JPS6379588A

JPS6379588A - 細胞培養用基材およびその製造方法

Info

Publication number: JPS6379588A
Application number: JP61224992A
Authority: JP
Inventors: Yasuo Moriya; 守谷　保夫
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-09-25
Filing date: 1986-09-25
Publication date: 1988-04-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■５発明の背景（発明の分野）本発明は、細胞培養用基材およびその製造方法に関する
ものである。詳しく述ぺると本発明は、細胞増殖を強く
支持する細胞培養用基材およびその製造方法を提供する
ことを目的とする。

（先行技術）近年、医学、生物学の分野において、体細胞を生体内的
に（ｉｎ　ｖｉｖｏ　＞あるいは試験管内的に（ｉｎ　
ｖｉｔｒｏ＞培養することに関心がもたれている。

例えば、熱傷、採皮創および皮膚剥削創、外傷性皮唐欠
損創等の疾患ないし創傷により皮膚組織の損失、特に広
範な皮膚の損失を被った場合、患部における感染および
体液の過度の損失により直ちに生命の危険にざらされる
虞れが生じるゆえ、迅速な組織の修復が望まれるところ
である。このような患部に対する処置としては、本人の
正常な部位の皮膚をとり、自家移植することが現在最善
の策とされているが、自家移植は、常に適用可能である
とは限らず、例えば欠損部が広範にわたる場合などは非
常に困難なものとなり、適用可能である場合も一度にす
べての欠損部に移植することは不可能であり、長期間に
わたり幾度となく移植を繰返す必要がめった。このため
に自家移植に代わり患部を一時的にあるいは永続的に被
覆し、細菌感染および体液の損失を防ぎ、組繊細胞を増
殖して組織の修復を促進するための創傷被覆材の開発が
望まれている。

このような創傷部を被泣するものとしては、ガーゼ、）
悦脂綿が古くから用いられているが、これらは細菌感染
防止性が低くかつ滲出液による劣化が大きく頻繋に取り
替える必要があり、また組織の修復を促進する効果は何
ら望めないものでめった。またこれらに代るものとして
、シリコーン製ガーゼ、シリコーンゴム膜およびベロア
−状の表面描込を有するナイロン、テフロンなどの合成
繊維シート等の人工材料の被覆膜も開発されているか、
これらは、生体適合性の面で問題があり、また患部との
密着性、水蒸気透過性、ひび割れなどの点で種々の問題
を残すものであった。さらに、同種植皮、あるいは乾燥
豚皮、羊膜、異種動物からのフィブリン膜、コラーゲン
膜などの異種植皮も知られている。これらの生体由来の
被覆膜は、生体適合性の面では優れたものであるが、そ
のほとんどは免疫原性（抗原性）を有し、また細菌感染
性および滲出液による劣化の虞れの大きいものも多い。

この中で、同種植皮はすぐれた臨床効果を発揮するが、
皮１腎提供者を必要とするために入手が困難であり、ま
た、羊膜も抗原性が低下しているため比較的良好な結果
を期待できるがこれもまた材料の入手が困難でめった。

コラーゲンは、比較的入手が容易であり従来より創傷被
覆膜に限らず細胞培養系の基材としてしばしば用いらて
あり、トリプシン処理、ペプシン処理、パパイン処理な
ど【こより精製ないしは変性すると免疫原性をほとんど
示さないものになること、またコラーゲンを線維化また
は架橋させて、コラゲナーゼによる分解を抑制すること
も広く研究されている。しかしながら一方では、コラー
ゲンが細胞の伸展と増殖を濃度依存的に抑制することも
知られてあり、細胞培養用基材としてコラーゲン膜は十
分なものとは言えないものでおった。

また、近年、培養移植法あるいは培養皮吉とも言える皮
膚に近い材料の移植法が行なわれてきている。これは重
度の患者を対象として、患者の残された正常部位の皮膚
を採取して、単離した細胞を試験管内で培養を行ない、
もとの細胞の数十倍から数百倍に増殖したのち、被覆、
膜とともに患者の創傷部位に移植してやり、表皮化を形
成させ治癒を図るものでおる。この方法を臨床に応用し
た例として、ガラコら［Ｇ、Ｇ、　Ｇａ１ｌｉｃｏ　ｅ
ｔ　ａｔ、　Ｊの研究にュー　イングランド　ジャーナ
ル　オブメデイシン、第３１１巻、第７号、第４４８〜
４５１頁（１９８４年）　　［Ｎｅｗ、　Ｅｎｇ、　Ｊ
、　Ｍｅｄ、、　Ｖｏｌ、３１１．　ＮＯ，７ｐｐ４４
８−４５１　　（１９８４）　］　）がおる。この臨床
例の場合、被覆材としてガーゼを使用しているが、この
点については古典的な感さえする。

ＴＩ　、発明の目的従って、本発明は、新規な細胞培養用基材およびその）
′！造方法を提供することを目的とする。本発明はまた
、細胞増殖を強く支持する細胞培養用具材およびその製
造方法を提供することを目的とする。本発明はまた、生
体適合性が高くまた免疫原性がなく、０１傷被覆材とし
て適用された場合に細胞増殖を促進し、早１す１の肉芽
層形成ないし表皮形成、治巳促進を図ることのできる細
胞培養用基材およびその製造方法を提供することを目的
とする。

上記諸口的は、コラーゲンを含む基材に血小板由来の細
胞増殖因子を担持させてなることを特徴とする細胞＠養
用基材により達成される。

本発明はまた、コラーゲンが配向性を有する線維とされ
ているものである細胞培養用基材を示すものである。本
発明はまた、コラーゲンが架橋化されているものである
細胞培養用基材を示すものである。本発明はさらにコラ
ーゲンを含む基材は、通気性を有する支持体にコラーゲ
ンを被覆させてなるものである細胞培養用基材を示すも
のである。

本発明はまた、コラーゲンを含む基材は、実質的にコラ
ーゲンのみよりなるものである細胞培養用塞材を示すも
のである。本発明はまた、コラーゲンを含む基材は、通
気性を有する支持２層で衰打ちされているものである細
胞ｊｆ３ｆ３用基材を水基材のである。本発明はざらに
、コラーゲンを含む基材が、ゲル状、フィルム状、織布
状、不織布状、多孔質状、またはスポンジ状の形態を有
するものでおる細胞培養用基材を示すものでおる。本発
明はざらにまた支持層がポリウレタン、シリコーン、ス
チレン−ブタジエンブロック共重合体、エチレン−プロ
ピレン−ジエン三元共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリエ
ステルまたはフッ素系樹脂からなるものである細胞培養
用基材を示すものである。

本発明はざらにコラーゲンを含む基材は、孔径１〜１０
０μｍの孔を有するものである細胞培養用基材を示すも
のである。本発明はざらに細胞培養用基材の膜孔は、１
０μｍ〜１Ｑｍｍ程度のものである細胞ＰＪ養用基材を
示すものである。本発明はまた、創傷被覆材として適用
されるものである細胞培養用基材を示すものである。

上記諸口的はまた、コラーゲン溶液に平衡塩類溶液を添
加し、次に約３７℃でインキュベートし、さらにこれを
ゲル化させ、その後このゲル状物に新鮮血小板成分含有
溶液を加えてインキュベートすることを特徴とする細胞
培養用基材の製造方法により達成される。

本発明はまた、平衡塩類溶液がハンクス液でおる細胞培
養用基材の製造方法を示すものでおる。

本発明はさらに血小板成分含有溶液が血小板含有血漿で
ある細胞培養用基材の製造方法を示すもので必る。本発
明はまた、コラーゲン溶液に平衡ｊｎｎ温溶液加えた後
に均質化処理を行ない、その後約３７℃でインキュベー
トするものである細胞培養用基材の製造方法を示すもの
である。

上記諸口的はさらに、コラーゲン溶液を凍結屹燥し、得
られたコラーゲン層を架橋化処理し、次に架橋されたコ
ラーゲン層に新鮮血小板成分含有溶液を含浸させてイン
キュへ−１−することを特徴とする細胞培養用基材の製
造方法により達成される。

本発明はまた、架橋化処理が、グルタルアルデヒド、ホ
ルムアルデヒドおよびグリオキサールからなる群から選
ばれた処理剤を用いるものである細胞培養用基材の製造
方法を示すものでおる。本発明はさらにコラーゲン層が
支持層上に形成されるものである細胞培養用基材の製造
方法を示すものである。本発明はまた支持層が通気性を
有するものでおる細胞培養用基材の製造方法を示すもの
である。本発明はさらにまた、支持層か、ポリウレタン
、シリコーン、スチレン−ブタジエンブロック共重合体
、エチレン−プロピレン−ジエン三元共重合体、ポリ塩
化ビニル、ポリエステルまたはフッ素系樹脂からなるも
のである細胞培養用基材の製造方法を示すものである。

本発明はまた、コラーゲン層に含浸される新鮮血小板成
分含有溶液は、コラーゲン溶液との混合物として適用さ
れるものである細胞培養用基材の製造方法を示すもので
ある。本発明は、ざらに、新鮮血小板成分含有溶液と混
合されるコラーゲン溶液は、予め平衡塩類溶液を添加し
て３７℃でインキュベートされたものである細胞培養用
基材の製造方法を示すものである。

ＩＩｌ、発明の詳細な説明コラーゲンはを椎動物ならびに無を椎動物の結′合組械
の主要なタンパク質備成成分であって、上記したように
生体適合性が高く、十分に精製されたちのｌ、ｔ、免疫
原性をほとんど示さない。またコラーゲンは、血小板と
接触すると血小板凝集作用を起こさせることも公知であ
る。

一方、血小板中には、種々の細胞増殖因子が含まれてい
ることが公知である。このことは、一般に細胞を試験管
内的に培養する場合、正常細胞は通常のＰｉ養液のみで
は増殖せず、培谷液中に適肖量の血清を加えることが必
要でおり、さらに正常細胞に対する血清と血漿の効果を
比較した場合、細胞は血清中ではよく増殖するが血漿に
は増殖促選作用がきわめて少ないことより支持されてい
る。

またこれらの細胞増殖因子は、血小板凝集のさいに血清
中に放出されると考えられている。このような血小板由
来の細胞増殖因子は、血小板中に（かめて少量しか存在
せず、ガラスに吸打しやすい等の性質を有することから
分離同定は困難でおり、現在同定されているものとして
も、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）　、血管内皮細胞
増殖因子（ＶＥＰＦ）　、上皮成長因子（ＥＧＦ）など
ごくわずかなものである。

しかしながら、本発明者らが、コラーゲンを○む暴利に
血小板をざらして、基板表面において血小板凝集を起こ
させた際、驚くへきことに上記のごとき血小板由来の細
胞増殖因子が、容易に該基材へと担持され、このように
処理した基材を用いて各種細胞を培養した場合、血清を
用いなくとも細胞の増殖が促進されることが明らかとな
ったものである。

以下、本発明を実施態様に基づきより具体的に説明する
。

本発明の細胞培養用基材は、コラーゲンを合む基材に血
小板由来の細胞増殖因子を担持させてなることを特徴と
するものでおる。

本発明において用いられるコラーゲンとしては、種々の
動物源のコラーゲン、例えば、ウシ皮へ、ウシアキレス
オ、ウシ骨由来のコラーゲンが用いられ得、またアゾロ
コラーゲン（△Ｃ）、サクシニル化コラーゲン（ＳＡＣ
）　、メチル化コラーゲン（ＭＡＣ）およびプロタミン
等のグアニジル基を多量に含んだ物質を吸着させたコラ
ーゲンなどから適宜選択できる。

ざらにコラーゲン分子をイオン強度、ＤＨ’：９を調節
することにより、配向性をもった線維として使用でき、
さらにコラーゲンを架橋化することも可能である。この
ことは、例えば本発明の細胞培養用基材が創傷被覆材と
して用いられた場合に、コラ−ゲナーゼなどの酵素によ
る分解をおさえることができる点で有利である。配向性
をもった線維とするには、例えば、コラーゲン溶液を平
衡塩類溶液、例えばハンクス液と混合し、約３７℃てイ
ンキュベートすることによって行なわれ得る。

また架橋化するには、グルタルアルデヒド、ホルムアル
デヒド、グリオキサールなどのアルデヒド類、ヘキサメ
チレンジイソシアネート、ジフェニルメタンイソシアネ
ートなどのジイソシアネート類、カルボジイミド類およ
びアジド類等の架橋剤、好ましくはアルデヒド類、特に
好ましくはグルタルアルデヒドを用いて行なわれ得る。

本発明によるコラーゲンを含む基材は、上記のようなコ
ラーゲンのみにより実質的に形成されたコラーゲン層よ
りなるものであっても、あるいは支持体にコラーゲンを
被覆させてなるものであってもよい。ざらに細胞培養用
基材が創傷被覆材として使用される場合には、体液漏出
、細菌感染等防止の見地から、通気性を有する支持層に
コラーゲンを含む基材を裏打らさせてなるものが好まし
い。このようなコラーゲンを含む基材は、ゲル状、フィ
ルム状、織布状、不織布状、多孔質状、またはスポンジ
状の形態を有するものとされる。支持体の材質としては
、例えばナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレンおよ
びポリエステルなどが挙げられる。またこのようなコラ
ーゲンを含む基材を裏打らする支持層としては、ポリウ
レタン、シリコーン、スチレン−ブタジエンブロック共
重合体、エチレン−プロピレン−ジエン三元共重合体、
ポリ塩化ビニル、ポリエステルまたはフッ素系樹脂など
が望ましい。またコラーゲンを含む基材は、孔径１〜１
１００１−Ｉの孔を有することが望ましくはこれにより
該孔中で培養細胞が生長しそして形孔中を移動すること
を良好のものとする。このような構成を有する本発明の
細胞ＩＲ谷用基材は膜孔１０μｍ〜１Ｑｍｍ程度のもの
とされる。

本発明の細胞培養用基材においては、上記のコラーゲン
を含む基材に、血小板由来の細胞増殖因子が担持されて
いる。担持される細胞増殖因子は、コラーゲンを含む基
材に血小板が接触し凝集した際放出されたものであり、
担持された細胞増殖因子群の詳細は、十分明らかなもの
ではないが、得られた細胞培養用基材は表皮細胞、繊維
芽細胞、血管内皮細胞等の多くの正常細胞の増殖を支持
するものであった。

本発明の細胞培養用基材においては、さらに必要に応じ
てＮａ、に、Ｃａ、ＭＱ、Ｐ、Ｃ！Ｑなどの基本的無機
成分、炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミン、ホルモン
などを添加ないしは含浸させることも可能でおり、例え
ば、ダルベツコ改変ＭＥＭ培地、ＭＣＤＢ−１０４培地
などの合成培地の既知組成におけるものに準じて添加な
いしは○浸させ得る。

本発明の細胞培養用基材は、使用時まで無菌的に保存さ
れる。例えば本発明の細胞培養用基材は無菌的に１′！
造されそして予め滅菌型理を施したポリウレタン、ガラ
ス等の無毒姓の材ｖＸよりなる密封容器中に封入される
か、あるいは細胞培養用基材を密封容器中に封入した後
、滅菌処理、好ましくはγ線滅菌を行なって保存される
。

本発明の細胞培養用塞材は、コラーゲンを含む基材にお
いて血小板凝集を生起させ、この際放出される細胞増殖
因子を該基材に担持させることにより得られるもので必
って、例えば以下に示す２つの製造方法によって良好に
製造され得る。

第１の″：Ａ造方法においては、ますコラーゲン溶液に
、平衡塩類溶液、例えばハンクス液を添加する。次に、
この混合物を必要に応じて均質化処理した後、約３７℃
で５〜１００分間、好ましくは１０〜１５分間インキュ
ベートし、コラーゲンの再線維化を行ない、ざらに、こ
の混合物をゲル化させる。その後、このゲル状物に新鮮
な血小板成分含有溶液を添加して５〜１００分間、好ま
しくは３０〜６０分間インキュベートして、血小板をコ
ラーゲンと反応させコラーゲン線維上に粘合、凝集させ
る。新鮮な血小板成分含有溶液としては、培養細胞と同
種の抗凝固化全血から遠心分離によって得られる血小板
濃厚血Ｗｕ（ＰＰＰ）などの血小板含有血漿、あるいは
このような血小板含有血漿をさらにゲル濾過して得た血
小板を適当な緩衝液中に懸濁させたものなどが用いられ
得る。このようにして、血小板の凝集により放出された
細胞増殖因子をゲル状物に担持させた後、該ゲル状物を
、適当な洗浄液、例えばリン酸緩衝液を用いて十分に洗
浄することによって製品を得る。

また第２の製造方法においては、コラーゲン溶液は、最
初に凍結乾燥され製膜される。凍結乾燥条件としては、
例えばコラーゲン溶液を液体窒素中にコラーゲン溶液を
浸漬して急速に凍結した後、−１０’Ｃ〜−３０’Ｃ程
度に保持しつつ１〜３分間で１０”　Ｔｏｒｒまで脱気
することなどが挙げられる。

このようにして製膜されたコラーゲン層は、次に架橋処
理にかけられる。架橋処理は、コラーゲン層を、架橋剤
の０．０５〜２％溶液に２５〜３０℃の温度で５〜２４
時間浸潤処理することによって行なわれ得る。架橋剤と
しては、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、グリ
オギザールなどのアルデヒド類、ヘキサメチレンジイソ
シアネート、ジフェニルメタンイソシアネートなどのジ
インシアネート類、カルボジイミド類および７ジド類等
の架橋剤好ましくはアルデヒド類、特に好ましくはグル
タルアルデヒドである。架橋処理が終了した後に、］コ
ラーゲンは、未反応の架橋剤を除去するために十分に洗
浄される。このようにして得られた架橋コラーゲン層は
、必要に応じて支持層上に形成される。該支持層として
は通気性のあるものが好ましく、例えばコラーゲンを含
む木材が、フィルム状、織布状、不織布状、多孔賞状、
またはスポンジ状の形態を有するものとされる。

その材質としては、ポリウレタン、シリコーン、スチレ
ン−ブタジエンブロック共重合体、エチレン−プロピレ
ン−ジエン三元共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリエステ
ルまたはフッ素系樹脂などが用いられる。例えばポリウ
レタン製フィルム上に架橋コラーゲン層を形成しようと
する場合、塞板上に、ウレタン溶液を塗布した摂に、こ
の浸、１．’１層上に上記架橋コラーゲン層を載置し、
室温にて適当な時間放置した後加熱架橋して得ることが
できる。

架橋コラーゲン層には、次に新鮮な血小板成分含有溶液
か添加され５〜１００分間、好ましくは３０〜６０分間
インキュベートして、血小板をコラーゲンと反ｌ志させ
、架橋コラーゲン１付に血小板を粘む、凝集させる。新
鮮な血小板成分含有溶液としては、第１の製造方法にお
いて示したものと同様なものが用いられる。また、この
血小板成分○有溶液は、コラーゲン溶液との混合物とし
て適用されるものでおってもよい。このようにコラーゲ
ン溶液との混合液として適用されると、血小板凝集作用
か促進されることとなる。さらにこのコラーゲン溶液が
、予め平衡塩類溶液を添加して３７℃でインキュベート
されているものであると血小板凝集がより促進されるた
めに望ましい。おるいはまたその他の血小板凝集を促進
する物質、例えば八〇Ｐ、トロンビン、カルシウム等を
添ｈｕシて血小板凝集を促進することも可能である。こ
のようにして、血小板の凝集により放出された細胞増Ｍ
因子を架１矯コラーゲン居に担持させた後、該架橋コラ
ーゲン層を適当な洗浄液、例えばリン酸緩衝溶液を用い
て十分に洗浄することによって製品を得る。

このようにして装造され得る本発明の細胞壜台用基材は
、生体内的あるいは試験管内的な、種々の細１把培侍系
において使用され得、例えば火傷等により皮膚欠損０］
が生じた場合、創傷部における上皮細胞、繊維芽細胞の
増殖をなさせるために該患部に０１傷被覆材として適用
される。

（実施例）以下本発明を実施例によりざらに詳細に説明する。

実施例１コラーゲン溶液（高仙製、０．３％、組織培谷用）に９
倍濃縮ハンクスＭおよび蒸溜水を４℃下で３：１：５の
割合（容量）において混合した。

この混合物を１２穴プレート（テルモ（株）製、平底、
組織培侍用）のウェルに０．２ｍｌずつ加え、均質化し
たのちに、直ちに３７℃インキュベータに移して、２週
間インキュベートし、寒天状に固まらせた。

各ウェルに予め用意した、新鮮血小板含有血漿（５ｘ　
１０５／ｍｍ３　）を０．２ｄ加え、軽り震寵した。

この後の経過時間において、ウェルの上？ｕＨ中に含ま
れる血小板数を自動白球計算機（オルソ−社％、１４　
）を用いて削測し、経過時間と血小板吸着率との関係を
求め、併せて、コラーゲンゲルを走査を°重子顕微鏡を
用いて観察し血小板の粘着、凝集状態を調べた。結果を
第１表および第１図に示す。

この結果、６０分経過後、血小板の８０％がコラーゲン
との反応により粘着、凝集していることが明らかとなっ
た。

ざらに凝集により放出されたと考えられる血小板由来増
殖因子のコラーゲンゲルへの吸着を上澄液中の血小板第
４因子（ＰＦ〜４）およびβ−トロンボグロブリン（β
−ＴＧ）をマーカーとして測定した結果、大部分がコラ
ーゲンに吸着されていることが明らかとなった。結果を
第２表に示す。

比較例１〜２比較のために、コラーゲンを添加後３７℃でインキュベ
ートしなかったウェル（比較例１）、およびコラーゲン
を添加しなかったウェル（比較例２）に対して、実施例
１と同様に血小板含有血漿を添加し、血小板吸着率なら
びにＰ［−４およびβ−Ｔ　Ｇをマーカーとする血小板
由来増殖因子のゲルへの吸着の程度を測定した。結果を
第１〜２表および第１図に示す。

（以下余白）第１表血小板＠着率（％）５　分　　２０分　　６０分実施例１　　　　２９　　　５１　　　８０比較例１　
　　　２０　　　２２　　　２４比較例２　　　　１５
　　　１８　　　２０第２表反応上澄液中の濃度（ｎｏ／ｍｌ）マーカー　　　Ｏ分　　　６０分実施例１　　ＰＦ−４２０００１４０比較例１　　ＰＦ−４２０００１６１０比較例２ＰＦ−
４２０００　１７６０実施例１　β−ＴＧ　　　７４００　　５１０比較例１
　β−ＴＧ　　　７４００　　５８３０比較例２　β−
ＴＧ　　　７４００　　６８４０実施例２コラーゲン溶液（高研装、０．３％、組織培養用）を０
．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，４で一昼夜、室温下で
透析させたのち、ステンレス製バットに移して２４時間
凍結乾燥した。更に１％グルタルアルデヒド溶液に２４
時間浸漬した後、十分に水洗して目的とするコラーゲン
マトリックスを得た。

次にシリコーン剥離紙上に２０％ポリエーテル型ウレタ
ン（大日精化（株）製、レザーミン２０４５Ｒ）のテト
ラハイドロフラン／ジメチルホルムアミド混合溶液を精
密被覆用具（例えばアプリケーター）を用いて塗布し成
膜した。塗布した直後に、その湿潤層上に上記の］ラー
ゲンマトリックスをのせ、室温で１０分間敢買した後、
６０’Ｃ（少なくとも１時間、オーブンで硬化させた。

これに予め用意したラットの新鮮血小板含有血漿（５０
ｘ　１０５／ｍｍ３　）と実施例１と同様にして調ＹＪ
シたコラーゲン混合溶液（０，３％コラーゲン溶液、９
倍濃縮ハンクス液および恭溜水を４℃下で３：１：５の
割合で混合し、３７℃で２週間インキコ、ベートしたも
の）とを含浸させた。６０分経過後にこのコラーゲンマ
トリックスをリン酸緩衝溶液、Ｉ）Ｈ７，４を用いて十
分に洗浄した。

実施例３５週齢のラットの背部皮膚全層を１　ｃｍ除去し、ＤＩ
傷部を形成した。この創傷部位に対して、実施例２で得
られた細胞培薔用基材（面積１ｃ屑）を付着させ、生理
食塩水を含浸させたガーゼおよびエラスディクバンドを
当て、辺縁に抗生物質含有ワセリンを塗布して１週間後
の組織反応を調べた。

結末を第３表に示す。

比較例３〜６比較のために、以下に示す各種材料を実施例３の場合と
同様にしてラットのΩＨａ部位に適用し、１週間後の組
織反応を調べた。結果を第３表に示す。なお用いられた
被覆材は、比較例３は凍結乾燥豚皮、比較例４は、牛皮
由来のコラーゲンを酵素！２！！理して１１Ｉたアテロ
コラーゲンから調製したコラーグン不織布、比較例５は
ガーゼに抗生物質（硫酸フラジオマイシン）含有ワセリ
ンを塗イ「シたソフラチュール（商品名、ルセルラボラ
トリーズ社製）、また比較例６はホルマール化ポリビニ
ルアルコールスポンジでめった。

第３表組織応答０実施例３　　＋＋　　　　　＋　　　　＋　　　　＋＋
比較例３　　　＋　　　十＋＋＋＋＋ｕ４　　　＋＋＋　　　＋＋＋　　　　＋ｒｔ　　５　
　＋＋　　　士土十十十十ｎ　　　５　　　＋＋＋　　
　　　　　＋　　　　　　　十＋６応答は、＋・・・弱
い、十＋・・・中程度、十＋十強いの３段階に評価され
た。

第３図に示すように、比較例３においては、浸　゛出液
反応は弱く、浸潤細胞反応は中程度であったが、非常に
強い異物上細胞反応がみられ肉芽形成は少ない。比較例
４においては、浸出液反応は弱く、浸潤細胞反応は中程
度であったが、異物上細胞反応はやや強く、肉芽形成は
少ない。従って、これらの生体材料は、組織からの異種
タンパク質反応がかなり強いものと考えられる。一方、
比較例５の場合、浸出液反応、浸潤細胞反応は中程度で
あるが、繊維周辺に異物上細胞反応がひき起こされ、肉
芽反応は強く、組織をとり囲んでいる。

比較例６の場合、浸出液反応は強く、浸潤細胞反応と異
物上細胞反応は弱く、肉芽形成も少ない。

これに対して本発明の実施例６の場合、細胞増殖が促進
され毛細管をともなう肉芽、図の形成が観察された。

ＩＶ、発明の効果以上述べたように本発明は、コラーゲンを含む基材に血
小板由来の細胞増殖因子を担持させてなることを特徴と
する細胞培養用基祠であるから、生体内的および試験管
内的細胞培養に適用された際細胞増殖を強く支持するも
のであって、かつ生体適合性が高く免疫原性もないもの
でおるために、例えば創傷被覆材として適用された場合
に早期の肉芽層形成ないし表皮形成をもたらし治癒促進
を図ることのできるものとなる。また本発明の細胞培養
用基材においてコラーゲンが配向性を有する線維とされ
ているあるいはまた架橋化されているものであると、細
胞増殖因子の担持がより良好なものとなりまたコラ−ゲ
ナーゼ等の酵素による分解をおさえることが可能となる
。さらに本発明の細胞培養用基材は、通気性を有する支
持層、例えばポリウレタン、シリコーン、スチレン−ブ
タジエンブロック共重合体、エチレン−プロピレン−ジ
エン三元共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリエステルまた
はフッ素系樹脂からなる支持層で裏打ちされることもで
き、これによって例えば創傷被覆材として適用された場
合に、体液漏出、細菌感染等の発生を最小限におさえる
ことが可能である。

ざらに本発明の細胞培養用基材においてコラーゲンを含
む基材が孔径１〜１００μｍの孔を有するものとされて
いると、細胞の増殖がより良好なものとなるものである
。

本発明はまた、コラーゲン溶液に平衡塩類溶液を添加し
、次に約３７℃でインキュベートし、ざらにこれをゲル
化させ、その後このゲル状物にＹ斤鮮血小板成分含有溶
液を加えてインキュベートすることを特徴とする細胞培
養用基材の製造方法であるから、上記のごとき優れた性
能を有する細胞培養用基材を良好な血小板凝集を利用す
ることにより容易に製造することができる。この製造方
法において、平衡塩類溶液がハンクス液であり、血小板
成分含有溶液が血小板含有血漿であり、ざらにコラーゲ
ン溶液に平衡塩類溶液を加えた後に均質化処理を行なう
ものであるとより容易にかつ浸れた細胞培養用基材を提
供することができろものとなる。

本発明はさらに、コラーゲン溶液を凍結乾燥し、）７ら
れたコラーゲン層を架橋化処理し、次に架橋されたコラ
ーゲン層に新鮮血小板成分含有溶液を含浸させてインキ
ュベートすることを特徴とする細胞培養用基材の製造方
法でおるから、上記のごとき優れた性能を有する細胞培
養用基材をまた容易に製造しうるちのでおる。さらにこ
の′！Ａ造方決方法いて、架橋化処理が、グルタルアル
デヒド、ホルムアルデヒドおよびグリオキサールからな
る群から選ばれた処理剤を用いるものであり、コラーゲ
ン層に含浸される新鮮血小板成分含有溶液が、コラーゲ
ン溶液、より望ましくは予め平衡塩類溶液を添加されて
３７℃でインキュベートされたコラーゲン溶液との混合
物として適用されるものであると、より容易にかつ優れ
た細胞培養用基材を提供することができるものとなる。

ざらにこの製造方法においては、コラーゲン層を、支持
層、好ましくは通気性を有する支持層上に容易に形成す
ることが可能であり、例えばポリウレタン、シリコーン
、スチレン−ブタジエンブロック共重合体、エチレン−
プロピレン−ジエン三元共重合体、ポリ塩化ビニル、ポ
リエステルまたはフッ素系樹脂からなる支持図で裏打ち
することかできる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の細す包培養用基材の製造方法の一実
施例および比較例に係るコラーゲン層への血小板吸着率
の時間的変動を示すグラフで必る。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）コラーゲンを含む基材に血小板由来の細胞増殖因
子を担持させてなることを特徴とする細胞培養用基材。
（２）コラーゲンは、配向性を有する線維とされている
ものである特許請求の範囲第１項に記載の細胞培養用基
材。
（３）コラーゲンは、架橋化されているものである特許
請求の範囲第１項または第２項に記載の細胞培養用基材
。
（４）コラーゲンを含む基材は、通気性を有する支持体
にコラーゲンを被覆されてなるものである特許請求の範
囲第１項〜第３項のいずれかに記載の細胞培養用基材。
（５）コラーゲンを含む基材は、実質的にコラーゲンの
みよりなるものである特許請求の範囲第１項〜第３項の
いずれかに記載の細胞培養用基材。
（６）コラーゲンを含む基材は、通気性を有する支持層
で裏打ちされているものである特許請求の範囲第１項〜
第５項のいずれかに記載の細胞培養用基材。
（７）コラーゲンを含む基材が、ゲル状、フィルム状、
織布状、不織布状、多孔質状、またはスポンジ状の形態
を有するものである特許請求の範囲第１〜第６項のいず
れかに記載の細胞培養用基材。
（８）支持層は、ポリウレタン、シリコーン、スチレン
−ブタジエンブロック共重合体、エチレン−プロピレン
−ジエン三元共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリエステル
またはフッ素系樹脂からなるものである特許請求の範囲
第６項または第７項に記載の細胞培養用基材。
（９）コラーゲンを含む基材は、孔径１〜１００μｍの
孔を有するものである特許請求の範囲第１項〜第８項の
いずれかに記載の細胞培養用基材。
（１０）細胞培養用基材の膜孔は、１０μｍ〜１０ｍｍ
程度のものである特許請求の範囲第１項〜第１０項のい
ずれかに記載の細胞培養用基材。
（１１）細胞培養用基材は、創傷被覆材として適用され
るものである特許請求の範囲第１項〜第１０項のいずれ
かに記載の細胞培養用基材。
（１２）コラーゲン溶液に平衡塩類溶液を添加し、次に
約３７℃でインキュベートし、さらにこれをゲル化させ
、その後このゲル状物に新鮮血小板成分含有溶液を加え
てインキュベートすることを特徴とする細胞培養用基材
の製造方法。
（１３）平衡塩類溶液がハンクス液である特許請求の範
囲第１２項に記載の細胞培養用基材の製造方法。
（１４）血小板成分含有溶液が血小板含有血漿である特
許請求の範囲第１２項または第１３項に記載の細胞培養
用基材の製造方法。
（１５）コラーゲン溶液に平衡塩類溶液を加えた後に均
質化処理を行ない、その後約３７℃でインキュベートす
るものである特許請求の範囲第１２項〜第１４項のいず
れかに記載の細胞培養用基材の製造方法。
（１６）コラーゲン溶液を凍結乾燥し、得られたコラー
ゲン層を架橋化処理し、次に架橋されたコラーゲン層に
新鮮血小板成分含有溶液を含浸させてインキュベートす
ることを特徴とする細胞培養用基材の製造方法。
（１７）架橋化処理が、グルタルアルデヒド、ホルムア
ルデヒドおよびグリオギザールからなる群から選ばれた
処理剤を用いるものである特許請求の範囲第１６項に記
載の細胞培養用基材の製造方法。
（１８）コラーゲン層は、支持層上に形成されるもので
ある特許請求の範囲第１６項または第１７項に記載の細
胞培養用基材の製造方法。
（１９）支持層は、通気性を有するものである特許請求
の範囲第１８項に記載の細胞培養用基材の製造方法。
（２０）支持層は、ポリウレタン、シリコーン、スチレ
ン−ブタジエンブロック共重合体、エチレン−プロピレ
ン−ジエン三元共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリエステ
ルまたはフッ素系樹脂からなるものである特許請求の範
囲第１８項または第１９項に記載の細胞培養用基材の製
造方法。
（２１）コラーゲン層に含浸される新鮮血小板成分含有
溶液は、コラーゲン溶液との混合物として適用されるも
のである特許請求の範囲第１６項〜第２０項のいずれか
に記載の細胞培養用基材の製造方法。
（２２）新鮮血小板成分含有溶液と混合されるコラーゲ
ン溶液は、予め平衡塩類溶液を添加して３７℃でインキ
ュベートされたものである特許請求の範囲第２１項に記
載の細胞培養用基材の製造方法。