JP5733784B2 - Efficient synthesis of cDNA / mRNA-protein conjugates - Google Patents
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Description
本発明は進化工学的ディスプレイ技術における、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）−リンカー−タンパク質連結体を、効率よく合成する方法に関する。 The present invention relates to a method for efficiently synthesizing mRNA (messenger RNA) -linker-protein conjugates in evolutionary engineering display technology.
遺伝子工学の発展により、遺伝子配列を明らかにするという「ゲノム解析」の時代から遺伝子の発現産物による「機能解析」へと、開発研究のテーマは移行している。これは、遺伝子に依拠する遺伝形質は、遺伝子発現産物を介して、組織、器官及び人体等の機能として表れるものであるためである。こうした遺伝子発現産物の中でもタンパク質及びペプチドは、特に基礎的で重要な機能解析の対象である。
ポストゲノム時代においては、ゲノム解析により特定された遺伝子とその機能解明に基づき遺伝子標的をより明確にし、その作用機序を明らかにすることにより合理的な分子標的バイオ医薬（抗体医薬、ペプチド医薬）の開発が可能である。そして、近年注目されているのが核酸医薬の合成においても有効性が実証されている進化分子工学的手法である。
ペプチド医薬は、現在、広く使われるようになりつつある抗体医薬と同じ働きをしながら、抗体医薬よりも小さなタンパク質分子で同一の機能を発揮する医薬である。今後はその生産性の高さから、抗体医薬を置き換わっていくものと考えられている。
With the development of genetic engineering, the theme of development research has shifted from the era of “genome analysis” to clarify gene sequences to “functional analysis” using gene expression products. This is because a genetic trait that depends on a gene appears as a function of a tissue, an organ, a human body, or the like via a gene expression product. Among these gene expression products, proteins and peptides are objects of basic and important functional analysis.
In the post-genome era, rational molecular target biopharmaceuticals (antibody drugs, peptide drugs) by clarifying gene targets based on elucidation of genes identified by genome analysis and their functions, and clarifying their mechanism of action Development is possible. In recent years, an evolutionary molecular engineering technique that has been noted for its effectiveness in the synthesis of nucleic acid drugs has attracted attention.
Peptide drugs are drugs that exhibit the same function with smaller protein molecules than antibody drugs while performing the same functions as antibody drugs that are now widely used. In the future, it is considered that antibody drugs will be replaced due to its high productivity.
高機能分子の新規創出を目的とする進化工学は、ランダムな配列を有する莫大なペプチドあるいはタンパク質のライブラリー中から、タンパク質に限られない特定の分子に特異的に結合するペプチド等を選択することを目的とする。
とりわけ、配列のランダム化の元となる遺伝子とその発現産物であるタンパク質とを分子的に対応付ける、又はディスプレイするIn vitro virus（ＩＶＶ）法は、その中核をなす技術の一つであると言える。
ＩＶＶはタンパク質等の遺伝子発現産物の機能や表現型と、これに対応する遺伝子がコードされるmRNA等を当該分子上で１：１に対応付けることのできる分子である。ＩＶＶ法においては、それぞれランダムなタンパク質を有するいくつかのＩＶＶから、最も機能の高いタンパク質を選んだのちに、そこに連結されたmRNAを逆転写しＰＣＲ増幅等をすることでその配列を、最も機能の高い遺伝子の情報として検出することができる。
Evolutionary engineering for the purpose of creating new high-performance molecules is to select peptides that specifically bind to specific molecules, not limited to proteins, from a huge library of peptides or proteins with random sequences. With the goal.
In particular, it can be said that the in vitro virus (IVV) method that molecularly associates or displays a gene that is a source of sequence randomization and a protein that is an expression product thereof is one of the core technologies.
IVV is a molecule capable of associating 1: 1 the function and phenotype of a gene expression product such as a protein with the mRNA encoded by the corresponding gene. In the IVV method, the most functional protein is selected from several IVVs each having a random protein, and then the mRNA linked to the selected protein is reverse transcribed and subjected to PCR amplification, etc. Can be detected as high-gene information.
進化工学的手法の一つであるcDNAディスプレイ法ではDNAライブラリから始まり、転写、リンカーの連結、翻訳とタンパク質の連結、固相化、逆転写、固相からの切り離し、精製、スクリーニング、cDNAの増幅と変異導入（ライブラリ化）、プロモーターの連結を、一のサイクルとし、複数回のサイクルを繰り返すのが標準とされている。一方、ｍＲＮＡディスプレイ法では逆転写工程がスクリーニング工程の後に実行される。
このディスプレイ（対応付け）とスクリーニングのサイクルを繰り返すことで、前記の「スクリーニング」と分子への「変異導入」の回数を増やすことが出来るので、より優れた分子を創出し選び出すことが出来る。
進化工学的手法、及びＩＶＶ法ついては非特許文献１，２，３，７，８及び特許文献１，４，５，６に詳細が解説されている。
前記文献においてはｍＲＮＡディスプレイ法と呼ばれる方法が採られてきたが、近年のＩＶＶ法の進展の中で、In vitro virus合成後の分子の安定性向上のためｃＤＮＡディスプレイ法が開発された。これについては非特許文献４，５，６，９及び特許文献２，３，７に詳細が解説されている。
The cDNA display method, which is one of the evolutionary engineering methods, starts with a DNA library, and includes transcription, linker linking, translation and protein linking, solid phase immobilization, reverse transcription, separation from the solid phase, purification, screening, cDNA amplification. It is standard to introduce mutations (library) and promoter ligation in one cycle and repeat multiple cycles. On the other hand, in the mRNA display method, the reverse transcription step is performed after the screening step.
By repeating this display (association) and screening cycle, the number of “screening” and “mutation introduction” to the molecule can be increased, so that a better molecule can be created and selected.
Details of the evolutionary engineering method and the IVV method are described in Non-Patent Documents 1, 2, 3, 7, and 8 and Patent Documents 1, 4, 5, and 6.
In the above literature, a method called mRNA display method has been adopted, but in recent progress of IVV method, cDNA display method has been developed to improve the stability of molecules after in vitro virus synthesis. This is described in detail in Non-Patent Documents 4, 5, 6, and 9 and Patent Documents 2, 3, and 7.
またＩＶＶに関連して、そのタンパク質の機能解析は、例えば、タンパク質−タンパク質相互作用やタンパク質−核酸相互作用等の試験による生化学的機能分析を通して行われている。
このようなタンパク質−タンパク質相互作用の解析法としては、イーストツーハイブリッド法、ファージディスプレイ法、ＧＳＴ−融合タンパク質プルダウン法、免疫共沈法等が古くから知られている。一方、タンパク質−核酸相互作用の解析法としては、電気泳動移動度シフトアッセイ法、DNaseIフットプリント法、メチル化緩衝法等が知られている。
合成されるＩＶＶはこれらの試験に要求されるタンパク質と同等の品質を満たすものでなくてはならない。
Further, in relation to IVV, the functional analysis of the protein is performed through a biochemical functional analysis by a test such as a protein-protein interaction or a protein-nucleic acid interaction.
As an analysis method of such protein-protein interaction, the yeast two-hybrid method, the phage display method, the GST-fusion protein pull-down method, the co-immunoprecipitation method and the like have been known for a long time. On the other hand, as methods for analyzing protein-nucleic acid interactions, an electrophoretic mobility shift assay method, a DNase I footprint method, a methylation buffer method, and the like are known.
The synthesized IVV must meet the same quality as the protein required for these tests.
前記ＩＶＶ法においては、遺伝子をコードするｍＲＮＡに対してタンパク質結合部位を有するリンカー（分子間連結のための分子）を連結することで、当該ｍＲＮＡから合成されたタンパク質がリンカーに結合し、捕捉される。このため、１分子ごとに遺伝子と、遺伝子発現産物とを対応させることができることが知られている。
タンパク質をリンカーにトラップするには、翻訳合成系において、アミノアシルｔＲＮＡアナログを有するリンカーを伸長タンパク質鎖中に取り込ませる手法等が使われる。こうしたアナログとしてはピューロマイシン（Puromycin）等があり、これらにより修飾された核酸構築物を利用することでＩＶＶ法を実施することが可能となる。
In the IVV method, a linker having a protein binding site (a molecule for intermolecular linkage) is linked to mRNA encoding a gene, so that a protein synthesized from the mRNA is bound to the linker and captured. The For this reason, it is known that a gene and a gene expression product can be made to correspond for every molecule.
In order to trap a protein in a linker, a technique of incorporating a linker having an aminoacyl tRNA analog into an extended protein chain is used in a translation synthesis system. Such analogs include puromycin and the like, and the IVV method can be carried out by using a nucleic acid construct modified by these.
従来、ｍＲＮＡとピューロマイシン・リンカーとを連結する工程では、反応効率の点から、微量のｍＲＮＡに対してピューロマイシン・リンカーを過剰に投入し、精製の際にこれを除去するという作業を行っていた。これらは、その後の翻訳反応において、タンパク質合成、及び連結体形成の阻害要因となると考えられていたためである（非特許文献１〜１０，特許文献１〜８参照）。これらの除去は、フェノール・クロロホルム抽出や、ゲルろ過、イオン交換、ＯＤＳ逆相カラム、ＨＰＬＣその他のカラムを用いた精製、シリカメンブレンや限外濾過等の濾過、アクリルアミドゲル切出抽出、透析その他の種々の手法を用いて行われてきている。
また、リンカーとｍＲＮＡとを紫外光照射によるクロスリンクで連結させ、ライゲーション反応を回避し、後の精製工程を省略する方法が提案されている（非特許文献３）
一方で、あらかじめリンカーを固相に固定しておき、バッファー交換によって反応液を除去して精製を回避する方法も開発されている（特許文献３，非特許文献９）。
Conventionally, in the step of linking mRNA and puromycin linker, from the viewpoint of reaction efficiency, an excessive amount of puromycin linker is added to a very small amount of mRNA, and this is removed during purification. It was. These are because it was thought that it became an inhibitor of protein synthesis and the formation of a conjugate in subsequent translation reactions (see Non-Patent Documents 1 to 10 and Patent Documents 1 to 8). These removals include phenol / chloroform extraction, gel filtration, ion exchange, ODS reverse phase column, HPLC and other column purification, silica membrane and ultrafiltration filtration, acrylamide gel excision extraction, dialysis and other Various methods have been used.
In addition, a method has been proposed in which a linker and mRNA are linked by ultraviolet light irradiation cross-linking to avoid a ligation reaction and to omit the subsequent purification step (Non-patent Document 3).
On the other hand, a method has been developed in which a linker is fixed to a solid phase in advance and the reaction solution is removed by buffer exchange to avoid purification (Patent Document 3, Non-Patent Document 9).
従来の方法は、１分子ごとに遺伝子と、遺伝子発現産物とを対応させることができるという点では優れたものである。しかし、以下のような問題点があった。
すなわち、系に投入するリンカー濃度を上げるとｍ−ＲＮＡとリンカーとの連結体の収量は増加するが、リンカー同士やリンカーとｍＲＮＡとの凝集を招くため、投入できる濃度には限界がある。また連結効率を考えると、ｍＲＮＡとリンカーの投入量とは、最大でｍＲＮＡ：リンカー比＝１：２００程度とする必要があり、未濃縮の連結体を得るのに十分な濃度のｍＲＮＡが投入できなかった。
さらに、反応生成物であるｍＲＮＡ−リンカー連結体の濃縮が必須であり、上記各カラム精製後の抽出、エタノール沈殿、限外濾過、エバポレーション等が行われてきた。
こうした精製は操作が煩雑で手間がかかるだけでなく、ＩＶＶ法で得られた多種多様なペプチドのスクリーニングを自動化するには適していない。
The conventional method is excellent in that a gene and a gene expression product can correspond to each molecule. However, there were the following problems.
That is, when the linker concentration to be added to the system is increased, the yield of the conjugate of m-RNA and linker increases, but the concentration at which the linker can be added is limited because it causes aggregation between the linkers and the linker and mRNA. Considering the ligation efficiency, the input amount of mRNA and linker must be at most about mRNA: linker ratio = 1: 200, so that a sufficient concentration of mRNA can be input to obtain an unconcentrated conjugate. There wasn't.
Furthermore, it is essential to concentrate the mRNA-linker conjugate that is a reaction product, and extraction, ethanol precipitation, ultrafiltration, evaporation and the like after the above column purification have been performed.
Such purification is not only complicated and time-consuming, but also not suitable for automating the screening of a wide variety of peptides obtained by the IVV method.
一方、タンパク質の収率に影響し得る未反応ｍＲＮＡについても、リンカーと同様に、除去することが望ましい。あらかじめリンカーを固相に固定しておく従来の方法では、未反応ｍＲＮＡを除去することはできるが、収量が著しく減少するという問題を有しており、多様なペプチドスクリーニングの需要に必ずしも応えられるものとは言えない。このように、液相中にて未反応ｍＲＮＡのみを除去する有効な手段は現在見出されていない。
これに対し、リンカーとｍＲＮＡの連結にライゲーション反応ではなく、紫外光照射によるクロスリンクを用いる方法が提案されている。この方法は精製工程を省略することができる点で特に優れたものである。しかし、この方法では、リンカーの構造がさらに複雑になるため、製造コストを上昇させるほか、紫外光照射によってｍＲＮＡが損傷されることもあるという問題がある。
さらに、上述したように、進化工学的手法ではディスプレイとスクリーニングの回数を増やすほど優れた分子種を得られるため、上述した一連のサイクルは出来るだけ多いことが必要とされる。そしてサイクル中の作業工程数は少なければ少ないほどよく、特に人が関与する作業は少ないほど良い。
しかしながら、上記進化工学的手法には省略できない化学反応工程が数多く含まれており、サイクル全体の作業工程の短縮及び省力化は困難であった。
On the other hand, it is desirable to remove unreacted mRNA that may affect the yield of protein as well as the linker. In the conventional method in which the linker is fixed to the solid phase in advance, unreacted mRNA can be removed, but it has a problem that the yield is remarkably reduced, and can always meet the demand for various peptide screenings. It can not be said. Thus, an effective means for removing only unreacted mRNA in the liquid phase has not been found at present.
On the other hand, a method has been proposed that uses a cross-link by ultraviolet light irradiation instead of a ligation reaction for the linker and mRNA. This method is particularly excellent in that the purification step can be omitted. However, this method has a problem that the structure of the linker is further complicated, resulting in an increase in manufacturing cost and that mRNA may be damaged by ultraviolet light irradiation.
Further, as described above, since the evolutionary engineering method can obtain better molecular species as the number of displays and screenings is increased, the series of cycles described above needs to be as many as possible. And the fewer the number of work steps in the cycle, the better, and the less work that people are involved in.
However, the evolutionary engineering method includes many chemical reaction steps that cannot be omitted, and it has been difficult to shorten the work steps and save labor in the entire cycle.
以上のような観点から、ｍＲＮＡとリンカーとの連結後の精製及び濃縮に要する手間と時間及びコストを大幅に削減することで、実用的なハイスループットスクリーニングの開発を促す、前記連結体の生成方法等に対する社会的な要請があった。
さらに、上記ペプチド医薬等の開発促進のニーズに応えるためにペプチドスクリーニング技術の発展と普及が必要とされている。このため、次世代医薬としてのリードペプチドの探索手法（ペプチドスクリーニング）においては、自動化及び省力化に対する強い要請があった。
From the above viewpoints, the method for producing the ligated body that facilitates development of practical high-throughput screening by greatly reducing the labor, time and cost required for purification and concentration after ligation of mRNA and linker There was a social request for
Furthermore, the development and popularization of peptide screening techniques are required in order to meet the development promotion needs of the above-mentioned peptide drugs and the like. For this reason, in the search method (peptide screening) of the lead peptide as a next generation medicine, there was a strong demand for automation and labor saving.
すなわち本発明の第１の態様は、液相中における個々の分子の反応において、タンパク質結合部位を有し、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡアナログならびにＤＮＡを含む主鎖を備えるリンカーと、所定の3'末端近傍配列を有するmRNAとを、所定の割合で混合し、その後ライゲーション反応により結合させてmRNA−リンカー連結体を含むライゲーション溶液を得る工程と；無細胞翻訳系に前記ライゲーション溶液をそのまま投入して、前記mRNA−リンカー連結体中の前記所定の配列を有するmRNAを翻訳してタンパク質を合成する工程と；前記タンパク質が、前記mRNA−リンカー連結体中の前記タンパク質結合部位に結合する工程と；を備える、mRNA−リンカー−タンパク質連結体の生成方法である。 That is, according to the first aspect of the present invention, in the reaction of individual molecules in the liquid phase, a linker having a protein binding site and comprising a main chain containing RNA and / or DNA analog and DNA, and a predetermined 3 ′ end A step of mixing mRNA having a neighboring sequence at a predetermined ratio, and then binding by a ligation reaction to obtain a ligation solution containing an mRNA-linker conjugate; and adding the ligation solution as it is to a cell-free translation system; Translating the mRNA having the predetermined sequence in the mRNA-linker conjugate to synthesize a protein; and binding the protein to the protein binding site in the mRNA-linker conjugate. , A method for producing an mRNA-linker-protein conjugate.
前記所定の割合は、前記リンカー：前記mRNA＝３：１〜１：６であることが好ましく、前記リンカー：前記mRNA＝１：１〜１：１．５であることが特に好ましい。前記主鎖の鎖長は１６〜６０塩基であることが好ましく、２１〜３８塩基であることが特に好ましい。
前記リンカーの主鎖は、5'位がリン酸化された主鎖5'末端部と、第１及び第２の切断部位と、前記第１及び第２の切断部位の間に位置し、固相との間の結合形成に使用される固相結合部位とを備え、前記リンカーの主鎖、側鎖及び前記mRNAからなる群から選ばれるいずれとも非相補的な配列を有する、主鎖5'末端近傍部と、前記mRNAの3'末端近傍配列と相補的な配列を有する主鎖3'末端側領域部と、を備えることが好ましい。
前記リンカーは核酸アナログとＤＮＡとを含む側鎖をさらに備え、前記主鎖は主鎖3'末端側領域部に側鎖連結部位をさらに備え、かつ前記主鎖の3'末端まで前記mRNAの3'末端近傍配列と相補的な配列をさらに有し；前記側鎖は、5'末端に位置する前記主鎖連結部位と、3'末端に位置する前記タンパク質結合部位とを有することが特に好ましい。
前記切断部位は、制限酵素認識配列を有することが好ましい。前記mRNA−リンカー−タンパク質連結体の生成方法は、前記固相結合部位を介して固相と結合させる工程と、前記第１及び第２の切断部位を制限酵素で切断する工程とをさらに備えることが好ましい。前記制限酵素はPvuIIであることが好ましい。
前記切断部位はまた、グアノシンを有することが好ましい。前記mRNA−リンカー−タンパク質連結体の生成方法は、前記固相結合部位を介して固相と結合させる工程と、前記第１及び第２の切断部位をＲＮＡ切断酵素で切断する工程とをさらに備えることが好ましい。前記ＲＮＡ切断酵素はリボヌクレアーゼＴ１であることが特に好ましい。
The predetermined ratio is preferably the linker: mRNA = 3: 1 to 1: 6, and particularly preferably the linker: mRNA = 1: 1 to 1: 1.5. The chain length of the main chain is preferably 16 to 60 bases, particularly preferably 21 to 38 bases.
The linker main chain is located between the 5 ′ end phosphorylated at the 5 ′ position, the first and second cleavage sites, and the first and second cleavage sites, and a solid phase. A 5 ′ end of the main chain having a non-complementary sequence selected from the group consisting of the main chain, side chain and the mRNA of the linker. It is preferable to comprise a vicinity portion and a main chain 3 ′ end side region portion having a sequence complementary to the 3 ′ end vicinity sequence of the mRNA.
The linker further comprises a side chain containing a nucleic acid analog and DNA, the main chain further comprises a side chain linking site in the main chain 3 ′ end side region, and up to the 3 ′ end of the main chain. It is particularly preferred that the sequence further comprises a sequence complementary to a sequence near the end; the side chain has the main chain linking site located at the 5 ′ end and the protein binding site located at the 3 ′ end.
The cleavage site preferably has a restriction enzyme recognition sequence. The method for producing the mRNA-linker-protein conjugate further comprises a step of binding to a solid phase via the solid phase binding site and a step of cleaving the first and second cleavage sites with a restriction enzyme. Is preferred. The restriction enzyme is preferably PvuII.
It is preferred that the cleavage site also has guanosine. The method for producing the mRNA-linker-protein conjugate further comprises a step of binding to a solid phase via the solid phase binding site, and a step of cleaving the first and second cleavage sites with an RNA cleaving enzyme. It is preferable. The RNA cleaving enzyme is particularly preferably ribonuclease T1.
本発明の第２の態様は、液相中における個々の分子の反応において、タンパク質結合部位を有し、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡアナログならびにＤＮＡを含む主鎖を備えるリンカーと、所定の3'末端近傍配列を有するmRNAとを、所定の割合で混合し、その後ライゲーション反応により結合させてmRNA−リンカー連結体を含むライゲーション溶液を得る工程と；無細胞翻訳系に前記ライゲーション溶液をそのまま投入して、前記mRNA−リンカー連結体中の前記所定の配列を有するmRNAを翻訳してタンパク質を合成する工程と；前記タンパク質が、前記mRNA−リンカー連結体中の前記タンパク質結合部位に結合し、mRNA−リンカー−タンパク質連結体を生成する工程と；mRNA−リンカー−タンパク質連結体を前記リンカーの備える固相結合部位を介して固相と結合させる工程と；前記主鎖の3'末端を反応開始点とし、前記mRNAを鋳型として、固相上で逆転写反応を行ってｃＤＮＡ鎖を形成させる工程と；前記主鎖の備える第１及び第２の切断部位を、制限酵素又はＲＮＡ切断酵素で切断する工程と；を備えるmRNA−リンカー−タンパク質−ｃＤＮＡ連結体の生成方法である。 In a second aspect of the present invention, in the reaction of individual molecules in a liquid phase, a linker having a protein binding site and comprising a main chain containing RNA and / or a DNA analog and DNA, and a vicinity of a predetermined 3 ′ end A step of mixing mRNA having a sequence at a predetermined ratio and then binding by a ligation reaction to obtain a ligation solution containing an mRNA-linker conjugate; and adding the ligation solution as it is to a cell-free translation system, translating mRNA having the predetermined sequence in the mRNA-linker conjugate to synthesize a protein; and binding the protein to the protein binding site in the mRNA-linker conjugate, and mRNA-linker-protein Generating a conjugate; and binding the mRNA-linker-protein conjugate to a solid phase via a solid phase binding site comprising said linker. A step of performing a reverse transcription reaction on a solid phase using the 3 ′ end of the main chain as a reaction start point and the mRNA as a template to form a cDNA chain; a first and a second provided in the main chain; And cleaving the two cleavage sites with a restriction enzyme or an RNA cleavage enzyme; and a method for producing an mRNA-linker-protein-cDNA conjugate.
前記リンカーは核酸アナログとＤＮＡとを含む側鎖をさらに備え、前記リンカーの主鎖は、5'位がリン酸化された主鎖5'末端部と、前記第１及び第２の切断部位と、前記第１及び第２の切断部位の間に位置し、固相との間の結合形成に使用される前記固相結合部位とを備え、前記リンカーの主鎖、側鎖及び前記mRNAからなる群から選ばれるいずれとも非相補的な配列を有する、主鎖5'末端近傍部と、側鎖連結部位を備え、前記主鎖の3'末端まで前記mRNAの3'末端近傍配列と相補的な配列を有する主鎖3'末端側領域部と、を備えることが好ましい。また、前記側鎖は、5'末端に位置する前記主鎖連結部位と、3'末端に位置する前記タンパク質結合部位とを有することが好ましい。 The linker further comprises a side chain containing a nucleic acid analog and DNA, the main chain of the linker is a main chain 5 ′ end phosphorylated at the 5 ′ position, the first and second cleavage sites, The solid phase binding site located between the first and second cleavage sites and used to form a bond with the solid phase, the group consisting of the main chain of the linker, the side chain and the mRNA A non-complementary sequence selected from any of the above, comprising a portion near the 5 ′ end of the main chain and a side chain linking site, and a sequence complementary to the sequence near the 3 ′ end of the mRNA up to the 3 ′ end of the main chain It is preferable that the main chain 3 ′ terminal region region having The side chain preferably has the main chain linking site located at the 5 ′ end and the protein binding site located at the 3 ′ end.
本発明がなされるまでは、ライゲーション反応後の精製濃縮工程は省略することが出来ないとするのが、ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡディスプレイ技術における技術常識であった。本発明の方法に拠ればこれを省略することが可能になる。
本発明の効果は、ＩＶＶすなわちmRNA−リンカー−タンパク質連結体の効率的な生成を可能とすることであり、さらにｍＲＮＡディスプレイ法、ｃＤＮＡディスプレイ法、分子進化学的手法全体にとっての工程の簡略化を可能にすることである。
Until the present invention was made, it was common technical knowledge in the cDNA / mRNA display technology that the purification and concentration step after the ligation reaction cannot be omitted. According to the method of the present invention, this can be omitted.
The effect of the present invention is to enable efficient generation of IVV, that is, mRNA-linker-protein conjugate, and further simplifies the process for the entire mRNA display method, cDNA display method, and molecular evolutionary method. Is to make it possible.
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
１．連結体生成用リンカー
本発明において、「リンカー」とは、ＩＶＶ法において用いられる、ｍＲＮＡ−リンカー連結体（連結体Ａ）、ｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体（連結体Ｂ）及びｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質−ｃＤＮＡ連結体からなる群から選ばれるいずれかの連結体を生成する際に使用するリンカーのことをいう。
本発明において使用するリンカーは、ＤＮＡ（すなわちデオキシリボ核酸単量体）、ＲＮＡ（すなわちリボ核酸単量体、例えばｒＧ：グアノシン）、及びＤＮＡアナログからなる群から選ばれる少なくとも２以上の物質によって形成される主鎖を含み、この主鎖中に上記連結体を固相部位に結合するための固相結合部位と、前記固相結合部位を挟む位置に設けられた一対の切断部位を有することを特徴とする。ここで、ＤＮＡアナログはBiotin-dT、Fluorescein-dT等を含むものとする。
本発明において使用するリンカーは、全体として、柔軟性があり、親水性であり、かつ特異構造を形成する可能性の少ない配列を有するように、設計することが好ましい。
The present invention is described in further detail below.
1. Linker for producing a conjugate In the present invention, “linker” refers to an mRNA-linker conjugate (conjugate A), mRNA-linker-protein conjugate (conjugate B), and mRNA-linker-protein used in the IVV method. -A linker used in producing any one of the linkages selected from the group consisting of cDNA linkages.
The linker used in the present invention is formed by at least two or more substances selected from the group consisting of DNA (ie, deoxyribonucleic acid monomer), RNA (ie, ribonucleic acid monomer, such as rG: guanosine), and DNA analog. The main chain has a solid phase binding site for binding the conjugated body to the solid phase site, and a pair of cleavage sites provided at positions sandwiching the solid phase binding site. And Here, the DNA analog includes Biotin-dT, Fluorescein-dT, and the like.
The linker used in the present invention is preferably designed so as to have a sequence that is flexible, hydrophilic, and less likely to form a specific structure as a whole.
本発明の詳細な説明において「液相反応」とは、通常の試験管、微量サンプルチューブ、マイクロウェルプレート等の反応容器内の均一な反応液中での反応を指すものとする。また、「固相反応」とは前記同様の反応容器内における反応ではあるが、固相ビーズや容器底面等な固相表面に反応させるべき分子を結合し、固相表面上において集中的に反応を行うことを指すものとする。
ここで「ｍＲＮＡの有する所定の配列」には、遺伝子をコードする配列、連結体形成、翻訳反応促進に必要な配列その他の配列が含まれ、特に限定されない。
また、本発明の詳細な説明において「アミノアシルｔＲＮＡ３’末端アナログ」とは、その３’末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似し、翻訳系でタンパク質の合成が行われた際に、伸長中のペプチド鎖のＣ末端に結合する能力を有する化合物をいう。
In the detailed description of the present invention, “liquid phase reaction” refers to a reaction in a uniform reaction solution in a reaction vessel such as a normal test tube, a minute sample tube, or a microwell plate. The “solid phase reaction” is a reaction in the same reaction vessel as described above, but the molecules to be reacted are bonded to the solid phase surface such as the solid phase beads or the bottom of the vessel, and the reaction is concentrated on the solid phase surface. Refers to doing.
Here, the “predetermined sequence possessed by mRNA” includes a sequence encoding a gene, formation of a ligated body, a sequence necessary for promoting a translation reaction and other sequences, and is not particularly limited.
In the detailed description of the present invention, the term “aminoacyl tRNA 3 ′ terminal analog” means that the 3 ′ terminal is similar to aminoacyl tRNA in the chemical structure skeleton and is being extended when protein synthesis is performed in the translation system. A compound having the ability to bind to the C-terminus of a peptide chain.
また、本発明の詳細な説明において「Ｘを有するＹ部位」の文言は、以下のように定義される。ここで、Ｘは、FITCその他の蛍光色素、RnaseT1その他の酵素の基質等の機能性分子を表わし、Ｙは機能性分子Ｘが発揮する機能を表わす。「Ｘを有するＹ部位」は、Ｘが結合しているか、Ｘを含んでいることで、機能Ｙを発揮する一塩基〜数十塩基からなるリンカー中の特定の配列を指す。前記特定の配列は、機能性分子Ｘ、Ｘに結合する修飾基のみで構成されるものであってもよく、前記特定の配列に含まれる塩基には、核酸アナログ等も含まれる。
一例を挙げると、「ｒＧを有する切断部位」とは、グアノシン（ｒＧ）を含むことにより、リボヌクレアーゼＴ１がｒＧを特異的に認識してホスホジエステル結合を加水分解することができる部位を指す。
Further, in the detailed description of the present invention, the term “Y portion having X” is defined as follows. Here, X represents a functional molecule such as FITC or other fluorescent dye, RnaseT1 or other enzyme substrate, and Y represents a function exhibited by the functional molecule X. The “Y site having X” refers to a specific sequence in a linker consisting of one to several tens of bases that exerts the function Y when X is bound or contains X. The specific sequence may be composed only of a functional molecule X, a modifying group that binds to X, and the base included in the specific sequence includes a nucleic acid analog or the like.
As an example, the “cleavage site having rG” refers to a site where ribonuclease T1 can specifically recognize rG and hydrolyze a phosphodiester bond by including guanosine (rG).
また、本発明中で、リンカー主鎖はＲＮＡ及び／又はＤＮＡアナログならびにＤＮＡを含む主鎖を備えるものである。本発明の方法ではリンカーの主鎖が、その全長に対して、少なくとも６０％以上が、１本鎖ＤＮＡと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡアナログとで構成されていることが好ましい。より好ましくはリンカー主鎖の７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上、１本鎖ＤＮＡと、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡアナログとで構成されている。
本発明において使用するリンカーでは、種々の反応工程での反応性、上述した連結体の生成効率などを考慮して主鎖の長さを決定するが、好ましくは１６〜６０ｍｅｒであることが好ましく、より好ましくは２１〜３８ｍｅｒである。なお、本発明において使用するリンカーは、後述するような公知の化学合成の手法を用いて合成することができる。
図１を用いて本発明に用いるリンカーの主鎖の構造を説明する。主鎖２００には主鎖5'末端部２０１が存在する。主鎖5'末端近傍部２０２は主鎖5'末端部２０１を含まない領域であり、主鎖3'末端側領域部２０３は主鎖3'末端部を含まない領域である。なお、図１は上記各部の塩基長を限定したものではない。
In the present invention, the linker main chain includes an RNA and / or DNA analog and a main chain containing DNA. In the method of the present invention, it is preferable that at least 60% or more of the main chain of the linker is composed of single-stranded DNA and RNA and / or DNA analog. More preferably, it is composed of 70% or more, more preferably 80% or more, most preferably 90% or more of the linker main chain, and single-stranded DNA and RNA and / or DNA analog.
In the linker used in the present invention, the length of the main chain is determined in consideration of the reactivity in various reaction steps, the production efficiency of the above-mentioned linked body, etc., preferably 16 to 60 mer, More preferably, it is 21-38mer. The linker used in the present invention can be synthesized using a known chemical synthesis method as described later.
The structure of the main chain of the linker used in the present invention will be described with reference to FIG. The main chain 200 has a main chain 5 ′ end 201. The main chain 5 ′ terminal vicinity 202 is a region not including the main chain 5 ′ terminal 201, and the main chain 3 ′ terminal region 203 is a region not including the main chain 3 ′ terminal. In addition, FIG. 1 does not limit the base length of each said part.
２．所定の配列を有するｍＲＮＡ
本発明で用いるｍＲＮＡは、配列未知のもの、配列既知のものの双方を含む。前記配列は、ゲノム情報として自然界に存在する配列、又は人為的に設計した配列のいずれであってもよく、その構造は特に限定されない。
上記連結体を用いて、配列既知のタンパク質に結合する物質を探索又は定量する場合には、当該タンパク質の遺伝子をコードするｍＲＮＡを用いることができる。逆に、上記連結体を用いて、配列未知のタンパク質の配列を特定の機能に関連づけて解析する場合には、配列未知の遺伝子をコードするｍＲＮＡを用いることができる。
2. MRNA having a predetermined sequence
The mRNA used in the present invention includes both those with unknown sequences and those with known sequences. The sequence may be either a sequence existing in the natural world as genome information or an artificially designed sequence, and its structure is not particularly limited.
In the case of searching for or quantifying a substance that binds to a protein with a known sequence using the above-mentioned conjugate, mRNA encoding a gene of the protein can be used. On the other hand, when the sequence of a protein with an unknown sequence is analyzed in association with a specific function using the above ligated product, mRNA encoding a gene with an unknown sequence can be used.
こうしたｍＲＮＡとしては、例えば、配列既知の各種レセプタータンパク質をコードするｍＲＮＡ、各種抗体又はその断片をコードするｍＲＮＡ、各種酵素をコードするｍＲＮＡ、各種遺伝子ライブラリー中のＤＮＡから転写される配列未知のｍＲＮＡ、有機合成によってランダムに合成された配列を有するＤＮＡから転写されたランダムな配列を有するｍＲＮＡ、ＰＣＲ法を利用したランダム変異の挿入により配列未知のタンパク質をコードするようになったＤＮＡから転写されるｍＲＮＡその他のｍＲＮＡ等を挙げることができ、これらの中から選択される。
本発明で用いるｍＲＮＡは、自然界に存在するｍＲＮＡや、ｍＲＮＡ特有の構造に限定されるものではないが、タンパク質の合成効率上、５’末端に７−メチル化グアノシンキャップ構造又は３’末端にポリＡ尾部構造の少なくとも一方を持っていることが好ましい。翻訳の開始を促進するKozak配列や、Shine-Dlgarno配列を有することが、さらに好ましい。
ｍＲＮＡはin vitro転写反応、化学合成、生体・細胞・微生物からの抽出などの所与の方法を用いて得ることができる。リンカーとの連結及び無細胞翻訳の反応効率の点から、in vitro転写反応を用いて生成することが好ましい。
本発明で用いるｍＲＮＡの長さは、反応効率の面から50〜1,000塩基であることが好ましく、200〜500塩基であることが反応効率が最も高いことから、さらに好ましい。
Examples of such mRNA include mRNA encoding various receptor proteins with known sequences, mRNA encoding various antibodies or fragments thereof, mRNA encoding various enzymes, and mRNA of unknown sequence transcribed from DNA in various gene libraries. Transcribed from DNA having random sequence transcribed by organic synthesis, mRNA having random sequence transcribed from DNA encoding random protein by insertion of random mutation using PCR method mRNA and other mRNAs can be mentioned and selected from these.
The mRNA used in the present invention is not limited to mRNA existing in nature or a structure peculiar to mRNA. However, for the efficiency of protein synthesis, a 7-methylated guanosine cap structure at the 5 ′ end or a polymorph at the 3 ′ end. It is preferable to have at least one of the A tail structure. More preferably, it has a Kozak sequence that promotes the initiation of translation or a Shine-Dlgarno sequence.
mRNA can be obtained using a given method such as in vitro transcription reaction, chemical synthesis, extraction from living organisms, cells or microorganisms. From the viewpoint of the reaction efficiency of linker linking and cell-free translation, it is preferable to produce the linker using an in vitro transcription reaction.
The length of mRNA used in the present invention is preferably 50 to 1,000 bases from the viewpoint of reaction efficiency, and more preferably 200 to 500 bases because reaction efficiency is the highest.
３．ハイブリダイゼーション及び連結方法
ｍＲＮＡとリンカーとの連結は、公知の手法を用いて、直接的又は間接的に、化学的又は物理的に行うことができる。例えば、ｍＲＮＡの３’末端にリンカーの末端と相補的な配列を設けておくと、両者をハイブリダイゼーションによって連結することができる。また、末端でのライゲーション反応、又は末端を含む各部分でのソラレンを用いた光架橋反応により化学結合によって連結することもできる。
本発明をｍＲＮＡディスプレイ法の中で実施する場合、リンカーと前記ｍＲＮＡとの連結は、ライゲーション反応により行われることが好ましい。ｍＲＮＡとリンカーとの化学結合反応を促進するため、連結予定部位同士がハイブリダイゼーションしたことに起因して、近接していることが好ましい（アニーリング）。
アニーリングでは、第三の核酸分子がｍＲＮＡの３’末端近傍及びリンカーの５’末端近傍の両者に相補鎖を形成してもよい（Splint DNA法）が、ｍＲＮＡの３’末端近傍とリンカーの５’末端近傍とが相補鎖を形成していることがより好ましい（Y-ligation法）（非特許文献６）。より具体的には、ｍＲＮＡの３’末端近傍とリンカーの５’末端近傍とが、数塩基〜数十塩基に渡って相補鎖を形成することが好ましい。また、リンカーの５’末端とｍＲＮＡ中途配列とが相補鎖を形成することも、ライゲーションによる連結を安定させる上でさらに好ましい。ただし、上記要件は、末端塩基に連なる数塩基が必ず相補鎖を形成していることや、相補鎖を形成する領域が必ず連続していることを要求するものではない。ｃＤＮＡディスプレイ法の中で好適に使用できるリンカーの条件は後述する。
3. Hybridization and Linkage Method The linkage between mRNA and linker can be performed directly or indirectly, chemically or physically, using a known technique. For example, if a sequence complementary to the end of the linker is provided at the 3 ′ end of mRNA, both can be linked by hybridization. Moreover, it can also link | link by a chemical bond by the ligation reaction by a terminal, or the photocrosslinking reaction using the psoralen in each part containing a terminal.
When the present invention is carried out in the mRNA display method, the linker and the mRNA are preferably linked by a ligation reaction. In order to promote the chemical binding reaction between the mRNA and the linker, the sites to be linked are preferably close to each other due to hybridization (annealing).
In annealing, the third nucleic acid molecule may form complementary strands both near the 3 ′ end of the mRNA and near the 5 ′ end of the linker (Splint DNA method). It is more preferable that the vicinity of the end forms a complementary strand (Y-ligation method) (Non-patent Document 6). More specifically, it is preferable that the vicinity of the 3 ′ end of mRNA and the vicinity of the 5 ′ end of the linker form a complementary strand over several bases to several tens of bases. In addition, it is more preferable that the 5 ′ end of the linker and the mRNA intermediate sequence form a complementary strand in order to stabilize the ligation by ligation. However, the above requirement does not require that several bases connected to the terminal base always form a complementary strand, or that the region forming the complementary strand is always continuous. The linker conditions that can be suitably used in the cDNA display method will be described later.
本発明において、「ライゲーション」又は「ライゲーション反応」は、酵素により促進される反応をいう。こうした酵素は、酵素番号の６群にあたるリガーゼであり、ＤＮＡやＲＮＡのライゲーション反応については、EC6.5.1.1（ATP依存性DNAリガーゼ）、EC6.5.1.2（NAD+依存性DNAリガーゼ）、EC6.5.1.3（RNAリガーゼ）等を利用することができる。ＲＮＡ／ＤＮＡ間ライゲーションを行うＲＮＡリガーゼのほか、ＲＮＡ間及びＲＮＡ／ＤＮＡ間のライゲーションを行うＤＮＡリガーゼを利用することもできる。
具体的には、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ又はTS2126耐熱性ファージ由来ＤＮＡリガーゼを好適に利用することができ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを利用することが、連結効率の理由からさらに好ましい。
In the present invention, “ligation” or “ligation reaction” refers to a reaction promoted by an enzyme. These enzymes are ligases corresponding to the 6 groups of enzyme numbers. For DNA and RNA ligation reactions, EC6.5.1.1 (ATP-dependent DNA ligase), EC6.5.1.2 (NAD + -dependent DNA ligase), EC6.5.1.3 (RNA ligase) can be used. In addition to RNA ligase that performs RNA / DNA ligation, it is also possible to use DNA ligase that performs ligation between RNA and RNA / DNA.
Specifically, T4 RNA ligase or TS2126 thermostable phage-derived DNA ligase can be preferably used, and it is more preferable to use T4 RNA ligase for reasons of ligation efficiency.
ライゲーション反応前のアニーリングは、60〜100℃にて2〜60分間、ヒートブロック、アルミブロック、ウォーターバスその他の加温用器具にて温めた後、室温で2〜60分間放置して液温を穏やかに低下させ、さらに-5〜10℃に冷却して行うのが好ましい。例えば、90 ℃で５分間アルミブロック上にて温め、次に70 ℃で５分間アルミブロック上にて温め、最後に室温で10分間放置した後、氷上に置くようにすることが好ましい。
ライゲーション反応液の組成は、0.1〜2.5 U/μｌのT4ポリヌクレオチドキナーゼ; 0.4〜5 U/μｌのT4 RNAリガーゼ; 10〜250 ｍＭのTris-塩酸（pH 7.0〜8.0）; 2.0〜50 ｍＭの塩化マグネシウム; 2.0〜50 ｍＭのジチオスレイトール（DTT）; 0.2〜5.0のｍＭ ATPを含むものであることが好ましい。反応効率の点から、0.5 U/μｌのT4ポリヌクレオチドキナーゼ; 2.0 U/μｌのT4 RNAリガーゼ; 50 ｍＭのTris-塩酸（pH 7.5）; 10 ｍＭの塩化マグネシウム; 10 ｍＭのDTT; 1.0 ｍＭのATPを含有するものであることが好ましい。この反応液には、必要に応じて、SUPERase RNase inhibitor（Ambion社）などのＲＮＡ分解酵素阻害剤を添加してもよい。
For annealing before the ligation reaction, heat at 60 to 100 ° C for 2 to 60 minutes, warm with a heat block, aluminum block, water bath or other heating equipment, then leave it at room temperature for 2 to 60 minutes to increase the liquid temperature. It is preferable that the temperature is lowered gently and further cooled to -5 to 10 ° C. For example, it is preferable to warm on an aluminum block at 90 ° C. for 5 minutes, then warm on the aluminum block at 70 ° C. for 5 minutes, and finally leave at room temperature for 10 minutes before placing on ice.
The composition of the ligation reaction was 0.1-2.5 U / μl T4 polynucleotide kinase; 0.4-5 U / μl T4 RNA ligase; 10-250 mM Tris-HCl (pH 7.0-8.0); 2.0-50 mM Magnesium chloride; 2.0 to 50 mM dithiothreitol (DTT); preferably 0.2 to 5.0 mM ATP. In terms of reaction efficiency, 0.5 U / μl T4 polynucleotide kinase; 2.0 U / μl T4 RNA ligase; 50 mM Tris-HCl (pH 7.5); 10 mM magnesium chloride; 10 mM DTT; 1.0 mM It is preferable that it contains ATP. If necessary, an RNA-degrading enzyme inhibitor such as SUPERase RNase inhibitor (Ambion) may be added to this reaction solution.
ライゲーション反応を行う反応系の体積は、4.0〜100 μｌであることが好ましい。反応効率の点から20〜40μｌとすることが好ましく、20μｌとすると最も反応効率が高い。
この反応系中でのRNAとリンカーとの量比は、リンカー 5.0〜100 pmolに対し、ｍＲＮＡ5.0〜100 pmolとすることが好ましい。反応効率を上げ、残余を最少化するために、リンカー 10〜20 pmolに対し1/3〜6倍量のｍＲＮＡを反応させるのが好ましく、リンカー10 pmolに対し10〜15 pmolのｍＲＮＡを反応させるのが最も好ましい。
アニーリング反応は、T4ポリヌクレオチドキナーゼ及びT4 RNAリガーゼを除いたライゲーション反応液中で行うことができる。そして、アニーリングの終わった反応液中に、これらの酵素を必要量投入することで、ライゲーション反応を開始させることができる。
ライゲーション反応は、10〜40 ℃で１分間〜16時間行うのが好ましい。作業効率及び反応効率の面から、20〜30 ℃で5〜180分間とすることが好ましく、25℃で15分間とすることが最も好ましい。
The volume of the reaction system for performing the ligation reaction is preferably 4.0 to 100 μl. The reaction efficiency is preferably 20 to 40 μl, and the reaction efficiency is highest when 20 μl.
The amount ratio of RNA and linker in this reaction system is preferably 5.0 to 100 pmol of mRNA with respect to 5.0 to 100 pmol of linker. In order to increase the reaction efficiency and minimize the residue, it is preferable to react 1/3 to 6 times the amount of mRNA to 10 to 20 pmol of the linker, and 10 to 15 pmol of mRNA to react with 10 pmol of the linker. Is most preferred.
The annealing reaction can be performed in a ligation reaction solution excluding T4 polynucleotide kinase and T4 RNA ligase. Then, the ligation reaction can be started by introducing a necessary amount of these enzymes into the reaction solution after the annealing.
The ligation reaction is preferably performed at 10 to 40 ° C. for 1 minute to 16 hours. From the viewpoint of work efficiency and reaction efficiency, it is preferably 5 to 180 minutes at 20 to 30 ° C, and most preferably 15 minutes at 25 ° C.
４．無細胞系タンパク質合成及び連結体の形成
連結体Ａ（ｍＲＮＡとリンカーとの連結体）を無細胞翻訳系と接触させることによって、タンパク質の合成を行う。ここで、タンパク質を合成するための無細胞翻訳系は、動物由来細胞、植物由来細胞、菌類及び細菌類からなる群から選択したものから得てもよく、また部分的にあるいは全体として人工的に合成したものでもよい。具体的には、大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽抽出物などを使用することができる（Lamfrom H., Grunberg-Manago M., Biochem. Biophys. Res. Commun., 27, 1 (1967)）。
生物種により翻訳に利用されるコドンの種類が異なるので、対象となる遺伝子や遺伝子の由来に合わせて無細胞翻訳系を選択することが好ましい。または、利用したい翻訳系に合て、ｍＲＮＡの配列や構造を再設計するのが好ましい。
4). Cell-free protein synthesis and formation of a conjugate A protein is synthesized by bringing the conjugate A (conjugate of mRNA and linker) into contact with a cell-free translation system. Here, the cell-free translation system for synthesizing the protein may be obtained from a group selected from the group consisting of animal-derived cells, plant-derived cells, fungi and bacteria, and partially or wholly artificially. It may be synthesized. Specifically, Escherichia coli, rabbit reticulocyte, wheat germ extract and the like can be used (Lamfrom H., Grunberg-Manago M., Biochem. Biophys. Res. Commun., 27, 1 (1967)).
Since the type of codon used for translation differs depending on the biological species, it is preferable to select a cell-free translation system in accordance with the target gene and the origin of the gene. Alternatively, it is preferable to redesign the sequence and structure of mRNA according to the translation system to be used.
本発明の実施形態においては、前記無細胞翻訳系として哺乳類の網状赤血球細胞のライセートを利用することが好ましく、ウサギの血液から得られた網状赤血球細胞のライセートを利用することがさらに好ましい。また、血中の網状赤血球の割合を高めるため、前記哺乳動物に予めアセチルフェニルヒドラジンを投与して溶血性貧血等を誘導し、その後数日間飼育して採血をすることが好ましい。前記ライセートは、マイクロコッカルヌクレアーゼによって細胞由来のｍＲＮＡを分解し、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）を加えてカルシウムをキレートし、前記ヌクレアーゼを不活化処理したもの（以下、「マイクロコッカルヌクレアーゼ処理済」という。）とすることが、より好ましい。 In an embodiment of the present invention, it is preferable to use a lysate of mammalian reticulocyte cells as the cell-free translation system, and it is more preferable to use a lysate of reticulocyte cells obtained from rabbit blood. In order to increase the ratio of reticulocytes in the blood, it is preferable to administer acetylphenylhydrazine to the mammal in advance to induce hemolytic anemia and the like, and then raise and collect blood for several days. The lysate is obtained by degrading cell-derived mRNA with micro-coccal nuclease, adding glycol ether diamine tetraacetic acid (EGTA) to chelate calcium, and inactivating the nuclease (hereinafter referred to as “micro-coccal nuclease treatment”). It is more preferable to say “finished”).
翻訳反応液の組成は、3.4〜85 μｌのウサギ網状赤血球ライセート（マイクロコッカルヌクレアーゼ処理済）と0.24〜10 pmolの上記連結体を含む反応バッファー（最終濃度：16〜400 ｍＭの酢酸カリウム；0.１〜2.5 ｍＭの酢酸マグネシウム；0.2〜50 ｍＭのクレアチンリン酸；各0.00〜0.25 ｍＭのアミノ酸を含む）を10〜100 μｌ用いるのが好ましい。反応効率の点から、17 μｌのウサギ網状赤血球ライセート（マイクロコッカルヌクレアーゼ処理済）と1.2〜2.0 pmolの上記連結体とを含む反応バッファー（最終濃度：80 ｍＭの酢酸カリウム；0.5 ｍＭの酢酸マグネシウム；10 ｍＭのクレアチンリン酸；各0.05 ｍＭのアミノ酸（メチオニン及びロイシンは各々0.025 ｍＭ）を25 μｌ用いるのが、さらに好ましい。
また必要に応じて、この反応液に、SUPERase RNase inhibitor（Ambion社）などのＲＮＡ分解酵素阻害剤を添加してもよい。
The composition of the translation reaction solution was 3.4 to 85 μl of rabbit reticulocyte lysate (micrococcal nuclease treated) and a reaction buffer (final concentration: 16 to 400 mM potassium acetate; 0.24 to 10 pmol) 0.1 to 2.5 mM magnesium acetate; 0.2 to 50 mM creatine phosphate; each containing 0.00 to 0.25 mM amino acids) is preferably used in 10 to 100 μl. From the viewpoint of reaction efficiency, a reaction buffer (final concentration: 80 mM potassium acetate; 0.5 mM magnesium acetate) containing 17 μl of rabbit reticulocyte lysate (treated with micrococcal nuclease) and 1.2 to 2.0 pmol of the above-mentioned conjugate. More preferably, 25 μl of 10 mM creatine phosphate; each 0.05 mM amino acid (0.025 mM each for methionine and leucine).
If necessary, an RNase inhibitor such as SUPERase RNase inhibitor (Ambion) may be added to the reaction solution.
翻訳反応は20〜40 ℃で10〜90分間行うことが好ましく、生成効率と作業効率の点から、30℃で20分間行うことが特に好ましい。
翻訳反応後、連結体Ａと翻訳産物（タンパク質）との連結（連結体Ｂの形成）を、高塩濃度条件下にて促進することができる。連結体Ｂの形成促進は、終濃度0.3〜1.6 Ｍの塩化カリウム及び終濃度40〜170 ｍＭの塩化マグネシウム存在下で行うのが好ましい。生成効率の点から、25μｌの上記反応液に7〜10μｌの３Ｍの塩化カリウム、及び３μｌの１Ｍの塩化マグネシウム（終濃度：0.60〜0.79 ｍＭの塩化カリウム；79〜86 ｍＭの塩化マグネシウム）を添加することが、さらに好ましい。
連結体Ｂの形成促進は27〜47 ℃で30分〜３時間という反応条件下で行われることが好ましい。生成効率と作業効率の点から、37 ℃で90〜120分間反応させることが特に好ましい。
The translation reaction is preferably performed at 20 to 40 ° C. for 10 to 90 minutes, and particularly preferably performed at 30 ° C. for 20 minutes from the viewpoint of production efficiency and work efficiency.
After the translation reaction, ligation between the ligation A and the translation product (protein) (formation of the ligation B) can be promoted under high salt concentration conditions. It is preferable to promote the formation of Conjugate B in the presence of a final concentration of 0.3 to 1.6 M potassium chloride and a final concentration of 40 to 170 mM magnesium chloride. From the viewpoint of production efficiency, 7 to 10 μl of 3M potassium chloride and 3 μl of 1M magnesium chloride (final concentration: 0.60 to 0.79 mM potassium chloride; 79 to 86 mM magnesium chloride) are added to 25 μl of the above reaction solution. More preferably.
It is preferable that the formation of the connector B is promoted under reaction conditions of 27 to 47 ° C. and 30 minutes to 3 hours. From the viewpoint of production efficiency and work efficiency, it is particularly preferable to react at 37 ° C. for 90 to 120 minutes.
５．連結体Ａとタンパク質の連結（ＩＶＶ形成）
連結体Ａを翻訳系に投入してタンパク質またはポリペプチド鎖を液相合成する際に、そのＣ末端に、前記ｍＲＮＡと翻訳されたタンパク質とがリンカー及びリンカーの有するタンパク質結合部位を介して個々の分子ごとに連結される。ここで、前記タンパク質結合部位は、アミノアシルｔＲＮＡ３’末端アナログを含むことが好ましく、前記アミノアシルｔＲＮＡ３’末端アナログはピューロマイシンであることが好ましい。
すなわち、ｍＲＮＡにピューロマイシン等を有するリンカーを結合させた連結体Ａと翻訳系とを接触させると、そのｍＲＮＡがピューロマイシンを介して翻訳されたタンパク質と結合したＩＶＶが生成する。（非特許文献１参照）。
5. Conjugate A and protein (IVV formation)
When the conjugate A is introduced into a translation system to synthesize a protein or polypeptide chain in a liquid phase, the mRNA and the translated protein are individually linked to the C-terminal via a linker and a protein binding site of the linker. Linked to each molecule. Here, the protein binding site preferably includes an aminoacyl tRNA 3 ′ terminal analog, and the aminoacyl tRNA 3 ′ terminal analog is preferably puromycin.
That is, when the ligated body A in which a linker having puromycin or the like is bound to mRNA is brought into contact with the translation system, IVV in which the mRNA is bound to a protein translated through puromycin is generated. (Refer nonpatent literature 1).
翻訳されたタンパク質はさらに、Ｎ末端側のペプチドの除去、糖鎖や脂質などの非アミノ酸成分の付加、アミノ酸の翻訳後修飾、又は立体構造や配列構造に基づく前記ｍＲＮＡに対する親和性結合や、タンパク質の酵素活性によるｍＲＮＡの化学修飾その他の翻訳後修飾がなされてもよい。
こうした翻訳後修飾は、前記ｍＲＮＡにコードされた遺伝情報に基づいて行われてもよく、前記遺伝情報ではなく外的要因に基づいて行われてもよい。また、これらの組み合わせに基づくものであってもよい。遺伝子情報に基づく反応としては、二量体及び多量体形成、自己フォールディング、分子内分解反応、元のｍＲＮＡとの複合体形成等が挙げられる。外的要因による反応としては、修飾基、脂質、又は糖鎖等の付加、分子シャペロンによるフォールディング又は複合体形成、その他の巨大構造物（ウィルス・細胞）との親和性結合等が挙げられる。遺伝子情報及び外的要因の組み合わせによる反応としては、当該タンパク質の特定配列部位における化学修飾や分解などが挙げられる。
ただし、前記反応はこれらに限定されるものではない。また、これらの反応は、解析やスクリーニング等の補助のために行うこともでき、それ自体を解析やスクリーニングの対象とすることもできる。
The translated protein further includes removal of the N-terminal peptide, addition of non-amino acid components such as sugar chains and lipids, post-translational modification of amino acids, or affinity binding to the mRNA based on the three-dimensional structure or sequence structure, Chemical modification and other post-translational modification of mRNA by the enzymatic activity of may be made.
Such post-translational modification may be performed based on genetic information encoded in the mRNA, or may be performed based on external factors instead of the genetic information. Moreover, it may be based on a combination of these. Reactions based on genetic information include dimer and multimer formation, self-folding, intramolecular degradation reaction, complex formation with the original mRNA, and the like. Reactions due to external factors include addition of modifying groups, lipids, sugar chains, etc., folding or complex formation by molecular chaperones, and affinity binding with other macrostructures (viruses / cells). Examples of the reaction based on a combination of genetic information and external factors include chemical modification and degradation at a specific sequence site of the protein.
However, the said reaction is not limited to these. In addition, these reactions can be carried out for the aid of analysis and screening, and the reaction itself can be used for analysis and screening.
アミノアシルｔＲＮＡ３’末端アナログの１つであるピューロマイシンは、下記式Ｉで表される化合物であり、翻訳系でタンパク質の合成が行われた際に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する。 Puromycin, one of the aminoacyl tRNA 3 ′ terminal analogs, is a compound represented by the following formula I, and has the ability to bind to the C terminus of the synthesized protein when the protein is synthesized in a translation system. Have.
ピューロマイシンは翻訳系でタンパク質の合成が行われた際に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する。その他のアミノアシルｔＲＮＡ３’末端アナログとしては、例えば、3'-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（3'-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-アミノ酸）を挙げることができる。PANS-アミノ酸としては、アミノ酸部がグリシンのPANS-Gly、バリンのPANS-Val、アラニンのPANS-Ala、又はアミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するPANS-アミノ酸混合物を挙げることができる。
その他には、3'-アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して形成される、アミド結合で連結した3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, AANS-アミノ酸）を挙げることができる。AANS-アミノ酸としては、アミノ酸部がグリシンのAANS-Gly、バリンのAANS-Val、アラニンのAANS-Ala、又はアミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するAANS-アミノ酸混合物を挙げることができる。
また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。
ピューロマイシン以外に好適に使用できるアミノアシルtRNA3'末端アナログとしては、リボシチジルピューロマイシン（rCpPur）、デオキシジルピューロマイシン（dCpPur）、デオキシウリジルピューロマイシン（dUpPur）などがあり、これらを下記式（II）〜（VI）に示す。
Puromycin has the ability to bind to the C-terminus of the synthesized protein when the protein is synthesized in the translation system. Examples of other aminoacyl tRNA 3 ′ terminal analogs include 3′-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside (PANS-amino acid). Examples of PANS-amino acids include PANS-Gly whose amino acid part is glycine, PANS-Val of valine, PANS-Ala of alanine, or a PANS-amino acid mixture whose amino acid part corresponds to all amino acids.
In addition, 3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, AANS-amino acid, formed by dehydration condensation of the amino group of 3'-aminoadenosine and the carboxyl group of amino acid, linked by an amide bond ). Examples of the AANS-amino acid include AANS-Gly whose amino acid part is glycine, AANS-Val of valine, AANS-Ala of alanine, or an AANS-amino acid mixture in which the amino acid part corresponds to each amino acid of all amino acids.
Further, nucleosides or those obtained by ester bonding of nucleosides and amino acids can be used.
Examples of aminoacyl-tRNA 3 ′ terminal analogs that can be suitably used in addition to puromycin include ribocytidylpuromycin (rCpPur), deoxydylpuromycin (dCpPur), and deoxyuridylpuromycin (dUpPur), which are represented by the following formula ( II) to (VI).
また、アミノアシルｔＲＮＡアナログは、公知の手法によってリンカーに付加することができる。ｍＲＮＡディスプレイ法では、アミノアシルｔＲＮＡアナログを有するタンパク質連結部位をリンカーの主鎖の５’末端に形成してもよい。一方、ｃＤＮＡディスプレイ法において、ｃＤＮＡ型ＩＶＶを形成するために、リンカーの主鎖の５’末端をｍＲＮＡとの相補鎖形成に用いる場合等には、上記のタンパク質結合部位をリンカーの側鎖中に形成することが好ましい。
リンカーの側鎖が短いと、アミノアシルｔＲＮＡアナログが取り込まれるときに翻訳複合体の立体障害を受けることから、リンカーの側鎖は十分な長さを持つものであることが好ましい。リンカーの側鎖は、例えば、下記式（VII）のSpacer 18 Phosphoramiditeのようなスペーサー分子を１〜８個程度含むものであることが好ましく、リンカー合成効率と連結体形成効率のバランスとから、こうしたスペーサー分子を４個含むものであることがさらに好ましい。
In addition, the aminoacyl tRNA analog can be added to the linker by a known technique. In the mRNA display method, a protein linking site having an aminoacyl tRNA analog may be formed at the 5 ′ end of the linker main chain. On the other hand, in the cDNA display method, when the 5 ′ end of the main chain of the linker is used to form a complementary chain with mRNA in order to form cDNA type IVV, the above protein binding site is placed in the side chain of the linker. It is preferable to form.
When the side chain of the linker is short, the translation complex undergoes steric hindrance when the aminoacyl tRNA analog is incorporated, so that the side chain of the linker is preferably of a sufficient length. The side chain of the linker preferably contains, for example, about 1 to 8 spacer molecules such as Spacer 18 Phosphoramidite of the following formula (VII). From the balance of linker synthesis efficiency and conjugate formation efficiency, such a spacer molecule It is more preferable that it contains four.
リンカーの主鎖と側鎖との連結は公知の方法に従って行うことができる。例えば、リンカーの主鎖が下記式（VIII）のAmino-Modifier C6 dTを含み、側鎖が下記式（IX）の5'-Thiol-Modifier C6から合成された5'末端を含む場合には、架橋剤として下記式（X）で表わされるEMCSを利用することができる。 The main chain and side chain of the linker can be linked according to a known method. For example, when the main chain of the linker contains Amino-Modifier C6 dT of the following formula (VIII) and the side chain contains a 5 ′ end synthesized from 5′-Thiol-Modifier C6 of the following formula (IX): EMCS represented by the following formula (X) can be used as a crosslinking agent.
本発明で使用するリンカーは、必要に応じて、タンパク質を連結体Ｂから遊離させるために、切断部位（以下、「タンパク質遊離部位」ということがある。）を設けることができる。このようなタンパク質遊離部位として、例えば、光切断部位等を挙げることができる。
ここで、「光切断性部位」とは，紫外線等の光を照射すると分解される性質を持つ化合物を有する部位いい，市販の化合物を用いることもできる。例えば、下記式（XI）で表されるPC Linker Phosphoramidite（Glen research社）、フラーレンを含有してなる核酸の光切断用組成物に係る化合物（特許文献８）、光分解(SBIP)手法による鎖切断に係る化合物などが好ましい。切断効率の点から、PC Linker Phosphoramiditeを利用することが好ましい。
The linker used in the present invention can be provided with a cleavage site (hereinafter sometimes referred to as “protein release site”) in order to release the protein from the conjugate B, if necessary. Examples of such a protein release site include a photocleavage site.
Here, the “photocleavable site” refers to a site having a compound having a property of being decomposed when irradiated with light such as ultraviolet rays, and a commercially available compound can also be used. For example, PC Linker Phosphoramidite (Glen research) represented by the following formula (XI), a compound related to a composition for photocleavage of nucleic acid containing fullerene (Patent Document 8), a chain by a photolysis (SBIP) technique A compound related to cleavage is preferred. From the viewpoint of cutting efficiency, it is preferable to use PC Linker Phosphoramidite.
６．ＩＶＶの検出
上記連結体Ａ又は連結体Ｂは、あらかじめリンカーに標識物質を結合させておくことによって、容易に検出することができる。そのような標識物質としては、蛍光性化合物、抗原のエピトープペプチド、放射性同位体等を挙げることができる。放射性同位体としては、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体を使用することが好ましい。
放射性同位体の利用が困難な場合には、蛍光性化合物を利用することが好ましい。蛍光性化合物としては、フリーの官能基（例えば、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、又はアミノ基など）を持ち、標識された塩基としてリンカーに連結可能な種々の蛍光色素を用いることが好ましい。このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、フィコビリタンパク質、希土類金属キレート、ダンシルクロライド又はテトラメチルローダミンイソチオシアネート等を挙げることができる。蛍光標識分子としては、FITC-dTや下記式（XII）で表わされるFluorescein-dTを使用することがより好ましい。
6). Detection of IVV The linked body A or the linked body B can be easily detected by binding a labeling substance to a linker in advance. Examples of such labeling substances include fluorescent compounds, epitope peptides of antigens, radioisotopes and the like. As the radioisotope, it is preferable to use a radioisotope such as 3 H, 14 C, 32 P, 125 I or 131 I.
When it is difficult to use a radioisotope, it is preferable to use a fluorescent compound. Fluorescent compounds have various functional groups that have free functional groups (for example, a carboxyl group that can be converted into an active ester, a hydroxyl group that can be converted into a phosphoramidide, or an amino group) and can be linked to a linker as a labeled base. It is preferable to use a dye. Examples of such fluorescent dyes include fluorescein isothiocyanate (FITC), phycobiliprotein, rare earth metal chelate, dansyl chloride or tetramethylrhodamine isothiocyanate. As the fluorescent labeling molecule, it is more preferable to use FITC-dT or Fluorescein-dT represented by the following formula (XII).
７．連結体Ｂの固相固定
本発明で使用するリンカーは、その主鎖中に上記連結体Ｂを固相部位に結合するための固相結合部位を有することが好ましい。
連結体Ｂが固定される固相は特に限定されず、その連結体が使用される目的に応じて適宜選択される。こうした固相としては、生体分子を固定する担体となる各種の形状のものを用いることができる。例えば、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ等のビーズ；ガラス基板、シリコン（石英）基板、プラスチック基板、金属基板（例えば、金箔基板）等の基板；ガラス容器、プラスチック容器等の容器；ニトロセルロース、ポリビニリデンフロリド（ＰＶＤＦ）等の材料からなるメンブレンなどが挙げられる。
7). Solid phase immobilization of linking body B The linker used in the present invention preferably has a solid phase binding site for binding the linking body B to the solid phase site in the main chain.
The solid phase to which the linked body B is fixed is not particularly limited, and is appropriately selected according to the purpose for which the linked body is used. As such a solid phase, those having various shapes serving as a carrier for immobilizing a biomolecule can be used. For example, beads such as styrene beads, glass beads, agarose beads, sepharose beads, magnetic beads; substrates such as glass substrates, silicon (quartz) substrates, plastic substrates, metal substrates (for example, gold foil substrates); glass containers, plastic containers Examples of such containers include membranes made of materials such as nitrocellulose and polyvinylidene fluoride (PVDF).
上記連結体Ｂでは、リンカーに固相結合部位を設けることで、その固相結合部位と、固相に結合させた「固相結合部位認識部位」とを介して、連結体Ｂを固相に固定することができる。「固相結合部位認識部位」とは、固相に設けられた部位であって、固相結合部位の有する物質に応じて、固相結合部位に結合する部位である。上記固相結合部位は、連結体Ｂを所望の固相に結合し得るものであればよく、特に限定されない。例えば、リガンド、エピトープペプチドその他の特定のポリペプチドに特異的に結合する構造単位を用いる場合には、固相表面には、これらと特定に結合する特定のポリペプチド等を結合させておくことになる。
こうした固相結合部位認識部位／固相結合部位の各々の有する物質の組合せの例としては、例えば、アビジン及びストレプトアビジンその他のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、配列特異的なＤＮＡ又はＲＮＡ結合タンパク質／特異配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡ、抗体又はアプタマー／抗体又はエピトープペプチド、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、エストラジオール受容体タンパク質／エストラジオール等の各種受容体タンパク質／そのリガンド等が挙げられる。
これらのうち、上記ビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／上記金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープペプチド）等を使用することが好ましく、リンカー合成の容易さの面から、ストレプトアビジン／ビオチンの組合せを使用することが、さらに好ましい。
In the above-mentioned conjugate B, by providing a solid phase binding site in the linker, the conjugate B is brought into the solid phase via the solid phase binding site and the “solid phase binding site recognition site” bound to the solid phase. Can be fixed. The “solid phase binding site recognition site” is a site provided on the solid phase, and is a site that binds to the solid phase binding site according to the substance possessed by the solid phase binding site. The solid phase binding site is not particularly limited as long as it can bind the conjugate B to a desired solid phase. For example, when a structural unit that specifically binds to a ligand, epitope peptide or other specific polypeptide is used, a specific polypeptide or the like that specifically binds to the solid phase surface should be bound. Become.
Examples of combinations of substances possessed by each of the solid phase binding site recognition site / solid phase binding site include, for example, avidin and streptavidin and other biotin binding proteins / biotin, maltose binding protein / maltose, G protein / guanine nucleotide, Polyhistidine peptide / metal ion such as nickel or cobalt, glutathione-S-transferase / glutathione, sequence-specific DNA or RNA-binding protein / DNA having specific sequence, antibody or aptamer / antibody or epitope peptide, calmodulin / calmodulin Examples include binding peptides, various receptor proteins such as ATP binding protein / ATP, estradiol receptor protein / estradiol, and ligands thereof.
Of these, the biotin-binding protein / biotin, maltose-binding protein / maltose, polyhistidine peptide / the metal ion, glutathione-S-transferase / glutathione, antibody / antigen molecule (epitope peptide), etc. are preferably used. From the viewpoint of ease of synthesis, it is more preferable to use a combination of streptavidin / biotin.
上記固相結合部位は、例えば、連結体Ｂをリンカーを介して固相に結合させるための部位であり、具体的には、こうした結合を可能にする化合物、結合基などを結合し得る塩基で構成される。より具体的には、ビオチンを結合し得る塩基（例えば、デオキシチミン（ｄＴ））もしくはビオチンが結合した塩基（例えば、ビオチン−デオキシチミン（Biotin-dT））、アミノ基によって修飾された塩基（例えば、アミノ修飾デオキシチミン（例、Amino-Modifier C6-dT:Glen Research Search社製）、カルボキシ基によって修飾された塩基（例えば、カルボキシ修飾デオキシチミン（Carboxy-dT））、チオール基によって修飾された塩基（例えば、チオール修飾デオキシチミン（4-Thio-dT））等で構成される。
上記リンカーでは、固相結合部位として下記式（XIII）のビオチン−デオキシチミンを好適に使用することができる。そして、このような固相結合部位を介し、ビオチンとアビジンの親和性を利用して、ビオチンが連結された連結体Ｂをアビジンが固定された固相に結合させることができる。なお、上記固相結合部位として、カルボキル基やアミノ基が結合した塩基が選択された場合は、固相と連結体Ｂとをエステル結合やアミド結合で結合させることができる。
The solid phase binding site is, for example, a site for binding the conjugate B to the solid phase via a linker. Specifically, the solid phase binding site is a base capable of binding a compound, a binding group, or the like that enables such binding. Composed. More specifically, a base capable of binding biotin (for example, deoxythymine (dT)), a base bound to biotin (for example, biotin-deoxythymine (Biotin-dT)), a base modified with an amino group (for example, , Amino-modified deoxythymine (eg, Amino-Modifier C6-dT: manufactured by Glen Research Search), base modified by carboxy group (eg, carboxy-modified deoxythymine (Carboxy-dT)), base modified by thiol group (For example, thiol-modified deoxythymine (4-Thio-dT)) and the like.
In the linker, biotin-deoxythymine represented by the following formula (XIII) can be preferably used as the solid phase binding site. Then, via such a solid-phase binding site, utilizing the affinity between biotin and avidin, the linked body B to which biotin is linked can be bound to the solid phase to which avidin is fixed. In addition, when a base to which a carboxy group or an amino group is bonded is selected as the solid phase binding site, the solid phase and the conjugate B can be bonded by an ester bond or an amide bond.
上記の方法で固相に固定された連結体Ｂを用いて、洗浄後公知の方法で逆転写反応を行う。逆転写反応後、再び洗浄し、新たに加えた所定のバッファー中で固相より遊離する。
本発明で使用するリンカーでは、必要に応じて、連結体Ｂを固相から遊離させるために、第１及び第２切断部位（以下、「固相遊離部位」という。）を設ける。上記固相遊離部位は、前記タンパク質遊離部位と同様の条件で切断又は分解されるようにすることもできる。スクリーニング等の工程をスムーズに進める上では、当該固相遊離部位は、前記タンパク質遊離部位と同様の条件で切断又は分解されない構成とすることが好ましい。
上記リンカーでは、例えば、リボＧ（グアノシン；ｒＧ；Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）等の特定の酵素が認識可能な塩基を含む配列として前記固相遊離部位を構成し、こうした酵素を用いて、固相に結合された連結体Ｂを固相から遊離させることが好ましい。
A reverse transcription reaction is performed by a known method after washing using the ligated body B immobilized on the solid phase by the above method. After the reverse transcription reaction, it is washed again and released from the solid phase in a newly added predetermined buffer.
In the linker used in the present invention, first and second cleavage sites (hereinafter referred to as “solid phase release sites”) are provided as needed to release the conjugated B from the solid phase. The solid phase free site may be cleaved or decomposed under the same conditions as the protein free site. In order to smoothly proceed the screening process and the like, it is preferable that the solid phase free site is configured not to be cleaved or decomposed under the same conditions as the protein free site.
In the above linker, for example, the solid-phase release site is configured as a sequence containing a base that can be recognized by a specific enzyme such as riboG (guanosine; rG; guanosine), and is bound to the solid phase using such an enzyme. It is preferable to release the conjugate B from the solid phase.
ここで用いられる酵素は、リンカーの設計に応じて決定することができ、例えば、主鎖の鎖長に余裕があれば制限酵素（旧ＥＣ番号3.1.23, 3.1.24, 3.1.25）を利用することができる。また、リンカーがＤＮＡを主体に形成されている場合には、ＲＮＡを切断部位として、ＲＮＡ切断酵素（ＥＣ番号3.1.26, 3.1.27）を利用することができる。また、酵素切断部位を、使用する酵素の種類に応じて適宜選択し、設計することもできる。 The enzyme used here can be determined according to the design of the linker. For example, if there is a margin in the length of the main chain, a restriction enzyme (former EC number 3.1.23, 3.1.24, 3.1.25) can be selected. Can be used. When the linker is mainly composed of DNA, RNA cleaving enzymes (EC numbers 3.1.26 and 3.1.27) can be used with RNA as a cleavage site. In addition, the enzyme cleavage site can be appropriately selected and designed according to the type of enzyme used.
ＲＮＡ切断酵素としては、RNaseT1、RNaseA、RNaseI、膵臓RNase、Ｓ１ヌクレアーゼ、蛇毒ヌクレアーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、アカパンカビヌクレアーゼ等を用いることができる。上記切断部位としては、これらの酵素のうち、RNaseT1、RNaseA、RNaseI、膵臓RNaseによって切断される部位であることが好ましく、特に、RNaseT1によって認識され、切断されるリボＧ（ｒＧ；グアノシン）を含む配列であることが好ましい。
RNaseT1は、ｒＧを１塩基で認識してリンカーを切断するため、ｒＧを使用するとリンカー主鎖長を短くすることが出来る。その結果、上述したライゲーションの際に、リンカー濃度を上げても凝集しにくいという利点がある。
As the RNA cleaving enzyme, RNaseT1, RNaseA, RNaseI, pancreatic RNase, S1 nuclease, snake venom nuclease, spleen phosphodiesterase, staphylococcal nuclease, mung bean nuclease, red bread fungus nuclease and the like can be used. Among these enzymes, the cleavage site is preferably a site that is cleaved by RNaseT1, RNaseA, RNaseI, or pancreatic RNase, and particularly includes riboG (rG; guanosine) that is recognized and cleaved by RNaseT1. A sequence is preferred.
Since RNaseT1 recognizes rG with one base and cleaves the linker, using rG can shorten the linker main chain length. As a result, there is an advantage that the above-described ligation hardly causes aggregation even when the linker concentration is increased.
リボヌクレアーゼＴ１（RNaseT1）等の一本鎖特異的ＲＮＡ切断酵素により切断されることを予定するリンカーでは、図２に示すように、リンカー２中で固相結合部位２ｂが第１切断部位２ｃ１と第２切断部位２ｃ２との間に位置し、これらは、リンカーの主鎖の3’末端近傍の一本鎖ループに位置していなければならない。なお、図２にはリンカーと相補鎖を形成するｍＲＮＡ１、リンカーの主鎖２００、リンカーの側鎖３００等も表されている。 In a linker that is scheduled to be cleaved by a single-strand-specific RNA cleaving enzyme such as ribonuclease T1 (RNaseT1), as shown in FIG. Located between the two cleavage sites 2c2 and these must be located in a single stranded loop near the 3 'end of the linker backbone. FIG. 2 also shows mRNA 1 that forms a complementary chain with the linker, the main chain 200 of the linker, the side chain 300 of the linker, and the like.
上記の特定のポリペプチド等と固相結合部位との結合は、ＩＶＶの変性を避けるために分子間の親和性のみを利用して行うことが好ましいが、その他の公知の方法を用いることもできる。そのような公知の方法としては、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート等を利用する方法を挙げることができる。また、上記の特定のポリペプチド等及び固相結合部位の有する分子としては、アミノ基、カルボキシル基、又は水酸基などの官能基を構成する分子が好ましい。
上記の特定のポリペプチド等と固相を構成する要素との結合は、公知の技術によって行うことができ、上述した市販の前記ビーズや前記基板等を利用してもよい。また上記固相遊離部位は固相側に設けることもできる。上記の固定化手段は、２つの相互に親和性を有する物質を利用した固定化方法であるが、固相がスチレンビーズ、スチレン基板などのプラスチック材料で構成されているのであれば、必要に応じて、公知の手法を用いてリンカーの一部を直接それらの固相に共有結合させることもできる（Qiagen社、LiquiChip Applications Handbook等参照）。なお、本発明においては、固定化手段については、上記の方法に限定されることなく、当業者に公知であれば如何なる手段をも利用することができる。
The binding between the above-mentioned specific polypeptide or the like and the solid phase binding site is preferably performed using only the affinity between molecules in order to avoid denaturation of IVV, but other known methods can also be used. . Examples of such a known method include a method using tannic acid, formalin, glutaraldehyde, pyruvic aldehyde, bis-diazotized benzidone, toluene-2,4-diisocyanate and the like. Moreover, as a molecule | numerator which said specific polypeptide etc. and a solid-phase binding site have, the molecule | numerator which comprises functional groups, such as an amino group, a carboxyl group, or a hydroxyl group, is preferable.
The above-mentioned specific polypeptide or the like can be bound to an element constituting the solid phase by a known technique, and the above-described commercially available beads, the substrate, or the like may be used. The solid phase free site can also be provided on the solid phase side. The above-mentioned immobilization means is an immobilization method using two substances having an affinity for each other. However, if the solid phase is composed of a plastic material such as styrene beads or a styrene substrate, it is necessary if necessary. In addition, a part of the linker can be covalently bonded directly to the solid phase using a known technique (see Qiagen, LiquidChip Applications Handbook, etc.). In the present invention, the immobilization means is not limited to the above method, and any means can be used as long as it is known to those skilled in the art.
８．本発明におけるＩＶＶ合成法と従来法との比較
ここで、図３及び図４を参照しつつ、上記連結体Ａ又は連結体Ｂを用いたＩＶＶ法における従来法と、本発明による方法と対比しつつ説明する。図中、同じ要素には同じ番号を付し、説明を省略する。
従来法を示す図３では、遺伝子情報を有するｍＲＮＡ１とリンカー２とは所定の方法によって連結される。ここでは、第１切断部位２ｃ１及び第２切断部位２ｃ２を合わせて固相遊離部位２ｃと表す。図３では、ハイブリダイゼーション反応につづくライゲーション反応により、ｍＲＮＡ１とリンカー２とが連結され連結体Ａが形成される（Step 1）。連結体の合成効率を高めるために、ｍＲＮＡ１とリンカー２とは１:１．５〜１:３の範囲で混合され、結果として過剰なリンカー２が未反応のまま残される。
8). Comparison of IVV Synthesis Method and Conventional Method in the Present Invention Here, with reference to FIG. 3 and FIG. 4, the conventional method in the IVV method using the above-mentioned connector A or connector B is compared with the method according to the present invention. I will explain. In the figure, the same elements are denoted by the same reference numerals and description thereof is omitted.
In FIG. 3 showing the conventional method, mRNA 1 having genetic information and linker 2 are linked by a predetermined method. Here, the first cleavage site 2c1 and the second cleavage site 2c2 are collectively referred to as a solid phase release site 2c. In FIG. 3, mRNA 1 and linker 2 are linked by a ligation reaction following the hybridization reaction to form linked body A (Step 1). In order to increase the synthesis efficiency of the conjugate, mRNA1 and linker 2 are mixed in the range of 1: 1.5 to 1: 3, and as a result, excess linker 2 is left unreacted.
未反応のリンカー２を除去するためにカラム精製を行い（Step 2）、次に、精製した連結体３（連結体Ａ）を濃縮するためエタノール沈殿を行う（Step 3）。次いで、連結体Ａを、例えば、無細胞翻訳系に供することによって（Step 4）、ｍＲＮＡ１に対応するタンパク質５が、タンパク質結合部位２ａに結合された状態で、連結体Ａ上で合成される（Step 5）。この結果、ｍＲＮＡ１、リンカー２及びタンパク質５からなる連結体４（連結体Ｂ）が生成する。連結体Ｂは、いわゆるIn Vitro Virus (ＩＶＶ)である。
固相結合部位認識部位６ａを有する固相ビーズ６に、得られた連結体Ｂが固定され（Step 5）、これを逆転写反応に供することによって、ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ７が生成される（Step 6）。ここで、ＲＮａｓｅＴ１などの酵素を用いて、固相遊離部位２ｃでリンカーを切断すると、固相ビーズ６から遊離させることができる（Step7）。さらに、標識２ｄを利用することで、各工程におけるタンパク質５、連結体３又は連結体４などの合成効率を定量することができる。
Column purification is performed to remove the unreacted linker 2 (Step 2), and then ethanol precipitation is performed to concentrate the purified conjugate 3 (conjugate A) (Step 3). Next, by subjecting the conjugate A to, for example, a cell-free translation system (Step 4), the protein 5 corresponding to the mRNA 1 is synthesized on the conjugate A in a state of being bound to the protein binding site 2a ( Step 5). As a result, a linked body 4 (linked body B) composed of mRNA1, linker 2, and protein 5 is generated. Conjugate B is so-called In Vitro Virus (IVV).
The obtained conjugate B is fixed to the solid-phase bead 6 having the solid-phase binding site recognition site 6a (Step 5), and this is subjected to a reverse transcription reaction, thereby generating cDNA 7 corresponding to mRNA (Step 5). 6). Here, when the linker is cleaved at the solid phase release site 2c using an enzyme such as RNase T1, it can be released from the solid phase beads 6 (Step 7). Furthermore, by using the label 2d, the synthesis efficiency of the protein 5, the linked body 3 or the linked body 4 in each step can be quantified.
また図３では省略したが、ＲＮａｓｅＨでｍＲＮＡを分解すると、タンパク質とそれをコードするＤＮＡが連結したＤＮＡ−タンパク質連結体（ＤＮＡのみに遺伝子を有するＩＶＶ）が生成される。タンパク質の機能や構造に基づいてスクリーニングを行いその後、光切断などの手法でタンパク質遊離部位２ｅにてリンカーを切断すると、タンパク質５を遊離することができる。
本発明による方法を示す図４中、図３と同一の符号を付したものは、同一の要素を表す。Step 1で合成された連結体Ａは精製及び濃縮の工程を経ることなくStep 4に供され、タンパク質が合成される。その後の固相化工程（Step 5）以降は従来法と同様である。
本発明の方法を用いることにより、ＩＶＶ形成またはmRNA/cDNAディスプレイ法において、二工程の短縮と、カラム精製を省略することができる。さらに、精製工程がないことから、mRNA/cDNAディスプレイ法によって、ペプチドスクリーニングも効率的に行うことができる。
Although omitted in FIG. 3, when mRNA is degraded with RNase H, a DNA-protein conjugate (IVV having a gene only in DNA) in which the protein and the DNA encoding it are linked is generated. Protein 5 can be released by screening based on the function and structure of the protein and then cleaving the linker at the protein release site 2e by a technique such as photocleavage.
In FIG. 4 showing the method according to the present invention, the same reference numerals as those in FIG. 3 denote the same elements. The conjugate A synthesized in Step 1 is subjected to Step 4 without undergoing purification and concentration steps, and a protein is synthesized. The subsequent solid phase step (Step 5) and subsequent steps are the same as in the conventional method.
By using the method of the present invention, two-step shortening and column purification can be omitted in IVV formation or mRNA / cDNA display methods. Furthermore, since there is no purification step, peptide screening can be performed efficiently by the mRNA / cDNA display method.
９．ランダムな遺伝子ライブラリーから目的のタンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングする方法
本発明の別の態様によれば、上記ＩＶＶを用いたタンパク質と遺伝子との対応関係を明らかにする、効率的な方法を利用したペプチドスクリーニング法が提供される。この解析方法は、（ａ）一種以上の遺伝子を含むｍＲＮＡのライブラリーを、ＩＶＶ合成系に投入し、連結体Ｂを形成する工程；（ｂ）工程（ａ）において合成されたタンパク質と一以上の標的物質とを接触させる工程；及び（ｃ）該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する工程、とを含む。
この解析方法は、例えば、（ｉ）配列既知のタンパク質に作用する物質をスクリーニングする場合、（ii）ある特定の物質（例えば、リガンド）が結合する配列未知のタンパク質をスクリーニングする場合等に用いることができる。例えば、（ｉ）の場合は、オーファンレセプタータンパク質をコードする核酸配列を有するｍＲＮＡと、ピューロマイシンとの連結体を複数用意しておき（すなわち、複数のオーファンレセプタータンパク質に対応するｍＲＮＡをそれぞれ有する連結体Ａ又は連結体Ｂを複数用意する。）、これを翻訳系に投入する。すると、各連結体Ａ又は連結体ＢのｍＲＮＡから複数のオーファンレセプタータンパク質が合成される。
9. Method for screening gene encoding target protein from random gene library According to another aspect of the present invention, an efficient method for clarifying the correspondence between a protein and a gene using IVV is used. Peptide screening methods are provided. In this analysis method, (a) a step of introducing a library of mRNA containing one or more genes into an IVV synthesis system to form a ligation B; (b) one or more proteins synthesized in step (a) And (c) measuring whether or not the protein and the target substance interact with each other.
This analysis method is used, for example, when (i) screening a substance that acts on a protein with a known sequence, (ii) screening a protein with an unknown sequence to which a specific substance (for example, a ligand) binds. Can do. For example, in the case of (i), a plurality of conjugates of mRNA having a nucleic acid sequence encoding an orphan receptor protein and puromycin are prepared (that is, mRNAs corresponding to a plurality of orphan receptor proteins are respectively prepared. Prepare a plurality of connected bodies A or connected bodies B.), and put them into the translation system. Then, a plurality of orphan receptor proteins are synthesized from the mRNA of each ligation body A or ligation body B.
各オーファンレセプタータンパク質は、固相に固定された連結体Ａ又は連結体Ｂのピューロマイシンに、Ｃ末端が結合することによって固定される。必要に応じて、不要な成分を洗浄して除去し、これに標的物質及びバッファー等を加えて、標的物質をオーファンレセプタータンパク質に結合させる試験を行う。（ii）の場合は、例えば、ある遺伝子ライブラリーから複数のｍＲＮＡを取得し、複数のｍＲＮＡとピューロマイシンとの連結体を作成し、固相に固定する。以下、同様にタンパク質の合成を行い、標的物質をそのタンパク質に接触させて結合実験を行う。
上記（ｂ）工程では、（ａ）工程で合成されたタンパク質と、一以上の標的物質とを接触させる。ここで用いられる「標的物質」とは、本発明において合成されるタンパク質と相互作用するか否か調べるための物質を意味し、具体的には、タンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられる。
Each orphan receptor protein is immobilized by binding the C-terminal to puromycin of Conjugate A or Conjugate B immobilized on a solid phase. If necessary, unnecessary components are washed and removed, and a target substance and a buffer are added thereto to perform a test for binding the target substance to the orphan receptor protein. In the case of (ii), for example, a plurality of mRNAs are obtained from a certain gene library, and a conjugate of a plurality of mRNAs and puromycin is prepared and immobilized on a solid phase. Thereafter, the protein is synthesized in the same manner, and a binding test is performed by bringing the target substance into contact with the protein.
In the step (b), the protein synthesized in the step (a) is brought into contact with one or more target substances. As used herein, the “target substance” means a substance for examining whether or not it interacts with the protein synthesized in the present invention, and specifically includes proteins, nucleic acids, sugar chains, low molecular weight compounds and the like. Can be mentioned.
前記標的物質としてのタンパク質は、アミノ酸配列及びその機能が既知のタンパク質でも、未知のタンパク質でもよく、タンパク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたタンパク質、又はｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製したタンパク質等であってもよい。合成されたペプチド鎖には、糖鎖が結合していてもよい。これらのうち、アミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、又はｃＤＮＡライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳、精製されたタンパク質を好適に標的とすることができる。
前記標的物質としての核酸も特に制限されることはなく、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれをも標的とすることができる。また、塩基配列又は機能が未知の核酸のみならず、既知の核酸も用いることができる。タンパク質に結合能力を有する核酸としての機能、及び塩基配列が既知のものか、又はゲノムライブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離してきたものに対し、本発明の方法を好適に使用することができる。
The protein as the target substance may be a protein whose amino acid sequence and function are known or an unknown protein, and may be a full-length protein or a partial peptide including a binding active site. These may be a synthesized peptide chain, a protein purified from a living body, a protein that has been translated from a cDNA library or the like using an appropriate translation system, and purified. A sugar chain may be bound to the synthesized peptide chain. Among these, it is possible to suitably target a purified protein having a known amino acid sequence or a protein translated and purified from a cDNA library or the like using an appropriate method.
The nucleic acid as the target substance is not particularly limited, and both DNA and RNA can be targeted. Further, not only nucleic acids with unknown base sequences or functions, but also known nucleic acids can be used. The method of the present invention is preferably used for a nucleic acid having a binding ability to a protein and a nucleotide sequence that is known or that has been cleaved and isolated from a genomic library using a restriction enzyme or the like. be able to.
前記標的物質としての糖鎖も特に制限はなく、その糖配列又は機能が、未知の糖鎖のみならず既知の糖鎖を標的とすることができる。好ましくは、既に分離・解析され、糖配列又は機能が既知の糖鎖が用いられる。
前記標的物質としての低分子化合物についても特に制限はなく、機能が未知のもの、又はタンパク質に結合する能力が既に知られているもの等を用いることができる。
なお、これら標的物質と、リンカーに連結されたタンパク質との「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子との間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、及び静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示す。ここでいう共有結合には、配位結合、双極子結合が含まれる。また、静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発による立体構造に起因した結合が含まれる。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。相互作用の具体例としては、抗原と抗体との結合及び解離、タンパク質レセプターとリガンドとの間の結合及び解離、接着分子と相手方分子との結合及び解離、酵素と基質の間の結合及び解離、核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合及び解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合及び解離、あるいは糖鎖とタンパク質との間の結合及び解離が挙げられる。
The sugar chain as the target substance is not particularly limited, and the sugar sequence or function thereof can target not only unknown sugar chains but also known sugar chains. Preferably, a sugar chain that has already been separated and analyzed and whose sugar sequence or function is known is used.
There are no particular limitations on the low molecular weight compound as the target substance, and those having an unknown function or those already known for the ability to bind to proteins can be used.
The “interaction” between the target substance and the protein linked to the linker usually means a covalent bond, hydrophobic bond, hydrogen bond, van der Waals bond, and electrostatic force between the protein and the target molecule. The effect | action by the force which acts on the molecule | numerator resulting from at least 1 of the coupling | bonding by is shown. The covalent bond here includes a coordination bond and a dipole bond. Moreover, the coupling | bonding by an electrostatic force includes the coupling | bonding resulting from the three-dimensional structure by an electric repulsion other than an electrostatic coupling | bonding. In addition, a binding reaction, a synthesis reaction, and a decomposition reaction resulting from the above action are also included in the interaction. Specific examples of the interaction include binding and dissociation between antigen and antibody, binding and dissociation between protein receptor and ligand, binding and dissociation between adhesion molecule and partner molecule, binding and dissociation between enzyme and substrate, Binding and dissociation between nucleic acids and proteins that bind to them, binding and dissociation between proteins in information transmission systems, binding and dissociation between glycoproteins and proteins, or binding and dissociation between sugar chains and proteins Is mentioned.
ここで用いられる標的物質は、必要に応じて、上述した標識物質により標識して用いることができる。これらの標識物質は、標的物質と固定化タンパク質との間の相互作用に基づいて発生する信号の変化の測定又は解析方法に適したものを選択すればよい。上記標識物質の標的物質への結合は、公知の手法に基づいて行うことができる。
次いで、本解析方法によれば、工程（ｃ）において、タンパク質と標的物質とが相互作用しているか否かを測定する。タンパク質と標的物質とが相互作用しているか否かの測定は、両分子間の相互作用に基づいて発生される信号の変化を測定、検出することにより行う。
そのような測定手法としては、例えば、表面プラズモン共鳴法（Cullen D.C., et al., Biosensors, 3(4), 211-225 (1987-88)）、エバネッセント場分子イメージング法（Funatsu T., et al., Nature, 374, 555-559 (1995)）、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)：Crowther J.R., Methods in Molecular Biology, 42 (1995)）、蛍光偏光解消法（Perran J., et al., J. Phys. Rad., 1, 390-401 (1926)）、及び蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)：Eigen M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5740-5747 (1994)）等が挙げられる。
The target substance used here can be used after being labeled with the above-described labeling substance, if necessary. These labeling substances should just select the thing suitable for the measurement or analysis method of the change of the signal which generate | occur | produces based on interaction between a target substance and immobilized protein. The labeling substance can be bound to the target substance based on a known method.
Next, according to the present analysis method, in the step (c), it is measured whether or not the protein and the target substance interact. Whether or not the protein and the target substance are interacting is measured by measuring and detecting a change in signal generated based on the interaction between the two molecules.
Examples of such measurement techniques include surface plasmon resonance (Cullen DC, et al., Biosensors, 3 (4), 211-225 (1987-88)), evanescent field molecular imaging (Funatsu T., et al. al., Nature, 374, 555-559 (1995)), fluorescence imaging analysis, Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA): Crowther JR, Methods in Molecular Biology, 42 (1995)), fluorescence Depolarization (Perran J., et al., J. Phys. Rad., 1, 390-401 (1926)), and Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS): Eigen M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5740-5747 (1994)).
本発明の解析方法においては、必要に応じて、さらに、（ｃ）工程において相互作用していると判断されたタンパク質−標的物質結合体中の、タンパク質及び／又は標的物質を同定する。タンパク質の同定は、通常のアミノ酸配列シークエンサーで行うこともでき、こうしたタンパク質に結合しているＲＮＡからＤＮＡを逆転写し、得られたＤＮＡの塩基配列を解析することによって行うこともできる。標的物質の同定は、ＮＭＲ、ＩＲ、各種質量分析等を用いて行うことができる。
なお、本発明のＲＮＡチップ及びプロテインチップを用いて、タンパク質−タンパク質間相互作用を解析する場合は、通常のプロテインチップ上のサンプル解析と同様に、飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）を用いることができる。
In the analysis method of the present invention, if necessary, the protein and / or target substance in the protein-target substance conjugate determined to interact in step (c) is further identified. Protein identification can also be performed with a normal amino acid sequencer, or by reverse transcription of DNA from RNA bound to such protein and analysis of the base sequence of the obtained DNA. Identification of the target substance can be performed using NMR, IR, various mass spectrometry and the like.
When analyzing the protein-protein interaction using the RNA chip and protein chip of the present invention, the time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF MS) is used in the same manner as the sample analysis on a normal protein chip. Can be used.
（ｒＧを切断部位とするリンカーを利用したＩＶＶ合成）
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．リンカーの合成
本発明で使用するShort-Biotin-ピューロマイシン・リンカー（ＳＢＰリンカー）を合成した。まず、以下の特殊ＤＮＡ合成をジーンワールド（株）（東京）及び（株）ＢＥＸ（東京）に委託した。
(IVV synthesis using a linker with rG as a cleavage site)
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. The present invention is not limited to these examples.
1. Synthesis of Linker Short-Biotin-Puromycin linker (SBP linker) used in the present invention was synthesized. First, the following special DNA synthesis was entrusted to GeneWorld (Tokyo) and BEX (Tokyo).
（Ａ）Puro-F-S［配列；5'-(S)-(PL)C(F)-(Spacer18)-(Spacer18)-(Spacer18)-(Spacer18)-CC-(Puro)-3'］
ここで、(S)は5'-Thiol-Modifier C6で化合物名はS-Trityl-6-mercaptohexyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite；(PL)はPC Linker Phosphoramiditeで3-(4,4'-Dimethoxytrityl)-1-(2-nitrophenyl)-1-propanyl-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite；(F)はFluorescein-dTで（5'-Dimethoxytrityloxy-5-[N-((3',6'-dipivaloylfluoresceinyl)-aminohexyl)-3-acryimido]-2'-deoxyUridine-3'-succinoyl-long chain alkylamino）；(Puro)はピューロマイシン；(Spacer18)はSpacer Phosphoramidite 18（18-0-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite）である（すべてGlen Research社製）。
（Ｂ）Hybri［(26mer) 配列番号１：5'-CC(rG)C(T-B) C(rG)CCC CGCCG CCCCC CG(T)CC T-3'］
ここで、(rG)はリボＧ；(T)はAmino-Modifier C6 dT（5'-Dimethoxytrityl-5-[N-(trifluoroacetylaminohexyl)-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine,3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)；(T-B)はBiotin-dT（5'-Dimethoxytrityloxy-5-[N-((4-t-butylbenzoyl)-biotinyl)-aminohexyl)-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)である（すべてGlen Research Search社製）。
(A) Puro-FS [sequence: 5 '-(S)-(PL) C (F)-(Spacer18)-(Spacer18)-(Spacer18)-(Spacer18) -CC- (Puro) -3']
Where (S) is 5'-Thiol-Modifier C6 and the compound name is S-Trityl-6-mercaptohexyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)]-phosphoramidite; (PL) is PC Linker Phosphoramidite with 3- (4,4'-Dimethoxytrityl) -1- (2-nitrophenyl) -1-propanyl-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)]-phosphoramidite; (F) is Fluorescein -dT (5'-Dimethoxytrityloxy-5- [N-((3 ', 6'-dipivaloylfluoresceinyl) -aminohexyl) -3-acryimido] -2'-deoxyUridine-3'-succinoyl-long chain alkylamino); (Puro ) Is puromycin; (Spacer18) is Spacer Phosphoramidite 18 (18-0-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol, 1-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)]-phosphoramidite) (all manufactured by Glen Research).
(B) Hybri [(26mer) SEQ ID NO: 1 5'-CC (rG) C (TB) C (rG) CCC CGCCG CCCCC CG (T) CC T-3 ']
Where (rG) is ribo-G; (T) is Amino-Modifier C6 dT (5'-Dimethoxytrityl-5- [N- (trifluoroacetylaminohexyl) -3-acrylimido] -2'-deoxyUridine, 3 '-[(2 -cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)]-phosphoramidite); (TB) is Biotin-dT (5'-Dimethoxytrityloxy-5- [N-((4-t-butylbenzoyl) -biotinyl) -aminohexyl) -3 -acrylimido] -2'-deoxyUridine-3 '-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)]-phosphoramidite) (all made by Glen Research Search).
上記ＳＢＰリンカーは、（Ａ）Puro-F-Sと（Ｂ）Hybriを以下の方法に従って架橋し精製して得た。
Puro-F-S 10 nmolを100 μｌの50 ｍＭリン酸バッファー（pH 7.0）に溶かし、100 ｍＭ Tris[2-carboxyethyl]phosphine（TCEP、Pierce社製）を１μｌ加え（最終濃度 １ｍＭ）、室温で６時間放置し、Puro-F-Sのトリチル化メルカプト基をチオール基に還元した。架橋反応を行う直前に、50 ｍＭリン酸バッファー（pH 7.0）で平衡化したNAP-5 Columns（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）を用いてTCEPの除去及び脱塩を行った。
0.2 Ｍリン酸バッファー（pH 7.0）100 μｌに、500 pmol/μｌのHybriを20 μｌ、100 ｍＭの架橋剤EMCS（6-Maleimidohexanoic acid N-hydroxysuccinide ester）、（株）同仁化学研究所製）20 μl、を加えて良く攪拌し、37 ℃で30分反応させた。その後、４℃でエタノール沈殿を行って反応産物を沈殿させ、未反応のEMCSを除去した。沈殿を500μｌの冷70%エタノールにて洗浄し、減圧下で乾燥させた後、0.2 Ｍリン酸バッファー（pH 7.0）10 μｌに溶解した。
この反応産物に、上記還元したPuro-F-S（〜10 nmol）を速やかに加えて、４℃で一晩放置した。サンプルに終濃度が４ｍＭになるようにTCEPを加え、37 ℃で15分間放置し、チオール基の架橋反応を停止させた。室温にてエタノール沈殿を行い、合成したリンカーを沈殿させ、未反応のPuro-F-Sを取り除き、さらに未反応のHybri、及びそれらのEMCS架橋物を取り除くために、以下の条件でHPLC精製を行った。
The SBP linker was obtained by cross-linking (A) Puro-FS and (B) Hybri according to the following method.
Dissolve Puro-FS 10 nmol in 100 μl of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) and add 1 μl of 100 mM Tris [2-carboxyethyl] phosphine (TCEP, manufactured by Pierce) (final concentration 1 mM) for 6 hours at room temperature. The tritylated mercapto group of Puro-FS was reduced to a thiol group. Immediately before the cross-linking reaction, TCEP was removed and desalted using NAP-5 Columns (manufactured by GE Healthcare Japan) equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 7.0).
0.2 μM phosphate buffer (pH 7.0) 100 μl, 500 μmol / μl Hybri 20 μl, 100 mM cross-linking agent EMCS (6-Maleimidohexanoic acid N-hydroxysuccinide ester), manufactured by Dojin Chemical Laboratory 20 μl was added, stirred well, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, ethanol precipitation was performed at 4 ° C. to precipitate the reaction product, and unreacted EMCS was removed. The precipitate was washed with 500 μl of cold 70% ethanol, dried under reduced pressure, and then dissolved in 10 μl of 0.2 M phosphate buffer (pH 7.0).
To this reaction product, the reduced Puro-FS (˜10 nmol) was quickly added and left at 4 ° C. overnight. TCEP was added to the sample to a final concentration of 4 mM, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 15 minutes to stop the thiol group crosslinking reaction. Precipitate the synthesized linker at room temperature, remove unreacted Puro-FS, and then perform HPLC purification under the following conditions in order to remove unreacted Hybri and their EMCS cross-linked products .
（HPLC条件）
カラム：COSMOSIL（登録商標）10 x 250 mm C18-AR-300（ナカライテスク（株）製）
バッファーＡ：0.1 Ｍ TEAA（triethylammonium acetate）
バッファーＢ：80 ％アセトニトリル（超純水で希釈したもの）
流速：0.5 ml/分
濃度勾配：Ａ及びＢの混合バッファー濃度は85：15→65：15（Ａ：Ｂ）で変化させる（33分間）。
HPLCにより分画された生成物を18％アクリルアミドゲル（８Ｍ 尿素、６２℃）の電気泳動にて検出し、目的の画分を減圧下で乾燥させた。この後、DEPC（Diethylpyrocarbonate）処理水で溶かして、10 pmol/μｌとした。
(HPLC conditions)
Column: COSMOSIL (registered trademark) 10 x 250 mm C18-AR-300 (manufactured by Nacalai Tesque)
Buffer A: 0.1 M TEAA (triethylammonium acetate)
Buffer B: 80% acetonitrile (diluted with ultrapure water)
Flow rate: 0.5 ml / min Concentration gradient: The mixing buffer concentration of A and B is changed from 85:15 to 65:15 (A: B) (33 minutes).
The product fractionated by HPLC was detected by electrophoresis on 18% acrylamide gel (8M urea, 62 ° C.), and the target fraction was dried under reduced pressure. Then, it was dissolved in DEPC (Diethylpyrocarbonate) -treated water to make 10 pmol / μl.
２．ｍＲＮＡの合成
モデルmRNAとしてBDA（B domain of Protein A）を用いることとした。BDA遺伝子(BDA gene；配列番号２；192塩基長)の5'側上流にT7プロモーター配列と翻訳促進配列、3'側下流にスペーサー領域、ヒスチジンタグ（Hisタグ）及びピューロマイシン・リンカーとの相補鎖領域を有する配列を付加したDNA(BDA whole；配列番号３；367塩基長)をPCRによって合成、精製した後、T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System（プロメガ（株）製））を用いて、添付のプロトコールに従って5〜30 pmol/μｌのｍＲＮＡ(BDA mRNA；配列番号４；337塩基長)を合成した。
2. Synthesis of mRNA BDA (B domain of Protein A) was used as a model mRNA. The BDA gene (BDA gene; SEQ ID NO: 2; 192 bases long) is complemented with a T7 promoter sequence and translation promoting sequence upstream of the 5 'side, a spacer region, a histidine tag (His tag), and a puromycin linker downstream of the 3' side. After synthesizing and purifying DNA added with a sequence having a chain region (BDA whole; SEQ ID NO: 3; 367 bases in length) by T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System (Promega Corp.)), According to the attached protocol, 5 to 30 pmol / μl of mRNA (BDA mRNA; SEQ ID NO: 4; 337 base length) was synthesized.
３．連結体の形成
３．１ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いたライゲーション酵素反応
ライゲーション反応は、リンカー１に対して１〜６倍のmRNAを加え、20 μｌのＴ４ ＲＮＡリガーゼバッファー（50 ｍＭ Tris-HCl, pH 7.5; 10 ｍＭ 塩化マグネシウム; 10 ｍＭ DTT; １ｍＭ ATP）中にて行なった。酵素を加える前にアニーリングするため、90 ℃で５分間アルミブッロク上にて温めた、次に70 ℃で５分間アルミブロック上にて温め、最後に室温で10分間放置した後、氷上に置いた。ここに、１μｌのT4ポリヌクレオチドキナーゼ（10 U/μｌ）及び１μｌのT4 RNAリガーゼ（40 U/μｌ）（いずれもタカラバイオ（株）製）を加え、25 ℃で15分間、保持した。
生成反応液を半分に分割して、後の実験工程にて比較するため、リンカー10 pmolに対しｍＲＮＡ 10 pmolを反応させたサンプルについては、全ての物質を倍に増量して40 μｌの系にて反応させた（反応系Ｒ１）。
3. Ligation enzyme reaction using T4 RNA ligase In the ligation reaction, 1 to 6 times as much mRNA as linker 1 was added, and 20 μl of T4 RNA ligase buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5) was used. 10 mM magnesium chloride; 10 mM DTT; 1 mM ATP). To anneal before adding enzyme, warmed on aluminum block at 90 ° C for 5 minutes, then warmed on aluminum block at 70 ° C for 5 minutes, finally left at room temperature for 10 minutes, then placed on ice . To this, 1 μl of T4 polynucleotide kinase (10 U / μl) and 1 μl of T4 RNA ligase (40 U / μl) (both manufactured by Takara Bio Inc.) were added and held at 25 ° C. for 15 minutes.
In order to divide the generated reaction solution in half and compare it in the subsequent experimental step, for the sample in which 10 pmol of mRNA was reacted with 10 pmol of linker, all the substances were doubled to make a 40 μl system. (Reaction system R1).
３．２ ライゲーション反応の結果
以下に示す混合比で、ｍＲＮＡとＳＢＰリンカーとの連結効率を比較した。比較は、65℃、８Ｍ 尿素、５％変性アクリルアミドゲルを用い、200Ｖにて25分間の電気泳動にて行った。サンプルを各々１μｌずつ分注し、３μｌのローディングバッファーと２μｌのDEPC水と混合して、ゲルにロードした。結果を図５に示す。バンドの検出はリンカーに結合したFITCの蛍光により行い、未反応のリンカー又は上記連結体Ａを検出した。
図５は、10 pmolのｍＲＮＡに対して、10 pmolのリンカーを加え（前記40 μｌの反応系にて反応させたもの）（レーン１、反応系Ｒ１）、6.6 pmol（レーン２、反応系Ｒ２）、3.3 pmol（レーン３、反応系Ｒ３）、1.66 pmol（レーン４、反応系Ｒ４）、上記の通りライゲーション反応させたものの電気泳動像を表す。なお、図５中、矢印は未反応のリンカー、＊はリンカーが連結された反応産物（連結体Ａ）を示す。
図５から分かるとおり、レーン１においてリンカーの残余が見られたが、その他のレーンではほとんど見られなかった。また混合比１：１の場合を除き、連結体Ａの合成量に差はなく、いずれにおいてもほぼ等量のライゲーション反応の起きたことが観察された。
3.2 Results of ligation reaction The ligation efficiency of mRNA and SBP linker was compared at the mixing ratio shown below. The comparison was performed by electrophoresis at 65 ° C., 8M urea, 5% denatured acrylamide gel at 200V for 25 minutes. Each sample was dispensed in 1 μl, mixed with 3 μl loading buffer and 2 μl DEPC water and loaded onto the gel. The results are shown in FIG. The band was detected by the fluorescence of FITC bound to the linker, and the unreacted linker or the above-mentioned conjugate A was detected.
FIG. 5 shows 10 pmol mRNA added with 10 pmol linker (reacted in the 40 μl reaction system) (lane 1, reaction system R1), 6.6 pmol (lane 2, reaction system R2). ), 3.3 pmol (lane 3, reaction system R3), 1.66 pmol (lane 4, reaction system R4), and electrophoresis images of those subjected to the ligation reaction as described above. In FIG. 5, an arrow indicates an unreacted linker, and * indicates a reaction product (linker A) to which the linker is linked.
As can be seen from FIG. 5, a linker residue was seen in lane 1, but almost no other lane was seen. In addition, except for the case of a mixing ratio of 1: 1, there was no difference in the amount of synthesis of ligated A, and it was observed that almost the same amount of ligation reaction occurred in all cases.
図６には、上記のサンプルについてSYBR Goldにて染色した電気泳動像を示した。電気泳動の条件は上記と同様とした。なお、図６中、矢印は未反応のリンカー、＊はリンカーが連結された合成物（連結体Ａ）、＊＊は連結体を形成せずに残存するｍＲＮＡをそれぞれ示す。レーンＭは分子量マーカーを、その左側の数字は各バンドの分子量を表す。
図６から分かるとおり、レーン１においてリンカーの残余が見られたが、その他のレーンではほとんど見られなかった。またレーン１を除き、連結体Ａの合成量に差はなく、ｍＲＮＡの投入量が増えるにつれてｍＲＮＡの残余量の増加していることが観察された。
以上より、リンカーに対して1.0〜1.5倍量のｍＲＮＡがあれば連結体Ａの形成には十分なことが示された。
FIG. 6 shows an electrophoresis image of the above sample stained with SYBR Gold. The electrophoresis conditions were the same as described above. In FIG. 6, an arrow indicates an unreacted linker, * indicates a synthesized product (linker A) in which the linker is linked, and ** indicates mRNA that remains without forming a linkage. Lane M represents a molecular weight marker, and the number on the left side represents the molecular weight of each band.
As can be seen from FIG. 6, a linker residue was seen in lane 1, but almost no other lane was seen. Further, except for lane 1, there was no difference in the amount of conjugate A synthesized, and it was observed that the remaining amount of mRNA increased as the input amount of mRNA increased.
From the above, it was shown that the presence of 1.0 to 1.5 times the amount of mRNA relative to the linker is sufficient for the formation of conjugate A.
４．連結体Ａの精製と濃縮
ライゲーション後の反応生成物の精製及び濃縮の要否を確認するために、精製及び濃縮についての実験結果を示す。
前記Ｒ１より20 μｌを分取し、以下の精製濃縮工程に供した（反応系Ｒ１’）。Ｒ１の残りとＲ２〜Ｒ４については、ライゲーション反応後、そのままの状態で冷却して保持した。
未連結のリンカーと反応液とを除くために、ＲＮｅａｓｙ（登録商標） Ｋｉｔ（（株）キアゲン）を用いて、添付のプロトコールに従い精製した。DEPC水により溶出した連結体Ａ（30-50μｌ）は、共沈剤Quick-Precip Plus solution（EdgeBio社）を用いて添付のプロトコールに従い、エタノール沈殿させた。これを12μｌのＤＥＰＣ水に溶解し、翻訳用テンプレートとした。
4). Purification and Concentration of Conjugate A In order to confirm the necessity of purification and concentration of the reaction product after ligation, experimental results on purification and concentration are shown.
20 μl was separated from R1 and subjected to the following purification and concentration step (reaction system R1 ′). The rest of R1 and R2 to R4 were cooled and held as they were after the ligation reaction.
In order to remove the unlinked linker and the reaction solution, purification was performed using RNeasy (registered trademark) Kit (Qiagen Co., Ltd.) according to the attached protocol. Conjugate A (30-50 μl) eluted with DEPC water was ethanol precipitated using a coprecipitation agent Quick-Precip Plus solution (EdgeBio) according to the attached protocol. This was dissolved in 12 μl of DEPC water to obtain a template for translation.
５．ＩＶＶ形成（翻訳と並行する連結体Ａ及びタンパク質の連結）
５．１ ＩＶＶ（連結体Ｂ）合成
無細胞翻訳系にはRetic Lysate IVT Kit（Ambion社製）を利用した。混合の方法等は、キットのProtocolを参照して行った。無細胞翻訳反応に使用される全ての試薬を穏やかに撹拌して遠心した後、氷上に置いた。25μｌスケールの反応液は次のような順番で混合して調製し、反応させた。
0.625μｌの20X Translation Mix minus-Met、0.625μｌの20X Translation Mix minus-Leu、及び１７μのRetic lysateを泡立たないよう注意深くピペッテイングし、混合した。
この混合液を2.4μｌのＲ１'及び4.0μｌのＲ１〜４に添加した。さらに反応液が25μｌになるようにDEPC水を加えた。そして再び泡がでないように丁寧に混合した。混合の後30 ℃で20分間、翻訳反応をさせた。
上記翻訳反応後に、連結体Ａと合成タンパク質の連結を促進するため、上記反応液に10μｌの３Ｍ 塩化カリウム、及び３μｌの１Ｍ 塩化マグネシウムを加え37 ℃で90分間反応させた。
5. IVV formation (linkage of conjugate A and protein in parallel with translation)
5.1 IVV (conjugate B) synthesis Retic Lysate IVT Kit (Ambion) was used for the cell-free translation system. The mixing method was performed with reference to the protocol of the kit. All reagents used in the cell-free translation reaction were gently agitated and centrifuged, then placed on ice. A 25 μl scale reaction solution was prepared by mixing and reacting in the following order.
0.625 μl of 20X Translation Mix minus-Met, 0.625 μl of 20X Translation Mix minus-Leu, and 17 μ of Retic lysate were carefully pipetted and mixed without bubbling.
This mixture was added to 2.4 μl R1 ′ and 4.0 μl R1-4. Further, DEPC water was added so that the reaction solution became 25 μl. And it was mixed carefully so that there was no foam again. After mixing, the translation reaction was allowed to proceed at 30 ° C. for 20 minutes.
After the translation reaction, 10 μl of 3M potassium chloride and 3 μl of 1M magnesium chloride were added to the reaction solution and reacted at 37 ° C. for 90 minutes in order to promote the connection between the conjugate A and the synthetic protein.
５．２ ＩＶＶ（連結体Ｂ）合成効率の比較
上記の通り合成した連結体Ｂについて、上記同様の混合比で、ｍＲＮＡとＳＢＰリンカーとの連結効率を比較した。比較は、８Ｍ 尿素の６％ＳＤＳアクリルアミドゲを用いて、0.01Ａで60分間、その後、さらに0.02Ａで60分間、電気泳動を行った。その結果を図７に示す。バンドの検出はリンカーに結合したFITCの蛍光により行った。これにより、連結体Ａ又はＢを観察することができる。
図７は、レーン１：Ｒ１’、レーン２：Ｒ１、レーン３：Ｒ２、レーン４：Ｒ３、レーン５：Ｒ４、レーン６：連結体Ａを表す。なお、図７中、＊は連結体Ａ、矢印は連結体Ｂのそれぞれの分子量を示す。
図７から分かるとおり、Ｒ１とＲ２においてはレーン１のＲ１'と遜色の無い連結体Ｂの生成が見られた。その一方で、Ｒ３とＲ４においては生成量が少なく、ｍＲＮＡの量比が増えるにつれて連結体の形成効率が低下することが観察された。
5.2 Comparison of IVV (Conjugate B) Synthesis Efficiency For Linkage B synthesized as described above, the coupling efficiency of mRNA and SBP linker was compared at the same mixing ratio. For comparison, electrophoresis was carried out using 6% SDS acrylamide gel of 8M urea at 0.01 A for 60 minutes, and then at 0.02 A for 60 minutes. The result is shown in FIG. Band detection was performed by fluorescence of FITC bound to the linker. Thereby, the coupling body A or B can be observed.
FIG. 7 represents Lane 1: R1 ′, Lane 2: R1, Lane 3: R2, Lane 4: R3, Lane 5: R4, Lane 6: Conjugate A. In FIG. 7, * indicates the molecular weight of the linking body A, and the arrow indicates the molecular weight of the linking body B.
As can be seen from FIG. 7, in R1 and R2, the formation of a ligation B that is inferior to R1 ′ in lane 1 was observed. On the other hand, in R3 and R4, the production amount was small, and it was observed that the formation efficiency of the conjugate decreased as the mRNA ratio increased.
以上より、ライゲーション反応後のシリカゲルメンブレンカラム精製及びエタノール沈殿による濃縮を行わずとも、ＩＶＶを形成できることが示された。また、リンカーとｍＲＮＡの混合量比を1.0：1.0〜1.5に設定することで、上記精製及び濃縮を行った場合と遜色の無いＩＶＶ形成効率を得られることが示された。
本発明によれば、低コストで実施可能なＩＶＶ形成法を提供できる。また、本発明の好ましい態様における利用は、従来の方法と比較して遜色の無いＩＶＶ合成効率を有するため、mRNA/cDNAディスプレイ法の作動効率を低下させることなく、工程を簡略化できる。このことにより、本発明が、ＤＮＡ及びタンパク質の機能解析及び機能タンパク質の取得を目指すハイスループットな進化分子工学的手法に応用されることで、上記新規医薬創出の要請に応えるものである。
From the above, it was shown that IVV can be formed without performing silica gel membrane column purification after ligation reaction and concentration by ethanol precipitation. In addition, it was shown that IVV formation efficiency comparable to that obtained by the purification and concentration described above can be obtained by setting the mixing ratio of linker and mRNA to 1.0: 1.0 to 1.5.
According to the present invention, it is possible to provide an IVV forming method that can be performed at a low cost. Moreover, since the use in the preferred embodiment of the present invention has IVV synthesis efficiency comparable to that of the conventional method, the process can be simplified without reducing the operating efficiency of the mRNA / cDNA display method. Thus, the present invention is applied to a high-throughput evolutionary molecular engineering method aiming at functional analysis of DNA and protein and acquisition of functional protein, thereby meeting the above-mentioned demand for creation of a new drug.
また、本発明は上記創薬を始めとして、医療診断、環境分析、食品分析、研究用バイオイメージングの各分野で有用である。 The present invention is useful in the fields of medical diagnosis, environmental analysis, food analysis, and research bioimaging, including the above drug discovery.
１ ｍＲＮＡ
２ リンカー
２ａ タンパク質結合部位
２ｂ 固相結合部位
２ｃ 固相遊離部位
２ｃ１ 第１切断部位
２ｃ２ 第２切断部位
２ｄ 標識
２ｅ タンパク質遊離部位
３ 連結体Ａ
４ 連結体Ｂ
５ タンパク質
６ 固相ビーズ
６ａ 固相結合部位認識部位
７ ｃＤＮＡ
２００ 主鎖
２０１ 主鎖５’末端
２０２ 主鎖５’末端近傍部
２０３ 主鎖３’末端側領域部
３００ 側鎖
1 mRNA
2 Linker 2a Protein binding site 2b Solid phase binding site 2c Solid phase release site 2c1 First cleavage site 2c2 Second cleavage site 2d Label 2e Protein release site 3 Conjugate A
4 Conjugate B
5 Protein 6 Solid phase beads 6a Solid phase binding site recognition site 7 cDNA
200 Main chain 201 Main chain 5 ′ end 202 Main chain 5 ′ end vicinity 203 Main chain 3 ′ end side region 300 Side chain
Hybri
Guanosine
Biotin-dT
Amino-Modifier C6 dT
BDA whole
BDA mRNA
Hybri
Guanosine
Biotin-dT
Amino-Modifier C6 dT
BDA whole
BDA mRNA
Claims (10)
タンパク質結合部位を有し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡアナログからなる群から選ばれる少なくとも２以上の物質によって形成される１本鎖の主鎖を含み、この主鎖中に上記連結体を固相部位に結合するための固相結合部位と、前記固相結合部位を挟む位置に設けられた一対の切断部位を有するリンカーと、
所定の3'末端近傍配列を有するｍＲＮＡとを、３：１〜１：６の割合で混合し、その後ライゲーション反応により結合させてｍＲＮＡ−リンカー連結体を含むライゲーション溶液を得る工程と；
無細胞翻訳系に前記ライゲーション溶液をそのまま投入して、前記ｍＲＮＡ−リンカー連結体中の前記所定の配列を有するｍＲＮＡを翻訳してタンパク質を合成する工程と；
前記タンパク質が、前記ｍＲＮＡ−リンカー連結体中の前記タンパク質結合部位に結合する工程と；を備える、ｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体の生成方法。 In the reaction of individual molecules in the liquid phase,
A single-stranded main chain formed of at least two or more substances selected from the group consisting of DNA, RNA, and DNA analogs, and having the protein-binding site in the main chain; A linker having a solid phase binding site for binding to and a pair of cleavage sites provided at positions sandwiching the solid phase binding site ;
A step of mixing mRNA having a predetermined sequence near the 3 ′ end in a ratio of 3: 1 to 1: 6 and then binding by a ligation reaction to obtain a ligation solution containing an mRNA-linker conjugate;
Adding the ligation solution as it is to a cell-free translation system, translating the mRNA having the predetermined sequence in the mRNA-linker conjugate, and synthesizing a protein;
Binding the protein to the protein binding site in the mRNA-linker conjugate. A method for producing an mRNA-linker-protein conjugate.
5'位がリン酸化された主鎖5'末端部と、
第１及び第２の切断部位と、前記第１及び第２の切断部位の間に位置し、固相との間の結合形成に使用される固相結合部位とを備え、前記リンカーの主鎖、側鎖及び前記ｍＲＮＡからなる群から選ばれるいずれとも非相補的な配列を有する、主鎖5'末端近傍部と、
前記ｍＲＮＡの3'末端近傍配列と相補的な配列を有する主鎖3'末端側領域部と、
を備えることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体の生成方法。 The linker main chain is:
A 5′-end phosphorylated main chain 5 ′ end,
A main chain of the linker, comprising: a first and a second cleavage site; and a solid phase binding site which is located between the first and second cleavage sites and used for forming a bond with the solid phase. Each having a non-complementary sequence selected from the group consisting of a side chain and the mRNA, near the main chain 5 ′ end,
A main chain 3 'terminal region region having a sequence complementary to the 3' terminal vicinity of the mRNA,
The method for producing an mRNA-linker-protein conjugate according to any one of claims 1 to 4 , characterized by comprising:
前記主鎖は主鎖3'末端側領域部に側鎖連結部位をさらに備え、かつ前記主鎖の3'末端まで前記ｍＲＮＡの3'末端近傍配列と相補的な配列をさらに有し；
前記側鎖は、5'末端に位置する前記主鎖連結部位と、3'末端に位置する前記タンパク質結合部位とを有することを特徴とする、請求項６に記載のｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体の生成方法。 The linker further comprises a side chain comprising a nucleic acid analog and DNA;
The main chain further comprises a side chain linking site in the main chain 3 'terminal region, and further has a sequence complementary to the 3' terminal vicinity of the mRNA up to the 3 'end of the main chain;
The mRNA-linker-protein conjugate according to claim 6, wherein the side chain has the main chain linking site located at the 5 'end and the protein binding site located at the 3' end. Generation method.
前記第１及び第２の切断部位をＲＮＡ切断酵素で切断する工程とをさらに備えることを特徴とする、請求項７に記載のｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体の生成方法。 Binding to a solid phase via the solid phase binding site;
The method for producing an mRNA-linker-protein conjugate according to claim 7, further comprising a step of cleaving the first and second cleavage sites with an RNA cleaving enzyme.
タンパク質結合部位を有し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡアナログからなる群から選ばれる少なくとも２以上の物質によって形成される１本鎖の主鎖を備えるリンカーと、所定の3'末端近傍配列を有するｍＲＮＡとを、３：１〜１：６の割合で混合し、その後ライゲーション反応により結合させてｍＲＮＡ−リンカー連結体を含むライゲーション溶液を得る工程と；
無細胞翻訳系に前記ライゲーション溶液をそのまま投入して、前記ｍＲＮＡ−リンカー連結体中の前記所定の配列を有するｍＲＮＡを翻訳してタンパク質を合成する工程と；
前記タンパク質が、前記ｍＲＮＡ−リンカー連結体中の前記タンパク質結合部位に結合し、ｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体を生成する工程と；
ｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質連結体を前記リンカーの備える固相結合部位を介して固相と結合させる工程と；
前記主鎖の3'末端を反応開始点とし、前記ｍＲＮＡを鋳型として、固相上で逆転写反応を行ってｃＤＮＡ鎖を形成させる工程と；
前記主鎖の備える第１及び第２の切断部位を、ＲＮＡ切断酵素で切断する工程と；を備えるｍＲＮＡ−リンカー−タンパク質−ｃＤＮＡ連結体の生成方法であって、
前記リンカーは核酸アナログとＤＮＡとを含む側鎖をさらに備え、
前記リンカーの主鎖は、
5'位がリン酸化された主鎖5'末端部と、
前記第１及び第２の切断部位と、前記第１及び第２の切断部位の間に位置し、固相との間の結合形成に使用される前記固相結合部位とを備え、前記リンカーの主鎖、側鎖及び前記ｍＲＮＡからなる群から選ばれるいずれとも非相補的な配列を有する、主鎖5'末端近傍部と、
側鎖連結部位を含み、前記主鎖の3'末端まで前記ｍＲＮＡの3'末端近傍配列と相補的な配列を有する主鎖3'末端側領域部と、
を備えることを特徴とし；
前記側鎖は、5'末端に位置する前記主鎖連結部位と、3'末端に位置する前記タンパク質結合部位とを有することを特徴とする方法。 In the reaction of individual molecules in the liquid phase,
A mRNA having a protein binding site, a linker having a single-stranded main chain formed of at least two or more substances selected from the group consisting of DNA, RNA, and DNA analogs, and a sequence near a predetermined 3 ′ end Are mixed at a ratio of 3: 1 to 1: 6 and then bound by a ligation reaction to obtain a ligation solution containing an mRNA-linker conjugate;
Adding the ligation solution as it is to a cell-free translation system, translating the mRNA having the predetermined sequence in the mRNA-linker conjugate, and synthesizing a protein;
Binding the protein to the protein binding site in the mRNA-linker conjugate to produce an mRNA-linker-protein conjugate;
binding an mRNA-linker-protein conjugate to a solid phase via a solid phase binding site of the linker;
A step of performing a reverse transcription reaction on a solid phase using the 3 ′ end of the main chain as a reaction initiation point and the mRNA as a template to form a cDNA chain;
Cleaving the first and second cleavage sites of the main chain with an RNA cleaving enzyme; and a method for producing an mRNA-linker-protein-cDNA conjugate comprising:
The linker further comprises a side chain comprising a nucleic acid analog and DNA;
The linker main chain is:
A 5′-end phosphorylated main chain 5 ′ end,
The first and second cleavage sites, and the solid phase binding site that is located between the first and second cleavage sites and used to form a bond with the solid phase, A main chain, a side chain, and any portion selected from the group consisting of the mRNAs, each having a non-complementary sequence, and the vicinity of the main chain 5 ′ end;
A main chain 3 ′ end side region having a side chain linking site and having a sequence complementary to the 3 ′ end vicinity sequence of the mRNA up to the 3 ′ end of the main chain;
Characterized by comprising:
The side chain has the main chain linking site located at the 5 ′ end and the protein binding site located at the 3 ′ end.
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