JP2001510727A

JP2001510727A - ポリエチレンイミンベースの生体分子アレイ

Info

Publication number: JP2001510727A
Application number: JP2000503933A
Authority: JP
Inventors: ネス，ジェフリーバン; シー．タボン，ジョン; モイニハン，クリステン
Original assignee: ラピジーン，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-07-22
Filing date: 1998-07-21
Publication date: 2001-08-07
Also published as: EP0998347A1; AU8582598A; NZ501968A; CA2297175A1; AU735546B2; WO1999004896A1; US6150103A; CN1265049A; HUP0002488A2

Abstract

(57)【要約】生体分子のアレイを、表面を備える固体基板から形成する。ここで、この表面は、少なくとも部分的に、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）の層で覆われ、この層は、連続する第２の領域に隣接し、かつ囲まれた、複数の不連続な第１の領域の間で分割する。第１の領域は、生体分子およびＰＥＩの存在により規定される。第２の領域は、ＰＥＩの存在および該生体分子の実質的な不在によって規定される。このアレイは、表面を有する固体基板を提供する工程であって、ここで、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）の層が、表面の少なくとも一部を覆う、工程を包含する方法によって調製され得る。この層は、連続する第２の領域に隣接し、かつ囲まれた、複数の不連続な第１の領域を含む。この方法は、第２の領域を、生体分子を実質的に含まないように維持しながら、生体分子を第１の領域に配置する工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は生体分子のアレイに関し、より詳細には、基板を覆うポリエチレンイ
ミン層を通じて位置する不連続な生体分子含有エレメントのアレイに関する。

【０００２】（発明の背景）分子生物学および微生物学の分野において、そこに生体分子を固相化した固体
支持体を用いることは長い間常識であった。固相化は、種々の利点（例えば、サ
ンプルの多重化および多くのシグナル系において用いられるタグの素早い測定を
可能にすること）を提供する。例えば、核酸ポリマーをビーズに結合させること
について多数の文献が存在する。

【０００３】１つのこのような方法は、ストレプトアビジン被覆した磁気ビーズ（これは、
例えば、ＤｙｎａｌｏｆＯｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙから市販されている）を使
用する。これらのビーズを、末端を標識したビオチン化オリゴヌクレオチドと接
触させる。ビオチンおよびストレプトアビジンは、非共有的であるが高度に安定
な様式（これは、多くの目的のために、共有結合の機能的等価物である）で、相
互作用することが周知である。したがって、オリゴヌクレオチドは、このビオチ
ン−ストレプトアビジン相互作用により、ビーズに固相化され得る。

【０００４】別の方法は、カルボジイミド化学に依存する。この基本的アプローチにはいく
つかのバリエーションが存在する。例えば、ヒドラジド被覆したビーズは、カル
ボジイミド促進カップリングにより、例えば、Ｋｒｅｍｓｋｙ，Ｊ．Ｎ．らＮ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：２８９１−２９０９，１９８７に記
載のように、カルボキシ改変オリゴヌクレオチドに結合され得る。このアプロー
チの別のバリエーションは、カルボキシル基の表面被覆を有する、制御された孔
ガラス（ＣＰＧ）または磁性ポリスチレンビーズを使用する。これを、例えば、
Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．Ｓ．らＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：５３５
３−５３７２，１９８７およびＬｕｎｄＶ．らＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１６：１０８６１−１０８８０，１９８７に記載されるように、アミ
ノ改変オリゴヌクレオチドと反応させる。

【０００５】なお別の方法は、ビーズを取り囲むポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の層を使用
する。例えば、Ｗａｓｓｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｐ．らＢｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄＢ
ｉｏｅｎｇ．ＸＸＩＩ：２７１−２８７，１９８０；Ｐｏｖｅｙ，Ａ．Ｃ．ら
Ｊ．ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ７５：８３１−８３７
，１９８６；Ｒｏｕｎｄｓ，Ｍ．Ａ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．３６２：１８７−１９
６，１９８６；ＶａｎＮｅｓｓ，Ｊ．らＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．１９：３３４５−３３５０，１９９１；およびＰＣＴ国際公開ＷＯ９４／０
０６００を参照。さらに、ＰＥＩは、種々の生体分子（核酸ポリマーを含む）を
、広範囲の非ビーズ固体の支持体および表面に固相化するために使用されてきた
。例えば、Ｓｃｈｕｒｅｒ，Ｊ．Ｗ．らＪ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄＣｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５：３８４−３８７，１９７７；Ａｌ
ｐｅｒｔ，Ａ．Ｊ．らＪ．Ｃｈｒｏｍ．１８５：３７５−３９２，１９７９；
Ｖａｎｅｃｅｋ，Ｇ．らＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１：１５６−１６９
，１９８２；ＥｌＲａｓｓｉ，Ｚ．らＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ１
９：９−１８，１９８４；Ｒｏｕｎｄｓ，Ｍ．Ａ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．３６２：１
８７−１９６，１９８６；Ｓｗａｎｎ，Ｗ．Ｅ．ら，への欧州特許出願第０,１９７,７８４号１９８６；Ｄ’Ｓｏｕｚａ，Ｓ．Ｆ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔ．８：６４３−６４８，１９８６；Ｐｏｖｅｙ，Ａ．Ｃ．らＪ
．ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ７６：２０１−２０７，
１９８７；Ｎｇｏ，Ｔ．Ｔ．への米国特許第４,７５３,９８３号１９８８；Ｃ
ｒａｎｅ，Ｌ．Ｊ．ら（１９９０）への欧州特許出願第０,４０３,７００Ａ１；
Ｔｒｉｎｈ，Ｃ．Ｋ．ＤｉｅＡｎｇｅｗａｎｄｔｅＭａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈ
ｅｍｉｅ２１２：１６７−１７９，１９９３；Ｂｒｕｉｌ，Ａ．らＪ．Ｂｉ
ｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．２７：１２５３−１２６８，１９９３；ＰＣＲ国際
公開第ＷＯ９５／０２１８４号を参照。確かに、ＰＥＩは、固体支持体の非存在
下でオリゴヌクレオチドに結合することが報告されている。例えば、Ｂｏｕｓｓ
ｉｆ，Ｏ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：７２９
７−７３０１，１９９５を参照。

【０００６】最近、平坦な固体支持体に生体分子、そして特にポリヌクレオチドのアレイを
作製することに強い注意が集中してきた。以下の刊行物（およびその中で引用さ
れる参考文献）（これらは単に例示である）は、これら生体分子アレイについて
の種々の有用性の一般的および具体的な概観、ならびにこのようなアレイを調整
する方法を提供する：Ｅｇｇｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．らＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＤ
ＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＳＰＩＥＶｏｌ．１８
９１：１１３−１２６，１９９３；Ｃｈｅｔｖｅｒｉｎ，Ａ．Ｂ．らＢｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：１０９３−１０９９，１９９４；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
，Ｅ．Ｍ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２２：１３６８
−１３７３，１９９４；Ｌｉｐｓｈｕｔｚ，Ｒ．Ｊ．らＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ１９：４４２−４４７，１９９５；Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ＢｉｏＥｓｓａ
ｙｓ１８：４２７−４３１，１９９６；Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ａ．Ｐ．らＢ
ｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ１１：６８７−６９
０，１９９６；Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ−Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｍ．Ｊ．らＧｅｎｅｔ
ｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ：ＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ１３：１５１−１５７，１９９６；Ｒｅｇａｌａｄｏ，Ａ．Ｓｔａｒｔ−Ｕ
ｐ２４−３０，Ｏｃｔ．１９９６；およびＳｔｉｐｐ，Ｄ．Ｆｏｒｔｕｎｅ
３０−４１頁，１９９７年３月３１日。

【０００７】これらのアレイを調製するために報告された手順の多くが、ビーズおよび他の
固体支持体に生体分子を固相化することに関して開発された専門技術を利用して
きた。恐らく驚くべきことに、今日まで、アレイ形式に生体分子を固相化するた
めにＰＥＩを使用する報告はなかった。せいぜい、これは、オリゴヌクレオチド
をナイロン支持体に連結することについての理論的可能性として示唆されてきた
。例えば、ＶａｎＮｅｓｓ，Ｊ．らＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．
１９：３３４５−３３５０，１９９１を引用するＰＣＴ国際公開第ＷＯ９５／０
９２４８号を参照。

【０００８】本明細書に開示するように、本発明者らは、ＰＥＩベースのオリゴヌクレオチ
ドアレイを調製することに関連する問題を特定し、そしてその問題を解決し、そ
の結果、ＰＥＩベースのアレイが、今や、単なる理論的可能性どころではなくな
った。さらに、本発明のＰＥＩベースのアレイは、本明細書にも開示されるよう
に、他の型のアレイと比較して、種々の利点を提供する。

【０００９】（発明の要旨）本発明は、表面を備える固体基板を含む生体分子のアレイであって、その表面
が、少なくとも部分的に、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）の層で覆われ；こ
の層は、連続する第２の領域に隣接しかつ囲まれた、複数の不連続な第１の領域
を含み；第１の領域は、生体分子およびＰＥＩの存在により規定され；第２の領
域は、ＰＥＩの存在および上記生体分子の実質的な不在によって規定される、ア
レイを提供する。

【００１０】本明細書中で使用されるように、上記第１の領域はまた植え込み領域と呼ばれ
る。なぜなら、生体分子は、ある意味で、この第１の領域内のＰＥＩ中に植え込
まれるからである。また、本明細書中で使用されるように、上記第２の領域はま
たスペーサー領域または連続スペーサー領域と呼ぶ。なぜなら、実際に、このス
ペーサー領域は、前記植え込み領域中の反応性生体分子間に非反応性スペースを
供する。

【００１１】別の局面において、本発明は、生体分子のアレイを調製する方法を提供する。
この方法は、表面を備える固体基板を提供する工程であって、ポリ（エチレンイ
ミン）（ＰＥＩ）の層が、その表面の少なくとも一部を覆い、この層は、連続す
る第２の領域に隣接し、かつ囲まれた、複数の不連続な第１の領域を含む、工程
；および第２の領域を、生体分子を実質的に含まないように維持しながら、その生体分
子を第１の領域に配置する工程を包含する。

【００１２】本発明の他の局面は、添付の図面および以下の詳細な説明を参照することによ
り明らかになる。

【００１３】（発明の詳細な説明）本発明は生体分子のアレイを提供する。このアレイは、表面（好ましくは、平
板表面）を有する固体基板を含む。ここで、その表面は、少なくとも部分的に、
ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）の層で覆われる。ＰＥＩの層は、連続する第
２の領域に隣接し、かつ囲まれた、複数の不連続な第１の領域を有する。第１の
領域は、生体分子およびＰＥＩの存在により規定され、他方、第２の領域は、Ｐ
ＥＩの存在および前記生体分子の実質的な不在（すなわち、２,０００平方ミクロンの第２の領域あたり約１０³生体分子未満）によって規定される。

【００１４】図１Ａは、本発明の実施態様に従う生体分子アレイ１０の、模式的な平面図で
あり、図１Ｂは模式的な断面図である。アレイ１０は、平板表面２２を有する、
固体基部または支持体基板２０を有し得、そしてアレイ１０は、支持体基板２０
の少なくとも一部を覆う最上層３０を有し得る。最上層３０は、好ましくは、Ｐ
ＥＩから構成され、そして最下層２０は、好ましくは、剛直な物質（これにＰＥ
Ｉが共有結合する）から構成される。ＰＥＩ層３０は、連続スペーサー領域３４
に位置する複数の植え込み領域３２（例えば、図１Ａに示される１２個）を有す
る。各植え込み領域３２は、ＰＥＩ層３０中に植え込まれた生体分子の塊４０に
より規定される、不連続で、隔離された領域であり、スペーサー領域３４は、Ｐ
ＥＩ層３０の残りの部分により規定される。例えば、各植え込み領域３２は、最
上層３０の表面から、最上層３０内の中間深度「ｄ」まで伸びる、切形の円錐形
を有し得る。下記に詳述されるように、生体分子４０は、ＰＥＩ層３０の構造中
に拡散し、ＰＥＩ層３０内の反応性アミン部位に共有結合する。

【００１５】ＰＥＩ層３０、植え込み領域３２、および植え込み領域３２間のスペースの大
きさは、一般に、特定の適用に従って変化する。例えば、ＰＥＩ層３０の厚さＴ
は、ＰＥＩ分子の単一層のように小さくあり得る。さらに、植え込み領域は、一
般に、ＰＥＩ層３０の表面で、直径が約１０〜１００μｍであり、植え込み領域
３２間の中心間距離「Ｄ」は、一般に、１００μｍと１,０００μｍとの間である。好ましい実施態様において、植え込み領域３２の表面直径は、約５０μｍで
あり、そして植え込み領域３２は、約２００μｍの中心間距離Ｄだけ離れて位置
する。

【００１６】（固体基板）基板は好ましくはガラスまたはシリコンである。しかし、基板は、あるいは、
石英、金、合成有機ポリマー（例えば、ポリエチレン、マイラー、および６，６
−ナイロン）またはそれらの複合物であり得る。好ましい実施態様において、基
板は平板表面である。別の好ましい実施態様において、基板は、他は平面である
表面全体に分布するウェルまたは他の同一視できるものから形成される。基板は
、非孔性物質の構造を有し得るか、または基板は多孔性であり得る（例えば、ナ
イロン）。基板はメンブレンまたはフィルムであり得る（例えば、マイラーまた
は金）。ＰＥＩ含有、生体分子非含有領域によって取り囲まれた、ＰＥＩ含有、
生体分子含有領域の形成および保持を可能にする、本質的に任意の固体基板が、
用いられ得る。

【００１７】この目的に有用な固体支持体の例は、代表的には電子産業において半導体の構
築に使用されるシリコンウエハである。ウエハは、一方の面を高度に磨かれそし
て反射性であり、シラン化学を使用してポリ（エチレンイミン）で容易に被覆さ
れ得る。ウエハは、ＷａｆｅｒＮｅｔ（ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）のような会社
から市販されている。ガラススライドもまた、反射性被覆で被覆され得る。ガラ
ススライドもまた、シラン化学を使用してポリ（エチレンイミン）で容易に被覆
され得る。

【００１８】ポリ（エチレンイミン）のポリマー被覆は、市販の架橋剤（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒ
ｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、固体支持体への、オリゴヌクレオチド、Ｐ
ＣＲフラグメントもしくはアンプリコン、ＤＮＡ分子もしくはフラグメント、ま
たは他のアミン含有生体分子の共有結合を可能にする。ポリ（エチレンイミン）
（ＰＥＩ）被覆したスライドもまた、長い貯蔵安定性の付加された利益を有する
。

【００１９】（ＰＥＩ被覆の調製）基板にＰＥＩの層を接着するために使用した化学は、実質的に、その基板の化
学的個性に依存する。先行技術は、固体支持体にＰＥＩを接着し得る、適切な化
学の多くの例を提供する。例えば、基板が６，６−ナイロンである場合、ＰＥＩ
被覆は、ＶａｎＮｅｓｓ，Ｊ．らＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１
９：３３４５−３３５０，１９９１およびＰＣＴ国際公開ＷＯ９４／００６００
（共に、本明細書中に参考として援用する）に開示された方法によって適用され
得る。固体支持体がガラスまたはシリコンである場合、ＰＥＩの層を適用する適
切な方法は、例えば、Ｗａｓｓｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＸＸＩＩ：２７１−２８７，１
９８０；およびＤ’Ｓｏｕｚａ，Ｓ．Ｆ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅ
ｔｔｅｒｓ８：６４３−６４８，１９８６に見出される。

【００２０】好ましくは、ＰＥＩ被覆は固体基板に共有結合される。固体基板がガラスまた
はシリコンである場合、ＰＥＩ被覆は、シリル化化学を使用して、基板に共有結
合され得る。例えば、反応性シロキシ末端基を有するＰＥＩは、Ｇｅｌｅｓｔ，
Ｉｎｃ．（Ｔｕｌｌｙｔｏｗｎ，ＰＡ）から市販されている。このような反応性
のＰＥＩを、ガラススライドまたはシリコンウエハと接触させ得、そして穏やか
な攪拌後、ＰＥＩが基板に接着する。あるいは、二官能性シリル化試薬が用いら
れ得る。このプロセスに従って、ガラスまたはシリコン基板を、二官能性シリル
化試薬と反応させて、反応性表面を有する基板を提供する。次いで、ＰＥＩを反
応性表面と接触させ、そして二官能性試薬によりその表面に共有結合させる。

【００２１】ＰＥＩ被覆は生体分子を結合させるために当該分野において専ら使用されてき
た。ＰＥＩは、種々の理由から、この能力において非常に効果的である。例えば
、ＰＥＩは非常に親水性であり、したがって生体分子を含む水溶液で容易に湿る
。さらに、ＰＥＩは多くのアミノ基を含む。アミノ基は、生体分子中の酸性基と
塩を形成し得る。しかし、ＰＥＩが生体分子の水溶液を受け入れる容易さが、ま
さに、今日まで、生体分子アレイの調製に使用されなかった理由である。生体分
子水溶液がＰＥＩの層に配置された場合、溶液は、不連続な位置に留まるよりむ
しろ、ＰＥＩ被覆全体に容易に運ばれる（ｗｉｃｋ）。溶液は運ばれるので、ア
レイ形式に配置された溶液は簡単に合流し、そして単一の反応性エリアを形成す
る。これは、まさに、生体分子アレイの調製において避けるべきことである。

【００２２】（溶液のアレイ化）本発明者らは、ＰＥＩ被覆を用いて生体分子アレイを調製する方法を見出した
。本発明のアプローチは、組成物の総容量に基づいて、約３５容量％〜約８０容
量％の濃度の増粘剤、０.００１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ生体分子（好ましくは、オリゴヌクレオチド）、および水を含む、「アレイ化溶液」とも呼ばれる
、組成物を使用する。増粘剤が水性オリゴヌクレオチド組成物内に含まれる場合
、その増粘剤は組成物に所望の流体力学的特性を付与し、したがって、組成物を
、本明細書中で開示した改変スプリングプローブとともに使用して、組成物リザ
ーバーからの組成物の単一の積み込み（ｐｉｃｋｕｐ）のみで、複数の均一な微
小滴（ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ）を、ＰＥＩを有する平板表面に送達すること
が可能になる。

【００２３】増粘剤の濃度は、グリセロールのような液体増粘剤については、３５％Ｖ／Ｖ
〜８０％Ｖ／Ｖである。組成物における増粘剤の好ましい濃度は、いくらか、ア
レイ化が実施される温度に依存する。アレイ化温度が低ければ、使用に必要な増
粘剤の濃度は低くなる。温度と粘度制御の組み合わせが、アレイが、ほとんどの
型の固体支持体（例えば、ガラス、ウエハ、ナイロン６／６、ナイロンメンブレ
ンなど）に作製されることを可能にする。

【００２４】増粘剤の存在は、生体分子と組み合わせて存在すべき低濃度の種々の他の物質
の同時存在を可能にするというさらなる利益を有する。例えば、０.００１％Ｖ／Ｖ〜１％Ｖ／Ｖの界面活性剤が、アレイ化溶液中に存在し得る。ＰＣＲ緩衝液
が、少量のＴｗｅｅｎ−２０またはＮＰ−４０を含み、アンプリコンの前精製を
伴うことなく、ＰＣＲバイアルから直接サンプル核酸をアレイ化することがしば
しば望ましいので、これは有用である。増粘剤の使用は、アレイ化溶液中にまた
存在すべき塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、またはＭｇＣｌ₂）、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ）、および／またはキレート化試薬（例えば、ＥＤＴＡ）の存在を
可能にする。増粘剤の使用はまた、アレイ化溶液中に存在すべき架橋試薬および
／または有機溶媒の使用を可能にするというさらなる利益を有する。商業的に入
手されるように、架橋試薬は、通常、有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、Ｎ
ＭＰ、メタノール、エタノールなど）に溶解される。通常使用される有機溶媒は
、増粘剤が使用される場合、０.０５％〜２０％（Ｖ／Ｖ）で本発明のアレイ化溶液に使用され得る。

【００２５】一般に、増粘剤は、アレイ化溶液に増加した粘度を付与する。アレイ化溶液に
おいて適切な粘度が達成された場合、最初の滴は、例えば、配置された１００番
目の滴と実質的に同じサイズである。アレイ化溶液中で不適切な粘度が使用され
ると、配置された最初の滴は、配置されたより後の滴より有意に大きい。所望の
粘度は、純水の粘度と純グリセリンの粘度との間である。

【００２６】本発明のアレイ化溶液は、ほとんど任意の表面に微小滴を配置するために使用
され得る。固体支持体の表面特性は、微小滴の配置に対してほとんどまたは全く
効果を有さないので、生物学的サンプルは、ほとんど任意のタイプの被覆された
表面、またはポリマー被覆した固体支持体にアレイ化され得る。例えば、代表的
な水溶液は、親水性ポリマー（例えば、ポリ（リジン）またはポリ（エチレンイ
ミン））で被覆された固体支持体上で迅速に広がる傾向がある。他方、これら同
じ溶液は、疎水性表面（例えば、シリコンウエハ）上で容易に配置される傾向に
ない。しかし、本発明に従う、増粘剤を含むアレイ化溶液は、これら基板のうち
の任意のもので均一な小滴を配置するために使用され得る。

【００２７】アレイ化プロセス中にグリセロールのような増粘剤を含むことの別の重要な利
益は、質の制御である。例えば、グリセロールが、本明細書中に記載されるアレ
イ化方法において使用される場合、液体の小滴が、固体支持体に配置される。本
明細書に記載される方法において通常使用される濃度で、グリセロール濃度は、
微小滴の蒸発を防ぐに十分である。したがって、各アレイピンの各プリンティン
グは、アレイの化学的加工処理の前に、検査され得る。微小滴を可視化する能力
は、アレイ化プロセスに関して質の制御を行う能力を実質的に増強する。このこ
とは、アレイにする方法論における値の実質的な増加に至る。

【００２８】生体分子は核酸ポリマーまたはそのアナログ（例えば、ＰＮＡ、ホスホロチオ
エート、およびメチルホスホネート）であり得る。核酸とは、リボ核酸およびデ
オキシリボ核酸の両方をいう。生体分子は、非天然および／または合成塩基を含
み得る。生体分子は、一本鎖または二本鎖の核酸ポリマーであり得る。

【００２９】好ましい生体分子は核酸ポリマーであり、これには、オリゴヌクレオチド（約
１００ヌクレオチド塩基まで）およびポリヌクレオチド（約１００塩基を超える
）が含まれる。好ましい核酸ポリマーは、１５〜５０ヌクレオチド塩基から形成
される。別の好ましい核酸ポリマーは、５０〜１,０００ヌクレオチド塩基を有する。核酸ポリマーは、数例を挙げると、ＰＣＲ産物、ＰＣＲプライマー、また
は核酸二重鎖であり得る。しかし、本質的に任意の核酸タイプは、核酸が下記の
ように一次アミンを含む場合、ＰＥＩ被覆した表面に共有結合され得る。アレイ
化溶液中の核酸ポリマーの代表的な濃度は、０.００１〜１０μｇ／ｍＬ、好ましくは０.０１〜１μｇ／ｍＬ、そしてより好ましくは０.０５〜０.５μｇ／ｍＬである。

【００３０】好ましい核酸ポリマーは、それらが、核酸ポリマーの５'末端に一次アミンを含むように改変されている点で、「アミン改変」である。好ましくは、１または
それ以上のメチレン（−ＣＨ₂−）基が、核酸ポリマーの一次アミンと核酸部分との間に配置される。６は、メチレン基の好ましい数である。アミン改変した核
酸ポリマーが好ましい。なぜなら、それらは、５'アミン基により固体支持体に共有結合され得るからである。ＰＣＲ産物は、５'−ヘキシルアミン改変されたＰＣＲプライマーを使用してアレイにされ得る。核酸二重鎖は、アリル−ｄＵＴ
Ｐ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用するニックトランスレーショ
ンによる、アミンの導入後、アレイにされ得る。アミンは、ポリメラーゼ（例え
ば、ターミナルトランスフェラーゼ）またはリガーゼによる核酸への短いアミン
含有核酸ポリマーの連結によって、核酸中に導入され得る。

【００３１】好ましくは、核酸ポリマーは、ＰＥＩ皮膜と接触させる前に活性化される。こ
れは、アミン官能化核酸ポリマーを多官能性アミン反応性化学品（例えば、トリ
クロロトリアジン）と組合せることによって、共有結合的に達成され得る。核酸
ポリマーが５'アミン基を含む場合、その５'アミンを、塩化シアヌルとしてもま
た公知であるトリクロロトリアジンと反応させ得る（ＶａｎＮｅｓｓらＮｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９（２）：３３４５−３３５０，１９９
１）。好ましくは、過剰の塩化シアヌルを核酸ポリマー溶液に加え、ここで、ア
ッセイ化溶液中の核酸ポリマーのアミンの数を超える、１０〜１００倍モル過剰
の塩化シアヌルが好ましい。この方法で、アミン末端化核酸ポリマーの大部分は
、トリクロロトリアジンの１分子と反応し、その結果、核酸ポリマーは、ジクロ
ロトリアジンで終結するようになる。

【００３２】本発明の有利な特徴は、生体分子含有アレイ化溶液が、そのアレイ化溶液が十
分な量のトリクロロトリアジンを含んでも、ＰＥＩ被覆に配置され得ることであ
る。これは、アレイにするプロセス前に、カップリング剤が、アレイ化溶液から
取り除かれる必要がある方法に対して、顕著な利点を提供する。

【００３３】核酸ポリマーが二本鎖である場合、本発明の好ましい実施態様は、両方の鎖ま
たは一方の鎖が、末端アミノ基を含むことを提供する。二本鎖核酸ポリマーを、
ＰＥＩ被覆に１つの末端アミノ基により結合させ、これにより二本鎖ポリマーを
固相化し得る。しかし、２つの鎖のうち一方のみがＰＥＩ被覆と共有結合するの
で、他方の鎖は、変性条件下および洗浄条件下で除去され得る。このアプローチ
は、一本鎖核酸ポリマーのアレイを達成する、本発明に従う１つの簡便な方法を
提供する。二本鎖核酸ポリマーは、例えば、ＰＣＲからの反応生成物として、入
手され得る。

【００３４】好ましくは、アレイ化溶液は、通常の緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム、ホ
ウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、またはＴｒｉｓＨＣｌ）を使用して緩衝化
される。アレイ化溶液の好ましいｐＨ範囲は、７〜９であり、好ましい緩衝液は
、ｐＨ８.３〜ｐＨ８.５の新鮮に調製されたホウ酸ナトリウムである。

【００３５】代表的なアレイ化溶液を調製するため、ヘキシルアミン改変した核酸ポリマー
を、０.１μｇ／ｍＬで、０.２Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８.３）中に入れて、５０μｌの合計容量にする。次いで、１０μｌの１５ｍｇ／ｍＬの塩化シアヌル
溶液を加え、一定の攪拌で、２５℃にて１時間反応を進める。グリセロール（Ｇ
ｉｂｃｏＢｒｌ（登録商標）、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）を最終濃度
５６％まで添加する。

【００３６】（プリンティング技術）生体分子溶液は、微小製作において現在使用される多くの技術のうちの任意も
のによるＰＥＩ被覆に適用され得る。例えば、この溶液は、インクジェットプリ
ントヘッドに配置され得、そして被覆にこのようなヘッドから射出され得る。

【００３７】図２Ａは、アレイ１０のＰＥＩ層３０上に別個の制御された容量の生体分子溶
液を選択的に送達する好適な装置および方法を示す等角図である。１つの実施態
様において、この装置は、アクチュエーター６０に操作可能に接続されたスプリ
ングプローブ５０およびスプリングプローブ５０の反対の末端に接続された送達
チップ７０を有する。スプリングプローブ５０は、一般的に、バイアス部材５４
ならびにバイアス部材５４に隣接する第１の末端５７およびハウジング５２から
伸びる第２の末端５８を有するプランジャー５６を収めるハウジング５２を備え
る。ハウジング５２は、管状バレルであり得、そしてバイアス部材５４は、ハウ
ジング５２からプランジャー５６の第２の末端５８を押し出す圧縮ばねであり得
る。プランジャー５６の第１の末端５７は、ハウジング５２についてプランジャ
ー５６の最大伸長を制限するハウジング５２から半径方向に内向きに伸びる停止
５９を埋め込むショルダー５７ａを有する。適切なスプリングプローブ５０は、
ＥｖｅｒｅｔｔＣｈａｒｌｅｓ（Ｐｏｍｏｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｉ
ｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔＤｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．（ＫａｎｓａｓＣｉｔｙ
，Ｋａｎｓａｓ）、ＴｅｓｔＣｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｕｐｌａｎ
ｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および他の製造業者から入手可能である。

【００３８】アクチュエーター６０は、好ましくは、アレイ１０に垂直な軸（矢印Ｖによっ
て示される）に沿って、そしてＰＥＩ層３０の表面に平行な平面（矢印Ｐによっ
て示される）においてスプリングプローブ５０を移動させる。従って、アクチュ
エーター６０は、生体分子流体９０を含むウェル８０に送達チップ７０を浸漬す
るためにスプリングプローブ５０を制御し、ＰＥＩ層３０の所望の点上にスプリ
ングプローブ５０を配置させ、そしてＰＥＩ層３０の所望の点に対してチップ７
０を押しつける。別の実施態様において、アクチュエーター６０は、アレイ１０
に対して垂直にスプリングプローブ５０を移動させるのみであり、そして別のア
クチュエーター（示されていない）は、アレイ１０およびウェル８０を、ウェル
８０またはＰＥＩ層３０の所望の点上にチップ７０を配置するために移動する。
アクチュエーター６０は、好ましくは、生体分子溶液をＰＥＩ層３０にロボット
工学的に送達するロボットまたは他のコンピューター制御された操作デバイスで
ある。さらに、複数のスプリングプローブ５０は、複数の生体分子塊をＰＥＩ層
３０に同時に送達する単一のアクチュエーターに接続され得る。

【００３９】送達チップ７０は、好ましくは、ＰＥＩ層３０上に複数の生体分子塊を送達するに十分な容量の生体分子流体９０をその表面上に引き上げ、そして１回のピ
ックアップ工程で対応する複数の植え込み領域３２（図１Ａに示される）を形成
する。図２Ｂは、本発明の１つの実施態様に従う送達チップ７０の拡大された立
面図である。送達チップ７０は、好ましくは、遠位面７２および複数の溝または
チャネル７４を有する切断された円錐形を有する。遠位面７２は、ほぼ０．００
００１インチと０．０１０インチとの間、そしてより好ましくは、ほぼ０．００
１インチと０．００５インチとの間の距離「Ｒ」だけ、仮想の交点７３から奥ま
った平らな表面であり得る。さらに、溝７４は、ほぼ１５°と１２０°との間、
より好ましくは、６０°と９０°との間の角度αで遠位面７２に向かって収束す
る羽根または尾根７６を有する。

【００４０】スプリングプローブ５０、アクチュエーター６０、および送達チップ７０は、
アクチュエーター６０が、ＰＥＩ層３０に対して送達チップ７０を押しつけるごとに、制御された量の生体分子流体をＰＥＩ層３０に送達するためにともに作
動する。アクチュエーター６０は、毛管現象によって送達チップ７０上に十分な
容量の生体分子流体９２を引き上げそして保持するために、生体分子流体９０の
ウェル８０に送達チップ７０を最初に浸漬する（図２Ｂ）。次いで、アクチュエ
ーター６０は、ＰＥＩ層３０上にスプリングプローブ５０を配置させる。ウェル
８０からチップ７０を取り出した後、チップ７０上の生体分子流体９２の一部は
、チップの遠位面７２において流体のしずく（ｈａｎｇｉｎｇｍａｓｓ）９４
を形成する。次いで、アクチュエーターは、チップ７０上の生体分子流体の一部
から、アレイ１０の単一の別個の植え込み領域３２（図１Ａおよび１Ｂに示され
る）を形成するために、ＰＥＩ層に対してチップ７０を押しつける。アクチュエ
ーター６０は、好ましくは、チップ７０が、わずかな圧力でＰＥＩ層３０と接触
するように、ＰＥＩ層３０に対してチップ７０を押しつける。しかし、同じ圧力
でＰＥＩ層３０に対してチップ７０を一貫して押しつけることは困難である。な
ぜなら、アクチュエーター６０は、必ずしも同じ高度でチップ７０を配置すると
は限らないし、ＰＥＩ層３０の表面は、均一に平面ではないかもしれないからで
ある。従って、アクチュエーター６０のストロークまたはＰＥＩ層３０の形状の
わずかな不規則性にかかわらず、各送達について実質的に一定の圧力で、スプリ
ングプローブ５０がＰＥＩ層３０と接触することを可能にする、ＰＥＩ層３０に
対してチップ７０を押しつけることによって引き起こされるエネルギーを、バイ
アス部材５４が保存する。

【００４１】従って、上記に記載の送達システムは、チップ７０が、ＰＥＩ層３０に埋め込まれるごとに、一貫した植え込み容量の生体分子流体を送達し得る装置を提供
する。正確な一貫した容量の生体分子流体は、ＰＥＩ層３０においてスペーサー
領域３４を維持するように、各植え込み領域３２において、ＰＥＩ層３０に送達
されるべきであることが理解される。植え込み領域３２においてＰＥＩ層３０へ
植え込まれた生体分子流体の量は、一般的に、経験的に決定され、そしてそれは
、チップ７０が、ＰＥＩ層３０に埋め込まれる時間、生体分子流体９０の粘性、
チップ７０の外形、およびチップ７０とＰＥＩ層３０との間の圧力の関数である
。バイアス部材５４は、チップ７０とＰＥＩ層３０との間に実質的に一定の圧力
を提供するので、ＰＥＩ層３０に送達される生体分子流体の量に影響を及ぼす主
要な因子は、チップ７０がＰＥＩ層３０に埋め込まれる時間である。

【００４２】図３は、本発明に従う送達チップ１７０の別の実施態様の正面立面図である。
この実施態様において、送達チップ１７０は、溝または羽根なしの切形の円錐形
を有する。従って、送達チップ１７０は、チップの円錐形部の表面上に生体分子
流体を保持する。送達チップ１７０は、生体分子流体をＰＥＩ層３０に送達する
ために使用され得るが、溝を切ったチップを使用することが一般的により望まし
い。なぜなら、このようなチップは、より多くの生体分子流体を保持するからで
ある。

【００４３】図４Ａは、複数の溝１７４および羽根１７６を有するさらに別の実施態様の送
達チップ２７０の正面立面図であり、図４Ｂは、このチップの底面図である。送
達チップ２７０は、上記のチップ７０と実質的に同じ様式で作動するため、これ
はまた、実質的に同じ利点を提供する。

【００４４】上記の送達チップ７０、１７０、および２７０は、生体分子流体をＰＥＩ層３
０に植え込むために使用され得る送達チップのわずかな例を表す。異なる形状お
よび遠位面の設計を使用することを含む、いくつかのチップの改変がなされ得る
ことは明らかである。例えば、チップは、特定の適用に依存して、錐体、円筒、
立方体、または他の適切な形状を有する。さらに、溝は、これらの図において示
される溝以外の外形を有し得る。従って、送達チップは、必ずしも図２Ｂ〜４Ｂ
において図示されるチップに限られるわけではない。

【００４５】（アレイ化条件およびアレイ化後の処理）上記に記載のアレイ化溶液は、アレイ化プロセスにおいて直接使用され得る。
すなわち、核酸ポリマーをアレイ化するための好ましい実施態様において、活性
化された核酸ポリマーは、プリンティング工程の前に未反応の塩化シアヌルから
精製されない。驚くべきことに、このアレイ化方法においては、プリンティング
の前に過剰な架橋剤を除去する必要はないことが発見された。すなわち、反応混
合物における過剰の塩化シアヌルは、ＰＥＩを被覆した固体支持体に対する核酸
ポリマーの共有結合を妨げないか、またはこれと競合しない。これは、任意の所
定の容量（ナノリトットル〜ピコリットル）でアレイ化される塩化シアヌル分子
の数より過剰なアミン基が固体支持体上に存在するからである。

【００４６】代表的には、固体支持体に活性化された核酸を結合させる反応を、２０〜５０
℃で１〜２０時間にわたって進行させる。好ましくは、反応時間は、２５℃で１
時間である。

【００４７】本発明のアレイは、ハイブリダイゼーションアッセイを実施するにおいて特に
有用である。しかし、このようなアッセイを行うために、固体支持体上のアミン
は、ハイブリダイゼーション工程を行う前にキャップされなければならない。こ
れは、０．１〜２．０Ｍの無水コハク酸と固体支持体を反応させることによって
達成され得る。好ましい反応条件は、７０％ｍ−ピロールおよび０．１Ｍホウ酸
ナトリウム中の１．０Ｍの無水コハク酸である。反応を、代表的には、２５℃で
１５分〜４時間（好ましい反応時間は３０分間である）にわたって生じさせる。
残りの無水コハク酸は、３回の水洗で除去される。

【００４８】次いで、固体支持体は、ｐＨ７〜９の０．１〜１０．０Ｍのホウ酸ナトリウム
中の０．１〜５Ｍのグリシンを含む溶液でインキュベートされる。この工程は、
モノクロロトリアジンへの変換によってＰＥＩ表面に共有結合され得る任意のジ
クロロトリアジンを「キャップ」する。好ましい条件は、ｐＨ８．３の０．１Ｍ
ホウ酸ナトリウム中の０．２Ｍグリシンである。次いで、固体支持体は、未結合
の物質（例えば、微量のＮＭＰ）を除去するために、界面活性剤を含む溶液で洗
浄され得る。好ましくは、固体支持体は、０．０１ＭのＮａＣｌ、０．０５Ｍの
ＥＤＴＡ、および０．１ＭのＴｒｉｓｐＨ８．０中で５分間９５℃に加熱され
る。この加熱工程は、ＰＣＲ産物のような非共有結合した核酸ポリマーを除去す
る。二本鎖核酸がアレイ化される場合において、この工程はまた、２本鎖を１本
鎖形態に変換する効果を有する（変性）。

【００４９】アレイは、ビオチン化されたプローブ（例えば、オリゴヌクレオチド、核酸フ
ラグメント、ＰＣＲ産物など）によってインターロゲーションされ得る。核酸を
ビオチン化するための方法は、当該分野で周知であり、そしてＰｉｅｒｃｅ（Ａ
ｖｉｄｉｎ−ＢｉｏｔｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＡＨａｎｄｂｏｏｋ，Ｐｉ
ｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ，１９９２，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ
Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）によって適切に記載される。プローブは、一般的に、ＧｕＳ
ＣＮ、ＧｕＨＣｌ、ホルムアミドなどを含む標準的なハイブリダイゼーション溶
液中０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌで使用される（ＶａｎＮｅｓｓおよび
Ｃｈｅｎ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：５１４３−５１５１、
１９９１を参照のこと）。

【００５０】ハイブリダイゼーション事象（すなわち、ビオチンの存在）を検出するために
、固体支持体は、ストレプトアビジン／セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合体
とともにインキュベートされる。このような酵素結合体は、例えば、Ｖｅｃｔｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｃａ）から市販されて
いる。ストレプトアビジンは、ハイブリダイズしたプローブの近傍にセイヨウワ
サビペルオキシダーゼを有するビオチン分子に高い親和性で結合する。未結合の
ストレプトアビジン／セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合体は、簡単な洗浄工
程において洗い流される。次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼ酵素の存在
を、ペルオキシドおよび適切な緩衝液の存在下で沈澱する基質を使用して検出す
る。

【００５１】ウエハのような反射する表面上に析出した青色の酵素産物は、比色基質につい
て予測されたレベルと比較して何倍も低い検出レベル（ＬＬＤ）を有する。さら
に、ＬＬＤは、異なる呈色酵素産物に関して非常に異なる。実施例５に示される
ように、５０μｍの直径のスポットあたりの４−メトキシ−ナフトール（沈澱し
た青色産物を産生する）についてのＬＬＤは、約１０００分子であるが、その一
方で、赤色沈澱基質は、５０μｍ直径のスポットあたり１，０００，０００分子
で約１０００倍高いＬＬＤを与える。ＬＬＤは、可視光源およびＣＣＤカメラ（
ＰｒｉｎｃｅｔｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）を
備えた顕微鏡（例えば、Ｚｅｉｓｓから市販されるＡｘｉｏｔｅｃｈ顕微鏡）を
用いて表面をインターロゲーションすることによって決定される。約１０，００
０μｍ×１０，０００μｍの画像が一度に走査され得る。

【００５２】青色比色検出スキームを使用するために、表面は、酵素反応後に非常にクリー
ンでなければならず、そしてウエハまたはスライドは、乾燥状態で走査されなけ
ればならない。さらに、酵素反応は、参照スポットの飽和前に停止されなければ
ならない。セイヨウワサビペルオキシダーゼについて、これは、約２〜５分であ
る。

【００５３】アルカリホスファターゼもしくはセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
についての化学発光基質、またはＨＲＰもしくはアルカリホスファターゼについ
ての蛍光基質を使用することもまた可能である。例としては、ＰｅｒｋｉｎＥ
ｌｍｅｒから入手可能なアルカリホスファターゼについての二酸化物（ｄｉｏｘ
）基質またはＪＢＬＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＳａｎＬｕｉｓＯｂｉｓｐｏ
，ＣＡ）からのＡｔｔｏｐｈｏｓＨＲＰ基質が挙げられる。

【００５４】（生体分子流体のロボット工学的送達）本発明は、固体支持体上に生体分子を堆積させるための方法を提供し、この方
法は、以下の工程を包含する：スプリングプローブのチップを生体分子の溶液に
浸漬する工程；チップを溶液から取り出して、チップに付着した生体分子溶液を
提供する工程；および生体分子溶液と固体支持体とを接触させ、これによって固
体支持体にチップから生体分子溶液を移動させる工程。好ましい実施態様におい
て、チップを接触させる工程は、ロボット工学的に達成され得る。換言すると、
正確なロボット工学的システムは、ｘ軸、ｙ軸、およびｚ軸において制御され得
る。正確なデカルト座標系ロボットシステムは、適切なモーターを連結した線形
位置決めテーブル、増幅器、動作コントローラー、パーソナルコンピューター、
および線形位置決めテーブルを駆動させるためのソフトウェアから構成される。
正確な線形位置決めテーブルは、ＰａｒｋｅｒＨａｎｎｉｆｉｎＣｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ（ＤａｅｄｅｌＤｉｖｉｓｉｏｎ，ＨａｒｒｉｓｏｎＣｉｔｙ
，ＰＡ）またはＴＨＫＣｏｍｐａｎｙ，ＬＴＤ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）
から入手可能である。モーター、増幅器、および動作コントローラーは、ＰａｒｋｅｒＨａｎｎｉｆｉｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＤａｅｄｅｌＤｉｖ
ｉｓｉｏｎ，ＨａｒｒｉｓｏｎＣｉｔｙ，ＰＡ）またはＧａｌｉｌＭｏｒｔ
ｉｏｎＣｏｎｔｒｏｌ，Ｉｎｃ．（ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）から
入手可能である。ソフトウェアは、特注である可能性が最も高く、そしてＢｏｒ
ｌａｎｄＣ＋＋４．５（ＢｏｒｌａｎｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｎ
ｃ．，ＳｃｏｔｔｓＶａｌｌｅｙ，ＣＡ）またはＶｉｓｕａｌＢａｓｉｃ
４．０（ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ
）のような言語において書かれ得る。パーソナルコンピューターは、Ｄｅｌｌ
ＣｏｍｐｕｔｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）のような多
くの製造業者から入手可能である。

【００５５】上記のスプリングプローブは、いくつかの様式のレセプタクルのいずれにも取
り付けられるように製造される。そして本発明において有用なロボットは、スプ
リングプローブを受容するために、適切なサイズのレセプタクルを備える。好ま
しいレセプタクルは、ニッケル−銀または青銅から作製され、次いで、硬質のニ
ッケル上を金メッキされる。好ましいレセプタクルのための設計は、直径１．５
ｍｍ〜２．０ｍｍ、より好ましくは直径１．６８ｍｍを有する金属管である。０
．５ｍｍ〜１ｍｍの厚さ、より好ましくは、０．６４ｍｍの厚さの角ワイヤが、
その管の一方の末端に圧着され、そしてシールされる。各レセプタクルは、安全
にスプリングプローブを保持するために刻み目（ｉｎｄｅｎｔ）および圧力リン
グを用いて製造される。プローブは、プローブのバレルがレセプタクル末端と同
一面であるようにレセプタクル中に挿入される。

【００５６】取り付けヘッドは、流体をアレイ化する目的のためにロボットに取り付けられ
る。ヘッドは、種々のプリンティング適用に互換であるバーを有する。バーは、
２つの螺子を取り外すこと、および、例えば、９６ウェルプレートからアレイ化
するために設計されたあるバーを、３８４ウェルプレートからアレイ化するため
に設計されたスプリングプローブを保持するように設計されたバーで置きかえる
ことによって容易に交換され得る。レセプタクルは、正確に穿孔された二種の深
さの孔を、レセプタクルのワイヤラップおよび圧着した領域をぴったりと適合さ
せるために使用して、摩擦によってバーに保持される。この設計は、損傷したか
またはあまり性能が良くないレセプタクルおよび／またはスプリングプローブの
容易な置換を可能にする。一旦挿入されると、レセプタクル／スプリングプロー
ブユニットは、バーから２５ｍｍの距離下に伸長するため、プローブを、アレイ
化されるサンプル流体を有するマイクロタイタープレートの底に到達させること
が可能である。

【００５７】（アレイ）本発明の生体分子アレイは、表面を備える固体基板を含む。ここで、この表面
は、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）の層で少なくとも部分的に覆われている
。ＰＥＩ層は、連続する第２の領域によって隣接しかつ囲まれた複数の別個の第
１の領域を有する。第１の領域は、生体分子およびＰＥＩの存在によって規定さ
れるが、第２の領域は、ＰＥＩの存在および生体分子の実質的な非存在によって
規定される。好ましくは、基板は、ガラスプレートまたはシリコンウエハである
。しかし、基板は、上記のように、例えば、石英、金、ナイロン−６，６、ナイ
ロンまたはポリスチレン、ならびにそれらの複合体であり得る。

【００５８】ＰＥＩ被覆は、好ましくは、１００〜１００，０００の範囲の分子量を有する
ＰＥＩを含む。二官能性カップリング剤の反応産物は、基板表面とＰＥＩ被覆と
の間に析出し得、ここで、反応産物は、表面およびＰＥＩ被覆の両方に共有結合
し、そして表面のＰＥＩ被覆を確実にする。二官能性カップリング剤は、第１お
よび第２の反応性官能基を含み、ここで、第１の反応性官能基は、例えば、トリ
（Ｏ−Ｃ₁−Ｃ₅アルキル）シランであり、そして第２の反応性官能基は、例えば
、エポキシド、イソシアネート、イソチオシアネート、および無水基である。好
ましい二官能性カップリング剤としては、２−（３，４−エポキシシクロヘキシ
ル）エチルトリメトキシシラン；３，４−エポキシブチルトリメトキシシラン；
３−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン；３−（トリエトキシシリル）−
２−メチルプロピルコハク酸無水物および３−（２，３−エポキシプロポキシ）
プロピルトリメトキシシランが挙げられる。

【００５９】本発明のアレイは、各領域が、約１，０００平方ミクロン〜約１００，０００
平方ミクロンの範囲内にある、第１の生体分子含有領域を含む。好ましい実施態
様において、第１の領域は、約５，０００平方ミクロン〜約２５，０００平方ミ
クロンの範囲であるエリアを有する。

【００６０】第１の領域は、好ましくは実質的に円形であり、ここで、この円は、約１０ミ
クロン〜約２００ミクロンの平均直径を有する。円形であろうとなかろうと、第
１の領域の境界は、好ましくは、少なくとも約２５ミクロンであるが約１ｃｍ以
下（そして好ましくは約１，０００ミクロン以下）の平均距離だけ（第２の領域
より）互いに離れている。好ましいアレイにおいて、隣接する第１の領域の境界
は、約２５ミクロン〜１００ミクロンの平均距離だけ離れており、ここで、この
距離は、好ましくはアレイ全体を通じて一定であり、第１の領域は、好ましくは
、本明細書に添付された図面において示されるように、反復幾何学的パターンに
配置される。好ましい反復幾何学的パターンにおいて、全ての隣接する第１の領
域は、ほぼ同じ距離（約２５ミクロン〜約１００ミクロン）だけ離れている。

【００６１】好ましいアレイにおいて、基板上には１０〜５０の第１の領域が存在する。別
の実施態様において、基板上には５０〜４００の第１の領域が存在する。さらに
別の実施態様において、基板上には４００〜８００の第１の領域が存在する。

【００６２】第１の領域に配置される生体分子は、好ましくは、核酸ポリマーである。好ま
しい核酸ポリマーは、約１５〜約５０のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチ
ドである。生体分子は、約５０〜約１，０００のヌクレオチドを有する増幅反応
産物であり得る。

【００６３】第１の領域の各々において、生体分子は、好ましくは、第１の領域の２，００
０平方ミクロンにつき、１０⁵〜１０⁹生体分子の範囲の平均濃度で存在する。よ
り好ましくは、生体分子の平均濃度は、２，０００平方ミクロンにつき、１０⁷ 〜１０⁹生体分子の範囲である。第２の領域において、生体分子は、好ましくは、上記の第２の領域の２，０００平方ミクロンにつき、１０³未満の生体分子の平均濃度で存在し、そしてより好ましくは、２，０００平方ミクロンにつき、１
０²未満の生体分子の平均濃度で存在する。最も好ましくは、第２の領域は、生体分子を全く含まない。

【００６４】本発明は、多くのバイオテクノロジー適用（具体的には、ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）、核酸ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションによる核
酸配列決定、ウイルス、細菌または細胞ライブラリーの複製を利用する大規模診
断スクリーニング方法を開発することに関する方法、ならびに固体表面上に溶液
を反復アレイ化することを包含する任意の他の方法）のために優れた有用性を有
する。

【００６５】本発明の生体分子アレイは、切断可能タグと共有結合されたオリゴヌクレオチ
ドのようなタグ化生体分子によりプローブされる。これらのタグ化生体分子は、
特にオリゴヌクレオチド配列決定および遺伝子発現アッセイのようなアッセイ手
順において使用され得る。これらに使用され得る例示的なタグ化生体分子および
アッセイは、米国特許出願第０８／７８６，８３５号；同第０８／７８６，８３
４号および同第０８／７８７，５２１号（いずれも１９９７年１月２２日出願）
において、ならびに出願番号第０８／８９８，１８０号；同第０８／８９８，５
６４号；および同第０８／８９８，５０１号を有する３件の米国の一部継続出願
（いずれも１９９７年１月２２日出願）において；ならびにＰＣＴ国際公開番号
ＷＯ９７／２７３３１；ＷＯ９７／２７３２５；およびＷＯ９７／２７３２７に
おいて記載される。これら６件の米国特許出願および３件のＰＣＴ国際公開は、
それぞれ、本明細書においてそれらの全体が参考として十分に援用される。

【００６６】さらに、本発明の生体分子アレイは、１つより多いオリゴヌクレオチド配列を
エレメント内部（すなわち、図１の言葉でいう「第１の領域」）に含み得る。１
つより多いオリゴヌクレオチド配列をエレメント内部に含む生体分子アレイおよ
びその使用は、「アレイエレメント内部の多様な機能性およびその使用」と題さ
れた米国仮特許出願第６０／０５３，４３６号（１９９７年７月２２日出願）お
よび同様に題された米国非仮特許出願第号（本出願と同時に出願）（この両者
は、本明細書中でそれらの全体が参考として十分に援用される）に記載される。

【００６７】本発明の生体分子アレイはまた、本発明者らの「核酸アレイ上で実施される増
幅および他の酵素反応」と題された米国仮特許出願第６０／０５３，４２８号（
１９９７年７月２２日出願）および同様に題された米国非仮特許出願第号（こ
れは本出願と同時に出願されている）（これらの両者は、本明細書中でそれらの
全体が参考として十分に援用される）に記載されるように、増幅および他の酵素
反応の実施において使用され得る。

【００６８】本発明の生体分子アレイは、「固体支持体上に溶体をアレイ化するための装置
および方法」と題された米国仮特許出願第６０／０５３，４３５号（１９９７年
７月２２日出願）および同様に題された米国非仮特許出願第号（これは本出願
と同時に出願されている）（これらの両者は、本明細書中でそれらの全体が、参
考として十分に援用される）に開示される技術に従って調製され得る。

【００６９】「データを相関付けるためのコンピューターの方法およびシステム」と題され
た米国仮特許出願第６０／０５３，４２９号（１９９７年７月２２日出願）およ
び同様に題された米国非仮特許出願第号（これは本出願と同時に出願されてい
る）（両者は、本明細書中でそれらの全体が参考として十分に援用される）に記
載されるように、データを相関付けるためのコンピューターシステムおよび方法
は、本明細書に記載されるように生体分子アレイとともに使用され得る。

【００７０】以下の実施例は、例示の目的のために提供されるものであり、制限するもので
はない。

【００７１】

【実施例】

（実施例１ＰＥＩ被覆化ガラススライドの調製のための１工程プロセス）
ガラススライドを０．１Ｎ酢酸で洗浄し、次いでスライドからリンスされた
水のｐＨがスライドをリンスするために使用される水のｐＨと等しくなるまで水
でリンスする。次いでスライドを乾燥させる。

【００７２】９５：５のエタノール：水の溶液に、十分量の２−プロパノール中のトリメト
キシシリルプロピル−ポリエチレンイミン（６００ＭＷ）の５０％ｗ／ｗ溶液
（Ｇｅｌｅｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｌｌｙｔｏｗｎ，ＰＡ，ＣａｔａｌｏｇＮｏ
.ＳＳＰ０６０）を加えて、２％Ｗ／Ｗの最終濃度にする。この２％溶液を５分間攪拌した後、ガラススライドを溶液中に浸漬させ、２分間穏やかにかき混ぜ
、次いで、取り出す。ガラススライドを過剰のシリル化剤を洗い落とすためにエ
タノールに浸漬する。次いでガラススライドを風乾させる。

【００７３】（実施例２ＰＥＩ被覆化シリコンウエハの調製のための１工程プロセス）
シリコンウエハ（ＷａｆｅｒＮｅｔ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）を０．１Ｎ
酢酸で洗浄し、次いでウエハからリンスされた水のｐＨがウエハをリンスするた
めに使用される水のｐＨと等しくなるまで水でリンスする。次いでウエハを乾燥
させる。

【００７４】９５：５のエタノール：水の溶液に、十分量の２−プロパノール中のトリメト
キシシリルプロピル−ポリエチレンイミン（６００ＭＷ）の５０％ｗ／ｗ溶液
（Ｇｅｌｅｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｌｌｙｔｏｗｎ，ＰＡ，ＣａｔａｌｏｇＮｏ
.ＳＳＰ０６０）を加えて、２％Ｗ／Ｗの最終濃度にする。この２％溶液を５分間攪拌した後、シリコンウエハを溶液中に浸漬させ、２分間穏やかにかき混ぜ
、次いで、取り出す。シリコンウエハを過剰のシリル化剤を洗い落とすためにエ
タノールに浸漬する。次いでシリコンウエハを風乾させる。

【００７５】（実施例３ＰＥＩ被覆化ガラススライドの調製のための２段階プロセス）
ガラススライドを０．１Ｎ酢酸で洗浄し、次いでスライドからリンスされた水
のｐＨがスライドをリンスするために使用される水のｐＨと等しくなるまで水で
リンスする。次いでスライドを乾燥させる。

【００７６】９５：５のエタノール：水の溶液に、十分量の求電子性シリル化剤を２％Ｗ／
Ｗの最終濃度になるまで攪拌しながら加える。求電子性シリル化剤は、２−（３
，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ，Ｉ
ｎｃ．，ＣａｔａｌｏｇＮｏ．ＳＩＥ４６７０．０）、３，４−エポキシブチ
ルトリメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ，Ｉｎｃ．，ＣａｔａｌｏｇＮｏ．ＳＩ
Ｅ４６６５．０）または３−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン（Ｇｅｌ
ｅｓｔ，Ｉｎｃ．，ＣａｔａｌｏｇＮｏ．ＳＩＩ６４５４．０）の中の１つで
ある。この２％溶液を５分間攪拌した後、ガラススライドをこの溶液に浸漬させ
、２分間穏やかにかき混ぜ、次いで取り出す。ガラススライドを過剰のシリル化
剤を洗い落とすためにエタノールに浸漬する。

【００７７】７０，０００分子量のポリ（エチレンイミン）の３％（ｗ／ｖ）溶液を、１−
メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）を含むポリ（エチレンイミン）（Ｐｏｌｙｓ
ｃｉｅｎｃｅ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）の３０％水溶液を希釈することに
より調製する。処理したガラススライドを、この３％溶液に浸漬させ、そして２
４時間穏やかにかき混ぜる。過剰のＰＥＩをスライドから除去するために、ガラ
ススライドをＮＭＰに（２回）浸漬させ、引き続き０．０９ＭＮａＣｌ、５０
ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．６および２５ｍＭＥＤＴＡも含む０．１％ドデシル
硫酸ナトリウム水溶液に（２回）浸漬させ、次いで水中に（２回）浸漬させ、そ
して最後にエタノールに（１回）浸漬させる。次いでガラススライドを風乾させ
る。

【００７８】（実施例４ＰＥＩ-被覆化シリコンウエハの調製のための２段階プロセス）シリコンウエハ（ＷａｆｅｒＮｅｔ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）を実施例３に
記載されるように０．１Ｎ酢酸で洗浄し、また実施例３に記載されるように引き
続きシリル化剤およびＰＥＩで処理する。

【００７９】（実施例５市販のスプリングプローブからのアレイチップの調製）ＸＰ５４Ｐスプリングプローブを、Ｏｓｂｙ−Ｂａｒｔｏｎ（ＥｖｅｒｅｔｔＣｈａｒｌｅｓ（Ｐｏｍｏｎａ，ＣＡ）の一部門）から購入した。プローブは
、極細目のダイアモンド砥石（ＤＭＴＩｎｃ．，ＭｉａｍｉＬａｔｔｅｒｓ
，ＦＬ）に対して「先端を下に（ｔｉｐ−ｄｏｗｎ）」して、そして穏やかな圧
力で約０．５ｃｍほどの距離で石全体を動かす。その結果、およそ０．００５イ
ンチ（０．００１〜０．０１インチ）の金属を顕微鏡により観察しながらチップ
の末端から取り外す。次いで、このチップの末端を、皮片を交差させてチップを
擦ることにより研磨した。次いでチップを水で洗浄した。最初の使用の前、また
は使用の合間に、チップを乾燥させて保管するか、または−２０℃で５０％グリ
セロール中に保管する。

【００８０】（実施例６改変型スプリングプローブを有するアレイ化デバイスの構築）
実施例５で調整されるようなチップを、ｘ軸、ｙ軸およびｚ軸に制御され得る
精密なロボットシステムに取り付けたアレイ化ヘッドに取り付けた。精密なデカ
ルト座標系のロボットシステムは、適切なモーターを連結した線形位置決めテー
ブル、増幅器、動作コントローラー、パーソナルコンピューター、およびテーブ
ルを駆動させるためのソフトウェアから構成される。精密な線形位置決めテーブ
ルは、ＰａｒｋｅｒＨａｎｎｉｆｉｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｄａｅｄｅ
ｌＤｉｖｉｓｉｏｎ、ＨａｒｒｉｓｏｎＣｉｔｙ、ＰＡ）またはＴＨＫＣ
ｏｍｐａｎｙ. Ｌｔｄ.（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から入手可能である。モー
ター、増幅器、および動作コントローラーは、ＰａｒｋｅｒＨａｎｎｉｆｉｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＤａｅｄｅｌＤｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｒｒｉｓｏ
ｎＣｉｔｙ，ＰＡ）またはＧａｌｉｌＭｏｔｉｏｎＣｏｎｔｒｏｌ，Ｉｎ
ｃ.（ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）から入手可能である。

【００８１】（実施例７流体ピックアップ、流体移動および微量液滴析出を促進するた
めの親水性表面の使用）実施例５によるスプリングプローブの先端を、１００ｍＭ１，４−ジチオス
レイトールおよび０．１Ｍホウ酸ナトリウムの溶液中に６０分間浸漬させる。ジ
チオスレイトールは、金表面とチオール−金配位を介して反応し、金親水性の表
面を形成する（この表面は実質的にヒドロキシル化されている）。

【００８２】（実施例８反応性オリゴヌクレオチドの調製）７５μｌの５’−ヘキシルアミン−ＧＴＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧ
ＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧ−３’（０．５μｇ／μｌ）溶液を、５μｌの２０ｍｇ
／ｍｌ塩化シアヌルおよび２０μｌの１Ｍホウ酸ナトリウムと３０分間室温で反
応させた。

【００８３】（実施例９オリゴヌクレオチドのアレイ化溶液）１２．５μｌの（新たに調製されるかまたは−２０℃での保管物から解凍され
た）１Ｍホウ酸ナトリウムｐＨ８．３、５０μｌの０．１μｇ／μＬ５’ヘ
キシルアミンオリゴヌクレオチド（５’ヘキシルアミン−ＧＴＣＡＴＡＣＴＣＣ
ＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧ−３’）、７．５μｌのアセトニト
リル中の１５ｍｇ／ｍＬ塩化シアヌルから構成されるアレイ化溶液を調製した
。この混合物は、室温で３０〜６０分間インキュベートさせた。次いで、１５５
μｌの８０％グリセロールを溶液に添加し、そして得られた溶液をよく混合させ
た。幾つかの場合において、１５μｌの１０％ＮＰ−４０または１０％Ｔｗ
ｅｅｎ−２０または１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＲｏｈｍａｎｄＨ
ａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を溶液に添加する。アレイ化する基
板がナイロンまたはニトロセルロース膜で構成される場合は、２５μｌの５Ｍ
ＮａＣｌをアレイ化溶液に添加する。

【００８４】（実施例１０ＰＣＲアンプリコンのアレイ化溶液）ＰＣＲアンプリコンがアレイ化されるべきである場合、２．５μＬの（新たに
調製されるかまたは−２０℃での保管物から解凍された）１Ｍホウ酸ナトリウ
ムｐＨ８．３、５０μｌの０．１μｇ／μＬ５’ヘキシルアミンオリゴヌク
レオチド（５’ヘキシルアミン−ＧＴＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴ
ＣＣＡＣＡＴＣＴＧ−３’）、７．５μＬのアセトニトリル中の１５ｍｇ／ｍＬ塩化シアヌルを、温度サイクル工程が完了した後にＰＣＲ内容物を含むＰＣＲ
チューブに添加する。この混合物を室温で３０〜６０分間室温でインキュベート
させる。次いで１５５μＬの８０％グリセロールを溶液に添加し、そして得られ
た溶液をよく混合させる。いくつかの場合では、１５μＬの１０％ＮＰ−４０、または１０％Ｔｗｅｅｎ２０、または１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を溶液に添加する。アレイ化する基板がナイロンまたはニトロセルロース膜から構
成される場合には、２５μＬの５ＭＮａＣｌをアレイ化溶液に添加する。

【００８５】（実施例１１アレイ化オリゴヌクレオチドの調整）実施例５の改変型スプリングプローブを、実施例６によるロボット送達デバイ
スに配置し、そしてスプリングプローブチップを実施例７に従って調整する。こ
のチップを実施例９のアレイ化溶液中に２分間、５ミリメートル沈める。次いで
、この溶液をつけたチップを、ロボットにより、実施例２、４のいずれかに従う
か、またはＣｅｌｌＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）
など（彼らは契約してＰＥＩ被覆化基板を調製する）により提供されるように調
製されるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）被覆化シリコンウエハ上の１２×６のグ
リッド中に７２個のマイクロスポットをプリントするために使用する。生成され
たスポットは、直径が約１００〜１５０ミクロンであり、近接するスポットの中
心間が２００ミクロンであった。

【００８６】（実施例１２活性ＰＥＩ部位のブロッキング）実施例１１のアレイを、アレイ上の未反応のＰＥＩ部位をブロックするために
、１００％ＮＭＰ中の１００ｍｇ／ｍＬ無水コハク酸で１５分間処理する。
次いでこれを水洗する（３回）。

【００８７】（実施例１３未反応塩化シアヌル部位のブロッキング）実施例１２のアレイを、アレイ上の未反応塩化シアヌルをブロックするために
、０．０１ＭＴｒｉｓ中の０．１Ｍグリシンで１５分間処理し、次いで、Ｔ
ｅｎｓ（０．１ＭＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、０．０１ＭＴｒｉｓ、５ｍ
ＭＥＤＴＡ）で４回洗浄する。

【００８８】（実施例１４ハイブリダイゼーションのプロセス）実施例１３のアレイに固定されたオリゴヌクレオチドを、それらのビオチン化
相補物（５’−ビオチン−ＴＧＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＡＴＧ
−３’）と、２０分間、３７℃でハイブリダイズさせ、６×Ｔｅｎｓ、２×ＯＨ
Ｓ（０．０６ＭＴｒｉｓ、２ｍＭＥＤＴＡ）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶
液、６×ＳＳＣ（３ＭＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
）、３．６８ｍＭＮ−ラウロイルサルコシン、０．００５％ＮＰ−４０で洗
浄した。

【００８９】ハイブリダイゼーション後、ウエハを、０．５μｇ／ｍｌのアルカリホスホタ
ーゼストレプトアビジンを１５分間浸漬させ、２×Ｔｅｎｓ，４×ＴＷＳ（０．
１ＭＮａＣｌ、0.１％Ｔｗｅｅｅｎ２０、０．０５ＭＴｒｉｓ）を用いて
洗浄した。次いで、マイクロスポットを、ＶｅｃｔｏｒＢｌｕｅ（Ｖｅｃｔｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
）を使用して（キットのプロトコルに従って）発色させ、そしてＣＣＤカメラお
よび顕微鏡を使用して画像化した。図５は作成された画像を表示する。

【００９０】（実施例１５単一のアレイエレメント内部の複数のオリゴ）０．５μｇ／μｌに濃縮された２つのテンプレートオリゴ（オリゴ＃１＝５’
−ヘキシルアミン−ＴＧＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＡＴＧ−３
’、オリゴ＃２＝５’−ヘキシルアミン−ＡＣＴＡＣＴＧＡＴＣＡＧＧＣＧＣＧ
ＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’）は、両方とも５μｌの２
０ｍｇ／ｍｌの塩化シアヌルおよび２０μｌの１Ｍホウ酸ナトリウムとともに
、３０分間室温で別々に反応させた（総反応容量＝１００μｌ）。これらの２つ
の反応から、５６％グリセロールおよび希釈された２つのオリゴの組み合わせ
物から構成されるアレイ化溶液を作製した（表１を参照のこと）。８個のアレイ
チップを８個のアレイ化溶液それぞれに２秒間、５ミリメートル沈めた。この溶
液をつけたチップをロボットによって、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）被覆化シ
リコンウエハ上の７２個のマイクロスポットを含む８個の１２×６のグリッド各
々の２つのセットをプリントするために使用した。各グリッドは、単一のアレイ
化溶液を表す。生成されたスポットは、直径が約１００〜１５０ミクロンで、ス
ポットの中心間の間隔は２００ミクロンであった。

【００９１】アレイ化した後、ウエハ上の未反応のＰＥＩ部位を、１００％Ｎ−メチルピ
ロリニドン中の１００ｍｇ／ｍｌ無水コハク酸で１５分間ブロッキングし、水
で３回洗浄した。この未反応の塩化シアヌル酸部位を０．０１ＭＴｒｉｓ中の
０．１Ｍグリシンで１５分間ブロッキングし、４×Ｔｅｎｓ（０．１ＭＮａ
Ｃｌ、０．１％ＳＤＳ、０．０１ＭＴｒｉｓ、５ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄し
た。次いで２つのハイブリダイゼーションを実施した。

【００９２】最初のハイブリダイゼーションにおいて、１揃いの８つのアレイ化したオリゴ
の組み合わせ物を、オリゴ＃１に相補的なビオチン化オリゴ（５’−ビオチン−
ＴＧＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＡＴＧ−３’）とハイブリダイズ
させた。第２のハイブリダイゼーションにおいて、他の揃いの８つのアレイ化し
たオリゴの組み合わせ物を、オリゴ＃２に相補的なビオチン化オリゴ（５’−ビ
オチン−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＧＡＴ
ＣＡＧＴＡＧＴ）にハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼーションを、Ｈ
ｙｂｒｉｗｅｌｌＳｅａｌｉｎｇＣｏｖｅｒｓ（ＲｅｓｅａｃｈＰｒｏｄ
ｕｃｔｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔ
Ｐｒｏｓｐｅｃｔ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）の下で、２０分間３７℃で同時に実施
し、６×Ｔｅｎｓ、２×ＯＨＳ（０．０６ＭＴｒｉｓ、２ｍＭＥＤＴＡ）、
５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、６×ＳＳＣ（３ＭＮａＣｌ、０．３Ｍクエ
ン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、３．６８ｍＭＮ−ラウロイルサルコシン、０
．００５％ＮＰ−４０で洗浄した。

【００９３】ハイブリダイゼーション後、ウエハを０．５μｌ／ｍｌ西洋ワサビペルオキ
シダーゼストレプトアビジンに１５分間浸漬させ、２×Ｔｅｎｓ、４×ＴＷＳ（
０．１ＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５ＭＴｒｉｓ）で洗
浄した。次いで、マイクロスポットを、０．４ｍｇ／ｍｌ４−メトシキ−１−
ナフトール（０．０２％過酸化水素、１２％メタノール、ＰＢＳ）を使用し
て発色させ、最後に３回水洗する。

【００９４】オリゴ＃１の相補物にハイブリダイズされた混合オリゴのセットは、最も高い
濃度のオリゴ＃１を含むグリッドについては最も強い発色強度を、そして最も低
い濃度のオリゴ＃１を含むグリッドには最も弱い発色強度を示した。しかし、オ
リゴ＃２の相補物にハイブリダイズされた混合オリゴのセットは、最も高い濃度
のオリゴ＃２を含むグリッドについては最も強い発色強度を、そして最も低い濃
度のオリゴ＃２を含むグリッドには最も弱い発色強度を示した（図６を参照のこ
と）。

【００９５】

【表１】（実施例１６エレメントサイズの一貫性の決定）５６％グリセロールおよび４４％青色食用色素で着色された水から構成さ
れるアレイ化溶液を作製した。アレイチップをアレイ化溶液に２秒間、５ミリメ
ーター沈めた。次いでグリセロールをつけたチップをロボットによって、７２個
のマイクロスポットをシリコンウエハ上の１２×６のグリッドにプリントするた
めに使用した。生成したスポットは、直径が約１００〜１５０ミクロンであり、
スポット間の中心間の間隔が２００ミクロンであった。図７は、ロボットにより
生成されたグリッドのＣＣＤカメラ画像を示す。スポットの直径の標準偏差は、
約１５％である。

【００９６】（実施例１７アレイ化プロセスにおける再現性の決定）５６％グリセロール、０．０１ＭＴｒｉｓｐＨ７．２、５ｍｍＥＤＴ
Ａ、０．０１％サルコシル、および１％Ｖ／ＶＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅＰｌａｉｎ、０．５μＭミクロスフェア（２．５％スライド−ラテックス
）、（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）から構成される
アレイ化溶液を作製した。アレイピンをこの溶液中に５秒間、５ミリメーター沈
め、次いで複数のマイクロスポットをガラススライド上にプリントするために使
用した。次いで、顕微鏡写真を、蛍光光の下で、蛍光用のフィルターを使用して
作製した。図８は、各マイクロスポット（アレイエレメント）を有する蛍光性ミ
クロスフェアの（可視化検査により決定されたように）非常に再現可能な析出物
を示す。

【００９７】（実施例１８エレメントあたりの核酸ポリマー濃度の決定）アレイ化されたオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（５’−テ
キサスレッド−ＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＡＴＧＡ
Ｃ）を、３Ｍグアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）、０．０１ＭＴｒｉ
ｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％サルコシル中でアレイとハ
イブリダイズさせた。この容積は、固体支持体をカバーするのに十分であった（
ガラススライド（１×３インチ）あたり１ｍＬ）。テキサスレッドのオリゴヌク
レオチドの濃度は、５μｇ／ｍｌであり、そして反応を室温で実施した。ハイブ
リダイゼーションを３０分間で進行させた。次いで、スライドをＴｅｎｓで（５
回）洗浄した。次いでスライドを１ｍＬの溶出緩衝液（０．００５ＭＴｒｉｓｐＨ７．６、０．０００５ＭＥＤＴＡ、０．０１％サルコシル）で覆い、
そして９５℃まで２分間加熱した。この溶液をスライドから取り除き、そして黒
色のマイクロタイタープレート内に入れた。蛍光を黒色マイクロタイタープレー
トで測定した。この溶液をインキュベーションチューブから取り出し（２００μ
ｌ）、そして黒色マイクロタイタープレート（ＤｙｎａｔｅｋＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）内に入れた。次いでプレートを、フル
オレセインについては４９５ｎｍの励起波長を使用してそして５２０ｎｍで発光
をモニターして、テキサスレッドについては５９１ｎｍの励起波長を使用して、
そして６１２ｎｍで発光をモニターして、ならびにリサミンまたはＴＡＭＲＡに
ついては５７０ｎｍの励起波長を使用して、そして５９０ｎｍで発光をモニター
して、ＦｌｕｏｒｏｓｋａｎＩＩｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＦｌｏｗＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭｃＬｅａｎ，ＶＡ）を使用して直接読み取った。溶出
されたオリゴヌクレオチドの量を、テキサスレッドオリゴヌクレオチドの比活性
（オリゴヌクレオチド１μｇあたり６．９相対蛍光単位（ｒｆｕ））で、測定さ
れた蛍光の量（３．８４ｒｆｕ）を除することにより決定した。その結果、アレ
イのエレメント１つにつき、１０⁸のオリゴヌクレオチドが存在することを決定した。

【００９８】本発明の具体的な実施態様が、例示の目的のために本明細書中に記載されてい
るが、様々な改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得るこ
とが前述より理解される。従って、本発明は添付の請求の範囲によって制限され
ることを除いて、制限されない。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】本発明の実施態様に従うアレイの模式的平面図。

【図１Ｂ】図１Ａのアレイの模式的断面図。

【図２Ａ】本発明のアレイを調整するための送達装置の等角図。

【図２Ｂ】本発明に従う送達先端の実施態様の拡大正面図。

【図３】円錐形デザインを有する別の送達先端の正面図。

【図４Ａ】本発明の別の実施態様に従う、縦溝付円錐形デザインを有する送達先端のなお
別の実施態様の正面図。

【図４Ｂ】図４Ａの送達先端の底面図。

【図５】本発明に従って調製され、そしてＶｅｃｔｏｒＢｌｕｅ（ＶｅｃｔｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）使用
して開発し、そしてＣＣＤカメラおよび顕微鏡で画像化したマイクロスポットの
アレイを示す。

【図６】２つの異なるオリゴヌクレオチド（共に単一のアレイエレメント内に存在）を
、本発明に従って、どのように同定しそして部分的に定量し得るかを示す図。

【図７】本発明の方法論を使用して、ロボットにより作製したアレイのＣＣＤカメラ画
像。ここで、ドメインは、平均直径が約１００〜１５０ミクロンであり、スポッ
ト間の中心距離が２００ミクロンである。スポット直径の標準偏差は、約１５％
である。

【図８】蛍光用フィルターを使用する蛍光下で作製された顕微鏡写真。これは、アッセ
イ溶液から送達された非ビヒクル成分（この場合、蛍光ミクロスフェア）の再現
性のある堆積（肉眼検査により決定される）を実証する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者モイニハン，クリステンアメリカ合衆国ワシントン 98105，シアトル，９ティーエイチアベニューエヌ．イー． 5026 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 CA20 HA12 HA13 4G075 AA24 AA30 AA39 AA62 AA65 BB02 BB05 BD09 BD16 FB02 FB06 FB12 4H006 AA02 AD33

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】表面を備える固体基板を含む、生体分子のアレイであって、
ここで、該表面は、少なくとも部分的に、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）の層で覆
われ；該層は、連続する第２の領域に隣接し、かつ囲まれた、複数の不連続な第１の
領域を含み；該第１の領域は、生体分子およびＰＥＩの存在により規定され；そして該第２の領域は、ＰＥＩの存在および該生体分子の実質的な不在によって規定
される、アレイ。
【請求項２】前記基板がガラスプレートである、請求項１に記載のアレイ
。
【請求項３】前記基板がシリコンウエハである、請求項１に記載のアレイ
。
【請求項４】前記基板が、ガラス、石英、シリコン、金、ナイロン−６．
６、ナイロン、およびポリスチレンからなる群より選択される物質を含む、請求
項１に記載のアレイ。
【請求項５】前記ＰＥＩが、１００から１００,０００までの範囲の分子量を有する、請求項１に記載のアレイ。
【請求項６】二官能性カップリング剤の反応生成物が、前記表面と前記Ｐ
ＥＩ被覆との間に配置され、該反応性生物は、該表面および該ＰＥＩ被覆に共有
結合している、請求項１に記載のアレイ。
【請求項７】前記二官能性カップリング剤が、第１および第２の反応性官
能基を含み、該第１の反応性官能基は、トリ（Ｏ−Ｃ₁−Ｃ₅アルキル）シランで
あり、そして該第２の反応性官能基は、エポキシド、イソシアネート、イソチオ
シアネート、および無水物からなる群より選択される、請求項６に記載のアレイ
。
【請求項８】前記二官能性カップリング剤が、２−（３，４−エポキシシ
クロヘキシル）エチルトリメトキシシラン；３，４−エポキシブチルトリメトキ
シシラン；３−イソシアネートプロピルトリエトキシシラン；３−（トリエトキ
シシリル）−２−メチルプロピル無水コハク酸、および３−（２，３−エポキシ
プロポキシ）プロピルトリメトキシシランからなる群より選択される、請求項７
に記載のアレイ。
【請求項９】前記第１の領域のそれぞれが、約１,０００ミクロン〜約１００,０００ミクロンの範囲内のエリアにより規定される、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１０】前記エリアが約５,０００ミクロンから約２５,０００ミク
ロンまでの範囲である、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１１】前記第１の領域のそれぞれが実質的に円形である、請求項
１に記載のアレイ。
【請求項１２】前記第１の領域が、約１０ミクロン〜２００ミクロンの平
均直径を有する、請求項１１に記載のアレイ。
【請求項１３】前記第１の領域が、互いに、少なくとも約２５ミクロンの
平均距離だけ離れている、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１４】隣接する前記第１の領域が、約１ｃｍを超えない平均距離
だけ離れている、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１５】隣接する前記第１の領域が、約１,０００ミクロンを超えない平均距離だけ離れている、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１６】隣接する前記第１の領域が、約２５ミクロン〜１００ミク
ロンの平均距離だけ離れている、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１７】前記第１の領域が、反復する幾何学的パターンで配置され
ている、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１８】前記第１の領域が、互いに、ほぼ等距離である、請求項１
７に記載のアレイ。
【請求項１９】前記距離が約２５ミクロン〜約１００ミクロンである、請
求項１８に記載のアレイ。
【請求項２０】前記パターンが円形の第１の領域を含み、該円形の第１の
領域は、約１００〜約１,０００ミクロンの平均直径を有する、請求項１７に記載のアレイ。
【請求項２１】１０〜５０の第１の領域を有する、請求項１に記載のアレ
イ。
【請求項２２】５０〜４００の第１の領域を有する、請求項１に記載のア
レイ。
【請求項２３】４００〜８００の第１の領域を有する、請求項１に記載の
アレイ。
【請求項２４】前記生体分子が、核酸ポリマーからなる群より選択される
、請求項１に記載のアレイ。
【請求項２５】前記生体分子が、約１５から約５０までのヌクレオチドを
有するオリゴヌクレオチドである、請求項２４に記載のアレイ。
【請求項２６】前記増幅反応生成物が、約５０から約１,０００までのヌクレオチドを有する核酸ポリマーである、請求項２４に記載のアレイ。
【請求項２７】前記生体分子が、前記第１の領域に、２,０００平方ミクロンの第１の領域あたり１０⁵生体分子から１０⁹生体分子までの範囲の平均濃度
で存在する、請求項１に記載のアレイ。
【請求項２８】前記平均濃度が、２,０００平方ミクロンあたり、１０⁷生
体分子から１０⁹生体分子までの範囲である、請求項２７に記載のアレイ。
【請求項２９】前記生体分子が、前記第２の領域に、２,０００平方ミクロンの該第２の領域あたり１０³生体分子未満の平均濃度で存在する、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３０】生体分子のアレイを調製する方法であって、表面を備える固体基板を提供する工程であって、ポリ（エチレンイミン）（Ｐ
ＥＩ）の層が、該表面の少なくとも一部を覆い、該層は、連続する第２の領域に
隣接し、かつ囲まれた、複数の不連続な第１の領域を含む、工程；および該第２の領域を、生体分子を実質的に含まないように維持しながら、該生体分
子を該第１の領域に配置する工程を包含する、方法。
【請求項３１】前記基板がガラスプレートである、請求項３０に記載の方
法。
【請求項３２】前記基板がシリコンウエハである、請求項３０に記載の方
法。
【請求項３３】前記基板が、ガラス、石英、シリコン、ナイロン、ポリス
チレン、および金からなる群より選択される物質を含む、請求項３０に記載の方
法。
【請求項３４】前記ＰＥＩが、１００から１００,０００までの範囲の分子量を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】二官能性カップリング剤の反応生成物が、前記表面と前記
ＰＥＩ被覆との間に配置され、該反応性生物は、該表面および該ＰＥＩ被覆に共
有結合している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】前記二官能性カップリング剤が、第１および第２の反応性
官能基を含み、該第１の反応性官能基は、トリ（Ｏ−Ｃ₁−Ｃ₅アルキル）シラン
であり、そして該第２の反応性官能基は、エポキシド、イソシアネート、イソシ
アナト、および無水物からなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】前記二官能性カップリング剤が、２−（３，４−エポキシ
シクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン；３，４−エポキシブチルトリメト
キシシラン；３−イソシアネートプロピルトリエトキシシラン；３−（トリエト
キシシリル）−２−メチルプロピル無水コハク酸、および３−（２，３−エポキ
シプロポキシ）プロピルトリメトキシシランからなる群より選択される、請求項
３６に記載の方法。
【請求項３８】前記第１の領域のそれぞれが、約１,０００ミクロン〜約１００,０００ミクロンの範囲内のエリアにより規定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】前記エリアが約５,０００ミクロンから約２５,０００ミク
ロンまでの範囲である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】前記第１の領域のそれぞれが実質的に円形である、請求項
３０に記載の方法。
【請求項４１】前記第１の領域が、約１０ミクロン〜２００ミクロンの平
均直径を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】前記第１の領域が、互いに、少なくとも約２５ミクロンの
平均距離だけ離れている、請求項３０に記載の方法。
【請求項４３】隣接する前記第１の領域が、約１ｃｍを超えない平均距離
だけ離れている、請求項３０に記載の方法。
【請求項４４】隣接する前記第１の領域が、約１,０００ミクロンを超えない平均距離だけ離れている、請求項３０に記載の方法。
【請求項４５】隣接する前記第１の領域が、約２５ミクロン〜１００ミク
ロンの平均距離だけ離れている、請求項３０に記載の方法。
【請求項４６】前記第１の領域が、反復する幾何学的パターンで配置され
ている、請求項３０に記載の方法。
【請求項４７】前記第１の領域が、互いに、ほぼ等距離である、請求項４
６に記載の方法。
【請求項４８】前記距離が約２５ミクロン〜約１００ミクロンである、請
求項４７に記載の方法。
【請求項４９】前記パターンが円形の第１の領域を含み、該円形の第１の
領域は、約１００〜約１,０００ミクロンの平均直径を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】１０〜５０の第１の領域を有する、請求項３０に記載の方
法。
【請求項５１】５０〜４００の第１の領域を有する、請求項３０に記載の
方法。
【請求項５２】４００〜８００の第１の領域を有する、請求項３０に記載
の方法。
【請求項５３】前記生体分子が核酸ポリマーである、請求項３０に記載の
方法。
【請求項５４】前記生体分子が、約１５から約５０までのヌクレオチドを
有するオリゴヌクレオチドである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】前記増幅反応生成物が、約５０から約１,０００までのヌクレオチドを有する核酸ポリマーである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】前記生体分子が、前記第１の領域に、２,０００平方ミクロンの第１の領域あたり１０⁵生体分子から１０⁹生体分子までの範囲の平均濃度
で提供されるように存在する、請求項３０に記載の方法。
【請求項５７】前記平均濃度が、２,０００平方ミクロンあたり、１０⁷生
体分子から１０⁹生体分子までの範囲である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】前記生体分子が、前記第２の領域に、２,０００平方ミクロンの該第２の領域あたり１０³生体分子未満の平均濃度で存在する、請求項３０に記載の方法。
【請求項５９】生体分子を配置する前記工程が、核酸ポリマーをスプリン
グプローブの先端に移すことを包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項６０】生体分子を配置する前記工程が、インクジェットプリント
ヘッドから核酸ポリマーを噴出することを包含する、請求項３０に記載の方法。