. coli, and it is difficult to prepare the bait. With cell-free cotranslation, the cycle can be easily performed without the necessity.

無細胞共翻訳後の複合体のスクリーニングにおいて、無細胞共翻訳によって出来た複合体を壊すことなくプレイを網羅的にスクリーニングできることが好ましい。このために、親和性タグなどによってベイトに固定化の仕組みを持たせ、ベイトと相互作用するプレイを検出してもよい。その固定化の仕組みは、いかなるものでも構わない。たとえば、既存のTAP法などのように、IgG-プロテインA親和性やカルモジュリンビーズを用いた２段階のスクリーニングを行う方法、又はプルダウン法のように、ストレプトアビジン又はアビジン-ビオチン親和性、GST-tag、Flag-tag, T7-tag, His-tagなどを利用した一段階又は二段階のスクリーニングを行う方法が挙げられる。   In screening for a complex after cell-free cotranslation, it is preferable that the prey can be comprehensively screened without destroying the complex formed by cell-free cotranslation. For this purpose, a play that interacts with the bait may be detected by providing an immobilization mechanism for the bait using an affinity tag or the like. Any immobilization mechanism may be used. For example, IgG-protein A affinity, a two-step screening method using calmodulin beads, such as the existing TAP method, or streptavidin or avidin-biotin affinity, GST-tag, such as a pull-down method And one-step or two-step screening using Flag-tag, T7-tag, His-tag, and the like.

プレイ・ライブラリーとしては、cDNAライブラリー(ランダムプライミング・ライブラリー、dTプライミング・ライブラリー)、ランダム・ライブラリー、ペプチド・ライブラリー、ホルモン・ライブラリー、抗体・ライブラリー、リガンド・ライブラリー、医薬化合物ライブラリーなどが挙げられ、いかなるライブラリーでも構わない。たとえば、プレイ・ライブラリーとしてランダムプライミング・cDNAライブラリーを用いた場合、このライブラリーには完全長プレイは望めないが、機能ドメインを含むプレイは期待できる。このようなライブラリーは、特に、複合ベイトや完全長蛋白質との組み合わせによるスクリーニングに用いると、プレイの網羅的検出に有効となる。   Play libraries include cDNA libraries (random priming libraries, dT priming libraries), random libraries, peptide libraries, hormone libraries, antibody libraries, ligand libraries, pharmaceuticals A compound library can be used, and any library can be used. For example, when a random priming cDNA library is used as a play library, full-length play cannot be expected from this library, but play including a functional domain can be expected. Such a library is effective for comprehensive detection of prey, particularly when used for screening by combination with complex baits and full-length proteins.

ランダムプライミングライブラリーの例としては、マルチクローニングサイト(MCS)の5'側に、転写プロモーターとしてSP6のRNAポリメラーゼのプロモーター(SP6)と、翻訳エンハンサーとしてタバコモザイクウイルスのTMVオメガ配列の一部(O29)とを含んだ5'非翻訳(UTR)領域を持ち、かつMCSの3'側に親和タグ配列として、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるFlag-tag配列を、MCSに組み込まれた挿入配列から発現した蛋白質のＣ末端にFlag-tagが付加されるように含む3'末端を持つベクターのMCSに、ランダムプライミングで得られた cDNAが組み込まれたものが挙げられる。   As an example of a random priming library, on the 5 ′ side of the multiple cloning site (MCS), the promoter of SP6 RNA polymerase (SP6) as a transcription promoter and a part of the TMV omega sequence of tobacco mosaic virus as a translation enhancer (O29 The Flag-tag sequence, which is a tag for affinity separation analysis by antigen-antibody reaction, was incorporated into MCS as an affinity tag sequence on the 3 'side of MCS. Examples include those in which cDNA obtained by random priming is incorporated into MCS of a vector having a 3 ′ end so that a Flag-tag is added to the C-terminus of the protein expressed from the inserted sequence.

上記の本発明検出方法は、ベイトとプレイとを接触させ複合体を形成させる工程を含んでいる。従って、この工程に準じて、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとの複合体を形成させる方法が提供される。   The detection method of the present invention includes a step of bringing a bait and a prey into contact to form a complex. Therefore, according to this step, a method of forming a complex of a bait and a prey that interacts with the bait is provided.

本発明形成方法は、ベイトとベイトと相互作用する蛋白質であるプレイとの複合体の形成において、プレイとして本発明のライブラリーを用いるものであり、好ましくは、さらに、ベイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを主な特徴とするものである。従って、本発明形成方法の好ましい構成は、ベイトおよびプレイに特定の様式で検出用標識および分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを除いて、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させることを含む、ベイトとプレイとの複合体の通常の形成方法と同様でよい。ベイトおよびプレイの特定の様式での検出用標識および分離用修飾ならびに無細胞共翻訳については、本発明検出方法に関し説明した通りでよい。   The formation method of the present invention uses the library of the present invention as a prey in the formation of a complex between bait and prey, which is a protein that interacts with bait. The main feature is that the labeling for detection and the modification for separation are carried out in (3) and cell-free cotranslation is carried out. Thus, a preferred configuration of the method of forming the present invention interacts with the bait and its bait, with the exception of performing bait and prey detection labeling and separation modifications in a specific manner and cell-free cotranslation. It may be the same as the usual formation method of the complex of bait and play including contacting with play. Detection labels and separation modifications and cell-free cotranslation in a specific manner of bait and prey may be as described for the detection method of the present invention.

また、ポスト・セレクションの例として、以下のものも挙げられる。
蛋白質と標的分子との間の相互作用を解析する方法であって、該蛋白質を含む、修飾剤がＣ末端に結合したＣ末端修飾蛋白質を用いることを特徴とする方法。相互作用の解析は、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法により行うことができる。Ｃ末端修飾蛋白質を固定化してもよい。標的分子が固定されたアレイ上にＣ末端修飾蛋白質を添加し、該標的分子と特異的に結合した該Ｃ末端修飾蛋白質を検出してもよい。Examples of post selection include the following.
A method for analyzing an interaction between a protein and a target molecule, which comprises using a C-terminal modified protein containing the protein and having a modifying agent bonded to the C-terminus. Interaction analysis can be performed by fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence imaging analyze, fluorescence resonance energy transfer, evanescent field molecular imaging, fluorescence depolarization, surface plasmon resonance, or solid-phase enzyme immunoassay. it can. A C-terminal modified protein may be immobilized. A C-terminal modified protein may be added to the array on which the target molecule is immobilized, and the C-terminal modified protein specifically bound to the target molecule may be detected.

本態様の解析方法においては、通常には、上記で得られた本発明修飾蛋白質と標的分子を、修飾物質の種類や反応系の種類などにより適宜組み合わせて接触せしめ、該本発明修飾蛋白質又は該標的分子が発する信号において両分子間の相互作用に基づいて発生される上記信号の変化を測定することにより相互作用を解析する。相互作用の解析は、例えば、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法により行われる。これらの方法の詳細については下記で説明する。   In the analysis method of this embodiment, the modified protein of the present invention obtained above and the target molecule are usually brought into contact with each other in an appropriate combination depending on the type of the modifying substance, the type of reaction system, etc. The interaction is analyzed by measuring the change in the signal generated based on the interaction between both molecules in the signal emitted by the target molecule. The analysis of the interaction is performed by, for example, fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence imaging analyze, fluorescence resonance energy transfer, evanescent field molecular imaging, fluorescence depolarization, surface plasmon resonance, or solid phase enzyme immunoassay. Is called. Details of these methods are described below.

「標的分子」とは、本発明修飾蛋白質と相互作用する分子を意味し、具体的には蛋白質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられ、好ましくは、蛋白質又はＤＮＡである。   The “target molecule” means a molecule that interacts with the modified protein of the present invention, and specifically includes a protein, a nucleic acid, a sugar chain, a low molecular weight compound, and the like, preferably a protein or DNA.

蛋白質としては、本発明修飾蛋白質と相互作用する能力を有する限り特に制限はなく、蛋白質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、およびその機能が既知の蛋白質でも、未知の蛋白質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製された蛋白質、又はｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製した蛋白質等でも標的分子として用いることができる。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖蛋白質であってもよい。これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製された蛋白質か、又はｃＤＮＡライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳および精製された蛋白質を用いることができる。   The protein is not particularly limited as long as it has the ability to interact with the modified protein of the present invention, and may be the full length of the protein or a partial peptide containing a binding active site. The protein may be a protein having a known amino acid sequence and its function or an unknown protein. These can also be used as target molecules in a synthesized peptide chain, a protein purified from a living body, or a protein translated from a cDNA library or the like using an appropriate translation system and purified. The synthesized peptide chain may be a glycoprotein having a sugar chain bound thereto. Of these, a purified protein having a known amino acid sequence or a protein translated and purified from a cDNA library or the like using an appropriate method can be preferably used.

核酸としては、本発明修飾蛋白質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はなく、ＤＮＡ又はＲＮＡも用いることができる。また、塩基配列又は機能が既知の核酸でも、未知の核酸でもよい。好ましくは、蛋白質に結合能力を有する核酸としての機能、および塩基配列が既知のものか、あるいはゲノムライブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離してきたものを用いることができる。   The nucleic acid is not particularly limited as long as it has the ability to interact with the modified protein of the present invention, and DNA or RNA can also be used. Further, it may be a nucleic acid with a known base sequence or function or an unknown nucleic acid. Preferably, a nucleic acid having a function as a nucleic acid capable of binding to a protein and a base sequence are known, or a nucleic acid that has been cleaved and isolated from a genomic library or the like using a restriction enzyme or the like can be used.

糖鎖としては、本発明修飾蛋白質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はなく、その糖配列又は機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。好ましくは、既に分離解析され、糖配列又は機能が既知の糖鎖が用いられる。   The sugar chain is not particularly limited as long as it has the ability to interact with the modified protein of the present invention, and its sugar sequence or function may be a known sugar chain or an unknown sugar chain. Preferably, a sugar chain that has already been separated and analyzed and whose sugar sequence or function is known is used.

低分子化合物としては、本発明修飾蛋白質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はない。機能が未知のものでも、又は蛋白質に結合する能力が既に知られているものでも用いることができる。   The low molecular compound is not particularly limited as long as it has the ability to interact with the modified protein of the present invention. Those having an unknown function or those having an already known ability to bind to a protein can be used.

これら標的分子が本発明修飾蛋白質と行う「相互作用」とは、通常は、蛋白質と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、および静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。   The “interaction” that these target molecules perform with the modified protein of the present invention is usually at least one of a covalent bond, hydrophobic bond, hydrogen bond, van der Waals bond, and electrostatic force bond between the protein and the target molecule. This term should be interpreted in the broadest sense and should not be construed as limiting in any way. The covalent bond includes a coordination bond and a dipole bond. In addition, electrostatic coupling includes electric repulsion in addition to electrostatic coupling. In addition, a binding reaction, a synthesis reaction, and a decomposition reaction resulting from the above action are also included in the interaction.

相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合および解離、蛋白質レセプターとリガンドの間の結合および解離、接着分子と相手方分子の間の結合および解離、酵素と基質の間の結合および解離、核酸とそれに結合する蛋白質の間の結合および解離、情報伝達系における蛋白質同士の間の結合と解離、糖蛋白質と蛋白質との間の結合および解離、又は糖鎖と蛋白質との間の結合および解離が挙げられる。   Specific examples of interactions include binding and dissociation between antigen and antibody, binding and dissociation between protein receptor and ligand, binding and dissociation between adhesion molecule and partner molecule, binding and dissociation between enzyme and substrate, Binding and dissociation between a nucleic acid and a protein that binds to it, binding and dissociation between proteins in an information transmission system, binding and dissociation between a glycoprotein and a protein, or binding and dissociation between a sugar chain and a protein Is mentioned.

用いられる標的分子は、態様に応じて修飾物質により修飾して用いることができる。修飾物質は、通常、蛍光性物質などの非放射性修飾物質から選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基（例えばカルボキシル基、水酸基、アミノ基など）を持ち、蛋白質、核酸等の上記標的物質と連結可能な種々の蛍光色素、例えばフルオレセイン系列、ローダミン系列、Cy3、Cy5、エオシン系列、ＮＢＤ系列などのいかなるものであってもよい。その他、色素など修飾可能な化合物であれば、その化合物の種類、大きさは問わない。   The target molecule to be used can be modified with a modifying substance depending on the embodiment. The modifying substance is usually selected from non-radioactive modifying substances such as fluorescent substances. As fluorescent substances, various fluorescent dyes having free functional groups (for example, carboxyl group, hydroxyl group, amino group, etc.) and capable of being linked to the above target substances such as proteins and nucleic acids, such as fluorescein series, rhodamine series, Cy3, Cy5 Any of eosin series, NBD series, etc. may be used. In addition, as long as it is a modifiable compound such as a dye, the type and size of the compound are not limited.

これらの修飾物質は、標的分子と本発明修飾蛋白質との間の相互作用に基づいて発生される信号の変化の測定又は解析方法に適したものが適宜用いられる。   As these modifiers, those suitable for a method for measuring or analyzing a change in a signal generated based on the interaction between the target molecule and the modified protein of the present invention are appropriately used.

上記修飾物質の標的分子への結合は、それ自体既知の適当な方法を用いて行うことができる。具体的には、例えば、標的分子が蛋白質の場合、WO 02/48347に記載されたＣ末端を修飾する方法等を用いることができる。また標的分子が核酸の場合は、予め修飾物質を共有結合などで結合させたオリゴＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲを行う方法などによって簡便に修飾することができる。   Binding of the modifying substance to the target molecule can be performed using an appropriate method known per se. Specifically, for example, when the target molecule is a protein, a method for modifying the C-terminus described in WO 02/48347 can be used. Further, when the target molecule is a nucleic acid, it can be easily modified by a method of performing PCR using an oligo DNA primer in which a modifying substance is previously bound by a covalent bond or the like.

また、本発明修飾蛋白質又は本発明に用いられる標的分子は態様に応じて、固相に結合させる（即ち、固定化する）場合があるが、固相に結合させる方法としては、修飾物質を介して結合させるものと、それ以外の部分により結合させるものが挙げられる。   In addition, the modified protein of the present invention or the target molecule used in the present invention may be bound (that is, immobilized) to a solid phase depending on the embodiment. And those that are bonded by other parts.

修飾物質を介して結合させる場合に用いられる修飾物質は、通常には、特定のポリペプチドに特異的に結合する分子（以下、「リガンド」と称することがある。）であり、固相表面には該リガンドと結合する特定のポリペプチド（以下、「アダプター蛋白質」と称することがある）を結合させる。アダプター蛋白質には、結合蛋白質、受容体を構成する受容体蛋白質、抗体なども含まれる。   The modifier used when binding via a modifier is usually a molecule that binds specifically to a specific polypeptide (hereinafter sometimes referred to as a “ligand”) and is attached to the solid surface. Binds a specific polypeptide that binds to the ligand (hereinafter sometimes referred to as "adapter protein"). Adapter proteins also include binding proteins, receptor proteins that constitute receptors, antibodies, and the like.

アダプター蛋白質／リガンドの組み合わせとしては、例えば、アビジンおよびストレプトアビジン等のビオチンおよびイミノビオチン結合蛋白質／ビオチン又はイミノビオチン、マルトース結合蛋白質／マルトース、Ｇ蛋白質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケル又はコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合蛋白質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合蛋白質／ＡＴＰ、又はエストラジオール受容体蛋白質／エストラジオールなどの各種受容体蛋白質／そのリガンドなどが挙げられる。   Examples of adapter protein / ligand combinations include biotin such as avidin and streptavidin and iminobiotin-binding protein / biotin or iminobiotin, maltose-binding protein / maltose, G protein / guanine nucleotide, polyhistidine peptide / nickel or cobalt, etc. Various receptor proteins such as metal ions, glutathione-S-transferase / glutathione, DNA binding protein / DNA, antibody / antigen molecule (epitope), calmodulin / calmodulin binding peptide, ATP binding protein / ATP, or estradiol receptor protein / estradiol / And its ligands.

これらの中で、アダプター蛋白質／リガンドの組み合わせとしては、アビジンおよびストレプトアビジンなどのビオチンおよびイミノビオチン結合蛋白質／ビオチン又はイミノビオチン、マルトース結合蛋白質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケル又はコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）、などが好ましく、特にストレプトアビジン／ビオチン又はイミノビオチンの組み合わせが最も好ましい。これらの結合蛋白質は、それ自体既知のものであり、該蛋白質をコードするＤＮＡは既にクローニングされている。   Among these, adapter protein / ligand combinations include biotin such as avidin and streptavidin and metal ions such as iminobiotin-binding protein / biotin or iminobiotin, maltose-binding protein / maltose, polyhistidine peptide / nickel or cobalt, Glutathione-S-transferase / glutathione, antibody / antigen molecule (epitope) and the like are preferable, and a combination of streptavidin / biotin or iminobiotin is particularly preferable. These binding proteins are known per se, and the DNA encoding the protein has already been cloned.

アダプター蛋白質の固相表面への結合は、それ自体既知の方法を用いることができるが、具体的には、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン-2,4-ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、又はホスホアミダイドに変換可能な水酸基又はアミノ基などを利用する方法を用いることができる。   The adapter protein can be bound to the solid phase surface by a method known per se. Specifically, for example, tannic acid, formalin, glutaraldehyde, pyruvaldehyde, bis-diazotized benzidone, toluene- A method using a 2,4-diisocyanate, an amino group, a carboxyl group that can be converted into an active ester, a hydroxyl group or an amino group that can be converted into a phosphoramidide, or the like can be used.

修飾物質以外の部分により固相に結合させる場合は、通常蛋白質、核酸、糖鎖、低分子化合物を固相に結合させるのに用いられる既知の方法、具体的には例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン-2,4-ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、又はホスホアミダイドに変換可能な水酸基又はアミノ基などを利用する方法を用いることができる。   When binding to the solid phase by a moiety other than the modifying substance, known methods commonly used for binding proteins, nucleic acids, sugar chains, low molecular weight compounds to the solid phase, specifically, for example, tannic acid, formalin, Use a method that uses glutaraldehyde, pyruvic aldehyde, bis-diazotized benzidone, toluene-2,4-diisocyanate, amino group, carboxyl group that can be converted to active ester, hydroxyl group or amino group that can be converted to phosphoramidide, etc. be able to.

固相は、通常、蛋白質や核酸等を固定化するのに用いられるものでよく、その材質および形状は特に限定されない。例えば、ガラス板やニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレンやポリビニリデンフロライド膜、又はプラスチック製のマイクロプレート等を用いることができる。   The solid phase may be usually used for immobilizing proteins, nucleic acids and the like, and the material and shape thereof are not particularly limited. For example, a glass plate, a nitrocellulose membrane, a nylon membrane, a polyvinylidene fluoride membrane, or a plastic microplate can be used.

「測定」とは解析のために用いられる信号の変化を収集するための手段であり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。用いられる測定法としては、例えば、蛍光相関分光法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、蛍光イメージングアナライズ法、表面プラズモン共鳴法、固相酵素免疫検定法など、分子間相互作用を検出できるあらゆる系が利用可能である。   “Measurement” is a means for collecting changes in the signal used for analysis and should not be construed as limiting in any way. Examples of the measurement method used include molecular correlation such as fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence resonance energy transfer method, evanescent field molecular imaging method, fluorescence depolarization method, fluorescence imaging analyze method, surface plasmon resonance method, solid phase enzyme immunoassay method, etc. Any system capable of detecting intermolecular interactions is available.

この測定法は、標的分子が固定されたアレイ上に本発明修飾蛋白質を添加し、該標的分子と特異的に結合した本発明修飾蛋白質を検出することを含む方法も含む。標的分子が固定されたアレイとは、標的分子がそれらの同定が可能な配置で固定化されている固相を意味する。該標的分子と特異的に結合した本発明修飾蛋白質の検出の方法は、該標的分子と特異的に結合した本発明修飾蛋白質が検出される限り、特に限定されず、通常には、本発明修飾蛋白質を添加したアレイから、標的分子に結合しない本発明修飾蛋白質を洗浄により除去し、残った本発明修飾蛋白質を検出する方法が挙げられる。   This measurement method also includes a method including adding the modified protein of the present invention onto an array on which the target molecule is immobilized, and detecting the modified protein of the present invention specifically bound to the target molecule. An array on which target molecules are immobilized means a solid phase on which target molecules are immobilized in an arrangement that allows their identification. The method for detecting the modified protein of the present invention specifically bound to the target molecule is not particularly limited as long as the modified protein of the present invention specifically bound to the target molecule is detected. Examples include a method in which the modified protein of the present invention that does not bind to the target molecule is removed from the array to which the protein has been added by washing, and the remaining modified protein of the present invention is detected.

以下、測定法の例について説明する。   Hereinafter, an example of the measurement method will be described.

（１）蛍光相関分光法
蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy（FCS）: Eigen, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5740-5747(1994)）は、共焦点レーザー顕微鏡等の下で、粒子の流動速度、又は拡散率、容積収縮等を測定する方法であり、本発明においては、本発明修飾蛋白質（Ｃ末端修飾蛋白質）と標的分子間の相互作用により元の修飾分子１分子の並進ブラウン運動の変化を測定することにより、相互作用する分子を測定することができる。(1) Fluorescence correlation spectroscopy (Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS): Eigen, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5740-5747 (1994)) This is a method for measuring the flow rate, diffusivity, volume shrinkage, etc. of particles under a focused laser microscope, etc. In the present invention, the interaction between the modified protein of the present invention (C-terminal modified protein) and the target molecule is used. By measuring the change in the translational Brownian motion of one molecule of the original modifying molecule, the interacting molecule can be measured.

具体的には試料粒子が励起光により励起されて、試料液容積の一部において蛍光を放射し、この放射光を測定し光子割合を得る。この値は、特定の時間に観測されている空間容積中に存在する粒子の数と共に変化する。上述した種々のパラメターは自己相関関数を使用してこの信号の変動から算出され得る。このFCSを行う為の装置もカールツァイス（Zeiss）社等から市販されており、本方法においてもこれらの装置を用いて解析を行うことができる。   Specifically, sample particles are excited by excitation light to emit fluorescence in a part of the sample liquid volume, and the emitted light is measured to obtain a photon ratio. This value varies with the number of particles present in the spatial volume observed at a particular time. The various parameters described above can be calculated from this signal variation using an autocorrelation function. An apparatus for performing this FCS is also commercially available from Carl Zeiss, etc., and in this method, analysis can be performed using these apparatuses.

この方法を用いて蛋白質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端修飾蛋白質又は標的分子のいずれも溶液として供することが必要である（液相法）。標的分子は修飾の必要はない。また相互作用を調べようとするＣ末端修飾蛋白質より非常に分子量の小さい分子は、Ｃ末端修飾蛋白質のブラウン運動に影響を及ぼさないため本方法においてはふさわしくない。   When measuring or analyzing the protein-target molecule interaction using this method, it is necessary to provide either the C-terminal modified protein or the target molecule as a solution (liquid phase method). The target molecule need not be modified. In addition, a molecule having a molecular weight much smaller than that of the C-terminal modified protein to be examined for interaction does not affect the Brownian motion of the C-terminal modified protein, and thus is not suitable for this method.

しかし、２種類の蛍光色素を用いる蛍光相互相関分光法（FCCS）は、１種類の蛍光色素を用いるFCSでは困難であった同じくらいの分子量をもつ蛋白質間の相互作用も検出できる。２種類の蛍光色素を用いる他の方法としては蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）法が知られているが、FRETが生じるためには２つの蛍光色素が40〜50Å以内に近接する必要があり、蛋白質の大きさや蛍光色素の付いている位置によっては、相互作用していてもFRETが観測されない危険性がある。FCCS法では相互相関の検出は蛍光色素間の距離に依存しないので、そのような問題がない。一方、他の検出系である蛍光偏光解消法と比較すると、FCCS法は必要なサンプル量が少なく、検出時間が短く、HTSのための自動化が容易等の長所がある。さらにFCCS法では蛍光標識された分子の大きさや数というきわめて基本的な情報が得られるので、表面プラズモン共鳴法のように汎用的な用途に利用できる可能性がある。両者の違いは、表面プラズモン共鳴法では蛋白質が固定化された状態で相互作用を検出するのに対して、FCCS法ではより天然の状態に近い溶液中の相互作用を見ることができる点にある。FCCS法では、蛋白質の固定化が必要ないかわりに、蛋白質を蛍光色素で標識する必要があるが、本発明により、この課題を克服することが可能となった。   However, fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) using two types of fluorescent dyes can also detect interactions between proteins having the same molecular weight that was difficult with FCS using one type of fluorescent dye. As another method using two types of fluorescent dyes, the fluorescence resonance energy transfer (FRET) method is known, but in order for FRET to occur, the two fluorescent dyes must be close to each other within 40 to 50 mm, and protein Depending on the size and position of the fluorescent dye, FRET may not be observed even if they interact. In the FCCS method, the detection of cross-correlation does not depend on the distance between fluorescent dyes, so there is no such problem. On the other hand, the FCCS method has advantages such as a small amount of sample required, a short detection time, and easy automation for HTS compared with other detection systems such as fluorescence depolarization. Furthermore, since the FCCS method provides very basic information such as the size and number of fluorescently labeled molecules, it may be used for general purposes such as the surface plasmon resonance method. The difference between the two is that the surface plasmon resonance method detects the interaction while the protein is immobilized, whereas the FCCS method allows the interaction in a solution closer to the natural state to be observed. . In the FCCS method, it is necessary to label the protein with a fluorescent dye instead of immobilizing the protein, but the present invention has made it possible to overcome this problem.

また、FCCS法では細胞内の環境に近い溶液状態で蛋白質・蛋白質相互作用や蛋白質・核酸相互作用を調べることができ、かつ解離定数（結合定数）を１回の測定で簡便に算出することができる。   In addition, the FCCS method can examine protein-protein interactions and protein-nucleic acid interactions in a solution state close to the intracellular environment, and can easily calculate the dissociation constant (binding constant) in one measurement. it can.

本方法においてＣ末端修飾蛋白質に標的分子を接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるものであってもよいが、好ましくは市販のＦＣＳ用装置の測定用ウェルに通常生化学的に用いられる緩衝液等に適当な濃度でＣ末端修飾蛋白質溶解した溶液を投入し、さらに同緩衝液に適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入する方法によって行われる。   In this method, the method for bringing the target molecule into contact with the C-terminal modified protein may be any method as long as the two molecules are brought into contact with each other to a sufficient extent, and a commercially available FCS device is preferable. A solution in which a C-terminal modified protein is dissolved at a suitable concentration in a buffer solution or the like generally used in biochemistry, and a solution in which a target molecule is dissolved at a suitable concentration in the buffer. Is done by.

この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記ＦＣＳ用測定装置の各測定用ウェルにそれぞれ異なる複数のＣ末端修飾蛋白質を投入し、これに特定の標的分子溶液を投入するか、又は特定のＣ末端修飾蛋白質を投入し、各ウェルに互いに異なる複数種の標的分子溶液を投入する方法が用いられる。   In this method, as a method for performing a large number of analyzes simultaneously, for example, a plurality of different C-terminal modified proteins are introduced into each measurement well of the FCS measurement apparatus, and a specific target molecule solution is added thereto. Alternatively, a method is used in which a specific C-terminal modified protein is introduced and a plurality of different target molecule solutions are introduced into each well.

（２）蛍光イメージングアナライズ法
蛍光イメージングアナライズ法は、固定化された分子に、修飾分子を接触せしめ、両分子の相互作用により、固定化された分子上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光を、市販の蛍光イメージングアナライザーを用いて測定又は解析する方法である。(2) Fluorescence imaging analysis method In fluorescence imaging analysis method, a modified molecule is brought into contact with an immobilized molecule, and the fluorescence emitted from the modified molecule staying on the immobilized molecule due to the interaction of both molecules, It is a method of measuring or analyzing using a commercially available fluorescence imaging analyzer.

この方法を用いて蛋白質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端修飾蛋白質又は標的分子のいずれか一方は上記した方法により固定化されていることが必要である。標的分子は固定化して用いる場合には修飾されているものと、されていないもののどちらも利用可能である。また、固定化しないで用いる場合には上記した修飾物質により修飾されていることが必要である。Ｃ末端修飾蛋白質は、修飾部を介して固定化されているものも、修飾部以外の部分で固定化されているものも用いることができる。   When measuring or analyzing a protein-target molecule interaction using this method, either the C-terminal modified protein or the target molecule must be immobilized by the method described above. When the target molecule is immobilized and used, either a modified molecule or an unmodified molecule can be used. Moreover, when using it without immobilizing, it needs to be modified with the above-mentioned modifying substances. As the C-terminal modified protein, a protein immobilized through a modification part or a protein immobilized at a part other than the modification part can be used.

Ｃ末端修飾蛋白質、又は標的分子を固定化するための基板（固相）としては、通常、蛋白質や核酸等を固定化するのに用いられるガラス板やニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレン、又はプラスチック製のマイクロプレート等も用いることができる。また、表面が種々の官能基（アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基等）や種々のリガンド（ビオチン、イミノビオチン、ニッケル又はコバルト等の金属イオン、グルタチオン、糖類、ヌクレオチド類、DNA、RNA、抗体、カルモジュリン、受容体蛋白質等）が結合した上記基板等も用いることができる。   As a substrate (solid phase) for immobilizing a C-terminal modified protein or a target molecule, a glass plate, a nitrocellulose membrane, a nylon membrane, or a plastic usually used for immobilizing proteins, nucleic acids, etc. A microplate or the like can also be used. Also, the surface has various functional groups (amino group, carboxyl group, thiol group, hydroxyl group, etc.) and various ligands (metal ions such as biotin, iminobiotin, nickel or cobalt, glutathione, saccharides, nucleotides, DNA, RNA, The above-mentioned substrates to which antibodies, calmodulins, receptor proteins, etc.) are bound can also be used.

本方法において修飾標的分子又はＣ末端修飾蛋白質を固定化分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは修飾標的分子又はＣ末端修飾蛋白質を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これを固相表面に接触させる方法が好ましい。   In this method, the method for bringing the modified target molecule or C-terminal modified protein into contact with the immobilized molecule may be any method as long as it is a method sufficient to allow both molecules to interact, but preferably A method of preparing a solution in which a modified target molecule or a C-terminal modified protein is dissolved in a buffer solution generally used biochemically at an appropriate concentration and bringing it into contact with the solid surface is preferred.

両分子を接触せしめた後、好ましくは過剰に存在する修飾標的分子又はＣ末端修飾蛋白質を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、固相上にとどまった標的分子又はＣ末端修飾蛋白質の修飾物質から発せられる蛍光信号、又は固定化されている修飾分子から発せられる蛍光と固相上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光が混ざり合った信号を、市販のイメージングアナライザーを用いて測定又は解析することにより、固定化された分子と相互作用する分子を同定することができる。   After contacting both molecules, a modified target molecule or C-terminal modified protein that remains on the solid phase is preferably washed with the same buffer or the like in the excess of the modified target molecule or C-terminal modified protein. Measurement or analysis using a commercially available imaging analyzer for a signal that is a mixture of a fluorescence signal emitted from a modified molecule or a fluorescence signal emitted from an immobilized modified molecule and a fluorescence emitted from a modified molecule remaining on the solid phase Thus, a molecule that interacts with the immobilized molecule can be identified.

この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記固相表面に、複数のＣ末端修飾蛋白質又は修飾もしくは非修飾標的分子を番地付けして固定化する方法、又は１種類のＣ末端修飾蛋白質又は修飾もしくは非修飾標的分子に固定化されていない複数種のＣ末端修飾蛋白質又は修飾標的分子を接触させる方法等が用いられる。複数種のＣ末端修飾蛋白質又は修飾標的分子を接触させる場合には、固相にとどまった該分子を緩衝液の濃度の差等により解離させて取得し、これを既知の方法により分析することにより同定できる。   In this method, a large number of analyzes can be performed simultaneously by, for example, a method in which a plurality of C-terminal modified proteins or modified or non-modified target molecules are addressed and immobilized on the solid phase surface, or one type of C-terminal. For example, a method in which a plurality of types of C-terminal modified proteins or modified target molecules not immobilized on a modified protein or a modified or unmodified target molecule is brought into contact is used. When contacting multiple types of C-terminal modified proteins or modified target molecules, the molecules staying in the solid phase are obtained by dissociation due to differences in buffer concentration, etc., and analyzed by a known method. Can be identified.

（３）蛍光共鳴エネルギー移動法
２種類の蛍光色素を用いる他の分子間相互作用検出法として、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）法がよく知られている。FRET とは、２種類の蛍光色素の一方（エネルギー供与体）の蛍光スペクトルと、もう一方（エネルギー受容体）の吸収スペクトルに重なりがあるとき、２つの蛍光色素間の距離が十分小さいと、供与体からの発光が起こらないうちに、その励起エネルギーが受容体を励起してしまう確率が高くなる現象をいう。したがって、相互作用を検出したい２つの蛋白質を、それぞれ供与体および受容体となる蛍光色素で標識しておき、供与体を励起すれば、２つの蛋白質が相互作用しない場合は、蛍光色素間の距離が大きいため FRETは起こらず、供与体の蛍光スペクトルが観察されるが、２つの蛋白質が相互作用して蛍光色素間の距離が小さくなると、FRETにより受容体の蛍光スペクトルが観察されるので、蛍光スペクトルの波長の違いから蛋白質間相互作用の有無を判別することができる。蛍光色素としては、供与体がフルオレセイン、受容体がローダミンという組み合わせがよく用いられている。また最近では、蛍光緑色蛋白質（GFP）の波長の異なる変異体の組み合わせにより、細胞の中で FRETを観察し相互作用を検出する試みがなされている。この方法の欠点としては、FRETが生じるために２つの蛍光色素が 40〜50Å以内に近接する必要があるため、蛋白質の大きさや蛍光色素の付いている位置によっては、相互作用していてもFRETが観測されない危険性があるという点が挙げられる。(3) Fluorescence resonance energy transfer method Fluorescence resonance energy transfer (FRET) method is well known as another intermolecular interaction detection method using two kinds of fluorescent dyes. FRET means that when there is an overlap between the fluorescence spectrum of one of the two fluorescent dyes (energy donor) and the absorption spectrum of the other (energy acceptor), if the distance between the two fluorescent dyes is sufficiently small, A phenomenon in which the probability that the excitation energy excites the acceptor before the light emission from the body occurs. Therefore, if the two proteins whose interaction is to be detected are labeled with a fluorescent dye serving as a donor and an acceptor, respectively, and the donor is excited, the distance between the fluorescent dyes does not interact with the two proteins. FRET does not occur and the donor's fluorescence spectrum is observed, but if the two proteins interact and the distance between the fluorescent dyes becomes smaller, the acceptor's fluorescence spectrum is observed by FRET. The presence or absence of protein-protein interaction can be determined from the difference in spectral wavelength. As a fluorescent dye, a combination in which a donor is fluorescein and an acceptor is rhodamine is often used. Recently, attempts have been made to observe FRET in cells and detect interactions by combining mutants of fluorescent green protein (GFP) with different wavelengths. The disadvantage of this method is that the two fluorescent dyes need to be close to each other within 40 to 50 mm in order for FRET to occur, so depending on the size of the protein and the position where the fluorescent dye is attached, FRET There is a point that there is a risk that will not be observed.

（４）エバネッセント場分子イメージング法
エバネッセント場分子イメージング法とは、Funatsu, T., et al., Nature, 374, 555-559 (1995)等に記載されている方法で、ガラス等の透明体に固定化した分子に溶液として第２の分子を接触せしめ、これにエバネッセント場が発生する角度でレーザー光等の光源を照射し、発生したエバネッセント光を検出器によって測定又は解析する方法である。これらの操作は、それ自体既知のエバネッセント場蛍光顕微鏡装置を用いて行うことができる。(4) Evanescent field molecular imaging method The evanescent field molecular imaging method is a method described in Funatsu, T., et al., Nature, 374, 555-559 (1995), etc. This is a method in which a second molecule is brought into contact with the immobilized molecule as a solution, irradiated with a light source such as a laser beam at an angle at which an evanescent field is generated, and the generated evanescent light is measured or analyzed by a detector. These operations can be performed using an evanescent field fluorescence microscope apparatus known per se.

この方法を用いて蛋白質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端修飾蛋白質又は標的分子のいずれか一方は上記した方法により固定化されていることが必要である。標的分子は固定化する場合は修飾の必要はないが、固定化しないで用いる場合には上記した修飾物質により修飾されていることが必要である。   When measuring or analyzing a protein-target molecule interaction using this method, either the C-terminal modified protein or the target molecule needs to be immobilized by the method described above. The target molecule does not need to be modified when immobilized, but needs to be modified with the above-described modifying substance when used without being immobilized.

Ｃ末端修飾蛋白質、又は標的分子を固定化するための基板としては、ガラス等の材質の基板が用いられ、好ましくは石英ガラスが用いられる。また、レーザー光の散乱等を防ぐために表面を超音波洗浄したものが好ましい。   As the substrate for immobilizing the C-terminal modified protein or the target molecule, a substrate made of a material such as glass is used, and quartz glass is preferably used. In addition, it is preferable to ultrasonically clean the surface in order to prevent scattering of laser light and the like.

本方法において固定化していないＣ末端修飾蛋白質又は修飾標的分子を固定化分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは固定化していないＣ末端修飾蛋白質又は修飾標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これを固相表面に滴下する方法が好ましい。   As a method for bringing the C-terminal modified protein or modified target molecule not immobilized in the present method into contact with the immobilized molecule, any method may be used as long as both molecules are brought into contact with each other. However, it is preferable to prepare a solution in which an unimmobilized C-terminal modified protein or modified target molecule is dissolved in a buffer solution generally used biochemically at an appropriate concentration and drop this onto the solid surface. .

両分子を接触せしめた後、エバネッセント場照明により励起された蛍光をＣＣＤカメラ等の検出器を用いて測定することにより、固定化された分子と相互作用する分子を同定することができる。   After bringing both molecules into contact with each other, a molecule that interacts with the immobilized molecule can be identified by measuring the fluorescence excited by the evanescent field illumination using a detector such as a CCD camera.

この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記基板に、複数のＣ末端修飾蛋白質又は修飾標的分子を番地付けして固定化する方法等が用いられる。   In this method, as a method for performing a large number of analyzes simultaneously, for example, a method in which a plurality of C-terminal modified proteins or modified target molecules are addressed and immobilized on the substrate is used.

（５）蛍光偏光解消法
蛍光偏光法（Perran, J., et al., J. Phys. Rad., 1, 390-401(1926)）は、蛍光偏光で励起された蛍光分子が、励起状態の間、定常状態を保っている場合には同一の偏光平面で蛍光を放射するが、励起された分子が励起状態中に回転ブラウン運動等を行った場合に、放射された蛍光は励起光とは異なった平面になることを利用する方法である。分子の運動はその大きさに影響を受け、蛍光分子が高分子である場合には、励起状態の間の分子の運動はほとんどなく、放射光は偏光を保ったままになっているのに対して、低分子の蛍光分子の場合は、運動速度が速いために放射光の偏光が解消される。そこで、平面偏光で励起された蛍光分子から放射される蛍光の強度を、元の平面とそれに垂直な平面とで測定し、両平面の蛍光強度の割合からこの分子の運動性およびその存在状態に関する情報が得られるものである。この方法によれば、夾雑物があってもこれに影響されることなく、蛍光修飾された分子と相互作用する標的分子の挙動を追跡できる。これは蛍光修飾された分子と標的分子が相互作用するときにのみ、偏光度の変化として測定されるからである。(5) Fluorescence depolarization method Fluorescence polarization method (Perran, J., et al., J. Phys. Rad., 1, 390-401 (1926)) is a method in which fluorescent molecules excited by fluorescence polarization are excited. When the stationary state is maintained, the fluorescent light is emitted in the same polarization plane.However, when the excited molecule performs rotational Brownian motion or the like during the excited state, the emitted fluorescent light is the same as the excitation light. Is a method that uses different planes. The movement of the molecule is affected by its size, and when the fluorescent molecule is a polymer, there is little movement of the molecule during the excited state, whereas the emitted light remains polarized. Thus, in the case of a low-molecular fluorescent molecule, since the movement speed is high, the polarization of the emitted light is canceled. Therefore, the intensity of fluorescence emitted from a fluorescent molecule excited by plane-polarized light is measured on the original plane and a plane perpendicular to it, and the mobility of this molecule and its existence state are determined from the ratio of the fluorescence intensity on both planes. Information can be obtained. According to this method, the behavior of a target molecule that interacts with a fluorescently modified molecule can be traced without being affected by impurities. This is because a change in the degree of polarization is measured only when the fluorescence-modified molecule interacts with the target molecule.

この方法を行うための装置としては例えばBECON（Panyera社製）等が市販されており、本方法もこれらの装置を用いることにより行うことができる。   For example, BECON (manufactured by Panyera) is commercially available as an apparatus for performing this method, and this method can also be performed by using these apparatuses.

この方法を用いて蛋白質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端修飾蛋白質又は標的分子のいずれも溶液として供する必要がある。標的分子は修飾の必要はない。また相互作用を調べようとするＣ末端修飾蛋白質より非常に分子量の小さい分子は、Ｃ末端修飾蛋白質のブラウン運動に影響を及ぼさないため本方法においてはふさわしくない。   When measuring or analyzing the protein-target molecule interaction using this method, it is necessary to provide either the C-terminal modified protein or the target molecule as a solution. The target molecule need not be modified. In addition, a molecule having a molecular weight much smaller than that of the C-terminal modified protein to be examined for interaction does not affect the Brownian motion of the C-terminal modified protein, and thus is not suitable for this method.

本方法においてＣ末端修飾蛋白質に標的分子を接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるものであってもよいが、好ましくは市販の蛍光偏光解消装置の測定用ウェルに通常生化学的に用いられる緩衝液等に適当な濃度でＣ末端修飾蛋白質溶解した溶液を投入し、さらに同緩衝液に適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入する方法によって行われる。   In this method, the method for bringing the target molecule into contact with the C-terminal modified protein may be any method as long as the two molecules are brought into contact with each other to a sufficient extent to interact with each other. A solution in which the C-terminal modified protein is dissolved at an appropriate concentration is put into a buffer solution or the like usually used in biochemistry, and a solution in which a target molecule is dissolved at an appropriate concentration is put into the buffer well. Done by the method.

本方法において測定するＣ末端修飾蛋白質および標的分子との間の相互作用は、必ずしも抗原抗体反応ほど特異性は高くないことが考えられるため、最適の組み合わせを検出するためには、相互作用の程度を数値化することが有効である。相互作用の程度を示す指標としては、例えば一定濃度のＣ末端修飾蛋白質に対して、極大蛍光偏光度を与える最小標的物濃度の値等を用いることができる。   Since the interaction between the C-terminal modified protein and the target molecule measured in this method is not necessarily as specific as the antigen-antibody reaction, in order to detect the optimum combination, the degree of interaction It is effective to quantify. As an index indicating the degree of interaction, for example, the value of the minimum target concentration that gives the maximum fluorescence polarization degree with respect to a constant concentration of C-terminal modified protein can be used.

この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記蛍光偏光解消法測定装置の各測定用ウェルにそれぞれ異なる複数のＣ末端修飾蛋白質を投入し、これに特定の標的分子溶液を投入するか、又は特定のＣ末端修飾蛋白質を投入し、各ウェルに互いに異なる複数種の標的分子溶液を投入する方法が用いられる。   In this method, as a method for performing a large number of analyzes simultaneously, for example, a plurality of different C-terminal modified proteins are introduced into each measurement well of the fluorescence depolarization measurement apparatus, and a specific target molecule solution is introduced into this. Alternatively, a method is used in which a specific C-terminal modified protein is introduced and a plurality of different target molecule solutions are introduced into each well.

（６）表面プラズモン共鳴法
表面プラズモン共鳴法とは、金属／液体界面で相互作用する分子によって表面プラズモンが励起され、これを反射光の強度変化で測定する方法である（Cullen, D.C., et al., Biosensors, 3(4), 211-225(1987-88)）。この方法を用いて蛋白質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端修飾蛋白質は上記した方法により固定化されていることが必要であるが、標的分子の修飾は必要ない。(6) Surface plasmon resonance method The surface plasmon resonance method is a method in which surface plasmon is excited by molecules interacting at the metal / liquid interface and this is measured by a change in the intensity of reflected light (Cullen, DC, et al Biosensors, 3 (4), 211-225 (1987-88)). When measuring or analyzing a protein-target molecule interaction using this method, the C-terminal modified protein needs to be immobilized by the method described above, but the target molecule does not need to be modified.

Ｃ末端修飾蛋白質を固定化するための基板としては、ガラスの等の透明基板上に金、銀、白金等の金属薄膜が構成されたものが用いられる。透明基板としては、通常表面プラズモン共鳴装置用に用いられるものであればいかなるものであってもよく、レーザー光に対して透明な材料からなるものとして一般的にはガラス等からなるものであり、その厚さは０．１〜５ｍｍ程度のものが用いられる。また金属薄膜の膜厚は１００〜２０００Å程度が適当である。このような表面プラズモン共鳴装置用固基板として市販されているものも用いることができる。Ｃ末端修飾蛋白質の上記基板への固定化は前述した方法により行うことができる。   As the substrate for immobilizing the C-terminal modified protein, a substrate in which a metal thin film such as gold, silver or platinum is formed on a transparent substrate such as glass is used. As the transparent substrate, any material can be used as long as it is usually used for a surface plasmon resonance device, and it is generally made of glass or the like as a material transparent to laser light. A thickness of about 0.1 to 5 mm is used. The thickness of the metal thin film is suitably about 100 to 2000 mm. A commercially available solid substrate for such a surface plasmon resonance apparatus can also be used. The C-terminal modified protein can be immobilized on the substrate by the method described above.

本方法において標的分子をＣ末端修飾蛋白質へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液に固定化されたＣ末端蛋白質を接触させる方法を用いることができる。   In this method, the target molecule can be brought into contact with the C-terminal modified protein as long as it is a method sufficient to allow both molecules to interact with each other. In particular, a method of contacting the immobilized C-terminal protein with a solution dissolved at a suitable concentration in a buffer solution usually used can be used.

これらの行程は市販の表面プラズモン共鳴装置、例えばBIAcore2000 (Pharmacia Biosensor社製)によってもよい。両分子を接触せしめた後、それ自体既知の表面プラズモン共鳴装置を用いて、それぞれの反射光の相対強度の時間的変化を測定することにより、固定化されたＣ末端修飾蛋白質と標的分子の相互作用が解析できる。   These processes may be performed by a commercially available surface plasmon resonance apparatus such as BIAcore 2000 (Pharmacia Biosensor). After bringing both molecules into contact with each other, by measuring a temporal change in the relative intensity of each reflected light using a surface plasmon resonance apparatus known per se, the mutual relationship between the immobilized C-terminal modified protein and the target molecule is measured. The effect can be analyzed.

この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記表面プラズモン共鳴装置に用いられる基板に、複数のＣ末端修飾蛋白質を番地付けして固定化するか、又は１種類の固定化されたＣ末端修飾蛋白質に複数種の標的分子を接触させる方法等が用いられる。   In this method, as a method for performing a large number of analyzes simultaneously, for example, a plurality of C-terminal modified proteins are addressed and immobilized on a substrate used in the surface plasmon resonance apparatus, or one kind of immobilized protein is immobilized. A method of bringing a plurality of types of target molecules into contact with the C-terminal modified protein is used.

（７）固相酵素免疫検定法
固相酵素免疫検定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA): Crowther, J.R., Methods in Molecular Biology, 42 (1995)）は、固相上に固定化した抗原に対し、抗体を含む溶液を接触せしめ、両分子の相互作用（抗原抗体反応）により、固定化された抗原上にとどまった抗体をこれと特異的に結合する修飾分子（ＩｇＧ等）から発せられる蛍光、又は修飾分子を基質とする色素から発せられる信号を、市販の検出器（ＥＬＩＳＡリーダー）を用いて測定又は解析する方法である。(7) Solid-phase enzyme immunoassay (Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA): Crowther, JR, Methods in Molecular Biology, 42 (1995)) Fluorescence emitted from a modified molecule (such as IgG) that specifically binds to an antibody that has remained on the immobilized antigen by contacting the solution containing the antibody and interacting with both molecules (antigen-antibody reaction), Alternatively, it is a method of measuring or analyzing a signal emitted from a dye having a modifying molecule as a substrate using a commercially available detector (ELISA reader).

この方法を用いて蛋白質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、抗原となるＣ末端修飾蛋白質は上記した方法により固定化されていることが必要である。また抗体となる標的分子は上記した修飾物質により修飾されていることが必要である。   When measuring or analyzing a protein-target molecule interaction using this method, it is necessary that the C-terminal modified protein as an antigen is immobilized by the above-described method. Further, the target molecule to be an antibody needs to be modified with the above-described modifying substance.

抗原となるＣ末端修飾蛋白質を固定化するための基板としては、通常ＥＬＩＳＡに用いられるプラスチック製のマイクロプレート等も用いることができる。   As a substrate for immobilizing the C-terminal modified protein serving as an antigen, a plastic microplate or the like usually used for ELISA can also be used.

本方法において抗体となる修飾標的分子を固相分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは修飾標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これをマイクロプレートに注入する方法が好ましい。   In this method, the modified target molecule to be an antibody can be brought into contact with the solid phase molecule as long as it is a method that allows both molecules to interact with each other to a sufficient extent. A method in which a solution in which molecules are dissolved in a buffer solution usually used biochemically at an appropriate concentration is prepared and injected into a microplate is preferable.

両分子を接触せしめた後、好ましくは過剰に存在する固定化分子に結合していない修飾分子を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、固相上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光を、市販のＥＬＩＳＡリーダー等を用いて測定又は解析することにより、固定化された抗原分子と相互作用する分子を同定することができる。   After bringing both molecules into contact with each other, preferably a step of washing the modified molecules not bound to the excess immobilized molecules with the same buffer or the like is performed, and the fluorescence emitted from the modified molecules remaining on the solid phase is obtained. By measuring or analyzing using a commercially available ELISA reader or the like, a molecule that interacts with the immobilized antigen molecule can be identified.

この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記マイクロプレートの各穴にそれぞれ異なる複数の修飾標的分子を固定化する方法が用いられる。   In this method, as a method for performing a large number of analyzes simultaneously, for example, a method of immobilizing a plurality of different modified target molecules in each hole of the microplate is used.

上記のそれぞれの方法により測定されＣ末端修飾蛋白質との間に相互作用が認められた標的分子は、該分子の一次構造が未知の場合、それ自体既知の適当な方法により、その一次構造を解析することができる。具体的には、相互作用を認められた標的分子が蛋白質の場合、アミノ酸分析装置等によりアミノ酸配列を解析し、一次構造を特定することができる。また、標的分子が核酸の場合には、塩基配列決定方法により、オートＤＮＡシーケンサーなどを用いれば塩基配列を決定することができる。   If the primary structure of the target molecule measured by each of the above methods and recognized as interacting with the C-terminal modified protein is unknown, the primary structure is analyzed by an appropriate method known per se. can do. Specifically, when the target molecule in which the interaction is recognized is a protein, the primary structure can be identified by analyzing the amino acid sequence with an amino acid analyzer or the like. When the target molecule is a nucleic acid, the base sequence can be determined by an auto DNA sequencer or the like according to the base sequence determination method.

さらに、本発明のマップは、構造解析と機能解析のリンクによる創薬への応用が期待できる。図３に示したように、機能エレメントが抽出された蛋白質について構造解析を行えば、構造解析と機能解析のリンクが可能となる。これまでの相互作用マップでは、相互作用している部位の配列までは知りようがなかったが、機能エレメント抽出によるマップでは、相互作用している特定の配列とその部分の構造を比較することが可能となり、阻害剤などの創薬のためのミューテーション実験などが可能となる。   Furthermore, the map of the present invention can be expected to be applied to drug discovery by linking structural analysis and functional analysis. As shown in FIG. 3, if a structural analysis is performed on a protein from which a functional element is extracted, the structural analysis and the functional analysis can be linked. In previous interaction maps, it was impossible to know the sequence of the interacting site, but in the map based on functional element extraction, it is possible to compare the specific sequence interacting with the structure of that part. This will enable mutation experiments for drug discovery such as inhibitors.

＜２＞本発明の作成方法を実現するためのソフトウエアと装置
本発明の作成方法は、遺伝子および／又は蛋白質の機能エレメントに基づく相互関係のデータを記憶する記憶手段、ならびに、記憶手段から読み出された相互関係のデータに基づき遺伝子および／又は蛋白質の間の相互関係を示すマップを描画する手段を備える装置により実施することができる。<2> Software and Apparatus for Realizing the Creation Method of the Present Invention The creation method of the present invention comprises a storage means for storing interrelated data based on functional elements of genes and / or proteins, and a read from the storage means. It can be implemented by an apparatus provided with a means for drawing a map showing the correlation between genes and / or proteins based on the correlation data that has been issued.

本発明の装置の構成の例を図２０に示す。記憶手段１は、機能エレメントに基づく相互関係のデータ２を記憶する。描画手段３は記憶手段１から相互関係のデータを読み出して、ネットワーク・マップを描画する。   An example of the configuration of the apparatus of the present invention is shown in FIG. The storage means 1 stores interrelated data 2 based on functional elements. The drawing unit 3 reads the interrelated data from the storage unit 1 and draws a network map.

本発明の装置は、上記のような手段としてコンピューターを機能させるためのプログラムを実装したコンピューターにより構成することができる。   The apparatus of the present invention can be configured by a computer on which a program for causing a computer to function as the above-described means is installed.

本発明の装置は、さらに、相互関係のデータを入力又は修正するための入力手段や、描画されたマップを装置から出力する出力手段を備えていてもよい。
描画手段は、描画の様式を選択できる機能を有することが好ましい。例えば、ユーザーの選択により、選択した遺伝子および／又は蛋白質の機能エレメントに関連する相互関係あるいは選択した相互関係の種類のみを示す機能を有することが好ましい。これにより、また、多数の遺伝子および／又は蛋白質のマップでは、それらの相互関係を全て表示すると判別不能になってしまうことを防ぐことができる。The apparatus of the present invention may further include input means for inputting or correcting interrelated data and output means for outputting a drawn map from the apparatus.
The drawing means preferably has a function capable of selecting a drawing style. For example, it is preferable to have a function indicating only the type of the correlation or the correlation related to the functional element of the selected gene and / or protein, depending on the selection of the user. Thereby, in the map of many genes and / or proteins, it can prevent becoming indistinguishable if all the mutual relations are displayed.

本発明の装置は、必要により、機能エレメントの決定手段をさらに有していてもよい。このような装置およびそのためのソフトウエアの例としては、たとえば、図９のフローを実現するようなソフトウエアと装置などが考えられる。   The apparatus of the present invention may further include a function element determination unit as necessary. As an example of such a device and software for that purpose, for example, software and a device that realize the flow of FIG. 9 can be considered.

本発明のプログラムを記録したコンピューター読み取り可能な記録媒体も提供される。記録媒体としては、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭなどが挙げられる。   A computer-readable recording medium recording the program of the present invention is also provided. Examples of the recording medium include a flexible disk, a CD-ROM, and a DVD-ROM.

以下、本発明の相互作用のある遺伝子や蛋白質の機能エレメント抽出による機能エレメント間の結合によるネットワーク・マップとその作図方法、および機能エレメントが抽出された蛋白質とその抽出方法について具体的に記するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。   Hereinafter, the network map and its drawing method based on the coupling between the functional elements by extracting the functional elements of the interacting gene or protein of the present invention, and the method for extracting the protein and the method for extracting the protein from which the functional element has been extracted will be specifically described. The following examples should be regarded as an aid for obtaining specific recognition of the present invention, and the scope of the present invention is not limited by the following examples.

ベイトをc-Fos蛋白質として、プレイをマウス脳のcDNAライブラリーとして、IVVの共翻訳セレクション/スクリーニングを行い(図７)、その結果、c-Fos蛋白質と複合体を形成しうるc-Jun蛋白質をコードする遺伝子の核酸配列(配列番号１〜１５)およびアミノ酸配列(配列番号１６〜３１)を得た。また、それらの配列をアライメントすることで、c-Junの機能エレメントとして、核酸配列(配列番号３１〜３３)およびアミノ酸配列(配列番号３４〜３６)を得た。   IVV co-translation selection / screening using bait as a c-Fos protein and prey as a cDNA library of mouse brain (Fig. 7). As a result, c-Jun protein that can form a complex with c-Fos protein The nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 1 to 15) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 16 to 31) of the gene coding for were obtained. Further, by aligning these sequences, nucleic acid sequences (SEQ ID NOs: 31 to 33) and amino acid sequences (SEQ ID NOs: 34 to 36) were obtained as functional elements of c-Jun.

ベイトc-Fos蛋白質の作成方法は以下の通りであった。pCMV-FosCBPzzベクター(配列番号３７)から、TaKaRa Ex Taq(宝酒造)を用いて、PCR(プライマー5'SP6(O29)T7-FosCBPzz(配列番号３８)と3'FosCBPzz(配列番号３９)、PCRプログラムCYCB1(表１参照))によってDNAテンプレートを準備した。DNAテンプレートをRiboMAX^TM Large Scale RNA Production Systems(Promega)を用いて転写(37℃, 2h)し、ベイトc-Fos蛋白質のmRNAテンプレートを準備した。共存させるベイトDNAは、Fos/Junの結合配列を含むDNA-Fos/Jun(配列番号４０)をテンプレートとし、PCR(プライマー5'DNA(配列番号４１)と3'DNA(配列番号４２)、PCRプログラムV-2(表１参照))によって準備した。The method for preparing the bait c-Fos protein was as follows. From the pCMV-FosCBPzz vector (SEQ ID NO: 37), using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), PCR (primer 5'SP6 (O29) T7-FosCBPzz (SEQ ID NO: 38) and 3'FosCBPzz (SEQ ID NO: 39), PCR program A DNA template was prepared by CYCB1 (see Table 1). The DNA template was transcribed (37 ° C., 2 h) using RiboMAX ^™ Large Scale RNA Production Systems (Promega) to prepare a bait c-Fos protein mRNA template. The bait DNA to be coexisted was DNA-Fos / Jun (SEQ ID NO: 40) containing the binding sequence of Fos / Jun as a template, PCR (primer 5 ′ DNA (SEQ ID NO: 41) and 3 ′ DNA (SEQ ID NO: 42), PCR Prepared by Program V-2 (see Table 1).

プレイのマウス脳cDNAライブラリーの作成方法は以下の通りであった。図１０に従ってIVVランダムライブラリーを作成した。RNAライブラリーとして、市販のマウス脳 (polyA+) RNAライブラリー(組織抽出RNAライブラリーをoligo dTカラムで精製したもの；clontech)を購入した。アダプター設計は、対応付け分子の形成に適した5'UTR配列(プロモーターSP6+エンハンサーO29又はO')をライブラリーに、IVV形成に必要な配列として付加するための設計を行った。マウス脳(polyA+) RNAライブラリーには、エンハンサーO29をもつアダプターを使用した。エンハンサーO29用のアダプターの主鎖(配列番号４３又は４４)と副鎖(gaattcgc又はggaattcg)は、各々TEバッファー(10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA)に溶解して100μMとし、主鎖と副鎖をそれぞれ10μlずつ等モルで混合する。90℃で２分間加熱し、70℃で５分加熱し、60℃のウオーターバスにセットしてバスのヒーターを切ってゆっくりと60℃から室温まで下げた。5μlずつに分注して-20℃に保存した。次に、マウス脳(polyA+) RNAライブラリーを一本鎖DNAに逆転写した(図１０, I)。マウス脳(polyA+) RNAライブラリー(1.4 pmole/0.5μg)を0.5μg、3'ランダムプライマー(配列番号４５)を2 pmolとDEPC水とを加えて12.0μlとし、70℃で10 min加熱し、氷上で１分間冷却した。これを用いて、SuperScriptII RT (SuperScript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen)で45℃で1h逆転写反応を行った。次に、逆転写反応で合成した一本鎖DNAを全量用いて、E.coli DNAリガーゼ、E.coli ポリメラーゼI、およびE.coli RNase H (SuperScript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen)で16℃で 2h反応し、さらにT4 DNAポリメラーゼで16℃で5minで末端を平滑化し、二本鎖DNAを合成した(図１０, II)。次に、この二本鎖DNAの5'末端がリン酸化されていることを利用して、先に準備したアダプターを用いてライゲーションした(図１０, III)。合成した二本鎖DNAライブラリーをエタノール沈殿し、4μlのDEPC水に溶解した。これに、100μMの準備したアダプターを1.0μl添加し、50μl ligation high(TOYOBO)を加えて、16℃でオーバーナイトで反応させ、精製(DNA purification kit ; QIAGEN)した後50μlとした。次に、PCR(EX Taq Hot Start Version) TaKaRa)を行った(図１０, IV)。50μlのライゲーションした二本鎖DNAライブラリーから2μlをテンプレートとして、IVVに必要な特定配列(029)を持つ5'PCRプライマー(配列番号４１)と3'PCRプライマー(配列番号４２)を用いて、IVV cDNAライブラリーを作成した。PCRの条件は、全量100μl、22サイクル(94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で90秒を１サイクルとし、最後の伸長反応は、72℃で180秒)とした。   The method for constructing a mouse brain cDNA library for play was as follows. An IVV random library was created according to FIG. As an RNA library, a commercially available mouse brain (polyA +) RNA library (a tissue extracted RNA library purified with an oligo dT column; clontech) was purchased. The adapter was designed to add a 5 ′ UTR sequence (promoter SP6 + enhancer O29 or O ′) suitable for the formation of the mapping molecule to the library as a sequence necessary for IVV formation. For the mouse brain (polyA +) RNA library, an adapter with enhancer O29 was used. The adapter main chain (SEQ ID NO: 43 or 44) and sub-chain (gaattcgc or ggaattcg) for the enhancer O29 were dissolved in TE buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA) to 100 μM. Mix 10 μl of each strand and side chain in equimolar amounts. Heated at 90 ° C for 2 minutes, heated at 70 ° C for 5 minutes, set in a 60 ° C water bath, turned off the bath heater, and slowly lowered from 60 ° C to room temperature. 5 μl aliquots were stored at −20 ° C. Next, the mouse brain (polyA +) RNA library was reverse transcribed into single-stranded DNA (FIG. 10, I). Mouse brain (polyA +) RNA library (1.4 pmole / 0.5 μg) 0.5 μg, 3 ′ random primer (SEQ ID NO: 45) 2 pmol and DEPC water to 12.0 μl, heated at 70 ° C. for 10 min, Cool on ice for 1 minute. Using this, a reverse transcription reaction was performed for 1 h at 45 ° C. using SuperScript II RT (SuperScript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen). Next, using the entire amount of single-stranded DNA synthesized by reverse transcription, E. coli DNA ligase, E. coli polymerase I, and E. coli RNase H (SuperScript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen) at 16 ° C. The reaction was continued for 2 h, and the ends were blunted with T4 DNA polymerase at 16 ° C. for 5 min to synthesize double-stranded DNA (FIG. 10, II). Next, using the fact that the 5 ′ end of this double-stranded DNA was phosphorylated, ligation was performed using the adapter prepared in advance (FIG. 10, III). The synthesized double-stranded DNA library was ethanol precipitated and dissolved in 4 μl of DEPC water. To this, 1.0 μl of 100 μM prepared adapter was added, 50 μl ligation high (TOYOBO) was added, reacted at 16 ° C. overnight, and purified (DNA purification kit; QIAGEN) to 50 μl. Next, PCR (EX Taq Hot Start Version) TaKaRa) was performed (FIG. 10, IV). Using 2 μl from a 50 μl ligated double-stranded DNA library as a template, using a 5 ′ PCR primer (SEQ ID NO: 41) and a 3 ′ PCR primer (SEQ ID NO: 42) having a specific sequence (029) required for IVV, An IVV cDNA library was created. The PCR conditions were 100 μl in total, 22 cycles (94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 90 seconds, and the final extension reaction was 72 ° C. for 180 seconds).

これらベイトc-Fos蛋白質のmRNAテンプレート、プレイのマウス脳cDNAライブラリー、そして共存させるベイトDNAを小麦の無細胞翻訳系(Wheat Germ Extract(Promega))を用いて50μlで共翻訳(26℃, 60 min)させた。50μlのサンプルに対し、IgG結合バッファー（10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% NP40）50μlを添加し計100μl(共翻訳サンプル) とした。その後、IgGアガロース(Sigma)をIgG結合バッファーで２回洗浄し、これに共翻訳サンプル(100μl)を加え、４℃で２時間回転攪拌した。結合バッファーで３回、TEV切断バッファー（10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% NP40, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT）で1回洗浄し、IgGアガロースに結合したベイト/プレイ複合体をTEVプロテアーゼ(GIBCO-BRL)で切断した(１６℃、２時間)。さらに、上清90μlを300μl カルモジュリン結合バッファーと0.3μl 1 M CaCl２、さらに、500μlカルモジュリン結合バッファーで２回洗浄した50μl カルモジュリンビーズを加えて４℃で１時間回転攪拌した。遠心後、1000μl カルモジュリン結合バッファーで３回洗浄した。50μlカルモジュリン溶出バッファーを加えて、氷上で１〜２分放置し、遠心後、50μlを回収した。回収した溶液をテンプレートとして、RT-PCR(One step RT-PCR kit (QIAGEN)、プライマー；配列番号４６と４７、プログラム；RT-QH30'(表１参照))を行った。このスクリーニング/セレクション操作を３ラウンド繰り返した後のライブラリーをクローニングしてシーケンスすることで、c-Fos蛋白質と複合体を形成しうるc-Jun蛋白質をコードする遺伝子の核酸配列(配列番号１〜１５)およびアミノ酸配列(配列番号１６〜３１)を得た。この結果は、エンハンサーO29用のアダプターの主鎖として配列番号４３を用いて作成したライブラリーおよび配列番号４４を用いて作成したライブラリーのいずれでも同様であった。また、それらの配列を、ClustalXを用いてアライメントしクラスタリングすることで、c-Junの機能エレメントとして、核酸配列(配列番号３１〜３３)およびアミノ酸配列(配列番号３４〜３６)を得た(図１６)。   These bait c-Fos protein mRNA template, prey mouse brain cDNA library, and coexisting bait DNA were co-translated (26 ° C, 60 ° C) using wheat cell-free translation system (Wheat Germ Extract (Promega)). min). 50 μl of IgG binding buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% NP40) was added to 50 μl of sample to make a total of 100 μl (cotranslation sample). Thereafter, IgG agarose (Sigma) was washed twice with IgG binding buffer, and a cotranslation sample (100 μl) was added thereto, followed by rotating and stirring at 4 ° C. for 2 hours. A bait / prey complex that was washed three times with binding buffer and once with TEV cleavage buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% NP40, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT) and bound to IgG agarose The body was cleaved with TEV protease (GIBCO-BRL) (16 ° C., 2 hours). Further, 90 μl of the supernatant was added with 300 μl calmodulin binding buffer and 0.3 μl 1 M CaCl2, and further 50 μl calmodulin beads washed twice with 500 μl calmodulin binding buffer, and the mixture was rotated and stirred at 4 ° C. for 1 hour. After centrifugation, the plate was washed 3 times with 1000 μl calmodulin binding buffer. 50 μl calmodulin elution buffer was added and left on ice for 1-2 minutes. After centrifugation, 50 μl was recovered. RT-PCR (One step RT-PCR kit (QIAGEN), primers; SEQ ID NOs: 46 and 47, program; RT-QH30 ′ (see Table 1)) was performed using the collected solution as a template. By cloning and sequencing the library after repeating this screening / selection operation for 3 rounds, the nucleic acid sequence of the gene encoding the c-Jun protein that can form a complex with the c-Fos protein (SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 1) 15) and the amino acid sequence (SEQ ID NO: 16-31) were obtained. This result was the same for both the library prepared using SEQ ID NO: 43 as the main chain of the adapter for enhancer O29 and the library prepared using SEQ ID NO: 44. Moreover, the nucleic acid sequence (sequence number 31-33) and the amino acid sequence (sequence number 34-36) were obtained as a functional element of c-Jun by aligning and clustering those sequences using ClustalX (Fig. 16).

図１６のように、ライブラリーから得られたc-Jun遺伝子の核酸配列をアライメントしクラスタリングすると、Jun(E1+E2+E3)、Jun(E2)、Jun(E2+E3)に分けることが出来る。このことから、c-Junから３つの機能エレメント(E1-E3)を抽出し、核酸配列番号３１〜３３およびアミノ酸配列番号３４〜３６を得た。図１７に機能エレメント(E1-E3)の核酸配列とアミノ酸配列を記した。   As shown in FIG. 16, when c-Jun gene nucleic acid sequences obtained from the library are aligned and clustered, they can be divided into Jun (E1 + E2 + E3), Jun (E2), and Jun (E2 + E3). . From this, three functional elements (E1-E3) were extracted from c-Jun, and nucleic acid sequence numbers 31 to 33 and amino acid sequence numbers 34 to 36 were obtained. FIG. 17 shows the nucleic acid sequence and amino acid sequence of the functional element (E1-E3).

３つの機能エレメントを抽出されたc-Jun(図１８)は、c-Junの構造解析(Yurii Chinenov1 and Tom K Kerppola, Oncogene (2001) 20, 2438-2452)と付き合わせることで、E1はDNA結合領域の一部に当たり、E2はロイシンジッパー・モチーフとDNA結合領域の一部に当たり、E3はその先のC末端領域に当たることがわかる。このような情報が得られたことで、蛋白質結合領域やDNA結合領域を制御するためのミューテーション実験などを行うことが出来る。
さらに、これら抽出した３つの機能エレメントを用いてc-Jun遺伝子を中心にマッピングすることによって、これまで区別できなかったネットワークが３つに区別可能となり、３通りのネットワーク・パターン、すなわちc-Jun機能のパターンは少なくとも３つあることが読みとれる (図１９)。C-Jun (Fig. 18) from which three functional elements were extracted was combined with structural analysis of c-Jun (Yurii Chinenov1 and Tom K Kerppola, Oncogene (2001) 20, 2438-2452). It can be seen that E2 corresponds to a part of the binding region, E2 corresponds to the leucine zipper motif and part of the DNA binding region, and E3 corresponds to the C-terminal region beyond that. By obtaining such information, mutation experiments for controlling protein binding regions and DNA binding regions can be performed.
Furthermore, by mapping the c-Jun gene using these three extracted functional elements, the network that could not be distinguished until now can be distinguished into three network patterns, namely c-Jun. It can be seen that there are at least three functional patterns (Figure 19).

産業上の利用の可能性Industrial applicability

本発明は、遺伝子や蛋白質の機能エレメントを抽出し、それら機能エレメントを抽出した遺伝子や蛋白質のデータベースを用いた機能エレメント間の結合によるネットワーク・マップを提供する。そのことによって、遺伝子間や蛋白質間のネットワークの詳細な解析や複合体の予想が可能となり、構造解析と合わせて解析することにより、創薬支援システムへ応用可能なマップを提供することが可能になる。   The present invention provides a network map by extracting functional elements of genes and proteins, and connecting the functional elements using a database of genes and proteins from which the functional elements have been extracted. As a result, detailed analysis of networks between genes and proteins and prediction of complexes are possible, and by combining with structural analysis, it is possible to provide maps applicable to drug discovery support systems. Become.

Claims (17)

遺伝子および／又は蛋白質の相互関係のデータに基づき遺伝子および／又は蛋白質の相互関係を示すマップの作成方法であって、相互関係が遺伝子および／又は蛋白質の機能エレメントに基づく相互関係であることを特徴とする方法。 A method for creating a map showing a correlation between genes and / or proteins based on data on the correlation between genes and / or proteins, wherein the correlation is a correlation based on functional elements of genes and / or proteins And how to. 機能エレメントが、遺伝子および／又は蛋白質の相互作用解析によりランダムライブラリーから抽出された配列に基づき決定されたものである請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the functional element is determined based on a sequence extracted from a random library by gene and / or protein interaction analysis. ランダムライブラリーが核酸配列のランダムライブラリーである請求項２記載の方法。 The method of claim 2, wherein the random library is a random library of nucleic acid sequences. ランダムライブラリーが対応付け分子のランダムライブラリーである請求項２記載の方法。 The method according to claim 2, wherein the random library is a random library of mapping molecules. 相互作用解析が、in vitroウイルスを用いる相互作用解析である請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 2 to 4, wherein the interaction analysis is an interaction analysis using an in vitro virus. 遺伝子および／又は蛋白質の間の相互関係のデータを記憶する記憶手段、ならびに、記憶手段から読み出された相互関係のデータに基づき遺伝子および／又は蛋白質の間の相互関係を示すマップを描画する手段としてコンピューターを機能させるためのプログラムであって、遺伝子および／又は蛋白質の相互関係が、遺伝子および／又は蛋白質の機能エレメントに基づく相互関係であることを特徴とするプログラム。 Storage means for storing data of correlation between genes and / or proteins, and means for drawing a map showing the correlation between genes and / or proteins based on the correlation data read from the storage means A program for causing a computer to function as a program, wherein the correlation between genes and / or proteins is a correlation based on functional elements of genes and / or proteins. 機能エレメントが、遺伝子および／又は蛋白質の相互作用解析によりランダムライブラリーから抽出された配列に基づき決定されたものである請求項６に記載のプログラム。 The program according to claim 6, wherein the functional element is determined based on a sequence extracted from a random library by gene and / or protein interaction analysis. ランダムライブラリーが核酸配列のランダムライブラリーである請求項７記載のプログラム。 The program according to claim 7, wherein the random library is a random library of nucleic acid sequences. ランダムライブラリーが対応付け分子のランダムライブラリーである請求項７記載のプログラム。 The program according to claim 7, wherein the random library is a random library of mapping molecules. 相互作用解析が、in vitroウイルスを用いる相互作用解析である請求項７〜９のいずれか１項に記載のプログラム。 The program according to any one of claims 7 to 9, wherein the interaction analysis is an interaction analysis using an in vitro virus. 請求項６〜１０のいずれか１項に記載されたプログラムを記録したコンピューター読み取り可能な記録媒体。 The computer-readable recording medium which recorded the program as described in any one of Claims 6-10. 遺伝子および／又は蛋白質の間の相互関係のデータを記憶する記憶手段、ならびに、記憶手段から読み出された相互関係のデータに基づき遺伝子および／又は蛋白質の間の相互関係を示すマップを描画する手段を備える、遺伝子および／又は蛋白質の相互関係を示すマップの作成装置であって、遺伝子および／又は蛋白質の相互関係が、遺伝子および／又は蛋白質の機能エレメントに基づく相互関係であることを特徴とする装置。 Storage means for storing data of correlation between genes and / or proteins, and means for drawing a map showing the correlation between genes and / or proteins based on the correlation data read from the storage means An apparatus for creating a map showing a correlation between genes and / or proteins, wherein the correlation between genes and / or proteins is a correlation based on functional elements of genes and / or proteins apparatus. 機能エレメントが、遺伝子および／又は蛋白質の相互作用解析によりランダムライブラリーから抽出された配列に基づき決定されたものである請求項１２に記載の装置。 The apparatus according to claim 12, wherein the functional element is determined based on a sequence extracted from a random library by gene and / or protein interaction analysis. ランダムライブラリーが核酸配列のランダムライブラリーである請求項１２記載の装置。 The apparatus of claim 12, wherein the random library is a random library of nucleic acid sequences. ランダムライブラリーが対応付け分子のランダムライブラリーである請求項１２記載の装置。 The apparatus of claim 12, wherein the random library is a random library of mapping molecules. 相互作用解析が、in vitroウイルスを用いる相互作用解析である請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の装置。 The apparatus according to any one of claims 13 to 15, wherein the interaction analysis is an interaction analysis using an in vitro virus. in vitroウイルスを用いる相互作用解析により、相互作用する遺伝子又は蛋白質のライブラリーを得、そのライブラリーの遺伝子又は蛋白質の核酸配列又はアミノ酸配列から抽出された配列に基づき機能エレメントを決定することを含む、機能エレメントの決定方法。


including obtaining a library of interacting genes or proteins by in vitro virus interaction analysis and determining functional elements based on sequences extracted from the nucleic acid or amino acid sequences of the genes or proteins in the library , How to determine functional elements.

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