JPWO2002063310A1 - バイオチップ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

被検体と特異に反応し、被検体の構造又は機能に対する情報を得るために用いられるキャプチャーを複数種類、基板１０上に供給して、該基板１０上にキャプチャーによるスポットが多数配列されたバイオチップを製造するバイオチップの製造方法において、基板１０上に固定化補強液１６を供給し（第１の供給工程）、次いで、試料調製工程で得られた試料１４を基板１０上に供給されている固定化補強液１６上に供給することによって、バイオチップを製造する（第２の供給工程）。

Description

技術分野
本発明は、本発明は、生化学上の被検体と特異に反応し、被検体の構造、機能に対する情報を得るために使用されるバイオチップ等に代表される検査機器に用いられ、好ましくは顕微鏡スライドグラス等の基板上に、数百から数万種類以上の異なる種類の被検体を捕捉するキャプチャー、特にＤＮＡ断片等を微小スポットとして高密度に整列固定させたＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）及びその製造方法に関する。
背景技術
近年における遺伝子構造の解析方法の進歩にはめざましいものがあり、ヒトの遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子構造が明らかにされてきている。このような遺伝子構造の解析には、顕微鏡スライドグラス等の基板上に数百から数万種類以上の異なる種類のＤＮＡ断片等を微小スポットとして整列固定させたＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）が用いられるようになってきている。
このＤＮＡマイクロアレイの製造における微小スポットの形成方法としては、ＱＵＩＬＬ方式、ピン＆リング方式、あるいはスプリングピン方式等、ピンを使用し、試料液を基板上に打ち込むものが広く用いられている。
いずれの方法を採用した場合であっても、各微小スポットの容量と形状のばらつきを低く抑えて、各微小スポット間の距離を一定に保つことが重要となり、更には、基板上に形成された微小スポット中の被検体と特異に反応し、被検体の構造、機能に対する情報を得るために用いられるキャプチャー（ＤＮＡマイクロアレイの場合はＤＮＡ断片等に相当する）は、確実に基板上に固定化されることが必要である。
一方、更なる高密度化に向けて、微小スポットの形状制御性が良好であり、生産性に優れた新しい方法の開発に対する期待も大きい。
ところで、従来のバイオチップの製造においては、ＤＮＡ断片等を含む試料を基板上に滴下して微小スポットを形成する際や、その後のチップの扱いや処理において、該微小スポットが剥がれ落ちるという現象が生じる場合がある。ＤＮＡマイクロアレイにおけるＤＮＡ断片等の基板上への固定化は、ＤＮＡ断片自体に固定用の官能基を付けたり、基板の表面を官能基層でコーティングする手法が採用されているが、このような手法を採用しても、微小スポットの剥がれを防止するには不十分である。
また、ＤＮＡ断片等を含む試料中に親水性ポリマー等を溶解させて、ＤＮＡ断片等の基板上への固定を補強する手法も採用されているが、試料と固定化補強液を混合するための工程が必要となり、しかも、固定化補強液も多く必要となることからコストアップが懸念される。更に、そのような固定化補強液と試料を予め混合して基板上に供給する場合は、数千種以上の試料と１種類の固定化補強液のなじみや相溶性を考慮しなければならず、固定化補強液の材料の選択性に制限があった。
更にまた、固定化補強液を含んだ試料は、従来の方法にて基板上に供給しなければならないため、その供給方法にて供給できる物性を有した固定化補強液しか使用できないという欠点があった。
具体的には、ＤＮＡマイクロアレイの一般的な製造法であるピンを用いた機械式のスポット形成法においては、固定化補強液を含んだ試料は、物理的にピンに保持（付着）して試料を基板上に移動（供給）させるため、ピンに付着する試料でなければならず、またその付着量は、数千種以上のＤＮＡ断片等の全ての場合になるべく均一になるようにしなければならないため、ＤＮＡ断片等と混合する固定化補強剤の選定は極めて限られたものであった。
一方、微小スポットを精度よく形成する方法として、非接触式スポッティング法の一つであるインクジェット式スポッティング法がある。この方法を用いた、生体試料を微小量、精度よく分注する装置として、圧電／電歪素子をマイクロポンプとして使用したマイクロピペット及びこれを用いた分注装置が、開発、実用化されている。
この非接触式スポッティング法は、ＤＮＡ断片や核酸、アミノ酸等を含んだ生体試料を微小な液滴として空中に吐出し、スライド基板上に付着させるものである。
しかしながら、この方法は、各々液物性が微妙に異なる数百から数万種類の比較的粘度の高い生体試料の微小な液滴を空中に吐出し、スライド基板上に付着させるものであるため、吐出時に、目的とする液滴（目的吐出滴）の他に、いわゆるサテライト（目的吐出滴より細かいしぶき状の滴）が発生し易く、それが基板上に付着して、本来のスポット形成位置以外の箇所にスポットを形成させたり、微小スポット間の距離を一定に保つことができずに、相互混入によるコンタミネーションを引き起こす等、得られる製品の品質上問題があった。
このようないわゆるサテライトは、分注装置の運転初期には発生せずに、しばらく運転してから発生することもあり、工程管理上極めて厄介な問題であった。また、液滴の吐出速度が大きいと、スライド基板に付着する際に液滴の勢いが大きく、しぶき（飛沫）を発生させて、スポット周りにこの飛沫による不要スポット（これもサテライトと呼ぶ）を発生させる等の問題があった。
このようないわゆるサテライトの発生を防止するためには、吐出速度を小さくすればよいが、吐出速度を小さくすると、吐出が不安定になるという問題があった。
また、上述したＤＮＡ断片等を含む試料中に親水性ポリマー等を溶解させて、ＤＮＡ断片等の基板上への固定を補強する方法をインクジェット式スポッティング法に採用した場合、吐出ノズルを通じて試料溶液を基板上に吐出することになるが、試料溶液を基板に吐出する際に、試料溶液の固化が進み、吐出不能になるおそれがある。特に、試料に粘度の高い固定化液を混合させて吐出する場合、吐出ノズルの近傍での試料溶液の乾燥固化が原因で吐出不良を引き起こすという問題がある。
また、実際に被検体の構造又は機能に対する情報を得る場合に、被検体がスポット以外の基板に非特異的に付着する場合が生じる。従来は、このような現象を防止するために、基板上にスポットを形成した後に、ブロッキング処理（基板上のうち、スポットが形成された部分以外の部分に被検体が付着することがないようにする処理）するようにしている。
しかし、このブロッキング処理においては、基板上に供給されたキャプチャーの大半が前記ブロッキング処理の際に流れてしまうという問題があった。
また、ブロッキング処理が不完全で、スポットのシグナルのＳ／Ｎ比が劣化するという問題もあった。
本発明は、このような課題を考慮してなされたものであり、ＤＮＡ断片等を含む試料の微小スポットの抜けのなく、スポットにシグナルのＳ／Ｎ比が高い高品質なバイオチップを製造でき、製造工程の簡略化、コストの低廉化並びに歩留まりの向上を図ることができるバイオチップ及びその製造方法を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明は、被検体と特異に反応し、被検体の構造又は機能に対する情報を得るために用いられるキャプチャー溶液を複数種類基板上に供給して、基板上にキャプチャー溶液によるスポットが多数配列されたバイオチップにおいて、前記基板は、少なくとも前記スポットが形成されるべき箇所に、前記キャプチャーの前記基板上への固定化を担う第１の物質が形成されていることを特徴とする。ここで、キャプチャーを含む溶液試料とは、キャプチャーを液体中に溶解、あるいは、分散させた溶液のことであり、キャプチャー溶液を含む試料ともよばれる。
こうすることにより、キャプチャーの基板上への固定化が強固なものとなり、ブロッキング処理などによってキャプチャーが剥がれ落ちる不具合が回避される。尚、固定化を担う第１の物質は、前期キャプチャーを前期基板上に固定化させる固定化液であっても固定化を補強する固定化補強液であってもよい。
更に、本発明に係るバイオチップは、被検体と特異に反応し、被検体の構造又は機能に対する情報を得るために用いられるキャプチャーを含む試料を複数種類、基板上に供給して、該基板上にキャプチャーを含む試料によるスポットが多数配列されたバイオチップにおいて、前記基板は、少なくとも前記スポットが形成されるべき箇所に、前記キャプチャーの前記基板上への固定化を担う第１の物質が形成され、前記スポットが形成されるべき箇所以外の部分に、少なくとも前記キャプチャーの前記基板上への固定化を阻害する第２の物質が形成されていることを特徴とする。これにより、前記第２の物質が形成されていない部分の形状により、前記スポットの形状並びに配列形態が決定されることになる。そのため、試料を基板上に供給した際に、スポットの配列間隔がばらついたり、スポット同士が付着するなどの不具合は回避され、試料を規定の位置に供給できなかった場合には、第２の物質の存在により、該試料の基板上への付着が防がれるため、汚染源となることはなく、もって解析の際の信頼性、再現性、定量性に優れたバイオチップとなる。
また、試料をインクジェット方式で供給した場合に、試料吐出の際にしばしば発生するサテライト現象による飛沫は、前記第２の物質の存在によって基板への付着が阻害されるため、インクジェット方式にて発生していたサテライトの問題を解消させることができる。
つまり、本発明においては、安価に高品質なバイオチップを得ることができるのある。
そして、前記構成において、前記第２の物質は、前記キャプチャーの前記基板上への固定化を阻害し、かつ、前記被検体が前記基板上への付着を阻害する物質であることが好ましい。この場合、スポットの形成前において、すでにスポットが形成されるべき部分以外の部分に、被検体が基板上に付着することが阻害される物質が存在しているため、スポットの形成後に、スポット毎にブロッキング処理を行う必要がなくなる。そのため、基板上に固定されるキャプチャーの量を通常のバイオチップに比べ多く確保することができ、結果として、被検体に対する感度が向上する。
また、前記第１の物質を前記基板上の全面に形成し、前記第２の物質を前記基板上に形成された前記第１の物質上のうち、前記スポットが形成されるべき箇所以外の部分に形成するようにしてもよい。
こうすることで、スポットの形状並びに配列形態を決定する前記第２の物質が形成されていない部分の形状を、第２の物質の形成だけで規定できるため、よりスポットの間隔、個別の形状のバラツキが抑えられたバイオチップが実現され、結果として、被検体に対する感度が揃った精度の解析が可能となる。
そして、本発明は、被検体と特異に反応し、被検体の構造又は機能に対する情報を得るために用いられるキャプチャー溶液を複数種類基板上に供給して、基板上にキャプチャー溶液によるスポットが多数配列されたバイオチップを製造するバイオチップの製造方法において、キャプチャーを含む溶液試料とキャプチャーを含まない溶液試料とをそれぞれ別々に供給してバイオチップを製造することを特徴とする。この場合、前記キャプチャーを含む溶液試料をインクジェット方式で供給することが好ましい。
ここで、キャプチャーを含まない溶液試料とは、その液体中にキャプチャーが存在しない溶液のことをいい、キャプチャー溶液を含まない試料ともよぶ。
キャプチャー溶液を含む試料とキャプチャー溶液を含まない試料とをそれぞれ別々に供給することにより、キャプチャー溶液を含まない試料は、キャプチャーを基板上に確実に固定化、保持するための性能を持つという観点のみから選択でき好ましい。また、キャプチャー溶液を含む試料とキャプチャー溶液を含まない試料とをそれぞれ別々の供給手段にて供給することが可能になるため、それぞれの液に最適な供給法を用いることができる。
その結果、数百種以上になることもあるキャプチャー溶液を含む試料に対し、キャプチャー溶液を含まない試料は通常１種類になることが多く、キャプチャー溶液を含まない試料の供給手段として、簡易で安価、大量処理ができる手段を採用することが可能となる。
キャプチャー溶液を含む試料の供給手段としてインクジェット方式を用いることにより、キャプチャー溶液を含む試料を微小量、精度よく基板上に供給できる。また、インクジェット方式は、非接触式の液の供給方式であるため、このようなキャプチャー溶液を含む試料とキャプチャー溶液を含まない試料の２種類以上の液を供給して一つのスポットを形成する場合には最適である。
なぜならば、ごく限られた研究実験を除き、通常、バイオチップの製造は、一度に複数枚以上作製され、同じキャプチャー溶液を含む試料の基板上への供給は、複数の基板にわたり複数回以上行われることになる。この場合、例えばピン式のように基板に接触して試料を供給する場合、ピンの先端はキャプチャー溶液を含む試料とキャプチャー溶液を含まない試料が混合することになり、供給毎にその混合割合が変化し、結果としてバイオチップ毎の各スポットに供給されるキャプチャーの量がばらつく原因となる。インクジェット方式のような非接触式の液の供給方式を採用することによりこのような問題は完全に排除される。
また、インクジェット方式はその吐出量、吐出の勢い（吐出速度）等を電気的に精度よく制御できるため、意図的に各スポット間にてキャプチャー溶液を含む試料とキャプチャー溶液を含まない試料の割合を変化させることも可能となり品質向上に有利である。
更に、本発明においては、キャプチャー溶液を含まない試料をインクジェット方式でまたは、スクリーン印刷方式にて基板に供給することが好ましい。インクジェット方式で供給することにより、キャプチャー溶液を含まない試料の供給が、上述したキャプチャー溶液を含む試料の場合と同様に微小量、精度よく、また両液の混合割合がばらつきなく、制御性よく供給できることとなり、バイオチップの品質が向上する。
また、スクリーン印刷方式にて供給することにより、インクジェット式ほど量的、位置的に精度よくはできないが、通常の一枚あたり数千スポット程度が形成されたバイオチップでは十分な精度をもった試料の供給が、安価で、素早く、大量に可能になる。
なお、キャプチャー溶液を含まない試料の供給は、インクジェット方式、スクリーン印刷方式に限ったことではなく、必要に応じてマスク等でパターニングしてスプレー方式、あるいはディッピング方式等で供給してもよい。
ここで、前記キャプチャー溶液を含まない試料は、前記キャプチャー溶液を含む試料を前記基板上に固定化させるための固定化液または、固定化を補強するための固定化補強液とすることができる。
これにより、まず、キャプチャーを含んだ試料を供給する際に、固定化液も供給することから、予め固定化液を基板上に供給（多くの場合、コーティング）する必要がなく、基板のコストアップを未然に防ぐことができる。更に、固定化液とキャプチャーを含んだ試料との供給が比較的短い時間内に両方とも行われるため、予め固定化液を基板上に供給した場合のように、固定化液の経時変化によるバイオチップの品質のばらつき発生を抑えることができる。
また、試料と固定化補強液とをそれぞれ別々に供給することから試料と固定化補強液とを混合する工程が不要になり、また、固定化補強液の量として、基板上に供給される微量の試料を固定化補強させるために必要なわずかな量で済むことから、固定化補強液の量を大幅に減らすことができ、製造工程の簡略化及びコストの低廉化に有利となる。
また、インクジェット方式を採用した場合においては、固定化液または固定化補強液を供給するためのノズルを、キャプチャーを含んだ試料の供給仕様に合わせる必要がなく、専用に設計でき（例えば乾燥しにくい構造等）、設計の自由度を向上させることができる。
しかも、固定化液または固定化補強液が乾燥、固化しやすい液の場合でもキャプチャーを含んだ試料の供給中に試料が固化するということがないため、時間的余裕をもって試料の供給ができる。そのため、キャプチャーを含んだ供給箇所の位置決めや試料の種類に応じた供給タイミング、供給量などを考慮しながら試料や固定化液を供給することができ、バイオチップの品質の向上及び歩留まりの向上を図ることができる。
特に、前記固定化液、あるいは固定化補強液として、前記キャプチャーを含む試料と混合することにより、固定化または、固定化補強が進む液であることが好ましい。この場合、更に時間的余裕をもって試料や固定化液を供給することができ、歩留まりの向上に寄与することとなる。
そして、前記キャプチャーを含む試料と、前記固定化液または前記固定化補強液とをそれぞれ別々に供給する場合、基板上に該固定化液または該固定化補強液を供給した後に、該液が供給された部分に該キャプチャーを含む試料を供給するようにしてもよいし、反対に、基板上に該キャプチャーを含む試料を供給した後に、該キャプチャーを含む試料が供給された部分に該固定化液または該固定化補強液を供給するようにしてもよいし、両者を略同時期に供給してもよい。
固定化液または、固定化補強液を先に基板上に供給することにより、キャプチャーと基板との間に該液が物理的に介在することになり、固定化がより強固なものになる。但し、固定化補強剤の場合は、あくまでも固定化を補強するものであるため、キャプチャーと基板、あるいはキャプチャーと基板上の固定化液との物理的接触を阻害する影響が少ないものがよく、３次元的隙間の多い構造をもつポリマー系の物質がよい。
固定化液または、固定化補強液をキャプチャーを含む試料が供給された後から供給する場合は、予めキャプチャーを含む試料が精度よく供給された上から該液を供給することになり、固定化液または、固定化補強液の供給に際しては位置精度を厳しく規定する必要がないので、安価に歩留まりを上げることができる。この場合は、キャプチャーが被検体を捕らえることを阻害しないような構造、厚みをもった固定化液または固定化補強液でなければならない。
また、キャプチャーを含む試料と該固定化液または該固定化補強液を略同時期に供給する場合は、供給時間が短縮できて好適である。尚この場合は非接触式の供給方式であるインクジェット方式で可能になる。
前記キャプチャーは、核酸類であることが好ましく、更には、ＤＮＡ及びまたはその断片もしくは増幅されたもの、ｃＤＮＡ及びまたはその断片もしくは増幅されたもの、ＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ及びまたはその断片もしくは増幅されたもの、化学合成されたＤＮＡもしくは増幅されたもの、または、化学合成されたＲＮＡもしくは増幅されたものであることが好ましい。
また、前記キャプチャーは、蛋白質類であることが好ましく、更には、抗原、抗体、レクチン、アドヘシン、生理活性物質の受容体、またはペプチドであることが好ましい。
そして、前記固定化液がポジティブチャージを持った化学物質溶液であり、イオン結合により前記キャプチャーを固定化するもの、即ちγ−アミノプロピルトリエトキシシラン等のシランカップリング剤、ポリ−Ｌ−リジン、あるいはポリアルキルアミンであること、あるいは、前記固定化液が基板表面を化学修飾する化学物質であり、基板表面に導入された官能基と前記キャプチャーを修飾して導入した官能基を化学反応させ、共有結合によりキャプチャーと基板を固定化するもの、即ちアミノ基とアルデヒド基、アミノ基とＮ−ヒドロキシサクシイミド基、アミノ基とカルボキシル基、アミノ基とエポキシ基、チオール基とエポキシ基の反応であるもの、あるいは、前記固定化液がキャプチャーを基板にアフィニティ結合または水素結合を生じさせるもの、即ち、アビジン、ストレプトアビジン、プロタミンあるいはヒストンであるもの、あるいは、前記固定化液がキャプチャーを基板に疎水結合させるもの、即ち、ポリスチレン等の疎水性物質フェニル基、アルキルベンゼン等のアルキル基等の疎水基を含む溶液であることが好ましい。
更に、前記固定化補強液が、保水性物質であること、即ち、コロミン酸、ヒアルロン酸、またはコロミン酸とヒアルロン酸の混合物であること、あるいは、前記固定化補強液が、高分子物質であること、即ち、ＣＭ−セルロース、ニトロセルロース、ポリアクリル酸、アルギン酸等の酸性ポリマー、あるいは、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド等の塩基性ポリマー、あるいは、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等の中性ポリマー、または、ＢＳＡ、卵白アルブミン、リゾチーム等の蛋白質類であることが好ましい。
上記のようなキャプチャー、固定化液、固定化補強液の物質の組合せにより、キャプチャーの基板上への固定化がより強固なものになると共に、本発明の基本的な考えである、キャプチャーを含んだ溶液とキャプチャーを含まない溶液、即ち、固定化液若しくは固定化補強液を別々に基板上に供給する方法と組み合わせることにより、キャプチャーの配向性が揃った、即ち、基板上にキャプチャーが３次元的に広がった形態で固定化が進み、キャプチャーが被検体を捕獲しやすくなり、結果として、バイオチップの品質が向上する。
さらには、別々に供給することにより、固定化、固定化補強液の機能が大気中に放置することによる乾燥等の影響による劣化が防止され、上述した物質の本来の機能が保たれて基板上に供給されて好ましい。
更にまた、固定化補強液として、保水性物質を用いることは、スポット内に水分を保つことにより、キャプチャーの基板上への固定化反応を時間をかけて十分に進めることができ、好ましい。
また、固定化補強液として、高分子物質を用いることは固定化補強液中をキャプチャーが自在に移動でき、固体化、あるいは、キャプチャーの被検体の捕捉を妨げないため好ましい。
特に、キャプチャーとしてＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅してＰＣＲ産物を調製する工程と、前記ＰＣＲ産物を乾燥してＤＮＡ粉末とする工程と、前記ＤＮＡ粉末を緩衝液に溶かす工程とを踏んで調製されることが好ましい。ＰＣＲ増幅工程を経ることによりＤＮＡ断片に固定化を促進する種々の官能基を付加することができ、本発明に好適である。
また、本発明においては、基板が複数枚セットされた冶具を備え、キャプチャー溶液を含む試料とキャプチャー溶液を含まない試料との供給を冶具上に固定された状態の基板のまま行うことがよい。基板のセットを液の供給毎にセットし直さないことにより、製造コストの低減が可能となる、一方、２液が供給される位置のずれを低減できる利点を合わせもつ。
更に、本発明におけるバイオチップの製造法は、キャプチャー溶液を含まない試料が基板上に供給される領域が、キャプチャー溶液を含む試料が供給される領域と略同一又はキャプチャー溶液を含む試料が供給される領域を含む領域で、且つ領域の形状が略円形であることを特徴とする。
こうすることにより、バイオチップの各キャプチャーが存在するスポット形状が、１種類のキャプチャー溶液を含まない試料のスポット形状により規定されることになり、キャプチャーの種類が異なることによるスポット形状のばらつきをなくすことができる。
また、１種類のキャプチャー溶液を含まない試料を供給することから、供給手段（ピンや、インクジェットの吐出ユニット）も１種類で対応できるため、供給手段が異なることによるスポット形状のばらつきもなくすことができる。更に、バイオチップの各スポット形状の大きさを規定するのが、キャプチャーを含まない試料の供給量であり、キャプチャー溶液を含む試料の供給量より多くできることから、結果としてバイオチップに求められるスポットの大きさを実現するキャプチャー溶液を含む試料の供給量を低減することができる。
これは、現状のバイオチップの製造法では、基板上に供給されるキャプチャー溶液を含む試料の量の殆どが基板上に固定化されず洗い流されてしまうのに対し、本発明においては、キャプチャー溶液を含まない試料によって形成された供給領域までキャプチャー溶液を含む試料が拡散することから、より効率的に基板上に固定化され、固定化されずに洗い流されてしまう量を低減することができる。
更にまた、上記製造法はインクジェット法によりキャプチャー溶液を含む試料を供給する場合に好適である。この場合、上述するようなキャプチャー溶液を含む試料を供給するときにサテライトが発生しても、サテライトは、キャプチャーを含まない試料溶液領域に到達することが殆どなく、また、万一到達しても正規の試料と一体化するため、結果としてサテライト問題は、殆ど回避できることになる。
この効果はサテライト問題に対してだけではなく、インクジェット方式の場合に発生する可能性のある「吐出方向がばらついてしまう所謂飛行曲がり問題」に対しても同様の効果を発揮して好適である。
更にまた、本発明においては、キャプチャー溶液を含まない試料が基板上に供給される領域が、キャプチャー溶液を含む試料が供給される領域を２つ以上含む大きさであることを特徴とするバイオチップの製造方法としてもよい。この場合、キャプチャー溶液を含まない試料の供給がより簡便となる。
次に、本発明に係るバイオチップの製造方法は、少なくとも前記スポットが形成されるべき箇所に、前記キャプチャーの前記基板上への固定化を担う第１の物質を有する前記基板上のうち、前記スポットが形成されるべき箇所以外の部分に、少なくとも前記キャプチャーの前記基板上への固定化を阻害する第２の物質を形成する工程を有することを特徴とする。
これにより、予めスポッティングされるべき箇所には第１の物質、それ以外の箇所には第２の物質が形成された基板を用いてキャプチャーを含む溶液を基板上にスポッティングすることとなり、前記第２の物質が形成されていない部分の形状により、前記スポットの形状並びに配列形態が決定されることになり、スポットの配列間隔がばらついたり、スポット同士が付着するなどの不具合は生じなくなるとともに、試料を規定の位置に供給できなかった場合には、第２の物質の存在により、該試料の基板上への付着が回避されるため、汚染源となることはない。また、試料をインクジェット方式で供給した場合に、試料吐出の際にしばしば発生するサテライト現象による飛沫は、前記第２の物質の存在によって基板への付着が阻害されるため、インクジェット方式にて発生していたサテライトの問題を解消させることができる。以上のような利点があり、高品質なバイオチップを製造でき、製造工程の簡略化、コストの低廉化並びに歩留まりの向上を図ることができる。
そして、前記製造方法において、前記基板上のうち、少なくとも前記スポットが形成されるべき箇所に、前記第１の物質を形成する工程と、前記基板上のうち、前記スポットが形成されるべき箇所以外の部分に、前記第２の物質を形成する工程とを有するようにしてもよい。第１の物質を形成する工程と第２の物質を形成する工程とを有することによって、それぞれの物質の相性を加味しながら材料選定が出来ると共に、形成するタイミングを個別に調整でき、各々の物質の特性を最大限に引き出すことが可能になる。
また、前記製造方法において、前記基板上の全面に前記第１の物質を形成する工程と、前記基板上に形成された前記第１の物質上のうち、前記スポットが形成されるべき箇所以外の部分に、前記第２の物質を形成する工程とを有するようにしてもよい。第１の物質を全面に形成することにより、よりコストを抑えた大量生産の工程が採用できる。
また、前記製造方法において、前記基板として、予め前記スポットが形成されるべき箇所に、前記第１の物質が形成された基板を用い、前記基板上のうち、前記スポットが形成されるべき箇所以外の部分に、前記第２の物質を形成する工程を有するようにしてもよい。
前記第２の物質は、前記キャプチャーの前記基板上への固定化を阻害し、かつ、前記被検体が前記基板上への付着を阻害する物質であることが好ましい。
また、前記キャプチャーを含む試料をインクジェット方式で供給するようにしてもよい。この場合、試料の供給を高速で、かつ、効率よく行うことができる。しかも、試料の供給が、供給手段が基板と接触しない非接触方式であるため、予め基板上に形成してある第２の物質が試料の供給手段に混入してコンタミネーションを起こすという問題を回避することができる。
試料をインクジェット方式で供給した場合に、供給は高速で実現できるが、試料吐出の際にしばしばサテライト現象が発生して基板が汚染されることになる場合があるが、サテライト現象による飛沫は、前記第２の物質の存在によって基板への付着が阻害されるため、インクジェット方式にて発生していたサテライトの問題を解消させることができる。従って、インクジェット方式による試料の供給を積極的に促進させることができる。
また、前記製造方法において、前記第１の工程は、前記基板上の全面に前記第１の物質を形成する処理を含み、前記第２の工程は、前記基板上に形成された前記第１の物質上のうち、前記スポットが形成されるべき箇所以外の部分に、前記第２の物質を形成する処理を含むようにしてもよい。
この場合、前記第２の物質をインクジェット方式で供給するようにしてもよい。前記スポットが形成されるべき箇所以外の部分に、前記第２の物質を形成する場合に、位置精度、厚み精度共に良好とすることができ、スポットが形成されるべき部分とスポットが形成されるべき箇所以外の部分との境界を形状的に明確に区別させることができる。しかも、第２の物質の供給を無駄なく効率よく行うことができ、製造コストの低廉化に寄与させることができる。
また、前記第２の物質をスクリーン印刷法で形成するようにしてもよい。この場合、スポットが形成されるべき箇所以外の部分への第２の物質の供給時間を短縮することができ、スループットの向上及び工数の削減化を図ることができる。
また、前記第２の物質をディッピング法で形成するようにしてもよい。この場合、前記基板上に形成された前記第１の物質上のうち、前記スポットが形成されるべき箇所に、レジストを形成し、前記レジストを含む全面に前記第２の物質をディッピング法で形成し、前記レジストをリフトオフして、前記スポットが形成されるべき箇所以外の部分に、前記第２の物質を形成するようにしてもよい。
このディッピングによる方法は、第２の物質が粘度の低い場合に好適であり、この場合も、スポットが形成されるべき箇所以外の部分への第２の物質の供給時間を短縮することができ、スループットの向上及び工数の削減化を図ることができる。
そして、前記第１の物質が、ポジティブチャージを有する化学物質であって、イオン結合により前記キャプチャーの基板への固定化を担う場合においては、第２の物質として、ネガティブチャージを有する化学物質とする。
この場合、前記第１の物質は、少なくともγ−γ−アミノプロピルトリエトキシシラン等のシランカップリング剤、ポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、あるいはポリアルキルアミンを含み、前記第２の物質は、少なくともコハク酸、グルコン酸、グリコール酸、リンゴ酸、アクリル酸等の有機酸類、あるいはポリアクリル酸、ポリ乳酸、デキストラン硫酸、ポリグリコール酸等の合成高分子酸類、あるいはアルギン酸、ポリガラクチュロン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等の天然高分子酸類を含むことが好ましい。
尚、第１の物質が、ポジティブチャージを有する化学物質であり、第２の物質が、ネガティブチャージを有する化学物質であるという組み合せは、キャプチャーがネガティブチャージを有しイオン結合により基板への固定化を行なう場合においては好適に採用されるが、キャプチャーがネガティブチャージを有しない場合は、第１の物質が、ネガティブチャージを有する化学物質であり、第２の物質が、ポジティブチャージを有する化学物質の組み合せであっても良い。
また、前記第１の物質が、活性化基を有し、基板表面を修飾する化学物質であって、基板表面に導入された活性化基と前記キャプチャーを修飾して導入した官能基とを化学反応させ、共有結合により前記キャプチャーの基板への固定化を担う場合においては、前記第２の物質として、活性化基と反応する官能基を有する化学物質とする。
この場合、前記共有結合を達成する化学反応は、アミノ基とアルデヒド基との反応、アミノ基とＮ−ヒドロキシサクシイミド基との反応、アミノ基とカルボキシル基との反応、アミノ基とエポキシ基との反応、又は、チオール基とエポキシ基との反応である。
そして、前記第１の物質は、少なくともγ−アミノプロピルトリエトキシシランとグルタルアルデヒドとの混合物、γ−アミノプロピルトリエトキシシランと無水コハク酸とＮ−ヒドロキシサクシニミドとの混合物、γ−アミノプロピルトリエトキシシランと無水コハク酸との混合物、エピクロロヒドリン、あるいはビスオキシランを含み、前記第２の物質は、少なくともグリシン等のアミノ酸類、アミノ基を有するトリス、エタノールアミン、チオール基を有するシステイン、グルタチオン、あるいはチオブライコールを含むことが好ましい。
また、前記第１の物質が、基板表面を修飾する化学物質であって、アフィニティ結合により前記キャプチャーの基板への固定化を担う場合においては、前記第２の物質は、該化学物質とアフィニティ結合する物質とする。
この場合、前記第１の物質は、少なくともアビジン、ストレプトアビジン、プロタミン、ヒストン、ビオチン、抗原、抗体結合蛋白質、あるいは抗体を含み、
前記第２の物質は、少なくともアビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、核酸、抗原、抗体結合蛋白質、あるいは抗体を含むことが好ましい。
また、前記第１の物質が、スチレン基、フェニル基、アルキル基等の疎水基を含み、基板表面を修飾する化学物質であって、疎水結合により前記キャプチャーの基板への固定化を担う場合においては、前記第２の物質は、少なくとも両親媒性物質を含むこととする。
この場合、前記第１の物質は、少なくともポリスチレンあるいはアルキルベンゼンを含み、前記第２の物質は、少なくともゼラチンあるいはカゼインを含むことが好ましい。
また、前記第２の物質は、シリコンあるいはフッ素等を含む撥水性を有する物質よりなるが好ましい。一般にキャプチャーを含む試料のような生体物質は水溶液である場合が多く、第２の物質として撥水性、或いは疎水性をもつ物質が選択されることにより、前記キャプチャーの前記基板上への固定化を阻害する効果がより増加されるとともに、バイオチップの使用時において用いられるサンプル液（被検体を含む試料溶液）も水溶液である場合が多く、その場合、スポット以外の第２の物質が形成されている個所との排斥力によりスポット以外の個所へのサンプルの非特異吸着が効果的に抑えられ、もってスポットのシグナルのＳ／Ｎ比が向上する。
そして、前記キャプチャーを核酸類としてもよい。この場合、核酸類としては、ＤＮＡ及び／又はその断片もしくは増幅されたもの、ｃＤＮＡ及び／又はその断片もしくは増幅されたもの、ＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ及び／又はその断片もしくは増幅されたもの、化学合成されたＤＮＡもしくは増幅されたもの、又は、化学合成されたＲＮＡもしくは増幅されたものが挙げられる。
また、前記キャプチャーを蛋白質類としてもよい。この場合、蛋白質類としては、抗原、抗体、レクチン、アドヘシン、生理活性物質の受容体、又はペプチドが挙げられる。
添付した図面と協同する次の好適な実施の形態例の説明から、上記の目的及び他の目的、特徴及び利点がより明らかになるであろう。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明に係るバイオチップ及びその製造方法の実施の形態例を図１〜図１６Ｃを参照しながら説明する。
まず、第１の実施の形態に係るバイオチップの製造方法は、図１に示すように、基板１０の表面にｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ層１２（図４Ａ〜図４Ｃ参照）を形成する前処理工程Ｓ１と、ＤＮＡ断片を含む試料を調製する試料調製工程Ｓ２と、基板１０上に固定化補強液を供給（滴下を含む）する第１の供給工程Ｓ３と、試料調製工程Ｓ２において得られた試料を基板１０上に供給された固定化補強液上に供給（滴下を含む）して図３に示すバイオチップ２０を製造する第２の供給工程Ｓ４とを有する。
また、試料調製工程Ｓ２は、図２に示すように、ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅してＰＣＲ産物を調製する増幅工程Ｓ１１と、得られたＰＣＲ産物を乾燥してＤＮＡ粉末とする粉末生成工程Ｓ１２と、得られたＤＮＡ粉末を緩衝液に溶かす混合工程Ｓ１３とを含む。
具体的に説明すると、前処理工程Ｓ１は、まず、基板１０をアルカリ溶液に浸し、室温で少なくとも２時間ゆっくりと振盪する。前記アルカリ溶液は、例えばＮａＯＨを蒸留水に溶かし、更にエタノールを加えて、完全に透明になるまで攪拌した溶液である。
その後、基板１０を取り出して、蒸留水中に移し、リンスして、アルカリ溶液を除去する。次いで、蒸留水中にｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅを加えて調製されたｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ液に基板１０を浸し、１時間放置する。
その後、基板１０を取り出して、遠心機にかけて遠心し、余分なｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ液を除去する。次いで、基板１０を４０℃、５分ほど乾燥させて、表面にｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ層１２が形成された基板１０を得る。
次に、試料調製工程Ｓ２は、まず、既知のＰＣＲ機で増幅したＰＣＲ産物（増幅工程Ｓ１１）に、３Ｍｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅとイソプロパノールとを加え、数時間放置する。その後、このＰＣＲ産物溶液を遠心機で遠心し、ＤＮＡ断片を沈殿させる。
沈殿させたＤＮＡ断片をエタノールでリンスし、遠心の後、乾燥させてＤＮＡ粉末を生成する（粉末生成工程Ｓ１２）。得られたＤＮＡ粉末にＴＥバッファー液を加え、数時間放置して完全に溶かすことによって（混合工程Ｓ１３）、試料が調製される。この段階での試料の濃度は０．１〜１０μｇ／μリットルである。
そして、この実施の形態では、図４Ａに示すように、基板１０上に固定化補強液１６を供給し（第１の供給工程Ｓ３）、次いで、図４Ｂに示すように、試料調製工程Ｓ２で得られた試料１４を基板１０上に供給されている固定化補強液１６上に供給することによって、図３に示すバイオチップ２０を製造する（第２の供給工程Ｓ４）。なお、試料１４の供給領域は、供給量を調整することにより、固定化補強液１６の供給されている領域よりも小さくする。ところで、試料１４の種類によっては、試料１４を希釈するようにしてもよい。また、固定化補強液１６としては、有機ポリマーを使用する。試料１４は、供給後速やかに、固定化補強液１６中を拡散し、図４Ｃに示すように固定化補強液１６で規定された領域中に均等に分散される。
特に、この実施の形態では、第１の供給工程Ｓ３及び第２の供給工程Ｓ４に、図５Ａに示すような分注装置３０を使用する。
この分注装置３０は、矩形状の固定板３２の上面に例えば１０個のマイクロピペット３４を５行２列に配列し、各列方向に整列されたマイクロピペット３４群をそれぞれ固定治具３６を介して固定板３２に固定させた構成を有する。
マイクロピペット３４は、図５Ｃ及び図６に示すように、ほぼ直方体の形状を有する基体５０の上面に形成された試料注入口５２と、該基体５０の下面に形成された試料吐出口５４と、内部に試料注入口５２と試料吐出口５４との間に形成されたキャビティ５６と、基体５０を振動させたり、キャビティ５６の体積を変化させたりするアクチュエータ部５８とを有して構成されている。
従って、図６に示すように、前記固定板３２には、マイクロピペット３４の試料吐出口５４に対応する箇所にそれぞれ貫通孔４０が設けられている。これにより、マイクロピペット３４の試料吐出口５４から吐出された試料１４や固定化補強液１６が、前記貫通孔４０を通じて、例えば固定板３２の下方に固定された基板１０に供給されることになる。
このマイクロピペット３４は、試料注入口５２から基体５０の内部にかけて開口幅の大きいほぼＬ字状の導入穴６０が形成されている。この導入穴６０とキャビティ５６との間には、径の小さい第１の連通孔６２が形成され、試料注入口５２から注入された試料１４や固定化補強液１６が導入穴６０及び第１の連通孔６２を通じてキャビティ５６に導入されるようになっている。
キャビティ５６のうち、前記第１の連通孔６２とは異なる位置に、試料吐出口５４に連通し、かつ、第１の連通孔６２よりも径の大きい第２の連通孔６４が形成されている。本実施の形態では、キャビティ５６の下面のうち、試料注入口５２寄りに第１の連通孔６２を形成し、同じくキャビティ５６の下面のうち、試料吐出口５４に対応した位置に第２の連通孔６４を形成するようにしている。
更に、この実施の形態では、基体５０のうち、キャビティ５６の上面が接する部分が薄肉とされ、外部応力に対して振動を受けやすい構造となっており、振動部６６として機能するようになっている。
基体５０は、複数枚のジルコニアセラミックスのグリーンシートを積層し、一体焼成して構成されている。
つまり、基体５０は、試料注入口５２を構成する窓部が形成され、一部において導入穴６０の一部及び第２の連通孔６４の一部を構成する複数の窓部がそれぞれ形成された層と、導入穴６０の一部及び第２の連通孔６４の一部を構成する複数の窓部がそれぞれ形成された層と、第２の連通孔６４の一部を構成する窓部が形成された層とを積層し、一体焼成して構成されている。
アクチュエータ部５８は、基体５０と同様に、一部において第１の連通孔６２及び第２の連通孔６４の一部を構成する複数の窓部がそれぞれ形成された層と、キャビティ５６が形成された層と、振動部６６を形成する層とが、積層、一体焼成されたジルコニアセラミックスからなるベース４６と、該振動部６６上に直接形成された下部電極７０と、該下部電極７０上に形成された圧電／電歪層や反強誘電体層等の圧電体層７２と、該圧電体層７２の上面に形成された上部電極７４とを有して構成されている。
下部電極７０と上部電極７４は、図５Ｃに示すように、それぞれ前記ベース４６の上面に形成された複数のパッド７６及び７８を通じて図示しない駆動回路に電気的に接続される。
試料吐出口５４を形成したノズルシート４８は、樹脂フィルムにエキシマレーザー加工にて、試料吐出口５４を形成している。
上記のような構成のマイクロピペット３４によれば、上部電極７４と下部電極７０との間に電界が生じると、圧電体層７２が変形し、それに伴って振動部６６が変形し、振動部６６に接しているキャビティ（加圧室）５６の容積が減少することになる。
このキャビティ５６の容積の減少によってキャビティ５６内に充填された試料１４や固定化補強液１６がキャビティ５６に連通する試料吐出口５４から所定速度で吐出され、図３に示すように、マイクロピペット３４から吐出された試料１４や固定化補強液１６が顕微鏡スライドガラス等の基体５０上に微小スポット８０として整列固定されたバイオチップ２０を作製することができる。
なお、アクチュエータ部５８の駆動によって、キャビティ５６の容積が減少する構造としては、いわゆるインクジェット方式の装置構造を採用することができる（特開平６−４００３０号公報参照）。
そして、キャビティ（加圧室）５６は、ＤＮＡ断片などを含む試料１４が移動するような流路寸法に形成されている。
つまり、キャビティ５６の寸法は、試料１４の種類、作製する液滴の大きさ、形成密度により異なるが、例えば、塩基対１〜１００００程度のＤＮＡ断片を０．３μｇ／μリットルの濃度で×緩衝液（ＴＥバッファ）に分散させた試料１４を数百μｍピッチで百数十μｍφ液滴径の供給を行う場合においては、図７に示すように、キャビティ長（Ｌ）は、１〜５ｍｍ、キャビティ幅（Ｗ）は、０．１〜１ｍｍ、キャビティ深さ（Ｄ）は、０．１〜０．５ｍｍが好ましい。またキャビティ５６の内壁には、流れを乱す突起物がないように滑らかであることがよく、その材質は、試料１４と親和性のよいセラミックスからなることが好ましい。
このような形状にすることにより、キャビティ５６を試料注入口５２から試料吐出口５４に至る流路の一部として、試料注入口５２から導入穴６０、第１の連通孔６２を経てキャビティ５６内に移動する試料１４や固定化補強液１６の流れを乱すことなく試料吐出口５４に導くことができる。
ところで、図５Ａに示すように、固定板３２の上面には、マイクロピペット３４を位置決め固定するための複数のピン３８が設けられている。マイクロピペット３４を固定板３２上に固定する場合は、マイクロピペット３４の基体５０の両側に設けられた位置決め用孔９０（図５Ｃ参照）に固定板３２のピン３８を挿入させながら、マイクロピペット３４を固定板３２に載置することで、自動的に複数のマイクロピペット３４が所定の並びで配列位置決めされることになる。
また、各固定治具３６は、複数のマイクロピペット３４を固定板３２に押さえ付ける押さえ板１００を有する。押さえ板１００の両端には、それぞれネジ１０２が挿通される挿通孔が形成され、この挿通孔にネジ１０２を挿通して、固定板３２にねじ込むことによって、前記押さえ板１００で複数のマイクロピペット３４を一度に固定板３２に押さえ付けることができるようになっている。そして、１つの押さえ板１００で押さえ付けた複数のマイクロピペット３４で１つのユニットが構成される。図５Ａに示すように列方向に配列された５つのマイクロピペット３４で１つのユニットが構成されている。
また、押さえ板１００には、複数のマイクロピペット３４を押さえ付けたときに、各マイクロピペット３４の試料注入口５２に対応する箇所にそれぞれ試料１４や固定化補強液１６を供給するための導入孔１０４（図５Ｂ参照）が形成されており、各導入孔１０４の上端部にはそれぞれ試料１４や固定化補強液１６を導入孔１０４に導くためのチューブ１０６が保持されている。
なお、押さえ板１００の幅は、配線作業の効率化を考慮すると、複数のマイクロピペット３４を固定板３２に押さえ付けた際に、アクチュエータ部５８の各電極７０及び７４につながるパッド７６及び７８が上方に臨むような寸法であることが好ましい。
このように、上述の分注装置３０は、試料注入口５２及び試料吐出口５４を有するマイクロピペット３４の複数個をそれぞれ試料吐出口５４を下方向に向けた状態で立設させて構成されている。
即ち、各マイクロピペット３４は、それぞれの試料注入口５２を上側とし、試料吐出口５４を下側とし、かつ、各試料吐出口５４が縦横に配列配置されて、試料吐出口５４からそれぞれ種類の異なる試料１４や固定化補強液１６が吐出されるようになっている。
尚、図５Ａでは、押さえ板１００の両端をネジ１０２で固定板３２に締め付けることで固定しているが、押さえ板１００の固定法は、ネジ、バネ等で機械的に行うほか、接着剤等で行ってもよい。
また、マイクロピペット３４を構成する基体５０及びアクチュエータ部５８のベース４６部分は、上述したように、セラミックスで形成されており、例えば、安定化ジルコニアや部分安定化ジルコニア、アルミナ、マグネシア、窒化珪素等を用いることができる。
このうち、安定化／部分安定化ジルコニアは、薄板においても機械的強度が大きいこと、靭性が高いこと、圧電体層７２や電極材との反応性が小さいことから最も好適に採用される。
そして、アクチュエータ部５８のベース４６部分等の材料として安定化／部分安定化ジルコニアを使用する場合には、少なくとも、圧電体層７２が形成される部分（振動部６６）には、アルミナあるいはチタニア等の添加物が含有されることが好ましい。
また、アクチュエータ部５８を構成する圧電体層７２は、圧電セラミックスとして、例えば、ジルコン酸鉛、チタン酸鉛、マグネシウムニオブ酸鉛、マグネシウムタンタル酸鉛、ニッケルニオブ酸鉛、亜鉛ニオブ酸鉛、マンガンニオブ酸鉛、アンチモンスズ酸鉛、マンガンタングステン酸鉛、コバルトニオブ酸鉛、チタン酸バリウム等やこれらのいずれかを組み合わせた成分を含有する複合セラミックスを用いることができるが、本実施の形態においては、ジルコン酸鉛とチタン酸鉛及びマグネシウムニオブ酸鉛からなる成分を主成分とする材料が好適に用いられる。
これは、このような材料が、高い電気機械結合係数と圧電定数を有することに加え、圧電体層７２の焼結時における基体材料との反応性が小さく、所定の組成のものを安定に形成することができることに基づくからである。
更に、本実施の形態では、前記圧電セラミックスに、ランタン、カルシウム、ストロンチウム、モリブデン、タングステン、バリウム、ニオブ、亜鉛、ニッケル、マンガン、セリウム、カドミウム、クロム、コバルト、アンチモン、鉄、イットリウム、タンタル、リチウム、ビスマス、スズ等の酸化物、もしくはこれらいずれかの組合せ、又は他の化合物を適宜、添加したセラミックスを用いてもよい。
例えば、ジルコン酸鉛とチタン酸鉛及びマグネシウムニオブ酸鉛を主成分とし、これにランタンやストロンチウムを含有するセラミックスを用いることもまた好ましい。
一方、アクチュエータ部５８における上部電極７４及び下部電極７０は、室温で固体であって導電性の金属で構成されていることが好ましく、例えば、アルミニウム、チタン、クロム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ニオブ、モリブデン、ルテニウム、パラジウム、ロジウム、銀、スズ、タンタル、タングステン、イリジウム、白金、金、鉛等の金属単体あるいはこれらのいずれかを組み合わせた合金が用いられ、更に、これらに圧電体層７２やベース４６部分と同じ材料を分散させたサーメット材料を用いてもよい。
また、ノズルシート４８は、一般的に吐出口の形成に適した材料からなることが好ましく、ＰＥＴ、ポリイミド、ポリアミド、マレイミド、ポリサルフォン等の樹脂で構成されていることが望ましく、溶液の吐出する側は、フッ素樹脂やシリコンで撥液処理がなされていることが、液滴を安定して吐出するのによい。本実施の形態では、エキシマレーザー加工性に優れ、生産性に優れたシリコンコーティング済みＰＥＴフィルムを好適に採用できる。
更に、型を使った打ち抜き、絞り加工等に優れたＳＵＳ等の金属シートからなるノズルシートを用いても良く、この場合も溶液の吐出する側は、フッ素樹脂やシリコンで撥液処理がなされていることが、液滴を安定して吐出するのによい。
次に、この分注装置３０を使って基板１０上に試料を供給する方法の一例について図８を参照しながら詳しく説明する。
図８に示すように、表面にｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ層１２をコーティングしたスライドガラス基板１０を複数枚、例えば２０枚のガラス基板１０を、ガラス固定冶具１１０に固定する。次に、このガラス固定冶具１１０と相対位置制御しながら、ガラス基板１０上を自在に移動できるようにロボットに取り付けられた分注装置３０の各チューブ（図示せず）からそれぞれ固定治具３６の導入孔１０４を介して各マイクロピペット３４のキャビティ５６内に固定化補強液１６を充填し、アクチュエータ部５８を駆動させて、図４Ａに示すように、基板１０上に固定化補強液１６を吐出供給させる。
この場合、図５Ａに示す１０個のマイクロピペット３４を全て用いて固定化補強液１６を供給してもよいが、供給領域の形状の安定性を優先し、１個のマイクロピペット３４を用いて全ての供給を行う。
次いで、予めマイクロピペット３４内を脱泡した純水等の置換液で充填した別の分注装置３０を用意し、試料１４を試料注入口５２から注入した後、アクチュエータ部５８を駆動させ置換液を吐出排出し、試料１４を試料注入口５２からキャビティ５６内に置換させる。
置換が完了した段階で、アクチュエータ部５８を駆動させて、図４Ｂに示すように、試料１４を同じガラス固定冶具にセットした基板１０上に供給されている固定化補強液１６上に吐出供給させる。このようにして、図４Ｃに示すように、基板１０上に固定化補強液１６を含んだ試料１４が供給されたバイオチップ２０が作製される。
次に、本発明に係るバイオチップの製造方法の他の実施の形態例を図９Ａ〜図１１Ｃを参照しながら説明する。
第２の実施の形態に係るバイオチップの製造方法は、図９Ａ〜図９Ｃに示すように、上述した第１の実施の形態に係るバイオチップの製造方法とほぼ同様に、使用する試料１４、基板１０、分注装置３０は同じであるが、基板１０上に液を供給する順序を固定化補強液１６と試料１４で逆転している点で異なる。
即ち、まず、図９Ａに示すように、最初に試料１４を供給し、その後、図９Ｂに示すように、試料１４が供給された領域に固定化補強液１６を重ねて供給し、図９Ｃに示すように、一体化するようにしている。
この第２の実施の形態においては、固定化補強液１６が、試料１４中を拡散し、基板１０まで到着しなければならないという物性が要求されることから、比較的重合度が低いポリマーまたは、モノマーを好適に採用することができる。
次に、第３の実施の形態に係るバイオチップの製造方法は、図１０Ａ及び図１０Ｂに示すように、上述した第１の実施の形態に係るバイオチップの製造方法とほぼ同様に、使用する試料１４、基板１０、分注装置３０は同じであるが、基板１０上に固定化液１８を供給した後、その領域に試料１４を供給した点で異なる。
即ち、まず、図１０Ａに示すように、基板１０上に、最初に固定化液１８を供給し、その後、図１０Ｂに示すように、固定化液１８が供給された領域に試料１４を重ねて供給する。
この第３の実施の形態においては、固定化液１８を供給した領域以外は、たとえ試料１４が供給されても基板１０上に固定化されることはない。固定化液１８としては、蒸留水中にｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅを加えて調製されたｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ液を採用した。
次に、第４の実施の形態に係るバイオチップの製造方法は、図１１Ａ〜図１１Ｃに示すように、基板１０上に固定化補強液１６を、試料１４を供給する領域を２つ以上含んだ領域にかけて供給し、その後、その上に試料１４を供給した点で異なる。
即ち、まず、図１１Ａに示すように、基板１０の略全面に固定化補強液１６をスクリーン印刷法にて形成した後、図１１Ｂに示すように、これまでの例と同様に、インクジェット法にて試料１４を供給する。その後、図１１Ｃに示すように、試料１４を供給した領域付近で、固定化補強液１６と試料１４とが一体化して基板１０上に強固に固定化される。
このように、第１〜第４の実施の形態に係るバイオチップの製造方法においては、ＤＮＡ断片を含む試料１４と該試料１４を確実に固定化するための固定化補強液１６若しくは固定化液１８とをそれぞれ別々に供給してバイオチップ２０を製造するようにしたので、固定化が確実なものとなり、微小スポットが剥がれ落ちるという現象が激減する。
更に、試料１４と固定化補強液１６若しくは固定化液１８とを混合する工程が不要になり、また、固定化補強液１６若しくは固定化液１８の量として、基板１０上に供給される微量の試料１４を固定化させるために必要なわずかな量で済むため、固定化補強液１６若しくは固定化液１８の量を大幅に減らすことができ、製造工程の簡略化及びコストの低廉化に有利となる。
また、固定化補強液１６若しくは固定化液１８を供給するための分注装置３０における試料吐出口５４を、試料１４の供給仕様に合わせる必要がなく、固定化補強液１６若しくは固定化液１８専用に設計でき（例えば乾燥しにくい構造等）、設計の自由度を向上させることができる。
しかも、供給中に試料１４が固化するということがないため、時間的余裕をもって試料１４や固定化補強液１６若しくは固定化液１８を供給することができる。そのため、供給箇所の位置決めや試料１４の種類に応じた供給タイミング、供給量などを考慮しながら試料１４や固定化補強液１６若しくは固定化液１８を供給することができ、バイオチップ２０の品質の向上及び歩留まりの向上を図ることができる。
次に、第５の実施の形態に係るバイオチップ１１０は、図１２に示すように、被検体と特異に反応し、被検体の構造又は機能に対する情報を得るために用いられるキャプチャーを含む試料を複数種類、基板１１２上に供給して、該基板１１２上にキャプチャーを含む試料によるスポット１８０が多数配列されて構成されている。
基板１１２は、図１３に示すように、顕微鏡スライドガラス等からなる基板本体１１４と、該基板本体１１４の上面に形成され、キャプチャーの基板１１２上への固定化を担う第１の物質１１６と、該第１の物質１１６上のうち、スポット１８０が形成されるべき箇所以外の部分に形成され、少なくともキャプチャーの基板１１２上への固定化を阻害する第２の物質１１８とを有して構成されている。
特に、この第２の物質１１８は、キャプチャーの基板１１２上への固定化を阻害し、かつ、前記被検体の基板１１２上への付着を阻害する物質にて構成されている。
ここで、キャプチャーとしては、核酸類あるいは蛋白質類が挙げられる。核酸類とした場合は、例えばＤＮＡ及び／又はその断片もしくは増幅されたもの、ｃＤＮＡ及び／又はその断片もしくは増幅されたもの、ＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ及び／又はその断片もしくは増幅されたもの、化学合成されたＤＮＡもしくは増幅されたもの、又は、化学合成されたＲＮＡもしくは増幅されたものが挙げられる。
一方、蛋白質類として場合は、抗原、抗体、レクチン、アドヘシン、生理活性物質の受容体、又はペプチド等が挙げられる。
次に、第１の物質１１６及び第２の物質１１８について説明する。まず、第１の物質１１６が、ポジティブチャージを有する化学物質であって、イオン結合によりキャプチャーの基板への固定化を担う場合においては、第２の物質１１８は、ネガティブチャージを有する化学物質とする。
この場合、第１の物質１１６は、γ−γ−アミノプロピルトリエトキシシラン等のシランカップリング剤、ポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、あるいはポリアルキルアミンであり、第２の物質１１８は、コハク酸あるいはポリアクリル酸である。
また、第１の物質１１６が、活性化基を有し、基板１１２の表面を修飾する化学物質であって、基板１１２の表面に導入された活性化基と前記キャプチャーを修飾して導入した官能基とを化学反応させ、共有結合によりキャプチャーの基板１１２への固定化を担う場合においては、第２の物質１１８として、活性化基と反応する官能基を有する化学物質とする。
この場合、前記共有結合を達成する化学反応は、アミノ基とアルデヒド基との反応、アミノ基とＮ−ヒドロキシサクシイミド基との反応、アミノ基とカルボキシル基との反応、アミノ基とエポキシ基との反応、又は、チオール基とエポキシ基との反応である。
そして、このような場合において、第１の物質１１６は、γ−アミノプロピルトリエトキシシランとグルタルアルデヒドとの混合物、γ−アミノプロピルトリエトキシシランと無水コハク酸とＮ−ヒドロキシサクシニミドとの混合物、γ−アミノプロピルトリエトキシシランと無水コハク酸との混合物、エピクロロヒドリン、あるいはビスオキシランであり、第２の物質１１８は、アミノ酸類であるグリシン、アミノ基を有するトリス、エタノールアミン、チオール基を有するシステイン、グルタチオン、あるいはチオブライコールである。
また、第１の物質１１６が、基板１１２の表面を修飾する化学物質であって、アフィニティ結合によりキャプチャーの基板１１２への固定化を担う場合においては、第２の物質１１８は、キャプチャーと同じ該化学物質とアフィニティ結合する物質とする。
この場合、第１の物質１１６は、アビジン、ストレプトアビジン、プロタミン、ヒストン、ビオチン、抗原、抗体結合蛋白質、あるいは抗体であり、第２の物質１１８は、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、核酸、抗原、抗体結合蛋白質、あるいは抗体である。
また、第１の物質１１６が、スチレン基、フェニル基、アルキル基等の疎水基を含み、基板１１２の表面を修飾する化学物質であって、疎水結合によりキャプチャーの基板１１２への固定化を担う場合においては、第２の物質１１８は、両親媒性物質である。
この場合、第１の物質１１６は、ポリスチレンあるいはアルキルベンゼンであり、第２の物質１１８は、ゼラチンあるいはカゼインである。
また、上記にあげた全ての第１の物質１１６に対して、第２の物質１１８は、シリコン、あるいはフッ素を含む樹脂である。シリコン、あるいはフッ素を含む樹脂は、水溶液に対して撥液性であるため、第１の物質が基板上に接触することを効果的に防ぎ固定化しなくなることに追加して、バイオチップ使用時においてサンプル液自体をはじく効果もあり、スポットのシグナルに対するバックグランドノイズが１／２以下に低減された。
次に、この第５の実施の形態に係るバイオチップ１１０の製造方法について図１４〜図１６Ｃを参照しながら説明する。
まず、図１４Ａに示すように、基板本体１１４上の全面に第１の物質１１６をスクリーン印刷法などによって形成する。もちろん、基板本体１１４として予め上面に第１の物質１１６が形成されたものを使用するようにしてもよい。
次に、図１４Ｂに示すように、基板本体１１４上に形成された第１の物質１１６上のうち、スポット１８０が形成される箇所以外の部分に第２の物質１１８をインクジェット方式にて供給する。
このインクジェット方式による第２の物質１１８の供給は、前述した実施例と同じく図５Ａに示すような分注装置３０を使用することができる。
特に、分注装置３０は、後述するように、キャプチャーを含む試料を基板１２上に供給する場合にも使用される。この場合は、各マイクロピペット３４のキャビティ５６内にキャプチャーを含む試料を充填し、更に、キャビティ５６の容積の減少によってキャビティ５６内の試料がキャビティ５６に連通する試料吐出口５４から所定速度で吐出され、図１２に示すように、マイクロピペット３４から吐出された試料が基板１１２上に供給されて、スポット１８０として整列固定されたバイオチップ１１０が作製されることになる。
尚、各マイクロピペット３４におけるキャビティ（加圧室）５６は、上述の第２の物質１１８や試料が移動するような流路寸法に形成されており、その材質は、第２の物質１１８や試料と親和性のよいセラミックスからなることが好ましい。
次に、この分注装置３０を使って基板本体１１４上に第２の物質１１８及び試料を供給する方法の一例について図１５を参照しながら詳しく説明する。
図１５に示すように、表面に第１の物質１１６が形成されたガラス基板本体１１４を複数枚、例えば２０枚のガラス基板本体１１４を、ガラス固定冶具２１０に固定する。次に、このガラス固定冶具２１０と相対位置制御しながら、ガラス基板本体１１４上を自在に移動できるようにロボットに取り付けられた分注装置３０の各チューブ（図示せず）からそれぞれ固定治具３６の導入孔１０４を介して各マイクロピペット３４のキャビティ５６内に第２の物質１１８を充填し、アクチュエータ部５８を駆動させて、図１４Ｂに示すように、基板本体に形成された第１の物質上のうち、スポット１８０が形成されるべき箇所以外の部分に第２の物質１１８を吐出供給させる。
この場合、図５Ａに示す１０個のマイクロピペット３４を全て用いて第２の物質１１８を供給してもよいが、供給領域の形状の安定性を優先し、１個のマイクロピペット３４を用いて全ての供給を行う。
次いで、予めマイクロピペット３４内を脱泡処理した純水等の置換液で充填した別の分注装置３０を用意し、キャプチャーを含む試料１４を試料注入口５２から注入した後、アクチュエータ部５８を駆動させ置換液を吐出排出し、試料１４を試料注入口５２からキャビティ５６内に置換させる。
置換が完了した段階で、アクチュエータ部５８を駆動させて、図１３に示すように、試料１４を同じガラス固定冶具２１０にセットした基板本体１１４上のうち、スポット１８０を形成すべき部分、即ち、第１の物質１１６が露出している部分に吐出供給させる。このようにして、図１２に示すように、基板１１２上に試料１４によるスポット１８０が多数配列されたバイオチップ１１０が作製される。
このように、第５の実施の形態に係るバイオチップ１１０及びその製造方法においては、前記基板本体１１４上の全面に、キャプチャーの基板１１２上への固定化を担う第１の物質１１６を形成し、基板本体１１４上に形成された第１の物質１１６上のうち、スポット１８０が形成されるべき箇所以外の部分に、キャプチャーの基板１１２上への固定化を阻害し、かつ、前記被検体が基板１１２上への付着を阻害する第２の物質１１８を形成するようにしたので、第２の物質１１８が形成されていない部分の形状により、スポット１８０の形状並びに配列形態が決定されることになる。
そのため、試料を基板１１２上に供給した際に、スポット１８０の配列間隔がばらついたり、スポット１８０同士が付着するなどの不具合は生じなくなる。しかも、試料を規定の位置に供給できなかった場合には、第２の物質１１８の存在により、該試料の基板１１２上への付着が回避されるため、汚染源となることはない。
また、試料をインクジェット方式で供給した場合に、試料吐出の際にしばしば発生するサテライト現象による飛沫は、第２の物質１１８の存在によって基板１１２への付着が阻害されるため、インクジェット方式にて発生していたサテライトの問題を解消させることができる。
つまり、この第５の実施の形態においては、安価に高品質なバイオチップ１１０を得ることができ、バイオチップ１１０の製造工程の簡略化、コストの低廉化並びに歩留まりの向上を図ることができる。
上述の第５の実施の形態では、分注装置３０を用いてインクジェット方式で第２の物質１１８を供給した例を示したが、その他、第２の物質１１８をスクリーン印刷法で形成するようにしてもよい。この場合、スポット１８０が形成されるべき箇所以外の部分への第２の物質１１８の供給時間を短縮することができ、スループットの向上及び工数の削減化を図ることができる。
その他の方法としては、第２の物質１１８をディッピング法で形成するようにしてもよい。この場合、例えば図１６Ａに示すように、基板本体１１４上に形成された第１の物質１１６上のうち、スポット１８０が形成されるべき箇所に、レジスト２１２を形成する。その後、図１６Ｂに示すように、レジスト２１２を含む全面に第２の物質１１８をディッピング法で形成する。その後、図１６Ｃに示すように、レジスト２１２をリフトオフする。これによって、スポット１８０が形成されるべき箇所以外の部分に、第２の物質１１８が形成されることになる。
このディッピングによる方法は、第２の物質１１８が粘度の低い場合に好適であり、この場合も、スポット１８０が形成されるべき箇所以外の部分への第２の物質１１８の供給時間を短縮することができ、スループットの向上及び工数の削減化を図ることができる。
なお、この発明に係るバイオチップ及びその製造方法は、上述の実施の形態に限らず、この発明の要旨を逸脱することなく、種々の構成を採り得ることはもちろんである。
【図面の簡単な説明】
図１は、第１の実施の形態に係るバイオチップの製造方法を示す工程ブロック図である。
図２は、試料調製工程の内訳を示す工程ブロック図である。
図３は、製造されるバイオチップを示す斜視図である。
図４Ａは、基板上に固定化補強液を供給した状態を示す工程図である。
図４Ｂは、基板の固定化補強液上に試料を供給した状態を示す工程図である。
図４Ｃは、試料と固定化補強液が一体化した状態を示す工程図である。
図５Ａは、第１の実施の形態に係るバイオチップの製造方法で使用される分注装置の構成を示す平面図である。
図５Ｂは、その正面図である。
図５Ｃは、分注装置を構成する１つのマイクロピペットを示す拡大平面図である。
図６は、マイクロピペットの構成を示す縦断面図である。
図７は、マイクロピペットの基体内に形成されるキャビティを含む流路の形状を示す斜視図である。
図８は、分注装置を使用してバイオチップを製造する方法の一例を示す説明図である。
図９Ａは、基板上に試料を供給した状態を示す工程図である。
図９Ｂは、基板の試料上に固定化補強液を供給した状態を示す工程図である。
図９Ｃは、試料と固定化補強液が一体化した状態を示す工程図である。
図１０Ａは、基板上に固定化液を供給した状態を示す工程図である。
図１０Ｂは、基板の固定化液上に試料を供給した状態を示す工程図である。
図１１Ａは、基板上に固定化補強液を供給した状態を示す工程図である。
図１１Ｂは、基板の固定化補強液上に試料を供給した状態を示す工程図である。
図１１Ｃは、試料と固定化補強液が一体化した状態を示す工程図である。
図１２は、第５の実施の形態に係るバイオチップを示す斜視図である。
図１３は、第５の実施の形態に係るバイオチップを示す拡大断面図である。
図１４Ａは、基板本体の上面に第１の物質を形成した状態を示す工程経過図である。
図１４Ｂは、第１の物質上のうち、スポットが形成されるべき箇所以外の部分に第２の物質を形成した状態を示す工程経過図である。
図１５は、分注装置を使用してバイオチップを製造する方法の一例を示す説明図である。
図１６Ａは、基板本体上に形成された第１の物質上のうち、スポットが形成されるべき部分にレジストを形成した状態を示す工程経過図である。
図１６Ｂは、レジストを含む全面に第２の物質を形成した状態を示す工程経過図である。
図１６Ｃは、レジストをリフトオフした状態を示す工程経過図である。

Claims (58)

1. 被検体と特異に反応し、被検体の構造又は機能に対する情報を得るために用いられるキャプチャーを含む試料を複数種類、基板上に供給して、該基板上にキャプチャーを含む試料によるスポットが多数配列されたバイオチップにおいて、
   前記基板は、少なくとも前記スポットが形成されるべき箇所に、前記キャプチャーの前記基板上への固定化を担う第１の物質が形成されていることを特徴とするバイオチップ。
2. 請求項１記載のバイオチップにおいて、
   前記固定化を担う第１の物質が、キャプチャーを含まない溶液試料であって、前記キャプチャーを前記基板上に固定化させるための固定化液であることを特徴とするバイオチップ。
3. 請求項１記載のバイオチップにおいて、
   前記固定化を担う第１の物質が、キャプチャーを含まない溶液試料であって、前記キャプチャーを前記基板上に固定化を補強する固定化補強液であることを特徴とするバイオチップ。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオチップにおいて、
   前記基板は、少なくとも前記スポットが形成されるべき箇所に、前記キャプチャーの前記基板上への固定化を担う第１の物質が形成され、前記スポットが形成されるべき箇所以外の部分に、少なくとも前記キャプチャーの前記基板上への固定化を阻害する第２の物質が形成されていることを特徴とするバイオチップ。
5. 請求項４記載のバイオチップにおいて、
   前記第２の物質は、前記キャプチャーの前記基板上への固定化を阻害し、かつ、前記被検体の前記基板上への付着を阻害する物質であることを特徴とするバイオチップ。
6. 請求項４又は５記載のバイオチップにおいて、
   前記第１の物質は、前記基板上の全面に形成され、
   前記第２の物質は、前記基板上に形成された前記第１の物質上のうち、前記スポットが形成されるべき箇所以外の部分に形成されていることを特徴とするバイオチップ。
7. 被検体と特異に反応し、被検体の構造又は機能に対する情報を得るために用いられるキャプチャーを含む試料を複数種類、基板上に供給して、該基板上にキャプチャーを含む試料によるスポットが多数配列されたバイオチップを製造するバイオチップの製造方法において、
   キャプチャーを含む溶液試料とキャプチャーを含まない溶液試料とをそれぞれ別々に供給してバイオチップを製造することを特徴とするバイオチップの製造方法。
8. 請求項７記載のバイオチップの製造方法において、
   前記キャプチャーを含む溶液試料をインクジェット方式で供給することを特徴とするバイオチップの製造方法。
9. 請求項７又は８記載のバイオチップの製造方法において、
   前記キャプチャーを含まない溶液試料をインクジェット方式で供給することを特徴とするバイオチップの製造方法。
10. 請求項７又は８記載のバイオチップの製造方法において、
    前記キャプチャーを含まない溶液試料をスクリーン印刷方式にて供給することを特徴とするバイオチップの製造方法。
11. 請求項７〜１０のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記キャプチャーを含まない溶液試料は、前記キャプチャーを前記基板上に固定化させるための固定化液であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
12. 請求項７〜１０のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記キャプチャーを含まない溶液試料は、前記キャプチャーの前記基板上への固定化を補強する固定化補強液であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
13. 請求項１１又は１２記載のバイオチップの製造方法において、
    前記固定化液又は前記固定化補強液は、前記キャプチャーを含む溶液試料と混合することにより、固定化又は固定化補強が進む液であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
14. 請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記基板上に前記キャプチャーを含む溶液試料を供給した後、該試料が供給された部分に前記固定化液、若しくは前記固定化補強液を供給することを特徴とするバイオチップの製造方法。
15. 請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記基板上に前記固定化液若しくは該固定化補強液を供給した後、該固定化液若しくは該固定化補強液が供給された部分に前記キャプチャーを含む溶液試料を供給することを特徴とするバイオチップの製造方法。
16. 請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記基板上に前記固定化液若しくは前記固定化補強液と、前記キャプチャーを含む溶液試料とを略同時期に供給することを特徴とするバイオチップの製造方法。
17. 請求項７〜１６のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記キャプチャーは、核酸類であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
18. 請求項１７記載のバイオチップの製造方法において、
    前記核酸類が、ＤＮＡ及びまたはその断片もしくは増幅されたもの、ｃＤＮＡ及びまたはその断片もしくは増幅されたもの、ＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ及びまたはその断片もしくは増幅されたもの、化学合成されたＤＮＡもしくは増幅されたもの、または、化学合成されたＲＮＡもしくは増幅されたものであることを特徴とするバイオチップの製造方法。
19. 請求項７〜１６のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記キャプチャーが、蛋白質類であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
20. 請求項１９記載のバイオチップの製造方法において、
    前記蛋白質類が、抗原、抗体、レクチン、アドヘシン、生理活性物質の受容体、またはペプチドであることを特徴とするバイオチップの製造方法。
21. 請求項１５〜２０のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記固定化液がポジティブチャージを持った化学物質溶液であり、イオン結合により前記キャプチャーを固定化することを特徴とするバイオチップの製造方法。
22. 請求項２１記載のバイオチップの製造方法において、
    前記化学物質がγ−アミノプロピルトリエトキシシラン等のシランカップリング剤、ポリ−Ｌ−リジン、あるいはポリアルキルアミンであることを特徴とするバイオチップの製造方法。
23. 請求項１５〜２０のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記固定化液が基板表面を化学修飾する化学物質であり、基板表面に導入された官能基と前記キャプチャーを修飾して導入した官能基を化学反応させ、共有結合によりキャプチャーと基板を固定化することを特徴とするバイオチップの製造方法。
24. 請求項２３記載のバイオチップの製造方法において、
    前記化学反応が、アミノ基とアルデヒド基との反応、アミノ基とＮ−ヒドロキシサクシイミド基との反応、アミノ基とカルボキシル基との反応、アミノ基とエポキシ基との反応、または、チオール基とエポキシ基との反応であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
25. 請求項１５〜２０のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記固定化液が、アビジン、ストレプトアビジン、プロタミンあるいはヒストンであることを特徴とするバイオチップの製造方法。
26. 請求項１５〜２０のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記固定化液が、フェニル基、アルキル基等の疎水基を含む溶液であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
27. 請求項１５〜２０のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記固定化補強液が、保水性物質であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
28. 請求項２７記載のバイオチップの製造方法において、
    前記保水性物質が、コロミン酸、ヒアルロン酸、またはコロミン酸とヒアルロン酸の混合物であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
29. 請求項１５〜２０のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記固定化補強液が、高分子物質であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
30. 請求項２９記載のバイオチップの製造方法において、
    前記高分子物質が、ＣＭ−セルロース、ニトロセルロース、ポリアクリル酸、アルギン酸等の酸性ポリマー、あるいは、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド等の塩基性ポリマー、あるいは、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等の中性ポリマー、または、ＢＳＡ、卵白アルブミン、リゾチーム等の蛋白質類であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
31. 請求項１１〜３０のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記基板が複数枚セットされた冶具を備え、前記キャプチャーを含む溶液試料と前記キャプチャーを含まない溶液試料との供給を前記冶具上に固定された状態の基板のまま行うことを特徴とするバイオチップの製造方法。
32. 請求項１１〜３１のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    キャプチャーを含まない溶液試料が前記基板上に供給される領域が、前記キャプチャーを含まない溶液試料が供給される領域と略同一又は前記キャプチャーを含む溶液試料が供給される領域を含む領域で、且つ領域の形状が略円形であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
33. 請求項１１〜３１のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    キャプチャーを含まない溶液試料が前記基板上に供給される領域が、前記キャプチャーを含まない溶液試料が供給される領域を２つ以上含む大きさであることを特徴とするバイオチップの製造方法。
34. 被検体と特異に反応し、被検体の構造又は機能に対する情報を得るために用いられるキャプチャーを含む試料を複数種類、基板上に供給して、該基板上にキャプチャーを含む試料によるスポットが多数配列されたバイオチップを製造するバイオチップの製造方法において、
    少なくとも前記スポットが形成されるべき箇所に、前記キャプチャーの前記基板上への固定化を担う第１の物質を有する前記基板上のうち、前記スポットが形成されるべき箇所以外の部分に、少なくとも前記キャプチャーの前記基板上への固定化を阻害する第２の物質を形成する工程を有することを特徴とするバイオチップの製造方法。
35. 請求項３４記載のバイオチップの製造方法において、
    前記基板上のうち、少なくとも前記スポットが形成されるべき箇所に、前記第１の物質を形成する工程と、
    前記基板上のうち、前記スポットが形成されるべき箇所以外の部分に、前記第２の物質を形成する工程とを有することを特徴とするバイオチップの製造方法。
36. 請求項３５記載のバイオチップの製造方法において、
    前記基板上の全面に前記第１の物質を形成する工程と、
    前記基板上に形成された前記第１の物質上のうち、前記スポットが形成されるべき箇所以外の部分に、前記第２の物質を形成する工程とを有することを特徴とするバイオチップの製造方法。
37. 請求項３４記載のバイオチップの製造方法において、
    前記基板として、予め前記スポットが形成されるべき箇所に、前記第１の物質が形成された基板を用い、
    前記基板上のうち、前記スポットが形成されるべき箇所以外の部分に、前記第２の物質を形成する工程を有することを特徴とするバイオチップの製造方法。
38. 請求項３４〜３７のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記第２の物質は、前記キャプチャーの前記基板上への固定化を阻害し、かつ、前記被検体の前記基板上への付着を阻害する物質であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
39. 請求項３４〜３８のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記キャプチャーを含む試料をインクジェット方式で供給することを特徴とするバイオチップの製造方法。
40. 請求項３４〜３９のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記第２の物質を、インクジェット方式で供給することを特徴とするバイオチップの製造方法。
41. 請求項３４〜３９のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記第２の物質を、スクリーン印刷法で形成することを特徴とするバイオチップの製造方法。
42. 請求項３４〜３９のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記第２の物質を、ディッピング法で形成することを特徴とするバイオチップの製造方法。
43. 請求項４２記載のバイオチップの製造方法において、
    前記基板上に形成された前記第１の物質上のうち、前記スポットが形成されるべき箇所に、レジストを形成し、
    前記レジストを含む全面に前記第２の物質をディッピング法で形成し、
    前記レジストをリフトオフして、前記スポットが形成されるべき箇所以外の部分に、前記第２の物質を形成することを特徴とするバイオチップの製造方法。
44. 請求項３４〜４３のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記第１の物質が、ポジティブチャージを有する化学物質であって、イオン結合により前記キャプチャーの基板への固定化を担う場合に、
    第２の物質は、ネガティブチャージを有する化学物質であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
45. 請求項４４記載のバイオチップの製造方法において、
    前記第１の物質は、少なくともγ−γ−アミノプロピルトリエトキシシラン等のシランカップリング剤、ポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、あるいはポリアルキルアミンを含み、
    前記第２の物質は、少なくともコハク酸、グルコン酸等の有機酸類あるいはポリアクリル酸、アルギン酸等の高分子酸類を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
46. 請求項３４〜４３のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記第１の物質が、活性化基を有し、基板表面を修飾する化学物質であって、基板表面に導入された活性化基と前記キャプチャーを修飾して導入した官能基とを化学反応させ、共有結合により前記キャプチャーの基板への固定化を担う場合に、
    前記第２の物質は、活性化基と反応する官能基を有する化学物質であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
47. 請求項４６記載のバイオチップの製造方法において、
    前記共有結合を達成する化学反応が、アミノ基とアルデヒド基との反応、アミノ基とＮ−ヒドロキシサクシイミド基との反応、アミノ基とカルボキシル基との反応、アミノ基とエポキシ基との反応、又は、チオール基とエポキシ基との反応であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
48. 請求項４６又は４７記載のバイオチップの製造方法において、
    前記第１の物質は、少なくともγ−アミノプロピルトリエトキシシランとグルタルアルデヒドとの混合物、γ−アミノプロピルトリエトキシシランと無水コハク酸とＮ−ヒドロキシサクシニミドとの混合物、γ−アミノプロピルトリエトキシシランと無水コハク酸との混合物、エピクロロヒドリン、あるいはビスオキシシランを含み、
    前記第２の物質は、少なくともアミノ酸類、アミノ基を有するトリス、エタノールアミン、チオール基を有するシステイン、グルタチオン、あるいはチオブライコールを含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
49. 請求項３４〜４３のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記第１の物質が、基板表面を修飾する化学物質であって、アフィニティ結合により前記キャプチャーの基板への固定化を担う場合に、
    前記第２の物質は、該化学物質とアフィニティ結合する物質であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
50. 請求項４９記載のバイオチップの製造方法において、
    前記第１の物質は、少なくともアビジン、ストレプトアビジン、プロタミン、ヒストン、ビオチン、抗原、抗体結合蛋白質、あるいは抗体を含み、
    前記第２の物質は、少なくともアビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、核酸、抗原、抗体結合蛋白質、あるいは抗体を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
51. 請求項３４〜４３のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記第１の物質が、スチレン基、フェニル基、アルキル基等の疎水基を含み、基板表面を修飾する化学物質であって、疎水結合により前記キャプチャーの基板への固定化を担う場合に、
    前記第２の物質は、少なくとも両親媒性物質を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
52. 請求項５１記載のバイオチップの製造方法において、
    前記第１の物質は、少なくともポリスチレンあるいはアルキルベンゼンを含み、
    前記第２の物質は、少なくともゼラチンあるいはカゼインを含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
53. 請求項３４〜４３記載のバイオチップの製造方法において、
    前記第２の物質は、撥水性を有する物質よりなることを特徴とするバイオチップの製造方法。
54. 請求項５３記載のバイオチップの製造方法において、
    前記第２の物質は、少なくともシリコンあるいはフッ素を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
55. 請求項３４〜５４のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記キャプチャーは核酸類であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
56. 請求項５５記載のバイオチップの製造方法において、
    前記核酸類が、ＤＮＡ及び／又はその断片もしくは増幅されたもの、ｃＤＮＡ及び／又はその断片もしくは増幅されたもの、ＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ及び／又はその断片もしくは増幅されたもの、化学合成されたＤＮＡもしくは増幅されたもの、又は、化学合成されたＲＮＡもしくは増幅されたものであることを特徴とするバイオチップの製造方法。
57. 請求項３４〜５４のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法において、
    前記キャプチャーが、蛋白質類であることを特徴とするバイオチップの製造方法。
58. 請求項５７記載のバイオチップの製造方法において、
    前記蛋白質類が、抗原、抗体、レクチン、アドヘシン、生理活性物質の受容体、又はペプチドであることを特徴とするバイオチップの製造方法。

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