【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質−分子間相互作用、および、タンパク質立体構造挙動を解析する方法等に関し、更に詳しくは、タンパク質合成時に蛍光共鳴エネルギー移動を起こす組み合わせの一方の蛍光物質をＣ末端部位特異的に導入し、該Ｃ末端標識タンパク質を用いて、他方の蛍光物質で標識された分子との相互作用に基づく蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値の測定によりタンパク質−分子間相互作用、あるいは、タンパク質立体構造挙動等を簡便かつ迅速に解析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ゲノム・プロジェクト、あるいは、完全長ｃＤＮＡプロジェクトが活発に実施されたことにより、ヒト、マウス、あるいは他の生物より、これまでにない多量の未知遺伝子が単離され、さらに、その塩基配列が明らかにされた。これにより、多数の遺伝子が容易に利用可能になり、該遺伝子がコードするタンパク質の機能が速やかに解析されることが期待されている。
【０００３】
一方、大腸菌抽出液、コムギ胚芽抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液等を用いる無細胞タンパク質合成技術の進歩により、比較的簡便かつ迅速にタンパク質を調製することが可能になった。これにより、タンパク質の機能解析あるいは構造解析が飛躍的に促進されることが期待されている。
無細胞タンパク質合成等により調製されたタンパク質の相互作用解析法としては、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光イメージアナライズ法、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光偏光解消法、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）等があげられる。
【０００４】
しかしながら、これらの方法は、検出感度が低い、操作の手間がかかる等の問題があり、無細胞タンパク質合成等により調製されたタンパク質をハイ・スループットに解析することは困難であった。
例えば、ＥＬＩＳＡにおいては、相互作用する分子に対する特異的な抗体を取得すること、および反応操作に試薬の添加と反応部位の洗浄が含まれ、操作が煩雑であることなど、機能や構造が未知のタンパク質を大規模に解析するには種々の問題を有している。
【０００５】
ドットブロット法は、固相と液相の分離操作が必要なため、試薬の添加と反応部位（ニトロセルロース等の紙状部材）の洗浄を順次行う必要があり、手動で行う場合には操作が煩雑であることはもとより、機械による自動化に際しては反応工程が多いことによる分析時間の増大や洗浄の際の液残りなど数多くの問題点を含んでいる。
【０００６】
固相を標準的に規格化された９６ ｗｅｌｌあるいは３８４ ｗｅｌｌマイクロタイタープレートなどを用いてドットブロットを行う方法では、手動で行う場合には８連あるいは１２連のマルチピペットを用いることにより、また、機械で行う場合には８連あるいは９６連の分注機を用いることにより、試薬の添加操作は前述のドットブロットよりも飛躍的に向上するが、煩雑な洗浄操作を依然として含んでいる。
【０００７】
ドットブロットをガラス等の基板上で高密度に行うマイクロアレイ法と呼ばれる方法（Ｐ．Ｏ．Ｂｒｏｗｎら（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０、４６７−４７０）は、密度を上げることにより実験の速度を高める効果が認められている。しかしながら、ドットブロットあるいはマイクトタイタープレートを用いる方法と同様に、相互作用を解析したい一方の分子が固相に固定化されているため、操作の煩雑さや自動化が困難であるとともに、液相同士での反応に比べて、反応速度が遅い、反応効率が悪いという課題がある。
【０００８】
微小空間中の蛍光分子のブラウン運動を観察することにより、分子間の結合反応を追跡する蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）は、液相同士の反応であり固相が関与しないため、測定値が本来の反応に近い結合定数であることが期待される。しかしながら、現状では蛍光標識に用いた標識物質のうち未反応のものを除去しないと測定ができないため、測定試薬の調製が非常に長時間を要しかつ煩雑であるという問題点を有する。
【０００９】
【発明の解決しようとする課題】
本発明は、無細胞タンパク質合成等により調製されたタンパク質のタンパク質−分子間相互作用の解析において、解析操作を簡便にし、ロボット等による自動化が容易であり、かつ、迅速な分析法を可能にし、ハイスループットなタンパク質−分子間相互作用、および、タンパク質立体構造挙動を解析する方法等を提供することを目的としてなされたものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、蛍光共鳴エネルギー移動を起こす組み合わせの一方の蛍光物質で、Ｃ末端が特異的に標識されたタンパク質を無細胞タンパク質合成により調製し、かくして調製されたＣ末端標識タンパク質を用いることにより、蛍光共鳴エネルギー移動を起こす他方の蛍光物質で標識された分子との相互作用が、蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定することにより、簡便かつ迅速に測定できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【００１１】
すなわち、本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動を起こす組み合わせの一方の蛍光物質でタンパク質合成時にＣ末端標識されたタンパク質と、蛍光共鳴エネルギー移動を起こす組み合わせの他方の蛍光物質で標識された分子とを接触させて、二つの蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定することを特徴とするタンパク質−分子間相互作用の解析方法を提供するものである。
【００１２】
また、本発明の方法の接触反応中に他の被検物質を添加することにより、タンパク質と分子間の相互作用を阻害あるいは促進する調節物質をスクリーニングすることができる。
また、本発明の別の態様により、蛍光共鳴エネルギー移動を起こす組み合わせの一方の蛍光物質でＣ末端が標識され、蛍光共鳴エネルギー移動を起こす組み合わせの他方の蛍光物質で別の部位が標識されたタンパク質を調製し、二つの蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定することを特徴とするタンパク質立体構造挙動（タンパク質分子内相互作用）の解析方法が提供される。
【００１３】
上記解析方法の分子、分析対象分子、被検物質としては、タンパク質、ペプチド、ホルモン、核酸、糖、糖鎖、脂質、低分子化合物、高分子有機物質、若しくはこれらの融合体、または、ウイルス若しくは細胞を構成する分子が挙げられる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）（以下これを「ＦＲＥＴ」と略称することがある。）を起こす組み合わせの一方の蛍光物質でＣ末端が標識されたタンパク質（以下これを「Ｃ末端標識タンパク質」と略称することがある。）と、ＦＲＥＴを起こす組み合わせの他方の蛍光物質で標識された分子を用いるタンパク質−分子間相互作用解析方法、および、タンパク質−分子間相互作用調節物質のスクリーニング方法、並びに、Ｃ末端および別の部位が標識されたタンパク質を用いるタンパク質立体構造挙動の解析方法、および、タンパク質の立体構造挙動に影響を及ぼす物質のスクリーニング方法等である。本発明の方法により、簡便な操作で全自動化に適した工程でのハイ・スループットな解析が可能となり、また、反応に固相が関与しないため、反応効率がよく、迅速に分析することができると共に、測定値が本来の反応に近い結合定数であることが期待される。
【００１５】
以下に、本発明を更に詳細に説明する。
１．Ｃ末端標識タンパク質
本発明の方法は、Ｃ末端標識タンパク質（特開平１１−３２２７８１、特開２０００−１３９４６８）を用いることに一つの特徴を有する方法である。本発明で使用するＣ末端標識タンパク質は、「タンパク質部」が該タンパク質のＣ末端が蛍光共鳴エネルギー移動を起こす組み合わせの一方の蛍光物質を含む「標識試薬」により標識されている。「標識部」とにより構成される。Ｃ末端標識タンパク質は、後述するとおり、タンパク質部をコードする鋳型核酸を、「標識試薬」の存在下、転写および、または翻訳させることにより調製できる。
【００１６】
「タンパク質部」とは、その機能が既知又は未知である相互作用の解析対象として用いるタンパク質部を意味し、このタンパク質部と後述する分析・解析対象となる分子との相互作用の有無の測定が行われる。
このタンパク質部は、天然タンパク質又はその変異体、及び人工タンパク質又はその変異体の何れでもよい。天然タンパク質としては、種々の生物の器官、組織又は細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーから転写、翻訳される多様性を有するタンパク質のライブラリーをも含むものである。人工タンパク質としては、天然タンパク質の全てもしくは部分配列を組み合わせた配列、又はランダムなアミノ酸配列を含むものである。
【００１７】
「標識試薬」は、蛍光共鳴エネルギー移動を起こす組み合わせの一方の蛍光物質を含む「標識部」と、タンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物を含む「アクセプター部」とを含む。標識部とアクセプター部とは化学結合で連結されている。標識部とアクセプター部とは直接化学結合していてもよく、またスペーサーを介して化学結合していてもよい。
【００１８】
「標識部」に使用する蛍光物質は、ＦＲＥＴを起こす組み合わせの蛍光物質である限り、その種類を問わない。ＦＲＥＴは、Ｆｏｒｓｔｅｒの理論（Ｆｏｒｓｔｅｒ， Ｔ．， Ａｎｎ． Ｐｈｙｓｉｋ．、１９４８年、２、５５−７５）にあるように，短波長側の蛍光物質の蛍光スペクトルと長波長側の蛍光物質の励起スペクトルとの重なり積分に比例して増大する。このような組み合わせとして望ましいのは、例えば、フルオロセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｃｙ５とＣｙ５．５、ＣＦＰ（ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）とＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）の組み合わせなどが挙げられる。また、シグナルとバックグラウンドノイズとの比（Ｓ／Ｎ比）が大きいことが分析の精度上好ましいため、ＦＲＥＴによる蛍光値を時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（以下これを「ＴＲ−ＦＲＥＴ」と略称することがある。）として測定することが望ましい。ＴＲ−ＦＲＥＴとして測定するためには、蛍光共鳴エネルギーを与える方の蛍光物質（以下これを「ドナー蛍光物質」と略称することがある。）が、長い蛍光寿命を有することが必要であり、具体的には、ランタノイドまたはその塩若しくは錯体が望ましい。ランタノイドとしては、好ましくはユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、サマリウム（Ｓｍ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、特に好ましくはユーロピウム、テルビウムが挙げられる。ランタノイドの塩または錯体としては、例えばＭａｔｈｉｓらのユーロピウム・クリプテート錯体（Ｌｏｐｅｚ−Ｃｒａｐｅｚ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ． ２００１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２９， ｅ７０）や、通常のＢＨＨＣＴ（４，４’−ｂｉｓ（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ｈｅｐｔａｆｌｕｏｒｏ−４”，６”−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｎ−６”−ｙｌ）−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏ−ｏ−ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ）などのβジケトン類のユーロピウム錯体が挙げられる。ＴＲ−ＦＲＥＴとして測定するための蛍光物質の組み合わせ例としては、ユーロピウム（Ｅｕ）錯体とアロフィコシアニン、あるいはユーロピウム（Ｅｕ）錯体とＣｙ５の組み合わせ等が挙げられる。
【００１９】
標識試薬を構成する「アクセプター部」としては、通常は核酸誘導体が用いられる。この核酸誘導体としては、無細胞タンパク質合成系又は生細胞中でタンパク質の合成（翻訳）が行われた時に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物である限り特に限定されないが、その３’末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似しているものを選択することができる。代表的な化合物として、アミド結合を有するピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ 、 ＰＡＮＳ−アミノ酸）、たとえば、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸化合物が挙げられる。
【００２０】
また、３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して形成されるアミド結合で連結した３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ， ＡＡＮＳ−アミノ酸）、例えば、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸化合物を使用できる。
【００２１】
また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。さらにまた、核酸あるいは核酸に類似した化学構造骨格及び塩基を有する物質と、アミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質とを化学的に結合した化合物は、すべてアクセプター部を構成する核酸誘導体として用いることができる。
【００２２】
アクセプター部としては、ピューロマイシン、ＰＡＮＳ−アミノ酸もしくはＡＡＮＳ−アミノ酸がリン酸基を介してヌクレオシドと結合している化合物がより好ましい。これらの化合物の中で、ピューロマイシン、リボシチジルピューロマイシン、デオキシジルピューロマイシン、デオキシウリジルピューロマイシンなどのピューロマイシン誘導体が特に好ましい。
【００２３】
標識試薬は、上記標識部とアクセプター部とを所望によりスペーサーを介して、それ自体既知の化学結合方法によって結合させることにより製造することができる。具体的には、例えば、適当な保護基で保護された上記アクセプター部を固相担体上に結合させ、核酸合成機を用いてスペーサーとしてスペーサーホスホアミダイト、標識部として蛍光物質などを結合したホスホアミダイトを順次結合させた後、脱保護を行うことによって作成することができる。上記各部の種類、あるいは結合の種類によっては液相合成法で結合させるかあるいは両者を併用することもできる。また、標識部としてニッケル等の金属イオンを結合させるには、金属イオンが配位しうるニトリロトリ酢酸やイミノジ酢酸等のキレート性の試薬用いて行うことができる。
【００２４】
標識部とアクセプター部をつなぐスペーサーとしては、ポリエチレン、ポリエチレングリコールなどの高分子物質が用いられ、好ましくはポリエチレングリコール（分子量１，０００〜１０，０００）が用いられる。
本発明で用いるＣ末端標識タンパク質の調製法は、特に制限されないが、例えば、次の方法を挙げることができる。先ず、標識試薬の存在下で、前記タンパク質部をコードするコーディング領域をＴ７、ＳＰ６等のウイルスや細胞に由来するプロモーター領域の制御下に連結し、これを転写することによりｍＲＮＡを合成する。該コーディング領域ＤＮＡとしては、ストップコドンを削除した配列が好ましく用いられる。これにより標識の効率が数十倍向上する。また、それ自体既知の方法で生体から取得されたｍＲＮＡを用いることもできる。これらのｍＲＮＡは、翻訳系で発現させてタンパク質合成を行わせることにより調製することができる。
【００２５】
なお、本明細書における、核酸の単離・調製、核酸の連結、核酸の合成、ＰＣＲ、プラスミドの構築、無細胞系での翻訳等の遺伝子操作技術は、特に明記しない限り、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載の方法またはそれに準じた方法で行うことができる。
【００２６】
用いられる翻訳系としては、無細胞翻訳系又は生細胞などが挙げられる。無細胞翻訳系又は生細胞などは、その中にタンパク質をコードする核酸を添加又は導入することによってタンパク質合成が行われるものである限り特に制限されない。無細胞翻訳系としては、原核又は真核生物の抽出物により構成される無細胞翻訳系、例えば大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽抽出物（特開２０００−２３６８９６）などが使用できる。無細胞タンパク質合成系の方法としては、バッチ法、透析法（ＰＮＡＳ， Ｖｏｌ．９７， ｐ．５５９−５６４， ２０００）、重層法（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ．５１４， ｐ．１０２−１０５， ２００２）などが挙げられるが、透析法は少種類のサンプルを大量に合成する場合に好ましく、重層法は多種類のサンプルを効率よく合成する上で好ましい。生細胞翻訳系としては、原核又は真核生物、例えば大腸菌の細胞などが使用できる。無細胞翻訳系を用いる場合、用いる核酸がＤＮＡである場合、それ自体既知のＲＮＡポリメラーゼなどを用いる方法により転写して合成したＲＮＡを鋳型として導入する。
【００２７】
この翻訳系において、標識試薬を適当な濃度で存在させることにより合成されたタンパク質部のＣ末端にアクセプター部を介して蛍光物質を結合させることができる。存在させる標識試薬の濃度としては、一般的には最終濃度が０．１〜２００μＭの範囲が好ましく用いられる。
標識試薬の濃度は、実際に使用するＲＮＡ、蛍光物質、核酸誘導体、及び翻訳系等によって異なる。好ましい標識試薬の濃度の選定は、次のとおり、種々の濃度の標識試薬を、用いる鋳型核酸とともに翻訳系に投入し、合成されたタンパク質を適当な方法で分離した後、タンパク質より発せられる信号の強度を測定し、最も高い値を示した系に投入した標識試薬の濃度を選択することによって行うことができる。
【００２８】
すなわち、上記したＣ末端標識タンパク質を作成する系において、標識試薬（蛍光物質が結合した核酸誘導体）、例えばフルオレセニルピューロマイシン（Ｆｌｕｏｒｐｕｒ）やフルオレセニルチオピューロマイシン（Ｆｌｕｏｒｔｈｉｏｐｕｒ）を濃度を違えて添加し、得られた翻訳産物をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を用いる等して分離し、Ｃ末端に結合している蛍光物質より発せられる信号強度を測定し、最も信号強度の高い値を示した濃度を選択する。具体的には、Ｔ７プロモータの制御下にあるチオレドキシンのコーディング領域の全長を、ＦｌｕｏｒｐｕｒもしくはＦｌｕｏｒｔｈｉｏｐｕｒの存在下で大腸菌の無細胞転写翻訳系においてタンパク質を合成する場合には、ＦｌｕｏｒｐｕｒもしくはＦｌｕｏｒｔｈｉｏｐｕｒの最適濃度は、０．１〜１μＭである。またウサギ網状赤血球抽出液を用いた場合では０．３〜５０μＭ、小麦胚芽抽出液を用いた場合には１０〜５０μＭである。
【００２９】
このようにして合成されたＣ末端標識タンパク質は、そのままＦＲＥＴによる蛍光値の測定系に用いることも可能であるいが、以下の方法により未反応の標識試薬を除去した後に用いることもできる。翻訳系に生細胞を用いた場合は細胞をそれ自体既知の方法で溶解後、ゲル濾過カラム（例えば、Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ ６；ＢＩＯ−Ｒａｄ社製）等によって未反応の標識試薬を除去し、取得することができる。また、無細胞翻訳系を用いた場合には、同様にゲル濾過カラム等によって未反応の標識試薬を除去すればよい。
【００３０】
本発明に用いられるＣ末端標識タンパク質は、可能ならばそのまま測定に用いても構わないし、その後何らかの修飾・誘導を加えても構わない。修飾・誘導化の例としては、ば蛍光増感、親水化、安定化、官能基の付加や糖、核酸、タンパク質、ペプチド、脂質等の誘導化等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらタンパク質複合体あるいはタンパク質誘導体の全てが、本発明にいうＣ末端標識タンパク質に含まれる。
【００３１】
２．分子（分析・解析対象物質および分子の標識化）
本発明において、「分子」とは、Ｃ末端標識タンパク質を用いる分析や解析の対象となりうる物質を意味する。具体的にはタンパク質、ペプチド、ホルモン、核酸、糖、糖鎖、脂質、低分子化合物、高分子有機物質、若しくはこれらの融合体、または、ウィルス若しくは細胞を構成する分子などが挙げられる。なお、本明細書において、これらの分子で、分析や解析の対象として用いるものを「分析対象分子」または「標的分子」ということがある。
【００３２】
タンパク質としては、タンパク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、及びその機能が既知のタンパク質でも、未知のタンパク質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたタンパク質、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳、精製されたタンパク質を用いることができる。
【００３３】
核酸としては、 特に制限はなく、ＤＮＡあるいはＲＮＡも用いることができる。また、塩基配列あるいは機能が既知の核酸でも、未知の核酸でもよい。好ましくは、タンパク質に結合能力を有する核酸としての機能、及び塩基配列が既知のものか、あるいはゲノムライブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離してきたものを用いることができる。
【００３４】
糖鎖としては、その糖配列あるいは機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。好ましくは、既に分離解析され、糖配列あるいは機能が既知の糖鎖が用いられる。
低分子化合物としては、 Ｃ末端標識タンパク質と相互作用する可能性を有する限り、特に制限はない。機能が未知のものでも、あるいはタンパク質に結合する能力が既に知られているものでも用いることができる。
【００３５】
これら標的分子がＣ末端標識タンパク質と行う「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、及び静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。
【００３６】
相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合及び解離、タンパク質レセプターとリガンドの間の結合及び解離、接着分子と相手方分子の間の結合及び解離、酵素と基質の間の結合及び解離、アポ酵素と補酵素の間の結合及び解離、核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合及び解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合及び解離、あるいは糖鎖とタンパク質との間の結合及び解離が挙げられるが、この範囲に限られるものではない。例えばイムノグロブリンやその派生物であるＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、レセプターや酵素とその派生物、核酸、天然あるいは人工のペプチド、人工ポリマー、糖質、脂質、無機物質あるいは有機配位子、ウィルス、細胞、薬物等が挙げられる。
【００３７】
「分子」および「被検物質」は、必ずしも蛍光物質により標識されている必要はなく、相互作用するペアの１つであるか、あるいは相互作用するペアの結合形成を阻害あるいは促進する相互作用調節物質である限りで、その種類を問わない。例えば低分子有機化合物、タンパク質、ペプチド、ホルモン、脂質、糖、核酸、高分子有機物質、ウィルス、細胞等である。
【００３８】
ＦＲＥＴによる蛍光値の測定に用いる値は、それがＦＲＥＴに直接的あるいは間接的に由来する物理・化学量である限り、その種類を問わない。例えば、蛍光共鳴エネルギーを受け取る方の蛍光物質（以下これを「アクセプター蛍光物質」と略称することがある。）の蛍光カウント値、ドナー蛍光物質の蛍光カウント値、ドナー蛍光物質の蛍光カウント値とアクセプター蛍光物質の蛍光カウント値の比、それらの各時間分解蛍光の蛍光値などである。
【００３９】
また、タンパク質−分子間相互作用そのものを測定することと、タンパク質−分子間相互作用形成にともなうＦＲＥＴによる蛍光値の測定とを組み合わせることで、測定結果の信頼性向上や測定範囲の増大などの副次的、多次元的な情報を得てもよい。例えばタンパク質−分子間相互作用の形成数がＦＲＥＴによる蛍光値の測定にとって多すぎ、いわゆる検量範囲を越えている場合に、タンパク質−分子間相互作用の形成数を比濁法で測定することにより、感度の高い方法と、感度の低い比濁法との組み合わせで広い定量範囲を得ることができる。
【００４０】
タンパク質−分子間相互作用の解析に用いるタンパク質、あるいは、分子は、少なくとも一方がＣ末端標識タンパク質である。他方の分子は、必ずしもＣ末端標識タンパク質に限定されない。例えば蛍光物質で標識されたタンパク質、核酸、低分子有機化合物、高分子有機物質、脂質、糖、ペプチド、ホルモン、核酸、ウィルス、細胞等であってもよい。望ましくは、５’端あるいは３’端を特異的に蛍光修飾された核酸、アミノ基を選択的に蛍光修飾されたタンパク質、６位のヒドロキシル基を選択的に蛍光修飾された糖等であることが好ましい。
【００４１】
これらは，そのもの自体が蛍光を発するＣＦＰやＹＦＰなどのタンパク質やＮＡＤＨなどの低分子であっても構わないし、これらの誘導体あるいはキメラタンパク質であっても構わない。また、蛍光を有しない、あるいは蛍光共鳴エネルギー移動に適した励起／蛍光スペクトルを有しない物質であっても、蛍光体と結合させることで本発明の用途に用いることができる。例えば、イソチオシアネート基を有するフルオロセインをタンパク質と接触させることにより、タンパク質のアミノ基とイソチオシアネート基が反応し、タンパク質とフルオロセインを共有結合させることができる。こういった、後から蛍光体を結合させる方法としては、上述のような共有結合以外にも、水素結合や分子間力といった力を利用してもよい。例えば、核酸の螺旋構造に結合するインターカレーターの蛍光誘導体などを用いてもよい。
【００４２】
３．タンパク質−分子間相互作用解析方法および相互作用調節物質のスクリーニング方法
本発明の方法における反応様式は、タンパク質相互作用の形成あるいはタンパク質相互作用の形成を阻害あるいは促進を利用する形であれば、その様式を問わない。これら反応様式の具体例を、図１〜図３に示す。
【００４３】
例えば２分子間の相互作用の定性的あるいは定量的な結合反応の検出として、各分子をそれぞれＦＲＥＴを起こす組み合わせの蛍光物質で標識し、結合の有無を検出してもよい（図１参照）。この場合、分析対象物質のいずれか一方あるいは両方が、Ｃ末端標識タンパク質である。この方法は２分子の結合に限定されるものではなく、３分子以上が結合する反応を検出してもよい。
【００４４】
また、ＦＲＥＴを起こす組み合わせの一方の蛍光物質で標識された分子と、ＦＲＥＴを起こす組み合わせの他方の蛍光物質で標識された分子と、第三の分析対象分子との３者の結合を検出してもよい（図２参照）。この場合、ＦＲＥＴを起こす組み合わせの蛍光物質で標識された物質のいずれか一方あるいは両方が、Ｃ末端標識タンパク質あるいはその誘導体である。また、この方法は３分子の結合に限定されるものではなく、４分子以上の相互作用をの検出に用いることもできる。
【００４５】
ＦＲＥＴを起こす組み合わせの蛍光物質でそれぞれ標識された特異的結合ペアの相互作用を、阻害する物質の定性的あるいは定量的な調節反応として検出してもよい（図３参照）。この方法によりタンパク質−分子間相互作用の阻害物質をスクリーニングすることができる。この場合、特異的結合ペアとなる分析対象物質のいずれか一方あるいは両方が、Ｃ末端標識タンパク質である。また、阻害物質は直接的に特異的結合ペアの相互作用する部位の結合を阻害してもよいし（競合阻害）、特異的結合ペアのいずれかあるいは両方に相互作用を及ぼすことによって、間接的に特異的結合を阻害してもよく（非競合阻害あるいは反競合阻害）、さらに、本発明において検出される阻害反応の形式は、以上に限定されるものではない。また、同様の方法で特異的結合ペアの結合（タンパク質−分子間相互作用）を促進する物質をスクリーニングすることができる。ここで、本明細書において、これら阻害物質および促進物質を「調節物質」と総称することがある。
【００４６】
上記方法における操作手順は、上記の反応様式の反応とその後の検出・測定が可能である限り特に限定されない。すなわち、試薬を任意の順に逐次添加してもよいし、あらかじめ混合しておいた後に添加してもよい。また、ＦＲＥＴの検出・測定は、反応が終了した後に時間的に１点で行ってもよいし、反応前後あるいは反応中に経時的に行ってもよい。
【００４７】
この操作手順は反応様式および各試薬の特性に応じてさまざまな組み合わせが可能であり、近接した２種の蛍光分子を利用しＦＲＥＴを検出・測定する限りにおいてどのような形でも使用可能である。以下にその代表的な例を挙げるが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
【００４８】
例１）２分子間相互作用
Ｃ末端標識試薬：ピューロマイシン−Ｃｙ５誘導体
他方の蛍光物質：Ｅｕ錯体
測定：アクセプター蛍光分子／ドナー蛍光分子の蛍光強度比、時間分解蛍光
操作：Ｅｕ錯体で修飾したウサギ抗体を分注する。Ｃ末端が標識されたプロテインＡのｚｚドメインを分注する。結合のための反応時間をとる。アクセプター蛍光分子／ドナー蛍光分子の蛍光強度比を時間分解蛍光で測定する。
【００４９】
例２）２分子間相互作用
Ｃ末端標識試薬：ピューロマイシン−Ｃｙ５誘導体
他方の蛍光物質：Ｅｕ錯体
測定：アクセプター蛍光分子／ドナー蛍光分子の蛍光強度比、時間分解蛍光
操作：５’端をＥｕ錯体で修飾した転写配列を含むＤＮＡ分子を分注する。Ｃ末端が標識された転写因子を分注する。結合のための反応時間をとる。アクセプター蛍光分子／ドナー蛍光分子の蛍光強度比を時間分解蛍光で測定する。
【００５０】
例３）３分子間相互作用
Ｃ末端標識試薬：ピューロマイシン−フルオロセイン誘導体
他方の蛍光物質：ローダミン
測定：ドナー蛍光分子の消光。
操作：ローダミンで修飾した抗ヒトＦＳＨ−αサブユニット抗体を分注する。Ｃ末端が標識された抗ＴＳＨ抗体のＦａｂを分注する
ＴＳＨを分注する。結合のための反応時間をとる。ドナー蛍光分子の蛍光強度を測定する。
【００５１】
例４）２分子間相互作用阻害反応
Ｃ末端標識試薬：ピューロマイシン−Ｃｙ５誘導体。
他方の蛍光物質：Ｅｕ錯体
測定：アクセプター蛍光分子／ドナー蛍光分子の蛍光強度比
操作：Ｅｕ錯体で修飾したサイトカインを分注する。上記サイトカインの有機低分子アンタゴニストを分注する。Ｃ末端標識した可溶化レセプターを分注する。結合のための反応時間をとる。アクセプター蛍光分子／ドナー蛍光分子の蛍光強度比を測定する。
【００５２】
４．タンパク質立体構造挙動の解析方法、立体構造挙動に影響を及ぼす物質のスクリーニング方法、基質タンパク質をスクリーニングする方法
１分子内の２カ所以上の別部位を、ＦＲＥＴを起こす組み合わせの蛍光物質で標識し、標識された部位の立体構造挙動を解析してもよい（図４参照）。
【００５３】
即ち、蛍光共鳴エネルギー移動を起こす組み合わせの一方の蛍光物質でＣ末端が標識され、かつ蛍光共鳴エネルギー移動を起こす組み合わせの他方の蛍光物質でＣ末端と別の部位が標識されたタンパク質を調製し、二つの蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定することにより、タンパク質立体構造挙動を解析方法することができる。
【００５４】
また、蛍光共鳴エネルギー移動を起こす組み合わせの一方の蛍光物質でＣ末端が標識され、かつ蛍光共鳴エネルギー移動を起こす組み合わせの他方の蛍光物質でＣ末端と別の部位が標識されたタンパク質を調製し、被検物質の存在下、溶液中で、二つの蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、測定された蛍光値と被検物質の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較することにより、タンパク質の立体構造挙動に影響を及ぼす物質をスクリーニングすることができる。例えば、被検物質としてプロテアーゼを選択することにより、Ｃ末端標識タンパク質を基質とするプロテアーゼをスクリーニングすることができる。
【００５５】
また、蛍光共鳴エネルギー移動を起こす組み合わせの一方の蛍光物質でＣ末端が標識され、かつ蛍光共鳴エネルギー移動を起こす組み合わせの他方の蛍光物質でＣ末端と別の部位が標識された基質タンパク質を調製し、特定物質の存在下、溶液中で、二つの蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、測定された蛍光値と特定物質の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較することにより、特定物質により立体構造挙動に影響を及ぼされる基質タンパク質をスクリーニングすることができる。例えば、特定物質としてプロテアーゼを選択することにより、特定プロテアーゼの基質となるタンパク質をスクリーニングすることができる。
【００５６】
さらに、これらの反応系を阻害する物質あるいは促進する物質のスクリーニングに用いることも可能である。
また、標識物質同士が結合する反応を検出することもできるが、これは上記図１の反応様式の変法である。
【００５７】
例５）１分子内相互作用・立体構造挙動
Ｃ末端標識試薬：ピューロマイシン−Ｅｕ錯体誘導体
他方の蛍光物質：アロフィコシアニン
測定：アクセプター蛍光分子／ドナー蛍光分子の蛍光強度比、時間分解蛍光
操作：Ｎ末端側がアロフィコシアニンとキメラタンパクになっているＣ末端標識プロテアーゼ基質を分注する。プロテアーゼを加える。切断反応のための時間をとる。アクセプター蛍光分子／ドナー蛍光分子の蛍光強度比を時間分解蛍光で測定する。
【００５８】
５．試薬キット
本発明のキットは、少なくともコムギ胚芽抽出液および蛍光共鳴エネルギー移動を起こす組み合わせの少なくとも一方の蛍光物質が結合したピューロマイシンを含み、任意の要素として、緩衝液、エネルギー供給液、発現ベクター、発現用配列を含むＰＣＲ用ＤＮＡプライマー、マイクロプレート等の重層法による無細胞タンパク質合成に用いるための反応容器等を含んでいてもよい。また、該キットには、ＲＮＡポリメラーゼ等の転写系の試薬が含まれていてもよい。さらに、該キットには、ＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ等による遺伝子増幅に必要な試薬が含まれていてもよい。
【００５９】
【発明の効果】
本発明の方法は、分離操作が不要であるために、手動の分析では煩雑さが減少し、また全自動化に際しても工程が単純化するという長所を有する。また、液層同士の反応であり固相が関与しないため、反応速度が速く分析時間が短いことが特徴であると共に、測定値が本来の反応に近い結合定数であることが期待される。また、従来は、Ｃ末端標識タンパク質を分析する場合、洗浄を含む方法を用いない限りは、測定前に未反応の蛍光標識体を除去する操作が必要であったが、本発明の方法ではこの操作が不要であることが大きな長所である。これらを考慮すると、本発明は、特にＣ末端標識タンパク質を、機械を用いた自動化の系でハイ・スループットに分析することにより解析速度を飛躍的に向上させることが可能である。
【００６０】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例 １ 反応の特異的検出の確認
（１）転写用ＤＮＡ（プラスミド）の構築
プロテインＡのｚｚドメイン配列を含むＴａｎｄｅｍ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＡＰ）用の配列（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７巻、１０３０−１０３２頁、１９９９年）の３’側に、ヒト由来ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｇａｍｍａ ２（ＰＰＡＲγ２）遺伝子（Ｃｅｌｌ、７９巻、７号、１１４７−１１５６頁、１９９４年）を以下に示すとおり、ＰＣＲライゲーション法により連結し、ＴＡＰ− ＰＰＡＲγ２連結断片を作成した後、プラスミドベクターにクローニングした。
【００６１】
まず、ＴＡＰ配列（配列番号１）を鋳型として、ＴＡＰ配列の５’末端配列からなるＤＮＡ（配列番号３）とＴＡＰ配列の３’末端配列からなるＤＮＡ（配列番号４）をプライマーとして通常の条件でＰＣＲ反応を行い、ＴＡＰ配列を含む特異的増幅ＤＮＡ断片を得た。
次に、ＰＰＡＲγ２遺伝子（配列番号２）を含有するプラスミド（Ｃｅｌｌ、７９巻７号１１４７−１１５６頁、１９９４年）を鋳型として、上記ＰＣＲ増幅産物、ＴＡＰ配列の５’末端配列に制限酵素ＸｂａＩ部位の配列を付加したＤＮＡ（配列番号３）、ＰＰＡＲγ２遺伝子の５’末端配列にＰＣＲライゲーション用の配列を付加したＤＮＡ（配列番号５）とＰＰＡＲγ２遺伝子の３’末端配列（終始コドンなし）に制限酵素ＸｈｏＩ部位の配列を付加したＤＮＡ（配列番号６）をプライマーとして添加し、通常の条件によりＰＣＲライゲーション反応を行い、ＴＡＰ−ＰＰＡＲγ２遺伝子を含み、両末端に制限酵素ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ部位を保持した特異的増幅ＤＮＡ断片を増幅した。
【００６２】
上記で得られたＴＡＰ−ＰＰＡＲγ２遺伝子ＤＮＡ断片を、添付のプロトコールに従ってクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にクローニングした。まず、ＴＡＰ−ＰＰＡＲγ２ＤＮＡ断片、および、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を、常法に従い制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで切断した後、ライゲーションし、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン（１００ｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地プレート（ＬＢ培地＋２％寒天）上で３７℃で生育させた。出現したいくつかのコロニーを培養しプラスミドの抽出を通常の条件で行った。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで切断後、目的のＤＮＡ断片がプラスミドに挿入されているかアガロース電気泳動により確認した。
【００６３】
（２）タンパク質の標識の方法
まず、上記（１）で作製したプラスミドＤＮＡを鋳型として、ＴＡＰ配列の５’末端配列の５’側にＳＰ６プロモーター配列と翻訳エンハンサー領域（Ω配列）を付加したＤＮＡ（配列番号７）とＴＡＰ配列の３’末端配列（終始コドンあり）からなるＤＮＡ（配列番号８）をプライマーとして使用してＰＣＲで増幅し転写用鋳型とした。ＰＣＲはＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いた。
【００６４】
ＰＣＲ増幅産物を鋳型としてＲＮＡ合成キット（ＲｉｂｏＭａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ： Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてマニュアルに従いｍＲＮＡを調製し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製を行った。
次に、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系に、佐々木らの方法（ＦＥＢＳ ＬｅｔｔｅｒｓＶｏｌ．５０２、 ｐ７９−８３、 ２００１）に従って合成したＣｙ５誘導化ピューロマイシンを加えて、重層法（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ．５１４， ｐ．１０２−１０５， ２００２）により翻訳した。９６穴のマクロプレートに、１０μＬの翻訳液（２４％（ｖ／ｖ）コムギ胚芽抽出液、２４ ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ， ｐＨ ７．８、１．２ ｍＭ ＡＴＰ、０．２５ ｍＭ ＧＴＰ、１６ ｍＭクレアチンリン酸、０．４ ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、２ ｍＭジチオスレイトール、０．４ ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ−アミノ酸（各 ０．３ ｍＭ）、２．７ ｍＭ酢酸マグネシウム、１００ ｍＭ酢酸カリウム、５０ μｇ／ｍｌコムギ胚芽から抽出した脱アセチル化ｔＲＮＡ、０．０５ ％ ＮＰ−４０、０．００５ ％ アジ化ナトリウム、３０μＭ Ｃｙ５−ピューロマイシン、２０ ｐｍｏｌ ｍＲＮＡ）を分注し、その上に５０μＬの基質液（翻訳液からｍＲＮＡとクレアチンキナーゼを除いたもの）を注意深く重層し、２６℃で１８時間反応した。
【００６５】
翻訳されたタンパク質溶液４００μＬにＰＢＳ、１％ ＢＳＡを等量加え、５０％ ウサギＩｇＧ固定化アガロースビーズ（シグマ社製Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｇａｒｏｓｅ （Ａ−２９０９） ｌｏｔ＃ ８１Ｋ９０４５）を２００μＬ加えた後、４℃で２時間反応させた。次に、アガロースビーズをＰＢＳで３回洗浄し、５０ ｍＭの酢酸２００μＬで溶出後中和し、Ｃ末端標識タンパク質として用いた。
【００６６】
（３）Ｃ末端標識タンパク質を用いたタンパク質−タンパク質間分子相互作用の解析
Ｅｕ錯体標識ウサギ抗体（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製：ＬＡＮＣＥ Ｅｕ−Ｗ１０２４−ｌａｂｅｌｌｅｄ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （ＡＤ００７６） ｌｏｔ＃ ７２９０４１ ６ Ｅｕ／ｐｒｏｔｅｉｎ、 ２．２ μｍｏｌ／Ｌ）を、１％ ＢＳＡ を含有するリン酸バッファー（ＰＢＳ）中に２．２ ｎｍｏｌ／Ｌになるように調整し１００μＬを分注した。次に、１０ ｍｇ／ｍＬに調整したウサギイムノグロブリン（Ｒａｂｂｉｔ Ｇａｍｍａ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｒ ＩＩ、Ｃｕｌｖｅｒ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を１μＬ添加し、上記（２）で得たＣ末端標識タンパク質１０μＬを添加した後、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製の時間分解蛍光測定装置ＡＲＶＯ ＳＸ １４２０ ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｃｏｕｎｔｅｒ Ｌで６１５ ｎｍと６６５ ｎｍの時間分解蛍光を測定し（プロトコル名＝ＬＡＮＣＥ ６１５／６６５）、６６５ ｎｍの値と６１５ ｎｍの値の比で定量した。その結果を表１に示す。
【００６７】
【表１】
【００６８】
上記表１から明らかなとおり、本方法によりタンパク質−タンパク質（Ｅｕ錯体標識ウサギ抗体−Ｃｙ５で標識したプロテインＡのｚｚドメイン）間の相互作用が特異的に検出可能であることが明らかになった。
【００６９】
実施例 ２ 反応の定量性の確認
実施例１で用いたＥｕ錯体標識ウサギ抗体を、１％ ＢＳＡ を含むＰＢＳ中に２．２ ｎｍｏｌ／Ｌになるように調整し１００ μＬを分注した。次に、実施例１で調製したＣ末端標識タンパク質、あるいは、その１００倍希釈溶液（１％ ＢＳＡ を含むＰＢＳで希釈）を添加した後、実施例１と同様に６１５ ｎｍと６６５ ｎｍの時間分解蛍光を測定し、６６５ ｎｍの値と６１５ ｎｍの値の比で定量した。
【００７０】
その結果を表２に示す。なお、表２中の「Ｃ末端標識タンパク質添加量」において添加量が０．４μＬ以下の場合は、１００倍希釈溶液からの換算量で示している。例えば０．４μＬの場合、実際は１００倍希釈溶液を４０μＬ添加している。
【００７１】
【表２】
【００７２】
表２の結果から、Ｃ末端標識タンパク質の添加量０．４〜５０μＬの間で、添加量に比例して測定値が定量的に得られていることが明らかになった。
【００７３】
実施例 ３ 夾雑物存在下での分析例
実施例１と同様に調製したＣ末端標識タンパク質を用い実験を行った。
実施例１と同様のＥｕ錯体標識ウサギ抗体をＰＢＳ、１％ＢＳＡ中に２．２ ｎｍｏｌ／Ｌになるように調整し、１００ μＬを分注した。その後、実施例１と同様に精製した際の、ウサギＩｇＧ固定化アガロースビーズに対するｐａｓｓ画分２０μＬを加えた後、Ｃ末端標識タンパク質、あるいはその１００倍希釈溶液（ＰＢＳ、１％ ＢＳＡで希釈）を添加し、実施例１と同様に６１５ ｎｍと６６５ ｎｍの時間分解蛍光を測定し、６６５ ｎｍの値と６１５ ｎｍの値の比で定量した。その結果を表３に示す。
【００７４】
【表３】
【００７５】
表３の結果から、夾雑物（翻訳反応液、未反応蛍光物質）存在下においてもＣ末端標識タンパク質の添加量に応じて定量的に測定可能であることがわかった。
【００７６】
【配列表】
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【００８１】
【００８２】
【００８３】
【００８４】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法による２分子間相互作用検出の反応様式の一例を模式的に示した図である。
【図２】本発明の方法による３分子間相互作用検出の反応様式の一例を模式的に示した図である。図中の記号は図１と同義である。
【図３】本発明の方法による２分子間相互作用阻害反応検出の反応様式の一例を模式的に示した図である。図中の記号は図１と同義である。
【図４】本発明の方法による立体構造挙動検出の反応様式の一例を模式的に示した図である。図中の記号は図１と同義である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for analyzing protein-molecule interaction, protein three-dimensional structure behavior, and the like. More specifically, the present invention relates to a method of specifically combining one fluorescent substance that causes fluorescence resonance energy transfer during protein synthesis with a C-terminal site. Using the C-terminally labeled protein, and measuring the fluorescence value by fluorescence resonance energy transfer based on the interaction with the molecule labeled with the other fluorescent substance, to determine the protein-molecule interaction or the protein three-dimensional structure behavior And the like, and a method for simply and quickly analyzing the results.
[0002]
[Prior art]
In recent years, the Genome Project or the Full-Length cDNA Project has been actively implemented, and as a result, an unprecedented amount of unknown genes have been isolated from humans, mice, and other organisms. Revealed. As a result, a large number of genes can be easily used, and the functions of the proteins encoded by the genes are expected to be rapidly analyzed.
[0003]
On the other hand, advances in cell-free protein synthesis technology using Escherichia coli extract, wheat germ extract, rabbit reticulocyte extract and the like have made it possible to prepare proteins relatively easily and quickly. Thus, it is expected that functional analysis or structural analysis of proteins will be drastically promoted.
Examples of interaction analysis methods for proteins prepared by cell-free protein synthesis include surface plasmon resonance (SPR), evanescent field molecular imaging, fluorescence image analysis, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and fluorescence depolarization. Method, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) and the like.
[0004]
However, these methods have problems such as low detection sensitivity and long operation time, and it has been difficult to analyze a protein prepared by cell-free protein synthesis or the like at a high throughput.
For example, in ELISA, the functions and structures are unknown, such as obtaining a specific antibody against the interacting molecule, and adding complicated reagents and washing the reaction site in the reaction operation. There are various problems in analyzing proteins on a large scale.
[0005]
Since the dot blot method requires a separation operation between a solid phase and a liquid phase, it is necessary to sequentially add a reagent and wash a reaction site (a paper-like member such as nitrocellulose). In addition to being complicated, automation by a machine involves a number of problems such as an increase in analysis time due to a large number of reaction steps and a liquid residue during washing.
[0006]
In a method of performing a dot blot using a 96-well or 384-well microtiter plate that has a standardized solid phase, an 8- or 12-well multipipette can be used when manual operation is performed. When a machine is used, the use of an 8- or 96-dispensing machine greatly improves the reagent addition operation compared to the dot blot described above, but still involves a complicated washing operation.
[0007]
A method called a microarray method in which dot blots are performed at high density on a substrate such as glass (PO Brown et al. (1995) {Science} 270, 467-470) has the effect of increasing the speed of experiments by increasing the density. Have been. However, similar to the method using a dot blot or microtiter plate, one of the molecules whose interaction is to be analyzed is immobilized on a solid phase, which makes the operation complicated and difficult to automate, and also requires a liquid phase. There is a problem that the reaction rate is lower and the reaction efficiency is lower than the above reaction.
[0008]
Fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS), which tracks the binding reaction between molecules by observing the Brownian motion of fluorescent molecules in a small space, is a reaction between liquid phases and does not involve the solid phase. It is expected that the coupling constant is close to the original reaction. However, at present, the measurement cannot be performed unless the unreacted substances among the labeling substances used for the fluorescent label are removed, so that there is a problem that the preparation of the measurement reagent requires a very long time and is complicated.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention, in the analysis of protein-molecule interaction of proteins prepared by cell-free protein synthesis and the like, to simplify the analysis operation, easy automation by robots and the like, and enables a rapid analysis method, An object of the present invention is to provide a method for analyzing a high-throughput protein-molecular interaction, a protein three-dimensional structure behavior, and the like.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, by using cell-free protein synthesis, a protein that is specifically labeled at the C-terminus with one fluorescent substance of a combination that causes fluorescence resonance energy transfer. By using the prepared C-terminally labeled protein thus prepared, the interaction with the molecule labeled with the other fluorescent substance that causes fluorescence resonance energy transfer is performed by measuring the fluorescence value by the fluorescence resonance energy transfer. It has been found that measurement can be performed easily and quickly. The present invention has been achieved based on these findings.
[0011]
That is, the present invention contacts a protein labeled with C-terminal at the time of protein synthesis with one fluorescent substance of a combination causing fluorescence resonance energy transfer and a molecule labeled with the other fluorescent substance of the combination causing fluorescence resonance energy transfer. It is another object of the present invention to provide a method for analyzing a protein-molecule interaction, which comprises measuring the fluorescence value of two fluorescent substances by fluorescence resonance energy transfer.
[0012]
In addition, by adding another test substance during the contact reaction of the method of the present invention, a modulator that inhibits or promotes the interaction between the protein and the molecule can be screened.
According to another aspect of the present invention, there is provided a protein in which the C-terminus is labeled with one fluorescent substance of a combination causing fluorescence resonance energy transfer, and the other site is labeled with the other fluorescent substance of the combination causing fluorescence resonance energy transfer. And measuring the fluorescence value of the two fluorescent substances by fluorescence resonance energy transfer, which provides a method for analyzing protein three-dimensional structure behavior (protein intramolecular interaction).
[0013]
Molecules of the above-described analysis method, molecules to be analyzed, and test substances include proteins, peptides, hormones, nucleic acids, sugars, sugar chains, lipids, low molecular weight compounds, high molecular weight organic substances, or fusions thereof, or viruses or Molecules that constitute cells are exemplified.
[0014]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention relates to a protein whose C-terminus is labeled with one fluorescent substance of a combination that causes fluorescence resonance energy transfer (Fluorescent Resonance Energy Transfer) (hereinafter, this may be abbreviated as “FRET”). A protein-molecule interaction analysis method using a molecule labeled with the other fluorescent substance in a combination that causes FRET, and a protein-molecule interaction regulator. , A method for analyzing a protein three-dimensional structure using a protein having a C-terminal and another site labeled, and a method for screening a substance that affects the three-dimensional structure of a protein. According to the method of the present invention, high-throughput analysis can be performed in a step suitable for full automation by a simple operation, and since a solid phase is not involved in the reaction, the reaction efficiency is high and the analysis can be performed quickly. At the same time, it is expected that the measured value is a binding constant close to the original reaction.
[0015]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
1. C-terminal labeled protein
The method of the present invention is a method having one feature in using a C-terminal labeled protein (JP-A-11-322278, JP-A-2000-139468). The C-terminal labeled protein used in the present invention is labeled with a “labeling reagent” in which the “protein portion” contains one fluorescent substance of a combination in which the C-terminal of the protein causes fluorescence resonance energy transfer. It is composed of a “marker”. As described below, a C-terminal labeled protein can be prepared by transcribing and / or translating a template nucleic acid encoding a protein portion in the presence of a “labeling reagent”.
[0016]
“Protein part” means a protein part used as an analysis target of an interaction whose function is known or unknown, and measurement of the presence or absence of interaction between this protein part and a molecule to be analyzed / analyzed described below is performed. Done.
This protein part may be any of a natural protein or a mutant thereof, and an artificial protein or a mutant thereof. Natural proteins include those having a diversity of proteins that are transcribed and translated from cDNA libraries derived from organs, tissues or cells of various organisms. The artificial protein includes a sequence obtained by combining all or a partial sequence of a natural protein, or a random amino acid sequence.
[0017]
The “labeling reagent” includes a “labeling part” containing one fluorescent substance of a combination causing fluorescence resonance energy transfer, and an “acceptor part” containing a compound capable of binding to the C-terminus of a protein. The label part and the acceptor part are linked by a chemical bond. The label portion and the acceptor portion may be directly chemically bonded, or may be chemically bonded via a spacer.
[0018]
The kind of the fluorescent substance used for the “labeling part” is not limited as long as it is a fluorescent substance of a combination that causes FRET. FRET, as described in Forster's theory (Forster, @T., @Ann. @Physik., 1948, 2, 55-75), has a fluorescence spectrum of a fluorescent substance on the short wavelength side and an excitation spectrum of a fluorescent substance on the long wavelength side. Increases in proportion to the overlap integral with Desirable examples of such a combination include, for example, a combination of fluorescein and rhodamine, a combination of Cy5 and Cy5.5, a combination of CFP (cyan @ fluorescen @ protein) and YFP (yellow @ fluorescen @ protein). In addition, since a large ratio of signal to background noise (S / N ratio) is preferable in terms of analysis accuracy, the fluorescence value obtained by FRET is referred to as time-resolved fluorescence resonance energy transfer (hereinafter abbreviated as “TR-FRET”). It is desirable to measure as In order to measure as TR-FRET, a fluorescent substance that gives fluorescence resonance energy (hereinafter, may be abbreviated as “donor fluorescent substance”) needs to have a long fluorescence lifetime. Specifically, lanthanoids or salts or complexes thereof are desirable. Preferred lanthanoids include europium (Eu), terbium (Tb), samarium (Sm), dysprosium (Dy), and particularly preferably europium and terbium. Examples of lanthanoid salts or complexes include, for example, Mathis et al.'S europium cryptate complex (Lopez-Crapez, E., et al. 2001, Nucleic Acids Research, 29, e70), and ordinary BHHCT (4,4′-bis ( Europium of β diketones such as 1 ", 1", 1 ", 2", 2 ", 3", 3 "-heptafluoro-4", 6 "-hexanedion-6" -yl) -chlorosulfo-o-terphenyl Complexes. Examples of combinations of fluorescent substances for measurement as TR-FRET include a europium (Eu) complex and allophycocyanin, or a combination of a europium (Eu) complex and Cy5.
[0019]
As the “acceptor portion” constituting the labeling reagent, a nucleic acid derivative is usually used. The nucleic acid derivative is not particularly limited as long as it is a compound having the ability to bind to the C-terminus of the synthesized protein when the protein is synthesized (translated) in a cell-free protein synthesis system or a living cell. Those whose 3 ′ terminus has a similar chemical skeleton to aminoacyl-tRNA can be selected. As a typical compound, puromycin having an amide bond (Puromycin), 3′-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside (3′-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-amino acid), for example, PNS-Gly having an amino acid moiety of glycine PAN-Val in which the amino acid portion is valine, PANS-Ala in which the amino acid portion is alanine, and other PANS-amino acid compounds in which the amino acid portion corresponds to all amino acids.
[0020]
Also, 3'-N-aminoacyladenosine aminonucleoside (3'-aminoacyladenosine aminonucleoside, @ AANS-amino acid) linked by an amide bond formed by dehydration condensation of an amino group of 3'-aminoadenosine and a carboxyl group of amino acid, for example, AANS-Gly in which the amino acid portion is glycine, AANS-Val in which the amino acid portion is valine, AANS-Ala in which the amino acid portion is alanine, and other AANS-amino acid compounds in which the amino acid portion corresponds to each amino acid of all amino acids can be used.
[0021]
Further, nucleosides or those in which a nucleoside and an amino acid are ester-bonded can also be used. Furthermore, any compound in which a nucleic acid or a substance having a chemical structural skeleton and a base similar to a nucleic acid and a substance having a chemical structural skeleton similar to an amino acid are chemically bonded to each other should be used as a nucleic acid derivative constituting the acceptor portion. Can be.
[0022]
As the acceptor moiety, puromycin, a compound in which a PANS-amino acid or an AANS-amino acid is bonded to a nucleoside via a phosphate group is more preferable. Among these compounds, puromycin derivatives such as puromycin, ribocytidyl puromycin, deoxydilpuromycin and deoxyuridyl puromycin are particularly preferred.
[0023]
The labeling reagent can be produced by binding the above-mentioned labeling part and acceptor part via a spacer as required by a chemical bonding method known per se. Specifically, for example, the above acceptor portion protected with an appropriate protecting group is bound on a solid support, and a phosphoramidite having a spacer phosphoramidite as a spacer and a fluorescent substance or the like bound as a labeling portion using a nucleic acid synthesizer. Can be prepared by sequentially bonding and then deprotecting. Depending on the type of each part or the type of bonding, they may be combined by a liquid phase synthesis method, or both may be used in combination. In addition, binding of a metal ion such as nickel as the label portion can be performed using a chelating reagent such as nitrilotriacetic acid or iminodiacetic acid to which the metal ion can be coordinated.
[0024]
As the spacer connecting the labeling part and the acceptor part, a high molecular substance such as polyethylene or polyethylene glycol is used, and polyethylene glycol (molecular weight: 1,000 to 10,000) is preferably used.
The method for preparing the C-terminally labeled protein used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include the following methods. First, in the presence of a labeling reagent, a coding region encoding the protein portion is ligated under the control of a promoter region derived from a virus or a cell such as T7 or SP6, and the mRNA is synthesized by transcription. As the coding region DNA, a sequence from which a stop codon is deleted is preferably used. This improves the efficiency of labeling by several tens of times. Alternatively, mRNA obtained from a living body by a method known per se can be used. These mRNAs can be prepared by expressing them in a translation system and performing protein synthesis.
[0025]
Unless otherwise specified, genetic engineering techniques such as nucleic acid isolation / preparation, nucleic acid ligation, nucleic acid synthesis, PCR, plasmid construction, and translation in a cell-free system, unless otherwise specified, are described in Sambrook @ et @ al. {1989} Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press or a method analogous thereto.
[0026]
Examples of the translation system used include a cell-free translation system and living cells. The cell-free translation system or living cells are not particularly limited as long as protein synthesis is performed by adding or introducing a nucleic acid encoding a protein therein. As the cell-free translation system, a cell-free translation system composed of a prokaryotic or eukaryotic extract, for example, an Escherichia coli, rabbit reticulocyte, wheat germ extract (JP-A-2000-236896), or the like can be used. Examples of the cell-free protein synthesis method include a batch method, a dialysis method (PNAS, ９７Vol. 97, p. 559-564, 2000), and an overlay method (FEBS ｅｔ Letters, Vol. 514, p. 102-105, 2002). However, the dialysis method is preferable when a small number of samples are synthesized in a large amount, and the overlay method is preferable for efficiently synthesizing a large number of samples. Prokaryotic or eukaryotic organisms, such as E. coli cells, can be used as the live cell translation system. When a cell-free translation system is used, when the nucleic acid to be used is DNA, RNA transcribed and synthesized by a method using a known RNA polymerase or the like is introduced as a template.
[0027]
In this translation system, a fluorescent substance can be bound to the C-terminal of the synthesized protein part via the acceptor part by allowing the labeling reagent to be present at an appropriate concentration. As the concentration of the labeling reagent to be present, generally, a final concentration in the range of 0.1 to 200 μM is preferably used.
The concentration of the labeling reagent varies depending on the actually used RNA, fluorescent substance, nucleic acid derivative, translation system, and the like. The selection of a preferable concentration of the labeling reagent is as follows. Various concentrations of the labeling reagent are introduced into the translation system together with the template nucleic acid to be used, and the synthesized protein is separated by an appropriate method. The measurement can be performed by measuring the intensity and selecting the concentration of the labeling reagent introduced into the system showing the highest value.
[0028]
That is, in the above-described system for preparing a C-terminally labeled protein, the concentration of a labeling reagent (a nucleic acid derivative to which a fluorescent substance is bound) such as fluoresenyl puromycin (Fluorpur) or fluoresenylthiopuromycin (Fluorthiopur) is changed. After addition, the resulting translation product is separated by SDS polyacrylamide electrophoresis or the like, and the signal intensity emitted from the fluorescent substance bound to the C-terminus is measured. Select Specifically, when synthesizing a protein in the cell-free transcription / translation system of Escherichia coli in the presence of Fluorpur or Fluorthiopur, the optimal concentration of Fluorpur or Fluorthiopur is determined by adding the entire length of the thioredoxin coding region under the control of the T7 promoter. , 0.1 to 1 μM. In addition, when the rabbit reticulocyte extract is used, the concentration is 0.3 to 50 μM, and when the wheat germ extract is used, the concentration is 10 to 50 μM.
[0029]
The C-terminally labeled protein thus synthesized can be used as it is in a system for measuring a fluorescence value by FRET, or can be used after removing an unreacted labeling reagent by the following method. When live cells are used for the translation system, the cells are lysed by a method known per se, and the unreacted labeling reagent is removed by a gel filtration column (for example, Bio-Spin # 6; manufactured by BIO-Rad) to obtain the cells. can do. When a cell-free translation system is used, an unreacted labeling reagent may be similarly removed by a gel filtration column or the like.
[0030]
The C-terminal labeled protein used in the present invention may be used for measurement as it is, if possible, or may be modified or induced afterwards. Examples of modification and derivatization include, but are not limited to, fluorescence sensitization, hydrophilization, stabilization, addition of a functional group, and derivatization of sugar, nucleic acid, protein, peptide, lipid, etc. is not. All of these protein complexes or protein derivatives are included in the C-terminal labeled protein of the present invention.
[0031]
2. Molecules (Labeling of substances to be analyzed / molecules)
In the present invention, the term “molecule” refers to an analysis using a C-terminal labeled protein or a substance that can be an object of analysis. Specific examples include proteins, peptides, hormones, nucleic acids, sugars, sugar chains, lipids, low molecular weight compounds, high molecular weight organic substances, or fusions thereof, or molecules constituting viruses or cells. In the present specification, those molecules used as an object of analysis or analysis may be referred to as “analysis target molecule” or “target molecule”.
[0032]
The protein may be a full-length protein or a partial peptide containing a binding active site. The protein may have a known amino acid sequence and its function, or may have an unknown protein. These can be used as target molecules, even if they are translated from a synthesized peptide chain, a protein purified from a living body, or a cDNA library using an appropriate translation system, and purified, and the like. The synthesized peptide chain may be a glycoprotein having a sugar chain bonded thereto. Among these, preferably, a purified protein having a known amino acid sequence, or a protein translated and purified from a cDNA library or the like using an appropriate method can be used.
[0033]
The nucleic acid is not particularly limited, and DNA or RNA can also be used. Further, the nucleic acid may have a known or unknown base sequence or function. Preferably, those having a known function as a nucleic acid capable of binding to a protein and having a known base sequence, or those obtained by cleavage and isolation from a genomic library or the like using a restriction enzyme or the like can be used.
[0034]
The sugar chain may be a known sugar chain or an unknown sugar chain whose sugar sequence or function is known. Preferably, a sugar chain which has already been separated and analyzed and whose sugar sequence or function is known is used.
The low-molecular compound is not particularly limited as long as it has a possibility of interacting with the ΔC-terminal labeled protein. Those whose function is unknown or whose ability to bind to a protein is already known can be used.
[0035]
The “interaction” performed by these target molecules with a C-terminal labeled protein is generally defined as at least one of a covalent bond, a hydrophobic bond, a hydrogen bond, a van der Waals bond, and an electrostatic bond between the protein and the target molecule. This term should be interpreted in the broadest sense and not in any way in a limiting sense. The covalent bond includes a coordination bond and a dipole bond. The coupling by electrostatic force includes not only electrostatic coupling but also electric repulsion. In addition, a binding reaction, a synthesis reaction, and a decomposition reaction resulting from the above action are also included in the interaction.
[0036]
Specific examples of the interaction include binding and dissociation between an antigen and an antibody, binding and dissociation between a protein receptor and a ligand, binding and dissociation between an adhesion molecule and a partner molecule, binding and dissociation between an enzyme and a substrate, Binding and dissociation between an apoenzyme and a coenzyme, binding and dissociation between a nucleic acid and a protein bound thereto, binding and dissociation between proteins in a signal transduction system, binding and dissociation between a glycoprotein and a protein, Alternatively, binding and dissociation between a sugar chain and a protein may be mentioned, but the present invention is not limited to this range. For example, F (ab ') which is an immunoglobulin or a derivative thereof2, Fab ', Fab, receptors and enzymes and their derivatives, nucleic acids, natural or artificial peptides, artificial polymers, carbohydrates, lipids, inorganic or organic ligands, viruses, cells, drugs and the like.
[0037]
The “molecule” and the “test substance” do not necessarily need to be labeled with a fluorescent substance, and are one of interacting pairs or an interaction regulator that inhibits or promotes the binding of the interacting pair. It does not matter what kind it is, as long as it is a substance. For example, low molecular organic compounds, proteins, peptides, hormones, lipids, sugars, nucleic acids, high molecular organic substances, viruses, cells, and the like.
[0038]
The type used for the measurement of the fluorescence value by FRET is not limited as long as it is a physical or stoichiometric amount directly or indirectly derived from FRET. For example, the fluorescence count value of the fluorescent substance that receives the fluorescence resonance energy (hereinafter sometimes abbreviated as “acceptor fluorescent substance”), the fluorescent count value of the donor fluorescent substance, the fluorescent count value of the donor fluorescent substance, and the acceptor The ratio of the fluorescent count value of the fluorescent substance, the fluorescent value of each time-resolved fluorescent light, and the like.
[0039]
Further, by combining the measurement of the protein-molecule interaction itself with the measurement of the fluorescence value by FRET associated with the formation of the protein-molecule interaction, it is possible to improve the reliability of the measurement results and increase the measurement range. Secondary and multidimensional information may be obtained. For example, by measuring the number of protein-molecule interactions formed by turbidimetry when the number of protein-molecule interactions formed is too large for the measurement of the fluorescence value by FRET and exceeds the so-called calibration range, A wide quantitative range can be obtained by a combination of a method with high sensitivity and a turbidimetric method with low sensitivity.
[0040]
At least one of the proteins or molecules used for analyzing the protein-molecule interaction is a C-terminal labeled protein. The other molecule is not necessarily limited to C-terminally labeled proteins. For example, proteins, nucleic acids, low molecular weight organic compounds, high molecular weight organic substances, lipids, sugars, peptides, hormones, nucleic acids, viruses, cells, and the like, which are labeled with a fluorescent substance, may be used. Desirably, it is a nucleic acid whose 5 ′ end or 3 ′ end is specifically fluorescently modified, a protein whose amino group is selectively fluorescently modified, a sugar whose 6th hydroxyl group is selectively fluorescently modified, or the like. Is preferred.
[0041]
These may be proteins such as CFP and YFP which themselves emit fluorescence, or low molecules such as NADH, or derivatives or chimeric proteins thereof. Further, even a substance that does not have fluorescence or does not have an excitation / fluorescence spectrum suitable for fluorescence resonance energy transfer can be used for the purpose of the present invention by binding to a phosphor. For example, by bringing fluorescein having an isothiocyanate group into contact with a protein, the amino group of the protein reacts with the isothiocyanate group, and the protein and fluorescein can be covalently bonded. As such a method of bonding the phosphor later, a force such as a hydrogen bond or an intermolecular force may be used in addition to the above-described covalent bond. For example, a fluorescent derivative of an intercalator that binds to the helical structure of a nucleic acid may be used.
[0042]
3. Protein-molecular interaction analysis method and interaction modulator screening method
The reaction mode in the method of the present invention is not limited, as long as it utilizes the formation of protein interaction or the inhibition or promotion of the formation of protein interaction. Specific examples of these reaction modes are shown in FIGS.
[0043]
For example, as a qualitative or quantitative detection of the binding reaction of the interaction between two molecules, each molecule may be labeled with a combination of fluorescent substances causing FRET to detect the presence or absence of the binding (see FIG. 1). In this case, one or both of the analytes are C-terminally labeled proteins. This method is not limited to the binding of two molecules, and a reaction in which three or more molecules bind may be detected.
[0044]
Further, by detecting the binding of a molecule labeled with one fluorescent substance of the combination causing FRET, a molecule labeled with the other fluorescent substance of the combination causing FRET, and a third analyte molecule, (See FIG. 2). In this case, one or both of the substances labeled with a combination of fluorescent substances that cause FRET are C-terminal labeled proteins or derivatives thereof. In addition, this method is not limited to the binding of three molecules, and can be used for detecting an interaction of four or more molecules.
[0045]
The interaction of specific binding pairs, each labeled with a fluorescent substance in the combination causing FRET, may be detected as a qualitative or quantitative regulatory reaction of the inhibiting substance (see FIG. 3). According to this method, a protein-molecular interaction inhibitor can be screened. In this case, one or both of the analytes forming a specific binding pair are C-terminal labeled proteins. Further, the inhibitor may directly inhibit the binding of the interacting site of the specific binding pair (competitive inhibition), or may indirectly affect one or both of the specific binding pairs by interacting. May be inhibited (non-competitive inhibition or anti-competitive inhibition), and the type of inhibition reaction detected in the present invention is not limited to the above. In addition, a substance that promotes the binding of a specific binding pair (protein-molecular interaction) can be screened in the same manner. Here, in the present specification, these inhibitors and promoters may be collectively referred to as "modulators".
[0046]
The operating procedure in the above method is not particularly limited as long as the reaction in the above-described reaction mode and subsequent detection / measurement are possible. That is, the reagents may be added sequentially in any order, or may be added after mixing in advance. The detection and measurement of FRET may be performed at a single point in time after the reaction is completed, or may be performed before or after the reaction or over time during the reaction.
[0047]
This operation procedure can be variously combined depending on the reaction mode and the properties of each reagent, and can be used in any form as long as two kinds of fluorescent molecules in close proximity are used to detect and measure FRET. Representative examples are shown below, but the present invention is not limited to the following examples.
[0048]
Example 1) Interaction between two molecules
C-terminal labeling reagent: puromycin-Cy5 derivative
The other fluorescent substance: Eu complex
Measurement: ratio of fluorescence intensity of acceptor fluorescent molecule / donor fluorescent molecule, time-resolved fluorescence
Procedure: Dispense rabbit antibody modified with Eu complex. Dispense the zz domain of Protein A labeled at the C-terminus. Allow reaction time for binding. The fluorescence intensity ratio of the acceptor fluorescent molecule / donor fluorescent molecule is measured by time-resolved fluorescence.
[0049]
Example 2) Interaction between two molecules
C-terminal labeling reagent: puromycin-Cy5 derivative
The other fluorescent substance: Eu complex
Measurement: ratio of fluorescence intensity of acceptor fluorescent molecule / donor fluorescent molecule, time-resolved fluorescence
Operation: A DNA molecule containing a transcription sequence whose 5 'end is modified with an Eu complex is dispensed. Dispense C-terminally labeled transcription factors. Allow reaction time for binding. The fluorescence intensity ratio of the acceptor fluorescent molecule / donor fluorescent molecule is measured by time-resolved fluorescence.
[0050]
Example 3) Interaction between three molecules
C-terminal labeling reagent: puromycin-fluorescein derivative
The other fluorescent substance: rhodamine
Measurement: quenching of donor fluorescent molecule.
Procedure: Dispense an anti-human FSH-α subunit antibody modified with rhodamine. Dispense Fab of anti-TSH antibody labeled with C-terminus
Dispense TSH. Allow reaction time for binding. The fluorescence intensity of the donor fluorescent molecule is measured.
[0051]
Example 4) Two-molecule interaction inhibition reaction
C-terminal labeling reagent: puromycin-Cy5 derivative.
The other fluorescent substance: Eu complex
Measurement: Fluorescence intensity ratio of acceptor fluorescent molecule / donor fluorescent molecule
Procedure: Dispense cytokine modified with Eu complex. Dispense an organic small molecule antagonist of the cytokine. Dispense the C-terminal labeled solubilized receptor. Allow reaction time for binding. The fluorescence intensity ratio of the acceptor fluorescent molecule / donor fluorescent molecule is measured.
[0052]
4. Method for analyzing protein conformational behavior, method for screening substances that affect conformational behavior, method for screening substrate protein
Two or more different sites in one molecule may be labeled with a combination of fluorescent substances that cause FRET, and the steric behavior of the labeled sites may be analyzed (see FIG. 4).
[0053]
That is, a C-terminal is labeled with one fluorescent substance of the combination that causes fluorescence resonance energy transfer, and a C-terminal and another site are labeled with another fluorescent substance of the combination that causes fluorescence resonance energy transfer, to prepare a protein, By measuring the fluorescence values of the two fluorescent substances due to the fluorescence resonance energy transfer, it is possible to analyze the three-dimensional structure behavior of the protein.
[0054]
In addition, a C-terminal is labeled with one fluorescent substance of a combination that causes fluorescence resonance energy transfer, and a C-terminal and another site are labeled with another protein of the combination that causes fluorescence resonance energy transfer, to prepare a protein, In the presence of the test substance, measure the fluorescence value of the two fluorescent substances by fluorescence resonance energy transfer in solution, and compare the measured fluorescence value with the fluorescence value measured in the absence of the test substance By doing so, it is possible to screen substances that affect the three-dimensional structural behavior of the protein. For example, by selecting a protease as a test substance, a protease using a C-terminal labeled protein as a substrate can be screened.
[0055]
Further, a substrate protein is prepared in which the C-terminus is labeled with one fluorescent substance of the combination causing the fluorescence resonance energy transfer and the C-terminal and another site are labeled with the other fluorescent substance of the combination causing the fluorescence resonance energy transfer. In a solution in the presence of a specific substance, measure the fluorescence value of the two fluorescent substances by fluorescence resonance energy transfer, and compare the measured fluorescence value with the fluorescence value similarly measured in the absence of the specific substance As a result, it is possible to screen for a substrate protein that has an effect on the three-dimensional structure behavior by a specific substance. For example, by selecting a protease as a specific substance, a protein serving as a substrate for the specific protease can be screened.
[0056]
Furthermore, it can be used for screening for substances that inhibit or promote these reaction systems.
In addition, a reaction in which the labeling substances bind to each other can be detected, but this is a modification of the reaction mode shown in FIG.
[0057]
Example 5) Intermolecular interaction and three-dimensional structure behavior
C-terminal labeling reagent: puromycin-Eu complex derivative
The other fluorescent substance: allophycocyanin
Measurement: ratio of fluorescence intensity of acceptor fluorescent molecule / donor fluorescent molecule, time-resolved fluorescence
Procedure: Dispense a C-terminally labeled protease substrate having an allophycocyanin and a chimeric protein on the N-terminal side. Add protease. Take time for the cleavage reaction. The fluorescence intensity ratio of the acceptor fluorescent molecule / donor fluorescent molecule is measured by time-resolved fluorescence.
[0058]
5. Reagent kit
The kit of the present invention contains at least a wheat germ extract and puromycin to which a fluorescent substance of at least one of a combination causing fluorescence resonance energy transfer is bound, and a buffer, an energy supply solution, an expression vector, and an expression It may contain a DNA primer for PCR containing a sequence, a reaction container for use in cell-free protein synthesis by a multilayer method such as a microplate, and the like. In addition, the kit may include a transcription system reagent such as RNA polymerase. Further, the kit may contain reagents necessary for gene amplification by PCR or the like such as DNA polymerase.
[0059]
【The invention's effect】
The method of the present invention has the advantage that the complexity is reduced in manual analysis and the process is simplified even in full automation, since the separation operation is not required. In addition, since the reaction is a reaction between liquid layers and does not involve a solid phase, the reaction speed is high and the analysis time is short, and the measured value is expected to have a binding constant close to the original reaction. Conventionally, when analyzing a C-terminal labeled protein, an operation of removing an unreacted fluorescent label before measurement was required unless a method including washing was used. A major advantage is that no operation is required. In view of the above, the present invention makes it possible to dramatically improve the analysis speed by analyzing a C-terminal labeled protein at a high throughput by an automated system using a machine.
[0060]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
Example 1 Confirmation of specific detection of reaction
(1) Construction of DNA (plasmid) for transcription
On the 3 'side of a sequence for Tandem Affinity Purification (TAP) containing the zz domain sequence of Protein A (Nature Biotech., Vol. 17, pp. 1030-1032, 1999), a human-derived peroxisome proliferative gene that has been activated. ) The gene (Cell, Vol. 79, No. 7, pp. 1147-1156, 1994) was ligated by the PCR ligation method as shown below to prepare a TAP-ΔPPARγ2 ligated fragment, and then cloned into a plasmid vector.
[0061]
First, using the TAP sequence (SEQ ID NO: 1) as a template and the DNA consisting of the 5 ′ terminal sequence of the TAP sequence (SEQ ID NO: 3) and the DNA consisting of the 3 ′ terminal sequence of the TAP sequence (SEQ ID NO: 4) as primers under the usual conditions Was performed to obtain a specific amplified DNA fragment containing a TAP sequence.
Next, using the plasmid containing the PPARγ2 gene (SEQ ID NO: 2) (Cell, Vol. 79, No. 7, pages 1147-1156, 1994) as a template, a restriction enzyme XbaI site was added to the 5 ′ end sequence of the PCR amplification product and the TAP sequence. (SEQ ID NO: 3), DNA (SEQ ID NO: 5) obtained by adding a sequence for PCR ligation to the 5 ′ end sequence of the PPARγ2 gene, and restriction enzymes at the 3 ′ end sequence (no termination codon) of the PPARγ2 gene DNA (SEQ ID NO: 6) to which the sequence of the XhoI site was added was added as a primer, and a PCR ligation reaction was carried out under ordinary conditions to contain the TAP-PPARγ2 gene and specific restriction enzymes having XbaI-XhoI sites at both ends. The amplified DNA fragment was amplified.
[0062]
The TAP-PPARγ2 gene DNA fragment obtained above was cloned into a cloning vector pBluescript {II} (Stratagene) according to the attached protocol. First, the TAP-PPARγ2 DNA fragment and the cloning vector pBluescript {II} (Stratagene) were cut with restriction enzymes XbaI and XhoI according to a conventional method, ligated, and transformed into Escherichia coli JM109 (Takara Bio). The cells were transformed and grown at 37 ° C. on an LB medium plate (LB medium + 2% agar) containing ampicillin (100 g / ml). Some emerging colonies were cultured and plasmid extraction was performed under normal conditions. After the obtained plasmid DNA was digested with restriction enzymes XbaI and XhoI, it was confirmed by agarose electrophoresis whether the target DNA fragment was inserted into the plasmid.
[0063]
(2) Method for labeling proteins
First, using the plasmid DNA prepared in the above (1) as a template, a DNA (SEQ ID NO: 7) obtained by adding an SP6 promoter sequence and a translation enhancer region (Ω sequence) to the 5 ′ end of the 5 ′ terminal sequence of the TAP sequence, and a TAP sequence Using the DNA (SEQ ID NO: 8) consisting of the 3 ′ terminal sequence (with a termination codon) as a primer, the DNA was amplified by PCR and used as a template for transcription. The PCR used was AmpliTaq Gold Gold DNA Polymerase (Perkin-Elmer).
[0064]
Using the PCR amplification product as a template, mRNA was prepared according to the manual using an RNA synthesis kit (RiboMax Large Scale RNA Production System: manufactured by Promega) and purified using RNeasy mini Kit (Qiagen).
Next, Cy5 derivatized puromycin synthesized according to the method of Sasaki et al. (FEBS Letters Vol. 502, pp. 79-83,） 2001) was added to the wheat embryo cell-free protein synthesis system, and the overlay method (FEBS ｅｔ Letters, Vol. p.102-105, @ 2002). In a 96-well macroplate, 10 μL of a translation solution (24% (v / v) wheat germ extract, 24 mM HEPES / KOH, pH 7.8, 1.2 mM ATP, 0.25 mM GTP, 16 mM creatine Phosphate, 0.4 mg / ml creatine kinase, 2 mM dithiothreitol, 0.4 mM spermidine, 20 L-amino acids (each 0.3 mM), 2.7 mM magnesium acetate, 100 mM potassium acetate, Deacetylated tRNA, 0.05% NP-40, 0.005% sodium azide, 30 μM Cy5-puromycin, 20% pmol mRNA extracted from 50 μg / ml wheat germ was dispensed, and 50 μL of the above was dispensed thereon. Be careful with substrate solution (translation solution excluding mRNA and creatine kinase) Ku was layered, and reacted for 18 hours at 26 ℃.
[0065]
To 400 μL of the translated protein solution, an equal volume of PBS and 1% BSA was added, and 200 μL of 50% Rabbit IgG-immobilized agarose beads (Rabbit IgG Agarose (Sigma) (A-2909) lot # 81K9045 manufactured by Sigma) was added. The reaction was performed for 2 hours. Next, the agarose beads were washed three times with PBS, neutralized after elution with 200 μL of 50 mM acetic acid, and used as a C-terminal labeled protein.
[0066]
(3) Analysis of protein-protein molecular interaction using C-terminally labeled protein
Eu complex-labeled rabbit antibody (Perkin Elmer: LANCE Eu-W1024-labelled Anti-mouse IgG (AD0076) lot # 729041 6 Eu / protein, 2.2 μmol / L), phosphate buffer containing 1% {BSA} (PBS) was adjusted to 2.2 nmol / L, and 100 μL was dispensed. Next, 1 μL of rabbit immunoglobulin (Rabbit Gamma Globulin Fr II, Culver Bio-Products) adjusted to 10 mg / mL was added, and 10 μL of the C-terminal labeled protein obtained in the above (2) was added, followed by Perkin Elmer. Time-resolved fluorescence at 615 nm and 665 nm was measured with a time-resolved fluorescence measurement device ARVO SX 1420 multilabel counter L (protocol name = LANCE 615/665), and quantified by the ratio of the value at 665 nm to the value at 615 nm. . Table 1 shows the results.
[0067]
[Table 1]
[0068]
As is clear from Table 1 above, it was revealed that the interaction between the protein and the protein (the Eu complex-labeled rabbit antibody-the zz domain of protein A labeled with Cy5) can be specifically detected by this method.
[0069]
Example 2 Confirmation of quantitative reaction
The Eu complex-labeled rabbit antibody used in Example 1 was adjusted to 2.2 nmol / L in PBS containing 1% {BSA}, and 100 μL was dispensed. Next, after adding the C-terminal labeled protein prepared in Example 1 or a 100-fold diluted solution thereof (diluted with PBS containing 1% {BSA}), time-resolved 615 nm and 665 nm in the same manner as in Example 1. The fluorescence was measured and quantified by the ratio of the value at 665 nm to the value at 615 nm.
[0070]
Table 2 shows the results. In addition, when the addition amount is 0.4 μL or less in “C-terminal labeled protein addition amount” in Table 2, the amount is shown as a conversion amount from a 100-fold diluted solution. For example, in the case of 0.4 μL, 40 μL of a 100-fold diluted solution is actually added.
[0071]
[Table 2]
[0072]
From the results in Table 2, it became clear that the measured value was quantitatively obtained in proportion to the addition amount between 0.4 and 50 μL of the addition amount of the C-terminal labeled protein.
[0073]
Example 3 Example of analysis in the presence of contaminants
An experiment was performed using the C-terminal labeled protein prepared in the same manner as in Example 1.
The same Eu complex-labeled rabbit antibody as in Example 1 was adjusted to 2.2 nmol / L in PBS and 1% BSA, and 100 μL was dispensed. Then, after adding 20 μL of the pass fraction to the rabbit IgG-immobilized agarose beads when purified in the same manner as in Example 1, the C-terminal labeled protein, or a 100-fold diluted solution thereof (diluted with PBS, 1% 、 １BSA) was added. After addition, time-resolved fluorescence at 615 nm and 665 nm was measured in the same manner as in Example 1, and quantified by the ratio of the value at 665 nm to the value at 615 nm. Table 3 shows the results.
[0074]
[Table 3]
[0075]
From the results in Table 3, it was found that even in the presence of contaminants (translation reaction solution, unreacted fluorescent substance), quantitative measurement was possible according to the amount of C-terminal labeled protein added.
[0076]
[Sequence list]
[0077]
[0078]
[0079]
[0080]
[0081]
[0082]
[0083]
[0084]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram schematically showing an example of a reaction mode for detecting two-molecule interaction by the method of the present invention.
FIG. 2 is a diagram schematically showing an example of a reaction mode for detecting a three-molecule interaction by the method of the present invention. The symbols in the figure are the same as those in FIG.
FIG. 3 is a diagram schematically showing an example of a reaction mode for detecting a reaction for inhibiting a bimolecular interaction by the method of the present invention. The symbols in the figure are the same as those in FIG.
FIG. 4 is a diagram schematically showing an example of a reaction mode for detecting a three-dimensional structure behavior according to the method of the present invention. The symbols in the figure are the same as those in FIG.
