JPWO2003061700A1 - 慢性腎疾患治療薬 - Google Patents
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Abstract
Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体１を阻害する化合物を有効成分とする慢性腎疾患治療薬。
Description
技術分野
本発明は、新規な慢性腎疾患治療薬に関する。
背景技術
細胞内の遊離Ｃａ２＋は、心筋や種々平滑筋の収縮、神経伝達物質の放出、遺伝子発現を制御する重要なイオンであり、このＣａ２＋濃度の調節は細胞膜および筋小胞体膜のＣａ２＋−ｐｕｍｐ、Ｃａ２＋ｃｈａｎｎｅｌやＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体（ＮＣＸ）により調節されている。特にこの中でもＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体は心筋および血管平滑筋の収縮・弛緩に重要な役割を演じている（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第５２卷４６７頁（１９９０））。現在哺乳動物から３種のＮＣＸ遺伝子が分離同定されている。そしてＮＣＸ１蛋白は、脳、心臓、腎臓で多量に発現しており、ＮＣＸ２蛋白はおもに脳で発現し内臓平滑筋でも少量発現しており、ＮＣＸ３蛋白は脳でおもに発現し骨格筋に少量発現していることが知られている（血管第２４卷Ｎｏ．３，１０１頁（２００１）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７２，Ｃ１２５０−Ｃ１２６１（１９９７））。
一方、ＮＣＸ阻害薬としては（２−［２−［４［ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］ｅｔｈｙｌ）ｉｓｏｔｈｉｏ−ｕｒｅａｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＫＢ−Ｒ７９４３）等のｉｓｏｔｈｉｏｕｒｅａ誘導体や２−［４−［（２，５−ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｏｘｙ］−５−ｅｔｈｏｘｙａｎｉｌｉｎｅ（ＳＥＡ０４００）等のフェノキシアニリン誘導体の報告があり、Ｋ−ＢＲ７９４３は急性心筋梗塞モデルや脳および腎臓の虚血再灌流モデルに対しての有効性が確認されている（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．第２９６卷４１２頁（２００１））。しかし、ＮＣＸ阻害薬の慢性腎疾患治療への応用については何ら報告されていない。
発明の開示
本発明者らは、脳、心臓、腎臓より調製したＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体（ＮＣＸ）を用いて、Ｋ−ＢＲ７９４３、ＳＥＡ０４００等のＮＣＸ阻害作用を測定した。その結果、ＳＥＡ０４００を始めとするフェノキシアニリン誘導体およびフェノキシピリジン誘導体は、脳組織由来のＮＣＸと比較して、心臓および腎臓由来のＮＣＸを選択的に阻害することがわかった。
また、これまでの研究から上記化合物はＮＣＸを阻害する濃度で他の受容体、チャンネルおよびトランスポーターにはほとんど影響を及ぼさないことが報告されている（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．第２９８卷２４９頁（２００１））
以上のことから、フェノキシアニリン誘導体等はＮＣＸ１に高い選択性を有することが明らかとなった。
さらに本発明者らは、ＮＣＸ１と疾患・治療との関連について解明する目的で、種々の疾患モデル（慢性腎不全／腎糸球体硬化症モデル、糖尿病ラットなど）に関して上記ＮＣＸ１選択的阻害薬を用いて検討したところ、慢性腎不全、腎糸球体硬化症、糖尿病性腎症においてＮＣＸ１を阻害することが腎保護に有効であることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体１を阻害する化合物を有効成分とする慢性腎疾患治療薬である。
また、本発明は、式（１）
［式中、Ｒ１は水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルコキシ基を示し、Ｒ２はハロゲン原子又はニトロ基を示し、Ｒ３は水素原子又はハロゲン原子を示す。］で表わされる２−フェノキシアニリン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする慢性腎疾患治療薬である。
発明を実施するための最良の形態
本発明においてＮＣＸ１阻害する化合物は、腎臓由来のＮＣＸ１を阻害する化合物であれば特に限定されないが、後述する試験（参考例３）において３μＭの濃度で５０％以上阻害するものが好ましい。さらに副作用を防止する目的からＮＣＸ１を特異的に阻害する化合物が好ましい。
ＮＣＸ１を特異的に阻害する化合物とは、ＮＣＸ１を阻害する濃度で他の受容体、チャンネルおよびトランスポーターをほとんど阻害しない化合物をいい、具体的には、例えば３μＭの濃度においてＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌ、Ｎａ＋ｃｈａｎｎｅｌ、Ｋ＋ｃｈａｎｎｅｌ、Ｎａ＋／Ｈ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、Ｎａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ、５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ、ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ−ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｎｉｔｒｉｃ−ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＬＴＢ４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＰＡＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒを５０％以上阻害しないことが好ましい。なお、各々のイオンチャンネル、酵素、レセプターを用いた測定方法は、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．第２９８卷２４９頁（２００１）およびこれに引用された文献に記載されている。
ＮＣＸ１を特異的に阻害する化合物の例としては、フェノキシアニリン誘導体およびフェノキシピリジン誘導体を挙げることができる。
好ましくは、式（２）
［式中、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、同一又は異なって水素原子又はハロゲン原子を示し、Ｘは
を示す。Ｒ７は水素原子、置換若しくは無置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基又は置換若しくは無置換のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基を示し、Ｚはニトロ基、アミノ基又はＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｒ８基を示し、Ｒ８は水素原子、置換若しくは無置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換若しくは無置換のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ２〜Ｃ７アシロキシ基、ＮＲ９Ｒ１０又は
を示し、Ｒ９およびＲ１０は同一又は異なって水素原子、置換若しくは無置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｎ−メチル−４−ピペリジニル基を示し、Ｒ１１は水素原子、ヒドロキシ基又はＣ２〜Ｃ７アルコキシカルボニル基を示し、Ｙはメチレン基、エポキシ基、チオ基又はＮＲ１２基を示し、ｎは１から４の整数を示す。Ｒ１２は水素原子、置換若しくは無置換のＣ１〜Ｃ６アルキル基又は置換若しくは無置換のフェニル基を示す。］で表わされる化合物又はその薬学的に許容される塩である。
ＮＣＸ１阻害活性の点からさらに好ましくは、式（１）
［式中、Ｒ１は水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルコキシ基を示し、Ｒ２はハロゲン原子又はニトロ基を示し、Ｒ３は水素原子又はハロゲン原子を示す。］で表わされる２−フェノキシアニリン誘導体又はその薬学的に許容される塩である。
式（１）および（２）においてＣ１〜Ｃ６アルコキシ基とは、炭素原子数１〜６の直鎖又は分枝状のアルコキシ基を意味し、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチロキシ基、イソペンチロキシ基、ネオペンチロキシ基、ｔｅｒｔ−ペンチロキシ基、１−メチルブトキシ基、２−メチルブトキシ基、１，２−ジメチルプロポキシ基、ヘキシロキシ基、イソヘキシロキシ基等が挙げられる。
置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基の置換基としては、クロロ基、フルオロ基、ニトロ基、アミノ基、ジメチルアミノ基、カルボキシル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、フェニル基、ヒドロキシ基、シアノ基、カルバモイル基等が挙げられる。
ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子をいう。
Ｃ１〜Ｃ６アルキル基とは、炭素原子数１〜６の直鎖又は分枝状のアルキル基を意味し、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１，２−ジメチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基等が挙げられる。
置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル基の置換基としては、クロロ基、フルオロ基、ニトロ基、アミノ基、ジメチルアミノ基、カルボキシル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、フェニル基、メトキシ基、エトキシ基、ヒドロキシ基、シアノ基、カルバモイル基等が挙げられる。
Ｃ２〜Ｃ７アシロキシ基とは、炭素原子数２〜７の直鎖又は分枝状のアシロキシ基を意味し、アシル部分は、環状であっても、芳香族基を含んでいてもよい。例えばアセトキシ基、プロピオニロキシ基、イソプロピオニロキシ基、シクロヘキシニロキシ基、ベンゾイルオキシ基等が挙げられる。
Ｃ２〜Ｃ７アルコキシカルボニル基とは、炭素原子数２〜７の直鎖又は分枝状のアルコキシカルボニル基を意味し、アルコキシル部分は、環状であっても、芳香族基を含んでいてもよい。具体的には、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ペンチロキシカルボニル基、イソペンチロキシカルボニル基、ネオペンチロキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ペンチロキシカルボニル基、１−メチルブトキシカルボニル基、２−メチルブトキシカルボニル基、１，２−ジメチルプロポキシカルボニル基、ヘキシロキシカルボニル基、イソヘキシロキシカルボニル基等が挙げられる。
置換フェニル基の置換基としては、クロロ基、フルオロ基、ニトロ基、アミノ基、ジメチルアミノ基、カルボキシル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、メチル基、エチル基、メトキシ基、エトキシ基、ヒドロキシ基、シアノ基、カルバモイル基等が挙げられる。
優れた腎保護作用を示す化合物の例としては
で表される化合物（ＳＥＡ０４００）、
で表される化合物（ＳＥＡ００６４）を挙げることができる。
また、さらに副作用を防止する目的からはＮＣＸ２、ＮＣＸ３よりもＮＣＸ１を強力に阻害する化合物であることが好ましい。例えば、後述のＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体の測定法にて、
ＩＣ５０（腎皮質由来）／ＩＣ５０（脳由来）
ＩＣ５０（腎皮質由来）／ＩＣ５０（心筋膜由来）
の各々の計算値がＳＥＡ０４００を用いたときの計算値より小さいことが好ましい。
なお、式（１）および（２）であらわされる化合物は、ＷＯ９８／４３９４３、ＷＯ９９／２０５９８、特開平１０−２６５４６０、特開平１０−２１８８４４、特開平１１−４９７５２、特開平１１−９２４５４に記載の製造方法により合成することができる。
本発明において慢性腎疾患治療薬とは、慢性腎不全、腎糸球体硬化症、糖尿病性腎症、腎硬化症、慢性腎炎、慢性糸球体腎炎、多発性嚢胞腎等を含む慢性腎疾患の腎生理機能を低下させる疾患の治療薬を意味し、尿中蛋白やアルブミンを減少させるなど優れた腎保護作用を有する。
本発明の治療薬は適宜公知の担体、希釈剤等を用いて適宜の医薬組成形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、ドライシロップ、注射剤など）に調製して経口的又は非経口的に使用できる。
固形剤を製造するには種々の添加剤、例えば賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、コーティング基剤を用い、攪拌造粒法、流動層造粒法、破砕造粒法で製造できる。
その他必要に応じて抗酸化剤、コーティング剤、着色剤、矯味矯臭剤、界面活性剤、可塑剤等を加えることができる。
本発明医薬の有効成分の投与量は年齢、体重、投与形態等により異なるが、通常成人に対し０．１〜１０００ｍｇ／日であり、これを１日１回又は数回に分け投与する。
以下、本発明を製剤例、試験例等を用いて説明するが、本発明はこれら試験例等に限定されるものではない。
製剤例１
ＳＥＡ０４００ ５０ｍｇ
乳糖 ４０ｍｇ
コーンスターチ ４９．７５ｍｇ
結晶セルロース １７ｍｇ
カルメロースカルシウム １７ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース ５．２５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム １ｍｇ
合計 １８０ｍｇ
ＳＥＡ０４００、乳糖、コーンスターチ、結晶セルロース、カルメロースカルシウムを均一に混合し、これに１０％ヒドロキシプロピルセルロース水溶液を添加し、連合後、乾燥し、その顆粒を３０Ｍ篩で篩過し、均一の顆粒として、ステアリン酸マグネシウムを添加し、打錠して錠剤とした。
製剤例２
ＳＥＡ００６４ ５０ｍｇ
乳糖 ４０ｍｇ
コーンスターチ ４９．７５ｍｇ
結晶セルロース １７ｍｇ
カルメロースカルシウム １７ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース ５．２５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム １ｍｇ
合計 １８０ｍｇ
ＳＥＡ００６４、乳糖、コーンスターチ、結晶セルロース、カルメロースカルシウムを均一に混合し、これに１０％ヒドロキシプロピルセルロース水溶液を添加し、連合後、乾燥し、その顆粒を３０Ｍ篩で篩過し、均一の顆粒として、ステアリン酸マグネシウムを添加し、打錠して錠剤とした。
参考例１ 大脳ミクロソームＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体の測定法
ラット（８週齢）の大脳より得られたミクロソーム（１．５ｍｇ／ｍｌ）を１６０ｍＭ ＮａＣｌ含有バッファーで前処理し、膜小胞内にＮａをロードした。この懸濁液を２０μＭ４５ＣａＣｌ２含有バッファーで５０倍希釈して４５Ｃａ取り込みを誘発した後、バッファー（０℃）で希釈して反応を停止させ、速やかにニトロセルロース膜上に膜小胞を回収する。その後、膜小胞内の４５Ｃａを液体シンチレーター法で定量した。上記の大脳ミクロソームにおけるＮａ＋／Ｃａ２＋交換活性の測定はＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５７卷，５１１１頁（１９８２）の方法に準じて行った。
参考例２ イヌ心筋膜小胞Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体の測定法
イヌ心筋膜小胞（０．５ｍｇ／ｍｌ）をＭｅｔｈｏｄｓ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１５７卷，８５頁（１９８８）に準じた遠心分画法により調製し、溶液Ａ（２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４），１６０ｍＭ ＮａＣｌ ｏｒ ＫＣｌ）に懸濁して室温で 約１時間静置して小胞内にＮａ ｏｒ Ｋをロードした。この懸濁液を２０μＭ ４５ＣａＣｌ２含有バッファーで５０倍希釈して４５Ｃａ取り込みを誘発した後、バッファー（０℃）で希釈して反応を停止させ、速やかにニトロセルロース膜上に膜小胞を回収した。その後、膜小胞内の４５Ｃａを液体シンチレーター法で定量した。Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換活性は、Ｎａをロードした場合の値から、Ｋをロードした場合の値を差し引いた値で評価した。上記のイヌ心筋膜小胞におけるＮａ＋／Ｃａ２＋交換活性の測定はＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５７卷，５１１１頁（１９８２）の方法に準じて行った。
参考例３ ラット腎臓皮質由来ＢＬＭＶ（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）の調製法およびＮａ＋／Ｃａ２＋交換活性の測定法
（ＢＬＭＶの調製法）
ラット腎臓皮質由来のＢＬＭＶの調製およびＮａ＋／Ｃａ２＋交換活性の測定はＡｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第２６６卷Ｆ７８５頁（１９９４）の方法に準じて行った。
ラットより腎臓を摘出後、氷冷ｓｕｃｒｏｓｅ ｂｕｆｆｅｒ（０．２５ｍＭ ｓｕｃｒｏｓｅ，０．１ｍＭ ＰＭＳＦ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６））に入れ、被膜を除いた後、単離した皮質をｓｕｃｒｏｓｅ ｂｕｆｆｅｒ中で細かく切断した。ダウンス型ホモジェナイザーでホモジェナイズした後、ポリトロン型ホモジェナイザーでホモジェナイズした。その後２５００ｇ、１５ｍｉｎ遠心して上清を回収した。さらに２４０００ｇ、２０ｍｉｎ遠心し、ｗｈｉｔｅ ｆｌｕｆｆｙ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｌｌｅｔを回収した。さらにｓｕｃｒｏｓｅ ｂｕｆｆｅｒを添加してダウンス型ホモジェナイザーでホモジェナイズし、Ｐｅｒｃｏｌｌを添加した後、３００００ｇ、３５ｍｉｎ遠心してｍｉｄｄｌｅ ｌａｙｅｒを回収した。その後ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ ｍａｎｎｉｔｏｌ，５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４））を添加した後、３４０００ｇ、３０ｍｉｎ遠心してｌｏｏｓｅ ｗｈｉｔｅ ｐｅｌｌｅｔ（ＢＬＭＶ）を回収した。さらにＫＣｌ−ｍａｎｎｉｔｏｌ ｂｕｆｆｅｒに懸濁した後、３４０００ｇ、３０ｍｉｎ遠心して沈殿を回収し、活性測定に用いた。
（Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体（Ｎａ依存性４５Ｃａ取り込み）の測定方法）
ＢＬＭＶをｐｒｅｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＮａＣｌ，４０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４，１０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ，５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４））で平衡化（３７℃、１０分）した後、遠心（２００００ｇ、５ｍｉｎ）して沈殿を回収し、ｐｒｅｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁した。再遠心して沈殿を回収した後、ｐｒｅｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁した。このＢＬＭＶ懸濁液をｅｘｔｅｒｎａｌ ｍｅｄｉｕｍ（１００ｍＭ ｃｈｏｌｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，４０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４，１０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ，５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４），２５ｕＭ ｖａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ，１０ｕＭ ＣａＣｌ２，１ｍＣｉ／ｌ ４５ＣａＣｌ２）で２０倍希釈して取り込みを開始した。２５℃で一定時間反応後、ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｉｃｅ−ｃｏｌｄ １５０ｍＭ ＫＣｌ）２ｍｌ添加して反応を停止した後、速やかに限外濾過膜（０．４５ｕｍニトロセルロースフィルター）で濾過し、ＢＬＭＶをフィルター上に回収した。その後２ｍｌ ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎで２回洗浄した後、液体シンチレーター法でＢＬＭＶ内へ取り込まれた４５Ｃａを定量した。
また、ＳＥＡ００６４にあっても腎皮質由来のＮａ＋／Ｃａ２＋交換活性の測定法にてＳＥＡ０４００の約０．０７倍の阻害活性が確認された。
試験例１
Ｄａｈｌ−ｓａｌｔ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒａｔにおけるＮａ＋／Ｃａ２＋交換系阻害薬の腎保護作用
本試験は、Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ第２３巻９７０頁（１９９４）に記載の方法に準拠して行なった。具体的には、以下のように行なった。
＜方法＞
実験にはＤａｈｌ−ｓａｌｔ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（Ｄａｈｌ−Ｓ）ｒａｔおよび対照動物であるＤａｈｌ−ｓａｌｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ｄａｈｌ−Ｒ）ｒａｔ（オス、７週齢）を用い、下記のように３群に分けて（１群各６例）試験を行なった。
Ｉ群：Ｄａｈｌ−Ｒ＋４％ ＮａＣｌ食＋溶媒経口投与（１日２回）
ＩＩ群：Ｄａｈｌ−Ｓ＋４％ ＮａＣｌ食＋溶媒経口投与（１日２回）
ＩＩＩ群：Ｄａｈｌ−Ｓ＋４％ ＮａＣｌ食＋ＳＥＡ０４００ １０ｍｇ／ｋｇ経口投与（１日２回）
各群の動物には４％ ＮａＣｌ高食塩含有飼料（正常飼料は０．６％）を与え、飲料水は自由に摂取させた。溶媒およびＳＥＡ０４００は１日２回経口投与し（１回目は８：３０〜９：３０，２回目は１６：３０〜１７：３０）６週間連続経口投与する。投与開始より６週間後、代謝ケージにラットを一匹ずつ入れて尿を採取し、尿中蛋白およびアルブミン量を測定して腎機能に及ぼす影響を観察した。尿中蛋白およびアルブミンの測定は、それぞれＢｕｎｓｅｋｉ Ｋａｇａｋｕ第３２巻Ｅ３７９−Ｅ３８６頁（１９８３）およびＨｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ第４０巻６号８３４−８３９頁（２００２）に記載の方法に準拠して、日立自動分析装置７０６０を用いて行なった。
試験開始６週間後の尿中蛋白***量は、Ｉ群：２３±２ｍｇ／ｄａｙ，ＩＩ群：１４４±１１ｍｇ／ｄａｙであったが、ＳＥＡ０４００投与群（ＩＩＩ群）では９１±１２ｍｇ／ｄａｙであり溶媒投与群（ＩＩ群）と比較して有意に低値であった。
また、尿中アルブミン***量は、Ｉ群：２±１ｍｇ／ｄａｙ，ＩＩ群：１０９±１４ｍｇ／ｄａｙであったが、ＳＥＡ０４００投与群（ＩＩＩ群）では５８±８ｍｇ／ｄａｙであり溶媒投与群（ＩＩ群）と比較して有意に低値であった。
以上の結果よりＳＥＡ０４００は、Ｄａｈｌ−Ｓラットにおいて認められた尿中蛋白およびアルブミン***量の増加を有意に抑制し、腎保護作用示した。
試験例２
自然発症糖尿病ラット（ＺＳＦ−１）におけるＮａ＋／Ｃａ２＋交換系阻害薬の腎保護作用
＜方法＞
ＺＳＦ−１は自然発症の糖尿病ラットであり、腎機能障害を来たすことが知られている（Ｒｅｎａｌ Ｆａｉｌｕｒｅ第２２巻４号，３８７−４０６頁、２０００）。本試験では、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓ ｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した８週齢のＺＳＦ−１および対照動物であるＺＳＦ−１／ｌｅａｎを用い、下記のように５群に分けて（１群各８例）試験を行なった。
Ｉ群：ＺＳＦ−１／ｌｅａｎ＋溶媒経口投与（１日２回）
ＩＩ群：ＺＳＦ−１＋溶媒経口投与（１日２回）
ＩＩＩ群：ＺＳＦ−１＋ＳＥＡ０４００ １ｍｇ／ｋｇ経口投与（１日２回）
ＩＶ群：ＺＳＦ−１＋ＳＥＡ０４００ ３ｍｇ／ｋｇ経口投与（１日２回）
Ｖ群：ＺＳＦ−１＋ＳＥＡ０４００ １０ｍｇ／ｋｇ経口投与（１日２回）
溶媒およびＳＥＡ０４００は１日２回（１回目は８：３０〜１０：３０，２回目は１６：３０〜１８：３０）で８週間連続経口投与する。投与開始から８週間後、代謝ケージにラットを一匹ずつ入れて尿を採取し、尿中蛋白およびアルブミン量を測定して腎機能に及ぼす影響を観察した。尿中蛋白およびアルブミン量の測定は、上記の文献の記載に準拠して、日立自動分析装置７０６０で行なった。
試験開始８週間後の尿中蛋白***量は、Ｉ群：１４±１ｍｇ／ｄａｙ，ＩＩ群：５８±９ｍｇ／ｄａｙ ＩＩＩ群：４０±８ｍｇ／ｄａｙ，ＩＶ群：３７±７ｍｇ／ｄａｙ，Ｖ群：２９±５ｍｇ／ｄａｙであり、ＳＥＡ０４００ １０ｍｇ／ｋｇ投与群（Ｖ群）は溶媒投与群（ＩＩ群）と比較して有意に低値であった。
また、尿中アルブミン***量は、Ｉ群：１±０．１ｍｇ／ｄａｙ，ＩＩ群：２８±５ｍｇ／ｄａｙ ＩＩＩ群：２０±５ｍｇ／ｄａｙ，ＩＶ群：１７±５ｍｇ／ｄａｙ，Ｖ群：９±２ｍｇ／ｄａｙであり、ＳＥＡ０４００ １０ｍｇ／ｋｇ投与群（Ｖ群）は溶媒投与群（ＩＩ群）と比較して有意に低値であった。
以上の結果よりＳＥＡ０４００は、自然発症糖尿病ラットにおいて認められた尿中蛋白およびアルブミン***量の増加を有意に抑制し、腎保護作用を示した。
産業上の利用の可能性
本発明により、新規な作用機序に基づく慢性腎疾患治療薬の提供が可能となっり、副作用の少ない慢性腎疾患の治療、予防に有用である。
本発明は、新規な慢性腎疾患治療薬に関する。
背景技術
細胞内の遊離Ｃａ２＋は、心筋や種々平滑筋の収縮、神経伝達物質の放出、遺伝子発現を制御する重要なイオンであり、このＣａ２＋濃度の調節は細胞膜および筋小胞体膜のＣａ２＋−ｐｕｍｐ、Ｃａ２＋ｃｈａｎｎｅｌやＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体（ＮＣＸ）により調節されている。特にこの中でもＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体は心筋および血管平滑筋の収縮・弛緩に重要な役割を演じている（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第５２卷４６７頁（１９９０））。現在哺乳動物から３種のＮＣＸ遺伝子が分離同定されている。そしてＮＣＸ１蛋白は、脳、心臓、腎臓で多量に発現しており、ＮＣＸ２蛋白はおもに脳で発現し内臓平滑筋でも少量発現しており、ＮＣＸ３蛋白は脳でおもに発現し骨格筋に少量発現していることが知られている（血管第２４卷Ｎｏ．３，１０１頁（２００１）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７２，Ｃ１２５０−Ｃ１２６１（１９９７））。
一方、ＮＣＸ阻害薬としては（２−［２−［４［ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］ｅｔｈｙｌ）ｉｓｏｔｈｉｏ−ｕｒｅａｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＫＢ−Ｒ７９４３）等のｉｓｏｔｈｉｏｕｒｅａ誘導体や２−［４−［（２，５−ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｏｘｙ］−５−ｅｔｈｏｘｙａｎｉｌｉｎｅ（ＳＥＡ０４００）等のフェノキシアニリン誘導体の報告があり、Ｋ−ＢＲ７９４３は急性心筋梗塞モデルや脳および腎臓の虚血再灌流モデルに対しての有効性が確認されている（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．第２９６卷４１２頁（２００１））。しかし、ＮＣＸ阻害薬の慢性腎疾患治療への応用については何ら報告されていない。
発明の開示
本発明者らは、脳、心臓、腎臓より調製したＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体（ＮＣＸ）を用いて、Ｋ−ＢＲ７９４３、ＳＥＡ０４００等のＮＣＸ阻害作用を測定した。その結果、ＳＥＡ０４００を始めとするフェノキシアニリン誘導体およびフェノキシピリジン誘導体は、脳組織由来のＮＣＸと比較して、心臓および腎臓由来のＮＣＸを選択的に阻害することがわかった。
また、これまでの研究から上記化合物はＮＣＸを阻害する濃度で他の受容体、チャンネルおよびトランスポーターにはほとんど影響を及ぼさないことが報告されている（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．第２９８卷２４９頁（２００１））
以上のことから、フェノキシアニリン誘導体等はＮＣＸ１に高い選択性を有することが明らかとなった。
さらに本発明者らは、ＮＣＸ１と疾患・治療との関連について解明する目的で、種々の疾患モデル（慢性腎不全／腎糸球体硬化症モデル、糖尿病ラットなど）に関して上記ＮＣＸ１選択的阻害薬を用いて検討したところ、慢性腎不全、腎糸球体硬化症、糖尿病性腎症においてＮＣＸ１を阻害することが腎保護に有効であることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体１を阻害する化合物を有効成分とする慢性腎疾患治療薬である。
また、本発明は、式（１）
発明を実施するための最良の形態
本発明においてＮＣＸ１阻害する化合物は、腎臓由来のＮＣＸ１を阻害する化合物であれば特に限定されないが、後述する試験（参考例３）において３μＭの濃度で５０％以上阻害するものが好ましい。さらに副作用を防止する目的からＮＣＸ１を特異的に阻害する化合物が好ましい。
ＮＣＸ１を特異的に阻害する化合物とは、ＮＣＸ１を阻害する濃度で他の受容体、チャンネルおよびトランスポーターをほとんど阻害しない化合物をいい、具体的には、例えば３μＭの濃度においてＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌ、Ｎａ＋ｃｈａｎｎｅｌ、Ｋ＋ｃｈａｎｎｅｌ、Ｎａ＋／Ｈ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、Ｎａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ、５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ、ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ−ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｎｉｔｒｉｃ−ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＬＴＢ４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＰＡＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒを５０％以上阻害しないことが好ましい。なお、各々のイオンチャンネル、酵素、レセプターを用いた測定方法は、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．第２９８卷２４９頁（２００１）およびこれに引用された文献に記載されている。
ＮＣＸ１を特異的に阻害する化合物の例としては、フェノキシアニリン誘導体およびフェノキシピリジン誘導体を挙げることができる。
好ましくは、式（２）
ＮＣＸ１阻害活性の点からさらに好ましくは、式（１）
式（１）および（２）においてＣ１〜Ｃ６アルコキシ基とは、炭素原子数１〜６の直鎖又は分枝状のアルコキシ基を意味し、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチロキシ基、イソペンチロキシ基、ネオペンチロキシ基、ｔｅｒｔ−ペンチロキシ基、１−メチルブトキシ基、２−メチルブトキシ基、１，２−ジメチルプロポキシ基、ヘキシロキシ基、イソヘキシロキシ基等が挙げられる。
置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基の置換基としては、クロロ基、フルオロ基、ニトロ基、アミノ基、ジメチルアミノ基、カルボキシル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、フェニル基、ヒドロキシ基、シアノ基、カルバモイル基等が挙げられる。
ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子をいう。
Ｃ１〜Ｃ６アルキル基とは、炭素原子数１〜６の直鎖又は分枝状のアルキル基を意味し、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１，２−ジメチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基等が挙げられる。
置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル基の置換基としては、クロロ基、フルオロ基、ニトロ基、アミノ基、ジメチルアミノ基、カルボキシル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、フェニル基、メトキシ基、エトキシ基、ヒドロキシ基、シアノ基、カルバモイル基等が挙げられる。
Ｃ２〜Ｃ７アシロキシ基とは、炭素原子数２〜７の直鎖又は分枝状のアシロキシ基を意味し、アシル部分は、環状であっても、芳香族基を含んでいてもよい。例えばアセトキシ基、プロピオニロキシ基、イソプロピオニロキシ基、シクロヘキシニロキシ基、ベンゾイルオキシ基等が挙げられる。
Ｃ２〜Ｃ７アルコキシカルボニル基とは、炭素原子数２〜７の直鎖又は分枝状のアルコキシカルボニル基を意味し、アルコキシル部分は、環状であっても、芳香族基を含んでいてもよい。具体的には、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ペンチロキシカルボニル基、イソペンチロキシカルボニル基、ネオペンチロキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ペンチロキシカルボニル基、１−メチルブトキシカルボニル基、２−メチルブトキシカルボニル基、１，２−ジメチルプロポキシカルボニル基、ヘキシロキシカルボニル基、イソヘキシロキシカルボニル基等が挙げられる。
置換フェニル基の置換基としては、クロロ基、フルオロ基、ニトロ基、アミノ基、ジメチルアミノ基、カルボキシル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、メチル基、エチル基、メトキシ基、エトキシ基、ヒドロキシ基、シアノ基、カルバモイル基等が挙げられる。
優れた腎保護作用を示す化合物の例としては
また、さらに副作用を防止する目的からはＮＣＸ２、ＮＣＸ３よりもＮＣＸ１を強力に阻害する化合物であることが好ましい。例えば、後述のＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体の測定法にて、
ＩＣ５０（腎皮質由来）／ＩＣ５０（脳由来）
ＩＣ５０（腎皮質由来）／ＩＣ５０（心筋膜由来）
の各々の計算値がＳＥＡ０４００を用いたときの計算値より小さいことが好ましい。
なお、式（１）および（２）であらわされる化合物は、ＷＯ９８／４３９４３、ＷＯ９９／２０５９８、特開平１０−２６５４６０、特開平１０−２１８８４４、特開平１１−４９７５２、特開平１１−９２４５４に記載の製造方法により合成することができる。
本発明において慢性腎疾患治療薬とは、慢性腎不全、腎糸球体硬化症、糖尿病性腎症、腎硬化症、慢性腎炎、慢性糸球体腎炎、多発性嚢胞腎等を含む慢性腎疾患の腎生理機能を低下させる疾患の治療薬を意味し、尿中蛋白やアルブミンを減少させるなど優れた腎保護作用を有する。
本発明の治療薬は適宜公知の担体、希釈剤等を用いて適宜の医薬組成形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、ドライシロップ、注射剤など）に調製して経口的又は非経口的に使用できる。
固形剤を製造するには種々の添加剤、例えば賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、コーティング基剤を用い、攪拌造粒法、流動層造粒法、破砕造粒法で製造できる。
その他必要に応じて抗酸化剤、コーティング剤、着色剤、矯味矯臭剤、界面活性剤、可塑剤等を加えることができる。
本発明医薬の有効成分の投与量は年齢、体重、投与形態等により異なるが、通常成人に対し０．１〜１０００ｍｇ／日であり、これを１日１回又は数回に分け投与する。
以下、本発明を製剤例、試験例等を用いて説明するが、本発明はこれら試験例等に限定されるものではない。
製剤例１
ＳＥＡ０４００ ５０ｍｇ
乳糖 ４０ｍｇ
コーンスターチ ４９．７５ｍｇ
結晶セルロース １７ｍｇ
カルメロースカルシウム １７ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース ５．２５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム １ｍｇ
合計 １８０ｍｇ
ＳＥＡ０４００、乳糖、コーンスターチ、結晶セルロース、カルメロースカルシウムを均一に混合し、これに１０％ヒドロキシプロピルセルロース水溶液を添加し、連合後、乾燥し、その顆粒を３０Ｍ篩で篩過し、均一の顆粒として、ステアリン酸マグネシウムを添加し、打錠して錠剤とした。
製剤例２
ＳＥＡ００６４ ５０ｍｇ
乳糖 ４０ｍｇ
コーンスターチ ４９．７５ｍｇ
結晶セルロース １７ｍｇ
カルメロースカルシウム １７ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース ５．２５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム １ｍｇ
合計 １８０ｍｇ
ＳＥＡ００６４、乳糖、コーンスターチ、結晶セルロース、カルメロースカルシウムを均一に混合し、これに１０％ヒドロキシプロピルセルロース水溶液を添加し、連合後、乾燥し、その顆粒を３０Ｍ篩で篩過し、均一の顆粒として、ステアリン酸マグネシウムを添加し、打錠して錠剤とした。
参考例１ 大脳ミクロソームＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体の測定法
ラット（８週齢）の大脳より得られたミクロソーム（１．５ｍｇ／ｍｌ）を１６０ｍＭ ＮａＣｌ含有バッファーで前処理し、膜小胞内にＮａをロードした。この懸濁液を２０μＭ４５ＣａＣｌ２含有バッファーで５０倍希釈して４５Ｃａ取り込みを誘発した後、バッファー（０℃）で希釈して反応を停止させ、速やかにニトロセルロース膜上に膜小胞を回収する。その後、膜小胞内の４５Ｃａを液体シンチレーター法で定量した。上記の大脳ミクロソームにおけるＮａ＋／Ｃａ２＋交換活性の測定はＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５７卷，５１１１頁（１９８２）の方法に準じて行った。
参考例２ イヌ心筋膜小胞Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体の測定法
イヌ心筋膜小胞（０．５ｍｇ／ｍｌ）をＭｅｔｈｏｄｓ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１５７卷，８５頁（１９８８）に準じた遠心分画法により調製し、溶液Ａ（２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４），１６０ｍＭ ＮａＣｌ ｏｒ ＫＣｌ）に懸濁して室温で 約１時間静置して小胞内にＮａ ｏｒ Ｋをロードした。この懸濁液を２０μＭ ４５ＣａＣｌ２含有バッファーで５０倍希釈して４５Ｃａ取り込みを誘発した後、バッファー（０℃）で希釈して反応を停止させ、速やかにニトロセルロース膜上に膜小胞を回収した。その後、膜小胞内の４５Ｃａを液体シンチレーター法で定量した。Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換活性は、Ｎａをロードした場合の値から、Ｋをロードした場合の値を差し引いた値で評価した。上記のイヌ心筋膜小胞におけるＮａ＋／Ｃａ２＋交換活性の測定はＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５７卷，５１１１頁（１９８２）の方法に準じて行った。
参考例３ ラット腎臓皮質由来ＢＬＭＶ（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）の調製法およびＮａ＋／Ｃａ２＋交換活性の測定法
（ＢＬＭＶの調製法）
ラット腎臓皮質由来のＢＬＭＶの調製およびＮａ＋／Ｃａ２＋交換活性の測定はＡｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第２６６卷Ｆ７８５頁（１９９４）の方法に準じて行った。
ラットより腎臓を摘出後、氷冷ｓｕｃｒｏｓｅ ｂｕｆｆｅｒ（０．２５ｍＭ ｓｕｃｒｏｓｅ，０．１ｍＭ ＰＭＳＦ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６））に入れ、被膜を除いた後、単離した皮質をｓｕｃｒｏｓｅ ｂｕｆｆｅｒ中で細かく切断した。ダウンス型ホモジェナイザーでホモジェナイズした後、ポリトロン型ホモジェナイザーでホモジェナイズした。その後２５００ｇ、１５ｍｉｎ遠心して上清を回収した。さらに２４０００ｇ、２０ｍｉｎ遠心し、ｗｈｉｔｅ ｆｌｕｆｆｙ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｌｌｅｔを回収した。さらにｓｕｃｒｏｓｅ ｂｕｆｆｅｒを添加してダウンス型ホモジェナイザーでホモジェナイズし、Ｐｅｒｃｏｌｌを添加した後、３００００ｇ、３５ｍｉｎ遠心してｍｉｄｄｌｅ ｌａｙｅｒを回収した。その後ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ ｍａｎｎｉｔｏｌ，５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４））を添加した後、３４０００ｇ、３０ｍｉｎ遠心してｌｏｏｓｅ ｗｈｉｔｅ ｐｅｌｌｅｔ（ＢＬＭＶ）を回収した。さらにＫＣｌ−ｍａｎｎｉｔｏｌ ｂｕｆｆｅｒに懸濁した後、３４０００ｇ、３０ｍｉｎ遠心して沈殿を回収し、活性測定に用いた。
（Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体（Ｎａ依存性４５Ｃａ取り込み）の測定方法）
ＢＬＭＶをｐｒｅｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＮａＣｌ，４０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４，１０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ，５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４））で平衡化（３７℃、１０分）した後、遠心（２００００ｇ、５ｍｉｎ）して沈殿を回収し、ｐｒｅｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁した。再遠心して沈殿を回収した後、ｐｒｅｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁した。このＢＬＭＶ懸濁液をｅｘｔｅｒｎａｌ ｍｅｄｉｕｍ（１００ｍＭ ｃｈｏｌｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，４０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４，１０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ，５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４），２５ｕＭ ｖａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ，１０ｕＭ ＣａＣｌ２，１ｍＣｉ／ｌ ４５ＣａＣｌ２）で２０倍希釈して取り込みを開始した。２５℃で一定時間反応後、ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｉｃｅ−ｃｏｌｄ １５０ｍＭ ＫＣｌ）２ｍｌ添加して反応を停止した後、速やかに限外濾過膜（０．４５ｕｍニトロセルロースフィルター）で濾過し、ＢＬＭＶをフィルター上に回収した。その後２ｍｌ ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎで２回洗浄した後、液体シンチレーター法でＢＬＭＶ内へ取り込まれた４５Ｃａを定量した。
試験例１
Ｄａｈｌ−ｓａｌｔ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒａｔにおけるＮａ＋／Ｃａ２＋交換系阻害薬の腎保護作用
本試験は、Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ第２３巻９７０頁（１９９４）に記載の方法に準拠して行なった。具体的には、以下のように行なった。
＜方法＞
実験にはＤａｈｌ−ｓａｌｔ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（Ｄａｈｌ−Ｓ）ｒａｔおよび対照動物であるＤａｈｌ−ｓａｌｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ｄａｈｌ−Ｒ）ｒａｔ（オス、７週齢）を用い、下記のように３群に分けて（１群各６例）試験を行なった。
Ｉ群：Ｄａｈｌ−Ｒ＋４％ ＮａＣｌ食＋溶媒経口投与（１日２回）
ＩＩ群：Ｄａｈｌ−Ｓ＋４％ ＮａＣｌ食＋溶媒経口投与（１日２回）
ＩＩＩ群：Ｄａｈｌ−Ｓ＋４％ ＮａＣｌ食＋ＳＥＡ０４００ １０ｍｇ／ｋｇ経口投与（１日２回）
各群の動物には４％ ＮａＣｌ高食塩含有飼料（正常飼料は０．６％）を与え、飲料水は自由に摂取させた。溶媒およびＳＥＡ０４００は１日２回経口投与し（１回目は８：３０〜９：３０，２回目は１６：３０〜１７：３０）６週間連続経口投与する。投与開始より６週間後、代謝ケージにラットを一匹ずつ入れて尿を採取し、尿中蛋白およびアルブミン量を測定して腎機能に及ぼす影響を観察した。尿中蛋白およびアルブミンの測定は、それぞれＢｕｎｓｅｋｉ Ｋａｇａｋｕ第３２巻Ｅ３７９−Ｅ３８６頁（１９８３）およびＨｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ第４０巻６号８３４−８３９頁（２００２）に記載の方法に準拠して、日立自動分析装置７０６０を用いて行なった。
試験開始６週間後の尿中蛋白***量は、Ｉ群：２３±２ｍｇ／ｄａｙ，ＩＩ群：１４４±１１ｍｇ／ｄａｙであったが、ＳＥＡ０４００投与群（ＩＩＩ群）では９１±１２ｍｇ／ｄａｙであり溶媒投与群（ＩＩ群）と比較して有意に低値であった。
また、尿中アルブミン***量は、Ｉ群：２±１ｍｇ／ｄａｙ，ＩＩ群：１０９±１４ｍｇ／ｄａｙであったが、ＳＥＡ０４００投与群（ＩＩＩ群）では５８±８ｍｇ／ｄａｙであり溶媒投与群（ＩＩ群）と比較して有意に低値であった。
以上の結果よりＳＥＡ０４００は、Ｄａｈｌ−Ｓラットにおいて認められた尿中蛋白およびアルブミン***量の増加を有意に抑制し、腎保護作用示した。
試験例２
自然発症糖尿病ラット（ＺＳＦ−１）におけるＮａ＋／Ｃａ２＋交換系阻害薬の腎保護作用
＜方法＞
ＺＳＦ−１は自然発症の糖尿病ラットであり、腎機能障害を来たすことが知られている（Ｒｅｎａｌ Ｆａｉｌｕｒｅ第２２巻４号，３８７−４０６頁、２０００）。本試験では、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓ ｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した８週齢のＺＳＦ−１および対照動物であるＺＳＦ−１／ｌｅａｎを用い、下記のように５群に分けて（１群各８例）試験を行なった。
Ｉ群：ＺＳＦ−１／ｌｅａｎ＋溶媒経口投与（１日２回）
ＩＩ群：ＺＳＦ−１＋溶媒経口投与（１日２回）
ＩＩＩ群：ＺＳＦ−１＋ＳＥＡ０４００ １ｍｇ／ｋｇ経口投与（１日２回）
ＩＶ群：ＺＳＦ−１＋ＳＥＡ０４００ ３ｍｇ／ｋｇ経口投与（１日２回）
Ｖ群：ＺＳＦ−１＋ＳＥＡ０４００ １０ｍｇ／ｋｇ経口投与（１日２回）
溶媒およびＳＥＡ０４００は１日２回（１回目は８：３０〜１０：３０，２回目は１６：３０〜１８：３０）で８週間連続経口投与する。投与開始から８週間後、代謝ケージにラットを一匹ずつ入れて尿を採取し、尿中蛋白およびアルブミン量を測定して腎機能に及ぼす影響を観察した。尿中蛋白およびアルブミン量の測定は、上記の文献の記載に準拠して、日立自動分析装置７０６０で行なった。
試験開始８週間後の尿中蛋白***量は、Ｉ群：１４±１ｍｇ／ｄａｙ，ＩＩ群：５８±９ｍｇ／ｄａｙ ＩＩＩ群：４０±８ｍｇ／ｄａｙ，ＩＶ群：３７±７ｍｇ／ｄａｙ，Ｖ群：２９±５ｍｇ／ｄａｙであり、ＳＥＡ０４００ １０ｍｇ／ｋｇ投与群（Ｖ群）は溶媒投与群（ＩＩ群）と比較して有意に低値であった。
また、尿中アルブミン***量は、Ｉ群：１±０．１ｍｇ／ｄａｙ，ＩＩ群：２８±５ｍｇ／ｄａｙ ＩＩＩ群：２０±５ｍｇ／ｄａｙ，ＩＶ群：１７±５ｍｇ／ｄａｙ，Ｖ群：９±２ｍｇ／ｄａｙであり、ＳＥＡ０４００ １０ｍｇ／ｋｇ投与群（Ｖ群）は溶媒投与群（ＩＩ群）と比較して有意に低値であった。
以上の結果よりＳＥＡ０４００は、自然発症糖尿病ラットにおいて認められた尿中蛋白およびアルブミン***量の増加を有意に抑制し、腎保護作用を示した。
産業上の利用の可能性
本発明により、新規な作用機序に基づく慢性腎疾患治療薬の提供が可能となっり、副作用の少ない慢性腎疾患の治療、予防に有用である。
Claims (5)
- Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体１（ＮＣＸ１）を阻害する化合物を有効成分とする慢性腎疾患治療薬。
- Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体１（ＮＣＸ１）を特異的に阻害する化合物を有効成分とする慢性腎疾患治療薬。
- 式（１）
［式中、Ｒ１は水素原子又はＣ１〜Ｃ６アルコキシ基を示し、Ｒ２およびＲ３はハロゲン原子を示す。］で表わされる２−フェノキシアニリン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする慢性腎疾患治療薬。 - Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体１（ＮＣＸ１）を阻害することを特徴とする慢性腎疾患の治療又は予防方法。
- 慢性腎疾患治療時の腎保護のためのＮａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体１（ＮＣＸ１）を阻害する化合物の使用。
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