JPS63502904A - 合成ｈｔｌｖ−３ペプチド、その組成物及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 合成ＨＴＬＶ−Ｉｌｌペプチド、その組成物及び用途技術分野 本発明は合成ペプチドに監視、さらに詳しくはエイズ（ＡＩＤＳ）及びＡＲＣと して知られる症候群に病因上関連するＨＴＬＶ−ｉ［又はＨＴＬＶ−Ｉｌｌ様ウ ィルスによって生産されるタンパク質の一部もしくはタンパク質に似せた合成ペ プチドに関する。

背景技術 後天性免疫不全症候群（エイズ）は１９８１年米国で最初に認識された。米国で の症例数はそれ以来的１０か月ごとに倍増している。米国では１９８１年以来エ イズ症例が約１６．０００報告されており、その約半数はすでに死亡している。

この病気の予想される結果はいつも決まって死である、というのは現在のところ この病気の猛威を遅らせ又は防止する有効な治療法が知られていないからである 。この病気の最初は同性愛もしくは両性愛の男性や静脈内投与薬物濫用者に見い 出されたが、今や汚染針の共用やウィルス保有者との個人的な性的接触やウィル ス保有者からの血液製剤の受領によって他の人々鎧まで広がってきている。

エイズと関連する病因的因子はヒトＴｍ胞白血病つィルス■型（Ｈｕ＠ａｎ　Ｔ −ｃｅｌｌ　Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｅ　Ｖｉｒｕｓｅｓ−ｔｙｐｅ　Ｉ）（Ｈ ＴＬＶＩＩＩ）、ヒト免疫不全ウィルス（Ｈｕｍａｎ　Ｉｗｕｎｏｄｅｆｉｃｅ ｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ）（ＨＩＶ）、多発性リンパ節病変ウィルス（Ｌｙｉ＊ｐｈ ｏａｄｅｒｏｐａｔｈｙ　Ｖｉｒｕｓｅｓ）　（ＬＡＶ）又はエイズ関連ウィル ス（Ａ　Ｉ　ＤＳ　−Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｖｉｒｕｓｅｓ）　（ＡＲＶ）として知 られる一部の関連レトロウィルスであることが同定された。

エイズは血液製剤によって伝染することができるので、この病気が見い出された 当初から感染ウィルスに特異的な抗体もしくは高原で血液を検査する診断テスト の開発が試みられてきた。この分野の努力が実を結び、１９８５年の終わりまで に５つの会社がＨＴＬＶ−Ｉｌｌウィルスに対いずれも培養された、ＨＴＬＶ− ＩＩＩ感染Ｔ−リンパ球から得られるウィルスタンパク質を使用して抗体を検出 するものである。培養細胞から得られるウィルスは破壊され（例えば洗剤で）Ｊ 流体（ウィルス分解物（ｖｉｒａｌ　Ｉｙｓａｔｅ）という）が得られる。この 分解物（種々の、ウィルスタンパク質断片を含む）を代表的には免疫測定の固相 成分として用いる。

（ＥＬＩＳＡ）方式であり、その方式では面相成分（ウイスルス分解物をその上 に析出させである）をＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を含有する疑いのある血液もしくは血 清と接触させる。抗体が存在すると、ウィルス分解物と結合し、非結合物質を洗 浄除去後、酵素標識抗ヒト免疫グロブリンと接触させる。ＳＣ議された抗体は面 相に付着するヒト抗体のいずれとも結合する。従ってＨＴＬＶ−Ｉｔ抗体テスト の特異性はウィルス分解物によって授与される。

これらのテストにより血Ｐ＆製剤を通してのＨＴＬＶ−１ウイルスの伝染が大幅 に減少したけれども、ウィルス分解物によるこれらのテストはいくつかの重大な 欠点を有している。

まず第１に、ウィルス分解物は生存しているＨＴＬＶ−Ｉｔウィルスに感染した 細胞から生産されているので、それを製造する人々が製造中に感染スる恐れがあ る。又、ウィルスが破壊工程に耐えて生残し、診断テスト中に使用者に感染する 恐れが少なくとも理論上あり得る。

第２の欠点は分解物を得ることが困難なこと、及び処理工程、又はウィルス分解 物を得るのに用いる感染細胞の性質が多岐に亘ることにより、得られる分解物の 性質が多岐に亘ることである。

第３番目の、そしてはるかに深刻で実際的な欠点はこの現在のテストによって実 質的数の誤った陽性の、そしてより少ない程度に誤った陰性の判断がなされるこ とである。現在までに、ウィルス分解物エライザテストが実質数の誤った陽性の 結果を生じたことはよく認識されている［Ｈａｓｔｉｎｇｓ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｒ ｅｐｏｒｔ、　５ｐｅｃｉａｌ　５ｕｐｐｌｅ＠ｅｎｔ／Ａｕｇｕｓｔ１９８５ 、題“ＡＩＤＳ；Ｔｈｅ　Ｅｍｅｒｇｉｎｇ　Ｅｔｈｉｃａｌ　Ｄｉｌｅ論ｍｍ ｓ”エイズ；生じつつある処方上のレジマ）参照〕、その９頁に以下の記載があ る。

「　しかしながら、エライザテストは感受性であるほどには特異的でなく、すな わち、健康な血液提供者の群において１００のテストにつき１という多い割合で 溶性となる。これらから、１００のうち９０は誤った陽性となる６国の単位では 年に８００万の血液提供のうち４０，０００は誤って陽性となる。」誤って陽性 となる原因の一端は現在のアッセイのための固相成分中に用いられるウィルス分 解物標品中に非ウィルス性タンパク質が存在することにあると考えられる。

上記報告書はさらに誤って陽性とすることを排除するためにウェスタンプロット 確認法（ｉ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｃｏｎｆｉｒｓａｔｏｒｙ　ｔｅｓｔ ）　（エライブ法より高価で技術的により難しい）を行うべきであるとしている 。ウェスタンプロットアッセイそれ自体誤差がありまた主観的解釈によるので、 ＨＴＬＶ−ｐｉ抗体の簡単でかつ客観的な確認法がめられている・誤って陰性と される原因の一端はアッセイの性質、この病気の免疫抑制的性質又はＨＴＬＶ− ｍｌウィルスとの接触（Ｅｘｐｏｓｕｒｅ　）と抗体の発達との間の潜伏期間に あると考えられるが、誤った陰性も又問題がある。

現在の方法のさらなる欠点はＨＴＬＶ−ｍｌウィルスの抗体だけを検出し、ウィ ルスそれ自体またはウィルス抗原それ自体を検出しないことである。陽性の結果 はそれゆえテストされた被検者が一度ＨＴＬＶ−１ウィルスにさらされ、抗体を 発達させたことを示すのみであって、現に感染しているかどうか、感染力を有す るかどうかまたはエイズを有しているかどうかについての結論を示すものではな い、改訂された（　Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ　Ｄ　１ｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌの エイズの定義によれば（１９８５年６月）、ＨＴＬＶ−ＩＩＩに対する血清抗体 について陰性で、低い数のＴ−ヘルパーリンパ球もしくは低いＴ−ヘルパー／チ ーサプレッサーリンパ球比を有していない患者はエイズ症例から除外されること に注目すべきである。

現在の方法は結論的な診断値となり得ないのにも拘わらず、ウィルス汚染血液の 検出はもとより感染者（あからさまなエイズに進行し、又他人に病気を伝染させ る恐れがあると考えられる人）の検出のために用いられている。商業的に利用で きる抗体テストで陽性とされる人々のうち実質的な人が臨床的に症候を示さない のみならず、（明らかに）他人に感染させることができないので、現在のテスト には誤って人をエイズ保有者として認定し、社会的、心理的影響を招来する実質 的危険性がある。

現在の分解物依存テストの欠点の多くはウィルス分解物をウィルス感染細胞に由 来しない物質に代えることによってなくすことができる。そのような物質として は例えばウィルス特異的合成ペプチド又は組換え微生物（代表的にはＥ、コリ（ Ｅ、　ｃｏｌｉ）　）に由来するウィルス特異的ペプチドがあり得る。

後者のアプローチに関する研究はＲｏｂｅｒｔ　Ｃ，Ｇａ１ｌｏ　及び共同研究 者によって、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ、３．　ｐａｇｅｓ　９０５ −９０９（Ｏｃｔｏｂｅｒ、　１９８５）、５ｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ、２２８． 　ｐａｇｅｓ　９３゜９６　（Ａｐｒｉｌ　５．　１９８５）　、及びＮａｔｕ ｒｅ、ｖｏｌ　、３１５　＋　ｐ＠ｇｅｓ１５１−１５４　（Ｍａｙ　９．１９ ８５）をはじめとする種々の最近の論文において報告されている。これらの研究 者らは組換えＥ、コリ技術によって生産された。ＨＴＬＶ−ｍｌウィルスのＥＮ Ｎ領域の遺伝子断片によってコード化されている８２アミノ酸ペプチドを同定し た。このペプチドはＨＴＬＶ−１１ウイルスの抗体によって認識される。より最 近、ジェネンテック（Ｇｅａｅｎｔｅｃｈ）グループはＧａ１ｉｏグループの８ ２アミノ酸ペプチドを含有する１０２アミノ酸ペプチドについての研究を報告し た［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ、　４．　ｏｅ＠ｅｓ　１２８°１３ 　Ｂ　（Ｆｅｂｒｕａｒｙ。

１９８６）１　。

合成ペプチド技術はさらζ明らかな利点（例えば特異性、純度、製造容易性等） を提供するにも拘わらず、この分野の研究は殆どなかった。

実際、かかる研究（関して本発明者らが知っている公表はｔｈｅ　ＦｉｆｔｈＡ ｎｎｕａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｆｏｒ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ、Ｆｅｂｒｕａｒｙ　３−６．１９８５におけるＤ’＋ｎｏ　Ｄ ｉｎａ　博士及び共同研究者による講演のみである。その講演の要旨は種々の合 成ペプチドを（１）エイズ患者における免疫応答を測定するため及び（２）動物 における抗血清を高めるために使用することを示しているが、用いる特異的ペプ チドについては開示していない、しかも講演それ自体においても、特異的ぺ１チ ドは同定されておらず、又いずれかのペプチド又はペプチドの組合せがすべての もしくは大部分の既知の陽性の血清をｕ微できたという指摘もされなかった。１ ９８５年２月のその講演以来本願が依存する親特許出願を提出する日まで、本発 明者らは合ｔＨＴＬＶ−１１ペプチドについてのその研究グループもしくは他の グループによる公表に接していない、その後１９８６年８月にＷａＨらによる公 表、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ。

Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、、＜１９８６）８３：６１５’Ｌ６１６３が あった。

ＨＴＬＶ−ＩＩタンパク質の一部をうまく似せ、もってＨＴＬＶ−ＩＩＩの抗体 の検出とＨＴＬＶ−１ｉｔウイルスもしくはウィルス抗原を認識する抗体の生産 の両方に有用である合成ペプチドは当業界に大きな進歩をもたらすであろう０本 発明はかかるペプチド、かかるペプチドを含有する組成物、これらのペプチドの 使用方法、及び治療及び診断用組成物を提供する０本発明はさらに抗ペプチド抗 体、かかる抗体を含有する組成物、及びかかる抗体及び組成物の使用方法も提供 する。

発明の開示 本発明は）ＩＴＬＶ−ｍｌウィルスのｇｐ４１外膜（ＥＮＶ）タンパク中の残基 配列（ｒｅｓｉｃｌｕｓ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）に相当する、各々少なくとも７ つのアミノ酸残基の配列を有する合成ペプチドを提供する。かかるペプチドは在 来ウィルス（ｎａｔｉｖｅ　ｖｉｒｕｓ）それ自身の免疫特性に似ていることが 見い出され、以下の群から選ばれる：Ｃ３ＧＫＬＩＣ（１） ＩＷＧＣ８ＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰ　（ｎ）ＩＷＧＣ５ＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮ ＡＳ　（Ｉｔ）ＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣ３ＧＫＬＩ　ＨＶ）ＡＶＥ ＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣ３ＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ　（Ｖ） ＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣ３ＧＫＬＩ　（Ｖｌ）ＬＬＧＩＷＧＣ３ＧＫＬＩＣ（ ■） ＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ　（■）ＩＷＧＣ３ＧＫＬ ＩＣＴＴＡＶＰＷＮ　（ＩＸ）Ｃ３ＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ　（Ｘ）ＳＧ ＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ　０１）ＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣ３Ｇ ＫＬＩＣ（■）ＧＣ３ＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮ　（Ｘｌｌ＋）ＬＫＤＱＱＬＬ ＧＩＷＧＣ３ＧＫ　（Ｘ■）ＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣ３（Ｘ Ｖ）これらのペプチドはエイズ／ＡＲＣ患者からのＨＴＬＶ−１！Ｉ抗体陽性血 清及び診断未定の抗体陽性血清の大部分によって認識される。さらに、これらの ペプチドは誤った陽性を生ずることは殆どない、実質上すべてのＨＴＬＶ−Ｉ＋ 抗体陽性血清によって認識される好ましいペプチドは式（ＩＩ）　〜（Ｖｌ）、 （■）、（Ｘ）　、及び（ｘＩ）〜（ｘ■）ノヘフチトテある。

この知見は、ＨＴＬＶ−ｎ［外膜タンパクの部分に相当する他のペプチドがＨＴ Ｌ’／−Ｉｌ！ウィルスの抗体を選択的に認識するのに有効でない事実に照らし 、非常に驚くべきことである。

本発明はさらにＨＴＬＶ−１ｉ！ウイルスの抗体の認識が、上記ペプチドを特定 の選択処方に従って組み合わせることによって有意に高められるという知見によ っている。さらに詳しく述べると、その第１のペプチドがｇｐ４１タンパク質配 列 Ｃ３ＧＫＬＩＣ（１） ＷＯ金含有る、２もしくはそれ以上の上記ペプチドを選択することによって認識 が高められることが見い出された。この第１のペプチドは好ましくは少なくとも これらの７つのアミノ酸残基を含有し、さらに好ましくは式（１）の配列を含む 、ｇｐ、４１タンパク質からの少なくとも１２のアミノ酸残基配列を含有する。

ペプチドの組合せはそのペプチドが少なくとのもＬＬＧ（Ｘ）Ｗ　（Ｘ■） （式中、Ｘは１．Ｌ、ＭもしくはＦよりなる群から選ばれる）のアミノ酸残基配 列を含有する、少なくとも第２のペプチドを含有する。注意するべきは、Ｘがｇ ｐ４１タンパク質の６０２位に相当し、かつＸがＩのときは式（ＸＡ）配列がｇ ｐ４１タンパク質の５９９〜６０３位に相当することである。一方、ｇｐ４１タ ンパク質の臨界領域におけるＨＩＶ単離物の配列比較の研究から、この６０２位 のＩをり、Ｍ又はＦと代えても抗原的には等価であると考えられた。この第２の ペプチドは式（Ｘ［Ｖｌ　＞の配列を含むことに加え、さらにｇｐ４１タシパク 質中に見い出される配列中、全部で少なくとも１５のアミノ酸残基を含有する。

換言すれば第２のペプチドは配列 ＺＬＬＧＸＷＺ’ （式中、ＸはＩ、Ｌ、Ｍ又はＦよりなる群から選ばれ；ＺはＨＴＬＶウィルスｇ ｐ４１タンパク質の５９９番目の位置のし一ロイシン残基のアミノ側に直接隣接 した、ｇＰ４１タンパク質のアミノ酸残基配列から選ばれ；Ｚ′はＨＴＬＶ−１ １ウイｌレスｇｐ４１タンパク質の６０３番目の位置のＬ−）リプトファン残基 のカルボキシ側に直接隣接した、ｇＰ４１タンパク質のアミノ酸残基配列から選 ばれ：ＺもしくはＺ′の一方は残基長０でもよいが、ＺとＺ′とを合わせて少な くとも１０残基を含む）よりなる。

ペプチド（ＩＶ）もしくは（ＸＩ）とペプチド（Ｉ）、（Ｘｌｌ）　モＬ＜は（ Ｘ）との組合せが特に好ましい、ペプチド（１）と（■）、又は（Ｘｌｌ）（Ｗ ）の組合せが中でもより抜きの組合せである。

これらの結果から、ＨＴＬＶ−Ｉｔ抗体と反応する、ＨＴＬＶ−ＩＩウィルスの 有意な抗原決定基が上記式（１）の配列よりなる７つのアミノ酸残基ペプチドに 含まれることが明らかである。さらに、これらのペプチドはそれぞれ大部分のＨ ＴＬＶ−１陽性血清と反応するが、個々の患者の血清はこれらのペプチドの１つ と特異的に反応し他とは特異的に反応しないことが見い出された。この観察は式 （１）の配列を含むより長いペプチド、例えばペプチド（１１）〜（ＸＩ）中に 追加の抗原決定基が存在することを示している、ペプチド合成に携わる通常の研 究者にとってこれらのペプチド断片を調製し、その中の抗原性及び免疫原性断片 を決定することは容易である。従ってかかる抗原性及び免疫原性断片は本発明の 一部であると解されるべきである。さらに、当業者は又、ＨＴＬＶ−■外膜タン パクの部分に相当するより長いペプチドであって本教示に従うペプチドも本発明 の実施に際し同様に機能することを認識するであろう、従って、かかるより長い ペプチドも本発明の一部であると解されるべきである。

本発明のペプチドは少なくとも１つのシスティン残基を含み、ある場合にはシス ティン残基を２個含む、従って、本ペプチドは種々の酸化形態で存在することが できる。システィン残基のメルカプト基が還元状態にあるモノマー形態に加え、 ２もしくはそれ以上のペプチド分子上のメルカプト基が酸化されてジスルフィド 結合を形成したダイマーもしくはポリマー形態も存在し得る。１つのシスティン 残基しか含まない本ペプチドは線状ダイマーしか形成しえないが、２つのシステ ィン残基を有する本ペプチドは環状モノマーとしても、線状もしくは環状ダイマ ーとしても又種々の長さの線状ポリマーとしても存在し得る。これらの種々の酸 化形態は本発明の一部であると考えられ、１本ペプチド」の中に包含本発明はさ らに、本発明の１もしくはそれ以上の合成ペプチドを用いてＨＴＬＶ−１［抗体 を検出もしくは定量する方法、及びかかる合成ペプチドを用いるＨＴＬＶ−１抗 体検出もしくは定量用診断キットを提供する。かかる抗体を含有している疑いの ある流体（例えば血液、血清、証票、唾液もしくは尿）中のＨＴＬＶ−Ｉｌｌの 抗体を検出もしくは定量する本発明方法は以下のａ）、ｂ）及びＣ）の工程より なる。

ａ）　少なくとも１つの本ペプチドもしくはその抗原性断片を固体表面に付着さ せる、 ｂ）　このペプチド被覆固体表面とテスト流体とを免疫反応が起こるに十分な時 間接触させる、 Ｃ）　このペプチドもしくは抗原性断片に結合した、抗体の存在を検出するが、 抗体の量を定量する 用いる検出方法によっては、工程ｂ）の後、固体表面を流体から分離し、固体表 面物質から未結合物質を洗い落とすことが好ましい、採用する検出方法は臨海的 でないが、酵素標識抗ヒト免疫グロブリンが好適であることが見い出来れた。こ の方法を実施するための本診断用キットはそれに結合した少なくと６１１ｉ］ｉ の本ペプチド又はその抗原性断片を有する固体表面、及び標識されたく好ましく は酵素標識された）抗ヒト免疫グロブリンよりなる。抗体を標識するための他の 常用の物質、例えばとオチン、放射性同位元素も用いることができる。

本発明はさらにＨＴＬＶ−１［１ウイルス又はウィルス抗原の検出のために有用 な抗ペプチド抗体を製造する方法を提供する。すなわちかがる方法は重合化形態 の、もしくは適当な免疫原性担体に付着させた、本ペプチドもしくはその免疫原 性断片で宿主動物を免疫化することよりなる。

）（ＴＬＶ−Ｉｌｌのポリクローナル抗体を製造する方法は重合化形態の、もし くは適当な免疫原性担体に付着させた、少なくとも１８！の本ペプチドもしくは その免疫原性断片で宿主動物を免疫化し、ついで宿主動物から採血することより なる。ＨＴＬＶ−ＩＩＩのモノクローナル抗体を製造する方法は重合化形態の、 もしくは適当な免疫原性担体に付着させた、少なくとも１種の本ペプチドもしく はその免疫原性断片で宿主動物を免疫化し、免疫化した宿主からｐＩｉａ細胞を 単離し、該牌臓細胞と適当なミエローマ細胞系と融合し、融合細胞を免疫化誘起 ペプチドもしくは断片、ＨＴＬＶ　−Ｉｌｌ、又は）（ＴＬＶ−１ｌｌ−感染細 胞との反応性によって選択し、ついで選択したハイブリドーマをインビトロで培 養するが、適当な宿主中に注入することよりなる。目的のモノクローナル抗体は 培養されたハイブリドーマについての上清、又は接種された宿主の血清もしくは 腹水から回収することができる。

抗ペプチド抗体それ自体、該抗体を用いるＮＴＬＶ−Ｉｌｌウィルス検出方法、 及び該抗体（ＨＴＬＶ−Ｉｌｌウィルス検出に有用である）含有診断用キットも 又本発明に包含される。

）１ＴＬＶ−１！Ｉウイルスもしくは抗原を含有する疑いのある流体中の該ウィ ルスもしくはウィルス特異的抗原を検出もしくは定量するためのサンドイッチ方 法は次のａ）、ｂ）及びＣ）の工程よりなる：ａ）　少なくとも１種の本ペプチ ドもしくはその免疫原性断片の抗体であって、固体表面に付着させるものを用意 する、ｂ）　該固体被覆固体表面とテストすべき流体とを免疫学的反応が起こる に十分な時間接触させる Ｃ）　固体表面上の抗体に付着したＨＴＬＶ−Ｉｌｌウィルス又はウィルス特異 的抗原の存在を検出し、又はその量を定量する採用する検出方法によっては、工 程ｂ）のあと、固体表面を処理流体から分離し、そこから未結合物質を洗浄する のが好ましい。

ＨＴＬＶ−１１１ウイルスもしくは抗原を含有する疑いのある流体中の該ウィル スもしくはウィルス特異的抗原を検出もしくは定量する完全な方法は次のａ）〜 ｆ）の工程よりなる： ａ）　少なくともＩＮの本ペプチド又はその免疫原性断片の抗体であって、固体 表面に付着させたものを用意する、ｂ）　既知の少量の、テストすべき流体と既 知の量の標識された本ペプチドとを混合して混合試料をつくる、Ｃ）　抗体被覆 固体表面と混合試料とを免疫学的反応が起こるに十分な時間接触させる、 ｄ）　固体表面を混合試料から分離する、Ｃ）　固体表面に結合したか、混合試 料中に残存するｍｗｔペプチドの存在を検出するかその量を定量する、 ｆ）　工程ｅ）の結果から、流体中の該ウィルスもしくは抗原の存在もしくは量 を決定する サンドイッチもしくは完全方法によるＨＴＬＶ−ＩＩウィルス検定もしくは定量 のための診断用キットは ａ）　少なくとも１種の本ペプチドもしくはその免疫原性診断の抗体を結合させ た固体表面、及び ｂ）　ＨＴＬＶ−ＩＩ、ウィルス特異的抗原、本ペプチド、又はその免疫源性断 片に対する、既知量の標識された抗体（サンドイッチアッセイのため）：又は既 知量の標識された本ペプチド（競合アッセイのため） よりなる。

本発明はさらに本ペプチドの予防的及び治療的適用をも含む、かかる適用の１つ として、本発明は動物に免疫原的に有効な量の、重合化形態の、もしくは免疫原 的に有効な担体に付着させた少なくともＩＮの本ペプチドもしくはその免疫原性 断片を非経口的に投与することよりなる、ＨＴＬＶ−ＩＩＩウィルスに対し動物 を免疫化する方法を包含する０本発明の治療的適用の第２の面として、本発明は 潜伏性のもしくは現実のＨＴＬＶ−ＤＩウィルス感染症にかかつている動物に、 ＨＴＬＶ−１ｉｔウイルス感染症を治療するに有効な量の、重合化形態の、もし くは免疫原的に有効な担体に付着させた少なくとも１種の本ペプチドもしくはそ の免疫原性断片を非経口的に投与することよりなる、該動物を治療する方法を包 含する。さらに別の療法的適用において、本ペプチドに対して作成された抗体は 毒性のもしくは医療物質と結合させたり、感染細胞に指向させることができる０ 本発明の療法的側面の最後は、免疫原量の、重合化形態の、もしくは免疫原的に 有効な担体に付着させた少なくとも１種の本発明のペプチドもしくはその免疫原 性断片よりなる、上記方法にいずれにおける使用にも適当な組成物（ｃｏｍｐｏ ｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｔｔｅｒ）に関する。

本ペプチド、その抗原性断片又は組換えＨＴＬＶ−Ｉｌｌタンパクは又本ペプチ ドテストもしくは組換えＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパクを用いるテストの特異性を改 善し、もってより国難なウェスタンプロット確認テストへの依存を減するために 用いることができる０本ペプチドテストもしくは組換えタンパクテストでの陽性 の性格性は有効阻止（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）量の本ペプチド、その抗原性断片又は 組換えＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパクの存在下に該テストをくり返すことによって確 認することかできる。もしそう思われているＨＴＬＶ−Ｉｌｌ抗体の平板（ｔｈ ｅ　ｐｌａｔｅ　）への結合が加えたペプチド、断片もしくはタンパクによって 阻止されるなら、もとの陽性の結果が確認され、他方もし結合が阻止されないな らもとの結果は誤りのく非特異的な）陽性ということになる。

本発明は従ってＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体を含有する疑いのある流体試料の該抗体に ついてのテストであって、組換えＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパク又は合成ＨＴＬＶ− ＩＩＩペプチドを固体表面に付着させたサンドイッチアッセイであるテストの陽 性結果の正確性を判定する、次のａ）〜ｂ）の工程より、なる方法をも包含する ： ａ）　既知少蓋の該試料と有効阻止量の本ペプチド、その抗原性断片もしくは組 換えＨＴＬＶ−Ｉｌｌタンパクとを混合して混合試料とする、 ｂ）　混合試料と該テストの固体相とを免疫反応が起こるに十分な時間接触させ る、 Ｃ）　該混合試料中の抗体と固体相との結合が、該ペプチド、断片もしくはタン パクの不存在下での結合と比較して阻害されているかどうかを決定する、 ｄ）　阻害の存在又は不存在に基づいて陽性結果の正確性を判定する本ペプチド 、断片もしくはタンパクについて「有効阻止量」とはテストされる試料中に存在 する該ペプチド、断片もしくはタンパク中に含有される抗原決定基に対して指向 するＨＴＬＶ−１［抗体と実質上完全に反応し、かくしてこれらの抗体とアッセ イの固体表面上のペプチド又はタンパクとの反応を実質上阻止する量を意味する 。このサンドイッチアッセイはエサイブ法が好ましい。

本ペプチドは既成技術（’ＤＮＡ技術及び液相合成技術をはじめとする）によっ て製造することができるが、固相Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ型合成が本ペプチドを製 造、単離するのに手ごろな方法である。この技術のさらなる記述及び他の当業界 既知の技術についての記述がＭ、　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、　ａｔａｌ、、　Ｐｅ ｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　 ５ｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ、１９７６をはじめ当業者に知られた他の参考文献 中に見られる１合成技術（’ＤＮＡ技術になし）が生産物の純度、抗原特異性、 好ましくない副生物の不存在、生産の容易性等の観点から好ましい、かかる合成 で用いられる適当な保護基及びその省略は上記テキスト、及びＪ、　Ｆ、　Ｗ、 　ＭｃＯｎｉｅ、”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｒｎ　Ｏｒｇａｎｉ ｃ　Ｃｈ６ｍｉｓｔｒｙ”、Ｐｌｅｎｕ論Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１ ９７３に見い出される。これらの本を参考として本発明に加入させる。

本ペプチドを抗ペプチド抗体の発生のため、又は治療形態の本ペプチドの製造の ために付着させる代表的な担体は、例えばウシ血清アルブミン；破傷目トキソイ ド；キーホール　リンピットヘマシアニン（ｋｅｙｈ。

ｌｅ　ｌｉ＊ｉｐ　ｈｅ＋５ａｃｙａｎｉｎ）　；ブタ、ウシもしくはウマの免 疫グロブリン：及びコレラしくはＥ、コロ熱不安定性毒素Ｂ−サブユニットを含 有する。

本発明の治療そせいぶつの調製にあたって、重合化形態の、もしくは適当な抗原 性担体に付着させた本ペプチドもしくは断片を活性成分として、非経口的に受容 できる医療担体とよく混合する。この担体は通常、殺菌水であるが、溶解補助剤 や保存剤（例えばチメロザール（ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）やメチルパラベン（ｓ ａｔｈｙｌ　ｐａｒａｂｅｎｓ）　）も用いることができる。

注射し得る懸濁液として調製してもよく、この場合適当な液体担体、懸濁剤等を 使用する。これらの組成物は又チモペンチン（Ｔｈｙ＋＊ｏｐｅｎｔｉｎ）やイ ンタアーロイキン■のような免疫促進剤、又は水酸化アルミニウムやＢ、Ｃ，Ｇ 、のような他のアジュバントを含有していてもよい。

本ペプチドの構造はアミノ酸のための通常の一文字コード（ｓｉｎｇｌｅ　−１ ｅｔｔｅｒ　ｃｏｄｅｓ）によって示された、右から左に配列のアミノからカル ボキシ方向に相当するものとして読まれる。読者の便宜のため、本ペプチド中に 含まれるアミノ酸の一文字コードを以下に示す：■　イソロイシン　Ｗ　トリプ トファンＧ　グリシン　ＣＬ−システィン ＳＬ−セリン　ＫＬ−リジン ＬＬ−ロイシン　Ｔ　Ｌ−）レオニン ＡＬ−アラニン　ＶＬ−バリン ＰＬ−プロリン　ＤＬ−アスパラギン酸ＮＬ−アスパラギン　ＥＬ−グルタミン 酸ＲＬ−アルギニン　ＹＬ−チロシン ＱＬ−グルタミン　ＭＬ−メチオニン ＦＬ−フェニルアラニン 本発明を以下実施例によって説明する。

実施例　Ｉ Ａ　Ｂｏａ−プロリン樹脂の合成 １．３ｍｅｑクロライド／ｉ樹脂を含有するクロロメチル化したスチレン−ジビ ニルベンゼン重合体を無水Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアニド（ＤＭＦ）生触媒とし てのヨウ化カリウム（ＫＩ）を用いてＢＯＣ−プロリンでエステル化した０反応 は５５℃で２４時間行なった（１）。

Ｂｏａ−プロリンの置換は脱ブロックしな（ｄｅｂｌｏｃｋｅｄ）樹脂部分につ いてのピクリン酸アッセイにより定垣したところ０．９２ｍｍｏｌ　ｅ／ｇであ った。

Ｂ　ペプチド（ｉｔ）の合成及び性格づけ式（ｎ）のペプチドの合成を古典的Ｍ ｅｒｒｉｆｉｅｄｌｄ技術（２）を用いて行った。ペプチド配列ＩＭＧＣ３ＧＫ ＬＩＣＴＴＡＶＰをＶｅｇａ２５０Ｃ自動ペプチド合成装置上でダブルカップル プログラム（ｄｏｕｂｌｅｃｏｕｐｌｅ　ｐｒｏｇｒａｍ）を用いて合成した。

１．８３６２ｙのＢｏａ−プロリン樹脂を１２ｍｅｑ過剰の以下のＢｏａ−Ｌ− アミノ酸（３，８）を用いて連続的にダブルカップリング反応させた。

７９ノ数−一　−並−Ｊ− Ｂｏａ−Ｖａｔ　ＣＨ２Ｃ１ｔ Ｂｏｃ　−Ａ　ｌ　ａ　ＣＨ２Ｃ１ｔ Ｂｏａ−（０−Ｂｚｌ）−Ｔｈｒ　ＣＨｔＣｌｚＢｏｃ−（０−Ｂｚ　１）−Ｔ ｈｒ　ＣＨ２Ｃ１ｘＣＨ２Ｃ１ｘＢｏｃ−（＞−Ｃｙｓ　ＣＨｔＣｌｚＢｏｃ− １１ｅＣＨ，Ｃｈ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ　１０％ＤＭＦ／ＣＨ２Ｃ１ｚＢｏｃ−（ＣＩ−Ｚ）−Ｌｙｓ　 ＣＨ２Ｃ１ｚＢｏｃ−Ｇｌｙ　ＣＨｘＣｌｔ Ｂｏｃ−（０−Ｂｚｌ）−３ｅｒ　ｃＨｉｃｔｔＢｏａ−（ＭｅＯＢｚｌ）−Ｃ ｙｓ　ＣＨｚＣｌｚＢｏｃ−Ｇｌｙ　ＣＨｚＣｌａ Ｂｏｃ−”１−ｒｐ　１０％Ｄ　Ｍ　Ｆ　／　ＣＨｚ　Ｃ］　ｚＢｏｃ　−Ｉ　 １　ｅ　ＣＨｔＣｈ ペプチドをフッ化水素酸中の１０％アニソールで樹脂から切断し、２０％酢酸水 で抽出した。この溶液を枦遇して固体樹脂を除去し、２０％酢酸水よりなる抽出 液でカラムを脱塩しながらＦ　ｒａｃｔｏｇｅｌ　Ｔ　Ｓ　ＫＨＷ−４０Ｆを通 塔した。２８０ｎｍで溶性の吸光度を示す両分を水中の０．１％トリフルオロ酢 ［（ＴＦＡ）で希釈し、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（４）で分 析した。２１４ｎｍでの吸光度の主要ピークを１２．４２分の保持時間を有する ものと決定した。このピークの７０％以上（ｇｒｅａｔｅｒ　ｔｂ龜ｎ　７０％ ）を含有するフラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　）画分を集めＦｒ：ｌと標識 した。このピークの５０％以上だが７０％より小（１ｅｓｓ　ｔｈａｉ　７０％ 　ｂｕｔ　ｇｒｅａｔｅｒｔｈａｎ　５０％）を含むフラクトゲル画分を集め、 Ｆｒ：２と標識した。

Ｆｒ：１についての分析ＨＰＬＣ（４）は全面積の８７％に１２．４２分のピー クを示した。Ｆｒ：１はさらにアミノ酸分析（５）、配列決定（６）及びペプチ ド含量％の決定（７）によって性格づけちれた。ペプチド配列分析（６）はペプ チドの予想配列を確認するためにペプチド−樹脂についても行われた。

（１）　Ｓｔｅｗａｒｔ　＆　Ｙｏｕｎｇ、　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐ ｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ（固相ペプチド合成）　、　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉ ｏｎ　（１９８４）、Ｐ　１ｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

（２）　Ｍｅｒｒｉｔｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ、　（１９６３）、　Ｊ、Ａｍｅｒ、 　Ｃｂｅａ。

Ｓｏｅ、８５、ｐｐ、２１４９−２１５４（３）　Ｂｏｃ−アミノ酸は全てＢａ Ｃ１，６ｓ　Ｉ　ｎｃ、、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、Ｃｍ１ｉｆ、より得られた。

（４）　ＨＰＬＣ分析条件 緩衝液Ａ：　０．１％ＴＦＡ／蒸留脱イオン水緩衝液Ｂ：　０．１％ＴＦＡ／Ｈ ＰＬＣ等級アセトニトリル勾配条件：　２０分でＢを１０％から５０％にする波 　長：　２１４ｎｍ 流　速：　１．Ｏｉ１／ｓｉｎ カラム：　Ｖｙｄａｅ　２１４ＴＰ５４　Ｃ−４タンパクカラム、２５０　ｘ　 ４．５ｍｍ （５）　ＬＫＢ４１５０　α−アミノ酸分析機によってアミノ酸を分析した。

（６）　へブチド配列決定は応用生物系４７０Ａタンパク配列決定機（ａｐｐｌ ｉｅｄ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７０Ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ ｒ）によった。

（７）　ペプチド含量は既知量のペプチドのアミノ酸分析による回収率からめた 。

（８）　Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルα−アミノ保護基の化学的 略称である。この官能基はアミノ酸をカップリングしてペプチド鎖を成長させた 後、５０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１５０％ジクロロメタン（ＣＨｔＣｌ　 ｔ）中で加水分解することによって除去し得る。この反応によって鎖のアミノ末 端がさらされ、次のアミノ酸が有効にカップリングできるようになる。

すべてのアミノ酸のＢｏｃ９Ａ護基に加え、ある種のアミノ酸の側鎖をペプチド 合成の化学による攻撃からさらに保護することができる。以下の説明文中に揚げ るこれらの保護基はペプチド合成の条件ですべて安定であり、しかもフッ化水素 酸中での切断によってアミノ酸から容易に除去される。アニソール（メチルフェ ニルエーテル）はＨＦ切断工程の問親核性のスカベンジャーとして働き、遊離し た保護基カルボニウムイオンによるペプチドのアルキルを防止する。揚げられた アミノ酸の保護基は以下のごとく定義される。

０−ベンジル：　ベンジル−エステル：セリン及びトレオニンのヒドロキシ側鎖 に結合してペプチド鎖のアシル化又は分岐化を防止する。

ＭｅＯｚｌ：　４−メトキシベンジル；システィンのメルカプト基に結合してペ プチド合成の間その酸化を防止する。

ＣＩ−Ｚ：　２−クロロベンジルオキシカルボニル：リジンのα−アミノ基に結 合してペプチドのこの部位からの側鎖の成長を防止する Ｃ　式（ｎ）のペプチドの重合 上記Ｂ項のＦｒ：１中に含有されるペプチドを凍結乾燥して酢酸を除き、０．１ Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ９，０）中に２００Ｍｇ／ｗｌとなるよう溶解 した１重炭酸ナトリウムＭＮ液で２０Ｍｇ／ｘ１に希釈したこのペプチドの既知 少量を用いて、第■表に示すエライザ用の微量力価穴（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　 ５ｅｌｌｓ）を塗布した。第１〜■表に示すテストのために、ペプチドを１０％ ｇ／ｍｌの濃度で水に溶解し、ついで微量力価穴を塗布するためにリン酸緩衝液 （ＰＨ７，３）で５Ｍｇ／ｄに希釈した。

Ｆｒ：１のペプチドは主として単一・の形態で存在し、酸化されなかったモノマ ーであると考えられる。しかしながら、式（ＩＩ）のペプチドは２つのシスティ ンを含有しているので、中性もしくは塩基性の水性Ｍ衝液中に溶解することによ って重合する。以下にと述のエライザで用いたペプチドはごく少量の線状モノマ ーと大量の環状モノマー（分子内ジスルフィド結合によって形成される）とさら に大量の種々の大きさのポリマー（分子間ジスルフィド結合において形成される ）の混合物である。それに拘束されることは望まないが、本発明者らはポリマー 形態がここに記述する反応性にとって重要な意義を有すると信する。一方環状モ ノマー形態はポリマー形態の抗原性を多少保持しているが、微量力価くぼみに結 合するのに有効性がより小さく、エライザの固相成分としての有用性はより小さ い、そのそう考えられる環状モノマーはＨＰＬＣ分析で保持時間的１２．７分で の鋭いピークとして表れ、他方ポリマーは保持時間的１５．９分での広いピーク として特徴づけられる。当業者にとって既知のことであるが、酸化条件は温度、 ｐＨ，ぺ１チド濃度等について変えることができ、それによって標品中に残存す るモノマー、環状モノマー及びポリマーの比や形成されるポリマーの大きさを変 えることができる。少量の、いわゆる欠点へブチド（ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｐｅｐ ｔｉｄｅｓ）　（１もしくはそれ以上のアミノ酸を欠く）及びその酸化体がエラ イザに用いるペプチド標品中に見い出されることがあるが、これらの微量不純物 はペプチドの使用に影響を与えない。

実施例　■ ペプチド（Ｍｌ）〜（ＸＩ）の合成及び性格づけこれらのペプチドの合成はペプ チド（Ｉ［）ニツイテ記述したと実質的に同じ古典的Ｍｅｒｒｉｅｌｄ技術を用 いて行われた。ペプチド（ＩＩＩ）については０．９２ｍｍｏｌ／ｙの置換度（ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）のＢｏｃ−セリンを用いた。ペプチド（■）につい ては０．８ｍｍｏｌ／Ｈの置換度のＢｏａ−イソロイシン樹脂を用いた。Ｂｏｃ −セリン樹脂及びＢｏｃ−イソロイシン樹脂の合成はＳｔｅｗａｒｔ　＆　Ｙｏ ｕｎｇ　（１）に記述されたＧ１５ｉｎ法によって行った。

Ａ　ペプチド（Ｉｌｌ）のペプチド配列ＩＷＧＣ３ＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡ Ｓを１２ｍｅｑ過剰の以下のＢｏｃ−Ｌ−アミノ酸を用いて合成した。

−二乙よ！遣りｍ−溶　媒 Ｂｏｃ−Ｖｉａ　ＣＨ２Ｃｌ１ Ｂｏｃ　−Ａｓｎ／Ｈｏｂｔ　ＤＭＦ Ｂｏｃ　−Ｔｒｐ　１０％ＤＭＦ／ＣＨ，ＣＩ！Ｂｏｃ−Ｐｒｏ　ＣＨｔＣｌｔ Ｂｏｃ−Ｖａ　Ｉ　ＣＨｘＣ１ｔ Ｂｏｃ−Ａｌａ　ＣＨｚＣｌｔ Ｂｏｃ−（０−Ｂｚｌ）−’Ｉ’ｈｒ　ＣＨｚＣｌｔＢｏｃ−（０−Ｂｚｌ）− Ｔｈｒ　ＣＨ２Ｃｌ。

Ｂｏａ−（ＭｅＯＢｚｌ）−Ｃｙｓ　ＣＨｚＣｌｔＢｏｃ−１１ｅ　ＣＨｔＣｌ ｔ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ　１０％ＤＭＦ／ＣＨ２Ｃ１＊Ｂｏｃ−（ＣＩ　−Ｚ）−Ｌｙｓ 　ＣＨ２Ｃ１ｚＢｏｃ−Ｇｌｙ’　ＣＨｚＣｌｚ Ｂｏｃ−（０−Ｂｚｌ）−８ｅｒ　ＣＨｚＣｌｔＢｏｃ−（ＭｅＯＢｚｌ）−Ｃ ｙｓ　ＣＨ２Ｃｌ２Ｂｏｃ−Ｇｌｙ　ＣＨ２Ｃ１ｘ Ｂｏｃ−Ｔｒｐ　１０％ＤＭＦ／ＣＨ２Ｃ１ｔＢｏｃ−１１ｅ　ＣＨ２Ｃｌ２ Ｂ　ペプチド（ＴＶ）のペプチド配列 ＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣ３ＧＫＬＩを１２ｍｅｑ過剰の以下のＢｏ ｃ−アミノ酸を用いて合成した。

−二−Ｌ４１　−混−−腹一− Ｂｏｃ−Ｌｅｕ　１０％Ｄ　Ｍ　Ｆ　／　ＣＨ２Ｃ１＊Ｂｏｃ−（ＣＩ−Ｚ）化 ｙ　ｓ　ＣＨ２Ｃ１ｔＢｏｃ−Ｇｌｙ　ＣＨ，Ｃ１゜ Ｂｏａ−（０−Ｂｚｌ）−３ｅｒ　ＣＨｔＣｌｔＢｏｃ−（ＭｅＯＢｚｌ）−Ｃ ｙｓ　ＣＨｘＣｌｔＢｏｃ−Ｇｌｙ　ＣＨ１Ｃ１ｚ Ｂｏｃ−Ｔｒｐ　１０％Ｄ　Ｍ　Ｆ　／　ＣＨ＊　Ｃ１＊Ｂｏｃ−１１ｅ　ＣＨ ，ＣＩ。

Ｂｏｃ−Ｇｌｙ　ＣＨｔＣＩｔ Ｂｏａ−１，ｅｕ　１０％ＤＭＦ／ＣＨ１ＣＩ２Ｂｏｃ−Ｌｅｕ　１０％Ｄ　Ｍ 　Ｆ　／　ＣＨｔ　Ｃ１２Ｂｏｃ−Ｇｌｎ／Ｈｏｂｔ　ＤＭＦ Ｂｏｃ−Ｇｉｎ／Ｈｏｂｔ　ＤＭＦ Ｂｏｃ−（Ｂｚｌ＞−ＡＳＰ、　ＣＨ２Ｃ１ｚＢｏｃ−（ＣＩ　−Ｚ）−Ｌｙｓ 　ＣＨ，Ｃ１ｔＢｏｃ−Ｌｅｕ　１０％ＤＭＦ／ＣＨｔＣ１２Ｂｏｃ−（Ｂｒ− Ｚ）−Ｔｙｒ　ＣＨｚＣｌｘＢｏｃ−（Ｔｏｓｙｌ）−Ａｒｇ　１０％ＤＭＦ／ ＣＨｚＣ１＊Ｂｏｃ−（Ｂｚｌ）−Ｇｌｕ　ＣＨｚＣｌｔＢｏｃ−Ｖａｌ　ＣＨ ２Ｃ１ｚ Ｂｏｃ−Ａｌａ　ＣＨｚＣｌｔ ペプチド（ＩＩ）については、各アミノ酸のＢｏｃ保護基に加え、ある種のアミ ノ酸の側鎖をさらにペプチド合成化学による攻撃から保護する。

ペプチド（ｎ）合成のアミノ酸について記述した保護基に加え、ペプチド（ＩＩ Ｉ）及び＜ｙ＞に独特なアミノ酸について以下の保護基を用いた。

Ｈｏｂｔ二　１−しドロキシベンゾトリアゾールカップリング中グルタミン及び アスパラギンと等モル用いてニチリル体への脱水を防する Ｔｏｓｙｌ：ｐ−トルエンスルホニル アルギニルの側鎖中のグアニジン基をアシル化するために用いる Ｂｚｌ：　β−ベンジルエステル アスパラギン酸及びグアニジン酸の側鎖のカルボキシル基を保護する ＢｒＺ：　２−ブロモベンジルオキシカルボニルチロシン側鎖のヒドロキシル基 を保護するペプチドを樹脂から切断し、濾過し、酢酸で抽出し、実施例■のよう なフラクトゲル脱塩カラムを通塔した。ペプチド＜ＩＶ）については、フラクト ゲル画分を分析用ＨＰＬＣで分析し、保持時間約１４分に移っている主要ピーク としての２１４ｎｍでの全吸収の少なくとも３０％を含有する画分を系めた。集 めた画分を０．０１Ｍ酢酸アンモニウム（４，４）で平衡化したカルボキシメチ ルセルロースを用いるクロマトグラフィーに付し、０．２Ｍ酢酸アンモニウムで 溶出する両分を集め、凍結乾燥し、分析用ＨＰＬＣで分析した。保持時間１４分 に移っている主要ピークは２１４ｎｍでの全吸収の３０％と４０％の間よりなっ ており、この物質は満足し得るアミノ酸含量を有していた。この物質を再溶解し 、ペプチド（ＩＩ）について記述したエライザに用いた。

ペプチド（ＩＩりについて、フラクトゲル画分を同様に分析用ＨＰＬＣで分析し た。保持時間的１２．９９分に移っている主要ピークとしての２１４ｎｍでの全 吸収の少なくとも７０％を含有する両分を集め、凍結乾燥し、ＨＰＬＣによって 、又アミノ酸含量について分析しな、この物質を再溶解し、ペプチド（Ｉｔ）で 記述したエライザのために用いた。

エライザにおける固相成分として組合せて用いる場合、ペプチド（Ｉ［［）各１ μ２及びペプチド（Ｎ）０．５μＳを微量力価穴あたり用いた。ペプチドは乾燥 して３７℃の穴にのせるか、平板上へ湿潤状態で詰め（ｗｅｔ　ｐｏｃｋｅｄ） 　４℃で一夜インキユベートするかした。

Ｃペプチド（Ｖ）については、Ｂｏｃ−セリン樹脂をペプチド（ＩＩＩ）の合成 で記述したようにして用いた。（■）の合成はペプチド（ＩＩ）のＣ末端インロ イシンの添加まで（ＩＩＩ）の合成と同様に進行させた。その点から、（Ｖ）の 配列の完成のために、ペプチド（ｆＶ）のＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧ配列中の アミノ酸の添加の操作を継続させた。

ペプチド（Ｖ）を樹脂から切断し、濾過し、酢酸で抽出し、実施例■に記述した フラクトゲル脱塩カラムを通塔した。２８０ｎｍでの吸収の主要ピークを含有す るフラクトゲル画分を薬め、Ｆｒ：１と標識した。

Ｆｒ：１のアミノ酸含量を分析したところ満足すべきものであった。この画分を 凍結乾燥し、ペプチド（Ｕ）に記述したエライザ用に供した。

Ｄ　同様の手順により、式（１）、（Ｖｌ）〜（ＸＭ）のペプチドを調製した。

Ｅ　ペプチド（ＩＩ）、（Ｎ＞及び（Ｖ）の重合ペプチド（１）〜（ＩＩＩ）、 （Ｖ）、及び（■）〜（Ｘ）は２つのシスティンを含有している。したがって、 これらのペプチドは酸化ジスルフィド結合によって重合し、又環化することがで きる、（Ｉｌｌ）のＣ末端の４つのアミノ酸の添加は明らかに、エライザアツセ イにおけるプラスチック樟結合する、環状形態のペプチドを可能にする。その結 果、環状形態の（ＩＩ）が面相エライザにおいて環状形態の（Ｉｔ）よりもより 有効になる。ＨＴＬＶ−１１［抗体認識をテストするためにエライザにおいてこ こまでに用いられてきたペプチド（Ｕ）、（ＩＩＩ）及び（Ｖ）の形態は代表的 には線状モノマー、環状モノマー、ダイマー、及びポリマーであった。

ペプチド（Ｎ）、（Ｖｌ）及び（ＸＩ）は１つのシスティンしか有さない、これ らのペプチドはジスルフィド結合によってダイマー構造をとることができる。

エライザ用にペプチドを可溶化する条件（例えば０．１Ｍ重炭酸ナトリウムＭ衝 液）下で、ペプチド（１）、（Ｉ）、（ｆｆ）及び（Ｖ）のメルカプト基はジス ルフィド形感に変えられた。

実施例　■ 比較用ペプチドの調製 以下の式を有する比較用ペプチドを実施例■及び■と同様の手法によって合成し た。

ＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹ　（Ｃ：１）、ＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧ　（Ｃ− １１）、ＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣ８（Ｃ−１［１）、ＩＷＧＣ３ＧＫＬＩ　（ Ｃ−ｆｆ）、及びＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮ　（Ｃ−■）。

これらのペプチドは各々ＨＴＬＶ−Ｉｆ外膜の配列に相当する配列を有している が、本発明の教示に従っていない、具体的には、式（Ｃ−１）及び（Ｃ−１１） を有するペプチドは式（Ｉ）、すなわちＣ３ＧＫＬ、ＩＣの配列のアミノ末端か ら上流の配列である１式（Ｃ−ＩＩ）を有するペプチドは式（１）の配列のアミ ノ末端部分のみを含有する０式（Ｃ−Ｗ）を有するペプチドはカルボキシ末端の Ｌ−システィン残基を除き、式（１）の配列のすべてを含有している０式（Ｃ− ■）を有するペプチドは式（１）の配列のカルボキシ末端の下流の配列である。

後記するごとく、これらのペプチドはいずれも目的とする免疫反応性を示さない 、実施例　■ エライザアセイキットの調製及び使用方法エライザノための手順＃ｌ（第Ｎ表） （１）　エライザ板を０　、１　Ｍ　Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ　（ｐ　Ｈ９）中＜７） へ７”＋　１’　ｒｆｉ布するＩ　Ｍ　９／　５０μＪＬ／ｗｅｌｌ（２）　平 板をカバーしない状態で３７℃で一夜乾燥させ、ついでＰＢＳで洗浄する （３）　平板を５％ＮＣ３−ＰＢＳ３００ｕｊ／ｗｅｌｌで３７℃で２時間ブロ ックし、 （４）　ブロッキングＭｔｌｌ液を振り出して、よく排出させる（５）　テスト する抗血清を５０μｊ／ｗｅｌｌ加えて３７℃で３０〜１２０分放置する（抗血 清を希釈する場合はＴ−ウォッシュ（Ｔ　−ｗａｓｈ　）を用いる）８本発明者 らは１：２〜１：１００希釈液を用いた。

（６）　テスト抗血清を振り出し、板をＰＢＳ−ツイーン２０で６回洗浄する （７）　Ｔ−ウォッシュで１：４０００に希釈した２番目の抗体を１００μｊ／ ｗｅ１１加え、３７℃で３０〜１２０分放置する。

（８）　２番目の抗体を振り出し、板をＰＢＳ−ツイーン２０で６回洗浄する （９＞　ＯＰＤ基質を１０（１１／ｗｅｌｌ　（またはＡＢＴＳ溶液５ｕｊ）を 加え、室温で２０分放置する （１０）４Ｎ　Ｈ２ＳＯ，を５０Ｊｊｊ／ｗｅｌｌ加えてＯＰＤ反応を停止させ る（ＡＢＴＳ反応のためには１％ＳＤＳを１００μｊ／ｗｅｌｌ添加） （１１）ＭＲ６００マイクロプレートエライザプレートリーダー（ＭＲ６００Ｍ ｉｃｏｒｐｌａｔｅ　ＥＬＩＳＡ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ）で板を読む（Ｏ ＰＤについては４９０ｎｍ、ＡＢＴＳについては４０５ｎｍ） 試薬 （１）　０．１Ｍ　ＮａＨＣＯｓ　ｐＨ９（２）　ＰＢＳ　＋　５％通常ウシ血 清（３）　Ｔ−ウォッシュ：　（７８０ａ＋ｆｆ１ＴＳＢ　＋　２０ｘｌ　ＮＣ ３÷１．６ｇＢＳＡ◆０．４ｗｌツイーン２０） ＴＢＳニドリス塩基１２．１１　ｙ、ＮａＣ１１７，５ｇ、水１８００ｉ１’を ＭＣＩ（約３Ｎ）でｐＨ７，６にし、最終的に２０００社とする。

（４）　洗浄用緩衝液／ＰＢＳ−ツイーン２０：　０．５ｍｌツイーン１０／１ １　ＰＢＳ （５）　ＯＰＤ基質：　ｌｏＰＤ錠剤／　３　ｄ　Ｈ２０／　１−２４μｍ３０ ％Ｈ２０□ （６）　４Ｎ　Ｈ２ＳＯ。

（７）　ＡＢＴＳ　：　Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓによって供給される溶液と容量比で１：１のＨ２Ｏ２ＡＢＴＳ ＝２．２’−アジノージ−［３−エチル−ベンズチアゾリンスルホン酸塩］ （８）　１％ＳＤＳ エライザ板に塗布するために工程１で用いた物質は上記したごとく式（ｉｔ）、 （ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）で示したペプチド又はのそ混合物である。第２の 抗体は商業上入手し得るパーオキシダーゼ標識ポリクロナール抗体（Ｃａｐｐｅ ｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　カタログＮｏ、３２０１〜０２３１；パーオキ シダーゼが複合した、ヤギ抗ヒト免疫グロブリンのＩｇＧ画分）又はパーオキシ ダーゼ標識マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体、又はパーオキシダーゼ標識 マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ抗体の混合物である。

エライザのための手順＃（第■〜■表）（１）　エサイサ板にペプチドを塗布す る０、１Ｍ炭酸塩緩衝液ＰＨ９，６２００μＥ中のペプチド（ＩＹ）８ｇ、ペプ チド（ＩＩＩ）０．５μｓを穴あたり２００μ！（２）　平板を４０℃で一夜イ ンキユベートする（３）　平板を１．０％ＢＳＡ−ＰＢＳプラス添加剤３００　 ｕ　ｌ　／ｅｅｌ　１で３７℃で２時間ブロックする （４）　ブロッキング１ｍ液を振り出す（５）　平板を３７℃で１，５時間乾燥 させる（６）　１％ウシγ−グロブリンー５％ＢＳＡ−０，５％ツイーン−ＰＢ Ｓ　（ｐＨ７，２＞を２００ＡＺｊｌ／ｗｅｌｌ加える（７）　テスト血清をｌ Ｏμｊ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で３０分インキュベートする （８）　テスト血清を振り出し、板をＰＢＳ−０，５ツイーンで５回洗浄する （９＞　５０％ウシ胎児血清−１％ウマ血清−０，５％ツイーン−ＰＢＳで１　 ：　３５００に希釈したモノクロール抗ヒトＩｇＧを２００μｍ／ｗｅｌｌ加え る （１０）　３７℃で３０分インキュベートする（１１）　テスト血清を振り出し 、板をＰＢＳ−０，０５％ツイーンで５回洗浄する （１２）ＯＰＤ基質を２００μｊ／ｗｅｌｌ加え、室温で３０分インキュベート する （１３）　４Ｎ　Ｈ２ＳＯ４を５０μｊ／ｗｅｌｌ加えて反応を停止させる（１ ４）　ＭＲ６００マイクロプレートリーダーを用いて４９０ｎｍで板を読む 試薬 （１）　リン酸塩Ｍ’ｌｆｌ化食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７，３塩化ナトリウム８． ０　ｇ　、−塩基性リン酸カリウム０．２ｇ、二塩基性リン酸ナトリウム１．１ ６ｙ、塩化カリウム０．２ｙ及びチメロサール０．２ｇを水で８００ｄとして混 合し、必要ならｐＨを調製し、水を加えて１ｊとする。

（２）　塗布用１ｉａｒ液ｐＨ９，６ ０、ＯＩＭ炭酸塩ＭｖＲ液 （３）　ブロッキング用緩衝液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳプラス添加剤）１％ウシ血 清アルブミン（Ｓｉｇｎａ　＃Ａ７０３０　）１０にμ／ｉｆアプロチニン（Ａ ｐｒｏｔｉｎｉｎ）１０μｙ／ｚ１１−リプシン阻害剤 １０ｎＭ　ＥＡＣＡ　（Ｅ−アミノカプロン酸）０．５ｍＭ　ＰＭＳＦ（フェニ ル−メチル−スルホニルフルオライド） ２．０ｍＭ　ＥＤＴＡ １０％グリセロール （４）　希釈剤標品 凍結乾燥したウシγ−グロブリン、分画■１０１、ウシアルブミン分画ｖ５ｏ、 ｏｇ及びポリソルベート２０（ツーイーン２０）　（ツイーン２０）０．５ｘｊ ！に水を加えて１１とし混合し、０．２μのが過器で枦遇する。

（５）　複合希釈剤 ＰＢＳ４９０ｘｆ、熱不活性化したウシ胎児血清！５００ｗ１、熱不活性化ウマ 血清１０１１、チメロサール０．１ｇ及びフェリジアン化カリウム０．３２９ｙ に水を加えて１１とし、混合し、０．２μのが過器で枦遇する。

実施例　■ 実施例■手順４に記述された、ペプチド（ｎ）ｅついて作成されたエライザキッ トを健康な被検者、ＡＩＤＳに関係ない疾患もしくは病気の患者、既知のエイズ 患者、既知のＡＲＣ患者、及び診断がはっきりしないが商業的テスト又はウェス タンプロットアッセイでは抗体陽性である患者からなる一部の血清について評価 した。結果を第１〜■表に要約する。比較のため、同じこれらの血清試料を商業 上利用できるキット及びウェスタンプロットアッセイにより分析した。これらの 研究に選んだ商業用キットはＡｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｏｒ ｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ、　ｍ及びＥｌｅｃｔｒｏ−Ｎｅｕｃｌｅｏｎｉｅｓ、ｌ ｉｅ、（ＥＮＩ）、　Ｃｏ１ｕｓｂｉａ、Ｍｄ、のものであった。

Ａ　第１表は正常の血清についての結果を示す。

第　１　表 ペプチド（Ｕ）を用いるエライザによる正常血清のアッセイ１９８　５−．１９ ４ＮＴ　４１−．１５６ＮＴ　正常１　−　正常／７４９ １　ＮＴ　ＮＴ　正常／２８４６ 正常の平均　Ｅ８アッセイについて０．０１６平均からの標準偏差（Ｓ、Ｄ、） 　０．０１７平均÷Ｓ、Ｄ、でのカットした値　０．１０４０．１０４をカット した２００ 試料中での誤った陽性の割合　０．５％（１／２００）ＮＴ　テストせず 上表から分かるごとく、ＮＴＬＶｌｎの抗体を含有しない血清は一般に漂準エラ イザにおいてペプチド（ｎ）と反応しない、このことは吸収力・ノド値の計算に ついて抗体陰性血清と抗体陽性血清との区別を可能にする。

２００の正常血清の上記アッセイ中、カット値０．１０４が選ばれた。

このカットオフで誤りの陽性の割合は０．５％より小さくなるか等しくなると考 えられる。

Ｂ　誤りの陽性を除去するために、式（ｎ）のペプチドを用いる方がウィルス分 解物を用いる商業上入手し得るキットを用いるよりもすぐれた有効性が得られる ことを示すために、２つのエイズと関係ない疾患、すなわち鼻咽頭癌及びリウマ チ様関節炎の患者からの多くの血清を本アッセイ及び商業上のテストによってテ ストした。結果を下記第Ｂ表に要約するが、本アッセイの増大した特異性を示し ている。商業テストでは誤った陽性を与えた多くの試料が本アッセイでは陰性と して正しく同定された。

第　■　表 鼻咽頭癌及びリウマチ様関節炎の患者に対するテストロ　（リ　ＮＴ　（リ　Ｎ ＰＣ／非エイズ１７　−　ＮＴ　（リ　ＮＰＣ／非エイズ８　−　Ｎ′ｒ　ＮＰ Ｃ／非エイズ １　−　ＮＴ　Ｎ”ｒ　ＮＰＣ／非エイズ７　−　２−．５ＮＴ　３−．４ＮＴ 　ＲＡ／　非エイズ（＋）　誤りの陽性　ＮＴ　テストせずＮＰＣ鼻咽頭癌　Ｒ Ａ　リウマチ様関節炎Ｃエイズ／ＡＲＣ患者血清中のＨＴＬＶ−１ｉｔ抗体の検 出のための本アッセイの商業用キットと比較しての有効性を示すために、実施例 ■−手順１に記述したエライザキットをエイズ及びＡＲＣと診断された患者から 獲られた一部の血清について評価した。第■表に要約した結果は本アッセイがＨ Ｔ　Ｌ　Ｖ−の抗体を含有する血清を同定する能力について商業用キットと同等 であることを示している。

第　■　表 エイズ／ＡＲＣ血清のアッセイ ６７　◆　◆（１６ＮＴ）　エイズ ２　（−）　（−）　（−）　エイズ１５３３．３６２１１　（−）　エイズ／ ６５３ −ス　（−）　（−）　（−）　ＡＢＣ１５１２，５２９（−）　誤りの陰性 ＡＲＣエイズ関連群（Ａｉｄｓ　Ｒｏｌａｔｏｄ　Ｃｏａ＋ｐｌｅｘ）Ｄ　現在 出回っているウィルス分解物を用いるキットが高い割合で誤った性格づけをする 理由の一部はエイズ及び非エイズ患者血清の両方に存在する抗体と反応する細胞 抗原（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｔｉｇｅｎｓ）が分解物中に存在することにある 。さらに、ＨＴＬＶ−Ｉｌｌのようなウィルスに由来する複合抗原のような複合 抗原は多くのエピトー１を含み、ヒト血清中に存在する抗体と非特異的に反応す る傾向がある０本ペプチド（Ｕ）は患者血清と反応するのに用いられる抗原の複 雑性を１又は恐らくわずかばかりのエピトープに減する。非ＨＴＬＶ−Ｉ抗体と の非特異的相互作用は大きく減じられるものと考えられる。非特異的相互作用は しかしながらまた起こり得る、というのはある種の抗体は粘着性でアッセイに用 いるプラスチック支持体や、ペプチドの添加後平板を遮断するために用いるウシ 血清アルブミンやヤギ血清のような他のタンパク質に結合することができるから である６種々の患者血清のアッセイに関するデータを以下の通常のアッセイに加 え、本発明者らは該血清試料を有効阻止量のペプチド（Ｕ）と混合した後、ペプ チド（ＩＩ）に対してアッセイした。商業的に入手し得るキットを用いて各試料 をアッセイした結果も同表に併せ示す。

Ｏｏ　ｏ　ｏ　ロ　Ｏ。

Ｘ 　ｘ ÷　＋ ＋　÷ これらの結果から、商業上入手し得るキットの一方もしくは両方によって陽性と 誤って同定された非エイズ血清試料がペプチド競合アッセイを用いて陰性として 正しく同定されたことが明らかである。さらに本アッ妄イ（ｔｈｅ　ａｓｓａｙ ）によって陽性と誤って同定された試料でさえもペプチド競合アッセイでは陰性 として正しく同定された。このように阻止（ｂｌｏｋｉｎｓ）アッセイすなわち 競合アッセイも又ＨＴＬＶ−Ｉｌｌの抗体を含有する血清試料のテストを確認す るアッセイとして役立つことは意義深いことである。第■表に示すごとくテスト した最後の７つの試料は本テスト、商業上利用し得るアッセイ（Ａｂｂｏｔｔキ ットの場合の２つの誤った陰性を除いて）及びウェスタンプロットアッセイのい ずれにおいても抗体陽性であった。これらの血清とペプチド（ｎ）との反応性が 血清とペプチド（ＩＩ）の混合によって有効に阻止されたが、このことはペプチ ドに対する抗体の反応性がペプチド特異的であってこれら最後の７の試料が真の 陽性であることを示している。

実施例　■ 実施例■−手順ｌに記述したエライザキットはペプチド（１）〜（ＸＶ）及びペ プチド（Ｃ−１）　〜（Ｃ−Ｖｌ）を用いて作成した。各エライザキットを臨床 的に陽性の試料、すなわち商業的アッセイ及びウェスタンプロットアッセイによ ってＨＴＬＶ−［１感染の症候を示した試料よりなる一部）０の血清について評 価した。結果を下記第７表に示す。

エライザテストの吸光度水準が２つの正常血清の吸光度の平均である背景水準の ２倍以上（ｓｏｒｅ　ｔｈｅｎ　ｔｗｉｃｅ）であるときへプチドアッセイは陽 性とした。「平均」は背景水準を減じた後に計算したエライザの平均光学密度を 表わす、［指標」は式（ＩＩ）のツペプチドの活性と比較しての、与えられたペ プチドの活性を示す、この指標は背景の通常応答の水準から区別されて正しく陽 性を示す特定のペプチドアッセイの能力を評価するように考慮されている、この 指標を尋く式は以下のごとくである。

（％陽性）゛・ｉ □　；指標 （（％溶性）■）′・Ｊ〒ｉ■ 式中、％陽性は個々のペプチドアッセイについての％陽性であり、平均は個々の ペプチドアッセイについての平均であり、％陽性■はペプチド（ＩＩ）のアッセ イについての％陽性であり、％平均■はペプチド（ＩＩ）のアッセイについての 平均である。

上表から分かるごとく、ペプチド（１）〜（ＸＶ）を用いたアッセイは少なくと も５０％の陽性結果を与え、又少なくとも０．１の指標を与えた。一方、比較断 片はいずれもＨＴＬＶ−Ｉｌｌ外膜からの、すぐ隣りの、重なり合う又は部分的 に重なり合う断片であるにも拘わらず、陽性結果又は高い指標を示していない。

実施例　■ 追加のエイズ／ＡＲＣ患者血清を２つの高反応性のペプチド（Ｉり及び（■）（ 実施例■−手［１）を用いるエライザアッセイによってテストした。これらの血 清のいくつかについての、吸光度値として表わした反応性を第■表に示す。

第　■　表 ３３６２　０．６０３　０．１５１ ３４１２　＞２．００　０．５４Ｏ Ａ、　３６９３　０．５５９　０．１２０３７２２　０．６２０　０．１９３ ０６４９　０．７５６　０．３７９ ３５４４　０．４２８　＞２．００ ３５７５　０．３５０　１．７７３ ３７４４　０．３１１　１．３２６ Ｂ、　３７９０　０．２２４　１．７６５０５０９　０．４０３　２．０００ ０６５３　０．１１１　０．９９９ ０６６２　０．３０１　１．３９２ ３４１６　１．９１４　＞２．００ ３４５６　１．６７０　１．７８０ Ｃ，３６６６＞２．００　＞２．００ ３４１４　１．４５３　１．０５７ ３４１１　＞２．００　＞２．００ ３４１３　＞２．００　＞２．００ 拳−φ軸Φ・・・−−・骨Ｈ＋−１Φ會φ令管嗜嚇争中−魯拳番曽中・・・−ｅ ｌ−・１１・φ令畢中龜管・畳・もｅ暢・・うｅ嗜・・ｅ・E・争・・Φ・・・ ｅ・嘩骨ｅ１ｅΦ一番―会１ｏｅ・俸・軸魯拳ｅｅ―雫テストした多くの血清が 両方のペプチドと非常によく反応した。このことは第■表Ｃ群でより多くみられ る。しかしながら時折ある試料は、第■表Ａ及びＢ群でみられるごとく一方に対 し他方よりはるかによく反応した。このデータはエイズウィルスにさらされた患 者に共通に見い出されるこの３２にアミノ酸領域中に１より多い（ｍｏｒｅ　ｔ ｈａｎ　ｏｎｅ）エピトープ（例えば線状及び配座エピトープ）があることを示 している。

ペプチド（Ｉｌｌ）及び（ＩＶ）の溶液中での高性能液体クロマトグラフィー（ ＨＰＬＣ）分析はペプチド（Ｉ［［）の多くが環状モノマーとして存在し、ペプ チド（ｍＶ）が大部分ダイマーとして存在することを示している。ジスルフィド 結合によって、これら２つのペプチドに付与された構造特性が配座エピトープの 抗原提示及び創造の両方に関与するものと考えられる。

実施例　■ ペプチド（ＩＩＩ）及び（ｆＶ）中に１より多いエピトープがあるという別の証 拠が競合研究から導かれる。その−例の結果を第■Ａ表に示す、この研究ではへ ブチド（Ｉｎ）及び（Ｎ）の両方を固定化抗原として同じ微量力価平板に塗布し 、エライザアッセイを５つの異なった条件下に行った：競合なし、過剰のペプチ ド（Ｍｌ）との競合、過剰のペプチド（ＩＶ）との競合、過剰の両ペプチドでの 競合、過剰のＸ種ペプチドとの競合。

競合は微１カ価六に血清試料を加える直前に、その希釈血清に上記ペプチドを加 えることによって行った。

かかる条件で、ある試料が該ペプチドの一方又は両方と非常によく反応すること が明らかである０例えば試料３４１６は両ペプチドとよく反応する。というのは ペプチド（ＩＩＩ）との競合が光学密度（ＯＤ）〉１．８を与え、ペプチド（ｆ ｆ＞との競合がＯＤｌ、０５５を与え、両競合ペプチドの存在においてはＯＤは 本質的に背景水準まで下降するからである。他の血清試料例えば３４１２は一方 のペプチドに対して他方よりはるかに強く反応する。すなわち３４１２の場合、 ＯＤはペプチド（Ｉｌｌ）で阻止すると〉１．４から０．１１３に減じるがペプ チド（ＩＶ）で競合しても〉１を支持する。しかしながら、両方のペプチドの存 在下では免疫反応性は完全になくなる（０．０５９）ので、ペプチド（履）との 反応性がある程度あることは確かである。

平板上にペプチド（１）を用いる別の競合研究は、ペプチオ（Ｎ）はペプチド（ １）と有効に競合しないが、ペプチド（Ｉｌｌ）は非常に有効に競合することを 示している（下記の第■Ｂ表参照）。

第　■Ｂ　表 ムペプ　ドの １１　ＪｕｉＬ　±■−ＩＸＩ−１広Ｌ　Ｌ−１０１３１，１７７０，０３８０ ，０４６０，７７００，８６５０１４０，３８３０，０５００，０６７０，２７ ３０，３２４これらの分析から、ペプチド（ＩＩ）中に存在するエピトープはペ プチド（１）にも存在′し、このエピトープがペプチド（Ｎ）のエピトープと実 質的に異なっていると考えられる。さらに、この同じ試料に基づいていえば、事 実上すべての血清が、多くの場合一方のペプチドに対して他方より強く反応する けれども、べ１チド（Ｉ［Ｉ）及び（Ｎ）上のエピトープと反応する。

実施例　■ 固相抗原としてペプチド（ＩＩＩ）　１μｓ及びペプチド（Ｗ）０．５μｓの組 合せを用いるエライザアッセイ（実施例■−手順２）の特異性及び感度はテスト したいずれの商業上入手し得るウィルス分解物抗体検出キットによるそれらと同 等又はすぐれていた。

第■表は患者血清、正常血清、及びリウマチ様関節炎、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）　、 Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス感染症、サイトメガロウィルス感染症、グラ ム陰性敗血症、トキソプラズマ症、全身性紅斑性腺値及びヘルペスウィルス感染 症を含む種々の病気群からの血清を用いて得たエライザ結果を示す。

真正の正常血清を（Ｉｌｌ）／（Ｎ）アッセイ及びＥ　１ｅｃｔｒｏｎｕｃｌｅ ｎｉｃｓ。

Ｉ　ｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ　（Ｅ　Ｎ　Ｉ　）のアッセイでの反応性について テストしたところ、（Ｉ［［）／（ｆｆ＞ペプチドアッセイは著しく低い誤りの 陽性率を示した。すなわち第１表に示されるごとく、ＥＮＩについての誤りの陽 性率は１．６５％（１２／７２８）であるのに対し、（ＩＩ）／（！Ｖ）ペプチ ドアッセイでの誤りの陽性率はわずか０，５５％（４／７２８）であった６種々 の病気についての誤りの陽性率は本ペプチドアッセイはＥＮＩアッセイよりわず かに低かった、すなわち１．８１％対２．５８％（７／３８７対１０／３８７） 。

上記実施例は本発明の目的を例示するために提示したのであって、本発明を減縮 するものではない０本発明の範囲は以下の請求の範囲によってのみ定義される。

国際調査報告

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．ＣＳＧＫＬＩＣ、 ＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰ、 ＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ、ＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧ ＣＳＧＫＬＩ、ＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷ ＮＡＳ、 ＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩ、ＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣ、 ＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ、ＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴ ＴＡＶＰＷＮ、ＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ、 ＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ、 ＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣ、ＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶ ＰＷＮ、 ＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫ、及びＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷ ＧＣＳよりなる群から選はれる配列を含む合成ペプチド、その抗原往で免疫的な 断片、及びその製薬上もしくは診断上許容し得る塩。
2. ２．式ＣＳＧＫＬＩＣを有する請求の範囲第１項記載の合成ペプチド。
3. ３．式ＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰを有する請求の範囲第１項記載の合成ペ プチド。
4. ４．式ＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳを有する請求の範囲第１項記載 の合成ペプチド。
5. ５．式ＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩを有する請求の範囲第１ 項記載の合成ペプチド。
6. ６．式ＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳを 有する請求の範囲第１項記載の合成ペプチド。
7. ７．式ＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩを有する請求の範囲第１項記載の合 成ペプチド。
8. ８．式ＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣを有する請求の範囲第１項記載の合皮ペプチ ド。
9. ９．式ＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳを有する請求の範囲 第１項記載の合成ペプチド。
10. １０．式ＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮを有する請求の範囲第１項記載の 合成ペプチド。
11. １１．式ＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳを有する請求の範囲第１項記載の合 成ペプチド。
12. １２．式ＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳを有する請求の範囲第１項記載の合成 ペプチド。
13. １３．式ＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣを有する請求の範囲 第１項記載の合成ペプチド。
14. １４．式ＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮを有する請求の範囲第１項記載の合成 ペプチド。
15. １５．式ＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫを有する請求の範囲第１項記載の合成 ペプチド。
16. １６．式ＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳを有する請求の範囲第１ 項記載の合成ペプチド。
17. １７．重合体の形態にある請求の範囲第１項記載のペプチド。
18. １８．単独の各ペプチドに比べＨＴＬＶ−ＩＩＩの抗体に対する高められた認識 を有する２以上のペプチドの混合物であって；該混合物はＨＴＬＶ−ＩＩＩウイ ルスｇｐ４１タンパク配列の部分に相同のアミノ酸残基配列を含有する２以上の ツペプチドから選ばれてなり、その際該ペプチドの第１がＨＴＬＶ−ＩＩＩウイ ルスｇｐ４１タンパク配列の部分ＣＳＧＫＬＩＣを含有してなり、そして該ペプ チドの第２が配列ＺＬＬＧＸＷＺ′（式中、ＸはＩ、Ｌ、Ｍ又はＦよりなる群か ら選ばれ；ＺはＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスｇｐ４１タパクの５９９番目の位置に あるＬ−ロイシン残基のアミノ側に直ちに隣接するｇｐ４１タンパクのアミノ酸 残基配列から選はれ；Ｚ′はＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスｇｐ４１タンパクの６０ ３番目の位置のＬ−トリアトファン残基のカルボキシ側に直ちに隣接するｇｐ４ １タンパクのアミノ酸残基配列から選ばれ；ＺもしくはＺ′の一方は残基長０で もよいが、ＺとＺ′とを合わせて少なくとも１０残基よりなる）を含有してなる 、ことを特徴としてなる混合物。
19. １９．該最初のペプチドがＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ、ＧＣＳＧ ＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮ及びＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳよりなる群から 選ばれ、第２のペプチドがＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩ及び ＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＸＷＧＣＳＧＫＬＩＣよりなる群から選ばれる請求 の範囲第１８項記載のペプチド混合物。
20. ２０．最初のペプチドがＩＷＧＣＳＧＫＬｌＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳよりなり、第 ２のペプチドがＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＸＷＧＣＳＧＫＬ１よりなる請求の 範囲第１９項記載のペプチド混合物。
21. ２１．Ｘが１である請求の範囲第２０項記載の混合物。
22. ２２．最初のペプチドがＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮよりなり、第２のペプ チドがＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＸＷＧＣＳＧＫＬＩよりなる請求の範囲第１ ９項記載のペプチド混合物。
23. ２３．ＸがＩである請求の範囲第２２項記載の混合物。
24. ２４．ＨＴＬＶ−ＩＩＩの抗体を含有する疑いのある流体中の該抗体を検出又は 定量する方法であって、 ａ）固体表面に付着させた少なくとも１つの請求の範囲第１項記載のペプチドを 準備し、 ｂ）このペプチド被覆固体表面とテスト流体とを免疫反応が起こるに十分な時間 接触させ、ついで、 ｃ）該固体の表面上のこのペプチド又は抗原断片に結合した抗体の存在を検出す るか又は抗体の量を定量する、ことを特徴とする方法。
25. ２５．検出又は定量の工程が該表面と標識した抗ヒト免疫グロブリンとを接触さ せることを包含する請求の範囲第２４項記載の方法。
26. ２６．ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルの抗体を製造する方法であって、重合化するか及 び／又は適当な免疫抗原性担体に付着させた、免疫原的に有効な量の少なくとも １種の請求の範囲第１項記載のペプチドによって動物を免疫化し、ついで該動物 から採血することを特徴とする方法。
27. ２７．ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスに対して動物を免疫化する方法であって、重合 化するか及び／又は免疫原的に有効な担体に付着させた、免疫原的に有効な量の 少なくとも１種の請求の範囲第１項記載のペプチドを該動物に非経口的に投与す ることを特徴とする方法。
28. ２８．潜在的な又は現実のＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルス感染症を有する動物を治療 する方法であって、重合化するか及び／又は免疫原的に有効な担体に付着させた 、免疫原的に有効な量の少なくとも１種の請求の範囲第１項記載のペプチドを該 動物に非経口的に投与することを特徴とする方法。
29. ２９．ＨＴＬＶ−ＩＩＩの抗体を検出もしくは定量するための診断用キットであ って、（ａ）少なくとも１種の請求の範囲第１項記載のペプチドを結合した固体 表面、及び（ｂ）標識した抗ヒト免疫グロブリンを含有してなることを特徴とす るキット。
30. ３０．重合化するか及び／又は免疫原的に有効な抗体に付着させた、免疫原的に 有効な量の少なくとも１種の請求の範囲第１項記載のペプチドを含有してなる治 療用又は予防用組成物。
31. ３１．ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルス又はウイルス特異的抗原を含有する疑いのある 流体中の該ウイルス又は抗原を検出Ｘは定量するサンドイッチ方法であって、 ａ）固体表面に付着させた少なくとも１種の請求の範囲第１項記載のペプチドに 対する抗体を準備し、 ｂ）この抗体被覆固体表面とテスト流体とを免疫反応が起こるに十分な時間接触 させ、ついで ｃ）固体表面上のこの抗体に結合した、ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルス又はウイルス 特異性抗原の存在を検出するか又はその量を定量する、ことを特徴とする方法。
32. ３２．ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルス又はウイルス特異的抗原を含有する疑いのある 流体中の該ウイルス又は抗原を検出又は定量する競合方法であって、 ａ）少なくとも１種の請求の範囲第１項記載のペプチドの抗体であって、固体表 面に付着させたものを用意し、ｂ）既知の少量の、テストすべき流体と既知の量 の標識された該ペプチドとを混合して混合試料をつくり、ｃ）固体被覆固体表面 と該混合試料とを免疫学的反応が起こるにに十分な時間接触させ、 ｄ）固体表面を該混合試料から分離し、ｅ）固体表面に結合したか、又は該混合 試料中に残存する標識ペプチドの存在を検出するか又はその量を定量し、ついで ｆ）工程ｅ）の結果から、該流体中の該ウイルスもしくは抗原の存在もしくは量 を決定する、 ことを特徴とする方法。
33. ３３．ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルス又はウイルス特異性抗原を検出又は定量するた めの診断用キットであって、 ａ）少なくとも１種の請求の範囲第１項記載のペプチドに対する抗体を結合させ た固体表面、及び ｂ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ウイルス特異性抗原又は請求の範囲第１項記載のペプチ ドに対する、既知量の標識された抗体を含有してなることを特徴とするキット。
34. ３４．ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体を含有する疑いのある流体試料の該抗体についての テストにおいて、陽性結果の正確性を判定する方法であって該テストは組換えＨ ＴＬＶ−ＩＩＩタンパク又は合成ＨＴＬＶ−ペプチド又はその抗原断片を固体表 面に付着させたサンドイッチアッセイであり、そして該方法は、 ａ）既知少量の該試料と有効阻止量の該組換えＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパク又は合 成ＨＴＬＶ−ＩＩＩペプチド又はその抗原断片とを混合して混合試料とし、 ｂ）該混合試料と該テストの固体相とを免疫反応が起こるに十分な時間接触させ 、 ｃ）該混合試料中の該抗体と該固体相との結果が、該ペプチド、断片もしくはタ ンパクの不存在下での該結合と比較して阻害されているかどうかを決定し、つい で ｄ）該阻害の存在又は不存在に基づいて、陽性結果の正確性を判定する、 工程よりなることを特徴とする方法。
35. ３５．ＨＴＬＶ−ＩＩＩの抗体を定量又は検出し、陽性結果を判定するための診 断用キットであって、 ａ）請求の範囲第１項記載のペプチドを結合させた固体表面、ｂ）有効防止量の 請求の範囲第１項記載の該ペプチド、及びｃ）標識した抗ヒト免疫グロブリン よりなることを特徴とするキット。
36. ３６．ＨＴＬＶ−ＩＩＩのモノクロナール抗体を製造する方法であって、ａ）重 合形態の、Ｘは適当な免疫原性担体に付着させた請求の範囲第１項記載のペプチ ドで宿主動物を免疫化し、ｂ）該免疫化した動物をから脾臓細胞を単離し、ｃ） 該脾臓細胞と適当なミエローマ細胞系とを融合し、ｄ）該免疫化用ペプチド、Ｈ ＴＬＶ−ＩＩＩ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ感染細胞に対する反応性によって融合細胞 を選択し、ｅ）選択したハイブリドーマをインビトロで培養するか、スは適当な 宿主中に注入し、そして ｆ）培養したハイブリドーマの上清液、又は注入した宿主の血清もしくは腹水か ら目的とするモノクローナル抗体を回収することを特徴とする方法。