JPS6374484A - アリ−ル アシルアミダ−ゼの製造用ロ−ドコッカス細菌およびこれを用いるアリ−ル アシルアミダ−ゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアリール　アシルアミダーゼ酵素の製造、この
酵素を生成しうる微生物、およびアリール　アシルアミ
ダーゼ酵素に関する。

ニーに記載するアリール　アシルアミダーゼ酵素はイン
ターナショナル　ユニオン　オブ　バイオケミストリー
により規定されており（「酵素命名法（Ｅｎｚｙｍｅ　
Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）　Ｊ　１９７８＋　アカデ
ミ−出版、ニューヨーク）、これらの酵素はアニリドを
アニリンおよび脂肪酸陰イオンに加水分解する触媒作用
することが示されている。これらの酵素は酵素分類Ｅ、
Ｃ，３，５，１，１３に与えられている。

例えば、アリール　アシルアミダーゼ酵素はアセトアニ
リド、アセトアミノフェン（ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅ
ｎ）（パラセタモーノ喧ｐａｒａｃｅｔａｍｏｌ）　：
　２−−ヒドロキシ　アセトアニリドおよびツェナセチ
ン（上−エトキシアセトアニリド）を加水分解でき、こ
の結果パラセタモールのような薬剤として用いられる上
記化合物および他のＮ−アシル化第一芳香族アミンを評
価する方法に使用することができる。毒性代謝生成物の
生成を避ける場合には、過分投与量をすみやかに評価し
、およびすみやかに、かつ正しい投薬が要求される。

欧州特許明細書第５３４７０号に記載されている検定方
法においては、アニリドを酵素により加水分解し、加水
分解生成物を分光光度的に検出している。この方法の更
に詳細な説明は「アナリテ力ルバイオケミストリー（Ａ
ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　　
Ｊ１４３、１５２〜１５７；題目：「アセトアミノフェ
ンに関する酵素−ベースド検定（ｅｕｚｙｍｅ−ｂａｓ
ｅｄ　ａｓｓａｙ）の開発Ｊに記載されている。

欧州特許明細書第１８４８９５号に記載されている他の
方法においては、適当な電位に釣合わせた電極を、アニ
リドの含有すると思われ、かつ酵素で処理された試料に
さらしている。電極において発生した電流が生成した加
水分解生成物の量を示している。

上述する脱アセチル化を触媒作用する酵素の生成方法は
数年にわたって知られている。欧州特許明細書第５３８
９０号（アリール　アシルアミダーゼの製造）にはプソ
イドモナス属およびバチルス属の細菌、並びにペニシリ
ウム属カビを包含する酵素源についてのユニの引例が挙
げられている。

１コと±」７１丈！、菌株からのアリール　アシルアミ
ダーゼの生成は、特によく特徴づけられており、上記欧
州特許にはアニリドの存在でトリプトン大豆ブイヨンに
おけるあるプソイドモナス属性ｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ
）の生長中に酵素活性が誘導されることが示されている
。アリール　アシルアミダーゼの生成方法についての他
の詳細な説明については「ヨーロピアン　ジャーナル　
オプ　バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｌｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　Ｊ１３
２、６５１〜６５５（題目ニブソイトモナス　フロレン
セス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｓ）　ＡＴＣＣ３９００４からアリール　アシルアミダ
ーゼの精製および特性）に記載されている。

本発明はアリール　アシルアミダーゼ酵素を生成する新
規な方法を提供することである。本発明の方法は菌株ロ
ードコツカス　差Ａノ己しＬ九人（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃ
ｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）　ＮＣｌＢ１２２７
３またはアリール　アシルアミダーゼ生成突然変異体ま
たはその変異細胞（ｖａｒｉａｎｔｓ）の細菌を、この
細菌菌株がアリール　アシルアミダーゼを生成できる培
地において培養し、アリール　アシルアミダーゼ酵素含
有材料を回収することを特徴とする。

培養は、ｐＨ７〜８の増殖培地において接種した後、１
０〜４０時間にわたり２５〜３５℃で回分式で行うのが
好ましい。酵素含有材料は、例えば細胞を含まない抽出
物（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ　ｅｘｔｒａｃｔ）として回収
し、バッチ　イオン交換、カラム　イオン交換、疎水的
相互作用クロマトグラフィーおよび塩沈殿技術を包含す
る普通の技術で精製することができる。

本発明の他の観点において、本発明は菌株旦二上ユヱ左
ス　エ斐ムユ±丈入ＮＣｌＢ１２２７３または了り−ル
　アシルアミダーゼ生成突然変異体またはその変異細胞
を提供することである。

ユニ上ユヱ左ス孟ユ入二爽ニス、ダラム陽性株はノカル
デアセア（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）科またはアクチ
ノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目に属す
る。

一般に、細菌菌株は、アリール　アシルアミダーゼ誘導
物質、特に好ましくはアセトアニリドの存在でトリプト
ン大豆ブイヨン中で生長する場合に、アリール　アシル
アミダーゼを生成することができる。

本発明の他の観点において、本発明は菌株三ニドコツカ
ス　エユス旦爽丈スＮＣｌＢ１２２７３またはアリール
　アシルアミダーゼ生成突然変異体またはその変異細胞
の培養から得られたアリール　アシルアミダーゼ活性を
有する製剤を提供することである。

製剤は、貯蔵中に酵素活性の低下を抑制するために、ジ
チオトレイトール、β−メルカプトエタノールまたは他
のチオール保護剤を含有するのが好ましい。

次に、本発明を実施例について説明する。

スＪｌｉｉ　　ヱｌ垂皿 Ｒユ　エリスロポリス菌株ＮＣｌＢ１２２７３を、唯一
の炭素およびエネルギー源として芳香族アミド　アセト
アミノフェン（パラセタミノール；ｐ−ヒドロキシアセ
トアニリド）について選択濃厚化（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ
　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）によって庭土（ｇａｒｄｅｎ
　５ｏｎ）から単離した６つの有機体の１つとした。

唯一の炭素およびエネルギー源としてアセトアミノフェ
ン（０，１％ｖ　／　ｖ　）を含有する最終塩培地（５
０ｍｆｆｉ、　ｐＨ７，０（表１））を花壇からの少量
の庭土で培養した。

ＮａＮＯ３０，８５０ ＫＨ２ＰＯ４０，５６Ｏ ＮａｚＨＰＯｓ　　　　　　　　０．８６０に２ＳＯ４
０，１７０ ＭｇＳＯ４・７■２０　　　　　０．０３７ＣａＣ１ｚ
４ＨｚＯＯ，００７ Ｆｅ（ＩＩＩ）ＥＤＴＡ　　　　　　　　　Ｏ，００４
微量元素溶液　　　２．５戚／４ ＺｎＳＯａ４ＨｚＯＯ，２３２ ＭｎＳＯ４・４ＨｚＯＯ，１７Ｂ ｌｂＢＯ３０，０５６ ＣｕｂＯｎ　・５Ｈｚ６　　　　　　０．１００Ｎ１０
０Ｎａｚ・２ＨｚＯＯ，０３９ ＣｏＣ１２・６ＨｚＯＯ，０４２ Ｋｌ　　　　　　　　　　　　　Ｏ，０６６ＥＩＩＴＡ
　　　　　　　　　　　　Ｏ，１００ＦｅＳＯａ・７Ｈ
ｚＯＯ，０４Ｏ ４０Ｎ１Ｃｂ６１（０，０００４ Ｈ２ＳＯ４（ＩＭ）　　　　　　　８．０　　緘最初の
培養物を、第２単離処理する前に、オルビタル振盪機（
２０Ｏｒｐｍ）上で２〜５日間にねたり３０”Ｃで温間
した。

実蓋開叉；　第１垂離処理 第２単離処理は、最初の濃厚物（ｉｎｉｔｉａｌｅｎｒ
ｉｃｈｍｅｎｔｓ）を直接平板培養しおよび試験平板上
に発生する有機体を純粋にするため単離した。濃厚物を
、０．１％（Ｗ／Ｖ）の濃度でアセトアミノフェンを含
有する最小塩基天上で平板培養した（ｐｌａｔｅｄ）。

これらの濃厚化処理の終りに、６つの純粋培養物を単離
し、これらのうちの１つの単離物は０．１％アセトアミ
ノフェンまたは０．１％フェナセチンを含有する最小寒
天において生長するグラム陽性有機体であることを確め
た。培地の変色がいずれの場合においても生じた。培地
変色は置換アニリンの形成および反応の指示として利用
し、更に有機体のアニリド基質を加水分解し、このため
に了り−ル　アシルアミダーゼ活性を保有していたこと
を示した。有機体は次に示す特性に基づいて−ｏ−二上
ユエ立入　　エリスロポリス菌株であることを確めた。

１微生食艷性 単離有機体は、普通寒天上３０℃で生長させた場合に、
次に示す形態および染色特性を示した：形状：　　　　
　棒状 固有運動性：　　陰性 胞子：　　　　　なし ダラム染色：　　陽性 普通寒天上３０℃で３日間生長させた後、生成したコロ
ニーは丸く、規則正しく、純粋で（ｅｎｔｉｒｅ）、な
めらかで、凸状で、灰色がかった白で、光沢性で、粘液
様で、および不透明であり、かつ２〜３鵬直径を有して
いた。

３０℃で１０日間にわたり生長させた後、コロニーはう
すいピンク色を有した。

有機体はＯ−Ｆグルコース試験においてカタラーゼ腸性
、オキシダーゼ（コバックス（Ｋｏｖａｃｓ））陰性、
および弱酸化であった。

有機体は２５℃における４８時間試験において次の特性
を示した： Ｎｏ、還元　　　　　　　　　　　　　−ｖｅゼインー
ル生成　　　　　　　　　　−ｖｅグルコースからの酸
生成　　　　　　−ｖｅアルギニン　デヒドロラーゼ活
性　　−ｖｅウレアーゼ　　　　　　　　　　　　＋シ
６エスタリン加水分解　　　　　　　　＋νｅ（弱）ゼ
ラチン加水分解　　　　　　　　　−ｖｅβ−ガラクト
シダーゼ　　　　　　　微量グルコース同化　　　　　
　　　　　＋ｖｅアラビノース同化　　　　　　　　　
−ｖｅラマンース同化　　　　　　　　　　−シｅマン
ニトール同化　　　　　　　　　＋ｖｅＮ−アセチルグ
ルコサミン同化　　　＋ｖｅマルトース同化　　　　　
　　　　　−ｖｅグルクロン酸塩（Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ
）同化　　＋ｖｅカプリン酸塩（Ｃａｐｒａｔｅ）同化
　　　　−ｖｅアジピン酸塩同化　　　　　　　　　＋
ｖｅリンゴ酸塩同化　　　　　　　　　　＋ｖｅクエン
酸塩同化　　　　　　　　　　＋ｖｅ酢酸フェニル同化
　　　　　　　　　＋ｖｅチトクローム　オキシダーゼ
　　　　−ｖｅ有機体は２５℃における７日間試験にお
いて次の特性を示した： ・のヒ人　の　　； アデニン　　　　　　　　　　　　＋ｖｅチロシン　　
　　　　　　　　　　＋ｖｅ尿素　　　　　　　　　　
　　　　＋ｖｅアラントイン　　　　　　　　　　−ｖ
ｅ゛のヒＡ　か゛の　； イノシトール　　　　　　　　　　＋ｖｅトレハロース
　　　　　　　　　　　＋ｖｅマンニトール　　　　　
　　　　　＋νｅソルビトール　　　　　　　　　　＋
ｖｅ一の・、′における　　・ グリセロール　　　　　　　　　＋ｖｅソルビトール　
　　　　　　　　　＋ｖｅマルトース　　　　　　　　
　　　　＋ｖｅトレハロース　　　　　　　　　　　＋
νｅベンゾエート　　　　　　　　　　　−ｖｅクエン
酸塩　　　　　　　　　　　＋ｖｅ乳酸塩　　　　　　
　　　　　　　　十ｖｅＬ−チロシン　　　　　　　　
　　−ｖｅ上−ピーヒドロキシベンゾエート　＋ｖｅ血
■豊性 ０ＮＰＧ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　＋ｖｅツイーン８０　　　　　　　　　　　　　
＋　ｖｅグルコース寒天上の色　　うすいピンク色、粘
液様ホスファターゼ　　　　　　　　　＋ｖｅ１０’Ｃ
での生長　　　　　　　　　　＋ｖｅ４０℃での生長　
　　　　　　　　　−ｖｅこれらの特性は、有機体が４
０℃で生長しない典型的でないＲユ　エリスロポリス菌
株であることを示した。

菌株の生長における培養ｐｎおよび培養温度の種々の効
果を測定した。有機体は測定ｐＨ範囲にわたって、ｐｉ
（６，６〜ｐｌ＋　８．４で生長し、ｐＨ７，０〜ｐＨ
ｓ、。

の範囲において最適生長を示した。２６．３０および３
５℃での生長速度を比べ、３０℃において一番速い生長
を示した。

菌株は、ブタベスト条約に基づいて、トレイリサーチ　
ステーション（Ｔｏｒｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｔａ
ｔｉｏｎ）（英国、　ＡＢ９８ＤＧ、　Ｒｄアバディー
ン　アベイ１３５゜ピーオー　ボックス３１）における
ザ　ナショナルコレクション　オブ　インダストリアル
　バクテリアにおいて１９８６年６月に寄託番号ＮＣｌ
Ｂ１２２７３が与えられた。試料は関連する法律によっ
て入手できる。

災Ｊｉ［ＬＬ；　　ア１−ル　アシルアミダーゼゞ　の
拍拙− Ｌ　工丈入旦±北スの単離菌株を０．１％アセトアニリ
ドを含有する１００　ｄの２％トリプトン大豆ブイヨン
中で１．８のＡ６゜。に生長させた（この明細書に引用
したすべてのλ値はセシル型（Ｃｅｃｉｌｍｏｄｅｌ）
　ＣＢ５９４分光光度計で測定した）。培養物を遠心分
離により採収しく１０，０００工、１０分間）、ベレッ
トを洗浄すべきトリス／１（ＣＩ緩衝剤（５０ｍＭ、ｐ
Ｈ８，６）に再懸濁させた。遠心分離後、洗浄細胞ペレ
ットを５　ｍｆｌの同じ緩衝剤に再懸濁し、再懸濁細胞
懸濁物を超音波処理によって***させた（４×３０秒バ
ースト、２分間冷却期間で１６ｍＭ大きさ）。

***細胞懸濁物を遠心分離（１０，０００Ｌ、３０分間
）して細胞残骸（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｄｅｂｒｉｓ）を
除去し、上澄みを注意して除去し、分析するまで氷上で
貯蔵した。

アリール　アシルアミダーゼ活性は次の２つの方法によ
って検出した。

１）不連続検定法： 反応混合物は、細胞を含まない抽出物（１００μｆ）；
アセトアミノフェン（２６，５ｍＭ　：　１００μｌ）
；およびトリス／ＨＣＩ緩衝剤（１００ｍＭ　、ｐＨ８
，６，８００，ｃｒＩ！、）から作った。この混合物を
十分にかきまぜ、３０℃で温置した。所望の経過時間後
、反応をニークレゾール（１％ｖ　／　ｖ水溶液、２ｄ
）、硫酸銅（ｎ）（０，８８０アンモニア添加した０、
２％Ｗ　／　Ｖの無水塩（１，６＃１ｆｆｉ／１００戚
）　：　０．２　Ｗｒｌ＞　ｉおよび蒸留水（１，４ｍ
）を添加して終了させた。青色ピグメントの形成を反応
生成物ｐ−アミノフェノールの存在で確認し、この生成
物は６１５ｎｍ吸収帯の測定およびニーアミノフェノー
ルにより生成した標準曲線との比較により確めた。

２）連続検定法： 反応混合物をトリス／ＨＣＩ緩衝剤（１００ｍＭ　、ｐ
Ｈ８，６，０，６ｄ）　ｉおよび１−ニトロアセトアニ
リド（１ｍＭ、希釈前に固形物をエタノールに溶解して
１０％Ｖ　／　Ｖの最終エタノール濃度にして作った）
から作った。反応を、細胞を含まない抽出物（４００μ
りを添加して開始し、反応物を３０’Ｃで温置した。反
応生成物、Ｌ−ニトロアニリンは４０５ｎｍで強い吸収
帯を示し、これらの条件下で１０．０００　Ａ　１モル
／ｃＴ１１のモル消衰係数を有していた。

連続検定法により測定されるように細胞を含まない抽出
物のアリール　アシルアミダーゼは蛋白質■当り１分間
に０．３４μモルのｐ−ニトロアセトアニリドを加水分
解した。

連続検定法は酵素の活性単位を規定する基準とした。特
に、１単位の酵素活性を、連続検定条件下で１分間当り
上−ニトロアニリンに加水分解する１μモルの１−ニト
ロアセトアニリドとして規定する。

１血性土：　囮泉肢厳 ５０ｍＭ−トリス／ＨＣＩ緩衝剤（ｐＨ８，６）を用い
て作った単離Ｒ，，互ユノ、ｏ弘ユノ、菌株の細胞を含
まない抽出物は、４℃で１８時間にわたって貯蔵した場
合に、多くのアリール　アシルアミダーゼ活性を失った
。酵素の安定性は１ｍＭジチオトレイトールを抽出物に
添加することによって著しく改良された。１ｍＭジチオ
トレイトールの存在において、４℃１１８時間にわたる
貯蔵後、最初のアリールアシルアミダーゼ活性は細胞を
含まない抽出物において若干程度失っただけであった。

また、プロテアーゼ抑制剤フェニルメチルスルホニル　
フルオリドが、細胞を含まない抽出物におけるアリール
　アシルアミダーゼに影響を及ぼすことについて試験し
た所、アリール　アシルアミダーゼ活性の減少するのを
制御することを確めた。

Ｌ　正副ノ己しＬ九人菌株を１５２の２％トリプトン大
豆ブイヨン、０．１％アセトアニリド（アリール　アシ
ルアミダーゼ誘導物質として）および０．３３％（Ｖ／
Ｖ）のポリプロピレン　グリコールＰ２Ｏ００を含有す
る２Ｏ２発酵槽内において３０’Ｃ，ｐ）ｌ　７．２で
生長させた。使用する接種物を同じ培地上で３２時間に
わたり生長させた５００　ｍｌ培養物とした。生長は２
４時間でほぼ完了し、この間に培養物は７．０のＡ６（
１０を到達した。培養試料の細胞を含まない抽出物にお
いて測定したアリール　アシルアミダーゼの比活性は、
■蛋白質当り０．５９単位にした場合、生長の後指数増
殖期（生長の約１８時間後）において最高であった。

災施貫旦；　　Ｒ，工１スロボリスの７５リツトル１０
０　ｍの２％トリプトン大豆ブイヨン（オキソイド（Ｏ
ｘｏｉｄ））および０．１％のアセトアニリド（ＢＤ■
）を脱イオン化水に混合した混合物を２５０戚振盪フラ
スコに入れ、このフラスコをＬ　Ｉ＋Ｘ０１ｌＪ−スの
傾斜普通寒天から接種した。培養物を７２時間にわたり
オルビタル振盪１ｍ　（１５０ｒｐｍ）上３０°ｃで生
長させ、次いで２０ｒｄアリコートをそれぞれ５００　
ｍの同じ培地を含有する４個の２１振盪フラスコの接種
のために用いた。これらの培養物を同じ条件下で１６時
間にわたり生長させ、次いで１００　ｆパイロット　プ
ラント発酵槽（バイオエンジニアイング、スイス国）に
おいて７５１の同じ培地を接種するのに用いた。生長条
件は、温度３０℃、通気１分当り２５２、ｐＨ７，２（
０，２Ｍ　ＨＣＩの自動添加により維持した）にした。

撹拌機の速度を４０Ｏｒｐｍにした。

培養は、１８時時間積後、７．２の人、。。を達成し、
この期間においてシャープレス型連続遠心分離機を用い
、５５０ｇ湿重量の細胞を得た。

実Ｊｔｄ［ｉ　　煎ＪＪ！！ｌΔ皿 Ｌ　エ丈久旦凰丈入の培養物を実施例５に記載する方法
によって生長させた。１７時間生長させた後、培養物は
６の人、。。を達成し、シャープレス型連続遠心分離機
を用いて採収した。ｉ５０　ｇ湿重量の細胞を回収した
。細胞を約３００戚の５０ｍＭ　）リス／ＨＣＩ　、　
ｐＨ７，５緩衝剤に再懸濁させることによって洗浄し、
次いで懸濁物を１１，０００．、ｆＬで９０分間にわた
り４℃で遠心分離して上澄み（廃棄した）および細胞ペ
レットを生成した。細胞ペレットを３００ｍ１の５０ｍ
Ｍ　）リス／）ＩｃＩ　（ｐＨ７，５）緩衝剤に再懸濁
し、生成懸濁物を、必要とするまで、−２０℃に貯蔵し
た。

Ａ１：　バ・・チ　イオン六　九 イオン交換精製処理のために、５０ｍＭ　）リス／ＨＣ
Ｉ（ｐＨ７，５）緩衝剤で予じめ平衡させたＤＥ５２イ
オン交換樹脂（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）　）　　
４　ｇを５６−の細胞を含まない抽出物に添加した。細
胞を含まない抽出物を、−２０℃に貯蔵した採収懸濁物
６０ｍを取り、懸濁物を解凍し、および１０ｍ２の５０
ｍＭ　ｌ−リス／２ｌ− ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）緩衝剤をジチオトレイトール（
［１ＴＴ）と共に１ｍＭに添加した。懸濁物を２つのバ
ッチに分け、各バッチを超音波処理した（１０Ｘ４５秒
間、２分間冷却期間で１６ｍμ大きさ）。超音波処理材
料をプールしくｐｏｏｌｅｄ）　、次いで３１．０００
１で７０分間４℃で遠心分離して５７−の細胞を含まな
い抽出物を得た。

細胞を含まない抽出物およびＤＥ５２樹脂の混合物を４
℃で３時間にわたり撹拌し、次いでＤＥ５２樹脂を沈降
させるように放置した。上澄みを傾潟し、ＤＥ５２樹脂
を８０ｍｆｌの２０ｍＭ　）リス／ＨＣＩ　（ｐＨ７，
５）緩衝剤（１ｍＭ　ＤＴＴを含有する）を添加しおよ
び５分間４℃で撹拌することによって洗浄した。ｎＥ５
２樹脂を、再び沈降させ、上澄みを廃棄して約４　ｍｌ
の緩衝剤に懸濁させたイオン交換樹脂（全容量で約７ｍ
）を残留させた。これに、０．４ｍＭ塩化ナトリウムお
よび１ｍＭＤＴＴを含有する２１ｄの２０ｍＭ　）リス
／ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）を添加して約０．３５Ｍ最終
最終厚物を生成した。懸濁物を２時間にわたり撹拌し、
次いで０．４　μｍフィルターに通して濾過してイオン
交換樹脂を除去し、濾液にはアリール　アシルアミダー
ゼを含有していた。１．８倍の蛋白質精製、すなわち、
アリール　アシルアミダーゼ比活性において■蛋白質光
り０．５８単位から■蛋白質光り１．０５単位に増加す
ることができた。酵素の回収は７７％であった。

Ａ２Ｆ　　カラム　イオン六　几 バッチＤＦ！、５２樹脂精製処理により生成した材料を
、更にファーマシアＱ−セファロース　ファーストフロ
ー　ゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｑ−３ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗｇｓｌ）　（第四アミン官能基
を含む架橋アガロースゲル）のカラム上でのイオン交換
クロマトグラフィーによて精製した。ＤＥ５２樹脂精製
材料の試料５ｄを１−の２０ｍＭ　）リス／ＨＣＩ　（
ｐＨ７，５）と混合して試料のＮａＣｌ濃度を０．３Ｍ
以下に希釈した。５威容量の希釈試料を４８−のＱ−セ
ファロース　カラム（９Ｘ２．６ｃｍ）に供給した。こ
のカラムは０．３Ｍ　ＮａＣ１および１ｍＭジチオトレ
イトール（ＤＴＴ）を含む２０ｍＭトリス／ＨＣＩ　（
ｐＨ７，５）緩衝剤で予じめ平衡にした。

蛋白質を２４０　ｄの同じ緩衝剤で、次いで２４０−の
２０ｍＭ　トリス／ＨｃＩ　（ｐＨ７，５）緩衝剤およ
び０．４Ｍ　ＮａＣ１（および１ｍＭＤＴＴ）で溶離し
た。流速を２４０戚／時にし、１０ｄ部分の溶離剤を回
収した。６０〜１５０ｍ２の０，４Ｍ　ＮａＣ１緩衝剤
をカラムに供給した後に、アリール　アシルアミダーゼ
を溶離した。４．９倍の蛋白質精製を９０％収率で達成
した。

Ａ３ｉ　　　　・　　　　クロマトグーフィーＱ−セフ
ァロース　カラム精製処理により生成した酵素溶液の試
料をダイアフィルトレージョン（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔ
ｉｏｎ）で処理し、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）３０．０
００分子量のカットオフ中空繊維カートリッジおよび１
ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む２０ｍＭトリ
ス／ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）緩衝剤を用いて濃縮した。

試料を、再び、ａｏ、ｏｏｏ分子量カットオフ膜を設け
たアミコン限外濾過セルを用いて濃縮した。この処理に
おいて、約２倍の酵素の蛋白質精製を達成した。

−当り０．４２■蛋白質、■蛋白質光り１２．５単位ア
リール　アシルアミダーゼの上述する処理により得た濃
厚溶液の０．５ｍＡ試料をファーマシア　フェニル　セ
ファロース　ゲル（フェニル置換架橋アガロース　ゲル
）の４　ｔｄ　（２Ｘｌ、６　ｃｍ）カラムに供給した
。このカラムは２０ｍＭ　）リス／ＨＣＩ　（ｐＨ７，
５）および１ｍＭＤＴＴにおいて０．５Ｍ硫酸アンモニ
ウムで予じめ平衡にした。カラムを１０ｄの同じ溶液で
洗浄し、酵素を２０ｍＭ　）リス／ＨＣＩ　（ｐＨ７，
５）および１ｍＭ　ＤＴＴにおいて０．５　＝Ｏ，ＯＭ
硫酸アンモニウムの２０−線状降下グラジェント（ｌｉ
ｎｅｒ　ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）次
いで２０ｄの２０ｍＭ　）リス／ＨＣＩ　（ｐＨ７，５
）および１ｍＭ　ＤＴＴで溶離した。流速を０．３３ｄ
／分にし、および１ｍＭ部分を回収した。溶離酵素を硫
酸アンモニウム降下グラジェントの端部に向けた。１．
９倍精製を達成した。すなわち、アリール　アシルアミ
ダーゼ比活性は■蛋白質光り最初の１２．５単位から■
蛋白質光り２３．２単位に増加し、酵素の回収は８５％
であった。

Ｂ：　　Ｌ　アンモニウム　１ Ｌ　エユ久旦Ｌニスの細胞を含まない粗抽出物における
多量（８６％）のアリール　アシルアミダーゼを２０〜
４０％の範囲の硫酸アンモニウム飽和溶液で沈殿したこ
とを確めた（細胞を含まない粗抽出物は１０ｒｎｇ／ｍ
ｌの蛋白質を含み、かつ■蛋白質光り０．４８単位のア
リール　アシルアミダーゼ活性を有していた。抽出物を
１ｍＭエチレンジアミン−四節酸および１ｍＭジチオス
レイトールを含む５０ｍＭ　トリス／■Ｃ１（ｐＦｌ　
７．５）緩衝剤に添加した）。

１隻■主；　皿鬼静聚豊性 、　酵素の他の特性について検討した。

バッチ　イオン交換処理、次いでカラム　イオン交換処
理によって精製した酵素を使用し、およびｐ−ニトロア
セトアニリド検定をＲユ　エリスロｌ　　アリール　ア
シルアミダーゼの活性によるｐｉの影響の試験に用いた
。酵素はｐＨ８，０付近において最大活性を有する広い
最適ｐｕを有していた。

カラム　イオン交換クロマトグラフィで精製し、次いで
ファーマシアＰＤ−１０ゲル濾過カラムを用いて処理し
た酵素試料を用い、Ｌ　孟丈久旦ヱ史ムアリール　アシ
ルアミダーゼの等電点を等電点電気泳動ゲル電気泳動（
ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ　ｇｅｄｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により測定した。酵素
をアリ−ル　アシルアミダーゼ活性に対するｐ−ニトロ
アセトアニリド活性スティンによりゲル上で視覚化し、
ｐ■勾配におけるスティン位置を既知の等電点の着色蛋
白質標識に対して調べた。酵素は、Ｒ。

エリスロポリス　アリール　アシルアミダーゼの等電点
が約ｐｎ　７．０を示すｐＨ６，４５およびｐＨ７，３
の等電点を有する蛋白質標識の間の中間位置に集中した
。

特許出願人　　　ジェネティックス・インターナショナ
ル・インコーホレーテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、培地において、￥ロードコッカス￥￥エリスロポリ
   ス￥ＮＣＩＢ１２２７３およびアリールアシルアミダー
   ゼ生成突然変異体またはその変異細胞から選択したアリ
   ールアシルアミダーゼ生 成細菌菌株を培養し、およびアリールアシ ルアミダーゼ含有材料を回収することを特徴とするアリ
   ールアシルアミダーゼの製造方 法。 ２、アリールアシルアミダーゼ含有材料は、細胞を含ま
   ない抽出物である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、細菌菌株を、ｐＨ７〜８の増殖培地の接種後、２５
   〜３５℃で１０〜４０時間にわたって培養する特許請求
   の範囲第１または２項記載の方法。 ４、培地にはアリールアシルアミダーゼ誘導物質を含有
   する特許請求の範囲第１、２または３項記載の方法。 ５、誘導物質はアセトアニリドとする特許請求の範囲第
   ４項記載の方法。 ６、菌株￥ロードコッカス￥￥エリスロポリス￥ＮＣＩ
   Ｂ１２２７３またはアリールアシルアミダーゼ生成突然
   変異体またはその変異細胞。 ７、菌株￥ロードコッカス￥￥エリスロポリス￥ＮＣＩ
   Ｂ１２２７３またはアリールアシルアミダーゼ生成突然
   変異体またはその変異細胞の培養から得たアリールアシ
   ルアミダーゼ活性を有す る製剤。 ８、製剤はチオール保護剤を含有させた特許請求の範囲
   第７項記載の製剤。 ９、培地において、￥ロードコッカス￥￥エリスロポリ
   ス￥ＮＣＩＢ１２２７３およびアリールアシルアミダー
   ゼ生成突然変異体またはその変異細胞から選択したアリ
   ールアシルアミダーゼ生 成細菌菌株を培養し、およびアリールアシ ルアミダーゼ含有材料を回収して得たアリールアシルア
   ミダーゼで、Ｎ−アシル化第一 芳香族アミンを加水分解することを特徴とするＮ−アシ
   ル化第一芳香族アミンの検定方法。 １０、検定を欧州特許明細書第１８４８９５Ａの特許請
   求の範囲第１項の記載により行う特許請求の範囲第９項
   記載の方法。