JPS6374484A - アリ−ル アシルアミダ−ゼの製造用ロ−ドコッカス細菌およびこれを用いるアリ−ル アシルアミダ−ゼの製造方法 - Google Patents
アリ−ル アシルアミダ−ゼの製造用ロ−ドコッカス細菌およびこれを用いるアリ−ル アシルアミダ−ゼの製造方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
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- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
-
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- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はアリール アシルアミダーゼ酵素の製造、この
酵素を生成しうる微生物、およびアリール アシルアミ
ダーゼ酵素に関する。
酵素を生成しうる微生物、およびアリール アシルアミ
ダーゼ酵素に関する。
ニーに記載するアリール アシルアミダーゼ酵素はイン
ターナショナル ユニオン オブ バイオケミストリー
により規定されており(「酵素命名法(Enzyme
Nomenclature) J 1978+ アカデ
ミ−出版、ニューヨーク)、これらの酵素はアニリドを
アニリンおよび脂肪酸陰イオンに加水分解する触媒作用
することが示されている。これらの酵素は酵素分類E、
C,3,5,1,13に与えられている。
ターナショナル ユニオン オブ バイオケミストリー
により規定されており(「酵素命名法(Enzyme
Nomenclature) J 1978+ アカデ
ミ−出版、ニューヨーク)、これらの酵素はアニリドを
アニリンおよび脂肪酸陰イオンに加水分解する触媒作用
することが示されている。これらの酵素は酵素分類E、
C,3,5,1,13に与えられている。
例えば、アリール アシルアミダーゼ酵素はアセトアニ
リド、アセトアミノフェン(acetaminophe
n)(パラセタモーノ喧paracetamol) :
2−−ヒドロキシ アセトアニリドおよびツェナセチ
ン(上−エトキシアセトアニリド)を加水分解でき、こ
の結果パラセタモールのような薬剤として用いられる上
記化合物および他のN−アシル化第一芳香族アミンを評
価する方法に使用することができる。毒性代謝生成物の
生成を避ける場合には、過分投与量をすみやかに評価し
、およびすみやかに、かつ正しい投薬が要求される。
リド、アセトアミノフェン(acetaminophe
n)(パラセタモーノ喧paracetamol) :
2−−ヒドロキシ アセトアニリドおよびツェナセチ
ン(上−エトキシアセトアニリド)を加水分解でき、こ
の結果パラセタモールのような薬剤として用いられる上
記化合物および他のN−アシル化第一芳香族アミンを評
価する方法に使用することができる。毒性代謝生成物の
生成を避ける場合には、過分投与量をすみやかに評価し
、およびすみやかに、かつ正しい投薬が要求される。
欧州特許明細書第53470号に記載されている検定方
法においては、アニリドを酵素により加水分解し、加水
分解生成物を分光光度的に検出している。この方法の更
に詳細な説明は「アナリテ力ルバイオケミストリー(A
nalytical Biochemistry)
J143、152〜157;題目:「アセトアミノフェ
ンに関する酵素−ベースド検定(euzyme−bas
ed assay)の開発Jに記載されている。
法においては、アニリドを酵素により加水分解し、加水
分解生成物を分光光度的に検出している。この方法の更
に詳細な説明は「アナリテ力ルバイオケミストリー(A
nalytical Biochemistry)
J143、152〜157;題目:「アセトアミノフェ
ンに関する酵素−ベースド検定(euzyme−bas
ed assay)の開発Jに記載されている。
欧州特許明細書第184895号に記載されている他の
方法においては、適当な電位に釣合わせた電極を、アニ
リドの含有すると思われ、かつ酵素で処理された試料に
さらしている。電極において発生した電流が生成した加
水分解生成物の量を示している。
方法においては、適当な電位に釣合わせた電極を、アニ
リドの含有すると思われ、かつ酵素で処理された試料に
さらしている。電極において発生した電流が生成した加
水分解生成物の量を示している。
上述する脱アセチル化を触媒作用する酵素の生成方法は
数年にわたって知られている。欧州特許明細書第538
90号(アリール アシルアミダーゼの製造)にはプソ
イドモナス属およびバチルス属の細菌、並びにペニシリ
ウム属カビを包含する酵素源についてのユニの引例が挙
げられている。
数年にわたって知られている。欧州特許明細書第538
90号(アリール アシルアミダーゼの製造)にはプソ
イドモナス属およびバチルス属の細菌、並びにペニシリ
ウム属カビを包含する酵素源についてのユニの引例が挙
げられている。
1コと±」71丈!、菌株からのアリール アシルアミ
ダーゼの生成は、特によく特徴づけられており、上記欧
州特許にはアニリドの存在でトリプトン大豆ブイヨンに
おけるあるプソイドモナス属性seudomonads
)の生長中に酵素活性が誘導されることが示されている
。アリール アシルアミダーゼの生成方法についての他
の詳細な説明については「ヨーロピアン ジャーナル
オプ バイオケミストリー(European Lou
rnal of Biochemistry) J13
2、651〜655(題目ニブソイトモナス フロレン
セス(Pseudomonas fluorescen
s) ATCC39004からアリール アシルアミダ
ーゼの精製および特性)に記載されている。
ダーゼの生成は、特によく特徴づけられており、上記欧
州特許にはアニリドの存在でトリプトン大豆ブイヨンに
おけるあるプソイドモナス属性seudomonads
)の生長中に酵素活性が誘導されることが示されている
。アリール アシルアミダーゼの生成方法についての他
の詳細な説明については「ヨーロピアン ジャーナル
オプ バイオケミストリー(European Lou
rnal of Biochemistry) J13
2、651〜655(題目ニブソイトモナス フロレン
セス(Pseudomonas fluorescen
s) ATCC39004からアリール アシルアミダ
ーゼの精製および特性)に記載されている。
本発明はアリール アシルアミダーゼ酵素を生成する新
規な方法を提供することである。本発明の方法は菌株ロ
ードコツカス 差Aノ己しL九人(Rhodococc
us erythropolis) NClB1227
3またはアリール アシルアミダーゼ生成突然変異体ま
たはその変異細胞(variants)の細菌を、この
細菌菌株がアリール アシルアミダーゼを生成できる培
地において培養し、アリール アシルアミダーゼ酵素含
有材料を回収することを特徴とする。
規な方法を提供することである。本発明の方法は菌株ロ
ードコツカス 差Aノ己しL九人(Rhodococc
us erythropolis) NClB1227
3またはアリール アシルアミダーゼ生成突然変異体ま
たはその変異細胞(variants)の細菌を、この
細菌菌株がアリール アシルアミダーゼを生成できる培
地において培養し、アリール アシルアミダーゼ酵素含
有材料を回収することを特徴とする。
培養は、pH7〜8の増殖培地において接種した後、1
0〜40時間にわたり25〜35℃で回分式で行うのが
好ましい。酵素含有材料は、例えば細胞を含まない抽出
物(cell−free extract)として回収
し、バッチ イオン交換、カラム イオン交換、疎水的
相互作用クロマトグラフィーおよび塩沈殿技術を包含す
る普通の技術で精製することができる。
0〜40時間にわたり25〜35℃で回分式で行うのが
好ましい。酵素含有材料は、例えば細胞を含まない抽出
物(cell−free extract)として回収
し、バッチ イオン交換、カラム イオン交換、疎水的
相互作用クロマトグラフィーおよび塩沈殿技術を包含す
る普通の技術で精製することができる。
本発明の他の観点において、本発明は菌株旦二上ユヱ左
ス エ斐ムユ±丈入NClB12273または了り−ル
アシルアミダーゼ生成突然変異体またはその変異細胞
を提供することである。
ス エ斐ムユ±丈入NClB12273または了り−ル
アシルアミダーゼ生成突然変異体またはその変異細胞
を提供することである。
ユニ上ユヱ左ス孟ユ入二爽ニス、ダラム陽性株はノカル
デアセア(Nocardiaceae)科またはアクチ
ノミセス(Actinomycetales)目に属す
る。
デアセア(Nocardiaceae)科またはアクチ
ノミセス(Actinomycetales)目に属す
る。
一般に、細菌菌株は、アリール アシルアミダーゼ誘導
物質、特に好ましくはアセトアニリドの存在でトリプト
ン大豆ブイヨン中で生長する場合に、アリール アシル
アミダーゼを生成することができる。
物質、特に好ましくはアセトアニリドの存在でトリプト
ン大豆ブイヨン中で生長する場合に、アリール アシル
アミダーゼを生成することができる。
本発明の他の観点において、本発明は菌株三ニドコツカ
ス エユス旦爽丈スNClB12273またはアリール
アシルアミダーゼ生成突然変異体またはその変異細胞
の培養から得られたアリール アシルアミダーゼ活性を
有する製剤を提供することである。
ス エユス旦爽丈スNClB12273またはアリール
アシルアミダーゼ生成突然変異体またはその変異細胞
の培養から得られたアリール アシルアミダーゼ活性を
有する製剤を提供することである。
製剤は、貯蔵中に酵素活性の低下を抑制するために、ジ
チオトレイトール、β−メルカプトエタノールまたは他
のチオール保護剤を含有するのが好ましい。
チオトレイトール、β−メルカプトエタノールまたは他
のチオール保護剤を含有するのが好ましい。
次に、本発明を実施例について説明する。
スJlii ヱl垂皿
Rユ エリスロポリス菌株NClB12273を、唯一
の炭素およびエネルギー源として芳香族アミド アセト
アミノフェン(パラセタミノール;p−ヒドロキシアセ
トアニリド)について選択濃厚化(selective
enrichment)によって庭土(garden
5on)から単離した6つの有機体の1つとした。
の炭素およびエネルギー源として芳香族アミド アセト
アミノフェン(パラセタミノール;p−ヒドロキシアセ
トアニリド)について選択濃厚化(selective
enrichment)によって庭土(garden
5on)から単離した6つの有機体の1つとした。
唯一の炭素およびエネルギー源としてアセトアミノフェ
ン(0,1%v / v )を含有する最終塩培地(5
0mffi、 pH7,0(表1))を花壇からの少量
の庭土で培養した。
ン(0,1%v / v )を含有する最終塩培地(5
0mffi、 pH7,0(表1))を花壇からの少量
の庭土で培養した。
NaNO30,850
KH2PO40,56O
NazHPOs 0.860に2SO4
0,170 MgSO4・7■20 0.037CaC1z
4HzOO,007 Fe(III)EDTA O,004
微量元素溶液 2.5戚/4 ZnSOa4HzOO,232 MnSO4・4HzOO,17B lbBO30,056 CubOn ・5Hz6 0.100N10
0Naz・2HzOO,039 CoC12・6HzOO,042 Kl O,066EIITA
O,100FeSOa・7H
zOO,04O 40N1Cb61(0,0004 H2SO4(IM) 8.0 緘最初の
培養物を、第2単離処理する前に、オルビタル振盪機(
20Orpm)上で2〜5日間にねたり30”Cで温間
した。
0,170 MgSO4・7■20 0.037CaC1z
4HzOO,007 Fe(III)EDTA O,004
微量元素溶液 2.5戚/4 ZnSOa4HzOO,232 MnSO4・4HzOO,17B lbBO30,056 CubOn ・5Hz6 0.100N10
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培養物を、第2単離処理する前に、オルビタル振盪機(
20Orpm)上で2〜5日間にねたり30”Cで温間
した。
実蓋開叉; 第1垂離処理
第2単離処理は、最初の濃厚物(initialenr
ichments)を直接平板培養しおよび試験平板上
に発生する有機体を純粋にするため単離した。濃厚物を
、0.1%(W/V)の濃度でアセトアミノフェンを含
有する最小塩基天上で平板培養した(plated)。
ichments)を直接平板培養しおよび試験平板上
に発生する有機体を純粋にするため単離した。濃厚物を
、0.1%(W/V)の濃度でアセトアミノフェンを含
有する最小塩基天上で平板培養した(plated)。
これらの濃厚化処理の終りに、6つの純粋培養物を単離
し、これらのうちの1つの単離物は0.1%アセトアミ
ノフェンまたは0.1%フェナセチンを含有する最小寒
天において生長するグラム陽性有機体であることを確め
た。培地の変色がいずれの場合においても生じた。培地
変色は置換アニリンの形成および反応の指示として利用
し、更に有機体のアニリド基質を加水分解し、このため
に了り−ル アシルアミダーゼ活性を保有していたこと
を示した。有機体は次に示す特性に基づいて−o−二上
ユエ立入 エリスロポリス菌株であることを確めた。
し、これらのうちの1つの単離物は0.1%アセトアミ
ノフェンまたは0.1%フェナセチンを含有する最小寒
天において生長するグラム陽性有機体であることを確め
た。培地の変色がいずれの場合においても生じた。培地
変色は置換アニリンの形成および反応の指示として利用
し、更に有機体のアニリド基質を加水分解し、このため
に了り−ル アシルアミダーゼ活性を保有していたこと
を示した。有機体は次に示す特性に基づいて−o−二上
ユエ立入 エリスロポリス菌株であることを確めた。
1微生食艷性
単離有機体は、普通寒天上30℃で生長させた場合に、
次に示す形態および染色特性を示した:形状:
棒状 固有運動性: 陰性 胞子: なし ダラム染色: 陽性 普通寒天上30℃で3日間生長させた後、生成したコロ
ニーは丸く、規則正しく、純粋で(entire)、な
めらかで、凸状で、灰色がかった白で、光沢性で、粘液
様で、および不透明であり、かつ2〜3鵬直径を有して
いた。
次に示す形態および染色特性を示した:形状:
棒状 固有運動性: 陰性 胞子: なし ダラム染色: 陽性 普通寒天上30℃で3日間生長させた後、生成したコロ
ニーは丸く、規則正しく、純粋で(entire)、な
めらかで、凸状で、灰色がかった白で、光沢性で、粘液
様で、および不透明であり、かつ2〜3鵬直径を有して
いた。
30℃で10日間にわたり生長させた後、コロニーはう
すいピンク色を有した。
すいピンク色を有した。
有機体はO−Fグルコース試験においてカタラーゼ腸性
、オキシダーゼ(コバックス(Kovacs))陰性、
および弱酸化であった。
、オキシダーゼ(コバックス(Kovacs))陰性、
および弱酸化であった。
有機体は25℃における48時間試験において次の特性
を示した: No、還元 −veゼインー
ル生成 −veグルコースからの酸
生成 −veアルギニン デヒドロラーゼ活
性 −veウレアーゼ +シ
6エスタリン加水分解 +νe(弱)ゼ
ラチン加水分解 −veβ−ガラクト
シダーゼ 微量グルコース同化
+veアラビノース同化
−veラマンース同化 −シeマン
ニトール同化 +veN−アセチルグ
ルコサミン同化 +veマルトース同化
−veグルクロン酸塩(Gluconate
)同化 +veカプリン酸塩(Caprate)同化
−veアジピン酸塩同化 +
veリンゴ酸塩同化 +veクエン
酸塩同化 +ve酢酸フェニル同化
+veチトクローム オキシダーゼ
−ve有機体は25℃における7日間試験にお
いて次の特性を示した: ・のヒ人 の ; アデニン +veチロシン
+ve尿素
+veアラントイン −v
e゛のヒA か゛の ; イノシトール +veトレハロース
+veマンニトール
+νeソルビトール +
ve一の・、′における ・ グリセロール +veソルビトール
+veマルトース
+veトレハロース +
νeベンゾエート −veクエン
酸塩 +ve乳酸塩
十veL−チロシン
−ve上−ピーヒドロキシベンゾエート +ve血
■豊性 0NPG
+veツイーン80
+ veグルコース寒天上の色 うすいピンク色、粘
液様ホスファターゼ +ve10’C
での生長 +ve40℃での生長
−veこれらの特性は、有機体が4
0℃で生長しない典型的でないRユ エリスロポリス菌
株であることを示した。
を示した: No、還元 −veゼインー
ル生成 −veグルコースからの酸
生成 −veアルギニン デヒドロラーゼ活
性 −veウレアーゼ +シ
6エスタリン加水分解 +νe(弱)ゼ
ラチン加水分解 −veβ−ガラクト
シダーゼ 微量グルコース同化
+veアラビノース同化
−veラマンース同化 −シeマン
ニトール同化 +veN−アセチルグ
ルコサミン同化 +veマルトース同化
−veグルクロン酸塩(Gluconate
)同化 +veカプリン酸塩(Caprate)同化
−veアジピン酸塩同化 +
veリンゴ酸塩同化 +veクエン
酸塩同化 +ve酢酸フェニル同化
+veチトクローム オキシダーゼ
−ve有機体は25℃における7日間試験にお
いて次の特性を示した: ・のヒ人 の ; アデニン +veチロシン
+ve尿素
+veアラントイン −v
e゛のヒA か゛の ; イノシトール +veトレハロース
+veマンニトール
+νeソルビトール +
ve一の・、′における ・ グリセロール +veソルビトール
+veマルトース
+veトレハロース +
νeベンゾエート −veクエン
酸塩 +ve乳酸塩
十veL−チロシン
−ve上−ピーヒドロキシベンゾエート +ve血
■豊性 0NPG
+veツイーン80
+ veグルコース寒天上の色 うすいピンク色、粘
液様ホスファターゼ +ve10’C
での生長 +ve40℃での生長
−veこれらの特性は、有機体が4
0℃で生長しない典型的でないRユ エリスロポリス菌
株であることを示した。
菌株の生長における培養pnおよび培養温度の種々の効
果を測定した。有機体は測定pH範囲にわたって、pi
(6,6〜pl+ 8.4で生長し、pH7,0〜pH
s、。
果を測定した。有機体は測定pH範囲にわたって、pi
(6,6〜pl+ 8.4で生長し、pH7,0〜pH
s、。
の範囲において最適生長を示した。26.30および3
5℃での生長速度を比べ、30℃において一番速い生長
を示した。
5℃での生長速度を比べ、30℃において一番速い生長
を示した。
菌株は、ブタベスト条約に基づいて、トレイリサーチ
ステーション(Torry Re5earch 5ta
tion)(英国、 AB98DG、 Rdアバディー
ン アベイ135゜ピーオー ボックス31)における
ザ ナショナルコレクション オブ インダストリアル
バクテリアにおいて1986年6月に寄託番号NCl
B12273が与えられた。試料は関連する法律によっ
て入手できる。
ステーション(Torry Re5earch 5ta
tion)(英国、 AB98DG、 Rdアバディー
ン アベイ135゜ピーオー ボックス31)における
ザ ナショナルコレクション オブ インダストリアル
バクテリアにおいて1986年6月に寄託番号NCl
B12273が与えられた。試料は関連する法律によっ
て入手できる。
災Ji[LL; ア1−ル アシルアミダーゼゞ の
拍拙− L 工丈入旦±北スの単離菌株を0.1%アセトアニリ
ドを含有する100 dの2%トリプトン大豆ブイヨン
中で1.8のA6゜。に生長させた(この明細書に引用
したすべてのλ値はセシル型(Cecilmodel)
CB594分光光度計で測定した)。培養物を遠心分
離により採収しく10,000工、10分間)、ベレッ
トを洗浄すべきトリス/1(CI緩衝剤(50mM、p
H8,6)に再懸濁させた。遠心分離後、洗浄細胞ペレ
ットを5 mflの同じ緩衝剤に再懸濁し、再懸濁細胞
懸濁物を超音波処理によって***させた(4×30秒バ
ースト、2分間冷却期間で16mM大きさ)。
拍拙− L 工丈入旦±北スの単離菌株を0.1%アセトアニリ
ドを含有する100 dの2%トリプトン大豆ブイヨン
中で1.8のA6゜。に生長させた(この明細書に引用
したすべてのλ値はセシル型(Cecilmodel)
CB594分光光度計で測定した)。培養物を遠心分
離により採収しく10,000工、10分間)、ベレッ
トを洗浄すべきトリス/1(CI緩衝剤(50mM、p
H8,6)に再懸濁させた。遠心分離後、洗浄細胞ペレ
ットを5 mflの同じ緩衝剤に再懸濁し、再懸濁細胞
懸濁物を超音波処理によって***させた(4×30秒バ
ースト、2分間冷却期間で16mM大きさ)。
***細胞懸濁物を遠心分離(10,000L、30分間
)して細胞残骸(cellular debris)を
除去し、上澄みを注意して除去し、分析するまで氷上で
貯蔵した。
)して細胞残骸(cellular debris)を
除去し、上澄みを注意して除去し、分析するまで氷上で
貯蔵した。
アリール アシルアミダーゼ活性は次の2つの方法によ
って検出した。
って検出した。
1)不連続検定法:
反応混合物は、細胞を含まない抽出物(100μf);
アセトアミノフェン(26,5mM : 100μl)
;およびトリス/HCI緩衝剤(100mM 、pH8
,6,800,crI!、)から作った。この混合物を
十分にかきまぜ、30℃で温置した。所望の経過時間後
、反応をニークレゾール(1%v / v水溶液、2d
)、硫酸銅(n)(0,880アンモニア添加した0、
2%W / Vの無水塩(1,6#1ffi/100戚
) : 0.2 Wrl> iおよび蒸留水(1,4m
)を添加して終了させた。青色ピグメントの形成を反応
生成物p−アミノフェノールの存在で確認し、この生成
物は615nm吸収帯の測定およびニーアミノフェノー
ルにより生成した標準曲線との比較により確めた。
アセトアミノフェン(26,5mM : 100μl)
;およびトリス/HCI緩衝剤(100mM 、pH8
,6,800,crI!、)から作った。この混合物を
十分にかきまぜ、30℃で温置した。所望の経過時間後
、反応をニークレゾール(1%v / v水溶液、2d
)、硫酸銅(n)(0,880アンモニア添加した0、
2%W / Vの無水塩(1,6#1ffi/100戚
) : 0.2 Wrl> iおよび蒸留水(1,4m
)を添加して終了させた。青色ピグメントの形成を反応
生成物p−アミノフェノールの存在で確認し、この生成
物は615nm吸収帯の測定およびニーアミノフェノー
ルにより生成した標準曲線との比較により確めた。
2)連続検定法:
反応混合物をトリス/HCI緩衝剤(100mM 、p
H8,6,0,6d) iおよび1−ニトロアセトアニ
リド(1mM、希釈前に固形物をエタノールに溶解して
10%V / Vの最終エタノール濃度にして作った)
から作った。反応を、細胞を含まない抽出物(400μ
りを添加して開始し、反応物を30’Cで温置した。反
応生成物、L−ニトロアニリンは405nmで強い吸収
帯を示し、これらの条件下で10.000 A 1モル
/cT11のモル消衰係数を有していた。
H8,6,0,6d) iおよび1−ニトロアセトアニ
リド(1mM、希釈前に固形物をエタノールに溶解して
10%V / Vの最終エタノール濃度にして作った)
から作った。反応を、細胞を含まない抽出物(400μ
りを添加して開始し、反応物を30’Cで温置した。反
応生成物、L−ニトロアニリンは405nmで強い吸収
帯を示し、これらの条件下で10.000 A 1モル
/cT11のモル消衰係数を有していた。
連続検定法により測定されるように細胞を含まない抽出
物のアリール アシルアミダーゼは蛋白質■当り1分間
に0.34μモルのp−ニトロアセトアニリドを加水分
解した。
物のアリール アシルアミダーゼは蛋白質■当り1分間
に0.34μモルのp−ニトロアセトアニリドを加水分
解した。
連続検定法は酵素の活性単位を規定する基準とした。特
に、1単位の酵素活性を、連続検定条件下で1分間当り
上−ニトロアニリンに加水分解する1μモルの1−ニト
ロアセトアニリドとして規定する。
に、1単位の酵素活性を、連続検定条件下で1分間当り
上−ニトロアニリンに加水分解する1μモルの1−ニト
ロアセトアニリドとして規定する。
1血性土: 囮泉肢厳
50mM−トリス/HCI緩衝剤(pH8,6)を用い
て作った単離R,,互ユノ、o弘ユノ、菌株の細胞を含
まない抽出物は、4℃で18時間にわたって貯蔵した場
合に、多くのアリール アシルアミダーゼ活性を失った
。酵素の安定性は1mMジチオトレイトールを抽出物に
添加することによって著しく改良された。1mMジチオ
トレイトールの存在において、4℃118時間にわたる
貯蔵後、最初のアリールアシルアミダーゼ活性は細胞を
含まない抽出物において若干程度失っただけであった。
て作った単離R,,互ユノ、o弘ユノ、菌株の細胞を含
まない抽出物は、4℃で18時間にわたって貯蔵した場
合に、多くのアリール アシルアミダーゼ活性を失った
。酵素の安定性は1mMジチオトレイトールを抽出物に
添加することによって著しく改良された。1mMジチオ
トレイトールの存在において、4℃118時間にわたる
貯蔵後、最初のアリールアシルアミダーゼ活性は細胞を
含まない抽出物において若干程度失っただけであった。
また、プロテアーゼ抑制剤フェニルメチルスルホニル
フルオリドが、細胞を含まない抽出物におけるアリール
アシルアミダーゼに影響を及ぼすことについて試験し
た所、アリール アシルアミダーゼ活性の減少するのを
制御することを確めた。
フルオリドが、細胞を含まない抽出物におけるアリール
アシルアミダーゼに影響を及ぼすことについて試験し
た所、アリール アシルアミダーゼ活性の減少するのを
制御することを確めた。
L 正副ノ己しL九人菌株を152の2%トリプトン大
豆ブイヨン、0.1%アセトアニリド(アリール アシ
ルアミダーゼ誘導物質として)および0.33%(V/
V)のポリプロピレン グリコールP2O00を含有す
る2O2発酵槽内において30’C,p)l 7.2で
生長させた。使用する接種物を同じ培地上で32時間に
わたり生長させた500 ml培養物とした。生長は2
4時間でほぼ完了し、この間に培養物は7.0のA6(
10を到達した。培養試料の細胞を含まない抽出物にお
いて測定したアリール アシルアミダーゼの比活性は、
■蛋白質当り0.59単位にした場合、生長の後指数増
殖期(生長の約18時間後)において最高であった。
豆ブイヨン、0.1%アセトアニリド(アリール アシ
ルアミダーゼ誘導物質として)および0.33%(V/
V)のポリプロピレン グリコールP2O00を含有す
る2O2発酵槽内において30’C,p)l 7.2で
生長させた。使用する接種物を同じ培地上で32時間に
わたり生長させた500 ml培養物とした。生長は2
4時間でほぼ完了し、この間に培養物は7.0のA6(
10を到達した。培養試料の細胞を含まない抽出物にお
いて測定したアリール アシルアミダーゼの比活性は、
■蛋白質当り0.59単位にした場合、生長の後指数増
殖期(生長の約18時間後)において最高であった。
災施貫旦; R,工1スロボリスの75リツトル10
0 mの2%トリプトン大豆ブイヨン(オキソイド(O
xoid))および0.1%のアセトアニリド(BD■
)を脱イオン化水に混合した混合物を250戚振盪フラ
スコに入れ、このフラスコをL I+X01lJ−スの
傾斜普通寒天から接種した。培養物を72時間にわたり
オルビタル振盪1m (150rpm)上30°cで生
長させ、次いで20rdアリコートをそれぞれ500
mの同じ培地を含有する4個の21振盪フラスコの接種
のために用いた。これらの培養物を同じ条件下で16時
間にわたり生長させ、次いで100 fパイロット プ
ラント発酵槽(バイオエンジニアイング、スイス国)に
おいて751の同じ培地を接種するのに用いた。生長条
件は、温度30℃、通気1分当り252、pH7,2(
0,2M HCIの自動添加により維持した)にした。
0 mの2%トリプトン大豆ブイヨン(オキソイド(O
xoid))および0.1%のアセトアニリド(BD■
)を脱イオン化水に混合した混合物を250戚振盪フラ
スコに入れ、このフラスコをL I+X01lJ−スの
傾斜普通寒天から接種した。培養物を72時間にわたり
オルビタル振盪1m (150rpm)上30°cで生
長させ、次いで20rdアリコートをそれぞれ500
mの同じ培地を含有する4個の21振盪フラスコの接種
のために用いた。これらの培養物を同じ条件下で16時
間にわたり生長させ、次いで100 fパイロット プ
ラント発酵槽(バイオエンジニアイング、スイス国)に
おいて751の同じ培地を接種するのに用いた。生長条
件は、温度30℃、通気1分当り252、pH7,2(
0,2M HCIの自動添加により維持した)にした。
撹拌機の速度を40Orpmにした。
培養は、18時時間積後、7.2の人、。。を達成し、
この期間においてシャープレス型連続遠心分離機を用い
、550g湿重量の細胞を得た。
この期間においてシャープレス型連続遠心分離機を用い
、550g湿重量の細胞を得た。
実Jtd[i 煎JJ!!lΔ皿
L エ丈久旦凰丈入の培養物を実施例5に記載する方法
によって生長させた。17時間生長させた後、培養物は
6の人、。。を達成し、シャープレス型連続遠心分離機
を用いて採収した。i50 g湿重量の細胞を回収した
。細胞を約300戚の50mM )リス/HCI 、
pH7,5緩衝剤に再懸濁させることによって洗浄し、
次いで懸濁物を11,000.、fLで90分間にわた
り4℃で遠心分離して上澄み(廃棄した)および細胞ペ
レットを生成した。細胞ペレットを300m1の50m
M )リス/)IcI (pH7,5)緩衝剤に再懸濁
し、生成懸濁物を、必要とするまで、−20℃に貯蔵し
た。
によって生長させた。17時間生長させた後、培養物は
6の人、。。を達成し、シャープレス型連続遠心分離機
を用いて採収した。i50 g湿重量の細胞を回収した
。細胞を約300戚の50mM )リス/HCI 、
pH7,5緩衝剤に再懸濁させることによって洗浄し、
次いで懸濁物を11,000.、fLで90分間にわた
り4℃で遠心分離して上澄み(廃棄した)および細胞ペ
レットを生成した。細胞ペレットを300m1の50m
M )リス/)IcI (pH7,5)緩衝剤に再懸濁
し、生成懸濁物を、必要とするまで、−20℃に貯蔵し
た。
A1: バ・・チ イオン六 九
イオン交換精製処理のために、50mM )リス/HC
I(pH7,5)緩衝剤で予じめ平衡させたDE52イ
オン交換樹脂(ワットマン(Whatman) )
4 gを56−の細胞を含まない抽出物に添加した。細
胞を含まない抽出物を、−20℃に貯蔵した採収懸濁物
60mを取り、懸濁物を解凍し、および10m2の50
mM l−リス/2l− HCI (pH7,5)緩衝剤をジチオトレイトール(
[1TT)と共に1mMに添加した。懸濁物を2つのバ
ッチに分け、各バッチを超音波処理した(10X45秒
間、2分間冷却期間で16mμ大きさ)。超音波処理材
料をプールしくpooled) 、次いで31.000
1で70分間4℃で遠心分離して57−の細胞を含まな
い抽出物を得た。
I(pH7,5)緩衝剤で予じめ平衡させたDE52イ
オン交換樹脂(ワットマン(Whatman) )
4 gを56−の細胞を含まない抽出物に添加した。細
胞を含まない抽出物を、−20℃に貯蔵した採収懸濁物
60mを取り、懸濁物を解凍し、および10m2の50
mM l−リス/2l− HCI (pH7,5)緩衝剤をジチオトレイトール(
[1TT)と共に1mMに添加した。懸濁物を2つのバ
ッチに分け、各バッチを超音波処理した(10X45秒
間、2分間冷却期間で16mμ大きさ)。超音波処理材
料をプールしくpooled) 、次いで31.000
1で70分間4℃で遠心分離して57−の細胞を含まな
い抽出物を得た。
細胞を含まない抽出物およびDE52樹脂の混合物を4
℃で3時間にわたり撹拌し、次いでDE52樹脂を沈降
させるように放置した。上澄みを傾潟し、DE52樹脂
を80mflの20mM )リス/HCI (pH7,
5)緩衝剤(1mM DTTを含有する)を添加しおよ
び5分間4℃で撹拌することによって洗浄した。nE5
2樹脂を、再び沈降させ、上澄みを廃棄して約4 ml
の緩衝剤に懸濁させたイオン交換樹脂(全容量で約7m
)を残留させた。これに、0.4mM塩化ナトリウムお
よび1mMDTTを含有する21dの20mM )リス
/HCI (pH7,5)を添加して約0.35M最終
最終厚物を生成した。懸濁物を2時間にわたり撹拌し、
次いで0.4 μmフィルターに通して濾過してイオン
交換樹脂を除去し、濾液にはアリール アシルアミダー
ゼを含有していた。1.8倍の蛋白質精製、すなわち、
アリール アシルアミダーゼ比活性において■蛋白質光
り0.58単位から■蛋白質光り1.05単位に増加す
ることができた。酵素の回収は77%であった。
℃で3時間にわたり撹拌し、次いでDE52樹脂を沈降
させるように放置した。上澄みを傾潟し、DE52樹脂
を80mflの20mM )リス/HCI (pH7,
5)緩衝剤(1mM DTTを含有する)を添加しおよ
び5分間4℃で撹拌することによって洗浄した。nE5
2樹脂を、再び沈降させ、上澄みを廃棄して約4 ml
の緩衝剤に懸濁させたイオン交換樹脂(全容量で約7m
)を残留させた。これに、0.4mM塩化ナトリウムお
よび1mMDTTを含有する21dの20mM )リス
/HCI (pH7,5)を添加して約0.35M最終
最終厚物を生成した。懸濁物を2時間にわたり撹拌し、
次いで0.4 μmフィルターに通して濾過してイオン
交換樹脂を除去し、濾液にはアリール アシルアミダー
ゼを含有していた。1.8倍の蛋白質精製、すなわち、
アリール アシルアミダーゼ比活性において■蛋白質光
り0.58単位から■蛋白質光り1.05単位に増加す
ることができた。酵素の回収は77%であった。
A2F カラム イオン六 几
バッチDF!、52樹脂精製処理により生成した材料を
、更にファーマシアQ−セファロース ファーストフロ
ー ゲル(Pharmacia Q−3epharos
e Fast Flowgsl) (第四アミン官能基
を含む架橋アガロースゲル)のカラム上でのイオン交換
クロマトグラフィーによて精製した。DE52樹脂精製
材料の試料5dを1−の20mM )リス/HCI (
pH7,5)と混合して試料のNaCl濃度を0.3M
以下に希釈した。5威容量の希釈試料を48−のQ−セ
ファロース カラム(9X2.6cm)に供給した。こ
のカラムは0.3M NaC1および1mMジチオトレ
イトール(DTT)を含む20mMトリス/HCI (
pH7,5)緩衝剤で予じめ平衡にした。
、更にファーマシアQ−セファロース ファーストフロ
ー ゲル(Pharmacia Q−3epharos
e Fast Flowgsl) (第四アミン官能基
を含む架橋アガロースゲル)のカラム上でのイオン交換
クロマトグラフィーによて精製した。DE52樹脂精製
材料の試料5dを1−の20mM )リス/HCI (
pH7,5)と混合して試料のNaCl濃度を0.3M
以下に希釈した。5威容量の希釈試料を48−のQ−セ
ファロース カラム(9X2.6cm)に供給した。こ
のカラムは0.3M NaC1および1mMジチオトレ
イトール(DTT)を含む20mMトリス/HCI (
pH7,5)緩衝剤で予じめ平衡にした。
蛋白質を240 dの同じ緩衝剤で、次いで240−の
20mM トリス/HcI (pH7,5)緩衝剤およ
び0.4M NaC1(および1mMDTT)で溶離し
た。流速を240戚/時にし、10d部分の溶離剤を回
収した。60〜150m2の0,4M NaC1緩衝剤
をカラムに供給した後に、アリール アシルアミダーゼ
を溶離した。4.9倍の蛋白質精製を90%収率で達成
した。
20mM トリス/HcI (pH7,5)緩衝剤およ
び0.4M NaC1(および1mMDTT)で溶離し
た。流速を240戚/時にし、10d部分の溶離剤を回
収した。60〜150m2の0,4M NaC1緩衝剤
をカラムに供給した後に、アリール アシルアミダーゼ
を溶離した。4.9倍の蛋白質精製を90%収率で達成
した。
A3i ・ クロマトグーフィーQ−セフ
ァロース カラム精製処理により生成した酵素溶液の試
料をダイアフィルトレージョン(diafiltrat
ion)で処理し、アミコン(Amicon)30.0
00分子量のカットオフ中空繊維カートリッジおよび1
mMジチオトレイトール(DTT)を含む20mMトリ
ス/HCI (pH7,5)緩衝剤を用いて濃縮した。
ァロース カラム精製処理により生成した酵素溶液の試
料をダイアフィルトレージョン(diafiltrat
ion)で処理し、アミコン(Amicon)30.0
00分子量のカットオフ中空繊維カートリッジおよび1
mMジチオトレイトール(DTT)を含む20mMトリ
ス/HCI (pH7,5)緩衝剤を用いて濃縮した。
試料を、再び、ao、ooo分子量カットオフ膜を設け
たアミコン限外濾過セルを用いて濃縮した。この処理に
おいて、約2倍の酵素の蛋白質精製を達成した。
たアミコン限外濾過セルを用いて濃縮した。この処理に
おいて、約2倍の酵素の蛋白質精製を達成した。
−当り0.42■蛋白質、■蛋白質光り12.5単位ア
リール アシルアミダーゼの上述する処理により得た濃
厚溶液の0.5mA試料をファーマシア フェニル セ
ファロース ゲル(フェニル置換架橋アガロース ゲル
)の4 td (2Xl、6 cm)カラムに供給した
。このカラムは20mM )リス/HCI (pH7,
5)および1mMDTTにおいて0.5M硫酸アンモニ
ウムで予じめ平衡にした。カラムを10dの同じ溶液で
洗浄し、酵素を20mM )リス/HCI (pH7,
5)および1mM DTTにおいて0.5 =O,OM
硫酸アンモニウムの20−線状降下グラジェント(li
ner descending gradient)次
いで20dの20mM )リス/HCI (pH7,5
)および1mM DTTで溶離した。流速を0.33d
/分にし、および1mM部分を回収した。溶離酵素を硫
酸アンモニウム降下グラジェントの端部に向けた。1.
9倍精製を達成した。すなわち、アリール アシルアミ
ダーゼ比活性は■蛋白質光り最初の12.5単位から■
蛋白質光り23.2単位に増加し、酵素の回収は85%
であった。
リール アシルアミダーゼの上述する処理により得た濃
厚溶液の0.5mA試料をファーマシア フェニル セ
ファロース ゲル(フェニル置換架橋アガロース ゲル
)の4 td (2Xl、6 cm)カラムに供給した
。このカラムは20mM )リス/HCI (pH7,
5)および1mMDTTにおいて0.5M硫酸アンモニ
ウムで予じめ平衡にした。カラムを10dの同じ溶液で
洗浄し、酵素を20mM )リス/HCI (pH7,
5)および1mM DTTにおいて0.5 =O,OM
硫酸アンモニウムの20−線状降下グラジェント(li
ner descending gradient)次
いで20dの20mM )リス/HCI (pH7,5
)および1mM DTTで溶離した。流速を0.33d
/分にし、および1mM部分を回収した。溶離酵素を硫
酸アンモニウム降下グラジェントの端部に向けた。1.
9倍精製を達成した。すなわち、アリール アシルアミ
ダーゼ比活性は■蛋白質光り最初の12.5単位から■
蛋白質光り23.2単位に増加し、酵素の回収は85%
であった。
B: L アンモニウム 1
L エユ久旦Lニスの細胞を含まない粗抽出物における
多量(86%)のアリール アシルアミダーゼを20〜
40%の範囲の硫酸アンモニウム飽和溶液で沈殿したこ
とを確めた(細胞を含まない粗抽出物は10rng/m
lの蛋白質を含み、かつ■蛋白質光り0.48単位のア
リール アシルアミダーゼ活性を有していた。抽出物を
1mMエチレンジアミン−四節酸および1mMジチオス
レイトールを含む50mM トリス/■C1(pFl
7.5)緩衝剤に添加した)。
多量(86%)のアリール アシルアミダーゼを20〜
40%の範囲の硫酸アンモニウム飽和溶液で沈殿したこ
とを確めた(細胞を含まない粗抽出物は10rng/m
lの蛋白質を含み、かつ■蛋白質光り0.48単位のア
リール アシルアミダーゼ活性を有していた。抽出物を
1mMエチレンジアミン−四節酸および1mMジチオス
レイトールを含む50mM トリス/■C1(pFl
7.5)緩衝剤に添加した)。
1隻■主; 皿鬼静聚豊性
、 酵素の他の特性について検討した。
バッチ イオン交換処理、次いでカラム イオン交換処
理によって精製した酵素を使用し、およびp−ニトロア
セトアニリド検定をRユ エリスロl アリール ア
シルアミダーゼの活性によるpiの影響の試験に用いた
。酵素はpH8,0付近において最大活性を有する広い
最適puを有していた。
理によって精製した酵素を使用し、およびp−ニトロア
セトアニリド検定をRユ エリスロl アリール ア
シルアミダーゼの活性によるpiの影響の試験に用いた
。酵素はpH8,0付近において最大活性を有する広い
最適puを有していた。
カラム イオン交換クロマトグラフィで精製し、次いで
ファーマシアPD−10ゲル濾過カラムを用いて処理し
た酵素試料を用い、L 孟丈久旦ヱ史ムアリール アシ
ルアミダーゼの等電点を等電点電気泳動ゲル電気泳動(
isoelectric focusing gede
lectrophoresis)により測定した。酵素
をアリ−ル アシルアミダーゼ活性に対するp−ニトロ
アセトアニリド活性スティンによりゲル上で視覚化し、
p■勾配におけるスティン位置を既知の等電点の着色蛋
白質標識に対して調べた。酵素は、R。
ファーマシアPD−10ゲル濾過カラムを用いて処理し
た酵素試料を用い、L 孟丈久旦ヱ史ムアリール アシ
ルアミダーゼの等電点を等電点電気泳動ゲル電気泳動(
isoelectric focusing gede
lectrophoresis)により測定した。酵素
をアリ−ル アシルアミダーゼ活性に対するp−ニトロ
アセトアニリド活性スティンによりゲル上で視覚化し、
p■勾配におけるスティン位置を既知の等電点の着色蛋
白質標識に対して調べた。酵素は、R。
エリスロポリス アリール アシルアミダーゼの等電点
が約pn 7.0を示すpH6,45およびpH7,3
の等電点を有する蛋白質標識の間の中間位置に集中した
。
が約pn 7.0を示すpH6,45およびpH7,3
の等電点を有する蛋白質標識の間の中間位置に集中した
。
特許出願人 ジェネティックス・インターナショナ
ル・インコーホレーテッド
ル・インコーホレーテッド
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、培地において、¥ロードコッカス¥¥エリスロポリ
ス¥NCIB12273およびアリールアシルアミダー
ゼ生成突然変異体またはその変異細胞から選択したアリ
ールアシルアミダーゼ生 成細菌菌株を培養し、およびアリールアシ ルアミダーゼ含有材料を回収することを特徴とするアリ
ールアシルアミダーゼの製造方 法。 2、アリールアシルアミダーゼ含有材料は、細胞を含ま
ない抽出物である特許請求の範囲第1項記載の方法。 3、細菌菌株を、pH7〜8の増殖培地の接種後、25
〜35℃で10〜40時間にわたって培養する特許請求
の範囲第1または2項記載の方法。 4、培地にはアリールアシルアミダーゼ誘導物質を含有
する特許請求の範囲第1、2または3項記載の方法。 5、誘導物質はアセトアニリドとする特許請求の範囲第
4項記載の方法。 6、菌株¥ロードコッカス¥¥エリスロポリス¥NCI
B12273またはアリールアシルアミダーゼ生成突然
変異体またはその変異細胞。 7、菌株¥ロードコッカス¥¥エリスロポリス¥NCI
B12273またはアリールアシルアミダーゼ生成突然
変異体またはその変異細胞の培養から得たアリールアシ
ルアミダーゼ活性を有す る製剤。 8、製剤はチオール保護剤を含有させた特許請求の範囲
第7項記載の製剤。 9、培地において、¥ロードコッカス¥¥エリスロポリ
ス¥NCIB12273およびアリールアシルアミダー
ゼ生成突然変異体またはその変異細胞から選択したアリ
ールアシルアミダーゼ生 成細菌菌株を培養し、およびアリールアシ ルアミダーゼ含有材料を回収して得たアリールアシルア
ミダーゼで、N−アシル化第一 芳香族アミンを加水分解することを特徴とするN−アシ
ル化第一芳香族アミンの検定方法。 10、検定を欧州特許明細書第184895Aの特許請
求の範囲第1項の記載により行う特許請求の範囲第9項
記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB868618559A GB8618559D0 (en) | 1986-07-30 | 1986-07-30 | Rhodococcus bacterium |
US8618559 | 1986-07-30 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6374484A true JPS6374484A (ja) | 1988-04-04 |
Family
ID=10601927
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62189022A Pending JPS6374484A (ja) | 1986-07-30 | 1987-07-30 | アリ−ル アシルアミダ−ゼの製造用ロ−ドコッカス細菌およびこれを用いるアリ−ル アシルアミダ−ゼの製造方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5030571A (ja) |
EP (1) | EP0255390B1 (ja) |
JP (1) | JPS6374484A (ja) |
DE (1) | DE3785508T2 (ja) |
GB (1) | GB8618559D0 (ja) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6015683A (en) * | 1992-07-15 | 2000-01-18 | Clinical Diagnostic Systems, Inc. | Dry analytical element for acetaminophen assay |
JPH11510392A (ja) * | 1995-08-09 | 1999-09-14 | アライド コロイド リミテッド | アミダーゼの製造方法 |
DE19924632B4 (de) | 1999-05-28 | 2006-04-13 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Verfahren zur Verzögerung der Desaktivierung von Glutarylamidase während einer Enzymkatalyse |
DE10042835A1 (de) * | 2000-08-30 | 2002-03-14 | Basf Ag | Verfahren zur enzymatischen Umsetzung von Verbindungen mit mindestens einer Nitrilfunktion und/oder mindestens einer Amidfunktion |
SE0100902D0 (sv) | 2001-03-15 | 2001-03-15 | Astrazeneca Ab | Compounds |
SE0202539D0 (sv) | 2002-08-27 | 2002-08-27 | Astrazeneca Ab | Compounds |
US7648992B2 (en) | 2004-07-05 | 2010-01-19 | Astrazeneca Ab | Hydantoin derivatives for the treatment of obstructive airway diseases |
SE0401762D0 (sv) | 2004-07-05 | 2004-07-05 | Astrazeneca Ab | Novel compounds |
SE0403085D0 (sv) | 2004-12-17 | 2004-12-17 | Astrazeneca Ab | Novel componds |
SE0403086D0 (sv) | 2004-12-17 | 2004-12-17 | Astrazeneca Ab | Compounds |
TW200800954A (en) * | 2006-03-16 | 2008-01-01 | Astrazeneca Ab | Novel crystal modifications |
TW200831488A (en) | 2006-11-29 | 2008-08-01 | Astrazeneca Ab | Novel compounds |
US8669085B2 (en) * | 2009-02-05 | 2014-03-11 | Ut-Battelle, Llc | Transformation of gram positive bacteria by sonoporation |
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---|---|---|---|---|
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EP0053470B1 (en) * | 1980-12-02 | 1988-01-07 | The Public Health Laboratory Service Board | Method for the estimation of n-acylated primary aromatic amines |
NL8403093A (nl) * | 1984-10-11 | 1986-05-01 | Stamicarbon | Werkwijze voor de enzymatische hydrolyse van d-alfa-aminozuuramiden. |
CA1249025A (en) * | 1984-10-12 | 1989-01-17 | Anthony E.G. Cass | Chemical sensor for n-acetyl primary aromatic amines |
-
1986
- 1986-07-30 GB GB868618559A patent/GB8618559D0/en active Pending
-
1987
- 1987-07-30 JP JP62189022A patent/JPS6374484A/ja active Pending
- 1987-07-30 EP EP87306778A patent/EP0255390B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-30 US US07/079,759 patent/US5030571A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-30 DE DE87306778T patent/DE3785508T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0255390B1 (en) | 1993-04-21 |
US5030571A (en) | 1991-07-09 |
DE3785508T2 (de) | 1993-09-30 |
EP0255390A3 (en) | 1989-07-19 |
DE3785508D1 (de) | 1993-05-27 |
EP0255390A2 (en) | 1988-02-03 |
GB8618559D0 (en) | 1986-09-10 |
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