JPS63502904A - 合成htlv−3ペプチド、その組成物及び用途 - Google Patents
合成htlv−3ペプチド、その組成物及び用途Info
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- JPS63502904A JPS63502904A JP62502267A JP50226787A JPS63502904A JP S63502904 A JPS63502904 A JP S63502904A JP 62502267 A JP62502267 A JP 62502267A JP 50226787 A JP50226787 A JP 50226787A JP S63502904 A JPS63502904 A JP S63502904A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
合成HTLV−Illペプチド、その組成物及び用途技術分野
本発明は合成ペプチドに監視、さらに詳しくはエイズ(AIDS)及びARCと
して知られる症候群に病因上関連するHTLV−i[又はHTLV−Ill様ウ
ィルスによって生産されるタンパク質の一部もしくはタンパク質に似せた合成ペ
プチドに関する。
背景技術
後天性免疫不全症候群(エイズ)は1981年米国で最初に認識された。米国で
の症例数はそれ以来的10か月ごとに倍増している。米国では1981年以来エ
イズ症例が約16.000報告されており、その約半数はすでに死亡している。
この病気の予想される結果はいつも決まって死である、というのは現在のところ
この病気の猛威を遅らせ又は防止する有効な治療法が知られていないからである
。この病気の最初は同性愛もしくは両性愛の男性や静脈内投与薬物濫用者に見い
出されたが、今や汚染針の共用やウィルス保有者との個人的な性的接触やウィル
ス保有者からの血液製剤の受領によって他の人々鎧まで広がってきている。
エイズと関連する病因的因子はヒトTm胞白血病つィルス■型(Hu@an T
−cell Lymphotropie Viruses−type I)(H
TLVIII)、ヒト免疫不全ウィルス(Human Iwunodefice
ncy Virus)(HIV)、多発性リンパ節病変ウィルス(Lyi*ph
oaderopathy Viruses) (LAV)又はエイズ関連ウィル
ス(A I DS −Re1ated Viruses) (ARV)として知
られる一部の関連レトロウィルスであることが同定された。
エイズは血液製剤によって伝染することができるので、この病気が見い出された
当初から感染ウィルスに特異的な抗体もしくは高原で血液を検査する診断テスト
の開発が試みられてきた。この分野の努力が実を結び、1985年の終わりまで
に5つの会社がHTLV−Illウィルスに対いずれも培養された、HTLV−
III感染T−リンパ球から得られるウィルスタンパク質を使用して抗体を検出
するものである。培養細胞から得られるウィルスは破壊され(例えば洗剤で)J
流体(ウィルス分解物(viral Iysate)という)が得られる。この
分解物(種々の、ウィルスタンパク質断片を含む)を代表的には免疫測定の固相
成分として用いる。
(ELISA)方式であり、その方式では面相成分(ウイスルス分解物をその上
に析出させである)をHTLV−II抗体を含有する疑いのある血液もしくは血
清と接触させる。抗体が存在すると、ウィルス分解物と結合し、非結合物質を洗
浄除去後、酵素標識抗ヒト免疫グロブリンと接触させる。SC議された抗体は面
相に付着するヒト抗体のいずれとも結合する。従ってHTLV−It抗体テスト
の特異性はウィルス分解物によって授与される。
これらのテストにより血P&製剤を通してのHTLV−1ウイルスの伝染が大幅
に減少したけれども、ウィルス分解物によるこれらのテストはいくつかの重大な
欠点を有している。
まず第1に、ウィルス分解物は生存しているHTLV−Itウィルスに感染した
細胞から生産されているので、それを製造する人々が製造中に感染スる恐れがあ
る。又、ウィルスが破壊工程に耐えて生残し、診断テスト中に使用者に感染する
恐れが少なくとも理論上あり得る。
第2の欠点は分解物を得ることが困難なこと、及び処理工程、又はウィルス分解
物を得るのに用いる感染細胞の性質が多岐に亘ることにより、得られる分解物の
性質が多岐に亘ることである。
第3番目の、そしてはるかに深刻で実際的な欠点はこの現在のテストによって実
質的数の誤った陽性の、そしてより少ない程度に誤った陰性の判断がなされるこ
とである。現在までに、ウィルス分解物エライザテストが実質数の誤った陽性の
結果を生じたことはよく認識されている[Hastings Center R
eport、 5pecial 5upple@ent/August1985
、題“AIDS;The Emerging Ethical Dile論mm
s”エイズ;生じつつある処方上のレジマ)参照〕、その9頁に以下の記載があ
る。
「 しかしながら、エライザテストは感受性であるほどには特異的でなく、すな
わち、健康な血液提供者の群において100のテストにつき1という多い割合で
溶性となる。これらから、100のうち90は誤った陽性となる6国の単位では
年に800万の血液提供のうち40,000は誤って陽性となる。」誤って陽性
となる原因の一端は現在のアッセイのための固相成分中に用いられるウィルス分
解物標品中に非ウィルス性タンパク質が存在することにあると考えられる。
上記報告書はさらに誤って陽性とすることを排除するためにウェスタンプロット
確認法(i Western blot confirsatory test
) (エライブ法より高価で技術的により難しい)を行うべきであるとしている
。ウェスタンプロットアッセイそれ自体誤差がありまた主観的解釈によるので、
HTLV−pi抗体の簡単でかつ客観的な確認法がめられている・誤って陰性と
される原因の一端はアッセイの性質、この病気の免疫抑制的性質又はHTLV−
mlウィルスとの接触(Exposure )と抗体の発達との間の潜伏期間に
あると考えられるが、誤った陰性も又問題がある。
現在の方法のさらなる欠点はHTLV−mlウィルスの抗体だけを検出し、ウィ
ルスそれ自体またはウィルス抗原それ自体を検出しないことである。陽性の結果
はそれゆえテストされた被検者が一度HTLV−1ウィルスにさらされ、抗体を
発達させたことを示すのみであって、現に感染しているかどうか、感染力を有す
るかどうかまたはエイズを有しているかどうかについての結論を示すものではな
い、改訂された( Centerfor D 1sease Controlの
エイズの定義によれば(1985年6月)、HTLV−IIIに対する血清抗体
について陰性で、低い数のT−ヘルパーリンパ球もしくは低いT−ヘルパー/チ
ーサプレッサーリンパ球比を有していない患者はエイズ症例から除外されること
に注目すべきである。
現在の方法は結論的な診断値となり得ないのにも拘わらず、ウィルス汚染血液の
検出はもとより感染者(あからさまなエイズに進行し、又他人に病気を伝染させ
る恐れがあると考えられる人)の検出のために用いられている。商業的に利用で
きる抗体テストで陽性とされる人々のうち実質的な人が臨床的に症候を示さない
のみならず、(明らかに)他人に感染させることができないので、現在のテスト
には誤って人をエイズ保有者として認定し、社会的、心理的影響を招来する実質
的危険性がある。
現在の分解物依存テストの欠点の多くはウィルス分解物をウィルス感染細胞に由
来しない物質に代えることによってなくすことができる。そのような物質として
は例えばウィルス特異的合成ペプチド又は組換え微生物(代表的にはE、コリ(
E、 coli) )に由来するウィルス特異的ペプチドがあり得る。
後者のアプローチに関する研究はRobert C,Ga1lo 及び共同研究
者によって、Biotechnology、vol、3. pages 905
−909(October、 1985)、5cience、vol、228.
pages 93゜96 (April 5. 1985) 、及びNatu
re、vol 、315 + p@ges151−154 (May 9.19
85)をはじめとする種々の最近の論文において報告されている。これらの研究
者らは組換えE、コリ技術によって生産された。HTLV−mlウィルスのEN
N領域の遺伝子断片によってコード化されている82アミノ酸ペプチドを同定し
た。このペプチドはHTLV−11ウイルスの抗体によって認識される。より最
近、ジェネンテック(Geaentech)グループはGa1ioグループの8
2アミノ酸ペプチドを含有する102アミノ酸ペプチドについての研究を報告し
た[Biotechnology、vol、 4. oe@es 128°13
B (February。
1986)1 。
合成ペプチド技術はさらζ明らかな利点(例えば特異性、純度、製造容易性等)
を提供するにも拘わらず、この分野の研究は殆どなかった。
実際、かかる研究(関して本発明者らが知っている公表はthe FifthA
nnual Congress for Recombinant DNA R
e5earch、February 3−6.1985におけるD’+no D
ina 博士及び共同研究者による講演のみである。その講演の要旨は種々の合
成ペプチドを(1)エイズ患者における免疫応答を測定するため及び(2)動物
における抗血清を高めるために使用することを示しているが、用いる特異的ペプ
チドについては開示していない、しかも講演それ自体においても、特異的ぺ1チ
ドは同定されておらず、又いずれかのペプチド又はペプチドの組合せがすべての
もしくは大部分の既知の陽性の血清をu微できたという指摘もされなかった。1
985年2月のその講演以来本願が依存する親特許出願を提出する日まで、本発
明者らは合tHTLV−11ペプチドについてのその研究グループもしくは他の
グループによる公表に接していない、その後1986年8月にWaHらによる公
表、Proe、 Natl。
Aead、Sci、、U、S、A、、<1986)83:615’L6163が
あった。
HTLV−IIタンパク質の一部をうまく似せ、もってHTLV−IIIの抗体
の検出とHTLV−1itウイルスもしくはウィルス抗原を認識する抗体の生産
の両方に有用である合成ペプチドは当業界に大きな進歩をもたらすであろう0本
発明はかかるペプチド、かかるペプチドを含有する組成物、これらのペプチドの
使用方法、及び治療及び診断用組成物を提供する0本発明はさらに抗ペプチド抗
体、かかる抗体を含有する組成物、及びかかる抗体及び組成物の使用方法も提供
する。
発明の開示
本発明は)ITLV−mlウィルスのgp41外膜(ENV)タンパク中の残基
配列(resiclus 5equences)に相当する、各々少なくとも7
つのアミノ酸残基の配列を有する合成ペプチドを提供する。かかるペプチドは在
来ウィルス(native virus)それ自身の免疫特性に似ていることが
見い出され、以下の群から選ばれる:C3GKLIC(1)
IWGC8GKLICTTAVP (n)IWGC5GKLICTTAVPWN
AS (It)AVERYLKDQQLLGIWGC3GKLI HV)AVE
RYLKDQQLLGIWGC3GKLICTTAVPWNAS (V)
LKDQQLLGIWGC3GKLI (Vl)LLGIWGC3GKLIC(
■)
QQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS (■)IWGC3GKL
ICTTAVPWN (IX)C3GKLICTTAVPWNAS (X)SG
KLICTTAVPWNAS 01)AVERYLKDQQLLGIWGC3G
KLIC(■)GC3GKLICTTAVPWN (Xll+)LKDQQLL
GIWGC3GK (X■)RILAVERYLKDQQLLGIWGC3(X
V)これらのペプチドはエイズ/ARC患者からのHTLV−1!I抗体陽性血
清及び診断未定の抗体陽性血清の大部分によって認識される。さらに、これらの
ペプチドは誤った陽性を生ずることは殆どない、実質上すべてのHTLV−I+
抗体陽性血清によって認識される好ましいペプチドは式(II) 〜(Vl)、
(■)、(X) 、及び(xI)〜(x■)ノヘフチトテある。
この知見は、HTLV−n[外膜タンパクの部分に相当する他のペプチドがHT
L’/−Il!ウィルスの抗体を選択的に認識するのに有効でない事実に照らし
、非常に驚くべきことである。
本発明はさらにHTLV−1i!ウイルスの抗体の認識が、上記ペプチドを特定
の選択処方に従って組み合わせることによって有意に高められるという知見によ
っている。さらに詳しく述べると、その第1のペプチドがgp41タンパク質配
列
C3GKLIC(1)
WO金含有る、2もしくはそれ以上の上記ペプチドを選択することによって認識
が高められることが見い出された。この第1のペプチドは好ましくは少なくとも
これらの7つのアミノ酸残基を含有し、さらに好ましくは式(1)の配列を含む
、gp、41タンパク質からの少なくとも12のアミノ酸残基配列を含有する。
ペプチドの組合せはそのペプチドが少なくとのもLLG(X)W (X■)
(式中、Xは1.L、MもしくはFよりなる群から選ばれる)のアミノ酸残基配
列を含有する、少なくとも第2のペプチドを含有する。注意するべきは、Xがg
p41タンパク質の602位に相当し、かつXがIのときは式(XA)配列がg
p41タンパク質の599〜603位に相当することである。一方、gp41タ
ンパク質の臨界領域におけるHIV単離物の配列比較の研究から、この602位
のIをり、M又はFと代えても抗原的には等価であると考えられた。この第2の
ペプチドは式(X[Vl >の配列を含むことに加え、さらにgp41タシパク
質中に見い出される配列中、全部で少なくとも15のアミノ酸残基を含有する。
換言すれば第2のペプチドは配列
ZLLGXWZ’
(式中、XはI、L、M又はFよりなる群から選ばれ;ZはHTLVウィルスg
p41タンパク質の599番目の位置のし一ロイシン残基のアミノ側に直接隣接
した、gP41タンパク質のアミノ酸残基配列から選ばれ;Z′はHTLV−1
1ウイlレスgp41タンパク質の603番目の位置のL−)リプトファン残基
のカルボキシ側に直接隣接した、gP41タンパク質のアミノ酸残基配列から選
ばれ:ZもしくはZ′の一方は残基長0でもよいが、ZとZ′とを合わせて少な
くとも10残基を含む)よりなる。
ペプチド(IV)もしくは(XI)とペプチド(I)、(Xll) モL<は(
X)との組合せが特に好ましい、ペプチド(1)と(■)、又は(Xll)(W
)の組合せが中でもより抜きの組合せである。
これらの結果から、HTLV−It抗体と反応する、HTLV−IIウィルスの
有意な抗原決定基が上記式(1)の配列よりなる7つのアミノ酸残基ペプチドに
含まれることが明らかである。さらに、これらのペプチドはそれぞれ大部分のH
TLV−1陽性血清と反応するが、個々の患者の血清はこれらのペプチドの1つ
と特異的に反応し他とは特異的に反応しないことが見い出された。この観察は式
(1)の配列を含むより長いペプチド、例えばペプチド(11)〜(XI)中に
追加の抗原決定基が存在することを示している、ペプチド合成に携わる通常の研
究者にとってこれらのペプチド断片を調製し、その中の抗原性及び免疫原性断片
を決定することは容易である。従ってかかる抗原性及び免疫原性断片は本発明の
一部であると解されるべきである。さらに、当業者は又、HTLV−■外膜タン
パクの部分に相当するより長いペプチドであって本教示に従うペプチドも本発明
の実施に際し同様に機能することを認識するであろう、従って、かかるより長い
ペプチドも本発明の一部であると解されるべきである。
本発明のペプチドは少なくとも1つのシスティン残基を含み、ある場合にはシス
ティン残基を2個含む、従って、本ペプチドは種々の酸化形態で存在することが
できる。システィン残基のメルカプト基が還元状態にあるモノマー形態に加え、
2もしくはそれ以上のペプチド分子上のメルカプト基が酸化されてジスルフィド
結合を形成したダイマーもしくはポリマー形態も存在し得る。1つのシスティン
残基しか含まない本ペプチドは線状ダイマーしか形成しえないが、2つのシステ
ィン残基を有する本ペプチドは環状モノマーとしても、線状もしくは環状ダイマ
ーとしても又種々の長さの線状ポリマーとしても存在し得る。これらの種々の酸
化形態は本発明の一部であると考えられ、1本ペプチド」の中に包含本発明はさ
らに、本発明の1もしくはそれ以上の合成ペプチドを用いてHTLV−1[抗体
を検出もしくは定量する方法、及びかかる合成ペプチドを用いるHTLV−1抗
体検出もしくは定量用診断キットを提供する。かかる抗体を含有している疑いの
ある流体(例えば血液、血清、証票、唾液もしくは尿)中のHTLV−Illの
抗体を検出もしくは定量する本発明方法は以下のa)、b)及びC)の工程より
なる。
a) 少なくとも1つの本ペプチドもしくはその抗原性断片を固体表面に付着さ
せる、
b) このペプチド被覆固体表面とテスト流体とを免疫反応が起こるに十分な時
間接触させる、
C) このペプチドもしくは抗原性断片に結合した、抗体の存在を検出するが、
抗体の量を定量する
用いる検出方法によっては、工程b)の後、固体表面を流体から分離し、固体表
面物質から未結合物質を洗い落とすことが好ましい、採用する検出方法は臨海的
でないが、酵素標識抗ヒト免疫グロブリンが好適であることが見い出来れた。こ
の方法を実施するための本診断用キットはそれに結合した少なくと611i]i
の本ペプチド又はその抗原性断片を有する固体表面、及び標識されたく好ましく
は酵素標識された)抗ヒト免疫グロブリンよりなる。抗体を標識するための他の
常用の物質、例えばとオチン、放射性同位元素も用いることができる。
本発明はさらにHTLV−1[1ウイルス又はウィルス抗原の検出のために有用
な抗ペプチド抗体を製造する方法を提供する。すなわちかがる方法は重合化形態
の、もしくは適当な免疫原性担体に付着させた、本ペプチドもしくはその免疫原
性断片で宿主動物を免疫化することよりなる。
)(TLV−Illのポリクローナル抗体を製造する方法は重合化形態の、もし
くは適当な免疫原性担体に付着させた、少なくとも18!の本ペプチドもしくは
その免疫原性断片で宿主動物を免疫化し、ついで宿主動物から採血することより
なる。HTLV−IIIのモノクローナル抗体を製造する方法は重合化形態の、
もしくは適当な免疫原性担体に付着させた、少なくとも1種の本ペプチドもしく
はその免疫原性断片で宿主動物を免疫化し、免疫化した宿主からpIia細胞を
単離し、該牌臓細胞と適当なミエローマ細胞系と融合し、融合細胞を免疫化誘起
ペプチドもしくは断片、HTLV −Ill、又は)(TLV−1ll−感染細
胞との反応性によって選択し、ついで選択したハイブリドーマをインビトロで培
養するが、適当な宿主中に注入することよりなる。目的のモノクローナル抗体は
培養されたハイブリドーマについての上清、又は接種された宿主の血清もしくは
腹水から回収することができる。
抗ペプチド抗体それ自体、該抗体を用いるNTLV−Illウィルス検出方法、
及び該抗体(HTLV−Illウィルス検出に有用である)含有診断用キットも
又本発明に包含される。
)1TLV−1!Iウイルスもしくは抗原を含有する疑いのある流体中の該ウィ
ルスもしくはウィルス特異的抗原を検出もしくは定量するためのサンドイッチ方
法は次のa)、b)及びC)の工程よりなる:a) 少なくとも1種の本ペプチ
ドもしくはその免疫原性断片の抗体であって、固体表面に付着させるものを用意
する、b) 該固体被覆固体表面とテストすべき流体とを免疫学的反応が起こる
に十分な時間接触させる
C) 固体表面上の抗体に付着したHTLV−Illウィルス又はウィルス特異
的抗原の存在を検出し、又はその量を定量する採用する検出方法によっては、工
程b)のあと、固体表面を処理流体から分離し、そこから未結合物質を洗浄する
のが好ましい。
HTLV−111ウイルスもしくは抗原を含有する疑いのある流体中の該ウィル
スもしくはウィルス特異的抗原を検出もしくは定量する完全な方法は次のa)〜
f)の工程よりなる:
a) 少なくともINの本ペプチド又はその免疫原性断片の抗体であって、固体
表面に付着させたものを用意する、b) 既知の少量の、テストすべき流体と既
知の量の標識された本ペプチドとを混合して混合試料をつくる、C) 抗体被覆
固体表面と混合試料とを免疫学的反応が起こるに十分な時間接触させる、
d) 固体表面を混合試料から分離する、C) 固体表面に結合したか、混合試
料中に残存するmwtペプチドの存在を検出するかその量を定量する、
f) 工程e)の結果から、流体中の該ウィルスもしくは抗原の存在もしくは量
を決定する
サンドイッチもしくは完全方法によるHTLV−IIウィルス検定もしくは定量
のための診断用キットは
a) 少なくとも1種の本ペプチドもしくはその免疫原性診断の抗体を結合させ
た固体表面、及び
b) HTLV−II、ウィルス特異的抗原、本ペプチド、又はその免疫源性断
片に対する、既知量の標識された抗体(サンドイッチアッセイのため):又は既
知量の標識された本ペプチド(競合アッセイのため)
よりなる。
本発明はさらに本ペプチドの予防的及び治療的適用をも含む、かかる適用の1つ
として、本発明は動物に免疫原的に有効な量の、重合化形態の、もしくは免疫原
的に有効な担体に付着させた少なくともINの本ペプチドもしくはその免疫原性
断片を非経口的に投与することよりなる、HTLV−IIIウィルスに対し動物
を免疫化する方法を包含する0本発明の治療的適用の第2の面として、本発明は
潜伏性のもしくは現実のHTLV−DIウィルス感染症にかかつている動物に、
HTLV−1itウイルス感染症を治療するに有効な量の、重合化形態の、もし
くは免疫原的に有効な担体に付着させた少なくとも1種の本ペプチドもしくはそ
の免疫原性断片を非経口的に投与することよりなる、該動物を治療する方法を包
含する。さらに別の療法的適用において、本ペプチドに対して作成された抗体は
毒性のもしくは医療物質と結合させたり、感染細胞に指向させることができる0
本発明の療法的側面の最後は、免疫原量の、重合化形態の、もしくは免疫原的に
有効な担体に付着させた少なくとも1種の本発明のペプチドもしくはその免疫原
性断片よりなる、上記方法にいずれにおける使用にも適当な組成物(compo
sition of matter)に関する。
本ペプチド、その抗原性断片又は組換えHTLV−Illタンパクは又本ペプチ
ドテストもしくは組換えHTLV−IIIタンパクを用いるテストの特異性を改
善し、もってより国難なウェスタンプロット確認テストへの依存を減するために
用いることができる0本ペプチドテストもしくは組換えタンパクテストでの陽性
の性格性は有効阻止(blocking)量の本ペプチド、その抗原性断片又は
組換えHTLV−IIIタンパクの存在下に該テストをくり返すことによって確
認することかできる。もしそう思われているHTLV−Ill抗体の平板(th
e plate )への結合が加えたペプチド、断片もしくはタンパクによって
阻止されるなら、もとの陽性の結果が確認され、他方もし結合が阻止されないな
らもとの結果は誤りのく非特異的な)陽性ということになる。
本発明は従ってHTLV−III抗体を含有する疑いのある流体試料の該抗体に
ついてのテストであって、組換えHTLV−IIIタンパク又は合成HTLV−
IIIペプチドを固体表面に付着させたサンドイッチアッセイであるテストの陽
性結果の正確性を判定する、次のa)〜b)の工程より、なる方法をも包含する
:
a) 既知少蓋の該試料と有効阻止量の本ペプチド、その抗原性断片もしくは組
換えHTLV−Illタンパクとを混合して混合試料とする、
b) 混合試料と該テストの固体相とを免疫反応が起こるに十分な時間接触させ
る、
C) 該混合試料中の抗体と固体相との結合が、該ペプチド、断片もしくはタン
パクの不存在下での結合と比較して阻害されているかどうかを決定する、
d) 阻害の存在又は不存在に基づいて陽性結果の正確性を判定する本ペプチド
、断片もしくはタンパクについて「有効阻止量」とはテストされる試料中に存在
する該ペプチド、断片もしくはタンパク中に含有される抗原決定基に対して指向
するHTLV−1[抗体と実質上完全に反応し、かくしてこれらの抗体とアッセ
イの固体表面上のペプチド又はタンパクとの反応を実質上阻止する量を意味する
。このサンドイッチアッセイはエサイブ法が好ましい。
本ペプチドは既成技術(’DNA技術及び液相合成技術をはじめとする)によっ
て製造することができるが、固相Merrifield型合成が本ペプチドを製
造、単離するのに手ごろな方法である。この技術のさらなる記述及び他の当業界
既知の技術についての記述がM、 Bodanszky、 atal、、 Pe
ptide 5ynthesis、 John Wiley & 5ons、
5econdEdition、1976をはじめ当業者に知られた他の参考文献
中に見られる1合成技術(’DNA技術になし)が生産物の純度、抗原特異性、
好ましくない副生物の不存在、生産の容易性等の観点から好ましい、かかる合成
で用いられる適当な保護基及びその省略は上記テキスト、及びJ、 F、 W、
McOnie、”Protective Groups rn Organi
c Ch6mistry”、Plenu論Press、 New York、1
973に見い出される。これらの本を参考として本発明に加入させる。
本ペプチドを抗ペプチド抗体の発生のため、又は治療形態の本ペプチドの製造の
ために付着させる代表的な担体は、例えばウシ血清アルブミン;破傷目トキソイ
ド;キーホール リンピットヘマシアニン(keyh。
le li*ip he+5acyanin) ;ブタ、ウシもしくはウマの免
疫グロブリン:及びコレラしくはE、コロ熱不安定性毒素B−サブユニットを含
有する。
本発明の治療そせいぶつの調製にあたって、重合化形態の、もしくは適当な抗原
性担体に付着させた本ペプチドもしくは断片を活性成分として、非経口的に受容
できる医療担体とよく混合する。この担体は通常、殺菌水であるが、溶解補助剤
や保存剤(例えばチメロザール(thimerosal)やメチルパラベン(s
athyl parabens) )も用いることができる。
注射し得る懸濁液として調製してもよく、この場合適当な液体担体、懸濁剤等を
使用する。これらの組成物は又チモペンチン(Thy+*opentin)やイ
ンタアーロイキン■のような免疫促進剤、又は水酸化アルミニウムやB、C,G
、のような他のアジュバントを含有していてもよい。
本ペプチドの構造はアミノ酸のための通常の一文字コード(single −1
etter codes)によって示された、右から左に配列のアミノからカル
ボキシ方向に相当するものとして読まれる。読者の便宜のため、本ペプチド中に
含まれるアミノ酸の一文字コードを以下に示す:■ イソロイシン W トリプ
トファンG グリシン CL−システィン
SL−セリン KL−リジン
LL−ロイシン T L−)レオニン
AL−アラニン VL−バリン
PL−プロリン DL−アスパラギン酸NL−アスパラギン EL−グルタミン
酸RL−アルギニン YL−チロシン
QL−グルタミン ML−メチオニン
FL−フェニルアラニン
本発明を以下実施例によって説明する。
実施例 I
A Boa−プロリン樹脂の合成
1.3meqクロライド/i樹脂を含有するクロロメチル化したスチレン−ジビ
ニルベンゼン重合体を無水N、N−ジメチルホルムアニド(DMF)生触媒とし
てのヨウ化カリウム(KI)を用いてBOC−プロリンでエステル化した0反応
は55℃で24時間行なった(1)。
Boa−プロリンの置換は脱ブロックしな(deblocked)樹脂部分につ
いてのピクリン酸アッセイにより定垣したところ0.92mmol e/gであ
った。
B ペプチド(it)の合成及び性格づけ式(n)のペプチドの合成を古典的M
errifiedld技術(2)を用いて行った。ペプチド配列IMGC3GK
LICTTAVPをVega250C自動ペプチド合成装置上でダブルカップル
プログラム(doublecouple program)を用いて合成した。
1.8362yのBoa−プロリン樹脂を12meq過剰の以下のBoa−L−
アミノ酸(3,8)を用いて連続的にダブルカップリング反応させた。
79ノ数−一 −並−J−
Boa−Vat CH2C1t
Boc −A l a CH2C1t
Boa−(0−Bzl)−Thr CHtClzBoc−(0−Bz 1)−T
hr CH2C1xCH2C1xBoc−(>−Cys CHtClzBoc−
11eCH,Ch
Boc−Leu 10%DMF/CH2C1zBoc−(CI−Z)−Lys
CH2C1zBoc−Gly CHxClt
Boc−(0−Bzl)−3er cHicttBoa−(MeOBzl)−C
ys CHzClzBoc−Gly CHzCla
Boc−”1−rp 10%D M F / CHz C] zBoc −I
1 e CHtCh
ペプチドをフッ化水素酸中の10%アニソールで樹脂から切断し、20%酢酸水
で抽出した。この溶液を枦遇して固体樹脂を除去し、20%酢酸水よりなる抽出
液でカラムを脱塩しながらF ractogel T S KHW−40Fを通
塔した。280nmで溶性の吸光度を示す両分を水中の0.1%トリフルオロ酢
[(TFA)で希釈し、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)(4)で分
析した。214nmでの吸光度の主要ピークを12.42分の保持時間を有する
ものと決定した。このピークの70%以上(greater tb龜n 70%
)を含有するフラクトゲル(Fractogel )画分を集めFr:lと標識
した。このピークの50%以上だが70%より小(1ess thai 70%
but greaterthan 50%)を含むフラクトゲル画分を集め、
Fr:2と標識した。
Fr:1についての分析HPLC(4)は全面積の87%に12.42分のピー
クを示した。Fr:1はさらにアミノ酸分析(5)、配列決定(6)及びペプチ
ド含量%の決定(7)によって性格づけちれた。ペプチド配列分析(6)はペプ
チドの予想配列を確認するためにペプチド−樹脂についても行われた。
(1) Stewart & Young、 5olid Phase Pep
tide 5ynthesis(固相ペプチド合成) 、 2nd editi
on (1984)、P 1erce Chemical Co。
(2) Merritield、 R,B、 (1963)、 J、Amer、
Cbea。
Soe、85、pp、2149−2154(3) Boc−アミノ酸は全てBa
C1,6s I nc、、Torrance、Cm1if、より得られた。
(4) HPLC分析条件
緩衝液A: 0.1%TFA/蒸留脱イオン水緩衝液B: 0.1%TFA/H
PLC等級アセトニトリル勾配条件: 20分でBを10%から50%にする波
長: 214nm
流 速: 1.Oi1/sin
カラム: Vydae 214TP54 C−4タンパクカラム、250 x
4.5mm
(5) LKB4150 α−アミノ酸分析機によってアミノ酸を分析した。
(6) へブチド配列決定は応用生物系470Aタンパク配列決定機(appl
ied biosystems 470A protein 5equence
r)によった。
(7) ペプチド含量は既知量のペプチドのアミノ酸分析による回収率からめた
。
(8) Bocはtert−ブチルオキシカルボニルα−アミノ保護基の化学的
略称である。この官能基はアミノ酸をカップリングしてペプチド鎖を成長させた
後、50%トリフルオロ酢酸(TFA)150%ジクロロメタン(CHtCl
t)中で加水分解することによって除去し得る。この反応によって鎖のアミノ末
端がさらされ、次のアミノ酸が有効にカップリングできるようになる。
すべてのアミノ酸のBoc9A護基に加え、ある種のアミノ酸の側鎖をペプチド
合成の化学による攻撃からさらに保護することができる。以下の説明文中に揚げ
るこれらの保護基はペプチド合成の条件ですべて安定であり、しかもフッ化水素
酸中での切断によってアミノ酸から容易に除去される。アニソール(メチルフェ
ニルエーテル)はHF切断工程の問親核性のスカベンジャーとして働き、遊離し
た保護基カルボニウムイオンによるペプチドのアルキルを防止する。揚げられた
アミノ酸の保護基は以下のごとく定義される。
0−ベンジル: ベンジル−エステル:セリン及びトレオニンのヒドロキシ側鎖
に結合してペプチド鎖のアシル化又は分岐化を防止する。
MeOzl: 4−メトキシベンジル;システィンのメルカプト基に結合してペ
プチド合成の間その酸化を防止する。
CI−Z: 2−クロロベンジルオキシカルボニル:リジンのα−アミノ基に結
合してペプチドのこの部位からの側鎖の成長を防止する
C 式(n)のペプチドの重合
上記B項のFr:1中に含有されるペプチドを凍結乾燥して酢酸を除き、0.1
M重炭酸ナトリウム緩衝液(PH9,0)中に200Mg/wlとなるよう溶解
した1重炭酸ナトリウムMN液で20Mg/x1に希釈したこのペプチドの既知
少量を用いて、第■表に示すエライザ用の微量力価穴(microtiter
5ells)を塗布した。第1〜■表に示すテストのために、ペプチドを10%
g/mlの濃度で水に溶解し、ついで微量力価穴を塗布するためにリン酸緩衝液
(PH7,3)で5Mg/dに希釈した。
Fr:1のペプチドは主として単一・の形態で存在し、酸化されなかったモノマ
ーであると考えられる。しかしながら、式(II)のペプチドは2つのシスティ
ンを含有しているので、中性もしくは塩基性の水性M衝液中に溶解することによ
って重合する。以下にと述のエライザで用いたペプチドはごく少量の線状モノマ
ーと大量の環状モノマー(分子内ジスルフィド結合によって形成される)とさら
に大量の種々の大きさのポリマー(分子間ジスルフィド結合において形成される
)の混合物である。それに拘束されることは望まないが、本発明者らはポリマー
形態がここに記述する反応性にとって重要な意義を有すると信する。一方環状モ
ノマー形態はポリマー形態の抗原性を多少保持しているが、微量力価くぼみに結
合するのに有効性がより小さく、エライザの固相成分としての有用性はより小さ
い、そのそう考えられる環状モノマーはHPLC分析で保持時間的12.7分で
の鋭いピークとして表れ、他方ポリマーは保持時間的15.9分での広いピーク
として特徴づけられる。当業者にとって既知のことであるが、酸化条件は温度、
pH,ぺ1チド濃度等について変えることができ、それによって標品中に残存す
るモノマー、環状モノマー及びポリマーの比や形成されるポリマーの大きさを変
えることができる。少量の、いわゆる欠点へブチド(deletion pep
tides) (1もしくはそれ以上のアミノ酸を欠く)及びその酸化体がエラ
イザに用いるペプチド標品中に見い出されることがあるが、これらの微量不純物
はペプチドの使用に影響を与えない。
実施例 ■
ペプチド(Ml)〜(XI)の合成及び性格づけこれらのペプチドの合成はペプ
チド(I[)ニツイテ記述したと実質的に同じ古典的Merrield技術を用
いて行われた。ペプチド(III)については0.92mmol/yの置換度(
substitution)のBoc−セリンを用いた。ペプチド(■)につい
ては0.8mmol/Hの置換度のBoa−イソロイシン樹脂を用いた。Boc
−セリン樹脂及びBoc−イソロイシン樹脂の合成はStewart & Yo
ung (1)に記述されたG15in法によって行った。
A ペプチド(Ill)のペプチド配列IWGC3GKLICTTAVPWNA
Sを12meq過剰の以下のBoc−L−アミノ酸を用いて合成した。
−二乙よ!遣りm−溶 媒
Boc−Via CH2Cl1
Boc −Asn/Hobt DMF
Boc −Trp 10%DMF/CH,CI!Boc−Pro CHtClt
Boc−Va I CHxC1t
Boc−Ala CHzClt
Boc−(0−Bzl)−’I’hr CHzCltBoc−(0−Bzl)−
Thr CH2Cl。
Boa−(MeOBzl)−Cys CHzCltBoc−11e CHtCl
t
Boc−Leu 10%DMF/CH2C1*Boc−(CI −Z)−Lys
CH2C1zBoc−Gly’ CHzClz
Boc−(0−Bzl)−8er CHzCltBoc−(MeOBzl)−C
ys CH2Cl2Boc−Gly CH2C1x
Boc−Trp 10%DMF/CH2C1tBoc−11e CH2Cl2
B ペプチド(TV)のペプチド配列
AVERYLKDQQLLGIWGC3GKLIを12meq過剰の以下のBo
c−アミノ酸を用いて合成した。
−二−L41 −混−−腹一−
Boc−Leu 10%D M F / CH2C1*Boc−(CI−Z)化
y s CH2C1tBoc−Gly CH,C1゜
Boa−(0−Bzl)−3er CHtCltBoc−(MeOBzl)−C
ys CHxCltBoc−Gly CH1C1z
Boc−Trp 10%D M F / CH* C1*Boc−11e CH
,CI。
Boc−Gly CHtCIt
Boa−1,eu 10%DMF/CH1CI2Boc−Leu 10%D M
F / CHt C12Boc−Gln/Hobt DMF
Boc−Gin/Hobt DMF
Boc−(Bzl>−ASP、 CH2C1zBoc−(CI −Z)−Lys
CH,C1tBoc−Leu 10%DMF/CHtC12Boc−(Br−
Z)−Tyr CHzClxBoc−(Tosyl)−Arg 10%DMF/
CHzC1*Boc−(Bzl)−Glu CHzCltBoc−Val CH
2C1z
Boc−Ala CHzClt
ペプチド(II)については、各アミノ酸のBoc保護基に加え、ある種のアミ
ノ酸の側鎖をさらにペプチド合成化学による攻撃から保護する。
ペプチド(n)合成のアミノ酸について記述した保護基に加え、ペプチド(II
I)及び<y>に独特なアミノ酸について以下の保護基を用いた。
Hobt二 1−しドロキシベンゾトリアゾールカップリング中グルタミン及び
アスパラギンと等モル用いてニチリル体への脱水を防する
Tosyl:p−トルエンスルホニル
アルギニルの側鎖中のグアニジン基をアシル化するために用いる
Bzl: β−ベンジルエステル
アスパラギン酸及びグアニジン酸の側鎖のカルボキシル基を保護する
BrZ: 2−ブロモベンジルオキシカルボニルチロシン側鎖のヒドロキシル基
を保護するペプチドを樹脂から切断し、濾過し、酢酸で抽出し、実施例■のよう
なフラクトゲル脱塩カラムを通塔した。ペプチド<IV)については、フラクト
ゲル画分を分析用HPLCで分析し、保持時間約14分に移っている主要ピーク
としての214nmでの全吸収の少なくとも30%を含有する画分を系めた。集
めた画分を0.01M酢酸アンモニウム(4,4)で平衡化したカルボキシメチ
ルセルロースを用いるクロマトグラフィーに付し、0.2M酢酸アンモニウムで
溶出する両分を集め、凍結乾燥し、分析用HPLCで分析した。保持時間14分
に移っている主要ピークは214nmでの全吸収の30%と40%の間よりなっ
ており、この物質は満足し得るアミノ酸含量を有していた。この物質を再溶解し
、ペプチド(II)について記述したエライザに用いた。
ペプチド(IIりについて、フラクトゲル画分を同様に分析用HPLCで分析し
た。保持時間的12.99分に移っている主要ピークとしての214nmでの全
吸収の少なくとも70%を含有する両分を集め、凍結乾燥し、HPLCによって
、又アミノ酸含量について分析しな、この物質を再溶解し、ペプチド(It)で
記述したエライザのために用いた。
エライザにおける固相成分として組合せて用いる場合、ペプチド(I[[)各1
μ2及びペプチド(N)0.5μSを微量力価穴あたり用いた。ペプチドは乾燥
して37℃の穴にのせるか、平板上へ湿潤状態で詰め(wet pocked)
4℃で一夜インキユベートするかした。
Cペプチド(V)については、Boc−セリン樹脂をペプチド(III)の合成
で記述したようにして用いた。(■)の合成はペプチド(II)のC末端インロ
イシンの添加まで(III)の合成と同様に進行させた。その点から、(V)の
配列の完成のために、ペプチド(fV)のAVERYLKDQQLLG配列中の
アミノ酸の添加の操作を継続させた。
ペプチド(V)を樹脂から切断し、濾過し、酢酸で抽出し、実施例■に記述した
フラクトゲル脱塩カラムを通塔した。280nmでの吸収の主要ピークを含有す
るフラクトゲル画分を薬め、Fr:1と標識した。
Fr:1のアミノ酸含量を分析したところ満足すべきものであった。この画分を
凍結乾燥し、ペプチド(U)に記述したエライザ用に供した。
D 同様の手順により、式(1)、(Vl)〜(XM)のペプチドを調製した。
E ペプチド(II)、(N>及び(V)の重合ペプチド(1)〜(III)、
(V)、及び(■)〜(X)は2つのシスティンを含有している。したがって、
これらのペプチドは酸化ジスルフィド結合によって重合し、又環化することがで
きる、(Ill)のC末端の4つのアミノ酸の添加は明らかに、エライザアツセ
イにおけるプラスチック樟結合する、環状形態のペプチドを可能にする。その結
果、環状形態の(II)が面相エライザにおいて環状形態の(It)よりもより
有効になる。HTLV−11[抗体認識をテストするためにエライザにおいてこ
こまでに用いられてきたペプチド(U)、(III)及び(V)の形態は代表的
には線状モノマー、環状モノマー、ダイマー、及びポリマーであった。
ペプチド(N)、(Vl)及び(XI)は1つのシスティンしか有さない、これ
らのペプチドはジスルフィド結合によってダイマー構造をとることができる。
エライザ用にペプチドを可溶化する条件(例えば0.1M重炭酸ナトリウムM衝
液)下で、ペプチド(1)、(I)、(ff)及び(V)のメルカプト基はジス
ルフィド形感に変えられた。
実施例 ■
比較用ペプチドの調製
以下の式を有する比較用ペプチドを実施例■及び■と同様の手法によって合成し
た。
QLQARILAVERY (C:1)、AVERYLKDQQLLG (C−
11)、LKDQQLLGIWGC8(C−1[1)、IWGC3GKLI (
C−ff)、及びLICTTAVPWNASWSN (C−■)。
これらのペプチドは各々HTLV−If外膜の配列に相当する配列を有している
が、本発明の教示に従っていない、具体的には、式(C−1)及び(C−11)
を有するペプチドは式(I)、すなわちC3GKL、ICの配列のアミノ末端か
ら上流の配列である1式(C−II)を有するペプチドは式(1)の配列のアミ
ノ末端部分のみを含有する0式(C−W)を有するペプチドはカルボキシ末端の
L−システィン残基を除き、式(1)の配列のすべてを含有している0式(C−
■)を有するペプチドは式(1)の配列のカルボキシ末端の下流の配列である。
後記するごとく、これらのペプチドはいずれも目的とする免疫反応性を示さない
、実施例 ■
エライザアセイキットの調製及び使用方法エライザノための手順#l(第N表)
(1) エライザ板を0 、1 M N a HCOs (p H9)中<7)
へ7”+ 1’ rfi布するI M 9/ 50μJL/well(2) 平
板をカバーしない状態で37℃で一夜乾燥させ、ついでPBSで洗浄する
(3) 平板を5%NC3−PBS300uj/wellで37℃で2時間ブロ
ックし、
(4) ブロッキングMtll液を振り出して、よく排出させる(5) テスト
する抗血清を50μj/well加えて37℃で30〜120分放置する(抗血
清を希釈する場合はT−ウォッシュ(T −wash )を用いる)8本発明者
らは1:2〜1:100希釈液を用いた。
(6) テスト抗血清を振り出し、板をPBS−ツイーン20で6回洗浄する
(7) T−ウォッシュで1:4000に希釈した2番目の抗体を100μj/
we11加え、37℃で30〜120分放置する。
(8) 2番目の抗体を振り出し、板をPBS−ツイーン20で6回洗浄する
(9> OPD基質を10(11/well (またはABTS溶液5uj)を
加え、室温で20分放置する
(10)4N H2SO,を50Jjj/well加えてOPD反応を停止させ
る(ABTS反応のためには1%SDSを100μj/well添加)
(11)MR600マイクロプレートエライザプレートリーダー(MR600M
icorplate ELISA plate reader)で板を読む(O
PDについては490nm、ABTSについては405nm)
試薬
(1) 0.1M NaHCOs pH9(2) PBS + 5%通常ウシ血
清(3) T−ウォッシュ: (780a+ff1TSB + 20xl NC
3÷1.6gBSA◆0.4wlツイーン20)
TBSニドリス塩基12.11 y、NaC117,5g、水1800i1’を
MCI(約3N)でpH7,6にし、最終的に2000社とする。
(4) 洗浄用緩衝液/PBS−ツイーン20: 0.5mlツイーン10/1
1 PBS
(5) OPD基質: loPD錠剤/ 3 d H20/ 1−24μm30
%H20□
(6) 4N H2SO。
(7) ABTS : Kirkegaard and Perry Labo
ratoriesによって供給される溶液と容量比で1:1のH2O2ABTS
=2.2’−アジノージ−[3−エチル−ベンズチアゾリンスルホン酸塩]
(8) 1%SDS
エライザ板に塗布するために工程1で用いた物質は上記したごとく式(it)、
(III)、(IV)、(V)で示したペプチド又はのそ混合物である。第2の
抗体は商業上入手し得るパーオキシダーゼ標識ポリクロナール抗体(Cappe
l Laboratories カタログNo、3201〜0231;パーオキ
シダーゼが複合した、ヤギ抗ヒト免疫グロブリンのIgG画分)又はパーオキシ
ダーゼ標識マウスモノクローナル抗ヒトIgG抗体、又はパーオキシダーゼ標識
マウスモノクローナル抗ヒトIgG、IgA及びIgM抗体の混合物である。
エライザのための手順#(第■〜■表)(1) エサイサ板にペプチドを塗布す
る0、1M炭酸塩緩衝液PH9,6200μE中のペプチド(IY)8g、ペプ
チド(III)0.5μsを穴あたり200μ!(2) 平板を40℃で一夜イ
ンキユベートする(3) 平板を1.0%BSA−PBSプラス添加剤300
u l /eel 1で37℃で2時間ブロックする
(4) ブロッキング1m液を振り出す(5) 平板を37℃で1,5時間乾燥
させる(6) 1%ウシγ−グロブリンー5%BSA−0,5%ツイーン−PB
S (pH7,2>を200AZjl/well加える(7) テスト血清をl
Oμj/well加え、37℃で30分インキュベートする
(8) テスト血清を振り出し、板をPBS−0,5ツイーンで5回洗浄する
(9> 50%ウシ胎児血清−1%ウマ血清−0,5%ツイーン−PBSで1
: 3500に希釈したモノクロール抗ヒトIgGを200μm/well加え
る
(10) 37℃で30分インキュベートする(11) テスト血清を振り出し
、板をPBS−0,05%ツイーンで5回洗浄する
(12)OPD基質を200μj/well加え、室温で30分インキュベート
する
(13) 4N H2SO4を50μj/well加えて反応を停止させる(1
4) MR600マイクロプレートリーダーを用いて490nmで板を読む
試薬
(1) リン酸塩M’lfl化食塩水(PBS)pH7,3塩化ナトリウム8.
0 g 、−塩基性リン酸カリウム0.2g、二塩基性リン酸ナトリウム1.1
6y、塩化カリウム0.2y及びチメロサール0.2gを水で800dとして混
合し、必要ならpHを調製し、水を加えて1jとする。
(2) 塗布用1iar液pH9,6
0、OIM炭酸塩MvR液
(3) ブロッキング用緩衝液(1%BSA−PBSプラス添加剤)1%ウシ血
清アルブミン(Signa #A7030 )10にμ/ifアプロチニン(A
protinin)10μy/z11−リプシン阻害剤
10nM EACA (E−アミノカプロン酸)0.5mM PMSF(フェニ
ル−メチル−スルホニルフルオライド)
2.0mM EDTA
10%グリセロール
(4) 希釈剤標品
凍結乾燥したウシγ−グロブリン、分画■101、ウシアルブミン分画v5o、
og及びポリソルベート20(ツーイーン20) (ツイーン20)0.5xj
!に水を加えて11とし混合し、0.2μのが過器で枦遇する。
(5) 複合希釈剤
PBS490xf、熱不活性化したウシ胎児血清!500w1、熱不活性化ウマ
血清1011、チメロサール0.1g及びフェリジアン化カリウム0.329y
に水を加えて11とし、混合し、0.2μのが過器で枦遇する。
実施例 ■
実施例■手順4に記述された、ペプチド(n)eついて作成されたエライザキッ
トを健康な被検者、AIDSに関係ない疾患もしくは病気の患者、既知のエイズ
患者、既知のARC患者、及び診断がはっきりしないが商業的テスト又はウェス
タンプロットアッセイでは抗体陽性である患者からなる一部の血清について評価
した。結果を第1〜■表に要約する。比較のため、同じこれらの血清試料を商業
上利用できるキット及びウェスタンプロットアッセイにより分析した。これらの
研究に選んだ商業用キットはAbbott Laboratories、Nor
th Chicago、 m及びElectro−Neucleonies、l
ie、(ENI)、 Co1usbia、Md、のものであった。
A 第1表は正常の血清についての結果を示す。
第 1 表
ペプチド(U)を用いるエライザによる正常血清のアッセイ198 5−.19
4NT 41−.156NT 正常1 − 正常/749
1 NT NT 正常/2846
正常の平均 E8アッセイについて0.016平均からの標準偏差(S、D、)
0.017平均÷S、D、でのカットした値 0.1040.104をカット
した200
試料中での誤った陽性の割合 0.5%(1/200)NT テストせず
上表から分かるごとく、NTLVlnの抗体を含有しない血清は一般に漂準エラ
イザにおいてペプチド(n)と反応しない、このことは吸収力・ノド値の計算に
ついて抗体陰性血清と抗体陽性血清との区別を可能にする。
200の正常血清の上記アッセイ中、カット値0.104が選ばれた。
このカットオフで誤りの陽性の割合は0.5%より小さくなるか等しくなると考
えられる。
B 誤りの陽性を除去するために、式(n)のペプチドを用いる方がウィルス分
解物を用いる商業上入手し得るキットを用いるよりもすぐれた有効性が得られる
ことを示すために、2つのエイズと関係ない疾患、すなわち鼻咽頭癌及びリウマ
チ様関節炎の患者からの多くの血清を本アッセイ及び商業上のテストによってテ
ストした。結果を下記第B表に要約するが、本アッセイの増大した特異性を示し
ている。商業テストでは誤った陽性を与えた多くの試料が本アッセイでは陰性と
して正しく同定された。
第 ■ 表
鼻咽頭癌及びリウマチ様関節炎の患者に対するテストロ (リ NT (リ N
PC/非エイズ17 − NT (リ NPC/非エイズ8 − N′r NP
C/非エイズ
1 − NT N”r NPC/非エイズ7 − 2−.5NT 3−.4NT
RA/ 非エイズ(+) 誤りの陽性 NT テストせずNPC鼻咽頭癌 R
A リウマチ様関節炎Cエイズ/ARC患者血清中のHTLV−1it抗体の検
出のための本アッセイの商業用キットと比較しての有効性を示すために、実施例
■−手順1に記述したエライザキットをエイズ及びARCと診断された患者から
獲られた一部の血清について評価した。第■表に要約した結果は本アッセイがH
T L V−の抗体を含有する血清を同定する能力について商業用キットと同等
であることを示している。
第 ■ 表
エイズ/ARC血清のアッセイ
67 ◆ ◆(16NT) エイズ
2 (−) (−) (−) エイズ1533.36211 (−) エイズ/
653
−ス (−) (−) (−) ABC1512,529(−) 誤りの陰性
ARCエイズ関連群(Aids Rolatod Coa+plex)D 現在
出回っているウィルス分解物を用いるキットが高い割合で誤った性格づけをする
理由の一部はエイズ及び非エイズ患者血清の両方に存在する抗体と反応する細胞
抗原(cellular antigens)が分解物中に存在することにある
。さらに、HTLV−Illのようなウィルスに由来する複合抗原のような複合
抗原は多くのエピトー1を含み、ヒト血清中に存在する抗体と非特異的に反応す
る傾向がある0本ペプチド(U)は患者血清と反応するのに用いられる抗原の複
雑性を1又は恐らくわずかばかりのエピトープに減する。非HTLV−I抗体と
の非特異的相互作用は大きく減じられるものと考えられる。非特異的相互作用は
しかしながらまた起こり得る、というのはある種の抗体は粘着性でアッセイに用
いるプラスチック支持体や、ペプチドの添加後平板を遮断するために用いるウシ
血清アルブミンやヤギ血清のような他のタンパク質に結合することができるから
である6種々の患者血清のアッセイに関するデータを以下の通常のアッセイに加
え、本発明者らは該血清試料を有効阻止量のペプチド(U)と混合した後、ペプ
チド(II)に対してアッセイした。商業的に入手し得るキットを用いて各試料
をアッセイした結果も同表に併せ示す。
Oo o o ロ O。
X
x
÷ +
+ ÷
これらの結果から、商業上入手し得るキットの一方もしくは両方によって陽性と
誤って同定された非エイズ血清試料がペプチド競合アッセイを用いて陰性として
正しく同定されたことが明らかである。さらに本アッ妄イ(the assay
)によって陽性と誤って同定された試料でさえもペプチド競合アッセイでは陰性
として正しく同定された。このように阻止(blokins)アッセイすなわち
競合アッセイも又HTLV−Illの抗体を含有する血清試料のテストを確認す
るアッセイとして役立つことは意義深いことである。第■表に示すごとくテスト
した最後の7つの試料は本テスト、商業上利用し得るアッセイ(Abbottキ
ットの場合の2つの誤った陰性を除いて)及びウェスタンプロットアッセイのい
ずれにおいても抗体陽性であった。これらの血清とペプチド(n)との反応性が
血清とペプチド(II)の混合によって有効に阻止されたが、このことはペプチ
ドに対する抗体の反応性がペプチド特異的であってこれら最後の7の試料が真の
陽性であることを示している。
実施例 ■
実施例■−手順lに記述したエライザキットはペプチド(1)〜(XV)及びペ
プチド(C−1) 〜(C−Vl)を用いて作成した。各エライザキットを臨床
的に陽性の試料、すなわち商業的アッセイ及びウェスタンプロットアッセイによ
ってHTLV−[1感染の症候を示した試料よりなる一部)0の血清について評
価した。結果を下記第7表に示す。
エライザテストの吸光度水準が2つの正常血清の吸光度の平均である背景水準の
2倍以上(sore then twice)であるときへプチドアッセイは陽
性とした。「平均」は背景水準を減じた後に計算したエライザの平均光学密度を
表わす、[指標」は式(II)のツペプチドの活性と比較しての、与えられたペ
プチドの活性を示す、この指標は背景の通常応答の水準から区別されて正しく陽
性を示す特定のペプチドアッセイの能力を評価するように考慮されている、この
指標を尋く式は以下のごとくである。
(%陽性)゛・i
□ ;指標
((%溶性)■)′・J〒i■
式中、%陽性は個々のペプチドアッセイについての%陽性であり、平均は個々の
ペプチドアッセイについての平均であり、%陽性■はペプチド(II)のアッセ
イについての%陽性であり、%平均■はペプチド(II)のアッセイについての
平均である。
上表から分かるごとく、ペプチド(1)〜(XV)を用いたアッセイは少なくと
も50%の陽性結果を与え、又少なくとも0.1の指標を与えた。一方、比較断
片はいずれもHTLV−Ill外膜からの、すぐ隣りの、重なり合う又は部分的
に重なり合う断片であるにも拘わらず、陽性結果又は高い指標を示していない。
実施例 ■
追加のエイズ/ARC患者血清を2つの高反応性のペプチド(Iり及び(■)(
実施例■−手[1)を用いるエライザアッセイによってテストした。これらの血
清のいくつかについての、吸光度値として表わした反応性を第■表に示す。
第 ■ 表
3362 0.603 0.151
3412 >2.00 0.54O
A、 3693 0.559 0.1203722 0.620 0.193
0649 0.756 0.379
3544 0.428 >2.00
3575 0.350 1.773
3744 0.311 1.326
B、 3790 0.224 1.7650509 0.403 2.000
0653 0.111 0.999
0662 0.301 1.392
3416 1.914 >2.00
3456 1.670 1.780
C,3666>2.00 >2.00
3414 1.453 1.057
3411 >2.00 >2.00
3413 >2.00 >2.00
拳−φ軸Φ・・・−−・骨H+−1Φ會φ令管嗜嚇争中−魯拳番曽中・・・−e
l−・11・φ令畢中龜管・畳・もe暢・・うe嗜・・e・E・争・・Φ・・・
e・嘩骨e1eΦ一番―会1oe・俸・軸魯拳ee―雫テストした多くの血清が
両方のペプチドと非常によく反応した。このことは第■表C群でより多くみられ
る。しかしながら時折ある試料は、第■表A及びB群でみられるごとく一方に対
し他方よりはるかによく反応した。このデータはエイズウィルスにさらされた患
者に共通に見い出されるこの32にアミノ酸領域中に1より多い(more t
han one)エピトープ(例えば線状及び配座エピトープ)があることを示
している。
ペプチド(Ill)及び(IV)の溶液中での高性能液体クロマトグラフィー(
HPLC)分析はペプチド(I[[)の多くが環状モノマーとして存在し、ペプ
チド(mV)が大部分ダイマーとして存在することを示している。ジスルフィド
結合によって、これら2つのペプチドに付与された構造特性が配座エピトープの
抗原提示及び創造の両方に関与するものと考えられる。
実施例 ■
ペプチド(III)及び(fV)中に1より多いエピトープがあるという別の証
拠が競合研究から導かれる。その−例の結果を第■A表に示す、この研究ではへ
ブチド(In)及び(N)の両方を固定化抗原として同じ微量力価平板に塗布し
、エライザアッセイを5つの異なった条件下に行った:競合なし、過剰のペプチ
ド(Ml)との競合、過剰のペプチド(IV)との競合、過剰の両ペプチドでの
競合、過剰のX種ペプチドとの競合。
競合は微1カ価六に血清試料を加える直前に、その希釈血清に上記ペプチドを加
えることによって行った。
かかる条件で、ある試料が該ペプチドの一方又は両方と非常によく反応すること
が明らかである0例えば試料3416は両ペプチドとよく反応する。というのは
ペプチド(III)との競合が光学密度(OD)〉1.8を与え、ペプチド(f
f>との競合がODl、055を与え、両競合ペプチドの存在においてはODは
本質的に背景水準まで下降するからである。他の血清試料例えば3412は一方
のペプチドに対して他方よりはるかに強く反応する。すなわち3412の場合、
ODはペプチド(Ill)で阻止すると〉1.4から0.113に減じるがペプ
チド(IV)で競合しても〉1を支持する。しかしながら、両方のペプチドの存
在下では免疫反応性は完全になくなる(0.059)ので、ペプチド(履)との
反応性がある程度あることは確かである。
平板上にペプチド(1)を用いる別の競合研究は、ペプチオ(N)はペプチド(
1)と有効に競合しないが、ペプチド(Ill)は非常に有効に競合することを
示している(下記の第■B表参照)。
第 ■B 表
ムペプ ドの
11 JuiL ±■−IXI−1広L L−10131,1770,0380
,0460,7700,8650140,3830,0500,0670,27
30,324これらの分析から、ペプチド(II)中に存在するエピトープはペ
プチド(1)にも存在′し、このエピトープがペプチド(N)のエピトープと実
質的に異なっていると考えられる。さらに、この同じ試料に基づいていえば、事
実上すべての血清が、多くの場合一方のペプチドに対して他方より強く反応する
けれども、べ1チド(I[I)及び(N)上のエピトープと反応する。
実施例 ■
固相抗原としてペプチド(III) 1μs及びペプチド(W)0.5μsの組
合せを用いるエライザアッセイ(実施例■−手順2)の特異性及び感度はテスト
したいずれの商業上入手し得るウィルス分解物抗体検出キットによるそれらと同
等又はすぐれていた。
第■表は患者血清、正常血清、及びリウマチ様関節炎、鼻咽頭癌(NPC) 、
Epstein−Barrウィルス感染症、サイトメガロウィルス感染症、グラ
ム陰性敗血症、トキソプラズマ症、全身性紅斑性腺値及びヘルペスウィルス感染
症を含む種々の病気群からの血清を用いて得たエライザ結果を示す。
真正の正常血清を(Ill)/(N)アッセイ及びE 1ectronucle
nics。
I ncorporated (E N I )のアッセイでの反応性について
テストしたところ、(I[[)/(ff>ペプチドアッセイは著しく低い誤りの
陽性率を示した。すなわち第1表に示されるごとく、ENIについての誤りの陽
性率は1.65%(12/728)であるのに対し、(II)/(!V)ペプチ
ドアッセイでの誤りの陽性率はわずか0,55%(4/728)であった6種々
の病気についての誤りの陽性率は本ペプチドアッセイはENIアッセイよりわず
かに低かった、すなわち1.81%対2.58%(7/387対10/387)
。
上記実施例は本発明の目的を例示するために提示したのであって、本発明を減縮
するものではない0本発明の範囲は以下の請求の範囲によってのみ定義される。
国際調査報告
Claims (36)
- 1.CSGKLIC、 IWGCSGKLICTTAVP、 IWGCSGKLICTTAVPWNAS、AVERYLKDQQLLGIWG CSGKLI、AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPW NAS、 LKDQQLLGIWGCSGKLI、LLGIWGCSGKLIC、 QQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS、IWGCSGKLICT TAVPWN、CSGKLICTTAVPWNAS、 SGKLICTTAVPWNAS、 AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC、GCSGKLICTTAV PWN、 LKDQQLLGIWGCSGK、及びRILAVERYLKDQQLLGIW GCSよりなる群から選はれる配列を含む合成ペプチド、その抗原往で免疫的な 断片、及びその製薬上もしくは診断上許容し得る塩。
- 2.式CSGKLICを有する請求の範囲第1項記載の合成ペプチド。
- 3.式IWGCSGKLICTTAVPを有する請求の範囲第1項記載の合成ペ プチド。
- 4.式IWGCSGKLICTTAVPWNASを有する請求の範囲第1項記載 の合成ペプチド。
- 5.式AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIを有する請求の範囲第1 項記載の合成ペプチド。
- 6.式AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASを 有する請求の範囲第1項記載の合成ペプチド。
- 7.式LKDQQLLGIWGCSGKLIを有する請求の範囲第1項記載の合 成ペプチド。
- 8.式LLGIWGCSGKLICを有する請求の範囲第1項記載の合皮ペプチ ド。
- 9.式QQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASを有する請求の範囲 第1項記載の合成ペプチド。
- 10.式IWGCSGKLICTTAVPWNを有する請求の範囲第1項記載の 合成ペプチド。
- 11.式CSGKLICTTAVPWNASを有する請求の範囲第1項記載の合 成ペプチド。
- 12.式SGKLICTTAVPWNASを有する請求の範囲第1項記載の合成 ペプチド。
- 13.式AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICを有する請求の範囲 第1項記載の合成ペプチド。
- 14.式GCSGKLICTTAVPWNを有する請求の範囲第1項記載の合成 ペプチド。
- 15.式LKDQQLLGIWGCSGKを有する請求の範囲第1項記載の合成 ペプチド。
- 16.式RILAVERYLKDQQLLGIWGCSを有する請求の範囲第1 項記載の合成ペプチド。
- 17.重合体の形態にある請求の範囲第1項記載のペプチド。
- 18.単独の各ペプチドに比べHTLV−IIIの抗体に対する高められた認識 を有する2以上のペプチドの混合物であって;該混合物はHTLV−IIIウイ ルスgp41タンパク配列の部分に相同のアミノ酸残基配列を含有する2以上の ツペプチドから選ばれてなり、その際該ペプチドの第1がHTLV−IIIウイ ルスgp41タンパク配列の部分CSGKLICを含有してなり、そして該ペプ チドの第2が配列ZLLGXWZ′(式中、XはI、L、M又はFよりなる群か ら選ばれ;ZはHTLV−IIIウイルスgp41タパクの599番目の位置に あるL−ロイシン残基のアミノ側に直ちに隣接するgp41タンパクのアミノ酸 残基配列から選はれ;Z′はHTLV−IIIウイルスgp41タンパクの60 3番目の位置のL−トリアトファン残基のカルボキシ側に直ちに隣接するgp4 1タンパクのアミノ酸残基配列から選ばれ;ZもしくはZ′の一方は残基長0で もよいが、ZとZ′とを合わせて少なくとも10残基よりなる)を含有してなる 、ことを特徴としてなる混合物。
- 19.該最初のペプチドがIWGCSGKLICTTAVPWNAS、GCSG KLICTTAVPWN及びCSGKLICTTAVPWNASよりなる群から 選ばれ、第2のペプチドがAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLI及び AVERYLKDQQLLGXWGCSGKLICよりなる群から選ばれる請求 の範囲第18項記載のペプチド混合物。
- 20.最初のペプチドがIWGCSGKLlCTTAVPWNASよりなり、第 2のペプチドがAVERYLKDQQLLGXWGCSGKL1よりなる請求の 範囲第19項記載のペプチド混合物。
- 21.Xが1である請求の範囲第20項記載の混合物。
- 22.最初のペプチドがGCSGKLICTTAVPWNよりなり、第2のペプ チドがAVERYLKDQQLLGXWGCSGKLIよりなる請求の範囲第1 9項記載のペプチド混合物。
- 23.XがIである請求の範囲第22項記載の混合物。
- 24.HTLV−IIIの抗体を含有する疑いのある流体中の該抗体を検出又は 定量する方法であって、 a)固体表面に付着させた少なくとも1つの請求の範囲第1項記載のペプチドを 準備し、 b)このペプチド被覆固体表面とテスト流体とを免疫反応が起こるに十分な時間 接触させ、ついで、 c)該固体の表面上のこのペプチド又は抗原断片に結合した抗体の存在を検出す るか又は抗体の量を定量する、ことを特徴とする方法。
- 25.検出又は定量の工程が該表面と標識した抗ヒト免疫グロブリンとを接触さ せることを包含する請求の範囲第24項記載の方法。
- 26.HTLV−IIIウイルの抗体を製造する方法であって、重合化するか及 び/又は適当な免疫抗原性担体に付着させた、免疫原的に有効な量の少なくとも 1種の請求の範囲第1項記載のペプチドによって動物を免疫化し、ついで該動物 から採血することを特徴とする方法。
- 27.HTLV−IIIウイルスに対して動物を免疫化する方法であって、重合 化するか及び/又は免疫原的に有効な担体に付着させた、免疫原的に有効な量の 少なくとも1種の請求の範囲第1項記載のペプチドを該動物に非経口的に投与す ることを特徴とする方法。
- 28.潜在的な又は現実のHTLV−IIIウイルス感染症を有する動物を治療 する方法であって、重合化するか及び/又は免疫原的に有効な担体に付着させた 、免疫原的に有効な量の少なくとも1種の請求の範囲第1項記載のペプチドを該 動物に非経口的に投与することを特徴とする方法。
- 29.HTLV−IIIの抗体を検出もしくは定量するための診断用キットであ って、(a)少なくとも1種の請求の範囲第1項記載のペプチドを結合した固体 表面、及び(b)標識した抗ヒト免疫グロブリンを含有してなることを特徴とす るキット。
- 30.重合化するか及び/又は免疫原的に有効な抗体に付着させた、免疫原的に 有効な量の少なくとも1種の請求の範囲第1項記載のペプチドを含有してなる治 療用又は予防用組成物。
- 31.HTLV−IIIウイルス又はウイルス特異的抗原を含有する疑いのある 流体中の該ウイルス又は抗原を検出Xは定量するサンドイッチ方法であって、 a)固体表面に付着させた少なくとも1種の請求の範囲第1項記載のペプチドに 対する抗体を準備し、 b)この抗体被覆固体表面とテスト流体とを免疫反応が起こるに十分な時間接触 させ、ついで c)固体表面上のこの抗体に結合した、HTLV−IIIウイルス又はウイルス 特異性抗原の存在を検出するか又はその量を定量する、ことを特徴とする方法。
- 32.HTLV−IIIウイルス又はウイルス特異的抗原を含有する疑いのある 流体中の該ウイルス又は抗原を検出又は定量する競合方法であって、 a)少なくとも1種の請求の範囲第1項記載のペプチドの抗体であって、固体表 面に付着させたものを用意し、b)既知の少量の、テストすべき流体と既知の量 の標識された該ペプチドとを混合して混合試料をつくり、c)固体被覆固体表面 と該混合試料とを免疫学的反応が起こるにに十分な時間接触させ、 d)固体表面を該混合試料から分離し、e)固体表面に結合したか、又は該混合 試料中に残存する標識ペプチドの存在を検出するか又はその量を定量し、ついで f)工程e)の結果から、該流体中の該ウイルスもしくは抗原の存在もしくは量 を決定する、 ことを特徴とする方法。
- 33.HTLV−IIIウイルス又はウイルス特異性抗原を検出又は定量するた めの診断用キットであって、 a)少なくとも1種の請求の範囲第1項記載のペプチドに対する抗体を結合させ た固体表面、及び b)HTLV−III、ウイルス特異性抗原又は請求の範囲第1項記載のペプチ ドに対する、既知量の標識された抗体を含有してなることを特徴とするキット。
- 34.HTLV−III抗体を含有する疑いのある流体試料の該抗体についての テストにおいて、陽性結果の正確性を判定する方法であって該テストは組換えH TLV−IIIタンパク又は合成HTLV−ペプチド又はその抗原断片を固体表 面に付着させたサンドイッチアッセイであり、そして該方法は、 a)既知少量の該試料と有効阻止量の該組換えHTLV−IIIタンパク又は合 成HTLV−IIIペプチド又はその抗原断片とを混合して混合試料とし、 b)該混合試料と該テストの固体相とを免疫反応が起こるに十分な時間接触させ 、 c)該混合試料中の該抗体と該固体相との結果が、該ペプチド、断片もしくはタ ンパクの不存在下での該結合と比較して阻害されているかどうかを決定し、つい で d)該阻害の存在又は不存在に基づいて、陽性結果の正確性を判定する、 工程よりなることを特徴とする方法。
- 35.HTLV−IIIの抗体を定量又は検出し、陽性結果を判定するための診 断用キットであって、 a)請求の範囲第1項記載のペプチドを結合させた固体表面、b)有効防止量の 請求の範囲第1項記載の該ペプチド、及びc)標識した抗ヒト免疫グロブリン よりなることを特徴とするキット。
- 36.HTLV−IIIのモノクロナール抗体を製造する方法であって、a)重 合形態の、Xは適当な免疫原性担体に付着させた請求の範囲第1項記載のペプチ ドで宿主動物を免疫化し、b)該免疫化した動物をから脾臓細胞を単離し、c) 該脾臓細胞と適当なミエローマ細胞系とを融合し、d)該免疫化用ペプチド、H TLV−III又はHTLV−III感染細胞に対する反応性によって融合細胞 を選択し、e)選択したハイブリドーマをインビトロで培養するか、スは適当な 宿主中に注入し、そして f)培養したハイブリドーマの上清液、又は注入した宿主の血清もしくは腹水か ら目的とするモノクローナル抗体を回収することを特徴とする方法。
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